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KR102637862B1 - 메소텔린을 표적으로 하는 암 백신 및 이의 용도 - Google Patents

메소텔린을 표적으로 하는 암 백신 및 이의 용도 Download PDF

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KR102637862B1
KR102637862B1 KR1020207019754A KR20207019754A KR102637862B1 KR 102637862 B1 KR102637862 B1 KR 102637862B1 KR 1020207019754 A KR1020207019754 A KR 1020207019754A KR 20207019754 A KR20207019754 A KR 20207019754A KR 102637862 B1 KR102637862 B1 KR 102637862B1
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South Korea
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nucleic acid
seq
amino acid
mesothelin
vaccine
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지안 얀
안나 슬래거
브래들리 가먼
닐 쿠치
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이노비오 파마수티컬즈, 인크.
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Publication date
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Abstract

변형된 공통 메소텔린 항원을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 본원에 개시된다. 변형된 공통 메소텔린 항원을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 벡터, 조성물 및 백신이 개시된다. 메소텔린-발현 종양을 가진 대상체를 치료하는 방법 및 메소텔린-발현 종양을 예방하는 방법이 개시된다. 변형된 공통 메소텔린 항원이 개시된다.

Description

메소텔린을 표적으로 하는 암 백신 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 12월 13일자로 출원된 미국 특허 가출원 62/598,289의 우선권 및 이익을 주장하며, 이 개시는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 2018년 12월 11일에 작성된, 상기 ASCII 사본은 104409_000444_sequence_listing.txt로 명명되었으며 크기는 8,223 바이트이다.
기술분야
본 발명은 메소텔린 항원 및 이를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 메소텔린 항원 및/또는 핵산 분자를 포함하는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 면역 반응을 유도하고 메소텔린-발현 암성 세포를 갖는 대상체를 예방 및/또는 치료하기 위해 백신을 사용하는 방법에 관한 것이다.
암은 미국 및 전 세계에서 주요 사망 원인으로 남아 있다. 암 백신 시장은 빠르게 성장하고 있다. 효과적인 종양 백신은 종양 성장을 예방하는데 유용할 수 있고/있거나 진행성 암 환자에 대한 표준 치료에 대한 보다 효과적이고, 독성이 적은 대안으로서 유용할 수 있다. 암과 관련된 항원 및, 따라서, 항-종양 백신의 표적은 메소텔린이다.
메소텔린은 두 생성물로 분열되는　71 kD　단백질이다:　30 kD　거핵구 강화　인자 및　41 kD　GPI-고정 막 결합 성숙 메소텔린. 　메소텔린의 기능은 알려져 있지 않지만, 최근 연구는 메소텔린이 난소 암 세포의 표면에서　또한 고도로 발현되는 MUC16에 결합함으로써 난소 암 전이에서 일정 역할을 할 수 있는 것으로 시사한다.　 메소텔린의 발현이 IHC에 의해 중증 난소 암의 82 내지 100%에서 관찰되었다. Hassan, R. European journal of cancer 44, 46-53 (2008); Ordonez, N. G. The American journal of surgical pathology 27, 1418-1428 (2003). 난소 암에서 이의　높은 발현뿐만 아니라 그의 종양 침습과의 관련성 때문에,　메소텔린은　매력적인　암　치료　백신　표적이다.
암의 치료와 예방을 위한 백신은 매우 관심이 있다. 종양 세포 항원을 표적으로 하는 기존 백신은 빈약한 생체 내 항원 발현에　의해 종종 제한된다. 따라서, 당업계에는 메소텔린을 발현하는 종양에 적용할 수 있음으로써, 이러한 암을 앓고 있는 대상체에 치료를 제공하고 생존을 증진시키는 안전하고 효과적인 백신의 개발이 필요하다.
하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 본원에서 제공된다: (a) 서열 번호 2의 아미노산 19-607을 암호화하는 핵산 서열;　(b)　서열 번호 2의 아미노산　19-607을 포함하는 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산　서열;　(c) 서열 번호 2의 아미노산 19-607과 적어도 96% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열;　및 (d)　서열 번호　2의 아미노산 19-607과 적어도 96% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산　서열.
하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 또한 본원에 제공된다: 서열 번호 1 뉴클레오티드 55-1821;　(b)　서열 번호 1의 뉴클레오티드 55-1821을 포함하는 핵산 분자의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (c) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 55-1821과 적어도 96% 동일한 단편;　및 (d) 서열　번호　1의　뉴클레오티드 55-1821과 적어도 96% 동일한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편.
하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 본원에 제공된다: (a) 서열 번호 2를 암호화하는 핵산 서열; (b) 서열 번호 2의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; (c) 서열 번호 2와 적어도 96% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 및 (d) 서열 번호 2와 적어도 96% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열.
하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 또한 본원에 제공된다: (a) 서열 번호 1;　(b) 서열 번호 1의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;　(c)　서열 번호 1과 적어도 96% 동일한 단편; 및 (d) 서열 번호 1과 적어도 96% 동일한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편. 일부 양태에서, 핵산 분자는 서열 번호　1에서 제시된 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 핵산 분자는 플라스미드. 또는 바이러스성 벡터와 같은, 벡터에 통합될 수 있다.　 본원에 기재된 핵산 분자는 플라스미드 또는　바이러스성 벡터와 같은, 벡터에 통합될 수 있다. 일부 양태에서, 벡터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 분자 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다: (a) 서열 번호 2의 아미노산 19-607을 암호화하는 핵산 서열;　(b)　서열 번호　2의 아미노산 19-607을 포함하는 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산　서열; (c) 서열 번호　2의 아미노산 19-607과 적어도 96% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 및 (d) 서열 번호 2의 아미노산 19-607과 적어도 96% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열.　추가의 양태에서, 벡터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 분자 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다: 서열 번호 1 뉴클레오티드 55-1821;　(b) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 55-1821을 포함하는 핵산 분자의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;　(c) 서열 번호　1의 뉴클레오티드 55-1821과 적어도 96% 동일한 단편; 및 (d)　서열 번호 1의 뉴클레오티드 55-1821과 적어도 96% 동일한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편. 또 다른　양태에서, 벡터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 분자 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다: (a) 서열 번호 2를 암호화하는 핵산 서열;　(b)　 서열 번호 2의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산　서열;　(c) 서열 번호 2와 적어도 96% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열;　및 (d)　서열 번호 2와 적어도 96% 동일한 단백질의 전체 길이의　적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열. 추가의 양태에서, 벡터는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 분자 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다: (a) 서열 번호　1;　(b)　서열 번호 1의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;　(c)　서열 번호 1과 적어도 96% 동일한　단편; 및 (d)　서열 번호 1과 96%가 동일한　핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편. 또 다른 양태에서, 벡터는 서열 번호 1에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 기재된 핵산은 조절 요소에 작동 가능하게 연결되어 있다.　 일부 양태에서, 조절 요소는 프로모터 및/또는 폴리아데닐화 신호이다.　 추가의 양태에서, 프로모터는 인간 시토메갈로바이러스 조기-발현 프로모터 (hCMV　프로모터)이다.　 또 다른 양태에서, 폴리아데닐화 신호는 소　성장 호르몬　폴리아데닐화 신호 (bGH　폴리A)이다.
본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 조성물이 본원에 또한 제공된다.　 일부 양태에서, 조성물은 약학적으로 허용되는　담체를　포함한다.
하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 항원성 단백질이 제공된다: (a) 서열 번호 2의 아미노산 19-607;　(b)　서열 번호 2의 아미노산 19-607을　포함하는 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (c) 서열 번호 2의 아미노산 19-607과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열;　및 (d)　서열 번호　2의 아미노산 19-607과 적어도 95% 동일한　아미노산 서열의 전체　길이의　적어도 90%를 포함하는 단편.
하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 항원성 단백질이 추가로 제공된다: (a) 서열 번호 2;　(b) 서열 번호 2의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;　(c) 서열 번호 2와 적어도 96% 동일한 아미노산　서열;　및 (c) 서열 번호 2와 적어도 96% 동일한 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편. 일부 양태에서, 단백질은 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열을 포함하는, 메소텔린 항원을 포함하는 백신이 또한 제공된다.　 일부 양태에서, 항원은 서열 번호　1에　의해 암호화된다.
또한 서열 번호 1에 제시된 핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 96% 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자인 핵산 분자를 포함하는 백신이 제공된다. 　또한 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 96% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 메소텔린 항원을 암호화하는 핵산 분자인 핵산 분자를 포함하는 백신이 본원에서 개시된다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 발현　벡터를　포함할 수 있다. 백신은 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.　 일부 양태에서, 백신은 보조제를 추가로 포함할 수 있다.　 특정 양태에서, 보조제는 IL-12, IL-15, IL-28, 또는　RANTES이다.
본원에서　메소텔린 항원을 포함하는 백신이 또한 제공되며, 여기서 항원은　서열 번호 2에 제시된　아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 치료학적 유효량의 백신을 투여하는 것을 포함하는, 메소텔린-발현 암성 세포를 가진 대상체를 치료하는 방법이 추가로 제공된다. 일부 양태에서, 투여는 전기천공 단계를 포함한다. 다른 양태에서, 투여는 대상체의 하나 이상의 부위에서 발생한다.
체액성 면역 반응을 유도하는데 효과적인 본원에 기술된 백신의 양을 투여하는 것을 포함하는, 메소텔린-발현 암성 세포에 대해 대상체를 백신 접종하는 방법이 또한 제공된다. 일부 양태에서, 투여는 전기천공 단계를 포함한다. 다른 양태에서, 투여는 대상체의 하나 이상의 부위에서 발생한다.
하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 또한 본원에서 제공된다: (a) 서열 번호 2를 암호화하는 핵산 서열; (b) 서열 번호 2의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; (c) 서열 번호 2와 적어도 96% 동일한 단백질을 코딩하는 핵산 서열; 및 (d) 의약로 사용하기 위해 서열 번호 2와 적어도 96% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열. 일부 양태에서, 본원에 기술된 핵산 분자는 암의 치료에서 의약로서 사용하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 핵산 분자는 의약의 제조에 사용하기 위한 것이다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 핵산 분자는 암 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 것이다.
하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 본원에 제공된다: (a) 서열 번호 1; (b) 서열 번호 1의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; (c) 서열 번호 1과 적어도 96% 동일한 단편; 및 (d) 서열 번호 1과 적어도 96% 동일한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편. 일부 양태에서, 핵산 분자는 의약로서 사용하기 위한 서열 번호 1에 제시된 핵산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 핵산 분자는 암 치료에서의 의약로서 용도를 위한 것이다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 핵산 분자는 의약의 제조에서의 용도를 위한 것이다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 핵산 분자는 암 치료를 위한 의약의 제조에서의 용도를 위한 것이다.
도 1은 메소텔린　돌연변이체의 생성을 예시한다.
도　2는 GPI-고정-메소텔린 단백질　전구체의 구조의 개략도이다.
도 3은　합성 공통　메소텔린의 개략도를　보여준다.
도 4는 변형　pVAXl의　백본 (pGX0001)의 도해이다.
도 5는　플라스미드　pGX1438의 도해이다.
도 6은 인간 횡문근육종 세포에서 합성 공통 메소텔린 항원 발현의 웨스턴 블랏을 보여준다.
도 7a 내지 7b는 본　개시의 양태를 사용하여　합성　공통 메소텔린의 면역원성을 예시한다.
도 8은 본　개시의 양태를 사용하는　유동 세포 분석 게이팅　전략을　예시한다.
도 9a 내지 9d는　pGX1430에 의해 유도된 세포 면역 반응을　예시한다. 도 9a는 항원 특이적 CD4+ T　세포 반응의　합성 공통 메소텔린 유도된 빈도를 보여준다. 도 9b는 항원 특이적 CD8+　T 세포 반응의　합성 공통 메소텔린 유도된 빈도를 보여준다. 도 9c는 합성 공통 메소텔린 특이적 CD4+ T 세포의 사이토카인 프로파일을 보여준다. 도 9d는　합성 공통 메소텔린 특이적 CD8+ T 세포의 사이토카인 프로파일을 보여준다.
도　10a 내지 10d는 합성 공통 메소텔린 특이적 T 세포의 세포 용해 가능성을 예시한다.　 도　10a는 항원　특이적 CD4+CD107a+ T 세포의 빈도를 보여준다. 도 10b는　항원　특이적 CD8+CD107a+ T 세포의　빈도를　보여준다. 도 10c는 합성 공통 메소텔린 특이적 CD4+CD107a+ T 세포의 사이토카인 프로파일을 보여준다. 도 10d는 합성 공통 메소텔린 특이적 CD8+CD107a+ T 세포의 사이토카인 프로파일을 보여준다.
도 11a 내지 11c는 본　개시의 양태를　사용하여　개별　NHP로부터의　메소텔린-　특이적 IFNγ　SFU/106 PBMC를　보여준다. 도 11a는　메소텔린　단독을 보여주고, 도 11b는 저용량의 IL-12 (0.04 mg)를 갖는 메소텔린을 보여주고, 도　11c는 고용량의 IL-12 (0.2　mg)를　갖는 메소텔린을 보여준다.
도 12a 내지 12c는 본　개시의 양태를　사용하여　평균 메소텔린-특이적 IFNγ　SFU/106 PBMC를　보여준다.　도 12a는 메소텔린　단독을　보여주고, 도 12b는 저용량의 IL-12 (0.04 mg)의 메소텔린을 보여주고, 도 12c는 고용량의 IL-12 (0.2　mg)를　갖는 메소텔린을 보여준다.
본 발명은 메소텔린 항원을 포함하는 백신에 관한 것이다. 메소텔린은 많은 종양에서 발현된다. 따라서, 백신은 암 또는 종양 발현 메소텔린에 대한 치료를 제공한다. 본 발명의 백신은　치료가 필요한 대상체의 암의 특정 예방 또는 치료를 위한 특정 암 항원의　임의의 조합을 제공할 수 있다.
재조합 암 항원의 핵산 및 이의 암호화된 아미노산 서열을 설계하는 한 가지 방법은 천연 암 항원의 전체 아미노산 서열에서 특정한 아미노산을 변화시키는 돌연변이를 도입하는 것이다. 돌연변이의 도입은 포유류 대상체, 및 바람직하게는 인간 또는 개 대상체에 걸쳐 보편적으로 적용될 수 없을 정도로 암 항원을 그렇게 많이 변경시키지 않지만, 생성된 아미노산 서열이 내성을 파괴하거나 또는 면역 반응을 생성하기 위해 외부 항원으로 간주되기에 충분히 변화시킨다. 다른 방식은 상응하는 천연 암 항원에 대해 적어도 85% 및 최대 99% 아미노산 서열 동일성; 바람직하게는 적어도 90% 및 최대 98% 서열 동일성; 보다 바람직하게는 적어도 93% 및 최대 98% 서열 동일성; 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 95% 및 최대 98% 서열 동일성을 갖는 공통 재조합 암 항원을 생성하는 것일 수 있다. 일부 경우에 재조합 암 항원은 그의 상응하는 천연 암 항원에 대해 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성이다. 천연 암 항원은 특정한 암 또는 암 종양과 정상적으로 연관된 항원이다. 암 항원에 따라, 암 항원의 공통 서열은 포유류 종에 걸쳐 또는 종의 아형 내에서 또는 바이러스 균주 또는 혈청형에 걸쳐 있을 수 있다. 일부 암 항원은 암 항원의 야생형 아미노산 서열과 크게 다르지 않다. 일부 암 항원은 종에 걸쳐 매우 다양한 핵산/아미노산 서열을 가지며, 공통 서열이 생성될 수 없다. 이러한 경우에, 상응하는 천연 암 항원에 대해 적어도 85% 및 최대 99% 아미노산 서열 동일성; 바람직하게는 적어도 90% 및 최대 98% 서열 동일성; 보다 바람직하게는 적어도 93% 및 최대 98% 서열 동일성; 또는 보다 더 바람직하게는 적어도 95% 및 최대 98% 서열 동일성을 갖는, 내성을 파괴하고 면역 반응을 생성하는 재조합 암 항원이 생성된다. 일부 경우에 재조합 암 항원은 상응하는 천연 암 항원에 대해 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 동일성이다. 상기 언급된 접근법은 최종 재조합 암 항원이 상기 논의된 바와 같은 천연 암 항원 아미노산 서열에 대해 퍼센트 유사성을 갖도록 조합될 수 있다.
메소텔린 항원은 부분적으로, 상이한 종으로부터의 메소텔린의 서열로부터 또는 종 내의 상이한 동형으로부터 유래된 공통 메소텔린 항원일 수 있고, 따라서 공통 메소텔린 항원은 비천연이다. 변형은 MUC16 결합 도메인 및/또는 GPI-고정 신호 결합에 대한 것의 돌연변이 및 메소텔린 항원의 N-말단에 대한 업스트림 코작 및 IgE 선도서열의 추가를 포함할 수 있다.
합성　메소텔린은　항원-특이적 T 세포 및/또는 높은 역가 항체 반응을 유도함으로써, 항원을 발현하는 암 또는 종양에 대해 지시되거나 또는 반응성인 면역 반응을 유도 또는 도출할 수 있다. 일부 구현예에서, 유도 또는 도출된 면역 반응은 세포성, 체액성, 또는 세포성 및 체액성 면역 반응 둘 다일 수 있다. 일부 구현예에서, 유도 또는 도출된 세포성 면역 반응은 인터페론-감마(IFN-γ) 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 유도 또는 분비를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 유도 또는 도출된 면역 반응은 항원을 발현하는 종양 또는 암의 성장을 촉진하는 하나 이상의 면역 저해 인자, 예를 들어, 비제한적으로, MHC 제시를 하향 조절하는 인자, 항원-특이적 조절 T 세포(Treg)를 상향 조절하는 인자, PD-L1, FasL, 사이토카인 예컨대 IL-10 및 TFG-β, 종양 연관 대식세포, 종양 연관 섬유아세포, 면역 저해 세포에 의해 생산된 가용성 인자, CTLA-4, PD-1, MDSC, MCP-1, 및 면역 관문 분자를 감소 또는 저해할 수 있다.
백신은 세포 및 체액성 면역 반응 둘 다의 자극을 증가시키기 위해 PD-1 및 PDL-1과 같은 관문 억제제에 대한 항체와 추가로 조합될 수 있다. 항-PD-1 또는 항-PDL-1 항체를 사용하면 PD-1 또는 PDL-1이 T-세포 및/또는 B-세포 반응을 억제하는 것을 방지할 수 있다. 전반적으로, 면역계에 의해 인식되는 암 항원을 설계함으로써 종양 세포에 의한 다른 형태의 면역 억제를 극복하는 데 도움이 되고, 이들 백신은 T-세포 및/또는 B-세포 반응을 추가로 증가시키기 위해 억제 또는 저해 요법 (예를 들어 항-PD-1 및 항-PDL-1 항체 요법)과 조합하여 사용될 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 충돌이 있을 경우, 정의를 포함하는, 본 문서가 우선한다. 바람직한 방법 및 재료는 하기에 기재되어 있지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전문이 참고로 포함된다. 본원에 개시된 재료, 방법 및 예시는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예들만을 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아니다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "포함하다(comprise(s))," "함유하다(include(s))," "가지는(having)," "가지다(has)," "할 수 있다(can)," "함유하다(contain(s))," 및 이의 변이는 추가 행위나 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형 과도적인 문구, 용어 또는 단어로 의도된다. 단수형 "a," "and" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 명시되지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 개시는 또한　명시적으로 제시되는지 여부에 관계없이, 본원에 제시된 양태 또는 요소를 "포함하는(comprising)," "~로 이루어지는(consisting of)' 및 "~로 본질적으로 이루어지는(consisting essentially of)," 다른 양태를 고려한다.
본원에서 수치 범위의 인용을 위해, 인용된 범위 최소 및 최대와 동일한 정도의 정밀도를 갖는 각각의 개재 값이 명시적으로　고려된다. 예를 들어, 6 내지 9의 범위에서, 6　및　9에 추가하여 숫자 7 및 8이 고려되고, 범위　6.0 내지 7.0에 대해,　숫자　6.0,　6.1,　6.2,　6.3,　6.4,　6.5,　6.6,　6.7, 6.8, 6.9 및 7.0이 명시적으로 고려된다.
본원에 사용된 "보조제"는 메소텔린　항원 및/또는 본원에 기재된　바와 같은 항원을 암호화하는 핵산 분자의 면역원성을 향상시키기 위해 본원에 기재된 백신에 첨가된 임의의 분자를 의미한다.
본원에 사용된 "항체"는　Fab, F(ab')2,　Fd, 및 단일　사슬　항체, 디아바디, 이중특이적 항체, 및 이의 유도체를　포함하는 클래스 IgG, IgM, IgA,　IgD　또는　IgE,　또는 이의 단편 또는 유도체의　항체를 의미한다. 항체는 원하는 에피토프 또는 이로부터 유래된 서열에　대한　충분한 결합 특이성을 나타내는, 포유동물의 혈청 샘플로부터 분리된 항체, 다클론성 항체,　친화성 정제된 항체 또는　이들의 임의의 혼합물일 수　있다.
"메소텔린　항원"은 하기를 지칭한다: 서열　번호 2의　아미노산 19-607을 포함하는 돌연변이된 메소텔린　아미노산 서열을 갖는 단백질; 서열 번호 2; 본원에 제시된 길이의 이의　단편, 변이체, 즉 본원에 제시된 바와 같은 서열 번호 2와 동일성을 갖는 서열을 가진 단백질, 본원에 제시된, 서열 번호 2 길이를 갖는 변이체의　단편; 본원에 제시된 길이의 이의　단편, 변이체, 즉 본원에 제시된 바와 같은 서열 번호 2와 동일성을 갖는 서열을 가진 단백질, 본원에 제시된 길이를 갖는 변이체의 단편, 및 이의 조합. 항원은 임의로 다른　단백질로부터의 것과 같은 신호 펩티드를 포함할 수　있다.
본원에 사용된 "코딩 서열" 또는 "암호화 핵산"은 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 (RNA 또는 DNA 분자)을 의미한다. 코딩 서열은　핵산이 투여되는 대상체 또는 포유류의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에　작동 가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "상보체" 또는 사용된 "상보적"은 핵산이 핵산　분자의 뉴클레오티드　또는 뉴클레오티드 유사체　사이의 왓슨-크릭 (예를 들어, A-T/U 및 C-G) 또는　훅스틴(Hoogsteen)　염기　쌍을 의미할 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 "공통" 또는 "공통 서열"은 상이한 유기체로부터 동일한 유전자에 대한 다수의 서열의 정렬 분석에 기초한 폴리펩티드 서열을 의미한다. 공통 폴리펩티드 서열을 암호화하는 핵산 서열이 제조될 수 있다. 공통 서열을 포함하는 단백질 및/또는 이러한 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 백신은 항원에 대해 광범위한 면역을 유도하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "정전류"는 동일한 조직으로 전달되는 전기 펄스의 지속기간 동안, 조직, 또는 상기 조직을 정의하는 세포에 의해 받거나 또는 경험한 전류를 기재한다. 전기 펄스는 본원에 기재된 전기천공법 장치로부터 전달된다. 본원에 제공된 전기천공법 장치는 바람직하게는 순간 피드백을 갖는 피드백 요소를 갖기 때문에, 이 전류는 전기 펄스의 수명에 걸쳐 상기 조직에서 일정한 암페어로 유지된다. 피드백 요소는 펄스의 지속시간 내내 조직(또는 세포)의 저항을 측정하고 전기천공법 장치가 전기 에너지 출력을 변경시켜(예를 들어, 전압 증가) 동일한 조직에서의 전류가 전기 펄스 전체에 걸쳐(마이크로초의 수준으로), 펄스에서 펄스로 일정하게 유지되도록 할 수 있다. 일부 구현예에서, 피드백 요소는 제어기를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "전류 피드백" 또는 "피드백"은 상호교환가능하게 사용될 수 있고 제공된 전기천공법 장치의 능동 반응을 의미할 수 있으며, 이는 조직에서 전극 사이의 전류를 측정하고 이에 따라 전류를 일정한 수준으로 유지하기 위해 EP 장치에 의해 전달된 에너지 출력을 변경하는 것을 포함한다. 이 일정한 수준은 펄스 연쇄 또는 전기 처리의 개시 전에 사용자에 의해 미리 설정한다. 피드백은 전기천공법 장치의 전기천공법 구성요소, 예를 들어, 제어기에 의해 달성될 수 있는데, 그 안에 있는 전기 회로가 조직에서 전극 사이의 전류를 계속해서 모니터링하고 그 모니터링된 전류(또는 조직 내의 전류)를 미리 설정한 전류와 비교하고 계속해서 에너지-출력 조정을 수행하여 모니터링된 전류를 미리 설정한 수준에서 유지할 수 있기 때문이다. 피드백 루프는 아날로그 폐쇄-루프 피드백이므로 순간적일 수 있다.
본원에 사용된 "분산 전류"는 본원에 기재된 전기천공 장치의 다양한 바늘 전극 어레이로부터 전달된 전류의 패턴을 의미할 수 있으며, 여기서 패턴은 전기천공되는 조직의 임의의 영역에서 전기천공 관련 열 스트레스의 발생을 최소화하거나 바람직하게 제거한다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 "전기천공", "전기-투과성" 또는 "전기-동력 향상"("EP")은 생체막에서 미세한 경로 (기공)를 유도하기 위한 막 횡단 전계 펄스의 사용을 의미하고; 이들의 존재는 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, siRNA, 약물, 이온, 및 물과 같은 생체 분자가 세포막의 한쪽에서 다른 쪽으로 통과할 수 있게 한다.
핵산 서열과 관련하여 본원에 사용된 "단편"은 본원에 개시된 항원과 교차 반응하는 포유동물에서 면역 반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 단편은 하기 제시된 단백질 단편을 암호화하는 다양한 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나로부터 선택된 DNA 단편일 수 있다. 단편은 하기 제시된 단백질 단편을 암호화하는 다양한 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나로부터 선택된 DNA 단편일 수 있다.　 단편은 첨가된 임의의 이종 신호 펩티드를 제외하고, 본원에 기재된 하나 이상의 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%,　적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%을 포함한다.　 일부 양태에서, 단편은 첨가된 임의의 이종 신호 펩티드를 제외하고, 하기 제시된 하나 이상의 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%,　적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%,　적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 단편은 임의의 이종 신호 펩티드를 제외하고, 본원에 기재된 하나 이상의 핵산 서열과 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일할 수 있다. 일부 양태에서, 단편은　첨가된 임의의 이종 신호　펩티드를　제외하고, 하기에 제시된 하나 이상의 핵산 서열과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일할 수 있다.
추가의 양태에서, 단편은 동일성 백분율을 계산할 때 포함되지 않는 이종 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 추가로 임의로 포함할 수 있다. 단편은 또한 면역글로불린 신호 펩티드와 같은 신호 펩티드, 예를 들어 IgE 또는 IgG 신호 펩티드에 대한 코딩 서열(coding sequence)을 포함할 수 있다. N 말단 메티오닌 및/또는 신호 펩티드를 암호화하는 코딩 서열은 코딩 서열의 단편에 연결될 수 있다.
일부 양태에서, 단편은 적어도 1500개 이상의 뉴클레오티드, 1510개 이상의 뉴클레오티드, 1520개 이상의 뉴클레오티드, 1530개 이상의 뉴클레오티드, 1540개 이상의 뉴클레오티드, 1550개 이상의 뉴클레오티드, 1560개 이상의 뉴클레오티드, 1570개 이상의 뉴클레오티드, 1580개 이상의 뉴클레오티드, 1590개 이상의 뉴클레오티드, 1600개 이상의 뉴클레오티드, 1610개 이상의 뉴클레오티드, 1620개 이상의 뉴클레오티드, 또는 1630개 이상의 뉴클레오티드, 1640개 이상의 뉴클레오티드, 1650개 이상의 뉴클레오티드, 1660개 이상의 뉴클레오티드, 1670개 이상의 뉴클레오티드, 1680개 이상의　뉴클레오티드, 1690개 이상의 뉴클레오티드, 1700개 이상의 뉴클레오티드, 1710개 이상의 뉴클레오티드, 1720개 이상의 뉴클레오티드, 1730개 이상의 뉴클레오티드, 1740개 이상의 뉴클레오티드, 1750개 이상의 뉴클레오티드, 1760개 이상의 뉴클레오티드, 1770개 이상의 뉴클레오티드, 1780개 이상의　뉴클레오티드, 1790개 이상의 뉴클레오티드, 1800개 이상의 뉴클레오티드, 1810개 이상의 뉴클레오티드, 또는 1820개 이상의 뉴클레오티드 또는 하기 제시된 하나 이상의 핵산 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
폴리펩티드 서열과 관련하여 "단편" 또는 "면역원성 단편"은 본원에 개시된 항원과 교차 반응하는 포유동물에서 면역 반응을 유발할 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 본원에 기재된 다양한 아미노산 서열 중 하나 이상으로부터 선택된 폴리펩티드 단편일 수 있다. 공통 단백질의 단편은 첨가된 임의의 이종 신호 펩티드를 제외하고, 공통 단백질의 전체 길이의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 단편은 첨가된 임의의 이종 신호 펩티드를 제외하고, 하기 제시된 하나 이상의 아미노 서열의 길이의 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 단편은 임의의 이종 신호 펩티드를 제외하고, 본원에 기술된 하나 이상의 아미노산 서열과 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일할 수 있다. 일부 양태에서, 단편은 첨가된 임의의 이종 신호 펩티드를 제외하고, 하기 제시된 하나 이상의 아미노산 서열과 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일할 수 있다
추가의 양태에서, 단편은 동일성　백분율을 계산할 때 포함되지 않는 이종 신호 펩티드를 암호화하는 서열을 추가로 임의로 포함할 수　있다.　 단편은 면역글로불린 신호 펩티드와 같은　신호 펩티드, 예를 들어　IgE　또는 IgG 신호　펩티드를　추가로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 공통 단백질의 단편은 본원에 개시된 단백질 서열의 적어도 546개 이상의 아미노산, 547개 이상의 아미노산, 548개 이상의 아미노산, 549개 이상의 아미노산, 550개 이상의 아미노산, 551개 이상의 아미노산, 552개 이상의 아미노산, 553개 이상의 아미노산, 554개 이상의 아미노산, 555개 이상의 아미노산, 556개 이상의 아미노산, 557개 이상의 아미노산, 558개 이상의 아미노산, 559개 이상의 아미노산, 560개 이상의 아미노산, 561개 이상의 아미노산, 562개 이상의 아미노산, 563개 이상의 아미노산, 564개 이상의 아미노산, 565개 이상의 아미노산, 566개 이상의 아미노산, 567개 이상의 아미노산, 568개 이상의 아미노산, 569개 이상의 아미노산, 570개 이상의 아미노산, 571개 이상의 아미노산, 572개 이상의 아미노산, 573개 이상의 아미노산, 574개 이상의 아미노산, 575개 이상의 아미노산, 576개 이상의 아미노산, 577개 이상의 아미노산, 578개 이상의 아미노산, 579개 이상의 아미노산, 580개 이상의 아미노산, 581개 이상의 아미노산, 582개 이상의 아미노산, 583개 이상의 아미노산, 584개 이상의 아미노산, 585개 이상의 아미노산, 586개 이상의 아미노산, 587개 이상의 아미노산, 588개 이상의 아미노산, 589개 이상의 아미노산, 590개 이상의 아미노산, 591개 이상의 아미노산, 592개 이상의 아미노산, 593개 이상의 아미노산, 594개 이상의 아미노산, 595개 이상의 아미노산, 596개 이상의 아미노산, 597개 이상의 아미노산, 598개 이상의 아미노산, 599개 이상의 아미노산, 600개 이상의 아미노산, 601개 이상의 아미노산, 602개 이상의 아미노산, 603개 이상의 아미노산, 604개 이상의 아미노산, 605개 이상의 아미노산, 606개 이상의 아미노산, 607개를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 작제물"은 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 코딩 서열은 핵산 분자가 투여되는 대상체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "발현 가능한 형태"는 대상체의 세포에 존재하는 경우, 코딩 서열이 발현될 때 단백질을 암호화하는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 필요한 조절 요소를 함유하는 유전자 작제물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "상동성"은 상보성 정도를 지칭한다. 부분적 상동성 또는 완전한 상동성(즉, 동일성)이 있을 수 있다. 완전히 상보적인 서열이 표적 핵산으로 혼성화하는 것을 적어도 부분적으로 억제하는 부분 상보적 서열은 기능 용어 "실질적으로 상동"을 사용하여 지칭된다. cDNA 또는 게놈 클론과 같은 이중-가닥 핵산 서열과 관련하여 사용될 때, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 상동"은 낮은 엄격도의 조건 하에 이중-가닥 핵산 서열의 가닥에 혼성화할 수 있는 프로브를 지칭한다. 단일-가닥 핵산 서열과 관련하여 사용될 때, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 상동"은 낮은 엄격도의 조건 하에 단일-가닥 핵산 주형 서열에 혼성화할 수 있는(즉, 이의 상보체인) 프로브를 지칭한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 "동일한" 또는 "동일성"은 서열이 명시된 영역에 걸쳐 동일하게 있는 명시된 백분율의 잔기를 가짐을 의미한다. 백분율은 2개의 서열을 최적으로 정렬하고, 명시된 영역에 걸쳐 2개의 서열을 비교하고, 두 서열에서 동일한 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치하는 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 명시된 영역의 총 위치의 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 2개의 서열의 길이가 상이하거나 또는 정렬이 하나 이상의 엇갈린 단부를 생산하고 명시된 비교 영역이 단일 서열만을 포함하는 경우에, 단일 서열의 잔기는 분모에 포함되지만 계산 분자에는 포함되지 않는다. DNA 및 RNA를 비교할 때, 티민(T) 및 우라실(U)은 등가물로 간주될 수 있다. 동일성은 수동으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.
본원에 사용된 "임피던스"는 피드백 메커니즘을 논의할 때 사용될 수　있고 옴의 법칙에 따라 전류 값으로 전환될 수　있으며, 따라서 미리 설정된　전류와의 비교를 가능하게 한다.
본원에 사용된 "면역 반응"은　항원의 도입에 반응하여 숙주의 면역계, 예를 들어 포유동물의 면역계의 활성화를 의미한다. 면역 반응은 세포성 또는 체액성 반응 또는,　둘 다의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 함께 공유적으로 연결된 적어도 2개의 뉴클레오티드를 의미한다. 단일 가닥의 묘사는 또한 상보적 가닥의 서열을 정의한다. 따라서, 핵산은 또한 도시된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포함한다. 핵산의 많은 변이체는 주어진 핵산과 동일한 목적으로 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 상보체를 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화하는 프로브를 포함한다.
핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 또는 이중 가닥 및 단일 가닥 서열　둘 다의 일부를 함유할 수 있다. 핵산은 DNA, 게놈과 cDNA 둘 모두, RNA 또는 하이브리드일 수 있으며, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 사이토신, 구아닌, 이노신, 크산틴 하이포크산틴, 이소사이토신 및 이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.
본원에 사용된 "작동 가능하게 연결된"은 유전자의 발현이 공간적으로 연결된　프로모터의 제어 하에 있음을 의미한다. 프로모터는　그의 제어 하에 유전자의　5'　(업스트림) 또는　3'　(다운스트림)에　위치될 수 있다. 프로모터와 유전자 사이의 거리는 프로모터가 유래되는 유전자에서 해당 프로모터와 해당 프로모터가 제어하는 유전자 사이의 거리와 대략 동일할 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, 이 거리의 변동은 프로모터 기능의 상실 없이 수용될 수 있다.
본원에 사용된 "펩티드", "단백질" 또는 "폴리펩티드"는 아미노산의 연결된 서열을 의미할 수 있으며, 천연, 합성, 또는 천연 및 합성의 변형 또는 조합일 수 있다.
본원에 사용된 "프로모터"는 세포에서 핵산의 발현을 부여, 활성화 또는 향상시킬 수 있는 합성 또는 천연 유래 분자를 의미한다. 프로모터는 발현을 추가로 향상시키고/시키거나 세포에서 핵산의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경시키기 위해 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 원위 인핸서 또는 억제자 요소를 포함할 수 있으며, 이는 전사 시작 부위로부터 수천 개 정도의 염기 쌍에 위치할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 세균, 진균, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는　발현이 일어나는　세포,　조직 또는 기관에 대해, 또는 발현이 발생하는 발달 단계에 대해 또는 생리적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제와 같은 외부 자극에 반응하여　유전자 구성 요소의 발현을 구성적으로 또는 차등적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예시는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 작동자-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 조기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 조기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 CMV IE 프로모터 및 인간 시토메갈로 바이러스 조기-발현 프로모터 (hCMV)를　포함한다.　 특정 양태에서, 프로모터는　hCMV　프로모터이다.
"신호 펩티드" 및 "선도 서열"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며 본원에　제시된 단백질의 아미노산 말단에　연결될 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 신호 펩티드/선도 서열은 전형적으로 단백질의 국소화를 지시한다. 본원에 사용된 신호 펩티드/선도 서열은 바람직하게는 단백질이 생산되는 세포로부터 단백질의 분비를 촉진시킨다. 신호 펩티드/선도 서열은 종종 세포로부터 분비시, 종종 성숙 단백질로 지칭되는, 나머지 단백질로부터 절단된다. 신호 펩티드/선도 서열은 단백질의 아미노 말단 (즉, N 말단)에 연결된다.
본원에 사용된 바와 같은 "엄격한 혼성화 조건"은 제1 핵산 서열(예를 들어, 프로브)이 예컨대 핵산의 복합 혼합물에서 제2 핵산 서열(예를 들어, 표적)에 혼성화하는 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고 상이한 상황에서 다를 것이다. 엄격한 조건은 정의된 이온성 강도 pH에서 특이적 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5-l0℃ 낮도록 선택될 수 있다. Tm은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형시 표적 서열과 혼성화하는 온도(정의된 이온성 강도, pH, 및 핵 농도하)일 수 있다(표적 서열이 과도하게 존재함에 따라, Tm에서, 프로브의 50%가 평형시 점유된다). 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 나트륨 이온 미만, 예컨대 약 0.01-1.0 M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고 온도가 짧은 프로브(예를 들어, 약 10-50개 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 30℃ 및 긴 프로브(예를 들어, 약 50개 뉴클레오티드 초과)에 대해 적어도 약 60℃인 것들일 수 있다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 탈안정화제를 첨가하여 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양의 신호는 배경 혼성화의 적어도 2 내지 10배일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은 다음을 포함한다: 50% 포름아미드, 5x SSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션, 또는, 5x SSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션, 65℃에서 0.2x SSC, 및 0.1% SDS에서 세척.
본원에 사용된 "대상체"는 본원에 기술된 백신으로 접종되기를 원하거나 접종이 필요한 포유동물을 의미할 수 있다. 포유동물은 인간, 침팬지와 같은 비인간 영장류, 개, 고양이, 말, 소, 마우스, 또는 랫트일 수 있다.
본원에 사용된 "실질적으로 상보적"은 제 1 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐 제 2 서열의 상보체와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 또는 2개의 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "실질적으로 동일한"은 제1 및 제2 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 또는 핵산에 관하여, 제1 서열이 제2 서열의 상보체에 실질적으로 상보적인 경우를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 "치료하다", "치료", 또는 "치료하는"은 질환을 예방, 저해, 억제, 또는 완전히 제거하는 수단을 통해 질환으로부터 동물을 보호하는 것을 의미할 수 있다. 질환을 예방하는 것은 질환의 발병 전에 본 발명의 백신을 동물에 투여하는 것을 수반한다. 질환을 저해하는 것은 질환의 도입 후이지만 질환의 임상 출현 전에 본 발명의 백신을 동물에 투여하는 것을 수반한다. 질환을 억제하는 것은 질환의 임상 출현 후에 본 발명의 백신을 동물에 투여하는 것을 수반한다.
핵산과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오티드 서열의 일부 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부의 상보체; (iii) 참조된 핵산 또는 이의 상보체와 실질적으로 동일한 핵산; 또는 (iv) 엄격한 조건 하에 참조된 핵산, 이의 상보체, 또는 그와 실질적으로 동일한 서열을 혼성화하는 핵산을 의미한다.
펩티드 또는 폴리펩티드와 관련하여 본원에 사용된 "변이체"는 아미노산의 삽입, 결실 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 다르지만 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 아미노산 서열을 갖는 참조된 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 아미노산을 유사한 특성 (예를 들어, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)의 다른 아미노산으로 대체하는 것은 당업계에서 전형적으로 사소한 변화를 수반하는 것으로 인식된다. 이들 사소한 변화는, 당업계에서 이해되는 바와 같이, 아미노산의 소수성 지표(hydropathic index)를 고려함으로써, 부분적으로, 확인될 수 있다. Kyte et al, J. Mol. Biol. 157: 105-132(1982). 아미노산의 소수성 지표는 소수성 및 전하의 고려에 기초한다. 유사한 소수성 지표의 아미노산이 치환되고 여전히 단백질 기능을 유지할 수 있음이 당업계에 알려져 있다. 일 측면에서, ±2의 소수성 지표를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 유지하는 단백질을 초래하는 치환을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 펩티드의 맥락에서 아미노산 친수성의 고려는 항원성 및 면역원성과 널리 상관관계가 있는 것으로 보고된 바 있는 유용한 척도인, 해당 펩티드의 가장 큰 국부 평균 친수성의 계산을 허용한다. 본원에 참조로 완전히 포함된, 미국 특허 번호 제4,554,101호. 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은 당업계에서 이해되는 바와 같이, 생물학적 활성, 예를 들어 면역원성을 유지하는 펩티드를 초래할 수 있다. 치환은 서로 ±2 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산으로 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지표 및 친수성 값 둘 다는 해당 아미노산의 특정한 측쇄에 의해 영향을 받는다. 해당 관찰과 일치하게, 생물학적 기능과 호환되는 아미노산 치환은 소수성, 친수성, 전하, 크기, 및 다른 특성에 의해 나타낸 바와 같이, 아미노산의 상대적 유사성, 특히 그러한 아미노산의 측쇄에 의존하는 것으로 이해된다.
변이체는 전체 유전자 서열 또는 이의 단편의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일한 핵산 서열일 수 있다. 핵산 서열은 유전자 서열 또는 이의 단편의 전체 길이에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다. 변이체는 아미노산 서열 또는 이의 단편의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 아미노산 서열 또는 이의 단편의 전체 길이에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일할 수 있다.
본원에 사용된 "벡터"는 복제 기점을 함유하는 핵산 서열을　의미한다. 벡터는 바이러스 벡터, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다.　 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다.　 벡터는 자기 복제 염색체외 벡터일 수 있고, 바람직하게는 DNA 플라스미드이다. 　벡터는 하나 이상의 이종성 핵산　서열을　함유하거나 포함할 수 있다.
백신
본원에 기재된 바와 같은 메소텔린 항원 또는 메소텔린 항원을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 백신이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 백신은　본원에 기재된　메소텔린 항원을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 백신은 서열 번호 2의 아미노산 19-607을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자; 서열 번호 2의 아미노산 19-607을 포함하는 단백질의 전체 길이의　적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산　서열; 서열 번호 2의 아미노산 19-607과 적어도 96% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 및/또는 서열 번호 2의 아미노산 19-607과 적어도 96% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산　서열을 포함한다.
일부 양태에서, 백신은 서열 번호 2를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자; 서열 번호 2의 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; 서열 번호 2와 적어도 96% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 및/또는 서열 번호　2와　적어도 96% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산　서열을 포함한다.
일부 양태에서, 백신은 서열　번호 1 뉴클레오티드 55-1821을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 55-1821을 포함하는 핵산 분자의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 55-1821과 적어도 96% 동일한 단편; 및/또는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 55-1821과 적어도 96% 동일한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 포함한다.
일부 양태에서, 백신은 서열 번호 1을 포함하는 하나 이상의 핵산 분자; 서열 번호 1의 전체 길이의　적어도 90%를 포함하는 단편; 서열 번호 1과 적어도 96% 동일한 단편; 및/또는 서열 번호　1과 적어도 96% 동일한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 포함한다.
일부 양태에서, 백신은 MUC16 항원을 포함하고, 여기서 항원은 서열 번호 2의 아미노산 19-607;　서열 번호 2의 아미노산 19-607을 포함하는 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편;　서열 번호 2의 아미노산 19-607과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열;　및/또는 서열 식별 번호 2의 아미노산 19-607과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열의　전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 포함한다.
일부 양태에서, 백신은 MUC16 항원을 포함하고, 여기서 항원은 서열 번호 2;　서열 번호 2의 길이의 90%를　포함하는 단편; 서열 번호 2와 적어도 96% 동일한 아미노산 서열;　및/또는 서열 번호 2와 적어도 96% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 포함한다.
백신은　대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 생성할 수 있다.　 면역 반응은 치료 또는 예방 면역 반응일 수 있다.　 백신은 암, 예를 들어 암 또는 메소텔린-발현 종양에 대해 보호하기 위해 사용될 수 있다.　 백신은 이를 필요로 하는 대상체에서 메소텔린-발현 종양을 예방 및/또는 치료하는데 사용될 수 있다.　 백신은 메소텔린에 대해 및 메소텔린-발현 종양에 대해 세포성 및/또는 항체 반응을 유도할 수 있다. 　하나의 양태에서, 백신은 메소텔린을 발현하는 난소 암 세포, 구체적으로 메소텔린을 발현하는 상피 난소 암 세포, 보다 구체적으로는 메소텔린을　발현하는 장액성　난소 암 세포에 대한 보호, 예방 및/또는 치료하기 위해, 또는 세포성 및/또는 항체 반응을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 암 백신의 개발은 면역 시스템에 의해 인식되지 않고 비정상적으로　발현된 자가-항원인　암 항원, 예를 들어　메소텔린을 식별하는 것을 포함한다. 식별된 암 항원은 면역계에 의해 인식되도록　자가　항원에서 외래 항원으로　변경된다. 자가로부터 외래 항원으로의 재조합 암 항원의 핵산 및 아미노산의 재설계는 면역계에 의한 항원의 내성을 파괴한다. 내성을 파괴하기 위해, 여러 재설계 조치가 하기에 기술된 바와 같이 암 항원에 적용될 수 있다.
백신의 재조합 암 항원은 자기 인식되지 않아서, 내성을 파괴한다. 내성의 파괴는 항원-특이적 T 세포 및/또는 높은 역가 항체 반응을 유도해서, 항원을 발현하는 암 또는 종양에 대해 지시되거나 또는 반응성인 면역 반응을 유도 또는 도출할 수 있다. 일부 구현예에서, 유도 또는 도출된 면역 반응은 세포성, 체액성, 또는 세포성 및 체액성 면역 반응 둘 다일 수 있다. 일부 구현예에서, 유도 또는 도출된 세포성 면역 반응은 인터페론-감마(IFN-γ) 및/또는 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)의 유도 또는 분비를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 유도 또는 도출된 면역 반응은 항원을 발현하는 종양 또는 암의 성장을 촉진하는 하나 이상의 면역 저해 인자, 예를 들어, 비제한적으로, MHC 제시를 하향 조절하는 인자, 항원-특이적 조절 T 세포(Treg)를 상향 조절하는 인자, PD-L1, FasL, 사이토카인 예컨대 IL-10 및 TFG-β, 종양 연관 대식세포, 종양 연관 섬유아세포, 면역 저해 세포에 의해 생산된 가용성 인자, CTLA-4, PD-1, MDSC, MCP-1, 및 면역 관문 분자를 감소 또는 억제할 수 있다.
백신은 DNA 백신일 수 있다. DNA 백신은 본원에 참조로서 전체가 포함된, 미국　특허 번호 5,593,972, 5,739,118, 5,817,637, 5,830,876, 5,962,428, 5,981,505, 5,580,859, 5,703,055, 및 5,676,594에 개시되어 있다. 일부 양태에서,　핵산 분자는 발현 벡터를 포함할 수 있다. 　DNA 백신은 염색체 내로의 통합을 억제하는 요소 또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
백신은 암 항원을 암호화하는 RNA를 포함할 수 있다.　 RNA 백신은　세포　내로 도입될 수　있다.
백신은 약독화 생백신, 항원, 서브유닛 백신 및 당단백질 백신을 전달하기 위해 재조합 벡터를 사용하는 백신, 예를 들어 각각 본원에 참조로 포함된, 미국 특허　번호 4,510,245; 4,797,368; 4,722,848; 4,790,987; 4,920,209; 5,017,487; 5,077,044; 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,223,424; 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548; 5,310,668; 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5,453,364; 5,462,734; 5,470,734; 5,474,935; 5,482,713; 5,591,439; 5,643,579; 5,650,309; 5,698,202; 5,955,088; 6,034,298; 6,042,836; 6,156,319 및 6,589,529에 기술된 백신에 제한되지 않는 백신일 수 있다.
일부 양태에서, 핵산 백신은 분자　보조제를　추가로 포함할 수 있고, 일부 경우에 분자 보조제는 IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33, 및/또는 RANTES일 수 있으며, 일부 경우에 분자 보조제는 항-세포 독성 T-림프구 항원 4 (CTLA-4), 항-예정 사멸 수용체-1 (PD-1) 및 항-림프구-활성화 유전자 (LAG-3)를 포함하는, 관문 억제제이다. IL-12, IL-15, IL-28, 및/또는 RANTES에　대한 코딩 서열은 하나 이상의 항원에 대한 코딩 서열을　포함하는 하나 이상의 핵산 분자에 함유될 수 있다. IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33, 및/또는 RANTES에 대한 코딩 서열은 동일한 플라스미드에서와 같은 핵산 백신에 의해 암호화될 수 있거나, 이들은 별도의　플라스미드와 같은　별개 핵산　분자에 포함될 수 있다.
본 발명의 백신은 백신 자체가 안전하여 질환 또는 사망을 유발하지 않고;　질환에 대해 예방적이며;　중화　항체를　유도하고; 보호 T 세포 반응을 유도하며;　그리고　투여 용이성, 적은 부작용, 생물학적 안정성 및 용량 당 저비용을 제공하는 것과 같은 효과적인 백신에 요구되는 특징을 가질 수 있다. 백신은 하기 논의된 바와 같이 암 항원을 함유함으로써 이들 특징 중 일부 또는 전부를 달성할 수 있다.
백신은 하나　이상의　면역 관문 분자의 하나 이상의 억제제(즉, 면역 관문 억제제)를　추가로 포함할 수 있다. 면역 관문 분자는 아래에 보다 상세하게 기술되어 있다.　 면역 관문 억제제는 MHC 클래스 제시, T 세포 제시 및/또는 분화, B 세포 제시 및/또는 분화, 임의의 사이토카인, 케모카인 또는 면역 세포 증식 및/또는 분화를 위한 신호 전달과 같은 면역계의 임의의 성분의 억제를 방지하는 임의의 핵산 또는 단백질이다. 또한 하기에 보다 상세히 기술하는 바와 같이, 백신은 세포 및 체액성 면역 반응 둘 다의 자극을 증가시키기 위해 PD-1 및 PDL-1과 같은 관문 억제제에 대한 항체와 추가로 조합될 수 있다. 항-PD-1　또는　항　PDL-1 항체를 사용하면 PD-1 또는 PDL-1이 T-세포 및/또는 B-세포　반응을 저해하는 것을 방지할 수　있다.
항원
전술한 바와 같이, 백신은 항원 또는 항원을 암호화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 항원은 메소텔린, 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이들의 조합일 수 있다.
메소텔린은　두 개의 생성물로 절단되는 71 kD　단백질이다: 30 kD　거핵구 강화 인자 및 41 kD　GPI 고정 막 결합 성숙 메소텔린.　 메소텔린의 기능은 알려져 있지 않지만, 최근 연구에 따르면　메소텔린은 난소 암 세포 표면에서 고도로 발현되는, MUC16에 결합함으로써 난소 암 전이에 역할을 할 수 있다.　 메소텔린의　발현은 IHC에 의해 장액성 난소 암종의 82 내지 100%에서 관찰되었다. Hassan, R. European journal of cancer 44, 46-53 (2008); Ordonez, N. G. The American journal of surgical pathology 27, 1418-1428 (2003).
따라서, 백신은 메소텔린-발현 암 또는 종양을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다.　 일부 양태에서, 암은 난소 암이다.　 메소텔린　항원은 천연의 "정상적인" 메소텔린과 다를 수 있으며, 따라서　메소텔린　항원-발현 종양에 대한　치료 또는　예방을 제공한다. 따라서, 천연 메소텔린 유전자와 다른 메소텔린 항원 서열 (즉, 재조합 또는 돌연변이된 메소텔린 유전자 또는 서열)이　본원에 제공된다.
전술한 이종 서열을 포함하는　핵산　분자가 제공된다. 전술한 이종 서열로 이루어진 핵산 분자가 제공된다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다: (a) 서열 번호 1 뉴클레오티드 55-1821; (b) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 55-1821을　포함하는 핵산 분자의 전체 길이의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함하는　단편; (c) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 55-1821과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 단편; 및 (d) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 55-1821과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함하는　단편. 일부 양태에서, 핵산 분자는　하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다: (a) 서열 번호 1; (b) 서열 번호 1 전체　길이의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함하는　단편; (c) 서열 번호 1과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 단편; 및 (d) 서열 번호 1과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편. 일부 양태에서, 핵산 분자는 서열 번호 1에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
메소텔린 항원을 암호화하는 핵산 서열이 본원에서 제공된다. 일부 양태에서, (a) 서열 번호 2의 아미노산 19-607을 암호화하는 핵산 서열; (b) 서열 번호 2의 아미노산 19-607을 포함하는 단백질의 전체 길이의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; (c) 서열 번호 2의 아미노산 19-607과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 및 (d) 서열 번호 2의 아미노산 19-607과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열로부터 선택된 하나 이상의 핵산을 포함하는 핵산 분자 일부 양태에서, (a) 서열 번호 2를 암호화하는 핵산 서열; (b) 서열 번호 2의 전체 길이의　적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열; (c) 서열 번호 2와 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열; 및 (d) 서열 번호 2와 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 단백질의 전체 길이의 적어도 90%를 포함하는 단편을 암호화하는 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다.
상기 기재된 이종 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자는 하기 기술된 바와 같은 벡터, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 벡터 및 다른 형태의 핵산 분자에 도입될 수 있다.
상기 기재된 이종 아미노산 서열을 포함하는 단백질 분자가 제공된다. 상기 기재된 이종 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분자가 제공된다. 상기 기재된 서열을　갖는 단백질 및 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 단백질 및 폴리펩티드는 메소텔린 항원 및 메소텔린 면역원으로 지칭될 수 있다. 메소텔린 항원은 메소텔린 항원을 발현하는 종양에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다. 일부 양태에서, 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다: (a) 서열 번호 2의 아미노산 19-607; (b) 서열 번호 2의 아미노산 19-607을 포함하는 단백질의 전체 길이의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함하는 단편; (c) 서열 번호 2의 아미노산 19-607과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열; 및 (d) 서열 번호 2의 아미노산 19-607과 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함하는 단편. 일부 양태에서, (a) 서열 번호 2; (b) 서열 번호 2의 전체 길이의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함하는 단편; (c) 서열 번호 2와 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열; 및 (c) 서열 번호 2와 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열의 전체 길이의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함하는 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 제공된다. 일부 양태에서, 단백질은　서열 번호　2에　제시된 아미노산 서열을　포함한다.
한 측면에서, 공통 항원은 다음 중 하나 이상을 갖는 것을 포함하는, 개선된 전사 및 번역을 제공하는 것이 바람직하다: 전사를 증가시키는 낮은 GC 함량 선도 서열; mRNA 안정성 및 코돈 최적화; 및 가능한 한, 시스-작용 서열 모티프 (즉, 내부　TATA-박스)의 제거.
메소텔린 항원은 둘 이상의 종으로부터 유래된 공통 항원 (또는 면역원) 서열일 수 있다. 메소텔린 공통 항원은 MUC-16 결합 도메인에서 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 하나 이상의 돌연변이는 티로신의 알라닌으로의 치환을 초래하는 핵산 돌연변이를 포함할 수 있다. 하나 이상의 돌연변이는 GPI-고정 신호에서 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 하나 이상의 돌연변이는 세린을 트레오닌으로 및/또는 트레오닌을 발린으로 치환하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 하나 이상의 돌연변이는 메소텔린 MUC16 결합 및/또는 GPI-고정 신호에서 1, 2 또는 3개의 아미노산을 교체할 수 있다.
메소텔린 항원은 개선된 발현을 위한 변형을 포함할 수 있다. 변형은 코돈 최적화, RNA 최적화, 증가된 번역　개시를 위한 코작　서열　(예를 들어, GCC ACC)의 첨가 및/또는 메소텔린　항원의 면역원성을 증가시키기 위한 면역글로불린 선도 서열의 첨가를 포함할 수 있다. 메소텔린 항원은 예를 들어 면역글로불린 E (IgE) 또는 면역글로불린 G (IgG) 신호　펩티드에 제한되지 않는, 면역글로불린 신호 펩티드와 같은 신호 펩티드를 포함할 수 있다.
면역 관문 억제제와 조합된 백신
백신은 하나 이상의 면역 관문 분자의 하나 이상의 억제제 (즉, 면역 관문 억제제)를 추가로 포함할 수 있다. 면역 관문 분자는 이하에 더욱 상세히 기재되어 있다.　 면역 관문 억제제는 MHC 클래스 제시, T 세포 제시 및/또는 분화, B 세포 제시　및/또는 분화, 임의의 사이토카인, 케모카인 또는 면역 세포 증식 및/또는 분화에 대한 신호 전달과 같은 면역계의 임의의 성분의 억제를 방지하는 임의의 핵산 또는 단백질이다.
이러한 억제제는 핵산 서열, 아미노산 서열, 소분자, 또는 이의 조합일 수 있다. 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 조합일 수 있다. 핵산은 또한　펩티드 결합에　의해 면역 관문 억제제에 연결된 링커 또는 태그 서열을 암호화하는 추가 서열을 포함할 수 있다. 소분자는 저 분자량, 예를 들어, 800 달톤 미만, 효소 기질, 단백질 또는 핵산에 의해 결합된 리간드 (또는 이의 유사체), 또는 생물학적　과정의　조절제로서 작용할 수 있는 유기 또는 무기 화합물일 수 있다. 아미노산 서열은 단백질, 펩티드, 이의 변이체, 이의 단편, 또는　이의 조합일 수 있다.
일부 양태에서, 면역 관문 억제제는 항체, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 조합을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열일 수 있다. 다른 양태에서, 면역 관문 억제제는 항체,　이의 변이체, 이의 단편, 또는　이의　조합일 수 있다.
a. 면역 관문　분자
면역 관문 분자는 핵산 서열, 아미노산 서열, 소분자, 또는 이의 조합일 수 있다. 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이의 변이체, 이의 단편, 또는　이의　조합일 수 있다. 핵산은 또한　펩티드 결합에 의해 면역 관문 억제제에 연결된　링커 또는 태그 서열을 암호화하는 추가 서열을 포함할 수 있다. 소분자는 효소 기질, 단백질 또는 핵산에 의해 결합된 리간드(또는 이의 유사체), 또는 생물학적 과정의 조절기로서 작용할 수 있는 저분자량, 예를 들어, 800 달톤 미만의, 유기 또는 무기 화합물일 수 있다. 아미노산 서열은 단백질, 펩티드, 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 조합일 수 있다..
(1) PD-1 및 PD-Ll
면역 관문 분자는 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1(PD-1), 프로그램화된 세포 사멸 리간드 1(PD-L1), 이의 단편, 이의 변이체, 또는 이의 조합일 수 있다. PD-1은 PDCD1 유전자에 의해 암호화된 세포 표면 단백질이다. PD-1은 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이며 T 세포 및 전구-B 세포 상에서 발현되고, 따라서 이들 세포의 운명 및/또는 분화에 기여한다. 특히, PD-1은 T 세포 조절기의 CD28/CTLA-4 패밀리의 유형 1 막 단백질이며 T 세포 수용체(TCR) 신호를 음으로 조절하여, 면역 반응을 음으로 조절한다. PD-1은 CD8+ T 세포 반응을 음으로 조절할 수 있고, 따라서 CD8-매개 세포독성을 억제하고 종양 성장을 향상시킨다.
PD-1은 B7 패밀리의 구성원인 2개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2를 갖는다. PD-L1은 LPS 및 GM-CSF 처리에 반응하여 대식세포 및 수지상 세포(DC) 상에서 상향조절되고 TCR 및 B 세포 수용체 신호전달시 T 세포 및 B 세포 상에서 상향조절된다. PD-L1은 골수종, 비만세포, 및 흑색종을 포함한 많은 종양 세포주에 의해 발현된다.
b. 항-면역 관문 분자　항체
상기 기술한 바와 같이, 면역 관문 억제제는　항체일 수 있다. 항체는 항원 (즉, 상기 기재된 면역 관문 분자)에 결합하거나 또는 그와 반응할 수 있다. 따라서, 항체는 항-면역 관문 분자 항체 또는 면역 관문 분자 항체로 간주할 수 있다. 항체는 포함된 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다
항체는 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 중쇄 폴리펩티드는 가변 중쇄(VH) 영역 및/또는 적어도 하나의 불변 중쇄(CH) 영역을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 불변 중쇄 영역은 불변 중쇄 영역 1(CH1), 불변 중쇄 영역 2(CH2), 및 불변 중쇄 영역 3(CH3), 및/또는 힌지 영역을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 중쇄 폴리펩티드는 VH 영역 및 CH1 영역을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 중쇄 폴리펩티드는 VH 영역, CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역을 포함할 수 있다.
중쇄 폴리펩티드는 상보적 결정 영역("CDR") 세트를 포함할 수 있다. CDR 세트는 VH 영역의 3개의 초가변 영역을 함유할 수 있다. 중쇄 폴리펩티드의 N-말단으로부터 진행하여, 이들 CDR은 각각 "CDR1", "CDR2", 및 "CDR3"으로 나타낸다. 중쇄 폴리펩티드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 항원의 결합 또는 인식에 기여할 수 있다.
경쇄 폴리펩티드는 가변 경쇄(VL) 영역 및/또는 불변 경쇄(CL) 영역을 포함할 수 있다. 경쇄 폴리펩티드는 상보적 결정 영역("CDR") 세트를 포함할 수 있다. CDR 세트는 VL 영역의 3개의 초가변 영역을 함유할 수 있다. 경쇄 폴리펩티드의 N-말단으로부터 진행하여, 이들 CDR은 각각 "CDR1", "CDR2", 및 "CDR3"으로 나타낸다. 경쇄 폴리펩티드의 CDR1, CDR2, 및 CDR3은 항원의 결합 또는 인식에 기여할 수 있다.
항체는 중쇄 및 경쇄 상보적 결정 영역("CDR") 세트를 포함할 수 있으며, 각각 중쇄 및 경쇄 프레임워크("FR") 세트 사이에 개재되어 CDR에 대한 지지를 제공하고 서로에 관한 CDR의 공간적 관계를 정의한다. CDR 세트는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 3개의 초가변 영역을 함유할 수 있다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단으로부터 진행하여, 이들 영역은 각각 "CDR1", "CDR2", 및 "CDR3"으로 나타낸다. 따라서, 항원-결합 부위는 중쇄 및 경쇄 V 영역 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDR을 포함할 수 있다.
항체는 면역글로불린(Ig)일 수 있다. Ig는, 예를 들어, IgA, IgM, IgD, IgE, 및 IgG일 수 있다. 면역글로불린은 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 면역글로불린의 중쇄 폴리펩티드는 VH 영역, CH1 영역, 힌지 영역, CH2 영역, 및 CH3 영역을 포함할 수 있다. 면역글로불린의 경쇄 폴리펩티드는 VL 영역 및 CL 영역을 포함할 수 있다.
추가적으로, 단백질분해 효소 파파인은 우선적으로 IgG 분자를 절단하여 여러 단편을 생성하며, 이 중 2개(F(ab) 단편)는 각각 온전한 항원-결합 부위를 포함하는 공유 이종이량체를 포함한다. 효소 펩신은 IgG 분자를 절단하여 항원-결합 부위 둘 다를 포함하는, F(ab')2 단편을 포함한 여러 단편을 제공할 수 있다. 따라서, 항체는 Fab 또는 F(ab')2일 수 있다. Fab는 중쇄 폴리펩티드 및 경쇄 폴리펩티드를 포함할 수 있다. Fab의 중쇄 폴리펩티드는 VH 영역 및 CH1 영역을 포함할 수 있다. Fab의 경쇄는 VL 영역 및 CL 영역을 포함할 수 있다.
항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 항체는 키메라 항체, 단일 쇄 항체, 친화도 성숙 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 인간화 항체는 비-인간 종으로부터의 하나 이상의 상보적 결정 영역(CDR) 및 인간 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 갖는 원하는 항원에 결합하는 비-인간 종으로부터의 항체일 수 있다.
(1) PD-1 항체
항-면역 관문 분자 항체는 항-PD-1 항체 (본원에서 "PD-1 항체"로도 지칭됨), 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 조합일 수 있다.　 PD-1 항체는 니볼루맙일 수 있다. 항-PD-1 항체는 PD-1 활성을 억제할 수 있고, 그에 의해 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 유도, 유발, 또는 증가시키고 종양　성장을　감소시킬 수 있다.
(2) PD-Ll 항체
항-면역 관문 분자 항체는 항-PD-L1 항체 (본원에서 "PD-L1　항체"로도 지칭됨), 이의 변이체, 이의 단편, 또는 이의 조합일 수 있다.　 항-PD-L1 항체는 PD-L1　활성을　억제할 수 있고, 그에 의해 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 유도, 유발, 또는 증가시키고 종양　성장을　감소시킬 수 있다.
벡터
백신은 메소텔린 항원을 암호화하는 이종 핵산을 함유하는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다. 하나 이상의 벡터는 포유동물에서 면역 반응을 유발하기에 효과적인 양으로 항원을 발현할 수 있다. 벡터는 항원을 암호화하는 이종성 핵산을 포함할 수 있다. 벡터는 복제 기점을 함유하는 핵산 서열을 가질 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자가-복제 염색체 외 벡터이거나 숙주　게놈에　통합되는 벡터일 수 있다.
하나 이상의 벡터는 발현 작제물일 수 있으며, 이는 일반적으로 특정 유전자를 표적 세포 내로 도입하는데 사용되는 플라스미드이다. 발현 벡터가 세포 내부에 있으면,　유전자에 의해 암호화되는 단백질은 세포 전사 및 번역 기구 리보솜 복합체에 의해 생성된다. 플라스미드는 종종 인핸서 및 프로모터 영역으로 작용하고 발현 벡터 상에 보유된 유전자의 효율적인 전사를　유도하는 조절 서열을 함유하도록 조작된다. 본 발명의 벡터는 다량의 안정한 메신저 RNA, 및 따라서　단백질을　발현한다.
벡터는 강한 프로모터, 강한 종결 코돈, 프로모터와 클로닝된 유전자 사이의 거리 조정, 및 전사 종결 서열 및 PTIS (이동가능 번역 개시 서열)의 삽입과 같은 발현 신호를 가질 수 있다.
벡터는　프로모터 및 폴리아데닐화 신호로부터 선택된 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 프로모터는 인간 시토메갈로바이러스 조기-발현 프로모터 (hCMV　프로모터)이다.　 일부 양태에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 (bGH　폴리A)이다.
벡터는 원형　플라스미드　또는　선형　핵산일 수 있다. 원형 플라스미드 및 선형 핵산은 적절한 대상 세포에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 벡터는 항원-암호화 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 가질 수 있으며, 이는 종결 신호에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 벡터는 또한 뉴클레오티드 서열의 적절한 번역에 필요한 서열뿐만 아니라 벡터 및 이의 단편을 클로닝 및 서브클로닝하기 위한 서열을 함유할 수 있다. 관심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 키메라일 수 있는데, 이는 그의 성분 중 적어도 하나가 다른 성분 중 적어도 하나에 대해 이종임을 의미한다. 발현 카세트에서 뉴클레오티드 서열의 발현은 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있으며, 이는 숙주 세포가 어떠한 특정 외부 자극에 노출될 때만 전사를 개시한다. 다세포 유기체의 경우, 프로모터는 또한 특정 조직 또는 기관 또는 발달 단계에 특이적일 수 있다.
벡터는 플라스미드일 수 있다. 플라스미드는 항원을 암호화하는 핵산으로 세포를 형질 감염하는데 유용할 수 있으며, 형질 전환된 숙주 세포는 항원의 발현이　일어나는　조건 하에 배양 및 유지된다.
플라스미드는 항원에 대해 면역 반응을 도출할 수 있는 합성, 공통 항원, 이러한 단백질의 단편, 이러한 단백질의 변이체, 공통 단백질의 조합으로 구성된 변이체 또는 융합 단백질의 단편 및/또는 공통 단백질의 단편 및/또는 공통 단백질의 변이체 및/또는 변이체 공통 단백질의 단편을 암호화하는 코딩 서열을 포함한 상기 개시된 다양한 항원 중 하나 이상을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 플라스미드는 CCR20을 단독으로 또는 하나의 이들 플라스미드 중 일부로서 암호화하는 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 유사하게, 플라스미드는 IL-12, IL-15 및/또는 IL-28에　대한 코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다.
플라스미드는 코딩 서열의 업스트림에 있을 수 있는 개시 코돈 및 코딩 서열의 다운스트림에 있을 수 있는 정지 코돈을 추가로 포함할 수 있다. 개시 및 종결 코돈은 코딩 서열과 프레임으로 될 수 있다.
플라스미드는 또한 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 시미안 바이러스 40 (SV40), 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 인간 면역　결핍 바이러스 (HIV) 프로모터, 예를 들어 소 면역 결핍 바이러스 (BIV) 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 (ALV) 프로모터, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 예를 들어 CMV 조기-발현 프로모터 (hCMV 프로모터), 엡스타인 바 바이러스 (EBV) 프로모터, 또는 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 인간 유전자, 예를 들어 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 인간　메탈로티오네인과 같은 인간 유전자로부터의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한　천연 또는 합성의 근육 또는 피부 특이적 프로모터와 같은 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터의 예시는 미국 특허 출원 공개 번호 US20040175727에 기재되어 있고, 그 내용은 그　전체가　본원에 포함된다.
플라스미드는 또한　코딩 서열의　다운스트림에 있을 수 있는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호, LTR 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬 (bGH) 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬 (hGH) 폴리아데닐화 신호, 인간　β-글로빈 폴리아데닐화 신호 또는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호 (bGH 폴리A)일 수 있다. SV40 폴리아데닐화 신호는 pCEP4 플라스미드 (인비트로겐, San Diego, CA)로부터의 폴리아데닐화 신호일 수 있다.
플라스미드는 또한 코딩 서열의 업스트림 인핸서를 포함할 수 있다. 인핸서는 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 CMV, FMDV, RSV 또는 EBV 중 하나와 같은 바이러스 인핸서일 수 있다. 폴리뉴클레오티드　기능　인핸서는 미국　특허　5,593,972, 5,962,428, 및 W094/016737에 기재되어 있고, 각각의 내용은 전체로　참조로 포함된다.
플라스미드는 또한 플라스미드를 염색체외로 유지하고 세포에서 플라스미드의 다수의 카피를 생산하기 위해 포유류의 복제 기점을 포함할 수 있다. 플라스미드는 Invitrogen(캘리포니아주 샌디에이고 소재)으로부터의 p V AXI, pCEP4 또는 pREP4일 수 있으며, 이는 엡스타인 바 바이러스의 복제 기점 및 핵 항원 EBNA-l 코딩 영역을 포함할 수 있으며, 통합 없이 높은 카피 에피솜 복제를 생산할 수 있다. 플라스미드의 백본(backbone)은 pA V0242일 수 있다. 플라스미드는 복제 결함 아데노바이러스 유형 5(Ad5) 플라스미드일 수 있다.
플라스미드는 또한 조절 서열을 포함할 수 있으며, 이는 플라스미드가 투여되는 세포에서 유전자 발현에 매우 적합할 수 있다. 코딩 서열은　숙주　세포에서 코딩 서열의 보다 효율적인 전사를　허용할 수 있는 코돈을 포함할 수 있다.
코딩 서열은 또한 면역글로불린(Ig) 선도 서열을 포함할 수 있다. 선도 서열은　코딩 서열의　5"일 수 있다. 이 서열에 의해 암호화된 공통 항원은 N-말단 IgG 리더에 이어 공통 항원 단백질을 포함할 수 있다. N-말단 lg 리더는　IgE　또는　IgG일 수 있다.
플라스미드는 pSE420 (인비트로겐, San Diego, Calif.)일 수 있으며, 이는 대장균(E.coli)에서 단백질 생산에 사용될 수 있다. 플라스미드는 또한 p-YES2 (인비트로겐, San Diego, Calif.)일 수 있으며, 이는 효모의 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주에서 단백질 생산에 사용될 수 있다. 플라스미드는 또한 MAXBAC™ 완전 배큘로바이러스 발현 시스템 (인비트로겐, San Diego, Calif.) 중 하나일 수 있으며, 이는 곤충 세포에서 단백질 생산에 사용될 수 있다. 플라스미드는 또한　pcDNA I 또는 pcDNA3 (인비트로겐, San Diego, Calif.)일 수 있고, 이는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포와 같은 포유동물 세포에서 단백질 생산에 사용될 수 있다. 플라스미드는 또한　pGX001 (이노비오)일 수 있으며, 이는 pVAXl (써모 피셔 사이언티픽, Waltham, MA)로부터 변형된다.
벡터는 원형 플라스미드일 수 있으며, 이는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 표적 세포를 형질전환시킬 수 있거나　염색체 외적으로　존재할　수 있다　(예를 들어, 복제 기점을 갖는 자율 복제 플라스미드).
벡터는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 프로박스(provax), 또는 항원을 암호화하는 DNA를 발현하고 세포가 서열을 면역계에 의해 인식된 항원으로 번역하도록 할 수 있는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
전기천공을 통해 대상체에게 효과적으로 전달될 수 있고 하나 이상의 원하는 항원을 발현할 수 있는 선형 핵산 백신 또는 선형 발현 카세트 ("LEC")가 본원에 또한 제공된다. LEC는　임의의 인산염 백본이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. DNA는 하나 이상의 항원을 암호화할 수 있다. LEC는 프로모터, 인트론, 정지 코돈 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다. 항원의 발현은 프로모터에 의해 제어될 수 있다. LEC는　임의의 항생제 내성 유전자 및/또는 인산염 백본을 함유하지 않을 수 있다. LEC는 원하는 항원 유전자　발현과 관련이 없는 다른 핵산 서열을 함유하지 않을 수　있다.
LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드로부터 유래될 수 있다. 플라스미드는 항원을 발현할 수 있다. 플라스미드는　pNP (푸에르토리코/34) 또는 pM2 (뉴칼레도니아/99)일 수 있다. 플라스미드는 WLV009, pVAX, pcDNA3.0, 또는 프로박스, 또는 항원을 암호화하고 세포가 면역계에 의해 인식되는 항원으로 서열을 번역할 수 있게 하는 DNA를 발현 가능한 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.
LEC는 pcrM2일 수 있다. LEC는　pcrNP일 수 있다. pcrNP 및 pcrMR는 각각, pNP (푸에르토리코/34) 및 pM2 (뉴칼레도니아/99)로부터 유도될 수　있다.
벡터는 프로모터를 가질 수 있다. 프로모터는 유전자 발현을 유도하고 단리된 핵산의 발현을 조절할 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다. 이러한 프로모터는 본원에 기재된 항원 서열을 전사시키는 DNA 의존성 RNA 폴리머라제를 통한 전사에 필요한 시스-작용 서열 요소이다. 이종성 핵산의 직접 발현에 사용되는 프로모터의 선택은 특정 적용에 의존한다. 프로모터는 자연적 설정에서 전사 개시 부위로부터와 벡터에서 전사 개시로부터 거의 동일한 거리에 위치할 수 있다. 그러나, 이 거리의 변화는 프로모터 기능의 상실 없이 수용될 수 있다.
프로모터는 항원 및 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 리보솜 결합 부위, 및 번역 종결에 필요한 신호를 암호화하는 핵산　서열에　작동 가능하게 연결될 수 있다.
프로모터는 CMV 프로모터, SV40 조기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린(murine) 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터,　폴리헤드린　프로모터, 또는 진핵　세포에서 발현에 효과적인 것으로 나타난 다른 프로모터일 수 있다.
벡터는 기능성 스플라이스 공여자 및 수용자 부위를 갖는 인핸서 및 인트론을 포함할 수 있다. 벡터는 효율적인 종결을 제공하기 위해 구조 유전자의 전사 종결 영역 다운스트림을 함유할 수 있다. 종결 영역은 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 수득될 수 있거나 또는 상이한　유전자로부터 수득될 수 있다.
벡터를 제조하는 방법
본원에서는 본원에 논의된 메소텔린　항원을　암호화하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제조하는 방법이 제공된다. 포유동물 발현 플라스미드로의 최종 서브클로닝 단계　후의 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 대규모 발효 탱크에서 세포 배양물을 접종하는데 사용될 수 있다.
하기에　보다 상세하게　기술된 전기천공 장치와 함께 사용하기 위한 벡터는 공지된 장치 및 기술의 조합을 사용하여 제형화되거나 제조될 수 있지만, 바람직하게는 2008년 5월 23일에 출원된 미국 공보 번호 2009/004716에 기재된 최적화 플라스미드 제조 기술을 사용하여 제조된다. 일부 예시에서, 이들 연구에 사용된 DNA 플라스미드는 10 mg/mL 이상의 농도에서 제형화될 수 있다. 제조 기술은 또한　2007년 7월 3일에 발행된 미국 특허 번호 7,238,522에 기재된 것을 포함하여, 미국 일련 번호 60/939792에 기재된 것에 더하여 당업자에게 일반적으로 공지된 다양한 장치 및 프로토콜을 포함하거나 통합한다. 상기 언급된 공보 및 특허, 미국 공보 2009/004716 및 미국 특허 번호 7,238,522는 각각 그 전체가 본원에 통합되어 있다.
백신의 부형제 및 다른 성분
백신은 약학적으로 허용 가능한 부형제를　추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 비히클, 담체 또는 희석제와 같은 기능성 분자일 수 있다.　 약학적으로 허용 가능한 부형제는 형질 감염 촉진제일 수 있으며, 이는 표면 활성제, 예를 들어 면역 자극 복합체 (ISCOMS), 프로인트 불완전 보조제,　모노포스포릴　지질 A를　포함하는 LPS 유사체, 무라밀펩티드, 퀴논 유사체, 스쿠알렌 및 스쿠알렌과 같은 소포, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다가음이온, 다가양이온, 또는 나노 입자,　또는 기타 알려진 형질 감염 촉진제를　포함할 수 있다.
형질 감염 촉진제는 다가음이온, 폴리-L-글루타메이트(LGS)를 포함한 다가양이온, 또는 지질이다. 　형질 감염 촉진제는 폴리-L-글루타메이트이고, 폴리-L-글루타메이트는 6 mg/ml 미만의 농도로 백신에 존재할 수 있다.　 형질 감염 촉진제는 유전자 작제물과 함께 투여될 수도 있는 면역 자극 복합체 (ISCOMS), 프로인트 불완전 보조제,　모노포스포릴　지질 A를　포함하는 LPS 유사체, 무라밀펩티드, 퀴논 유사체 및 스쿠알렌 및 스쿠알렌과 같은 소포, 및 히알루론산과 같은 계면 활성제를 포함할 수 있다. DNA 플라스미드 백신은 또한　형질 감염 촉진제 예를 들어 지질, DNA-리포좀 혼합물로서(예를 들어　W09324640　참조) 레시틴 리포좀 또는　당업계에　공지된 다른 리포좀을 포함하는 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다가음이온, 다가양이온, 또는 나노 입자,　또는 기타 알려진 형질 감염 촉진제를 포함할 수 있다. 형질 감염 촉진제는 폴리-L-글루타메이트 (LGS), 또는 지질을 포함하는 다가음이온, 다가양이온이다. 백신의 형질 감염 촉진제의 농도는 4 mg/ml 미만, 2 mg/ml 미만, 1 mg/ml 미만, 0.750 mg/ml 미만, 0.500 mg/ml 미만, 0.250 mg/ml 미만, 0.100 mg/ml 미만, 0.050 mg/ml 미만, 또는 0.010 mg/ml 미만이다.
약학적으로 허용 가능한 부형제는 하나 이상의　보조제일 수 있다. 보조제는 대안적인 플라스미드에서 발현되거나 백신에서 상기 플라스미드와 조합된 단백질로서 전달되는 다른 유전자일 수 있다. 하나 이상의 보조제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: CCL20, α-인터페론 (IFN-α), β-인터페론 (IFN-β), γ-인터페론, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 상피 성장 인자 (EGF), 피부 T 세포 유인 케모카인 (CTACK), 상피 흉선 발현 케모카인 (TECK), 점막 관련 상피 케모카인 (MEC), IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33, MHC, CD80, CD86, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-1, MIP-la, MIP-1~, IL-8, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-18의 돌연변이 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-I, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK 리간드, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2, 삭제된 신호 서열을 암호화하는 신호 서열 또는 코딩 서열을 갖는 및 선택적으로 IgE로부터의 것과 같은 상이한 신호 펩티드 또는 IgE로부터의 것과 같은 상이한 신호 펩티드를 암호화하는 코딩 서열을 포함하는 IL-15, 및 이의 기능적 단편, 또는 이의 조합. 보조제는 IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, 표피 성장 인자 (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, 또는 이의 조합일 수 있다.
일부 양태에서 보조제는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 하나 이상의 단백질 및/또는 핵산 분자일 수 있다: CCL-20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC 또는 RANTES. IL-12 작제물 및 서열의 예시는 PCT 출원 번호 PCT/US1997/019502 및 해당 미국　출원　일련　번호　08/956,865, 및　2011년 12월 12일에 출원된 미국　가출원　일련　번호 61/569600에 개시되어 있고, 이는 참조로서 본원에 각각 포함되어 있다. IL-15 작제물 및 서열의 예시는 PCT 출원 번호 PCT/US04/18962 및 해당 미국 출원 일련 번호 10/560,650, 및 PCT 출원 번호 PCT/US07/00886 및 해당 미국 출원 일련 번호 12/160,766, 및 PCT 출원 번호 PCT/USI0/048827에 개시되어 있고, 이는 참조로서 본원에 각각 포함되어 있다. IL-28 작제물 및 서열의 예시는 PCT 출원 번호 PCT/US09/039648 및 해당 미국 출원 일련 번호 12/936,192에 개시되어 있고, 이는 참조로서 본원에 각각 포함되어 있다. RANTES 및 다른 작제물 및 서열의 예시는 PCT 출원 번호 PCT/US1999/004332 및 해당 미국 출원 일련 번호 09/622452에 개시되어 있고, 이는 참조로서 본원에 각각 포함되어 있다. RANTES 작제물 및 서열의 다른 예시는 PCT 출원 번호 PCT/US l1/024098에 개시되어 있고, 이는 참조로서 본원에 각각 포함되어 있다. RANTES 및 다른 작제물 및 서열의 예시는 PCT 출원 번호 PCT/US1999/004332 및 해당 미국 출원 일련 번호 09/622452에 개시되어 있고, 이는 참조로서 본원에 각각 포함되어 있다. RANTES 작제물 및 서열의 다른 예시는 PCT 출원 번호 PCT/US11/024098에 개시되어 있고, 이는 참조로서 본원에 각각 포함되어 있다. 케모카인 CTACK, TECK 및 MEC 작제물 및 서열의 예시는 PCT 출원 번호 PCT/US2005/04223l 및 해당 미국 출원 일련 번호 11/719,646에 개시되어 있고, 이는 참조로서 본원에 각각 포함되어 있다. OX40 및 다른 면역 조절제의 예시는 미국 출원 일련 번호 10/560,653에 개시되어 있고, 이는 참조로서 본원에 각각 포함되어 있다. DR5 및 다른 면역 조절제의 예시는 미국 출원 일련 번호 09/622452에 개시되어 있고, 이는 참조로서 본원에 각각 포함되어 있다.
보조제로서 유용할 수 있는 다른 유전자는 하기를 암호화하는 것을 포함한다: MCP-1, MIP-la, MIP-lp, IL-8, RANTES, L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, IL-18의 돌연변이 형태, CD40, CD40L, 혈관 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, IL-7, IL-22, 신경 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, Fas, TNF 수용체, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, 카스파제 ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, 불활성 NIK, SAP K, SAP-1, JNK, 인터페론 반응 유전자, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK 리간드, Ox40, Ox40 리간드, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPl, TAP2 및 이의 기능적 단편.
백신은 1994년 4월 1일 출원된 미국 일련 번호 021,579에 기술된 바와 같은 유전자 백신 촉진제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 참조로 완전히 포함된다.
백신은 약 1 나노그램 내지 100 밀리그램; 약 1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 또는 바람직하게는 약 0.1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 또는 더욱 바람직하게는 약 1 밀리그램 내지 약 2 밀리그램의 양으로 항원-암호화 벡터를 포함할 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 백신은 약 5 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램의 핵산을 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, 백신은 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램의 핵산을 함유할 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 백신은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 핵산을 함유할 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 백신은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 핵산을 함유할 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 백신은 약 25 내지 약 250 마이크로그램, 약 100 내지 약 200 마이크로그램, 약 1 나노그램 내지 100 밀리그램; 약 1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 약 0.1 마이크로그램 내지 약 10 밀리그램; 약 1 밀리그램 내지 약 2 밀리그램, 약 5 나노그램 내지 약 1000 마이크로그램, 약 10 나노그램 내지 약 800 마이크로그램, 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램, 약 1 내지 약 350 마이크로그램, 약 25 내지 약 250 마이크로그램, 약 100 내지 약 200 마이크로그램의 항원 또는　이의　플라스미드를 함유할 수 있다.
백신은 사용되는 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다. 주사용 백신　약학 조성물은 무균, 무발열원 및 무미립자일 수 있다. 등장성 제제 또는 용액이 사용될 수 있다. 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 및 락토오스를 포함할 수 있다. 백신은 혈관수축제를　포함할 수 있다. 등장성 용액은 인산염 완충 식염수를 포함할 수 있다. 백신은 젤라틴 및 알부민을 포함하는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 안정화제는 LGS 또는 다가양이온 또는 다가음이온을 포함하여, 제제를 실온 또는 주위 온도에서 장기간 안정되게 할 수 있다.
백신의 약학 조성물
백신은 약학 조성물의 형태일 수 있다. 약학 조성물은 백신을 포함할 수 있다. 약학 조성물은 약 5 나노그램 (ng) 내지 약 10 밀리그램 (mg)의 백신의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 약 25 ng 내지 약 5 mg의 백신의 핵산 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 50 ng 내지 약 1 mg의 백신의 핵산 분자를 함유한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 함유한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 함유한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 5 내지 약 250 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 함유한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 10 내지 약 200 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 함유한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 15 내지 약 150 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 함유한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 20 내지 약 100 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 함유한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 25 내지 약 75 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 함유한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 30 내지 약 50 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 함유한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 35 내지 약 40 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 함유한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 100 내지 약 200 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 함유한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 10 마이크로그램 내지 약 100 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 20 마이크로그램 내지 약 80 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 25 마이크로그램 내지 약 60 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 30 ng 내지 약 50 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 약 35 ng 내지 약 45 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, 약학 조성물은 약 0.1 내지 약 500 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 함유한다. 일부 바람직한 양태에서, 약학 조성물은 약 1 내지 약 350 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 함유한다. 일부 바람직한 양태에서, 약학 조성물은 약 25 내지 약 250 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 함유한다. 일부 바람직한 양태에서, 약학 조성물은 약 100 내지 약 200 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 함유한다.
일부 양태에서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 ng의 백신의 핵산 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 적어도 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 또는 1000 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 적어도 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 mg 이상의 백신의 핵산 분자를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 약학 조성물은 최대 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 ng의 백신의 핵산 분자를 포함할 수 있고 상기 수치를 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 최대 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995, 또는 1000 마이크로그램의 백신의 핵산 분자를 포함할 수 있고 상기 수치를 함유할 수 있다. 일부 양태에서, 약학 조성물은 최대 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5 또는 10 mg의 백신의 핵산 분자를 포함할 수 있고 상기 수치를 함유할 수 있다.
약학 조성물은 사용되는 투여 방식에 따라 제제화를 위한 다른 제제를 추가로 포함할 수 있다. 약학 조성물이 주사용 약학 조성물인 경우, 이들은 무균, 발열원 및 미립자가 없다. 　등장성 제제가 바람직하게 사용된다.　 일반적으로, 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨　및 락토오스를　포함할 수 있다. 일부 경우에, 인산염 완충 식염수와 같은 등장액이 바람직하다.　안정화제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.　 일부 양태에서, 혈관 수축제가 제제에 첨가된다.
약학 조성물은　상기 제공된 바와 같이 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함할 수　있다. 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 상기 제공된 바와 같은, 기능성 분자, 비히클, 보조제, 담체, 희석제, 또는 형질 감염 촉진제를 포함할 수　있다.
백신 접종 방법
상기 기재된 약학적 제제를 사용하여, 예를 들어 난소 암에 제한되지 않는, 메소텔린-발현 암을 치료 및/또는 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 대상체에서, 예를 들어 난소 암에 제한되지 않는, 메소텔린-발현 암의 치료 및/또는 예방에 상기 기재된 약학적 제제를 사용하는 방법이　또한 본원에　기재되어 있다. 또한, 대상체를 백신 접종하는　방법이 본원에 기재되어 있다. 또한　이를 필요로 하는 대상체에 본원에 기재된 약학적 제제를 투여하는 방법이 본원에 기재되어 있다. 본원에 기재된 약학적 제제를 사용하여 치료하는 방법으로 총괄적으로 지칭된 본원에 기술된 방법은 치료 및/또는 예방　면역　반응을 유도하기 위해　이를 필요로 하는 대상체에 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 백신을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 백신은 대상체의 면역계의 활성을 조절하고 면역 반응을 향상시키기 위해 대상체에 투여될 수 있다. 백신의 투여는 세포에서 발현되고 세포 표면으로 전달되는 핵산 분자로서 본원에 개시된 암 항원의 형질 감염일 수 있으며, 이에 면역계는 세포성, 체액성, 또는 세포성 및 체액성 반응을 인식하고 유도한다. 백신의 투여는 본원에 논의된 바와 같이 백신을 대상체에게 투여함으로써 메소텔린에 대한 대상체의 면역 반응을 유도하거나 유발하는데 사용될 수 있다.
백신은 대상체의 면역계 활성을 조절하여, 면역 반응을 향상시키기 위해 대상체에 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 대상체는 포유동물이다. 백신을 포유동물에게 투여하여 포유동물의 세포 내로 벡터를 도입하면, 형질 감염된 세포는 본원에 개시된 바와 같은 암 항원 중 하나 이상을 발현 및 분비할 것이다. 이들 분비된 단백질, 또는 합성 항원은 면역계에 의해 외래로 인식되고, 이는 하기를 포함할 수 있는 면역 반응을 일으킬 것이다: 하나 이상의 암 항원에 대해 제조된 항체, 및 하나 이상의 암 항원에 대한 특이적인 T-세포 반응. 일부 예시에서, 본원에 논의된 백신으로 백신 접종된 포유동물은 프라이밍된 면역계를 가질 것이고 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 암 항원으로 공격받을 때, 프라이밍된 면역계는 체액성, 세포성, 또는 세포성 및 체액성 면역 반응 둘 다를 통해 본원에 개시된 바와 같은 후속 암 항원의 신속한 제거를 가능하게 할 것이다.
백신의 DNA를 투여하는 방법은 미국 특허 번호 4,945,050 및 5,036,006에 기재되어 있고, 이 둘 모두 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
백신은 포유동물에게 투여되어 포유동물에서 면역 반응을 유발할 수 있다. 포유동물은 인간, 비인간 영장류, 젖소, 돼지, 양, 염소, 영양, 들소, 물소, 소과, 사슴, 고슴도치, 코끼리, 라마, 알파카, 생쥐, 랫트, 바람직하게는　사람, 소, 또는 돼지일 수 있다. 백신은 마찬가지로　면역　반응을 유발하기 위해　비-포유류 대상체, 예를 들어 닭에　투여될 수 있다.
백신 용량은 시간 경과에 따라 킬로그램 (kg) 체중 당 1 마이크로그램 내지 10 mg 활성 성분(성분/kg 체중/시간)일 수 있고, 20 마이크로그램 내지 10 mg 성분/kg 체중/시간일 수 있다. 백신은 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일 마다 투여될 수 있다. 효과적인 치료를 위한 백신 투약 횟수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회, 또는 그 이상의 투약일 수 있다.
백신으로 면역 반응을 생성하는 방법
백신은 포유동물 또는 비포유동물 대상체에서 치료적 또는 예방적 면역 반응을 포함한 면역 반응을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 면역 반응은　본원에 개시된　하나 이상의 암　항원에　대한 항체 및/또는 킬러 T 세포를 생성할 수　있다. 이러한 항체 및 T 세포는 단리될 수 있다.
일부 양태는 본원에 개시된 바와 같은　하나　이상의 암 항원에 대한 면역 반응을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 양태는　백신을 대상체에게　투여하는　것을 포함한다. 일부 양태는 상기 기재된 메소텔린 항원 중 하나 이상을 발현하는 암 또는 종양에 대해 대상체를 예방적으로 백신 접종하는 방법을 제공하며, 상기 양태는 백신을 투여하는 것을 포함한다. 일부　양태는 메소텔린을 발현하는　종양 또는 난소 암을　앓고 있는 대상체를 치료적으로 백신 접종하는　방법을 제공하며, 상기 양태는 백신을 투여하는 것을 포함한다. 백신의 투여 전에 본원에 개시된 바와 같은 하나 이상의 메소텔린 항원을　발현하는 종양 또는 난소 암의 진단이　일상적으로　수행될 수 있다.
백신으로 암을 치료하는 방법
백신은 난소 암, 더욱 특히 비제한적으로 상피 난소 암, 가장 특히 장액성 난소 암과 같이 메소텔린-발현 암에 반응성이거나 지시된 포유동물에서 면역 반응을 발생시키거나 유발하는데 사용될 수 있다. 유발된 면역 반응은 난소 암 또는 종양　성장을　예방할 수 있다.
유발된 면역 반응은 난소 암을 갖는 대상체에서 암성 또는 종양 세포의 전이를 예방 및/또는 감소시킬 수 있다. 따라서, 백신은 백신이 투여되는 암을 가진 포유동물 또는　대상체에서 암 또는 종양을 치료 및/또는 예방하는 방법에 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 투여된 백신은 (1) B 세포 반응을 통한 체액 면역을 유도하여 단핵구 화학유인물질 단백질-1(MCP-1) 생산을 차단하여, 골수 유래 저해 세포(MDSC)를 지연시키고 종양 성장을 저해하는 항체를 생성하고; (2) 종양 세포를 공격 및 사멸시키기 위해 CD8+과 같은 세포독성 T 림프구(CTL)를 증가시키고; (3) T 헬퍼 세포 반응을 증가시키고; (4) IFN-γ 및 TFN-α를 통한 염증 반응 또는 바람직하게는 상기 언급된 모든 것을 증가시킴으로써 종양 세포의 소거를 매개하거나 또는 성장을 방지할 수 있다. 백신은　무종양 생존율을　30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 및 45%까지 증가시킬 수 있다. 백신은 면역 후 종양 질량을 30%, 31% 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 및 60%까지 감소시킬 수 있다. 백신은 단핵구 화학 주성 단백질 1 (MCP-1), 골수 유래 억제 세포에 의해 분비된 사이토카인의 증가를 예방 및　차단할　수 있다. 백신은 종양 생존율을 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 및 60%까지 증가시킬 수 있다.
일부 양태에서, 면역 반응은 백신을 투여받은 대상체에서 다양한 조직 또는 시스템 (예를 들어, 뇌 또는 신경 시스템 등)에 대한 손상 또는 염증을 유발하지 않는 체액성 면역 반응 및/또는 항원-특이적 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 생성할 수 있다.
일부 양태에서, 백신은 백신이 투여된 대상체에서 손상 또는 질병 또는 사망을 야기하지 않고 하나 이상의 암 항원을 발현하는 암 또는 종양을 소거 또는 제거하기 위해 암성 또는 종양 세포 또는 조직을 표적화하는 항원-특이적 면역 반응을 확립하기 위해 (하기에 보다 상세하게 기재된 바와 같이) 주변부에 투여될 수 있다.
투여된 백신은 대상체에서 세포성 면역 반응을 약 50배 내지 약 6000배, 약 50배 내지 약 5500배, 약 50배 내지 약 5000배, 약 50배 내지 약 4500배, 약 100배 내지 약 6000배, 약 150배 내지 약 6000배, 약 200배 내지 약 6000배, 약 250배 내지 약 6000배, 또는 약 300배 내지 약 6000배까지 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 투여된 백신은 대상체에서 세포성 면역 반응을 백신을　투여받지 않은 대상체에서 세포성 면역 반응과 비교하여 약 50배, 100배, 150배, 200배, 250배, 300배, 350배, 400배, 450배, 500배, 550배, 600배, 650배, 700배, 750배, 800배, 850배, 900배, 950배, 1000배, 1100배, 1200배, 1300배, 1400배, 1500배, 1600배, 1700배, 1800배, 1900배, 2000배, 2100배, 2200배, 2300배, 2400배, 2500배, 2600배, 2700배, 2800배, 2900배, 3000배, 3100배, 3200배, 3300배, 3400배, 3500배, 3600배, 3700배, 3800배, 3900배, 4000배, 4100배, 4200배, 4300배, 4400배, 4500배, 4600배, 4700배, 4800배, 4900배, 5000배, 5100배, 5200배, 5300배, 5400배, 5500배, 5600배, 5700배, 5800배, 5900배, 또는 6000배까지 증가시킬 수 있다.
투여된 백신은 대상체에서 인터페론 감마 (IFN-γ) 수준을 약 50배 내지 약 6000배, 약 50배 내지 약 5500배, 약 50배 내지 약 5000배, 약 50배 내지 약 4500배, 약 100배 내지 약 6000배, 약 150배 내지 약 6000배, 약 200배 내지 약 6000배, 약 250배 내지 약 6000배, 또는 약 300배 내지 약 6000배까지 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 투여된 백신은 대상체에서의 인터페론 감마 (IFN-γ) 수준을, 백신을　투여받지 않은 대상체에서의 인터페론 감마 (IFN-γ) 수준과 비교하여 약 50배, 100배, 150배, 200배, 250배, 300배, 350배, 400배, 450배, 500배, 550배, 600배, 650배, 700배, 750배, 800배, 850배, 900배, 950배, 1000배, 1100배, 1200배, 1300배, 1400배, 1500배, 1600배, 1700배, 1800배, 1900배, 2000배, 2100배, 2200배, 2300배, 2400배, 2500배, 2600배, 2700배, 2800배, 2900배, 3000배, 3100배, 3200배, 3300배, 3400배, 3500배, 3600배, 3700배, 3800배, 3900배, 4000배, 4100배, 4200배, 4300배, 4400배, 4500배, 4600배, 4700배, 4800배, 4900배, 5000배, 5100배, 5200배, 5300배, 5400배, 5500배, 5600배, 5700배, 5800배, 5900배, 또는 6000배까지 증가시킬 수 있다.
백신 용량은 시간에 따른 킬로그램 (kg) 체중 당 1 마이크로그램 내지 10 mg 활성 성분 (성분/kg 체중/시간)일 수 있고, 20 마이크로그램 내지 10 mg 성분/kg 체중/시간일 수 있다. 백신은 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일마다 투여될 수 있다. 효과적인 백신 투약 횟수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 투약일 수 있다.
투여 경로
백신 또는 약제학적 조성물은 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 경점막, 국소, 흡입을 통해, 협측 투여를 통해, 흉강내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내 척추강내, 및/또는 관절내, 또는 이의 조합을 포함한 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 수의과 용도를 위해, 조성물은 정상 수의과 실습에 따라 적합하게 허용되는 제형으로 투여될 수 있다. 수의사는 특정한 동물에 가장 적합한 투약 레지멘 및 투여 경로를 용이하게 결정할 수 있다. 백신은 통상적인 주사기, 무바늘 주사 장치, "미세발사체 충격 유전자 총", 또는 전기천공법("EP"), "유체역학적 방법", 또는 초음파와 같은 다른 물리적 방법에 의해 투여될 수 있다.
백신의 벡터는 생체내 전기천공법, 리포솜 매개 형질감염, 나노입자 촉진 형질감염, 및 재조합 아데노바이러스, 재조합 아데노바이러스 연관 바이러스, 및 재조합 백시니아와 같은 재조합 벡터 사용과 함께 또는 없이 DNA 주사(또한 DNA 백신접종으로도 지칭됨)를 포함한 널리 알려진 여러 기술에 의해 포유동물에 투여될 수 있다. 백신의 하나 이상의 암 항원은 생체내 전기천공법과 함께 DNA 주사를 통해 투여될 수 있다.
전기천공
백신 또는 약학 조성물은 전기천공법에 의해 투여될 수 있다. 전기천공법을 통한 백신의 투여는 세포 막에서 가역성 기공을 형성시키는데 효과적인 에너지 펄스를 포유동물의 원하는 조직에 전달하도록 구성될 수 있는 전기천공법 장치를 사용하여 달성될 수 있고, 바람직하게는 에너지 펄스는 사용자에 의해 미리 설정된 전류 입력과 유사한 정전류이다. 전기천공법 장치는 전기천공법 구성요소 및 전극 어셈블리 또는 핸들 어셈블리를 포함할 수 있다. 전기천공법 구성요소는 제어기, 전류 파형 발생기, 임피던스 테스터, 파형 로거(waveform logger), 입력 요소, 상태 보고 요소, 통신 포트, 메모리 구성요소, 전원, 및 전원 스위치를 포함한 전기천공법 장치의 다양한 요소 중 하나 이상을 포함하고 통합할 수 있다. 전기천공법은 플라스미드에 의해 세포의 형질감염을 촉진시키는 생체내 전기천공법 장치, 예를 들어 CELLECTRA® EP 시스템(Inovio Pharmaceuticals, Inc., 펜실베니아주 블루 벨 소재) 또는 Elgen 전기천공기(Inovio Pharmaceuticals, Inc.)를 사용하여 달성될 수 있다.
본 발명의 DNA 백신의 투여를 촉진할 수 있는 전기천공법 장치 및 전기천공법 방법의 예는 Draghia-Akli 등에 의한 미국 특허 번호 제7,245,963호, Smith 등에 의해 제출된 미국 특허 공개 제2005/0052630호에 기재된 것들을 포함하며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. DNA 백신의 투여를 촉진하는데 사용될 수 있는 다른 전기천공법 장치 및 전기천공법 방법은 2007년 10월 17일자로 출원된 동시-계류중이고 공동 소유된 미국 특허 출원 일련 번호 제11/874072호에 제공된 것들을 포함하며, 이는 2006년 10월 17일자로 출원된 미국 가출원 일련 번호 제60/852,149호, 및 2007년 10월 10일자로 출원된 제60/978,982호에 대해 35 USC 119(e) 하에 우선권을 주장하며, 이들 모두 그 전문이 본원에 포함된다.
Draghia-Akli 등에 의한 미국 특허 번호 7,245,963는 신체 또는 식물에서 선택된 조직의 세포 내로 생체 분자의 도입을 촉진하기 위한 모듈형 전극 시스템 및 이들의 용도를 기술한다. 모듈형 전극 시스템은 복수의 바늘 전극; 피하 주사침; 프로그램 가능한 정전류 펄스 제어기로부터 복수의 바늘 전극으로의 전도성 링크를 제공하는 전기 커넥터; 및 전원을 포함할 수 있다. 조작자는 지지 구조물 상에 장착된 복수의 바늘 전극을 쥐고 이를 신체 또는 식물의 선택된 조직으로 단단히 삽입할 수 있다. 이어서 생체 분자는 피하 주사 바늘을 통해 선택된 조직으로 투여된다. 프로그램 가능한 정전류 펄스 제어기가 활성화되고 정전류 전기 펄스가 복수의 바늘 전극에 적용된다. 적용된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이에서 세포 내로 생체 분자의 도입을 용이하게 한다. 미국 특허 번호 7,245,963의 전체 내용은 그　전문이 본원에 참조로 포함된다.
Smith 등에 의해 제출된 미국 특허 공보 2005/0052630은 신체 또는 식물에서 선택된 조직의 세포 내로 생체 분자의 도입을 효과적으로 촉진하기 위해 사용될 수 있는 전기천공 장치를 기술한다. 전기천공 장치는 동작이 소프트웨어 또는 펌웨어에 의해 지정된 전기 동력학 장치 ("EKD 장치")를 포함한다. EKD 장치는 펄스 파라미터의 사용자 제어 및 입력에 기초한 어레이에서 전극 사이에 일련의 프로그램가능한 정전류 펄스 패턴을 생산하고, 전류 파형 데이터의 저장 및 수집을 허용한다. 전기천공법 장치는 또한 바늘 전극의 어레이를 갖는 교체형 전극 디스크, 주사 바늘용 중앙 주사 채널, 및 탈착형 가이드 디스크를 포함한다. 미국 특허 공보 2005/0052630의 전체 내용은 본원에 참조로 완전히 포함된다.
미국 특허 번호 7,245,963 및 미국 특허 공보 2005/0052630에 기술된 전극 어레이 및 방법은 근육과 같은 조직뿐만 아니라, 다른 조직이나 장기에도 깊이 침투하기 위해 조정될 수 있다. 전극 어레이의 구성으로 인해, 주사 바늘이 또한 표적 기관에 완전히 삽입되고, 주사는 전극에 의해 미리 기술된 영역에서, 표적 이슈에 수직으로 투여된다. 미국 특허 번호 7,245,963 및 미국 특허 공보 2005/005263에 기술된 전극은 바람직하게는 20 mm 길이 및 21 게이지이다.
추가로, 전기천공법 장치 및 그의 용도를 포함하는 일부 양태에서 고려하면, 하기 특허에 기재된 것과 같은 전기천공법 장치가 존재한다: 1993년 12월 28일에 허여된 미국 특허 5,273,525, 2000년 8월 29일에 허여된 미국 특허 6,110,161, 2001년 7월 17일에 허여된 6,261,281, 및 2005년 10월 25일에 허여된 6,958,060, 및 2005년 9월 6일에 허여된 미국 특허 6,939,862. 또한, 임의의 다양한 장치를 사용하는 DNA의 투여에 관한 2004년 2월 24일에 허여된 미국 특허 6,697,669에서 제공되는 청구대상을 다루는 특허, 및 DNA를 주입하는 방법에 관한 2008년 2월 5일에 허여된 미국 특허 7,328,064가 본원에서 고려된다. 상기 특허는　전체적으로　참조로 포함된다.
백신을 제조하는 방법
본원에는 본원에 논의된 DNA 플라스미드를 제조하는 방법이 제공된다.　 포유동물 발현 플라스미드로의 최종 서브클로닝 단계 후, DNA 플라스미드는 당업계에　공지된 방법을 사용하여, 대규모 발효 탱크에서　세포 배양물을 접종하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 전기천공법　장치와 사용하기 위한 DNA 플라스미드는 공지된 장치 및 기술의 조합을 사용하여 제형화 또는 제조될 수　있지만,　바람직하게는　이들은　2007년 5월 23일에 출원된 미국 발행된 출원 번호 20090004716에 기술된 최적화 플라스미드 제조 기술을 사용하여 제조된다. 일부 예시에서, 이들 연구에 사용된 DNA 플라스미드는 10 mg/mL 이상의 농도로 제형화될 수 있다. 제조 기술은 또한 라이선싱된 특허인 2007년 7월 3일에 허여된 미국 특허 번호 7,238,522에 기술된 것을 포함하여 미국 일련 번호 60/939792에 기술된 것들 이외에 당업자에게 일반적으로 공지된 다양한 장치 및 프로토콜을 포함하거나 또는 통합한다. 상기 인용된 출원 및 특허, 미국 일련 번호 60/939,792 및 미국 특허 번호 7,238,522는 각각 그 전체가 본원에 포함된다.
본 발명은　하기 비제한적 실시예에　의해 예시된 다수의 측면을 갖는다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 설명된다.　 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 나타내지만, 단지　예시의 방식으로　제공됨을 이해해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특성을 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본 발명을 다양한 용도 및 조건에 적응시키기 위해 본 발명을 다양하게 변경 및 수정할 수 있다. 따라서, 본원에 나타내고 설명된 것 이외에 본 발명의 다양한 변경은 상기 설명으로부터 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 변경은 또한　첨부된 청구항의 범위 내에 속하도록 의도된다.
실시예 1: 공통 메소텔린 서열의 생성
GenBank에 3가지 메소텔린 변이체가 보고되어 있다.　 변이체 1 및 2는 뉴클레오티드 수준에서 98% 동일하고 변이체 3은 대안적으로 스플라이싱된 C-말단이 GPI 앵커 영역을 방해하는 부분 서열이다.　 3개의 전사체 모두　인간 암 세포에 의해 발현되는 것으로 보고되었다.　 서열 분석에 기초하여, 변이체 1을 표적화하는 백신은 또한　변이체 2 및 3의 서열의 대부분을 표적화할 것이다. 또한, 변이체 1은 난소　종양에서 발현된 주요 전사체이다.　 따라서, 변이체 1이 백신　표적으로서 선택되었다.
인간 공통 메소텔린　인간을 생성하기 위해, 14개의 메소텔린　서열을 GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)로부터 수집하였다. 선택된 메소텔린 서열에 대한 GenBank 수탁 번호는 다음과 같다: NP_005814.2, BAA084l9.l, AAH09272.l, AAV87530.l, AAH03512.l, XP_008959182.1, AAC50348.l, XP_009428309.1, XP_007978969.1, XP_011822299.1, XP_011817841.1, XP_011822298.1, XP_009193880.1, 및 XP_011817843.1.
DNASTAR® 레이저유전자 소프트웨어 패키지 (버전 13.0.0.357)를 사용하여 공통 서열을 생성하였다. GenBank로부터의 메소텔린 서열을 MegAlign으로 불러오고 ClustalW 다중　서열 정렬 프로그램을　사용하여　정렬하였다. 생성된 메소텔린 공통 서열 (서열 번호 1)은 천연 인간　메소텔린과 95.8% 상동성을 공유한다.
실시예 2: 메소텔린의　기능을 폐지하기 위한　돌연변이의 도입
생성된 공통 메소텔린 단백질의 잠재적 생물학적　기능을 폐지하기 위해, 하나의 돌연변이를 MUC16/CA125 결합을 폐지하기 위해 도입하였다. 추가적으로, GPI-부착을 방해하기 위해 2개의 돌연변이를 도입하였다. 이들 돌연변이의 도입에 대한 근거는 하기에 기술되어 있다.
MUCJ6/CA125 결합 돌연변이
절단된 돌연변이 유발을 MUC16/CA125에 대한 메소텔린 상의 결합 부위를 식별하기 위해 사용하였다 (도 1). 도 1에 도시된 바와 같이, 메소텔린 전구체 (71-kDa)는 2개의 생성물, 30-kDa 거핵구 강화 인자 (MPF; 잔기 Ser34-Arg286) 및 Glu296로부터 시작하는 41-kDa GPI-고정된 막-결합된 성숙 메소텔린 (연회색)으로 나뉜다. 단백질 분해 절단 영역 (회색 빗금)은 Arg295의 푸린 절단 부위 및 Arg286의 트립신 절단 부위를 포함하는 다른 프로테아제 절단 부위를 함유한다. 메소텔린 상의 4개의 예측된 N-연결된 글리칸 (검은 막대; Asn57, Asn388, Asn488, 및 Asn515)이 표시되어 있다. 메소텔린의 CA125-결합 도메인을 순차적으로 좁히기 위해 절단된 돌연변이체 (영역 I, II, III, IAB, IBC, IA, IB, 및 IC)를 토끼 Fc 융합 단백질로서 생성하였다.
Kaneko et al., J. Biol Chem, 2009 Feb 6; 284(6):3739-49의 도 5에 나타낸 바와 같이, 위치 318의 티로신을 알라닌으로 치환 (Y3l8A)한 것은 CA125와의 상호 작용을 완전히 저해하였다. Glu324 (E324A; KD 42.4 nM) 및 Trp321 (W321A; KD 19.5 nM)에서 알라닌 돌연변이는 CA125에 대한 메소텔린의 결합을 감소시켰다. His354에서 알라닌 돌연변이 (H354A)는 메소텔린-CA125 상호작용을 변화시키지 않았다 (KD 2.71 nM).
Kaneko et al., J. Biol Chem, 2009 Feb 6; 284(6):3739-49의 도 4에 나타낸 바와 같이, 영역 IAB (296-359) 내의 알라닌 돌연변이체의 웨스턴 블랏은 상이한 결합을 나타냈다. Tyr3l8 (Y3l8A) 및 Glu324 (E324A)에서 알라닌 돌연변이는 CA125에 대한 메소텔린의 결합을 폐지시켰다. Trp321 (W321A)에서 알라닌 돌연변이는 CA125에 대한 메소텔린의 결합을 부분적으로 감소시켰다. His354에서 알라닌 돌연변이는 메소텔린-CA125 상호작용을 변화시키지 않았다.
마지막으로, Kaneko et al., J. Biol Chem, 2009 Feb 6; 284(6):3739-49의 도 6에 나타낸 바와 같이, 형광 강도 (기하 평균)를 CA125 결합을 정량적으로 측정하기 위해 사용하였다. CA125에 대한 메소텔린의 전체 길이의 성숙 형태 (FULL)의 결합을 100%의 결합으로 정하였다. 영역 I (296-390), 영역 IAB (296-359), 및 IAB의 H354A 돌연변이체는 임의의 다른 단편 또는 열거된 돌연변이체보다 유의하게 강하게 CA125에 결합하였다 (*, p _ 0.05). Y318A 돌연변이는 메소텔린의 전체 길이의 성숙 형태에 비해 결합을 크게 감소시켰다. 이러한 발견을 근거로, Y3l8A 돌연변이를 최종 합성 공통 메소텔린 서열로 도입하였다.
GPI-부착 부위
GPI-고정 신호는 친수성 스페이서 영역에 의해 GPI-부착 부위 (ω-부위)로부터 분리된 소수성 영역으로 이루어진다 (도 2). 부착 부위는　짧은 측쇄를 갖는　3개의　연속 아미노산　중 첫 번째이다. 그 뒤에 보통 비구조화된 짧은 스페이서 서열이 뒤따라야 하며, 이어서 카르복시-말단 소수성 신호 서열이 뒤따른다. Mayor, S. & Riezman, H. Nature reviews. Molecular cell biology 5 (2004). 메소텔린의 ω-부위는 세린에서 트레오닌으로 돌연변이되었다. 메소텔린의 ω+2는 트레오닌에서　발린으로 돌연변이되었다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 합성 공통 메소텔린 단백질 서열은 인간 천연 메소텔린과 95.2% 동일성을 공유한다.
표 1
실시예 3: 합성 공통 메소텔린 작제물의 특징화
합성 공통 메소텔린 DNA 서열이 수득되면, 보다 높은 발현 수준을 갖기 위해, 업스트림 코작 서열 및　IgE　선도 서열을 N-말단에 첨가하였다. Yang, J. S. et al. The Journal of infectious diseases 184, 809-816 (2001). 또한,　유전자의 코돈 사용은 호모 사피엔스 유전자의 코돈 편향에　맞추었다. Andre, S. et al. Journal of virology 72, 1497-1503 (1998); Deml, L. et al. Journal of virology 75, 10991-11001 (2001). RNA 최적화는 또한 매우 높은 (>80%) 또는 매우 낮은 (<30%) GC 함량의 영역 및 내부 TATA 박스, 카이-부위 및 리보솜 진입 부위와 같은 시스 작용 서열 모티프가 회피되도록 수행하였다. Muthumani, K. et al. Virology 314, 134-146 (2003); Muthumani, K. et al. Virology 314, 134-146 (2003).
합성 공통 메소텔린 작제물의 개략도는 도 3에 나타낸다. 별표(*)는 MUC16 결합 및 GPI 부착을 폐지하는 돌연변이를 나타낸다. 합성 공통 메소텔린에 대한 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 1) 및 아미노산 (서열 번호 2)는 각각 표 16 및 표 17에 제시된다. 서열 번호 2의 요소와 해당 아미노산의 주석은 표 2에 제공된다.
표 2
합성 공통 설계 과정의 가능한 단백질 구조 효과를 보다 잘 이해하기 위해, MPF 및 메소텔린의 분자 전구체의 비교 모델을 생성하였다. 모델을 정렬하고 생성하는 데 여러 보조 구조 요소를 사용하였다. 예측된 글리코실화 부위는 모델의 표면에 올바르게 배향되었다. 모델의 메소텔린 부분은 Sathyanarayana et al.에 의한 작업으로부터 추정하였고 일련의 ARM 반복으로 모델링하였다. Sathyanarayana, B. K., Hahn, Y. et al. BMC structural biology 9, 1 (2009) Sathyanarayana 참조는 이황화 결합의 위치를 다루지 않는 것으로 보였다. 이 특징은 개선된 모델에서 제시되었으며 국소적으로 올바르게 배향되었다. 또한, 잠재적 N-연결된 글리코사이트는 표면에 접근 가능하다.
합성 공통 메소텔린의 특징은 표 3에 요약되어 있다.
표 3
실시예 4: 플라스미드 구성 및 구조
벡터 백본은 pGX0001, 인간 시토메갈로바이러스 조기-발현 프로모터 (hCMV 프로모터)의 제어 하의 2998 bp 변형 pVAXl 발현 벡터이다. 원래 pVAXl는　써모 피셔 사이언티픽으로부터 수득하였다. pGX0001 백본은 카나마이신 내성 유전자 (KanR) 및 생산을 위한 플라스미드 복제 원점 (pUC ori)을 포함한다. 이러한 요소는 진핵 세포에서 기능하지 않는다. 변형된 발현 벡터　pVAXl (pGX0001)의 맵 및 설명은 도 4에 나타낸다.
pGX0001을 생성하기 위해 pVAXl에　변형이 도입되었다. 이들 변형은 표 4에 열거되어 있으며, 플라스미드 증폭 및　항체 전사 및 번역에 관한 문제는 발견되지 않았다. pGX0001을 백본으로 사용하여 현재까지 pGX0001의 서열에서 더 이상의 변화는 관찰되지 않았다. 염기 쌍 2, 3 및 4는 백본, CMV 프로모터의 업스트림에서 ACT에서 CTG로 변경된다.
표 4
합성된 합성 공통 메소텔린은 BamHI 및 Xhol으로 소화되고, 시토메갈로 바이러스 조기-발현 프로모터의 전사 제어 하의 배치된 발현 카세트를 사용하여 pGX0001로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드는 pGX1430로 지정하였다. 전체 길이　시퀀싱을 수행한 후 두 분석가에 의해 분석되고 정확하게 확인되었다. pGX1430의 개략도는 도 5에 제시되어 있다.
실시예 5: 시험관 내 항원 발현
pGX1430에 의한　항원　단백질의　발현을 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다. 10% FBS (써모피셔)를 갖는 DMEM 배지에 유지시킨 인간 횡문근육종 (RD) 세포 (ATCC, CCL-136)를 터보펙틴 8 (Origene)을 사용하여 pGX1430 또는 pGX0001 (6 μg/10cm2 디시)로 형질감염시켰다. 형질감염 48　시간　후, RIPA 세포 용해 완충액 (써모피셔)을 사용하여 세포를 용해시키고 세포 용해물을 수집하였다. 총 단백질 농도를 측정하기 위해 BCA 분석 (써모피셔)을 수행하였고, 15 μg의 세포 용해물을 4 내지 12% SDS-PAGE 겔 (써모피셔) 상에서 전기영동시키고 시판 항-메소텔린 항체 (세포 신호전달 기술 클론 D4X7M)를 사용하여 검출을 수행한 후 ECL 웨스턴 블랏 분석 시스템 (GE 헬스케어)을 사용하여 홍당무과산화효소 (HRP)-접합 항-토끼 IgG (산타 크루즈 바이오텍 #sc-2004)로 시각화하였다. 로딩 대조군으로서, 블랏을 항-β-액틴 단클론성 항체 (산타 크루즈 바이오텍, 클론, C4)를 사용하여 액틴 발현에 대해 재프로브시켰다.
인간 메소텔린 전구체는 46 내지 48 kDa에서 절단된 글리코실화된 형태를 갖는 70 kDa인 반면 합성 공통 메소텔린 전구체는 35 내지 37 kDa에서 절단된 글리코실화된 형태를 갖는 64.28 kDa이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 예상된 분자량의 단백질 밴드가 pGX1430 (64.28 kD)에 대해 검출되었다. pGX0001 레인에서는 단백질 밴드가 검출되지 않았다. 항-β-액틴 밴드가 각각의　레인에 동일한 양의 단백질이 로딩되었음을 나타내는 유사한 강도로 검출되었다.
실시예 6: 합성 공통 메소텔린 백신 작제물의 면역원성
동물 및 면역화
8-주령의 CB6Fl 암컷 마우스를 잭슨 연구소로부터 구입하였다. 모든 동물을 BTS 연구소 (San Diego, CA)의 온도-조절, 광 순환 시설에서 수용하였다. 동물 관리는　국립 건강 연구소 및 동물 관리 및 사용 제안 (ACUP) (BTS ACUP #15-091)에 따라 수행하였다. 마우스를 표　5에　상세히 기재된 바와 같이 5개의 군으로 나누었다.
표 5
면역화된 군의 마우스를 SOP R20-003147 CELLECTRA® 3P 마우스 처리에 따라 pGX0001 또는 pGX1430의 지시 용량으로 백신 접종하였다. 간략히, 플라스미드를 주사용 멸균수 (베트원)로 제제화하여, 지시된 용량이 30 μL 주사 부피로 경골 전방 근육 내로 근육 내 주사에 의해 전달되도록 하였다. 각각의 근육 내 주사 후 즉시 3P 어레이를 갖는 CELLECTRA® 2000 조정 정전류 전기천공 장치(이노비오 파마수티컬)를 사용하여 전기천공 (EP)을 수행하였다. 이 장치는 1초 지연 간격으로 52ms 펄스 폭의 2 개의 0.1 Amp 펄스를 전달하도록 구성되었다. 마우스는 3주 간격으로 3회의 면역을 받았다. 마지막 면역화 3주 후 마우스를 희생시키고 세포 면역 판독을 위해 비장을 수확하였다. 다른 조직은 수집하지 않았다.
비장 림프구 단리
비장 세포를 무균적으로 단리하고 5 mL의 R10 배지 (10% 태아　소　혈청 및 1% 항생제-항진균제가 보충된 로스웰 파크　메모리얼　연구원 배지 1640)에 두었다. 비장 세포를 스토마처 기구 (Seward 실험실 시스템 사)를 사용하여 비장을 기계적 파괴하여 단리하고, 결과 생성물을 40-μm 세포 스트레이너 (BD 팔콘)를 사용하여 여과하였다. 결과 생성물을 원심분리하고 펠렛을 RBC의 용해를 위해 ACK 용해 완충액(론자)으로 5분간 처리하였다. 이어서 비장세포를 원심분리하고, PBS에서 세척하고, 그런 다음 Rl0 배지에 재현탁하고 즉시 추가 분석을 위해 사용한다.
IFNγELISpot
마우스 IFNγELISpot 분석 (MabTech)을 항체-특이적 세포 반응을 평가하기 위해 수행하였다. 항-마우스 IFNγ 항체로 사전 코팅된 96 개의 웰 플레이트를 PBS에서 세척하고 완전한 배양 배지 (10% FBS 및 항생제가 보충된 RPMI 1640)로 실온에서 2시간 동안 차단시켰다. 비장 림프구를 R10 배지에 재현탁시키고 (그런 다음 웰 당 2 x 105 세포의 입력 세포 수로 3회 첨가하였다. 펩티드 세트를 합성하였고 (젠스크립트), 각각은 전체 합성 공통 메소텔린 단백질 서열을 나타내는 11개의 아미노산에 의해 중첩된 15개의 아미노산 잔기를 함유한다. 이들 펩티드 세트를 DMSO (시그마)에 재현탁시키고 ~2μg/ml 펩티드 농도로 2개의 펩티드 풀에 풀링하였다. 펩티드 풀은 합성 공통 메소텔린 항원 단백질에 상응하는 펩티드를 함유하였다. 5μg/ml의 콘카발린 A (시그마)를 양성 대조군으로 사용하였고 완전한 배양 배지를 음성 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2 분위기 배양기에서 18시간 동안 배양하였다. 이어서, 비오티닐화된 항-마우스 IFNγ 검출 항체 (MabTech)를 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척하고, 스트렙타비딘-ALP 항체 (MabTech)를 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양하였다.
키트 제조사 지시 (MabTech)에 따라 스팟 검출을 완료하였다. 자동 ELISPOT 판독기 (셀룰러 테크놀로지)를 사용하여 플레이트 상의 스팟을 계수하였다. 데이터 표시를 위해 평균 스팟 형성 단위 (SFU)의 수를 1 x 106 비장 세포로 조정하였다. IFNγ ELISpot에 의한 항원 특이적 반응은 배지 단독 대조군에서의 SFU보다 큰 1 x 106 비장 세포 당 IFNγ 스팟 형성 단위 (SFU)의 수로 보고된다.
합성 공통 메소텔린 작제물의 면역원성을 4개의 용량 (10 μg, 20 μg, 30 μg, 및 50 μg)에서 IFNγELISpot 및 유동 세포측정에 의해 평가하였다 (n=8/군). 마우스를 음성 대조군으로 빈 플라스미드 백본 (pGX0001)으로 면역화시켰다 (n=4/군). 음성 대조군 백신 접종된 마우스와 비교하여 합성 공통 메소텔린 (pGX1430)에 의한 백신 접종은 세포 면역 반응을 유도하였다. ELISpot에 의해 측정된, 합성 공통 메소텔린 특이적 IFNγ 생산의 규모는 30 및 50 μg 용량 모두에서 달성된 유사한 최대 반응을 가지며 10 및 20 μg 용량에서 용량 의존적인 것으로 측정되었다 (도 7a 및 도 7b). 구체적으로, 합성 공통 메소텔린 IFNγSFU는 10 μg, 20 μg, 30 μg, 및 50 μg 각각에서 1345 ± 1290, 2241 ± 1721, 2242 ± 1932, 및 2004 ± 674였다. 합성 공통 메소텔린 IFNγ 반응은 pGX1430의 10 μg (p=0.004), 20 μg (p=0.004), 30 μg (p=0.004), 및 50 μg (p=0.004) 용량에서 나이브보다 유의하게 컸다. IFNγ 반응은 표 6에 요약되어 있다.
표 6
유동 세포측정
합성 공통 메소텔린에 의해 유도된 세포 면역 반응을 유동 세포측정에 의해 추가로 특징화하였다. 백신 접종 및 나이브 마우스로부터의 2 x 106 비장세포를 브레펠딘 A (BD 바이오사이언스), 모넨신 (BD 바이오사이언스), 및 FITC 항-마우스 CD107a 항체 (BD 바이오사이언스)의 존재 하에 6시간 동안 합성 공통 메소텔린 펩티드를 사용하여 단리 후 즉시 자극하였다. 펩티드로 자극한 후, 비장 세포를 회전시키고 웰 당 20 μL의 마우스 BD Fc 블럭 (BD 바이오사이언스) 용액에 재현탁시켰다. Fc 블럭은 PBS 중 1:40의 초기 희석에서 사용되고 5분 동안 4℃에서 배양하였다.
배양 후, 남은 세포외 항체 (PBS 중)을 웰 당 30 μL로 첨가하고 30분 동안 4℃로 배양되도록 두었다. 세포 외 염색 추가시, 각 웰의 최종 부피는 50 μL이며, 1:100의 최종 희석에서 Fc 블록 및 적절한 작업 희석의 세포 외 항체로 이루어진다. 그런 다음 세포를 생존력 염료 (비비드, 써모-피셔) 및 다음 세포 외 항체를 사용하여 염색한다: APC-Cy7 항-마우스 CD3e, PerCP-Cy5.5 항-마우스 CD4, 및 APC 항-마우스 CD8a (BD 바이오사이언스). 세포 내 사이토카인은 후속적으로 다음 항체로 염색하였다: BV605 항-마우스 IFNγ, APC-R700 항-마우스 IL-2, 및 PE 항-마우스 TNF-α(BD 바이오사이언스).
ICS 데이터를 10-컬러 FACS CANTO (BD 바이오사이언스) 상에 수집하였고 분석을 FlowJo를 사용하여 완료하였다. 유동 세포측정 게이팅 전략은 도 8에 나타낸다. 유동 세포측정에 의해 세포를 항원 특이적이라고 부르기 위해서는, 보고된 매개 변수의 빈도가 배지 단독 대조군의 빈도를 초과해야 한다. 세포를 항원 특이적 CD107a를 생산하는 것으로 확인하기 위해서는, 세포는 불리언(Boolean) 게이팅에 의해 식별된 바와 같이 IFNγ, 및/또는 IL-2 및/또는 TNFa의 항원 특이적 생산에 대해 양성으로 식별되어야 한다.
합성 공통 메소텔린은 CD4+ T 세포 구획에서의 반응에 비해, CD8+ T 세포 구획에서 더욱 강력한 반응을 유발하였다 (도 9a 내지 9d). 합성 공통 메소텔린은 10 μg (0.29%±0.20%) (p<0.004), 20 μg (0.50%±0.30%) (p<0.004), 30 μg (0.42%±0.24%) (p<0.004) 및 50 μg (0.38%±0.17%) (p<0.004) 용량 군에서 나이브 (0.09%±0.07%) 보다 유의하게 더욱 강력한 항원 특이적 CD4+ T 세포 반응의 빈도를 유도하였다 (도 9a). 합성 공통 메소텔린 특이적 CD4+ T 세포 반응은 10 및 20 μg 용량에서 용량 의존적이지만, 30 및 50 μg 용량에서는 아니며, IFNγ-IL-2-TNFα+, IFNγ+IL-2-TNFα-, IFNγ-IL-2+TNFα+, 또는 IFNγ+IL-2+TNFα+ 생산 CD4+ T 세포로 주로 이루어진다 (도 9c). 항원 특이적 CD4+ T 세포의 빈도는 표 7에서 추가로 설명된다.
표 7
합성 공통 메소텔린에 의해 유도된 항원 특이적 CD8+ T 세포의 빈도는 모든 용량 군에서 대조군에 비해 증가하였다 (도 9b). 구체적으로, 10 μg (0.64%±0.42%) (p=0.016), 20 μg (0.70%±0.48%) (p=0.028), 30 μg (0.97%±0.96%) (p=0.008), 및 50 μg (1.00%±0.22%) (p=0.004)의 pGX1430으로 면역화된 군에서 항원 특이적 CD8+ T 반응의 빈도는 나이브와 비교하여 높은 용량에서 유의하게 더욱 강력하였다 (0.15%±0.04%). 합성 공통 메소텔린 특이적 CD8+ T 세포 반응은 용량에 따라 증가하였고 주로 IFNγ+IL-2-TNFα- 생산 CD8+ T 세포로 이루어졌다 (도 9d). 항원 특이적 CD8+ T 세포의 빈도는 표 8에서 추가로 설명된다.
표 8
모든 용량의 합성 공통 메소텔린은 나이브보다 더 큰 CD4+CD107a+ T 세포의 빈도를 유도하였다 (0.01%±0.01%). 구체적으로, 항원 특이적 CD4+CD107a+ T 세포의 빈도는 10 μg (p=0.004), 20 μg (p=0.004), 30 μg (p=0.016), 및 50 μg (p=0.004) 용량 군에서 각각 0.10%±0.11%, 0.20%±0.13%, 0.16%±0.13%, 및 0.15%±0.11% (도 10a)이었다. 합성 공통 메소텔린 특이적 CD4+CD107a+ T 세포의 사이토카인 프로파일은 용량 군에 걸쳐 유사하였고 IFNγ+IL-2+TNFα+, IFNγ+IL-2+TNFα-, IFNγ+IL-2-TNFα- 세포로 주로 구성되었다 (도 10c). 세포 용해 가능성을 가진 항원 특이적 CD4+ T 세포의 빈도는 표 9에 추가로 설명된다.
표 9
항원 특이적 CD8+ T 세포의 규모와 유사하게, 합성 공통 메소텔린은 나이브에 비교하여 모든 군에서 CD8+CD107a+ T 세포의 빈도에서 유의한 변화를 유도하였다 (0.05%±0.02%) (도 10c). 구체적으로, 항원 특이적 CD8+CD107a+ T 세포의 빈도는 10 μg (p=0.008), 20 μg (p=0.028), 30 μg (p=0.004), 및 50 μg (p=0.004) 용량 군에서 각각, 0.27%±0.22%, 0.57%±0.43%, 0.83%±0.85%, 및 0.90%±0.24%이었다 (도 10a). 합성 공통 메소텔린 특이적 CD8+CD107a+ T 세포의 사이토카인 프로파일은 용량 군에 걸쳐 유사하였고 대부분이 IFNγ-IL-2-TNFα+ 및 IFNγ+IL-2+TNFα+로 구성된 10 μg 용량 군을 제외하고 대부분은 IFNγ+IL-2-TNFa-로 구성되었다 (도 10d). 세포 용해 가능성을 가진 항원 특이적 CD8+ T 세포의 빈도는 표 10에 추가로 설명된다.
표 10
보고된 모든 데이터에 대해 면역화된 그룹 사이의 반응에 전반적으로 유의한 차이가 없었다 (즉, 10 μg는 50 μg 등 보다 유의하게 낮지 않았다).
통계 분석
통계 분석은 IBM SPSS 통계 22 (IBM 사)를 사용하여 완료하였다. 데이터는 많은 비교를 위해 정상적으로 분포되지 않았다. 이러한 이유로, 다중 분석을 위해 모든 분석에 대해 사후 본페르니 교정과 만-휘트니 U 검정을 사용하였다. 통계적 유의성은 p＜0.013에서 가정되었다 (0.05 / 4 비교 = 0.0125).
결론
합성 공통 메소텔린은 반응의 규모가 CD8+ T 세포 구획에서 훨씬 더욱 강력하였지만, 나이브에 비해, 항원 특이적 CD4+, CD4+ CD107a+ 및 CD8+, CD8+CD107a+ T 세포의 빈도를 증가시켰다.
실시예 7: 합성 공통 메소텔린 1가 비인간 영장류 연구
합성 공통 메소텔린 단독 및 저용량 및 고용량의 IL-12과의 조합의 잠재능을 조사하기 위해, 고유한 NHP ID 번호로 각각 식별되는, 18마리의 성체 레소스 원숭이를 6마리의 3군으로 나누고 다음과 같이 pGX1430로 면역화시켰다. 6마리 동물을 SSC에서 1.0 mL 주입 부피로 제형화시킨, 3.0 mg pGX1430로 (군 1), 보조제로서 0.04 mg의 pGX6006 (opt rh IL-12)를 더하여 3.0 mg pGX1430로 6마리 (군 2), 및 보조제로서 0.20 mg의 pGX6006 (opt rh IL-12)를 더하여 3.0 mg pGX1430로 6마리(군 3)를 면역화시켰다. 면역 주사는 0주, 4주, 8주 및 12주에 선택적인 5차 면역화와 함께 투여되었다. 모든 면역화는 멸균 WFI에서 제제화된 1 ml 주사 부피에서 CELLECTRA® 2000 5P-IM EP 장치를 사용하여 반대측 사지를 번갈아서 IM으로 수행하였다. EP 조건은 다음과 같다: OpBlock 0070 - IM, 0.5 Amp, 3 펄스, 52 밀리초, 펄스 간 0.2 초. 메소텔린 면역원성은 2주, 6주, 10주 및 14주에 평가하였다.
군 1 내지 3에 대한 동물 식별, 기원, 성별 및 무게는 표 11에 제공된다.
표 11
PBMC 단리
비인간 영장류 전혈을 항응고제 및 겔 장벽을 함유하는 시트르산 나트륨 세포 제조 튜브(CPT CPT의 BD 바이오사이언스)에 수집하였다. 하룻밤 배송 전에, PMBC를 분리하고 농축하기 위해 채혈 직후 (2시간 이내) 전혈을 회전시킨다. 적혈구 및 호중구는 튜브의 바닥으로 펠렛화되고 겔 장벽에 의해 제자리에 고정된다. 혈장 및 림프구는 겔 장벽 위에 남는다. 각 CPT는 ~8mL의 혈액을 담을 수 있으며 실온에서 배송된다. 샌디에고의 전임상 실험실에 도착하자마자, 회전된 CPT 튜브를 PBMC 단리를 위해 처리하였다. 염화-암모늄-칼륨 (ACK) 완충액으로 적혈구 용해 후, 인비트로겐 CountessTM 자동화 세포 계수기를 사용하여 생존 세포를 계수하고 완전 배양 배지 (10% FBS, 항생제, 및 β 메르캅토에탄올이 보충된 RPMI 1640)에 재현탁시켰다. 이 보고서에 설명된대로 분석이 완료되면, 나머지 PBMC를 냉동 바이알 내 동결 배지 (세라딤의 90% FBS 중 시그마의 10% DMSO)에서 동결시키고 액체 질소에서 장기간 보관하였다.
IFNγELISpot
백신으로 유도된 항원-특이적 세포 반응을 평가하기 위해, 키트 (MabTech IFNγELISpotPro, #3421M-2APW-10)를 사용하여 단리된 PMBC 상에서 원숭이 IFNγELISpot 분석을 각 시점에서 수행하였다. 간략하게, 항-원숭이 IFNγ 항체 (mAb MT126L)로 사전 코팅된 98 웰을 PBS에서 세척하고 완전 배양 배지(10% FBS, 항생제, 및 β 메르캅토에탄올로 보충된 RPMI 1640)를 사용하여 실온에서 2시간 동안 차단시켰다. NHP PBMC를 R10 배지에 재현탁시키고 (그런 다음 웰 당 2 x 105 세포의 입력 세포 수로 3회 첨가하였다. 전체 합성 공통 단백질 서열을 나타내는 11 개의 아미노산에 의해 15 개의 아미노산 잔기가 중첩된 펩티드 세트(젠스크립트)를 합성하였다. 이들 펩티드 세트를 DMSO (시그마)에 재현탁시키고 각각의 펩티드의 대략 2 μg/mL의 농도로 풀에 풀링하였다. 모든 항원 특이적 풀링된 펩티드는 1:100 희석으로 사용하였고, 이는 PBMC와 조합될 때 각각의 웰에서 1:200의 최종 희석을 초래한다. 메소텔린에 대해 4개의 풀을 생성하였다.
항-CD3 (mAb CD-2 Mabtech) 및/또는 이노마이신 (시그마)을 갖는 PMA (시그마)를 양성 대조군으로 사용하였다. 완전 R10 배양 배지를 음성 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2 분위기 배양기에서 대략 18시간 동안 배양하였다. 세포 제거 후, 및 ALP 접합 항-원숭이 IFNγ 검출 항체(MabTech Ab 7-B6-1-ALP)의 첨가 후, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음 샌드위치 면역 효소 분석을 키트 제조사 지시 (MabTech)에 따라 BCIP/NBT 기질 용액을 사용하여 진행시켰다. 각각 개별 IFNγ 생성 세포를 드러내기 위해 스팟으로 청-흙 색상 침전물이 형성된다. 그런 다음 스팟을 스캔하고 CTL ImmunoSpot® 분석기 및 소프트웨어 (셀룰러 테크놀로지)에 의해 계수하고, 숙련된 작업자가 품질 관리한다. IFNγ 반응은 배지 단독 대조군의 SFU보다 lxl06 PMBC 더 큰 스팟 형성 단위 (SFU)로 보고된다.
면역학 결과
메소텔린 특이적 IFNγ 반응을 군 1 내지 3에 대해 도 11a 내지 11c에 나타내고, 여기서 면역화는 메소텔린 단독 (도 12a), 저용량의 IL-12 (0.04 mg)를 갖는 메소텔린 (도 11b), 또는 고용량의 IL-12 (0.2 mg)를 갖는 메소텔린 (도 11c)으로 수행하였다. 결과는 투여 2주 후 각 시점에서의 반응을 나타낸다. 전반적으로, 모든 군 및 개별 동물은 기준선 프리블리드와 비교하여 용량 4 후 2주에 연구 종료시 반응이 증가하였다. 도 11a 내지 11c는 PD3를 통한 합성 공통 메소텔린에 대한 IFNγ 반응에 관한 보조제 효과를 제공하는 IL-12에 대한 경향을 나타낸다.
도 12a 내지 12c는 평균화된 메소텔린-특이적 IFNγ 반응을 묘사하고, 여기서 면역화는 메소텔린 단독 (도 12a), 저용량의 IL-12 (0.04 mg)를 갖는 메소텔린 (도 12b), 또는 고용량의 IL-12를 갖는 메소텔린 (0.2 mg)으로 수행하였다 (도 12c). 도 12a 내지 12c는 IL-12가 합성 공통 메소텔린에 대한 IFNγ의 규모를 증가시켰지만, 넓게 증가시키지 않았음을 나타낸다.
생리학적 매개 변수
각각, 표 12, 13 및 14에 나타낸 바와 같은 군 1, 2 및 3에 대한 면역화로 인해, 측정된 생리학적 매개변수에는 차이가 없었다. RBC, HCT, 호중구, 림프구, 단핵구, 호산구에 대해서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 이러한 값은 유사한 실험 절차를 거치는 이러한 종의 동물, 성별 및 연령의 예상 범위 내에 있다. 명시된 정상 범위로부터의 모든 변이는 산발적이며, 한 성별로만 나타나며, 용량 수준이나 시기와 관련이 없다.
표 12
표 13
표 14
모든 군에 대해, 연구 과정에 걸쳐 체중의 유의한 변화는 없으며, 아래 표 15에 나타낸 바와 같이 정상 범위는 4 내지 12이다.
표 15
전체적으로 결과는 단독 투여된 합성 공통 메소텔린은 NHP의 100%에서 면역 반응을 유도 가능함을 나타낸다. IL-12 보조제의 첨가에 따른 유의한 개선은 없었다.
전술한 상세한 설명 및 첨부된 예시는 단지 예시적인 것이며 첨부된 청구항 및 그 등가물에 의해서만 정의되는, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 않는 것으로 이해된다.
개시된 양태에 관한 다양한 변화 및 변경은 당업자에게 명백할 것이다. 화학 구조, 치환기, 유도체, 중간체, 합성물, 조성물, 제제, 또는 발명의 사용 방법에 관한 것에 제한되지 않는, 개시된 양태에 관한 이러한 변화 및 변경은 본 발명의 사상 및 그 범위를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.
표 16: 합성 공통 메소텔린 DNA 코딩 서열
표 17: 합성 공통 메소텔린 단백질 서열
<110> INOVIO PHARMACEUTICALS, INC YAN, Jian SLAGER, Anna GARMAN, Bradley COOCH, Neil <120> CANCER VACCINES TARGETING MESOTHELIN AND USES THEREOF <130> INO-1002WO / 104409.000444 <150> US 62/598,289 <151> 2017-12-13 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1827 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Consensus Mesothelin DNA Coding Sequence <400> 1 atggactgga catggattct gtttctggtc gccgccgcta cacgagtgca ttcaagcagg 60 gctctggcag gggagactgg gcaggaagca gccccactgg acggcgtgct ggcaaaccct 120 cccgatatca gctccctgag ccctagacag ctgctgggct tcccatgcgt ggaggtgagc 180 ggcctgtcca ccgagagggt gcgcgagctg gcagtggccc tggcacagaa gaatgtgaag 240 ctgtccgccg agcagctgag gtgcctggca cacaggctgt ctgagccacc cgaggacctg 300 gatgcactgc cactggacct gctgctgttc ctgaaccccg atgcctttag cggccctcag 360 gcctgtacaa ggttcttttc ccgcgtggcc aaggccaatg tggacctgct gcctaggggc 420 gccccagagc ggcagagact gctgccagcc gccctggcat gctggggcgt gaggggctct 480 ctgctgagcg aggcagacgt gcgcgccctg ggcggcctgg cctgtgatct gcctggccgc 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Asn Val Lys 65 70 75 80 Leu Ser Ala Glu Gln Leu Arg Cys Leu Ala His Arg Leu Ser Glu Pro 85 90 95 Pro Glu Asp Leu Asp Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Leu Phe Leu Asn 100 105 110 Pro Asp Ala Phe Ser Gly Pro Gln Ala Cys Thr Arg Phe Phe Ser Arg 115 120 125 Val Ala Lys Ala Asn Val Asp Leu Leu Pro Arg Gly Ala Pro Glu Arg 130 135 140 Gln Arg Leu Leu Pro Ala Ala Leu Ala Cys Trp Gly Val Arg Gly Ser 145 150 155 160 Leu Leu Ser Glu Ala Asp Val Arg Ala Leu Gly Gly Leu Ala Cys Asp 165 170 175 Leu Pro Gly Arg Phe Val Ala Glu Ser Ala Glu Val Leu Leu Pro Arg 180 185 190 Leu Val Ser Cys Leu Gly Pro Leu Asp Gln Asp Gln Gln Glu Ala Val 195 200 205 Arg Ala Ala Leu Gln Gly Gly Gly Pro Pro Tyr Gly Pro Pro Ser Thr 210 215 220 Trp Ser Ile Ser Thr Leu Asp Ala Leu Arg Gly Ser Leu Pro Val Leu 225 230 235 240 Gly Gln Pro Val Ile Arg Ser Ile Pro Gln Gly Ile Leu Ala Ala Trp 245 250 255 Arg Gln Arg Ser Ser Arg Asp Pro Ser Trp Arg Gln Pro Glu Arg Thr 260 265 270 Val Leu Arg Pro Arg Phe Arg Arg Asp Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro 275 280 285 Ser Gly Lys Lys Val His Glu Ile Asp Glu Ser Leu Ile Phe Ala Lys 290 295 300 Lys Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val Asp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Gln 305 310 315 320 Met Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val 325 330 335 Leu Lys His Lys Leu Asp Glu Leu Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser 340 345 350 Val Thr Gln His Leu Gly Tyr Leu Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp 355 360 365 Ile Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu 370 375 380 Glu Val Asn Lys Gly His Glu Met Ser Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile 385 390 395 400 Asp Arg Val Val Lys Gly Arg Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr Val Asp 405 410 415 Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu 420 425 430 Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser Ile Gly Ala Val Arg Pro Gln 435 440 445 Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys 450 455 460 Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys 465 470 475 480 Ile Gln Pro Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu 485 490 495 Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg 500 505 510 Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu 515 520 525 Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His Arg Pro Val 530 535 540 Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly 545 550 555 560 Leu Gly Leu Gln Gly Gly Ile Pro Asn Gly Tyr Leu Val Leu Asp Leu 565 570 575 Ser Val Arg Glu Ala Leu Thr Gly Val Pro Cys Leu Leu Gly Pro Gly 580 585 590 Pro Val Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Ser Thr Leu Ala 595 600 605

Claims (35)

  1. 핵산 분자로서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자:
    (a)　서열 번호　2의 아미노산 19-607을 암호화하는 핵산 서열; 및　
    (b)　서열 번호 2의 아미노산 19-607과 적어도 96% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 상기 단백질은 서열 번호 2에 대해 아미노산 위치 303에 알라닌, 아미노산 위치 583에 트레오닌, 및 아미노산 위치 585에 발린을 포함하는 것인, 상기 핵산 서열.
  2. 핵산 분자로서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자:
    (a)　서열 번호 1의 뉴클레오티드 55-1821; 및　
    (b)　서열 번호 1의 뉴클레오티드 55-1821과 적어도 96% 동일한 단편으로서, 상기 단편은 서열 번호 2에 대해 아미노산 위치 303에 알라닌, 아미노산 위치 583에 트레오닌, 및 아미노산 위치 585에 발린을 암호화하는 것인, 상기 단편.
  3. 핵산 분자로서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자:
    (a)　서열 번호　2를 암호화하는 핵산 서열; 및　
    (b)　서열 번호 2와 적어도 96% 동일한 단백질을 암호화하는 핵산 서열로서, 상기 단백질은 서열 번호 2에 대해 아미노산 위치 303에 알라닌, 아미노산 위치 583에 트레오닌, 및 아미노산 위치 585에 발린을 포함하는 것인, 상기 핵산 서열.
  4. 핵산 분자로서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자:
    (a)　서열 번호　1; 및　　
    (b)　서열 번호 1과 적어도 96% 동일한 단편으로서, 상기 단편은 서열 번호 2에 대해 아미노산 위치 303에 알라닌, 아미노산 위치 583에 트레오닌, 및 아미노산 위치 585에 발린을 암호화하는 것인, 상기 단편.
  5. 서열 번호　1에　제시된 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자.
  6. 제　1 항 내지 제　5　항 중 어느 한　항의 핵산　분자를　포함하는 벡터.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 프로모터 및 폴리아데닐화 신호로부터 선택된 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 벡터.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 프로모터가 인간 시토메갈로 바이러스 조기 발현 프로모터 (hCMV　프로모터)인, 벡터.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호가 소 성장 호르몬　폴리아데닐화 신호 (bGH　폴리A)인, 벡터.
  10. 제 6 항에 있어서, 상기 벡터가 플라스미드 또는 바이러스성 벡터인, 벡터.
  11. 제 1 항 내지 제　5　항 중 어느 한 항의 하나 이상의 핵산 분자를 포함하여, 메소텔린-발현 암성 세포를 가진 대상체에서 메소텔린-발현 암의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,약학적으로 허용되는　담체를　추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  13. 제 6 항의 하나 이상의 벡터를 포함하여, 메소텔린-발현 암성 세포를 가진 대상체에서 메소텔린-발현 암의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  14. 제　13 항에　있어서, 약학적으로 허용되는　담체를　추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 단백질로서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질:
    (a)　서열 번호　2의 아미노산　19-607; 및
    (b) 서열 번호 2의 아미노산 19-607과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열로서, 서열 번호 2에 대해 아미노산 위치 303에 알라닌, 아미노산 위치 583에 트레오닌, 및 아미노산 위치 585에 발린을 포함하는 상기 아미노산 서열.
  16. 단백질로서, 하기로 이루어진　군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 단백질:
    (a)　서열 번호　2; 및　　
    (b)　서열 번호 2와 적어도 96% 동일한 아미노산 서열로서, 서열 번호 2에 대해 아미노산 위치 303에 알라닌, 아미노산 위치 583에 트레오닌, 및 아미노산 위치 585에 발린을 포함하는 상기 아미노산 서열.
  17. 단백질로서, 서열 번호　2에　제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
  18. 항원을 포함하여, 메소텔린-발현 암에 지시된(directed) 포유동물에서 면역 반응을 발생시키거나 유발하기 위한 백신으로서,
    상기 항원은 서열 번호　2에　제시된 아미노산 서열을 포함하는 것인, 백신.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 항원은 서열 번호 1에 의해 암호화되는, 백신.
  20. 펩티드를 포함하여, 메소텔린-발현 암에 지시된(directed) 포유동물에서 면역 반응을 발생시키거나 유발하기 위한 백신으로서,
    상기 펩티드는　서열 번호　2에　제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 96%의 동일성을 갖고 서열 번호 2에 대해 아미노산 위치 303에 알라닌, 아미노산 위치 583에 트레오닌, 및 아미노산 위치 585에 발린을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인,
    백신.
  21. 핵산 분자를 포함하여, 메소텔린-발현 암에 지시된(directed) 포유동물에서 면역 반응을 발생시키거나 유발하기 위한 백신으로서,
    상기 핵산 분자는,　서열 번호　1에　제시된　핵산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 96%의 동일성을 갖고 서열 번호 2에 대해 아미노산 위치 303에 알라닌, 아미노산 위치 583에 트레오닌, 및 아미노산 위치 585에 발린을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것인,
    백신.
  22. 핵산　분자를 포함하여, 메소텔린-발현 암에 지시된(directed) 포유동물에서 면역 반응을 발생시키거나 유발하기 위한 백신으로서,　
    상기 핵산 분자는, 서열 번호　2에　제시된 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 96%의 동일성을 갖고 서열 번호 2에 대해 아미노산 위치 303에 알라닌, 아미노산 위치 583에 트레오닌, 및 아미노산 위치 585에 발린을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 암호화하는 것인,
    백신.
  23. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 발현　벡터를 포함하는, 백신.
  24. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 백신.
  25. 제 21 항 또는 제 22 항에 있어서, 추가로 보조제(adjuvant)를 포함하는,　백신.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 보조제가 IL-12, IL-15, IL-28, 또는　RANTES인, 백신.
  27. 제 15 항 내지 제　17 항　중 어느 한 항의 단백질의 치료학적 유효량을 포함하여, 메소텔린-발현 암성 세포를 가진 대상체에서 메소텔린-발현 암의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  28. 제 1 항 내지 제　5 항　중 어느 한 항의 핵산 분자, 또는 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터의 치료적 유효량을 포함하여, 메소텔린-발현 암성 세포를 가진 대상체에서 메소텔린-발현 암의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 전기천공에 의한 투여를 위해 제조되는 것인, 약제학적 조성물.
  30. 제 28 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 상기 대상체의 하나 이상의 부위에서의 투여를 위해 제조되는 것인, 약제학적 조성물.
  31. 제 1 항 내지 제　5 항　중 어느 한 항의 핵산 분자, 또는 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터, 또는 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 단백질의 체액성 면역 반응을 유도하기에 효과적인　양을 포함하여, 메소텔린-발현 암성 세포에 대해 대상체를 백신 접종하기 위한 약제학적 조성물.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 전기천공에 의한 투여를 위해 제조되는 것인, 약제학적 조성물.
  33. 제 31 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 상기 대상체의 하나 이상의 부위에서의 투여를 위해 제조되는 것인, 약제학적 조성물.
  34. 삭제
  35. 삭제
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