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KR102644194B1 - 종양의 진단 및 치료를 위한 표적단백질로서의 atf6 - Google Patents

종양의 진단 및 치료를 위한 표적단백질로서의 atf6 Download PDF

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KR102644194B1
KR102644194B1 KR1020210023597A KR20210023597A KR102644194B1 KR 102644194 B1 KR102644194 B1 KR 102644194B1 KR 1020210023597 A KR1020210023597 A KR 1020210023597A KR 20210023597 A KR20210023597 A KR 20210023597A KR 102644194 B1 KR102644194 B1 KR 102644194B1
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Abstract

본 발명은 ATF6 억제제를 포함하는 ATF6 과발현 종양인, 위장관 기질종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 ATF6의 활성을 억제하여, 급격한 세포사멸을 유발함에 따라 ATF6 과발현 종양을 예방 또는 치료할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 티로신 키나제 억제제와 동시에 또는 순차적으로 투여되어 더 효과적으로 ATF6 과발현 종양을 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

종양의 진단 및 치료를 위한 표적단백질로서의 ATF6 {ATF6 as a target protein for diagnosis or treatment of tumor}
본 발명은 ATF6를 과발현하는 종양의 진단용 조성물 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
위장관 기질 종양 (GIST, Gastrointestinal stromal tumor)은 위장관 벽의 중간에 위치한 근육층에 존재하는 기질세포가 암세포로 변이를 일으켜 발생한다. 일반적으로 위암이나 대장암처럼 소화기에 발생하는 대부분의 암이 상피세포에서 유래하는 것과 달리 위장관 기질 종양은 근육층의 중간엽 유래 기질 세포로부터 생기는 암으로서, 식도, 위, 소장, 결장, 직장 등 위장관의 어디든 발생할 수 있고 원인과 위치, 전이 양상 등이 역시 일반적인 위암 및 소화기암과 다르다. 또한 뚜렷한 증상이 없기 때문에 정기검진이 무엇보다 중요한 질환 중 하나다.
GIST의 주요 병리기전은 KIT 유전자 돌연변이로 인한 c-KIT 단백질의 지속적인 활성화와 PDGFRα 유전자 돌연변이로 알려졌는데, 대부분의 GIST 에서 KIT 또는 PDGFRα 유전자 돌연변이가 발견되고, 이중 KIT 유전자 돌연변이가 75~80%로 매우 흔한 것으로 보고되었다.
c-KIT (KIT, CD117, 또는 줄기세포인자 수용체로 알려짐)는 III형 수용체로서 작용하는 145 kDa 막관통 티로신 키나아제 단백질이다. 염색체 4q11-21에 위치한 c-KIT 유전자는 줄기세포 인자(SCF, 줄기세포 성장인자, kit 리간드)를 리간드를 가진 c-KIT 수용체 단백질을 암호화한다. c-KIT 수용체는 티로신-단백질 키나아제 활성을 가지며, 리간드인 SCF의 결합은 c-KIT를 자가인산화시키고 PI3K, GRB2, JAK2와 같은 하위신호전달물질과 결합시켜 PI3K-ATK, MAPK-ERK, JAK-STAT 신호전달계와 같은 종양 유발 신호전달계를 동시다발적으로 활성화킨다. 단백질 티로신 키나아제에 의한 티로신 인산화는 세포 신호 전달에서 특히 중요하며, 증식, 생존, 분화, 아폽토시스, 부착, 침습성 및 이동과 같은 주요 세포 과정을 위한 신호 전달을 매개할 수 있는 것으로 알려져 있다.
c-KIT 발현 및 활성의 역할은 급성 백혈병 및 GIST 같은 혈액학적 종양 및 고형 종양에서 연구되어 왔다. 대부분의 GIST는 RTK인 c-KIT(GIST의 75~80%) 또는 PDGFRα(비-c-KIT 돌연변이된 GIST의 8%)를 암호화하는 유전자에서 1차 활성화 돌연변이를 가진다. 특히 80% 정도를 차지하는 대부분의 GIST 환자는 c-KIT 유전자의 기능 획득 돌연변이(gain-of-function mutation)로 인해 c-KIT의 단백질 과발현 및 과인산화를 보인다. 1차 c-KIT 돌연변이 대부분은 엑손11에 의해 암호화된 단백질의 막인접 영역(JM region: juxtamembrane region)에서 발생하며, 프레임 내 결실 또는 삽입, 미스센스 돌연변이(즉, V560D)로 이루어진다. c-KIT 엑손11 돌연변이는 GIST 환자의 약 65%에서 1차 돌연변이로 나타나며, 이러한 JM 도메인 돌연변이는 c-KIT 키나제의 자가억제 기작을 방해하여, GIST의 원인이 되는 키나아제를 자동적으로 활성화시키고 세포의 형질전환을 유발시킨다. 그 외 다른 1차 GIST-유발 c-KIT 돌연변이는 엑손9(AY501-502 복제/삽입, 8%), 엑손13(돌연변이, 1%) 및 엑손17(돌연변이, 1%)에 위치하는 것으로 알려져 있다.
악성 종양에서 c-KIT 발현의 임상적 중요성은 티로신 키나아제 수용체를 특이적으로 억제하는 글리벡을 이용한 연구에서 입증되었다 또한, 임상적으로 큰 발전은, 글리벡이 통상적인 화학요법에 일반적으로 내성을 나타내는 GIST에 대한 표적 치료를 통한 항종양 효과를 보인 것이다. 그러나, c-KIT 억제제인 글리벡의 경우, 이미 전이가 되었거나 수술이 불가한 GIST 환자에 대해 치료효과를 어느 정도 기대할 수 있지만, 완치는 드물고, 약 50%의 환자는 치료 후 2년 이내에 암이 재발하기 때문에 이를 극복할 수 있는 새로운 치료제 개발이 요구된다.
c-KIT에 존재하는 돌연변이 위치는 글리벡(Gleevec)(Imatinib mesylate, Novartis Pharm.) 기반 치료에서 임상적으로 매우 중요한데 엑손 11번 돌연변이 환자의 경우 초기 글리벡 약물 반응성이 85% 수준으로 좋지만 엑손 9번 돌연변이 환자의 경우 45%, 엑손 13 및 17번 돌연변이 환자의 경우 거의 약물 반응성을 보이지 않아 돌연변이 위치별 약물 치료 효과가 현저한 차이를 보인다. 이러한 돌연변이 위치별 약물 반응성 차이로 인해 현재 임상에서는 글리벡 기반 GIST 치료의 한계점을 인정하고 있다. 전술한 것처럼 GIST는 돌연변이가 발생한 엑손 위치에 따라서 약물 반응성이 애초에 없거나 또는 약물 치료 과정에서 글리벡에 대해 내성을 나타내는 경우가 빈번하다. 글리벡 치료 과정 중 발생하는 약물 내성은 c-KIT 유전자에 발생하는 2차 돌연변이에 의해 유도되며, 2차 돌연변이가 발생했을 경우에 대한 확실한 치료법은 아직 정립되지 않았다. 글리벡 치료 과정 중 재발한 GIST 환자들은 본래 가지고 있던 1차 돌연변이에 추가하여 2차 돌연변이 발생으로 훨씬 더 공격적인 활성화 형태의 c-KIT 돌연변이 단백질을 갖게된다. 2차 돌연변이는 ATP 결합 포켓 (엑손13: K642E, V654A; 엑손14: T670I) 및 활성화 루프I(엑손17: N822K, D816H, D816V, D820A; 엑손18: A829P)에서 발견되는데, 글리벡이 ATP 결합 포켓에 결합하여 약물 활성을 나타내기 때문에 c-KIT의 이러한 2차 돌연변이체는 약물 내성을 유도한다.
삭제
수텐트(Sutent)(Sunitinib malate, Pfizer)는 다중 RTK의 억제제, 특히 본 맥락에서의 c-KIT의 억제제이며, 2차 돌연변이로 인한 글리벡 내성 c-KIT (e.g. ATP-결합 포켓 돌연변이체 V654A 및 T670I)을 저해할 수 있는 약제로 개발되었다. 그러나 GIST 환자 중 2차 돌연변이가 엑손17에 의해 암호화된 c-KIT 촉매 도메인의 활성화 루프에 위치하는 D816H 및 D816V와 같은 위치에 발생할 경우는 수니티닙(Sunitinib)에 대해서도 내성을 나타내며, 임상에서 수니티닙의 전반적인 약물 반응성은 10% 내외로 큰 성과를 거두지는 못하고 있는 것으로 보고되었다.
글리벡(Gleevec) 내성 GIST 환자에게 활용하는 또 따른 다중 키나제 억제제(multi kinase inhibitor)인 레고라페닙(Regorafenib) 역시 치료 반응성을 보이는 환자가 5% 미만에 불과하며, 그마저도 약물 부작용이 매우 심하기 때문에 적극적 활용에 어려움을 겪고 있다. 따라서 수니티닙과 레고라페닙 모두 글리벡(Gleevec)에 내성을 보이는 GIST에 대한 현실적 대안이 아니다.
전술한 것처럼 개별 환자 내에서 발생할 수 있는 복잡한 다중 2차 c-KIT 돌연변이는 글리벡에 대한 약물 반응성을 저해할 뿐만 아니라, KIT 단백질의 활성화를(키나아제 활성화) 조절하는 방식으로만 GIST를 치료하고자 했던 기존 치료법의 한계를 보여준다. 글리벡은 현재 GIST에서 가장 확실한 치료 수단이지만, 1차 돌연변이 발생 위치에 따른 약물 반응성 저하 문제 및 2차 돌연변이로 인한 약물 내성 문제 등의 문제가 존재하는바, 이를 극복할 수 있는 새로운 치료법 개발에 대한 연구 필요성이 강조되고 있다. 최근에는 KIT 단백의 활성화를 조절하기 보다 siRNA, microRNA 등을 이용하여 KIT mRNA나 KIT 단백질의 발현 자체를 직접 조절하거나 KIT의 발현을 조절하는 것으로 알려진 PKC-theta와 같은 인자들을 활용하여 간접적으로 KIT 단백질 발현을 제어하는 방식이 대안으로써 주목받고 있다. 또한 GIST에서 현재까지 알려져 있지 않은 새로운 암발생 및 진행 기전 규명을 통해 완전히 새로운 약물 표적 개발 등의 연구가 수행되고 있으나 현재까지 임상적용할만한 연구 성과는 발표된바 없다.
본 발명을 통해 GIST의 새로운 발생 기전을 규명하고 신규 약물 표적 인자를 발굴하여 이를 조절하는 방식을 통해 전술하였던 기존 c-KIT 타겟 치료법의 한계점을 극복하고자 하며, 아울러 글리벡에 좋은 약물 반응성을 보이는 초기 GIST 환자들 뿐만 아니라 글리벡에 대해 내성이 발생한 환자들에게 새로운 치료 선택지를 제시하고자 한다. 또한 기존 치료법인 글리벡과도 병용할 수 있는 치료법을 개발하여 조기의 강력한 암억제능 달성을 통한 근치적 GIST 치료법 개발 근거를 제시하고자 한다.
한국 공개특허 제 10-2020-0115607호
본 발명은 위장관 기질종양에 대한 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 위장관 기질종양의 진단 또는 예후예측을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. ATF6 억제제를 포함하는 ATF6 과발현 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 위 1에 있어서, 상기 ATF6 과발현 종양은 유방암, 담관암, 대장 선암, 식도암, 다형성 교모세포종, 급성 골수성 백혈병, 뇌 저등급 신경교종, 간암, 췌장암, 갈색 세포종/부신경 절종, 육종, 피부 흑색종, 위암, 난소암, 갑상선암, 흉선종, 고환암, 직장암, 전립선암, 부신 피질 암, 방광암, 림프종, 중피종, 폐암, 자궁내막암, 자궁경부암, 신장암, 두 경부암, 위장관암, 뇌수막종, 뇌하수체 선종, 청신경초종, 두개인두종, 모낭형 성상세포종, 혈관아 세포종, 미만성 성상세포종, 핍지 세포종, 비정형 뇌수박종, 상의 세포종 및 위장관 기질종양으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, ATF6 과발현 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 ATF6 억제제는 PF429242, 세아핀(Ceapin) A7 및 ㅁ멜라토닌(Melatonin)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, ATF6 과발현 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 위 1에 있어서, 티로신 키나제 억제제를 추가로 포함하는, ATF6 과발현 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 위 4에 있어서, 상기 티로신 키나제 억제제는 이마티닙, 수니티닙, 레고라페닙 및 아이바키트로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, ATF6 과발현 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
6. 위 4에 있어서, 상기 티로신키나아제 억제제는 ATF6 억제제와 동시에 또는 순차적으로 투여되는, ATF6 과발현 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
7. 시료의 ATF6 또는 그 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 위장관 기질종양의 진단 또는 예후예측을 위한 정보 제공 방법.
8. 위 7에 있어서, 상기 시료는 개체 또는 개체로부터 분리된 것인, 위장관 기질종양의 진단 또는 예후예측을 위한 정보 제공 방법.
9. 위 7에 있어서, 상기 ATF6 또는 그 mRNA의 수준이 정상 대조군의 발현 정도에 비해 높은 경우 위장관 기질종양으로 판단하는 단계를 더 포함하는, 위장관 기질종양의 진단 또는 예후예측을 위한 정보 제공 방법.
10. 위 7에 있어서, 상기 ATF6 또는 그 mRNA의 수준이 높을수록 위장관 기질종양의 예후가 나쁠 것으로 판단하는 단계를 더 포함하는, 위장관 기질종양의 진단 또는 예후예측을 위한 정보 제공 방법.
11. ATF6 또는 그 mRNA의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 위장관 기질종양의 진단 또는 예후예측용 조성물.
12. 위 11에 있어서, 상기 ATF6 또는 그 mRNA의 수준을 측정하는 물질은 ATF6 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 위장관 기질종양의 진단 또는 예후예측용 조성물.
13. 시료의 ATF6 또는 그 mRNA의 발현을 감소시키는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 위장관 기질종양 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
본 발명의 약학 조성물은 위장관 기질종양에서 과발현된 ATF6의 활성을 억제하여, 하위 샤페론 단백질의 발현을 억제함에 따라 급격한 세포사멸을 유발하는 효과를 나타낼 수 있다. 이에 위장관 기질종양을 예방 또는 치료할 수 있다.
또한 본 발명의 약학 조성물은 티로신 키타제 억제제와 동시에 또는 순차적으로 투여되어 더 효과적으로 위장관 기질종양을 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 GIST에서 cATF6 (절단 ATF6, ATF6 활성화 형태)의 발현이 높아져 있으며, 세포 내에서도 핵으로 이동해 있음을 WB, 형광 면역염색으로 GIST 세포주에서 확인하고 GIST 환자 조직에서 IHC로 확인한 결과이다.
도 2는 탑시가르긴(Thapsigargin, TG)(ER 스트레스 유발)를 농도별로 처리하여 ATF6, cATF6, ER 스트레스 신호전달 관여 인자 (PERK, IRE1α 및 각각의 인산화형태), CHOP (세포사멸 마커) 및 샤페론 단백질 (BIP, HSP90, GRP94, HSP70)의 발현을 단백질 수준에서 확인한 결과이다. 특히, ATF6가 활성화 되어 있는 GIST 세포는 약한(mild) ER 스트레스가 유도된 경우(TG: 0.1 uM) ER 스트레스를 극복하며 생존할 수 있음을 보여준다.
도 3은 GIST 세포주에 ATF6의 절단(cleavage) 및 활성화를 억제하는 세린 1 프로테아제 억제제(S1Pi, Serine 1 protease inhibitor)를 처리하면, 샤페론 단백질 (BIP, HSP90, GRP94, HSP70)의 발현이 억제되고 약한 ER 스트레스와 함께 유도될 경우에도 급격한 세포사멸이 유발됨을 확인하였고, 또한 ER 스트레스 유도에 따라 ATF6 관련 샤페론 단백질의 발현이 증가되는 시점이 지연되는 것을 확인하였음.
도 4는 KIT와 결합하는 단백질을 확인하기 위해 GIST 세포주에서 KIT 항체를 이용한 면역침강을 수행한 결과로, ATF6에 의해 조절되는 샤페론인 HSP90 단백질이 KIT와 결합함을 확인하였다. 또한 ATF6를 억제하면 하위 단계인 샤페론인 HSP90의 발현이 억제되고 이를 통해 GIST의 발생원인 중 하나인 돌연변이 KIT도 부수적으로 억제가 가능하여 ER 스트레스 감수성 증가를 통한 항암 효과뿐 아니라 돌연변이 KIT 단백 발현 억제를 통해서도 항암 효과를 유도할 수 있어 ATF6 저해가 여러 경로를 통해 GIST에서 강력한 항암 효과를 유도할 수 있음을 시사한다. 또한 ATF6 저해제 또는 HSP90 저해제 처리시 KIT 단백질의 발현이 감소되는 결과를 확인하였다.
도 5는 GIST 세포주에 ATF6 억제제 (S1Pi, 세아핀(Ceapin) A7, 멜라토닌(Melatonin))를 처리한 경우, 잘린 형태의 ATF6(활성상태의 ATF6, cleaved ATF6)의 발현이 감소한 것을 확인한 결과이다.
도 6은 실제 종양 미세 환경을 모사하기 위해 TG를 처리한 GIST 세포주 (GIST882: 이마티닙 민감성 세포주; GIST48: 이마티닙 내성 세포주)에 ATF6 억제제 (S1Pi, 세아핀(Ceapin) A7, 멜라토닌(Melatonin))를 독립적으로 처리해준 경우와 ER 스트레스 유발 물질 (Borteazomib, 17AAG) 또는 이마티닙과 ATF6 억제제를 동시에 투여한 경우의 세포 생존력 (cell viability)를 측정한 것으로, ATF6 억제제는 독립적으로 처리하여도 우수한 GIST 억제능을 보이고 ER 스트레스 유발 물질 역시 독립적으로 GIST를 억제할 수 있으며, ATF6 억제제와 ER 스트레스 유발 물질을 함께 처리한 경우 더 효율적으로 GIST를 억제함을 확인한 결과이다.
도 7은 TG를 처리하지 않은 GIST 세포주에 ATF6 억제제 (S1Pi, 세아핀(Ceapin) A7, 멜라토닌(Melatonin))를 독립적으로 처리해준 경우와 ER 스트레스 유발 물질 (Borteazomib, 17AAG) 또는 이마티닙과 ATF6 억제제를 동시에 투여한 경우의 세포 생존력 (cell viability)를 측정한 것으로, ATF6 억제제는 독립적으로 처리하여도 우수한 GIST 억제능을 보이고 ER 스트레스 유발 물질 역시 독립적으로 GIST를 억제할 수 있으며, ATF6 억제제와 ER 스트레스 유발 물질을 함께 처리한 경우 더 효율적으로 GIST를 억제함을 확인한 결과이다.
도 8은 ATF6 발현 환자군과 발현하지 않는 환자군의 생존확률을 나타낸 생존함수 그래프로, ATF6를 발현하는 환자군의 경우, 생존률이 낮음을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 ATF6 억제제를 포함하는 ATF6 과발현 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다:
ATF6 억제제는 ATF6의 C-말단 영역과 N-말단 영역을 연결하는 부위가 절단되어 C-terminal 영역, 즉 세포질 쪽에 위치한 ATF6가 핵 안으로 이동하는 활성화 과정을 억제하는 것으로, ATF6가 활성화 되는 기작을 억제하는 물질로서, 예를 들면 Serine 1 protease 억제제(S1Pi), PF429242, 세아핀(Ceapin) A7 및 멜라토닌(melatonin)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
ATF6 과발현 종양은 ATF6 또는 ATF6의 활성화 형태인 절단 ATF6(cATF6)의 mRNA 또는 단백질의 발현이 정상조직 또는 정상세포 대비 증가되어 있는 종양일 수 있으며, ATF6 과발현 종양은 예를 들면 유방암, 담관암, 대장 선암, 식도암, 다형성 교모세포종, 급성 골수성 백혈병, 뇌 저등급 신경교종, 간암, 췌장암, 갈색 세포종/부신경 절종, 육종, 피부 흑색종, 위암, 난소암, 갑상선암, 흉선종, 고환암, 직장암, 전립선암, 부신 피질 암, 방광암, 림프종, 중피종, 폐암, 자궁내막암, 자궁경부암, 신장암, 두 경부암, 위장관암, 뇌수막종, 뇌하수체 선종, 청신경초종, 두개인두종, 모낭형 성상세포종, 혈관아 세포종, 미만성 성상세포종, 핍지 세포종, 비정형 뇌수박종, 상의 세포종 또는 위장관 기질종양일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 위장관 기질종양은 위장관 벽의 근육층에 위치한 근육의 수축 이완을 조절하는 세포, 즉 카알세포가 변이를 일으켜 발생하는 희귀질환으로 기스트(GIST, Gastrointestinal stromal tumor)라고 불린다.
용어 "예방"은 위장관 기질종양을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
용어 "치료"는 위장관 기질종양 의심 및 발병 개체의 증상이 호전 되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 말한다.
본 발명 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태일 수 있다.
본 발명 약학 조성물은 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명 약학 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등일 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명 약학 조성물의 제형은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있으며, 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조될 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명 약학 조성물의 제형은 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제조될 수 있다.
제제화를 위한 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등일 수 있다.
본 발명 약학 조성물의 투여 경로는 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명 본 발명 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식이 선택될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
예를 들어, 본 발명 약학 조성물은 1일 0.0001 mg 내지 1000mg/kg 또는 0.001mg 내지 500mg/kg으로 투여될 수 있다. 본 발명 약학 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한 본 발명의 약학 조성물은 티로신 키나제 억제제를 더 포함하는 ATF6 과발현 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다:
상기 티로신 키나제 억제제는 성장인자 수용체 말단의 티로신 키나제(tyrosine kinase)를 억제함으로써 성장신호가 증폭 전달되는 것을 차단하는 물질을 의미하며, 예를 들면 이마티닙, 수니티닙, 레고라페닙, 아이바키트 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 티로신 키나제 억제제는 본 발명의 약학 조성물과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 그 투여 순서는 제한되지 않는다.
본 발명은 시료의 ATF6 또는 그 mRNA의 수준을 측정하는 단계를 포함하는 위장관 기질종양의 진단 또는 예후예측을 위한 정보 제공 방법을 제공할 수 있다:
상기 시료는 개체 또는 개체로부터 분리된 것일 수 있고, 시료의 종류는 예를 들면 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 개체는 위장관 기질종양이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 개체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics) (예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함할 수 있다.
ATF6 mRNA 또는 단백질을 검출하여, 시료 내 ATF6 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있다. ATF6를 검출하는 물질은 예를 들면 ATF6- 특이적 프라이머, 프로브, 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
ATF6 검출은 상기 검출하는 물질을 이용하여 당 분야에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 예를 들면 중합효소 연쇄반응, 웨스턴 블로팅, 면역염색, 면역 전기영동, 단백질 면역 침전, 효소 결합 면역 침강 분석법, 액체 크로마토그래피 등을 이용하여 검출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 실험 방법
(1) 세포 배양
GIST430, GIST430(V654A) 세포주는 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)에 15%의 태아 송아지 혈청(fetal calf serum)과 1%의 페니실린/스트렙토마이신를 혼합한 배지를 이용하였고, GIST882 세포주는 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 배지에 15%의 FBS와 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 혼합한 배지, GIST48 세포주는 IMDM 배지에 15% FBS와 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 혼합하여 37 ℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 대장암 세포주 Colo320DM, DLD-1, LS174T, H69, H128, H209은 RPMI 배지에 10% FBS와 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 혼합한 배지를 이용하였고, Kasumi-1 세포주는 RPMI 배지에 20% FBS와 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 혼합한 배지, HMC-1, K562 세포주는 IMDM 배지에 10% FBS와 1%의 페니실린/스트렙토마이신을 혼합하여 37 ℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다.
(2) 웨스턴 블랏
웨스턴 블랏 수행을 위해 프로테아제(protease) 저해제를 포함하는 패시브 라이시스 버퍼(Passive lysis buffer)를 활용하여 세포를 용해시켜준 후 해당 lysate를 얻어 전기 영동을 수행한 후(premade gel 사용, Invitrogen) 멤브레인으로 트랜스퍼 해주었다(iBlot2 system). 이후 탈지우유(nonfat dried milk)나 5% BSA 용액으로 블로킹해준 후 1차 항체와 4 ℃로 밤새 결합시켜준다. 워싱 후 2차 항체를 상온에서 1시간 결합시켜준 후 충분히 워싱하여 잔여 항체를 제거하고 LAS4000 시스템을 활용하여 이미지를 분석한다. 사용된 항체는 c-KIT (DAKO), ATF6 (Abcam), GAPDH (Trevigen), 인산화-IPE1α(Phospho-IRE1alpha) (Invitrogen), IRE1alpha, 인산화-PERK(phosphor-PERK), PERK, CHOP, HSP70, HSP90, GRP94, BIP, LC3 (Cell signaling)이다.
(3) 면역 세포 화학 염색
이미징 디쉬(imaging dish)에 배양한 세포를 워싱한 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 또는 100% 메탄올로 고정시킨다. 이후 0.2% Triton X-100으로 세포막 투과를 유도하고 1차 항체를 4도에서 오버나잇으로 인큐베이션한다. 2차 항체를 상온에서 1시간 인큐베이션한 후 충분히 워싱하고 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색하여 공초점 현미경을(Carl zeiss, LSM710) 이용하여 이미징을 수행한다.
(4) 면역 조직 화학 염색
파라핀 포매 포르말린 고정 조직 블록을 4-μm 두께로 섹션하여 Ventana XT 자동화 염색기를 이용하여 면역 조직 화학 염색을 수행하였다. ATF6의 발현 정도는 숙련된 병리의사 2명이 독립적으로 핵발현 정도를 판독하여 정량하였다.
(5) 통계분석
ATF6의 핵발현에 따른 무병생존기간은 SPSS 소프트웨어를 활용하여 분석하였고 만-휘트니 검정(Mann-Whitney tests), 스튜던트 t-검정(Student’s t-tests), 피셔 정확 검정(Fisher’s exact tests) 또는 카이-제곱 검정(chi-square tests)이 사용되었다. MTT 어세이 결과의 통계 분석은 사후 검정(Bonferroni)을 사용한 일원 분산 분석(one-way analysis of variance (ANOVA) with a post hoc test (Bonferroni)) 방법을 통해 분석하였고 데이터는 표준 오차 막대를 포함하여 제시되었다.
(6) 세포성장분석 어세이
각 세포주를 96-웰 플레이트에 웰당 104 개의 세포가 되도록 접종(seeding) 하고 24시간 후 ATF6 저해제인 PF429242, 세아핀(Ceapin) A7, 멜라토닌(Melatonin)을 각각의 농도 별로 12시간 전처리 하였다. 이후 각 ATF6 저해제와 탑시가르긴(Thapsigargin) 0.1μM 또는 보르테조밉(Bortezomib) 1nM 또는 17AAG 0.5μM 또는 이마티닙(Imatinib) 0.1μM를 포함한 배지로 교환하였다. 37 ℃, 5% CO2 배양기(incubator)에서 72시간 배양한 후에 살아있는 세포 수의 측정을 위해 MTT ([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl-) 2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 수행하였다. MTT 용액을 배양 배지에서 최종 농도 0.5mg/ml가 되도록 각각의 well에 추가한 후 37 ℃, 5% CO2 배양기(incubator)에서 4시간 배양하였다. 배양 후 용액을 완전히 제거하고 DMSO를 100μl씩 넣어 20분 동안 상온에서 배양(incubation)하여 세포를 lysis함과 동시에 살아있는 세포에 의해 생성된 자주색의 MTT 대사체(metabolite) (결정성)을 용해하였다. DMSO에 용해된 MTT 대사체의 양을 ELISA 플레이트 리더(plate reader)로 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
2. 실험 결과
(1) GIST에서의 ATF6 과발현 확인
정상 KIT 또는 돌연변이 KIT을 발현하는 여러 암종 (소세포폐암: H69, H128; 백혈병: ,H209, Kasumi-1, HMC-1; 대장암: K562, LS174T, Colo320DM, DLD-1, GIST: GIST430, GIST882)에서 ATF6는 GIST에서 특이적으로 과발현되지 않았으나, ATF6의 활성화 형태인 cleaved ATF6 (cATF6)의 경우에는 다른 암종에 비하여 GIST세포주에서 발현이 특이적으로 높은 것을 확인할 수 있었다(도 1A).
ATF6는 c-말단 부분(소포체 내강)과 N-말단 부분(세포질)으로 구성되는데, ATF6가 골지체로 이동한 후 N-말단 부분이 잘려 핵 내로 들어가게 되면 세포 생존, 사멸 및 성장에 관련된 유전자를 고절하여 암세포 사멸을 막는 것으로 알려져 있다. ATF6는 절단 ATF6(cATF6) 형태로 핵으로 이동하여야 활성화 되어있는 것으로 볼 수 있는데, ATF6는 GIST 세포주의 핵 내에 위치하고 있음을 공초점 형광 현미경 결과로도 확인할 수 있었다(도 1B).
GIST 환자에서도 ATF6가 핵 내 분포하며 과발현되어 있음을 조직 면역 염색 결과를 통해서도 확인할 수 있었다(도 1C).
(2) GIST 세포주에서 ER 스트레스에 따른 세포 사멸 관련 단백질 및 샤페론 단백질의 발현 확인
탑시가르긴(Thapsigargin) (TG, ER stress inducer)를 처리하여 약한-강한 ER 스트레스(mild to strong ER stress)를 유도하였을 때 0.1 uM의 약한 ER 스트레스의 경우 세포 사멸이 크게 증가하지 않지만 강한 ER 스트레스인 5 uM의 경우 세포 사멸이 크게 증가하였다(도 2A).
강한 ER 스트레스를 유도할 경우, ATF6 및 cATF6의 발현이 감소하며, 세포사멸 마커(cell death marker)인 CHOP이 증가한 것을 확인할 수 있었는데, 이는 GIST 세포가 강한 ER 스트레스는 견뎌낼 수 없음을 의미한다. 반면 ER 스트레스의 다른 신호전달경로(pathway)이며, 세포 사멸에 관여하는 것으로 알려진 PERK, IRE1a의 활성화형 (p-PERK, p-IRE1a) 경우 발현이 증가하여 세포 사멸을 유도하는 것을 알 수 있었다(도 2B).
약한 ER 스트레스를 유도할 경우, ATF6, cATF6의 발현이 초반에는 조금 감소하지만 결국 약한 ER 스트레스 정도는 24시간이 지나면 극복을 하고 세포 사멸 마커인 CHOP역시 증가하다 감소하는 양상을 보였다. 이러한 결과는 ATF6가 활성화될 경우에는 암세포가 ER 스트레스에 의해 사멸되는 것을 억제할 수 있음을 의미한다. 특히 ATF6에 의해 BIP, HSP90, GRP94, 등의 샤페론(chaperone) 단백질의 발현을 증가시켜 암세포 사멸을 막기위한 방어기전을 (잘못접힘 단백질 반응 기전, unfolded protein response) 작동시킨다는 사실도 확인할 수 있었다(도 2C).
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(3) ATF6 활성화 억제에 따른 ER 스트레스 및 잘못접힘 단백질 반응 기전에 미치는 효과 확인
세린 1 프로테아제 억제제 (Serine 1 protease inhibitor, S1Pi)는 ATF6의 절단(cleavage) 및 활성화를 억제하는데, 이를 GIST 세포에 처리해주면 ATF6 활성화 억제(cATF6 발현 억제), 하위 샤페론(chaperone) 발현 억제가 관찰된다(도 3A).
TG를 0.1 uM로 처리하여 약한 ER 스트레스를 유발한 경우에는 일반적으로 세포 사멸이 거의 이루어지지 않지만, S1Pi를 같이 처리할 경우에는 약한 ER 스트레스에서도 급격한 세포 사멸이 나타남을 확인하였다(도 3B).
TG 와 함께 SP1i 를 처리할 경우 ER 스트레스 유도에 따른 BIP, GRP94, HSP90 등의 ATF6 신호전달경로-의존 샤페론(ATF6 pathway dependent chaperone)의 발현 증가 타이밍이 많이 delay되는 것을 볼 수 있는데, 이는 ATF6 신호전달경로를 억제하면 암세포가 ER 스트레스에 적절히 대응하지 못하여 방어기전이 빠르게 작동하지 못해 세포사멸에 이르게 됨을 의미한다(도 3C).
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(4) ATF6 억제에 따른 HSP90 발현 및 KIT 발현 억제
ATF6에 의해 조절되는 샤페론 단백질 중 GIST 발생에 중요한 역할을 수행하는 KIT와 결합하는 샤페론 단백질을 확인하기 위해 GIST 세포주에 KIT 항체를 이용하여 면역침강법을 수행한 결과, ATF6에 의해 조절되는 샤페론인 HSP90가 돌연변이 KIT 단백질과 결합하고 있음을 확인할 수 있었다(도4). 이러한 결과는 ATF6를 억제하여 하위 신호전달체계에 위치한 샤페론의 발현이 억제되면, GIST의 발생원인 중 하나인 돌연변이 KIT 단백 역시 부수적으로 억제가 가능하여 강력한 항암 효과를 유도할 수 있음을 간접적으로 보여주는 결과이다. 실제로 ATF6를 억제하고, 그에 따른 HSP90 및 KIT의 발현수준 변화를 확인해본 결과, KIT 및 HSP90의 발현이 억제되었음을 확인할 수 있었다. 또한, HSP90의 저해제인 17AAG를 처리하여 HSP90을 억제한 경우에도 KIT 단백질의 발현이 감소되었음을 확인하였는데(도 5), 이러한 결과들를 종합해보면 HSP90를 조절하는 ATF6를 저해할 경우, HSP90가 억제되고 그에 따라 KIT 단백질의 발현까지 억제되는 것이 타당하다는 결론에 도달하게 된다.
(5) GIST 세포주에서의 ATF6 억제제 및 이마티닙의 병용투여 효과 확인
이마티닙(Imatinib)에 저항성을 보이는 세포주인 GIST430과 GIST430 세포에서 추가로 V654A 2차 돌연변이가 생긴 이마티닙(imatinib) 내성 세포주인 GISTS430(V654A)를 이용하여 세포 성장 평가 어세이 (MTT 어세이) 수행하였다.
종양 미세환경은 영양분 및 산소 부족과 같은 제약에 따라 ER 스트레스가 유도되는데, 탑시가르긴(Thapsigargin, TG)는 생체 내(in vivo)와 유사한 ER 스트레스 환경을 모사하기 위해 처리하는 것으로, 본 발명에서는 처리한 경우 (도 6)와 ATF6 억제제 자체의 효과를 확인하기 위해 처리하지 않은 경우(도 7)로 나누어 실험하였다.
결과적으로 TG를 처리하거나 처리하지 않은 두 경우 모두 ATF6 저해제(PF429242, 세아핀(Ceapin)A7, 멜라토닌(Melatonin)) 처리시 강력하게 세포사멸이 유도됨을 확인할 수 있었고, ER 스트레스 유도 물질(보르테조밉, 17AAG)만을 투여하였을 경우에도 강력한 세포사멸이 발생하였으며, ATF6 저해제와 ER 스트레스 유도 물질을 동시에 투여하였을 경우 강력한 종양 억제능 시너지를 확인하였다 (도 6 및 도 7). 특히 이러한 결과는 이마티닙에 대해 반응성을 보이거나 내성을 보이는 세포주에서 모두 확인한 것으로, ATF6를 저해하는 치료 접근법이 이마티닙에 대해 내성을 보이는 환자군에게 새로운 치료 옵션이 될 수 있음을 보여주는 것이며, 병용치료의 측면에서는 이마티닙(Imatinib)과 ATF6 저해제를 병용치료로 사용하면 이마티닙(Imatinib) 치료 효과를 보조 및 개선하여 치료 초기에 강력한 종양 억제능을 통해 근치적 치료법 개발이 가능할 것이다.
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(6) ATF6 발현과 생존확률과의 상관관계 확인
GIST 환자 50명로부터 얻은 조직을 ATF6 항체를 활용하여 면역 조직 화학 염색을 통해 ATF6의 핵발현 정도를 분석하였고 발현 유무에 따른 무병생존기간을 통계 분석한 결과 ATF6의 핵발현이 강할수록 무병생존기간이 짧아지는 경향성이 나타남을 확인하였다.

Claims (13)

  1. ATF6 억제제 및 티로신 키나제 억제제를 포함하는 위장관 기질종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 ATF6 억제제는 PF429242 및 세아핀(Ceapin) A7으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나이고,
    상기 티로신 키나제 억제제는 이마티닙인 것인, 약학 조성물.
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  6. 청구항 1에 있어서, 상기 티로신 키나제 억제제는 ATF6 억제제와 동시에 또는 순차적으로 투여되는, 위장관 기질종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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