[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

KR102621919B1 - iPSC-유래 세포의 장기 등가물로의 분화를 확립하는 신규한 다중 장기 칩 - Google Patents

iPSC-유래 세포의 장기 등가물로의 분화를 확립하는 신규한 다중 장기 칩 Download PDF

Info

Publication number
KR102621919B1
KR102621919B1 KR1020207020918A KR20207020918A KR102621919B1 KR 102621919 B1 KR102621919 B1 KR 102621919B1 KR 1020207020918 A KR1020207020918 A KR 1020207020918A KR 20207020918 A KR20207020918 A KR 20207020918A KR 102621919 B1 KR102621919 B1 KR 102621919B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ipsc
derived
organ
cells
iii
Prior art date
Application number
KR1020207020918A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200104880A (ko
Inventor
우베 마르크스
안자 람메
Original Assignee
티슈스 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 티슈스 게엠베하 filed Critical 티슈스 게엠베하
Publication of KR20200104880A publication Critical patent/KR20200104880A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102621919B1 publication Critical patent/KR102621919B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/16—Microfluidic devices; Capillary tubes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0671—Three-dimensional culture, tissue culture or organ culture; Encapsulated cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0672—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells; Oval cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0697—Artificial constructs associating cells of different lineages, e.g. tissue equivalents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/14—Coculture with; Conditioned medium produced by hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/23—Gastro-intestinal tract cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/25—Urinary tract cells, renal cells
    • C12N2502/256—Renal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/28—Vascular endothelial cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2531/00—Microcarriers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 미세유체 장치 상에서 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 세포의 장기 등가물로의 분화를 확립하는 신규한 다중 장기 칩 및 상응하는 장기 등가물의 생성 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 하이드로겔 내에 생체인쇄된 및/또는 하이드로겔 상에 씨딩된 iPSC-유래 내피 세포 및/또는 장기유사체로 생성된 장기 장벽을 모방하는 신규한 생체공학적 조직 구조체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 iPSC-유래 장기 전구체 세포 및 iPSC-유래 섬유아세포 및 내피 세포를 공동-배양하는 단계를 포함하는 장기 구조체의 생체공학 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 (i) iPSC-유래 간세포 전구체 세포; (ii) iPSC-유래 장 전구체 세포; (iii) iPSC-유래 신세뇨관 전구체 세포; 및 (iv) iPSC-유래 신경 전구체 세포를 포함하는 미세유체 장치를 제공하며, (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포는 단일 유형의 체세포로부터 재프로그래밍된 단일 공여자 iPSC로부터 분화된다.

Description

iPSC-유래 세포의 장기 등가물로의 분화를 확립하는 신규한 다중 장기 칩
본 발명은 미세유체 장치 상에서 유도 만능 줄기 세포 (induced pluripotent stem cell, iPSC)-유래 세포의 장기 등가물로의 분화를 확립하는 신규한 다중 장기 칩 및 상응하는 장기 등가물의 생성 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 하이드로겔 내에 생체인쇄된 및/또는 하이드로겔 상에 씨딩된 iPSC-유래 내피 세포 및/또는 장기유사체(organoids)로 생성된 장기 장벽을 모방하는 신규한 생체공학적 조직 구조체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 iPSC-유래 장기 전구체 세포 및 iPSC-유래 섬유아세포 및 내피 세포를 공동-배양하는 단계를 포함하는 장기 구조체의 생체공학 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 (i) iPSC-유래 간세포 전구체 세포; (ii) iPSC-유래 장(intestinal) 전구체 세포; (iii) iPSC-유래 신세뇨관(renal tubular) 전구체 세포; 및 (iv) iPSC-유래 신경 전구체 세포를 포함하는 미세유체 장치를 제공하며, (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포는 단일 유형의 체세포로부터 재프로그래밍된(reprogrammed) 단일 공여자 iPSC로부터 분화된다.
미세유체 장치는 in vitro에서 가장 작은 생물학적으로 허용가능한 척도로 인간 생물학을 모방할 수 있다. 종래의 (정치(static)) 세포 및 조직 배양과는 대조적으로, 미세생리학적 시스템은 인간 세포 및 조직의 최소 사용으로 장기 기능을 모방하기 위한 인자로서 조직의 생리학적 영양을 위해 동적 유체 흐름을 적용한다. 다중 장기 칩의 기술은 약물 개발 및 독성 시험 측면에서 제약 산업에 특히 중요하다. 다중 장기 칩 모델은 복잡한 생물학적 과정에 대한 기본적인 이해를 향상시킬 수 있으며, 화장품뿐만 아니라 약물에 대한 보다 빠르고 정확하며 비용-효율적이고 임상적으로 관련된 시험을 수행하는 것으로 간주된다. 따라서, 미세유체 장치 상에서 시행된 미세생리학적 시스템을 이용한 in vitro 시험이 in vivo 시험보다 더 효과적일 수 있고 또한 더 신뢰할 수 있다는 인식이 당해 기술분야에서 증가하고 있다.
줄기 세포는 연속적으로 분할하는 능력을 가지며 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있다. 최근에, 특히 이식을 위한 장기의 부족을 해결하기 위해 기능성 장기 생성을 위한 줄기 세포-기반 방법이 나타났고, 장기 칩(organ-on-a-chip) 장치에서 줄기 세포의 배양이 당해 기술분야에 보고되었다. 특히, 조베(Giobbe) 등 (Nat. Methods, 2015, 12(7), 637-640)은 칩 상에서 만능 줄기 세포의 심근세포 (cardiomyocytes) 및 간세포로의 기능성 분화를 기재하고, 장(Zhang) 등 (Future Sci. OA, 2017, 3(2), FS0197)은 중간엽 줄기 세포 배양 및 미세유체 장치에서 장기 칩으로의 분화를 기재한다. 그러나, 장기 기능성을 모방하는 다수의 모델을 갖는 다중 장기 칩을 확립하기 위한 상이한 줄기 세포-유래 장기 전구체 세포의 공동 배양에 대한 보고는 없으며, 특히 미세유체 장치 상에서 장기 등가물을 생성하기 위한 상이한 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 세포의 공동 배양에 관한 보고는 없다.
당해 기술분야에는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 세포의 장기 등가물로의 분화를 확립하는 다중 장기 미세유체 장치 및 상응하는 장기 등가물의 생성 방법이 필요하다. 본 발명은 특히 (i) iPSC-유래 간세포 전구체 세포; (ii) iPSC-유래 장 전구체 세포; (iii) iPSC-유래 신세뇨관 전구체 세포; 및 (iv) iPSC-유래 신경 전구체 세포를 포함하는 신규한 미세유체 장치 (여기서 (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포는 단일 유형의 체세포로부터 재프로그래밍된 단일 공여자 iPSC로부터 분화됨)를 제공함으로써, 및 iPSC-유래 장기 전구체 세포 및 iPSC-유래 섬유아세포 및 내피 세포를 공동-배양하는 단계를 포함하는 신규한 장기 구조체의 생체공학 방법을 제공함으로써, 이러한 필요성을 해결한다.
본 발명은 특히 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 세포의 장기 등가물로의 분화를 확립하는 신규한 다중 장기 칩을 제공한다. 특히, 본 발명은 상이한 iPSC-유래 장기 전구체 세포를 공동-배양하여 장기 기능성을 모방하는 다수의 모델을 갖는 다중 장기 칩을 생성하기 위한 신규한 미세유체 장치를 제공한다. 또한, 본 발명은 iPSC-유래 장기 전구체 세포 및 iPSC-유래 섬유아세포 및 내피 세포를 공동-배양하는 단계를 포함하는 장기 구조체의 생체공학 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 하이드로겔 내 또는 상에서 iPSC-유래 원발성 내피 세포 (예를 들어, HDMECs 포함) 및/또는 장기유사체로 생성된 장기 장벽을 모방하는 신규한 생체공학적 조직 구조체를 제공한다.
또한, 본 발명은 미세유체 칩에서 혈액 회로(blood circuit) 및 소변 회로 (urine circuit)를 시행하는 단계를 제공하고, 장기 기능성을 모방하는 다수의 모델의 상호 작용 및 누화(cross-talk)를 모방하는 시스템에서 안정한 미세환경을 유지하기 위한 생리학적 조건을 지지하는 미세생리학적 시스템을 확립한다. 놀랍게도, 소형화된 인간의 장, 간, 뇌 및 신장 등가물 (이들 모두는 동일한 공여자로부터의 iPSCs로부터 미리-분화됨)을 갖는 4개의 장기 칩은, 성장 인자가 없는 배양 배지에서 14일 배양 기간 동안 상이한 iPSC-유래 장기 모델의 추가 분화를 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 이 추가 분화는 장기 등가물 사이의 누화에 기인한다. 또한, 시간이 지남에 따라 상이한 조직에 대해 진행성 성숙이 관찰될 수 있다. 중요하게도, 상이한 iPSC-유래 장기 모델이 ADME-N (= ADME 칩 + 신경 등가물)에서 공동-배양 동안 안정한 것으로 나타났다, 즉 이들의 표현형을 유지하고, 시간이 지남에 따라 지시된 조직에 대해 정의되고 일관된 마커 유전자 발현을 나타낸다 (실험 7 및 도 21). 본 발명은 ADME(T) 프로파일링의 맥락에서 약동학적-약력학적 분석을 위한 어세이 확립에 적합한 신규한 미세유체 장치를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 추가 성장 인자의 첨가 없이, 생리학적 기반 약동학 (physiologically based pharmacokinetic, PBPK) 순응 미세생리학적 시스템 (MPS)에서 배양된 단일 공여자로부터 4개의 상이한 자가 iPSC-유래 장기 모델의 성공적인 전신 장기간 공동-배양을 확립한다.
특히, 본 발명은 하기를 제공한다:
[1] (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 간세포 전구체 세포; (ii) iPSC-유래 장 전구체 세포; (iii) iPSC-유래 신세뇨관 전구체 세포; 및 (iv) iPSC-유래 신경 전구체 세포를 포함하는 미세유체 장치로서; (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포는 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같이, iPSC-유래 전구체 세포는 자가 세포(autologous cells)로 간주될 수 있다.
[2] (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 간세포 장기유사체; (ii) iPSC-유래 장 장기유사체; 및 (iii) iPSC-유래 신세뇨관 장기유사체를 포함하는 미세유체 장치로서; (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기유사체는 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치.
[3] [1] 또는 [2]에 있어서, (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포, 또는 (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기유사체는, 각각, 별도의 세포 배양 구획에서 침착되는 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치.
[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 미세유체 장치는 제 1 회로 및 제 2 회로를 포함하고, (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포, 또는 (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기유사체를 함유하는 세포 배양 구획은, 각각, 제 1 회로의 일부를 형성하며, 제 2 회로는 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 포함하고, 두 회로는 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 통해 서로 연결되는 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치.
[5] [4]에 있어서, 여과 유닛은 분자의 크기 및 전하에 기초하여 제 1 회로에서 제 2 회로로 분자의 통과를 선택적으로 허용하는 여과 장벽을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치.
[6] 간세포 장기유사체, 장 장기유사체 및 신장 신세뇨관 장기유사체의 생성 방법으로서, 방법은 서로 미세유체 연결되어 있는 별도의 세포 배양 구획에서 (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 간세포 전구체 세포, (ii) iPSC-유래 장 전구체 세포, 및 (iii) iPSC-유래 신장 전구체 세포를 공동-배양하는 단계를 포함하는, 방법.
[7] [6]에 있어서, iPSC-유래 내피 세포를 공동-배양하는 단계를 더 포함하고, iPSC-유래 내피 세포는 (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포/구상체(spheroids)와 동일한 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지고, iPSC-유래 내피 세포는 세포 배양 구획을 연결하는 미세유체 채널에서 침착되는 것을 특징으로 하는, 방법.
[8] [6] 또는 [7]에 있어서, iPSC-유래 간세포 전구체 세포를 함유하는 세포 배양 구획은 iPSC-유래 간세포 전구체 세포와 동일한 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진 iPSC-유래 섬유아세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
[9] 분석 시험, 진단, 연구, 표적 검증, 독성 연구, 조직 공학, 조직 제조, 약물 스크리닝 및/또는 약동학적-약력학적 분석에서 [1]-[5] 중 어느 하나의 미세유체 장치의 용도.
[10] [1]-[5] 중 어느 하나의 미세유체 장치를 이용한 미세생리학적 시스템에서 분석물의 검출 방법.
[11] (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 장기유사체; (ii) iPSC-유래 섬유아세포; 및 (iii) iPSC-유래 내피 세포를 포함하는, 포유류 장기-장벽을 모방하는 생체공학적 결합 조직 구조체로서, (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기유사체 및 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 생체공학적 결합 조직 구조체.
[12] 포유류 장기-장벽을 모방하는 결합 조직 구조체의 생체공학 방법으로서, 방법은 (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 장기유사체, (ii) iPSC-유래 섬유아세포, 및 (iii) iPSC-유래 내피 세포를 하이드로겔 내에 생체인쇄하는 단계 및/또는 하이드로겔 상에 씨딩하는 단계를 포함하고, (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기유사체 및 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
[13] 조직 복구, 조직 공학 및/또는 조직 제조 중 어느 하나에 사용하기 위한 [11]의 결합 조직 구조체.
[14] (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 신경구(neurospheres); 및 (ii) iPSC-유래 내피 세포를 포함하는 포유류 혈액-뇌-장벽을 모방하는 생체공학적 조직 구조체로서, (i) 및 (ii)에 따른 iPSC-유래 신경구 및 내피 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 생체공학적 조직 구조체.
[15] 포유류 혈액-뇌-장벽을 모방하는 조직 구조체의 생체공학 방법으로서, 방법은 (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 신경구; (ii) iPSC-유래 내피 세포; 및 (ii) iPSC-유래 섬유아세포를 하이드로겔 내에 생체인쇄하는 단계 및/또는 하이드로겔 상에 씨딩하는 단계를 포함하고, (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 신경구, 내피 세포 및 섬유아세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
[16] [11]의 결합 조직 구조체 또는 [14]의 조직 구조체를 포함하는 미세유체 시스템.
[17] 단일 세포 배양 구획에서, (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 장기 전구체 세포, (ii) iPSC-유래 섬유아세포, 및 (iii) iPSC-유래 내피 세포를 공동-배양하는 단계를 포함하는 성체 장기 구조체의 생체공학 방법으로서, (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기 전구체 세포 및 iPSC-유래 섬유아세포 및 내피 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
[18] 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 내피 전구체 세포를 전단 응력에 노출시키는 단계를 포함하는, 성체 내피 세포의 생체공학 방법으로서, 바람직하게는 방법은 미세유체 시스템의 미세유체 채널에서 iPSC-유래 내피 전구체 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
[19] 단일 세포 배양 구획에서, (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 간세포 전구체 세포; (ii) iPSC-유래 섬유아세포; 및/또는 (iii) iPSC-유래 내피 세포를 공동-배양하는 단계를 포함하는 성체 간 장기 구조체의 생체공학 방법으로서, (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 간세포 전구체 세포, iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
본 명세서에 개시된 임의의 미세유체 장치, 조직 구조체, 방법 및 용도를 포함하는 본 발명의 다양한 실시예에서, iPSC-유래 전구체 세포 및/또는 iPSC-유래 장기유사체는 iPSC-유래 전구체 세포 및/또는 iPSC-유래 장기유사체에 대한 추가 성장 인자를 함유하지 않는 배지/영양액과 함께 배양된다. 예를 들어, 배지가 인간 성체 혈청을 함유하는 경우, 구체적으로 개별 iPSC-유래 전구체 세포 및/또는 iPSC-유래 장기유사체에 대한 추가 성장 인자를 함유하지 않는다, 즉, 예를 들어 간세포에 대한 간세포 성장 인자를 함유하지 않는다. 따라서, 다양한 실시예에서, 배지/영양액은 본 명세서에 개시된 iPSC-유래 전구체 세포 및/또는 iPSC-유래 장기유사체 중 어느 것에 특이적인 성장 인자를 함유하지 않는다. 본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 미세유체 장치, 조직 구조체, 방법 및 용도에서 iPSC-유래 전구체 세포 및/또는 iPSC-유래 장기유사체의 사용을 포함하고, iPSC-유래 전구체 세포 및/또는 iPSC-유래 장기유사체는 적어도 2주의 기간 동안 공동-배양된다. 바람직하게는, 이러한 공동-배양은 4개의 상이한 장기유사체/장기 등가물의 공동-배양을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 4개의 상이한 장기유사체/장기 등가물은 간 장기유사체/등가물, 신장 (또는 신장의) 장기유사체/등가물, 뇌 장기유사체/등가물, 및 장 장기유사체/등가물이다. 이러한 공동-배양에서, 배양 배지/영양액은 바람직하게는 iPSC-유래 전구체 세포 및/또는 iPSC-유래 장기유사체에 대한 성장 인자를 함유하지 않는다.
다양한 바람직한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 임의의 iPSC-유래 장기유사체는 iPSC-유래 섬유아세포 및/또는 iPSC-유래 내피 세포로부터/함께 조립되고, iPSC-유래 섬유아세포 및/또는 iPSC-유래 내피 세포는 iPSC-유래 장기유사체와 동일한 (단일 유형의 체세포로부터 얻은) iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다. 더 구체적으로, 다양한 바람직한 실시예에서, 장 장기유사체는 iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포로부터/함께 조립된다, 즉, 다양한 실시예에서, 장 장기유사체는 iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포와 함께 공동-배양된다. 또한, 다양한 바람직한 실시예에서, 간 장기유사체는 iPSC-유래 섬유아세포를 갖는 iPSC-유래 간세포로부터/함께 조립된다. 또한, 다양한 바람직한 실시예에서, 신장 장기유사체는 (iPSC-유래) 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포로부터/함께 조립될 수 있다. 마찬가지로, 다양한 바람직한 실시예에서, 뇌 장기유사체는 iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포로부터/함께 조립될 수 있다. 상기에 따르면, 이들 바람직한 실시예에서, iPSC-유래 섬유아세포 및/또는 iPSC-유래 내피 세포는 iPSC-유래 장기유사체와 동일한 (단일 유형의 체세포로부터 얻은) iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다.
본 발명의 다른 측면 및 실시예는 하기를 포함한다:
[1] 하나 이상의 세포 배양 구획을 갖는 제 1 회로 및 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 포함하는 제 2 회로를 포함하는 미세유체 장치로서, 두 회로는 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 통해 서로 연결되는 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치.
[2] [1]에 있어서, 여과 유닛은 분자의 크기 및 전하에 기초하여 제 1 회로에서 제 2 회로로 분자의 통과를 선택적으로 허용하는 여과 장벽을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치.
[3] [2]에 있어서, 여과 장벽은 기계적 또는 생물학적 장벽, 바람직하게는 족세포(podocytes)를 포함하는 생물학적 장벽인 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치.
[4] [1]-[3] 중 어느 하나에 있어서, 재흡수 유닛은 제 2 회로에서 제 1 회로로 유체의 재흡수를 허용하는 장벽을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치.
[5] [4]에 있어서, 재흡수 장벽은 생물학적 장벽이며, 바람직하게는 생물학적 장벽은 신세뇨관 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치.
[6] [1]-[5] 중 어느 하나에 있어서, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 간 기능을 모방하는 장기 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 장 기능을 모방하는 장기 등가물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치.
[7] 분석 시험, 진단, 연구, 표적 검증, 독성 연구, 조직 공학, 조직 제조, 약물 스크리닝 및/또는 약동학적-약력학적 분석에서 [1]-[6] 중 어느 하나의 미세유체 장치의 용도.
[8] [1]-[6] 중 어느 하나의 미세유체 장치를 이용한 미세생리학적 시스템의 작동 방법.
[9] [8]에 있어서, 위장관의 상피 세포를 포함하는 장기 등가물 또는 조직을 포함하고 장 기능을 모방하는 세포 배양 구획을 통해 영양액을 미세생리학적 시스템에 선택적으로 첨가하는 단계를 더 포함하는, 방법. 본 발명의 다양한 실시예에서, 영양액은 본 명세서의 다른 곳에 기재된 실시예에 따라 iPSC-유래 전구체 세포 및/또는 iPSC-유래 장기유사체에 대한 추가 성장 인자를 함유하지 않는다. 예를 들어, 영양액이 인간 성체 혈청을 함유하는 경우, 구체적으로 개별 iPSC-유래 전구체 세포 및/또는 iPSC-유래 장기유사체에 대한 추가 성장 인자를 함유하지 않는다, 즉, 예를 들어 간세포에 대한 간세포 성장 인자를 함유하지 않는다. 따라서, 다양한 실시예에서, 영양액은 본 명세서에 개시된 iPSC-유래 전구체 세포 및/또는 iPSC-유래 장기유사체 중 어느 것에 특이적인 성장 인자를 함유하지 않는다.
[10] [1]-[6] 중 어느 하나의 미세유체 장치를 이용한 미세생리학적 시스템에서 분석물의 검출 방법으로서, 방법은 시험 시료를 제 1 회로의 세포 배양 구획에 첨가하는 단계를 포함하고, 바람직하게는 세포 배양 구획은 위장관, 피부 또는 기도(respiratory tract)의 상피 세포를 포함하는 조직을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
[11] 하나 이상의 세포 배양 구획을 갖는 제 1 회로 및 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 포함하는 제 2 회로를 포함하는 미세생리학적 시스템을 작동시키는 단계를 포함하는 항상성(homeostasis)의 모방 방법으로서, 두 회로는 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 통해 서로 연결되는 것을 특징으로 하는, 방법.
[12] [11]에 있어서, 위장관, 피부 또는 기도의 상피 세포를 포함하는 세포 배양 구획을 통해 영양액을 미세생리학적 시스템에 선택적으로 첨가하는 단계를 포함하고, 바람직하게는 상피 세포는 위장관, 바람직하게는 소장의 상피 세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
[13] [1]-[6] 중 어느 하나의 미세유체 장치에 세포를 씨딩하는 단계를 포함하는 세포의 배양 및/또는 유지 방법.
[14] [1]-[6] 중 어느 하나의 미세유체 장치 및 사용 설명서를 포함하는 미세생리학적 시스템을 작동시키기 위한 키트.
[15] [1]-[6] 중 어느 하나에 따른 미세유체 장치를 포함하는, ADME (흡수, 분포, 대사, 배설) 어세이 또는 ADMET (흡수, 분포, 대사, 배설, 독성) 어세이.
본 발명은 미세유체 장치에서 상이한 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 장기 전구체 세포 및/또는 iPSC-유래 장기 등가물 조직의 공동 배양을 확립한다. 본 발명에 의해 제공된 신규한 미세유체 장치는 구체적으로 단일 유형의 체세포로부터 재프로그래밍된 단일 공여자 iPSC로부터 유래된 세포의 분화에 기초한 다수의 장기 등가물을 갖는 다중 장기 칩을 실현한다. 따라서, 장기 등가물로의 분화를 위해 본 발명에서 사용된 iPSC-유래 세포는 장기 전구체 세포, 더 구체적으로 장기-특이적 성체 세포의 전구체 세포를 포함한다. 이러한 iPSC-유래 세포는, 예를 들어 iPSC-유래 간세포 전구체 세포를 포함한다.
다양한 측면에서, 본 발명은 예를 들어 iPSC-유래 간세포 장기유사체를 포함하는 iPSC-유래 장기유사체의 사용을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 구체적으로 iPSC-유래 신경구의 사용을 포함한다.
본 발명의 실험 2 (실험 1.1, 1.2 및 2의 실험 설정에 대하여 도 2 참조)는 미세유체 칩 상에서 상이한 iPSC-유래 세포 또는 장기유사체의 공동 배양을 예시한다. 실시예 2에서 사용된 세포 유형은 청구된 "iPSC 다중 장기 칩"에 대해 기재된 장기 유형: 간세포 (간), 장 세포 (장), 신세뇨관 세포 (신장), 및 신경 세포 (뇌)를 나타낸다. 칩의 세트를 7일, 14일 및 21일 동안 배양하였다. 종료점에서, 면역조직학적 검사, qPCR 및 RNA 시퀀싱을 위해 세포 시료를 채취하였다. 이의 글루코오스, 락테이트, LDH (락테이트 탈수소효소(lactate dehydrogenase)), 알부민, 우레아, ALT (알라닌 아미노트랜스퍼라제) 및 AST (아스파르테이트 트랜스아미나제) 함량에 대해 상청액을 분석하였다. 제공된 장기 등가물의 정치 배양으로부터의 대조군을 0일, 7일 및 14일에 채취하였다.
본 발명은 (i) iPSC-유래 간세포 전구체 세포; (ii) iPSC-유래 장 전구체 세포; (iii) iPSC-유래 신세뇨관 전구체 세포; 및 (iv) iPSC-유래 신경 전구체 세포를 포함하는 미세유체 장치를 제공하고; (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포는 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 전구체 세포는 iPSC, 즉, iPSC로부터 분화된 iPSC로부터 유래된다. iPSC는 체세포, 즉, 체세포로부터 재프로그래밍된 체세포로부터 유래된다. 예를 들어, 간세포 전구체 세포는 iPSC로부터 분화된 iPSC로부터 유래되고, 이는 체성 피부 세포(somatic skin cell)로부터 재프로그래밍된 체성 피부 세포로부터 유래된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 세포는 단일 유형의 체세포로부터 얻어진 (즉, 재프로그래밍된), 단일 (즉, 하나의 동일한) 공여자 iPSC로부터 유래 (즉, 분화)될 수 있다. 예를 들어, 세포는 체성 피부 세포, 백혈구, 신장 세포, 지방 세포 등으로부터 얻어진 (즉, 재프로그래밍된), 단일 (즉, 하나의 동일한) iPSC로부터 유래 (즉, 분화)될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, iPSC로부터 유래된 전구체 세포, 또는 더 구체적으로 장기-특이적 전구체 세포는, 정의상 더 이상 iPSC는 아니지만, 여전히 하나 이상의 iPSC-특이적 마커의 발현, 예를 들어, OCT4, KLF4, SOX2 및 임의로 C-MYC와 같은 하나 이상의 재프로그래밍 인자의 발현을 나타낼 수 있다. 구체적으로, 본 명세서에 기재된 전구체 세포는 iPSC로부터 분화된 장기 전구체 세포이다. 더욱 더 구체적으로, 본 명세서에 기재된 장기-특이적 전구체 세포는 iPSC로부터 분화된 장기-특이적 전구체 세포이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 전구체 세포는 미리-분화된 장기 세포 또는 미리-분화된 미성숙 장기 세포로 간주될 수 있다. 더 구체적으로, 본 명세서에 기재된 장기-특이적 전구체 세포는 미리-분화된 장기-특이적 세포 또는 미리-분화된 미성숙 장기-특이적 세포로 간주될 수 있다.
다양한 실시예에서, iPSC로부터 분화된 전구체 세포는 (iPSC-유래) 유도 장기-특이적 전구체 세포로 간주될 수 있다.
바람직하게는, 본 명세서에 기재된 전구체 세포, 또는 더 구체적으로 장기-특이적 전구체 세포는 성숙 기능 장기 세포를 야기한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 간세포 전구체 세포 (즉, iPSC-유래 간세포 전구체 세포)는, 바람직하게는 성숙 기능 간세포를 야기하나, 다른 간세포도 야기할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 전구체 세포, 또는 더 구체적으로 장기-특이적 전구체 세포는 장기 세포-특이적 기능을 나타내거나 또는 보유하는 성숙 세포를 야기한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 간세포 전구체 세포는 바람직하게는 간세포-특이적 기능을 나타내거나 또는 보유하는 성숙 세포를 야기한다. 다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 간세포 전구체 세포는 간세포와 다른 간세포의 특이적 기능을 나타내거나 또는 보유하는 성숙 세포를 야기한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같이, iPSC-유래 간세포 전구체 세포로부터 얻은 성숙 간세포는, 특히, 인간 집단에서 관찰된 대사 표현형(metabolic phenotypes)을 요약할 수 있고, 원발성 인간 간세포와 동등한 수준에서 약물-대사 효소를 발현할 수 있으며, 및/또는 in vitro에서 안정한 기능성을 유지할 수 있다.
다양한 실시예에서, iPSC로부터 분화된 전구체 세포는 성숙 기능 장기 세포를 야기하는 이러한 전구체 세포의 관점에서 성숙 장기 세포-유도 세포로 간주될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 iPSC-유래 간세포 전구체 세포는 간세포-유도 세포로 간주될 수 있다.
다양한 다른 실시예에서, iPSC로부터 분화된 전구체 세포는 성체-유형 장기유사체로 성장하는 이의 능력의 관점에서 장기유사체-유도 세포로 간주될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 iPSC-유래 간세포 전구체 세포는 간세포 장기유사체-유도 세포로 간주될 수 있다.
다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 전구체 세포, 또는 더 구체적으로 장기-특이적 전구체 세포는 하나 이상의 성숙 장기 세포-특이적 마커 또는 마커 단백질을 발현할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 다양한 실시예에서, 간세포 전구체 세포는 하나 이상의 성숙 간세포-특이적 마커 또는 마커 단백질을 발현할 수 있다. 다양한 실시예에서, 간세포 전구체 세포는 CD45 및 CD109를 포함하는 세포 마커를 발현할 수 있다. 다양한 실시예에서, 간세포 전구체 세포는 알부민, HNF4A, 알파-1-항트립신 (alpha-1-antitrypsin, AAT), 및 알파-태아단백질 (Alpha-fetoprotein, AFP), 바람직하게는 알부민 및/또는 AFP를 포함하는 세포 마커를 발현할 수 있다.
마찬가지로, 다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 성숙 장기 세포는 하나 이상의 성숙 장기 세포-특이적 마커 또는 마커 단백질을 발현한다. 예를 들어, 본 발명의 다양한 실시예에서, 간세포는 하나 이상의 간세포-특이적 마커 단백질을 발현한다. 다양한 실시예에서, 성숙 간세포 마커는 알부민, PXR, H4 항원, 알파-1-항트립신 (AAT), 시토케라틴 7 (CK7), 시토케라틴 8 (CK8), 간세포 핵 전사 인자 (hepatocyte nuclear transcription factor, HNF-3), CAAT 인핸서-결합 단백질 (CEBP)-알파, CAAT 인핸서-결합 단백질 (CEBP)-베타, SLC10A1 (나트륨/담즙산 공동 수송체 - 간 담즙산 수송체), HNF4a (간세포 핵 인자 4 알파), 시토케라틴 8/18, CYP2A6, CYP2E1, 및 CYP3A4 (시토크롬 P450)을 포함한다. 바람직한 성숙 간세포 마커는 알부민, SLC10A1, HNF4a, 시토케라틴 8/18, CYP2A6, CYP2E1, 및/또는 CYP3A4를 포함한다.
약물 대사는 주요한 간세포 기능이다. 말단 간세포 분화는 시토크롬 P450 (CYP) 계열에서 약물-대사 효소의 발현 및 활성에 의해 평가될 수 있다. 따라서, 다양한 실시예에서, 성숙 간세포 마커는 CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6, CYP2A7, CYP2A13, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP2F1, CYP2J2, CYP2R1, CYP2S1, CYP2U1, CYP2W1, CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7, CYP3A43, CYP4A11, CYP4A22, CYP4B1, CYP4F2, CYP4F3, CYP4F8, CYP4F11, CYP4F12, CYP4F22, CYP4V2, CYP4X1, CYP4Z2, CYP5A1, CYP7A1, CYP7B1, CYP8A1, CYP8B1, CYP11A1, CYP11B1, CYP11B2, CYP17A1, CYP19A1, CYP20A1, CYP21A1, CYP21A2, CYP24A1, CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1, CYP27A1, CYP27B1, CYP27C1, CYP39A1, CYP46A1, 및/또는 CYP51A1 중 어느 하나를 포함한다. 다양한 실시예에서, 성숙 간세포 마커는 CYP1A2, CYP2C9, CYP3A4, 시토케라틴 8/18, CYP2A6, 및/또는 CYP2E1 중 어느 하나를 포함한다. 바람직한 성숙 간세포 마커는 시토케라틴 8/18, CYP2A6, CYP2E1, 및/또는 CYP3A4를 포함한다.
본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, iPSC-유래 장 전구체 세포는 바람직하게는 성숙 기능 장 세포를 야기한다. 따라서, iPSC-유래 장 전구체 세포는 바람직하게는 장 세포-특이적 기능을 나타내거나 또는 보유하는 성숙 장 세포를 야기한다. 다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 iPSC-유래 장 전구체 세포는 하나 이상의 (성숙 장 세포-특이적 및/또는 장 전구체 세포-특이적) 마커 단백질을 발현할 수 있다. 다양한 실시예에서, 이러한 성숙 장 세포-특이적 및/또는 장 전구체 세포-특이적 마커 단백질은 ABCB1, CDH1, CHGA, DPP4, KL5, LGR5, Lyz, SLC2A1, SLC2A3, SOX9, 및/또는 CXCR4를 포함한다.
다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 성숙 장 세포는 소장의 성숙 세포이다. 다양한 다른 실시예에서, 본 명세서에 기재된 성숙 장 세포는 장의 성숙 상피 세포를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 명세서에 기재된 성숙 장 세포는 소장의 성숙 상피 세포를 포함한다.
다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 성숙 장 세포는 하나 이상의 성숙 장 세포-특이적 마커 또는 마커 단백질을 발현할 수 있다. 다양한 실시예에서, 성숙 장 세포 마커는 CD326, CDX2, 시토케라틴 8/18, 및/또는 NaK-ATPase (상피 세포)를 포함한다.
본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, iPSC-유래 신세뇨관 전구체 세포는 바람직하게는 성숙 기능 신세뇨관 세포를 야기하나, 다른 신장 세포도 야기할 수 있다. 따라서, iPSC-유래 신세뇨관 전구체 세포는 바람직하게는 신세뇨관 세포-특이적 기능을 나타내거나 또는 보유하는 성숙 신세뇨관 세포를 야기한다. 다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 신세뇨관 전구체 세포는 신세뇨관 세포와 다른 신장 세포의 특이적 기능을 나타내거나 또는 보유하는 성숙 세포를 야기한다. 다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 iPSC-유래 신세뇨관 전구체 세포는 하나 이상의 (성숙 신세뇨관 세포-특이적 및/또는 신세뇨관 전구체 세포-특이적) 마커 단백질을 발현할 수 있다. 다양한 실시예에서, 이러한 성숙 신세뇨관 세포-특이적 및/또는 신세뇨관 전구체 세포-특이적 마커 단백질은 아쿠아포린1(Aquaporinl), MRP2, 시토케라틴 8/18, 및/또는 NaK-ATPase를 포함한다.
다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 성숙 신세뇨관 세포는 성숙 신세뇨관 상피 세포이다. 다양한 다른 실시예에서, 본 명세서에 기재된 성숙 신세뇨관 세포는 성숙 근위 신세뇨관 세포, 바람직하게는 성숙 근위 신세뇨관 상피 세포이다. 본 발명의 다른 실시예에서, 본 명세서에 기재된 성숙 신세뇨관 세포는 성숙 상피 신세뇨관 세포, 바람직하게는 성숙 상피 근위 신세뇨관 세포를 포함한다.
다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 성숙 신세뇨관 세포는 하나 이상의 성숙 신세뇨관 세포-특이적 마커 또는 마커 단백질을 발현할 수 있다. 다양한 실시예에서, 성숙 신세뇨관 세포 마커는 메갈린(Megalin) (근위 세뇨관 세포), 아쿠아포린1, MRP2, 시토케라틴 8/18, 및/또는 NaK-ATPase를 포함한다.
본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, iPSC-유래 신경 전구체 세포는 바람직하게는 성숙 기능 신경 세포를 야기하나, 뇌의 다른 세포도 야기할 수 있다. 따라서, iPSC-유래 신경 전구체 세포는 바람직하게는 신경 세포-특이적 기능을 나타내거나 또는 보유하는 성숙 신경 세포를 야기한다. 다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 iPSC-유래 신경 전구체 세포는 하나 이상의 (성숙 신경 세포-특이적 및/또는 신경 전구체 세포-특이적) 마커 단백질을 발현할 수 있다. 다양한 실시예에서, 이러한 성숙 신경 세포-특이적 및/또는 신경 전구체 세포-특이적 마커 단백질은 네스틴(Nestin) (신경외배엽(neuroectodermal) 줄기 세포 마커), TUBB3 (튜불린 베타-3 사슬, 신경 세포 분화의 초기 바이오마커, 및/또는 PAX6 (쌍 상자 단백질 (Paired box protein) Pax-6, 전사 인자, 눈과 뇌 발달의 주요 조절 유전자)을 포함한다. 다양한 다른 실시예에서, 이러한 성숙 신경 세포-특이적 및/또는 신경 전구체 세포-특이적 마커 단백질은 GFAP, 시냅토파이신(Synaptophysin), NeuN, 및/또는 MAP2를 포함할 수 있다.
다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 성숙 신경 세포는 하나 이상의 성숙 신경 세포-특이적 마커 또는 마커 단백질을 발현할 수 있다. 다양한 실시예에서, 성숙 신경 세포 마커는 NSE (감마-에놀라제(gamma-enolase) 또는 에놀라제-2; 성숙 뉴런(mature neurons) 및 신경 기원의 세포에 의해 발현된 시토졸 단백질 (cytosolic protein))를 포함한다. 다양한 실시예에서, 성숙 신경 세포 마커는 네스틴, TUBB3, 및/또는 PAX6를 더 포함한다. 다양한 다른 실시예에서, 성숙 신경 세포 마커는 GFAR, 시냅토파이신, NeuN, 및/또는 MAP2를 포함한다.
체세포의 재프로그래밍은 2006년에 야마나카(Yamanaka)와 타카하시 (Takahashi)의 연구로 확립되었다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, iPSC를 생성하는데 사용된 체세포는 iPSC로 재프로그래밍 가능한 임의의 유형의 체세포, 더 구체적으로 임의의 유형의 원발성 체세포일 수 있다. 다양한 실시예에서, 섬유아세포는 iPSCs, 바람직하게는 피부-유래 섬유아세포의 생성에 사용되는 원발성 체세포 유형이다. 다양한 다른 실시예에서, (모발-유래) 각질형성세포(keratinocytes)는 iPSCs의 생성에 사용되는 원발성 체세포 유형이다. 다양한 실시예에서, 섬유아세포는 피부 세포, 백혈구, 신장 세포, 지방 세포 등을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, iPSCs는 예를 들어 주요 재프로그래밍 인자 OCT4, KLF4, SOX2 및 임의로 C-MYC를 포함하는 재프로그래밍 인자의 발현을 특징으로 한다. 다양한 (바람직한) 실시예에서, 발현되는 것으로 확인된 재프로그래밍 인자는 SOX2, 나노그(Nanog), OCT3/4, SSEA5 및/또는 TRA-1-60을 포함한다.
본 발명에서, iPSCs는 통상의 기술자에게 알려지고 이용가능한 임의의 재프로그래밍 방법에 의해 단일 유형의 체세포로부터 얻어진다. 메논(Menon) 등, 2016 (Int. J. Mol. Sci., Vol. 17, 141)은 체세포를 iPSCs로 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 iPSC 재프로그래밍 방법에 대한 개요를 제공할 수 있다. 체세포를 iPSC로 재프로그래밍하기 위한 키트 및 프로토콜은 문헌에 보고되어 있으며, 시판되고 있다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC는 계약 제조업체(contract manufacturer)에서 구입할 수 있다. 그러나, 다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 방법에 관한 특정 실시예에서, 본 발명은 (단일 유형의) 체세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 단계를 포함한다.
다양한 실시예에서, 용어 "(단일 유형의) 체세포로부터 얻은 iPSC"는 iPSC가 체세포로부터 재프로그래밍되고, 이는 iPSC의 분화에 의해 이전에 얻어질 수 있거나 또는 얻어지지 않았을 수 있음을 의미한다.
다양한 실시예에서, 본 발명에 따른 iPSCs는 성체 체세포로부터 얻어진다.
다양한 실시예에서, 용어 "체세포" 및/또는 "성체 체세포"는 "체성 줄기 세포(somatic stem cells)" 및/또는 "성체 체성 줄기 세포" 및/또는 "성체 줄기 세포"를 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 바람직하게는, 용어 "체세포" 또는 "성체 체세포"는 "체성 줄기 세포" 및/또는 "성체 체성 줄기 세포" 및/또는 "성체 줄기 세포"를 배제한다.
본 발명에서, iPSC-유래 장기 전구체 세포는 통상의 기술자에게 알려지고 이용가능한 iPSC 분화의 수단 및 방법을 이용한 iPSCs의 분화에 의해 iPSCs로부터 얻어질 수 있다. 분화 키트 및 프로토콜은 문헌에 보고되어 있으며, 시판되고 있다. 표 1은 iPSC-유래 세포의 목록을 나타낸다. 분화 프로토콜은 열거된 논문에서 수정되었다.
표 1에 열거된 과학 논문에 기재된 분화 프로토콜은 구체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명의 다양한 실시예에서, iPSC-유래 장기 전구체 세포는 계약 제조업체에서 구입할 수 있다. 그러나, 다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 방법에 관한 특정 실시예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 iPSCs를 장기(-특이적) 전구체 세포로 분화시키는 단계를 포함한다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 이러한 iPSCs로부터 분화된 장기(-특이적) 전구체 세포는 미리-분화된 장기(-특이적) 세포 또는 미리-분화된 미성숙 장기(-특이적) 세포로 간주될 수 있다.
다양한 실시예에서, 미세유체 장치는 (i) iPSC-유래 간세포; (ii) iPSC-유래 장 세포; (iii) iPSC-유래 신세뇨관 세포; 및 (iv) iPSC-유래 신경 세포를 포함하고; (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 세포는 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다.
다양한 실시예에서, 미세유체 장치는 (i) iPSC-유래 간세포 장기유사체; (ii) iPSC-유래 장 장기유사체; 및 (iii) iPSC-유래 신세뇨관 장기유사체를 포함하고; (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기유사체는 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다. 다양한 실시예에서, 미세유체 장치는 (iv) (i), (ii) 및 (iii)에 따른 장기유사체와 다른 추가 장기 또는 세포 유형의 iPSC-유래 장기유사체를 더 포함하고, (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 장기유사체는 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다. 바람직한 실시예에서, (iv)에 따른 추가 iPSC-유래 장기유사체는 iPSC-유래 신경 장기유사체이고, (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 장기유사체는 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다.
iPSC-유래 장기 전구체 세포에 관한 발명과 유사하게, iPSC-유래 장기유사체는 iPSCs의 분화에 의해 얻어질 수 있거나 또는 얻어진 장기유사체를 의미한다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, "장기유사체"는 가장 작은 기능성 장기 또는 조직 유닛을 의미하거나 또는 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 따라서, iPSCs의 분화에 의해 얻어질 수 있거나 또는 얻어진 장기유사체는 구체적으로 장기유사체의 공급원으로 분화된 세포를 이용한 (단일 유형의 체세포로부터 얻은) 단일 공여자 iPSC의 분화를 의미한다. 더 구체적으로, 상기 분화된 세포는 장기-특이적 특성을 갖는 세포를 함유하는 장기유사체로 성장한다. 다양한 실시예에서, 상기 분화된 세포는 장기-특이적 (기능성) 특성을 갖는 세포를 함유하는 성체-유형 장기유사체로 성장하는 구형 장기유사체를 형성한다.
바람직하게는, 상기 장기-특이적 특성은 장기-특이적 기능성 특성이다.
다양한 실시예에서, 미세유체 장치는 (i) 성체-유형 간세포 장기유사체로 성장하는 iPSC-유래 구형 장기유사체; (ii) 성체-유형 장 장기유사체로 성장하는 iPSC-유래 구형 장기유사체; 및 (iii) 성체-유형 신세뇨관 장기유사체로 성장하는 iPSC-유래 구형 장기유사체를 포함하고; (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 구형 장기유사체는 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다. 다양한 실시예에서, 미세유체 장치는 (iv) (i), (ii) 및 (iii)에 따른 성체-유형 장기유사체와 다른 성체-유형 장기유사체로 성장하는 iPSC-유래 구형 장기유사체를 더 포함하고, (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 구형 장기유사체는 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다. 바람직한 실시예에서, (iv)에 따른 추가 iPSC-유래 구형 장기유사체는 성체-유형 신경 장기유사체로 성장하는 iPSC-유래 구형 장기유사체이고, (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 구형 장기유사체는 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 장기-특이적 전구체 세포와 유사하게, iPSC로부터 분화되고 상기 기재된 장기유사체의 공급원으로 사용된 세포는 (분화된 세포는 장기-특이적 특성을 갖는 세포를 함유하는 장기유사체로 성장함), 정의상 더 이상 iPSC는 아니지만, 여전히 하나 이상의 iPSC-특이적 마커의 발현, 예를 들어, OCT4, KLF4, SOX2 및 임의로 C-MYC와 같은 하나 이상의 재프로그래밍 인자의 발현을 나타낼 수 있다. 다양한 (바람직한) 실시예에서, 발현되는 것으로 확인된 재프로그래밍 인자는 SOX2, 나노그, OCT3/4, SSEA5 및/또는 TRA-1-60을 포함한다. 구체적으로, 이러한 분화된 세포는 iPSC로부터 분화된 (장기-특이적) 장기유사체 전구체 세포로 간주될 수 있다. 따라서, iPSC로부터 분화되고 상기 기재된 장기유사체의 공급원으로 사용된 세포는, 장기-특이적 특성을 갖는 세포를 함유하는 장기유사체로 성장하거나 또는 장기-특이적 (기능성) 특성을 갖는 세포를 함유하는 성체-유형 장기유사체로 성장하는 구형 장기유사체를 형성하는, 미리-분화된 세포 또는 미리-분화된 미성숙 세포로 간주될 수 있다.
다양한 실시예에서, iPSC로부터 분화되고 상기 기재된 장기유사체의 공급원으로 사용된 세포는, (iPSC-유래) 유도 장기-특이적 세포로 간주될 수 있다.
다양한 실시예에서, iPSC로부터 분화되고 상기 기재된 장기유사체의 공급원으로 사용된 세포는 (분화된 세포는 장기-특이적 특성을 갖는 세포를 함유하는 장기유사체로 성장함), 성체-유형 장기유사체로 성장하거나 또는 성체-유형 장기유사체로 성장하는 구형 장기유사체를 형성하는 이의 능력의 관점에서, (iPSC-유래) 장기유사체-유도 세포 또는 구형 장기유사체-유도 세포로 간주될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 iPSC-유래 장기유사체는, 특히, 인간 집단에서 관찰된 대사 표현을 요약할 수 있고, 원발성 인간 간세포와 동등한 수준에서 약물-대사 효소를 발현할 수 있으며, 및/또는 in vitro에서 안정한 기능성을 유지할 수 있다.
다양한 실시예에서, 장기유사체 세포 (즉, 장기유사체를 구성하는 세포)는 하나 이상의 성숙 장기 세포-특이적 마커 또는 마커 단백질을 발현할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 다양한 실시예에서, (iPSC-유래) 간세포 장기유사체 세포 (즉, 간세포 장기유사체를 구성하는 세포)는 하나 이상의 성숙 간세포-특이적 마커 단백질을 발현할 수 있다. 다양한 실시예에서, 간세포 장기유사체 세포는 CD45 및 CD109를 포함하는 세포 마커를 발현할 수 있다. 다양한 다른 실시예에서, 간세포 장기유사체 세포는 알부민, HNF4A, 알파-1-항트립신 (AAT), 및 알파-태아단백질 (AFP), 바람직하게는 알부민 및/또는 AFP를 포함하는 세포 마커를 발현할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 간세포 장기유사체 세포는 알부민, PXR, H4 항원, AAT, CK7, CK8, HNF-3, CEBP-알파, CEBP-베타, SLC10A1, HNF4a, 시토케라틴 8/18, CYP2A6, CYP2E1, 및/또는 CYP3A4를 포함하는 세포 마커를 발현할 수 있다. 바람직한 마커는 알부민, SLC10A1, HNF4a, 시토케라틴 8/18, CYP2A6, CYP2E1, 및 CYP3A4를 포함한다.
본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 (iPSC-유래) 장 장기유사체 세포 (즉, 장 장기유사체를 구성하는 세포)는 하나 이상의 (성숙 장 세포-특이적 및/또는 장 전구체 세포-특이적) 마커 단백질을 발현할 수 있다. 다양한 실시예에서, 이러한 성숙 장 세포-특이적 및/또는 장 전구체 세포-특이적 마커 단백질은 ABCB1, CDH1, CHGA, DPP4, KL5, LGR5, Lyz, SLC2A1, SLC2A3, SOX0, 및/또는 CXCR4를 포함한다. 다양한 다른 실시예에서, 본 명세서에 기재된 장 장기유사체 세포는 CD326, CDX2, 시토케라틴 8/18, 및/또는 NaK-ATPase를 포함하는 성숙 장 세포 마커를 발현할 수 있다.
본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 (iPSC-유래) 신세뇨관 장기유사체 세포 (즉, 신세뇨관 장기유사체를 구성하는 세포)는 하나 이상의 (성숙 신세뇨관 세포-특이적 및/또는 신세뇨관 전구체 세포-특이적) 마커 단백질을 발현할 수 있다. 다양한 실시예에서, 이러한 성숙 신세뇨관 세포-특이적 및/또는 신세뇨관 전구체 세포-특이적 마커 단백질은 아쿠아포린1, MRP2, 시토케라틴 8/18, 및/또는 NaK-ATPase를 포함한다.
본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 (iPSC-유래) 신경 장기유사체 세포 (즉, 신경 장기유사체를 구성하는 세포)는 하나 이상의 (성숙 신경 세포-특이적 및/또는 신경 전구체 세포-특이적) 마커 또는 마커 단백질을 발현할 수 있다. 다양한 실시예에서, 이러한 성숙 신경 세포-특이적 및/또는 신경 전구체 세포-특이적 마커 단백질은 네스틴, TUBB3, 및/또는 PAX6을 포함한다. 다양한 다른 실시예에서, 이러한 성숙 신경 세포-특이적 및/또는 신경 전구체 세포-특이적 마커 단백질은 GFAP, 시냅토파이신, NeuN, 및/또는 MAP2를 포함할 수 있다. 다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 신경 장기유사체 세포는 하나 이상의 성숙 신경 세포-특이적 마커 단백질을 발현할 수 있다. 다양한 실시예에서, 성숙 신경 세포 마커는 NSE를 포함한다. 다양한 실시예에서, 성숙 신경 세포 마커는 네스틴, TUBB3, 및/또는 PAX6을 더 포함한다. 다양한 다른 실시예에서, 성숙 신경 세포 마커는 GFAP, 시냅토파이신, NeuN, 및/또는 MAP2를 포함한다.
본 발명에서, 상기 기재된 장기유사체의 공급원으로 사용된 iPSC-유래 세포 (장기-특이적 특성을 갖는 세포를 함유하는 장기유사체로 성장하는 분화된 세포)는, 통상의 기술자에게 알려지고 이용가능한 iPSC 분화의 수단 및 방법을 이용한 iPSCs의 분화에 의해 iPSCs로부터 얻어질 수 있다. 본 발명의 다양한 실시예에서, iPSC-유래 장기유사체-유도 세포 (또는 iPSC-유래 장기유사체 전구체 세포)는 계약 제조업체에서 구입할 수 있다. 그러나, 다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 방법에 관한 특정 실시예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 iPSCs를 이러한 장기유사체-유도 세포 또는 iPSC-유래 장기유사체 전구체 세포 (즉, 장기유사체의 공급원으로 사용된 세포)로 분화시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 장기유사체는 세포외 매트릭스, 바람직하게는 세포외 겔 매트릭스, 더 바람직하게는 기저막-유사 세포외 매트릭스 추출물 (일반적으로 조직 세포외 환경과 유사)에 끼워 넣는다. 다양한 실시예에서, 기저막-유사 세포외 (겔) 매트릭스 추출물은 젤라틴 단백질 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 젤라틴 단백질 혼합물은 EHS (Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포에 의해 분비된 젤라틴 단백질 혼합물이다. 더 바람직하게는, 기저막-유사 세포외 (겔) 매트릭스는 Matrigel® 기저막 매트릭스 (Corning)이다. 본 발명의 다양한 실시예에서, 세포외 (겔) 매트릭스는 하이드로겔이다. 본 발명의 다양한 실시예에서, 세포외 (겔) 매트릭스는 콜라겐, 아가로오스, 알기네이트 또는 Matrigel® 하이드로겔이다. 다양한 다른 실시예에서, 하이드로겔은 합성 하이드로겔이다.
본 발명의 다양한 실시예에서, iPSC-유래 전구체 세포, 또는 iPSC-유래 장기유사체, 또는 장기유사체의 공급원으로 사용된 iPSC-유래 세포는, 미세유체 장치의 별도의 세포 배양 구획에서 침착된다.
다양한 실시예에서, 미세유체 장치는 iPSC-유래 세포 및 iPSC-유래 장기유사체 또는 구상체의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미세유체 장치는 (i) iPSC-유래 간세포 구상체; (ii) iPSC-유래 장 장기유사체; (iii) iPSC-유래 신세뇨관 세포 또는 iPSC-유래 신세뇨관 전구체 세포; 및 (iv) iPSC-유래 신경 구상체를 포함할 수 있고; (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 구상체, 장기유사체 및 세포는 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다. 바람직하게는, (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 구상체, 장기유사체 및 세포는 미세유체 칩의 별도의 세포 배양 구획에서 침착되거나 또는 존재한다. 바람직하게는, iPSC-유래 간세포 구상체를 포함하는 세포 배양 구획은 섬유아세포, 바람직하게는 iPSC-유래 섬유아세포를 더 포함한다. 따라서, iPSC-유래 간 등가물은 (iPSC-유래) 섬유아세포를 갖는 iPSC-유래 간세포의 구상체를 각각의 세포 배양 구획에 놓음으로써 달성된다.
다른 바람직한 실시예에서, iPSC-유래 장 장기유사체는 본 명세서의 다른 곳에서와 같이 세포외 매트릭스 또는 하이드로겔에 끼워 넣는다. 다른 바람직한 실시예에서, iPSC-유래 장 장기유사체를 포함하는 세포 배양 구획은 섬유아세포 및 내피 세포, 바람직하게는 iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포, 또는 iPSC-유래 섬유아세포 및 원발성 미세혈관 내피 세포를 더 포함한다. 원발성 미세혈관 내피 세포 또는 iPSC-유래 내피 세포는 바람직하게는 세포 배양 구획의 기저측면 (basolateral side)에 씨딩된다.
또한, iPSC-유래 신경 구상체를 포함하는 세포 배양 구획은 바람직하게는 생체인쇄된 혈액 뇌 장벽을 더 포함한다. 더 구체적으로, iPSC-유래 신경 구상체를 포함하는 세포 배양 구획은 세포 배양 구획의 기저측면에 씨딩된 내피 세포, 바람직하게는 iPSC-유래 내피 세포가 풍부하다.
다양한 실시예에서, iPSC-유래 전구체 세포, 또는 iPSC-유래 장기유사체, 또는 장기유사체의 공급원으로 사용된 iPSC-유래 세포를 함유하는 세포 배양 구획을 포함하는 미세유체 장치는 제 1 회로 및 제 2 회로를 포함하고, iPSC-유래 전구체 세포, 또는 iPSC-유래 장기유사체, 또는 장기유사체의 공급원으로 사용된 iPSC-유래 세포를 함유하는 세포 배양 구획은 제 1 회로의 일부를 형성하며, 제 2 회로는 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 포함하고, 두 회로는 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 통해 서로 연결된다. 바람직하게는, 여과 유닛은 분자의 크기 및 전하에 기초하여 제 1 회로에서 제 2 회로로 분자의 통과를 선택적으로 허용하는 여과 장벽을 포함한다. 더 바람직하게는, 여과 장벽은 생물학적 장벽이며, 더욱 더 바람직하게는 생물학적 장벽은 족세포를 포함한다. 다른 바람직한 실시예에서, 재흡수 유닛은 제 2 회로에서 제 1 회로로 유체의 재흡수를 허용하는 장벽을 포함한다. 더 바람직하게는, 재흡수 장벽은 생물학적 장벽이며, 더욱 더 바람직하게는 생물학적 장벽은 신세뇨관 세포를 포함한다.
바람직한 실시예에서, 미세유체 장치는 간 기능을 모방하는 간 등가물 또는 조직을 함유하는 제 1 회로에서 적어도 하나의 세포 배양 구획, 및 장 기능을 모방하는 장 등가물 또는 조직을 함유하는 제 1 회로에서 적어도 하나의 세포 배양 구획을 포함한다.
다양한 실시예에서, 제 2 회로의 여과 유닛 및 재흡수 유닛은 신장 또는 신장의 등가물로 간주될 수 있다. 바람직하게는, 신장 또는 신장의 등가물은 신장 또는 신장의 장기유사체를 의미한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 신장 또는 신장의 장기유사체는 바람직하게는 족세포 및 신세뇨관 세포의 장기유사체, 더 바람직하게는 iPSC-유래 족세포 및 iPSC-유래 신세뇨관 세포의 장기유사체를 의미한다. 마찬가지로, 간 장기유사체는 바람직하게는 간세포의 장기유사체, 더 바람직하게는 iPSC-유래 간세포의 장기유사체를 의미한다. 마찬가지로, (소)장 장기유사체는 바람직하게는 (소)장 세포의 장기유사체, 더 바람직하게는 iPSC-유래 (소)장 세포의 장기유사체를 의미한다. 마찬가지로, 신경 장기유사체는 바람직하게는 신경 세포의 장기유사체, 더 바람직하게는 iPSC-유래 신경 세포의 장기유사체를 의미한다. 마찬가지로, 기도 (바람직하게는, 폐) 장기유사체는 바람직하게는 기도 세포, 바람직하게는 폐 세포, 더 바람직하게는 폐 상피 세포의 장기유사체를 의미한다. 바람직하게는, 기도 세포 또는 폐 세포는 각각 iPSC-유래 기도 세포 또는 iPSC-유래 폐 세포이다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 신규한 미세유체 장치는 "간 등가물"을 포함하는 세포 배양 구획이 "장 등가물"을 포함하는 세포 배양 구획의 하류에 위치되도록 세포 배양 구획의 배열을 가진다 (도 1에 나타낸 "혈액 회로"의 배치에 따르나, 이에 한정되지 않음). 바람직하게는, "간 등가물" 및 "장 등가물"을 포함하는 세포 배양 구획은 주 미세채널 구조의 분지(branch)인 별도의 미세채널로 배열된다 (도 1에 나타낸 "혈액 회로"의 배치에 따르나, 이에 한정되지 않음). 바람직하게는, 다른 세포 배양 구획은 장 등가물 및 간 등가물의 세포 배양 구획 사이에 위치하지 않는다. 다양한 실시예에서, 미세유체 장치는 분지형 미세유체 네트워크 (또는 미세유체 채널의 분지형 네트워크)를 포함할 수 있다. 다른 바람직한 실시예에서, 신규한 미세유체 장치는 "신경 등가물"을 포함하는 세포 배양 구획이 "간 등가물" 및 "장 등가물"을 포함하는 세포 배양 구획과 평행하게 배열되도록 세포 배양 구획의 배열을 가지며, 더 바람직하게는 "신경 등가물"은 "간 등가물" 및 "장 등가물"을 포함하는 세포 배양 구획을 포함하는 미세채널 분지에 평행하게 배열된 별도의 미세채널 분지에 배열된다 (도 1에 나타낸 "혈액 회로"의 배치에 따르나, 이에 한정되지 않음).
미세유체 장치가 별도의 배지 저장소 또는 표본추출(sampling) 저장소를 함유하는 경우, 이는 바람직하게는 주 미세채널 구조로 배열된다, 즉, 분지 미세채널 구조로 배열되지 않는다 (도 1에 나타낸 "혈액 회로"의 배치에 따르나, 이에 한정되지 않음).
또한, 미세유체 장치가 미세펌프를 함유하는 경우, 미세펌프는 바람직하게는 주 미세채널 구조로 배열된다, 즉, 분지 미세채널 구조로 배열되지 않는다 (도 1에 나타낸 "혈액 회로"의 배치에 따르나, 이에 한정되지 않음).
다양한 바람직한 실시예에서, 제 2 회로는 분지형 미세유체 네트워크를 나타내지 않으나, 다소 비분지형 회로 또는 순환 시스템이다. 용어 "회로" 및 "순환 시스템"은 본 명세서에서 통용될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에서, (i) iPSC-유래 간세포 전구체 세포; (ii) iPSC-유래 장 전구체 세포; (iii) iPSC-유래 신세뇨관 전구체 세포; 및 (iv) iPSC-유래 신경 전구체 세포를 포함하는 신규한 미세유체 장치로서; (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포가 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 미세유체 장치는, 도 1에 나타낸 배치에 따르나 이에 한정되지 않는 세포 배양 구획의 배열을 가진다. 미세유체 장치가 iPSC-유래 장기유사체, 또는 장기유사체의 공급원으로 사용된 iPSC-유래 세포를 포함하는 본 발명에 따른 실시예에 대해서도 동일하게 적용된다.
본 발명의 다양한 다른 실시예에서, (i) iPSC-유래 간세포 전구체 세포; (ii) iPSC-유래 장 전구체 세포; (iii) iPSC-유래 신세뇨관 전구체 세포; 및 (iv) iPSC-유래 신경 전구체 세포를 포함하는 신규한 미세유체 장치로서; (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포가 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 미세유체 장치는, 도 1에 나타낸 "혈액 회로"의 배치에 따르나 이에 한정되지 않는 세포 배양 구획의 배열을 가진다. 이러한 실시예는 도 1에 나타낸 소변 회로의 신세뇨관 및/또는 신사구체 등가물을 조화시켜 2개의 회로의 중첩을 제공하는, 하나 이상의 구획을 가질 수 있거나 또는 갖지 않을 수 있다. 미세유체 장치가 iPSC-유래 장기유사체, 또는 장기유사체의 공급원으로 사용된 iPSC-유래 세포를 포함하는 본 발명에 따른 실시예에 대해서도 동일하게 적용된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, (i) iPSC-유래 간세포 전구체 세포; (ii) iPSC-유래 장 전구체 세포; (iii) iPSC-유래 신세뇨관 전구체 세포; 및 (iv) iPSC-유래 신경 전구체 세포를 포함하는 신규한 미세유체 장치의 신규한 미세생리학적 시스템으로서; (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포가 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 미세생리학적 시스템은, 바람직하게는 폐쇄형 채널 시스템(closed channel system)이다. 미세유체 장치가 iPSC-유래 장기유사체, 또는 장기유사체의 공급원으로 사용된 iPSC-유래 세포를 포함하는 본 발명에 따른 실시예에 대해서도 동일하게 적용된다.
따라서, 신규한 미세유체 장치의 혈액 및/또는 소변 회로는 폐쇄형 회로, 더 구체적으로 미세유체 채널의 폐쇄형 회로를 형성한다. 더 구체적으로, 신규한 미세생리학적 시스템은 자립형(self-supported) 또는 자급형(self-contained) 미세생리학적 시스템으로 간주될 수 있다. 2개의 신장 기능성 유닛 (여과 유닛 및 재흡수 유닛)을 포함하는 폐쇄형 채널 시스템은 시험 약물의 신장 독성을 구체적으로 분석할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 미세생리학적 시스템 또는 미세유체 장치는 제 1 회로에서 혈액-모방 액체 용액 및/또는 제 2 회로에서 소변-모방 액체 용액으로 작동된다.
(i) iPSC-유래 간세포 전구체 세포; (ii) iPSC-유래 장 전구체 세포; (iii) iPSC-유래 신세뇨관 전구체 세포; 및 (iv) iPSC-유래 신경 전구체 세포를 포함하는 신규한 미세유체 장치로서; (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포가 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 미세유체 장치는, (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포 각각에 대해 하나 이상의 세포 배양 구획을 포함할 수 있다.
마찬가지로, (i) iPSC-유래 간세포 장기유사체; (ii) iPSC-유래 장 장기유사체; 및 (iii) iPSC-유래 신세뇨관 장기유사체를 포함하는 신규한 미세유체 장치로서; (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포가 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 미세유체 장치는, (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포 각각에 대해 하나 이상의 세포 배양 구획을 포함할 수 있다. 다양한 실시예에서, 미세유체 장치는 (iv) (i), (ii) 및 (iii)에 따른 장기유사체와 다른 추가 장기 또는 세포 유형의 iPSC-유래 장기유사체를 더 포함하고, (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 장기유사체는 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다. 바람직한 실시예에서, (iv)에 따른 추가 iPSC-유래 장기유사체는 iPSC-유래 신경 장기유사체이고, (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 장기유사체는 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다.
바람직한 실시예에서, 신규한 미세유체 장치는 미세유체 장치 당 (또는 미세생리학적 시스템 당) 하나의 개별 장기 등가물 원칙에 따라, 각각의 장기 등가물을 한 번만 포함한다. 반면에, 예를 들어, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나가 간 등가물을 포함하는 경우, 이것은 각각 간 등가물을 포함하는 적어도 2개의 세포 배양 구획이 있을 수 있음을 의미한다.
다양한 실시예에서, 각각의 세포 배양 구획 (또는 단일 세포 배양 구획)은 세포 배양 구획 당 하나의 개별 장기 등가물 원칙에 따라, 단지 하나의 장기 등가물을 포함한다.
또한, 다양한 실시예에서, 세포 배양 구획은 하나 이상의 장기 등가물, 예를 들어 장 등가물과 함께 또는 조합한 신경 등가물을 포함할 수 있다. 다양한 다른 실시예에서, 각각의 세포 배양 구획 (또는 단일 세포 배양 구획)은 세포 배양 구획 당 하나의 개별 장기 등가물 원칙에 따라, 단지 하나의 장기 등가물, 즉 하나의 단일 장기와 관련된 등가물을 포함한다.
본 발명은 간세포 장기유사체, 장 장기유사체, 및 신세뇨관 장기유사체의 생성 방법을 제공하며, 방법은 (미세유체 채널을 통해) 서로 미세유체 연결되어 있는 별도의 세포 배양 구획에서 (i) iPSC-유래 간세포 전구체 세포, (ii) iPSC-유래 장 전구체 세포, 및 (iii) iPSC-유래 신장 전구체 세포를 공동-배양하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 성체-유형 간세포 장기유사체, 성체-유형 장 장기유사체, 및 성체-유형 신세뇨관 장기유사체의 생성 방법을 제공하며, 방법은 (미세유체 채널을 통해) 서로 미세유체 연결되어 있는 별도의 세포 배양 구획에서 (i) 성체-유형 간세포 장기유사체로 성장하는 iPSC-유래 구형 장기유사체; (ii) 성체-유형 장 장기유사체로 성장하는 iPSC-유래 구형 장기유사체; 및 (iii) 성체-유형 신세뇨관 장기유사체로 성장하는 iPSC-유래 구형 장기유사체를 공동-배양하는 단계를 포함한다.
다양한 실시예에서, 방법은 (미세유체 채널을 통해) 서로 미세유체 연결되어 있는 별도의 세포 배양 구획을 포함하는 미세유체 장치를 이용하여 수행된다.
다양한 실시예에서, 방법은 바람직하게는 iPSC-유래 내피 세포를 공동-배양하는 단계를 더 포함하며, iPSC-유래 내피 세포는 (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포와 동일한 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지고, iPSC-유래 내피 세포는 세포 배양 구획을 연결하는 미세유체 채널에서 침착된다.
바람직하게는, iPSC-유래 간세포 전구체 세포를 함유하는 세포 배양 구획은 iPSC-유래 간세포 전구체 세포와 동일한 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진 iPSC-유래 섬유아세포를 더 포함한다.
본 발명에 의해 제공된 신규한 미세유체 장치는 iPSC-유래 장기-특이적 전구체 세포 또는 iPSC-유래 장기-특이적 장기유사체를 이용한 미세생리학적 in vitro 시스템으로 장기유사체 또는 조직 공학을 제공할 수 있다. 본 발명은 iPSC-유래 장기유사체를 하이드로겔 내에 인쇄 (생체인쇄) 및/또는 하이드로겔 상에 씨딩함으로써 생성된 장기 장벽을 모방하는 신규한 생체공학적 조직 구조체를 더 제공한다. 특히, 본 발명은 구체적으로 iPSC-유래 장기유사체, iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포를 포함하는 포유류 장기 장벽을 모방하는 생체공학적 결합 조직 구조체, 및 iPSC-유래 신경구 및 iPSC-유래 내피 세포를 포함하는 혈액-뇌-장벽을 모방하는 생체공학적 결합 조직 구조체를 제공한다.
본 발명의 실험 1.1 및 실험 2의 iPSC 칩은 장 장벽을 모방하는 생체공학적 조직 구조체를 예시한다. 특히, 상기 두 실험의 iPSC 칩의 장 등가물은 iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포도 함유하는 마트리겔 하이드로겔 내에 끼워 넣은 iPSC-유래 장 세포의 장기유사체를 함유한다. iPSC-유래 장 등가물 모델에서, 원발성 미세혈관 내피 세포 또는 iPSC-유래 내피 세포는 세포 배양 삽입물의 기저측면에 씨딩된다.
또한, 실험 1.2의 iPSC 칩은 신경 구상체 하에서 인쇄 (생체인쇄)하는 iPSC-유래 내피 세포가 풍부한 iPSC-유래 신경 구상체를 함유하는 세포 배양 삽입물과 함께, 혈액 뇌 장벽을 갖는 신경 등가물을 함유한다. 실험 2의 iPSC 칩의 혈액 뇌 장벽을 갖는 신경 등가물에서, iPSC-유래 신경 구상체를 함유하는 세포 배양 삽입물은 세포 배양 삽입물의 기저측면에 씨딩된 iPSC-유래 내피 세포가 풍부하다.
구체적으로, 본 발명은 (i) iPSC-유래 장기유사체; (ii) iPSC-유래 섬유아세포; 및 (iii) iPSC-유래 내피 세포를 포함하는, 포유류 장기-장벽을 모방하는 결합 조직 구조체를 제공하고, (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기유사체 및 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다. 다양한 실시예에서, 결합 조직 구조체는 생체공학적 결합 조직 구조체이다. 또한, 포유류 장기 장벽은 피부 장벽, 장 장벽, 기도 장벽, 바람직하게는 폐 장벽, 눈 장벽, 구강 점막 조직 장벽, 및 생식기 점막 조직 장벽 중 어느 하나일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 따라서, iPSC-유래 장기유사체는 iPSC-유래 피부 장기유사체, iPSC-유래 장 장기유사체, iPSC-유래 기도, 바람직하게는 폐의 장기유사체, iPSC-유래 눈 장기유사체, iPSC-유래 구강 점막 조직 장기유사체, 및 iPSC-유래 생식기 점막 조직 장기유사체 중 어느 하나일 수 있다.
다양한 바람직한 실시예에서, 포유류 장기-장벽의 모방은 포유류 장기-장벽 기능의 모방을 의미한다.
다양한 실시예에서, 포유류 장기-장벽을 모방하는 결합 조직 구조체는 장벽 장기 등가물로 간주될 수 있다.
다양한 실시예에서, 결합 조직 구조체는 포유류 장 장벽을 모방하고 있다. 따라서, (i) iPSC-유래 장 장기유사체; (ii) iPSC-유래 섬유아세포, 바람직하게는 iPSC-유래 장 섬유아세포; 및 (iii) iPSC-유래 내피 세포, 바람직하게는 iPSC-유래 장 내피 세포를 포함하는, 포유류 장 장벽을 모방하는 결합 조직 구조체가 본 명세서에서 제공되고, (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장 장기유사체 및 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다.
마찬가지로, 본 명세서에 기재된 다른 포유류 장기 장벽을 모방하는 결합 조직 구조체는, 바람직하게는 (i) iPSC-유래 장기-특이적 장기유사체; (ii) iPSC-유래 섬유아세포, 더 바람직하게는 iPSC-유래 장기-특이적 섬유아세포; 및 (iii) iPSC-유래 내피 세포, 더 바람직하게는 iPSC-유래 장기-특이적 내피 세포를 포함하고, (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기-특이적 장기유사체 및 (iPSC-유래) 섬유아세포 및 내피 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다.
다양한 실시예에서, 포유류 장기-장벽을 모방하는 (생체공학적) 결합 조직 구조체는, 하이드로겔 내에 인쇄 (생체인쇄)하는 및/또는 하이드로겔 상에 씨딩하는 (i) iPSC-유래 장기유사체; (ii) iPSC-유래 섬유아세포; 및 (iii) iPSC-유래 내피 세포를 포함하고, (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기유사체 및 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다. 다양한 실시예에서, 하이드로겔은 세포외 매트릭스, 바람직하게는 세포외 겔 매트릭스, 더 바람직하게는 기저막-유사 세포외 매트릭스 추출물 (일반적으로 조직 세포외 환경과 유사)이다. 다양한 실시예에서, 기저막-유사 세포외 (겔) 매트릭스 추출물은 젤라틴 단백질 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 젤라틴 단백질 혼합물은 EHS (Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종 세포에 의해 분비된 젤라틴 단백질 혼합물이다. 더 바람직하게는, 기저막-유사 세포외 (겔) 매트릭스는 Matrigel® 기저막 매트릭스 (Corning)이다. 본 발명의 다양한 실시예에서, 세포외 (겔) 매트릭스는 콜라겐, 아가로오스, 알기네이트 또는 Matrigel® 하이드로겔이다. 다양한 다른 실시예에서, 하이드로겔은 합성 하이드로겔이다.
또한, 본 발명은 포유류 장기-장벽을 모방하는 결합 조직 구조체의 생체공학 또는 생성 방법을 제공하며, 방법은 (i) iPSC-유래 장기유사체, (ii) iPSC-유래 섬유아세포, 및 (iii) iPSC-유래 내피 세포를 하이드로겔 내에 인쇄 (생체인쇄)하는 단계 및/또는 하이드로겔 상에 씨딩하는 단계를 포함하고, (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기유사체 및 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다. 하이드로겔은 상기 기재된 임의의 하이드로겔일 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 포유류 장기-장벽을 모방하는 결합 조직 구조체의 생체공학 또는 생성 방법에 의해 얻어질 수 있거나 또는 얻어진 포유류 장기-장벽을 모방하는 결합 조직 구조체를 제공한다.
본 발명은 조직 복구, 조직 공학 및/또는 조직 제조 중 어느 하나에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 포유류 장기-장벽을 모방하는 결합 조직 구조체를 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) iPSC-유래 신경구 또는 iPSC-유래 신경 장기유사체; 및 (ii) iPSC-유래 내피 세포를 포함하는 포유류 혈액-뇌-장벽을 모방하는 조직 구조체를 제공하고, (i) 및 (ii)에 따른 iPSC-유래 신경구 또는 iPSC-유래 신경 장기유사체, 및 iPSC-유래 내피 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다. 다양한 실시예에서, 포유류 혈액-뇌-장벽을 모방하는 조직 구조체는 포유류 혈액-뇌-장벽을 모방하는 생체공학적 조직 구조체로 간주될 수 있다. 다양한 다른 실시예에서, 포유류 혈액-뇌-장벽을 모방하는 조직 구조체는 (iii) iPSC-유래 섬유아세포를 더 포함하고; (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 신경구 또는 iPSC-유래 신경 장기유사체, iPSC-유래 내피 세포 및 iPSC-유래 섬유아세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다.
또한, 본 발명은 포유류 혈액-뇌-장벽을 모방하는 조직 구조체의 생체공학 또는 생성 방법을 제공하며, 방법은 (i) iPSC-유래 신경구 또는 iPSC-유래 신경 장기유사체; (ii) iPSC-유래 내피 세포; 및 (iii) iPSC-유래 섬유아세포를 하이드로겔 내에 인쇄 (생체인쇄)하는 단계 및/또는 하이드로겔 상에 씨딩하는 단계를 포함하고, (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 신경구 또는 iPSC-유래 신경 장기유사체, iPSC-유래 내피 세포, 및 iPSC-유래 섬유아세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다. 하이드로겔은 포유류 장기 장벽을 모방하는 조직 구조체와 관련하여 상기 기재된 임의의 하이드로겔일 수 있다.
다양한 바람직한 실시예에서, 포유류 혈액-뇌-장벽의 모방은 포유류 혈액-뇌-장벽 기능의 모방을 의미한다.
다양한 실시예에서, 포유류 혈액-뇌-장벽을 모방하는 결합 조직 구조체는 장벽 장기 등가물로 간주될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 포유류 혈액-뇌-장벽을 모방하는 조직 구조체의 생체공학 또는 생성 방법에 의해 얻어질 수 있거나 또는 얻어진 포유류 혈액-뇌-장벽을 모방하는 조직 구조체를 제공한다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 포유류 장기 장벽 또는 포유류 혈액-뇌-장벽을 모방하는 결합 조직 구조체를 포함하는 미세유체 시스템을 제공한다.
또한, 본 발명은 단일 세포 배양 구획에서, (i) iPSC-유래 장기 전구체 세포, (ii) iPSC-유래 섬유아세포, 및 (iii) iPSC-유래 내피 세포를 공동-배양하는 단계를 포함하는 성체 장기 구조체의 생체공학 또는 생성 방법을 제공하며, (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기 전구체 세포 및 iPSC-유래 섬유아세포 및 내피 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다.
다양한 실시예에서, 방법은 단일 세포 배양 구획에서, (i) iPSC-유래 간세포 전구체 세포, (ii) iPSC-유래 섬유아세포, 및/또는 (iii) iPSC-유래 내피 세포를 공동-배양하는 단계를 포함하는 성체 간 장기 구조체의 생체공학 또는 생성 방법을 제공하며, (i), (ii) 및/또는 (iii)에 따른 iPSC-유래 간세포 전구체 세포 및 iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진다. 다양한 바람직한 실시예에서, iPSC-유래 섬유아세포는 iPSC-유래 간 섬유아세포이다. 다양한 다른 바람직한 실시예에서, iPSC-유래 내피 세포는 iPSC-유래 간 내피 세포이다.
다양한 실시예에서, 성체 장기 구조체의 생체공학 또는 생성 방법은 (i) iPSC-유래 장기 전구체 세포, (ii) iPSC-유래 섬유아세포, 및 (iii) iPSC-유래 내피 세포의 공동-배양을 위한 세포 배양 구획을 포함하는 미세유체 장치를 이용하여 수행될 수 있다.
다양한 실시예에서, 성체 장기 구조체는 성체 장기 기능을 모방하는 성체 장기 등가물로 간주될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 성체 장기 구조체는 성체 장기 기능을 모방하는 성체 장기 또는 성체 장기 등가물을 나타내는 마거 또는 마커 단백질의 발현을 특징으로 할 수 있다. 다양한 실시예에서, 성체 장기 기능을 모방하는 성체 장기 또는 성체 장기 등가물은 성체 장기 기능을 모방하는 성숙 장기 또는 성숙 장기 등가물로 간주될 수 있다. 성체 장기 기능을 모방하는 성숙 장기 또는 성숙 장기 등가물을 나타내고 발현하는 마커 단백질은 본 명세서의 다른 곳에 기재되어 있다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 성체 장기 구조체의 생체공학 또는 생성 방법에 의해 얻어질 수 있거나 또는 얻어진 성체 장기 구조체를 제공한다. 본 발명은 구체적으로 본 명세서에 기재된 성체 간 (장기) 구조체의 생체공학 또는 생성 방법에 의해 얻어질 수 있거나 또는 얻어진 성체 간 (장기) 구조체를 제공한다.
또한, 본 발명은 iPSC-유래 내피 전구체 세포를 전단 응력에 노출시키는 단계를 포함하는, 성체 내피 세포의 신규한 생체공학 방법을 제공한다. 방법은 바람직하게는 미세유체 시스템의 미세유체 채널에서 iPSC-유래 내피 전구체 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명의 도 11은 전단 응력이 다중 장기 칩의 채널에서 iPSC-유래 내피 세포의 연신을 촉진한다는 것을 나타낸다.
본 발명은 iPSC-유래 내피 전구체 세포를 전단 응력에 노출시키는 단계를 포함하는, 성체 내피 세포의 생체공학 또는 생성 방법을 제공한다. 다양한 실시예에서, 방법은 미세유체 시스템의 미세유체 채널에서 iPSC-유래 내피 전구체 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 성체 내피 세포의 생체공학 또는 생성 방법에 의해 얻어질 수 있거나 또는 얻어진 성체 내피 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 미세유체 칩에서 혈액 회로 및 소변 회로를 시행하는 단계를 제공하고, 장기 기능성을 모방하는 다수의 모델의 상호 작용 및 누화를 모방하는 시스템에서 안정한 미세환경을 유지하기 위한 생리학적 조건을 지지하는 미세생리학적 시스템을 확립한다. 본 발명은 ADME(T) 프로파일링의 맥락에서 약동학적-약력학적 분석을 위한 어세이 확립에 적합한 신규한 미세유체 장치를 제공한다. 본 발명의 도 1은 예시적인 ADME-N (ADME + 신경 등가물) 칩 밑넓이 (상단) 및 별개의 층의 등각투영도 (하단)를 나타낸다. 등각투영도는 두 회로 (혈액 회로 및 소변 회로) 사이의 막의 위치결정을 예시한다. 도 12는 본 발명의 ADME 칩의 개략적인 부분 단면도를 나타낸다.
본 명세서에 기재된 혈액 회로 및 소변 회로를 시행하는 신규한 미세유체 장치는, 도 3 및 10에 나타낸 글루코오스 및 LDH 측정치에 의해 입증된 바와 같이, 미세생리학적 시스템의 항상성 안정성을 확립하고 유지하는 것으로 나타났다.
사구체 및 세뇨관 구획 (여과 유닛 및 재흡수 유닛)은 폴리카보네이트 막과 단단한 신장 세포층의 조합으로 달성될 수 있다 (도 4). 전자는 더 큰 분자량의 배지 성분을 여과하기 위한 기술적 장벽을 시행하고 이들의 확산을 지연시킨다. 후자는 물질을 재흡수하고 "혈액" 및 "소변" 회로에 걸쳐 농도 구배의 증가를 야기한다. 이 구배는 LDH 뿐만 아니라 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST, 도 5)에서도 볼 수 있다. 이들의 명백하게 상이한 농도 둘다는 본 발명에 의해 제공된 신규한 미세유체 ADME 칩의 신장 막의 기능을 나타낸다. AST는 간세포에서 발견되는 세포내 효소이므로 간 등가물에서 유래한다.
모든 장기 등가물을 면역조직화학적으로 평가하여 동일성, 기능성 및 생존력을 결정하였다 (도 6-9).
대사 분석은 모든 장기 등가물 사이에 재현성 항상성의 확립을 나타내었다. 본 발명은 in vivo에서 관찰되는 세포 분극(cell polarization), 재조직화 (reorganization), 장벽 기능 및 트래피킹(trafficking)의 입증을 가능하게 한다. 하나 이상의 세포 배양 구획을 갖는 제 1 회로 및 신장 유닛의 제 1 회로와 중첩되는 여과 및 재흡수 유닛을 포함하는 제 2 회로를 조합하는 신규한 미세유체 장치에서 안정한 미세환경의 달성은, 예를 들어 약물 개발에서 반복 투여 시험에 대한 가능성을 열어 준다.
본 발명은 하나 이상의 세포 배양 구획을 갖는 제 1 회로, 및 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 포함하는 제 2 회로를 포함하는 신규한 미세유체 장치를 제공하며, 두 회로는 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 통해 서로 연결된다. 도 1은 하기의 장기 등가물: 장, 간, 신장 (사구체 및 세뇨관으로 분리됨) 및 신경 조직의 포함을 위한 공동을 함유하는 2개의 회로 ("혈액 회로" 및 "소변 회로"라고 함)를 포함하는 신규한 미세유체 장치의 예시적인 배치를 나타낸다. 전자의 3개의 조직은 소위 ADME 프로파일 (흡수, 분포, 대사, 배설)을 달성하는데 사용된다. 후자는 그 프로파일을 보충하는 추가 조직이다. 따라서, 칩은 ADME-N 칩 (ADME + 신경 등가물/조직)이라고 한다. 각 회로에서 하나의 저장소 구획은 상청액의 표본추출 ("배지 저장소 1 및 2")을 허용한다. 배지는 2개의 통합된 공압(pneumatic) 미세펌프 (각 회로마다 하나씩)에 의해 미세유체 네트워크를 통해 관류된다. 회로는 2개의 신장 유닛 구획에서 중첩되고 폴리카보네이트로 구성된 다공성 막에 의해 분리된다.
단일-장기 시스템/칩과 비교하여, 본 발명의 미세생리학적 시스템/미세유체 칩은, 미세유체 장치가 2개의 회로를 포함하고, 이에 의해 적어도 2개의 세포 배양 구획을 포함하며, 이들 중 하나는 제 1 회로에 국한되고 다른 하나는 신장 기능을 모방하는 제 2 회로의 유닛 중 하나, 특히 재흡수 유닛인 점을 고려하면, 다중 장기 시스템/칩으로 간주될 수 있다.
다양한 실시예에서, 신규한 미세유체 장치는 하나 이상의 세포 배양 구획을 갖는 제 1 회로, 및 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 포함하는 제 2 회로를 포함하는 것으로 간주될 수 있으며, 두 회로는 여과 유닛 및 재흡수 유닛에서 중첩된다. 다양한 바람직한 실시예에서, 두 회로의 중첩 부분 (또는 두 회로를 서로 연결하는 부분)은 다공성 막에 의해 분리된다. 이들 중첩/연결 부분은 구체적으로 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 의미한다.
다양한 실시예에서, 두 회로의 중첩/연결 부분을 분리하는 상기 다공성 막은 합성 또는 생물학적 다공성 막이다. 다양한 실시예에서, 상기 다공성 막은 콜라겐, 피브린 또는 세포외 매트릭스 (탈세포화 장기 매트릭스 포함) 중 어느 하나로 구성될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 실시예에서, 다공성 막은 Transwell® 삽입물과 동일한 특성을 나타낸다. 다양한 실시예에서, 다공성 막은 세포에 의해 재흡수될 수 있다. 다양한 다른 실시예에서, 다공성 막은 폴리카보네이트로 구성된다. 다양한 다른 실시예에서, 다공성 막은 폴리(디메틸실록산) (PDMS)으로 구성된 다공성 막이다.
여과 유닛 및 재흡수 유닛은 신장 세포, 특히 신사구체 등가물 (여과 유닛) 및 신세뇨관 등가물 (재흡수 유닛)의 포함을 위한 별도의 세포 배양 구획이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "세포 배양 구획(들)" 및 " 세포 배양 챔버(들)" 또는 " 세포 배양 공동(cavity)(들)"은 본 명세서에서 통용될 수 있다. 본 발명에 따른 세포 배양 구획은 본 발명의 맥락에서 사용되고 기재된 세포 및 조직을 배양하는데 특히 적합한 구획, 챔버 또는 공동이다. 다양한 실시예에서, 세포 배양 구획은 웰 플레이트 포맷, 특히 6-, 12-, 24-, 48-, 96-, 및 384-웰 포맷 중 어느 하나의 (미세)웰 세포 배양 플레이트 (또는 다중웰)를 포함한다. 바람직한 실시예는 24-, 48-, 96- 또는 384-웰 포맷의 다중웰을 포함한다. 다중웰은 다양한 물질로 구성될 수 있으며, 가장 일반적인 물질은 본 발명의 다양한 실시예에서 사용될 수 있는 폴리스티렌 및 폴리프로필렌이다. 다양한 다른 실시예에서, 세포 배양 구획은 Transwell® (미세유체) 삽입물, 더 바람직하게는 폴리카보네이트 (PC), 폴리에스터 (PE), 콜라겐-코팅된 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 또는 PET (폴리에틸렌 테레프탈레이트)로 구성된 Transwell® (미세유체) 삽입물이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 맥락에서 사용된 세포 배양 구획은 세포/조직 배양 및 성장을 위한 다공성 막 (표면)을 갖는 것으로 기재될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 다공성 막은 구체적으로 화학적 및/또는 생물학적 분자를 여과, 계량 및/또는 분리하기 위해서 뿐만 아니라, 세포 또는 조직 배양 및 성장을 위한 표면으로서도 사용될 수 있는, 다공성 구조를 갖는 막을 의미하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 맥락에서 사용된 세포 배양 구획의 다공성 막은 구체적으로 세포 배양 구획에 의해 포함된 장기 등가물과 미세유체 네트워크 사이의 유체 연결을 확립하는 역할을 한다. 따라서, 다양한 실시예에서, 본 명세서에 기재된 세포 배양 구획의 다공성 막은 다공성 막의 표면 상에 위치된 장기 등가물 (세포/조직)이 미세유체 장치의 미세유체 채널과 유체 연결되도록 배열된다. 다양한 실시예에서, 다공성 막은 막의 양면에 세포로 씨딩될 수 있다. 바람직하게는, 내피 세포는 다공성 막의 바닥면에 씨딩된다.
일반적으로, 제조 공정을 통해 기공 크기를 수 나노미터에서 마이크로미터로 조정할 수 있어 표적화된 화학적 및 생물학적 분자의 여과, 계량 및 분리, 및 세포 배양 구획의 장기 등가물과 미세유체 채널 네트워크 사이의 유체 흐름을 가능하게 한다. 다양한 실시예에서, 다공성 막은 상기 기재된 다공성 막이다. 따라서, 다공성 막은 합성 또는 생물학적 다공성 막일 수 있다. 다양한 실시예에서, 상기 다공성 막은 콜라겐, 피브린 또는 세포외 매트릭스 (탈세포화 장기 매트릭스 포함) 중 어느 하나로 구성될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 실시예에서, 다공성 막은 Transwell® 삽입물과 동일한 특성을 나타낸다. 다양한 실시예에서, 다공성 막은 세포에 의해 재흡수될 수 있다. 다양한 다른 실시예에서, 다공성 막은 폴리카보네이트로 구성된다. 다양한 다른 바람직한 실시예에서, 다공성 막은 폴리(디메틸실록산) (PDMS)으로 구성된 다공성 막이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "제 1 회로"는 구체적으로 포유류 혈액 순환 시스템을 모방하는 순환 시스템, 더 구체적으로 인간 혈액 순환 시스템을 모방하는 순환 시스템을 의미한다. 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 용어 "제 1 회로" 및 "혈액 회로 등가물" 또는 "생체모방 혈액 회로"는 본 명세서에서 통용될 수 있다. 마찬가지로, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "제 2 회로"는 구체적으로 포유류 비뇨기계(urinary system)를 모방하는 순환 시스템, 더 구체적으로 인간 비뇨기계를 모방하는 순환 시스템을 의미한다. 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 용어 "제 2 회로" 및 "소변 회로 등가물" 또는 "생체모방 소변 회로"는 본 명세서에서 통용될 수 있다.
신장 여과는 수동 여과 및 능동 여과를 포함하며, 사구체는 수동 여과 장벽으로서 작용하여 더 큰 분자량의 혈청 단백질이 네프론(nephron)으로 들어가는 것을 방지한다. 따라서, 이러한 더 큰 분자량의 혈청 단백질은 혈류(blood stream)에서 계속 순환된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 신규한 미세유체 장치의 여과 유닛은 분자의 크기 및 전하에 기초하여 제 1 회로 ("혈액 회로")에서 제 2 회로 ("소변 회로")로 분자의 통과를 선택적으로 허용하여 선택적 사구체 여과 장벽을 모방하는 여과 장벽을 포함한다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 여과 유닛에 의해 포함된 여과 장벽은 (두 회로의 중첩 부분을 분리하는) 혈액 회로로부터 여과 유닛 (및 재흡수 유닛)을 분리하는 다공성 막에 의해 확립된다. 따라서, 이러한 실시예에 따르면, 여과 장벽은 (다공성) 기계적 여과 장벽으로 간주될 수 있다. 구체적으로, (다공성) 기계적 여과 장벽은 사구체 여과 장벽을 모방하고 있다. 따라서, 다양한 실시예에서, 여과 장벽은 다공성 막을 갖는 세포 배양 구획에 의해서도 확립될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 기계적 여과 장벽은 대략 8 nm의 기공 크기를 가지나, ≤ 8 nm의 기공 크기를 가질 수 있다. 다른 바람직한 실시예에 따르면, 기계적 여과 장벽은 혈청 단백질이 제 2 (소변) 회로로 들어가기 위해 약 69 kDa의 상한을 설정한 기공 크기를 가진다. 다양한 실시예에서, 기계적 여과 장벽은 알부민, 바람직하게는 혈청 알부민 (또는 혈액 알부민)이 제 2 (소변) 회로로 들어가기 위해 한계를 설정한 기공 크기를 가진다.
본 발명의 다양한 다른 실시예에서, 여과 유닛에 의해 포함된 여과 장벽은 생물학적 여과 장벽이다. 바람직하게는, 생물학적 여과 장벽은 혈청 단백질이 제 2 (소변) 회로로 들어가기 위해 약 69 kDa의 상한을 설정한 여과 슬릿을 갖는 장벽이다. 다양한 실시예에서, 생물학적 여과 장벽은 족세포 (내장 상피 세포라고도 함)를 포함한다. 더 구체적으로, 생물학적 여과 장벽은 혈장 단백질이 제 2 (소변) 회로로 들어가는 것을 방지하는 족세포 (여과) 장벽이다. 족세포 여과 장벽은 바람직하게는 혈청 단백질이 제 2 (소변) 회로로 들어가기 위해 약 69 kDa의 상한을 설정한 여과 슬릿을 가진다. 다양한 실시예에서, 생물학적 또는 족세포 여과 장벽은 알부민, 바람직하게는 혈청 알부민 (또는 혈액 알부민)이 제 2 (소변) 회로로 들어가기 위해 한계를 설정한 기공 크기를 가진다.
신장 생리학에서, 재흡수 (또는 세뇨관 재흡수)는 네프론이 세뇨관 유체 (소변 전(pre-urine))에서 물과 용질을 제거하고, 이들을 순환 혈액으로 되돌아가게 하는 과정이다. 사구체 여과액은 더 농축되고, 이는 소변을 형성하는 단계 중 하나이다. 재흡수는 많은 유용한 용질 (주로 글루코오스 및 아미노산), 염 및 물이 혈액 순환으로 되돌아갈 수 있게 한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 신규한 미세유체 장치의 재흡수 유닛은 제 2 회로 (소변 회로)에서 제 1 회로 (혈액 회로)로 유체의 재흡수를 허용하는 장벽을 포함한다. 본 발명의 다양한 실시예에서, 재흡수 유닛에 의해 포함된 재흡수 장벽은 재흡수 장벽을 모방하는 (다공성) 기계적 장벽일 수 있다. 바람직하게는, 재흡수 장벽은 생물학적 장벽이며, 더 바람직하게는 생물학적 재흡수 장벽은 신장 세뇨관 세포 (또는 신세뇨관 세포)를 포함한다. 더 구체적으로, 생물학적 재흡수 장벽은 물, 염 및 용질 (후자는 단백질 포함)을 제 1 회로 (혈액 회로)로 되돌아가게 하는 신세뇨관 세포 (재흡수) 장벽이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 재흡수는 재흡수 장벽에서 (구체적으로, 세뇨관 세포에서) 제 1 회로 (혈액 회로)로의 사구체 여과액의 흐름으로 간주될 수 있으며, 이에 의해 특정 물질, 특히 물, 염 및 용질의 선택적 통과를 허용하여 제 1 회로 (혈액 회로)로 다시 통과시킬 수 있다. 다양한 실시예에서, 신세뇨관 세포는 신장 근위 세뇨관 세포로 간주될 수 있다.
본 명세서에 개시된 신규한 미세유체 장치의 제 2 회로는, 세포 배양 구획의 역할을 하지 않지만 (배지) 저장소 구획의 역할을 하는 구획을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 (배지) 저장소 구획은 독점적으로 제 2 회로에서 시료를 채취하기 위한 "표본추출 저장소" 또는 "표본추출 챔버/구획"의 역할을 할 수 있고, 및/또는 독점적으로 미세유체 시스템의 제 2 회로에 시험 시료를 첨가하기 위한 "시료 저장소" 또는 "시료 챔버/구획"의 역할을 할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 제 2 회로는 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 구성하는 2개의 구획/유닛과 다른 세포 배양 구획을 포함하지 않으면서, 제 2 회로에서 시료 (표본추출 구획)을 채취하는 역할을 하고, 및/또는 미세유체 시스템의 제 2 회로에 시험 시료를 첨가하기 위한 "시료 저장소" 또는 "시료 챔버/구획"의 역할을 하는, 별도의 (추가) 저장소 구획을 포함한다.
저장소 구획은 시스템에 영양액을 첨가하기 위해 사용될 수 있으며, 이것이 배지 저장소 구획이라고도 하는 이유이다. 따라서, 저장소 구획은 시험 시료를 표본추출 및 공급 및 첨가하는 3가지 기능을 제공할 수 있지만, 장기 등가물을 운반하는 세포 배양 구획의 역할을 하지 않는다.
본 명세서에 개시된 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로는 마찬가지로 세포 배양 구획의 역할을 하지 않지만 (배지) 저장소 구획의 역할을 하는 구획을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 (배지) 저장소 구획은 독점적으로 제 1 회로에서 시료를 채취하는 역할을 할 수 있다. 또한, 이러한 저장소 구획은 시스템에 영양액을 첨가하기 위해 사용될 수 있으며, 이것이 배지 저장소 구획이라고 할 수 있는 이유이다. 따라서, 제 1 회로의 저장소 구획은 표본추출 및 공급 기능 모두를 제공할 수 있지만, 장기 등가물을 운반하는 세포 배양 구획의 역할을 하지 않는다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 제 1 회로는 하나 이상의 세포 배양 구획 이외에 제 1 회로에서 시료 (표본추출 구획)을 채취하는 및/또는 시스템에 배지 (영양액)을 첨가하는 역할을 하는 저장소 구획을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 간 기능을 모방하는 조직 ("간 등가물")을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 간 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 장 등가물을 포함한다. 이러한 실시예는 미세유체 칩이 장 및 간 (제 1 회로), 및 신장 (제 2 회로)의 장기 등가물을 포함하기 때문에 ADME 프로파일링을 달성하는데 특히 유용하다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 장, 간 및 신장의 장기 등가물은 "ADME" 장기 등가물로 간주될 수 있다. 다양한 실시예에서, 신규한 미세유체 장치는 장, 간 및 신장의 "ADME" 장기 등가물과 다른 하나 이상의 추가 "비-ADME" 장기 등가물을 포함할 수 있다. 다양한 실시예에서, 이러한 추가 "비-ADME" 장기 등가물은 신경 등가물, 피부 등가물, 또는 기도 등가물 (바람직하게는, 폐 등가물)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 간 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 장 등가물을 포함하며, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 신경 등가물을 포함함으로써, ADME-N 칩을 확립한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 간 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 피부 등가물을 포함한다. 이러한 실시예는 미세유체 칩이 피부 및 간 (제 1 회로), 및 신장 (제 2 회로)의 장기 등가물을 포함하기 때문에 ADME 프로파일링을 달성하는데도 유용하다. 그 다음, 피부 등가물을 통해 시험 시료 (시험 약물)의 투여가 수행된다. 이러한 실시예는 크림을 포함하여 화장품 및/또는 소비자 제품을 시험하는데 특히 유용하다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 간 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 기도 등가물, 구체적으로 폐 등가물을 포함한다. 이러한 실시예는 미세유체 칩이 기도/폐 및 간 (제 1 회로), 및 신장 (제 2 회로)의 장기 등가물을 포함하기 때문에 ADME 프로파일링을 달성하는데도 유용하다. 그 다음, 기도/폐 등가물을 통해 시험 시료 (시험 약물)의 투여가 수행된다. 이러한 실시예는 기도/폐를 통한 적용을 위한 약물을 포함하는 물질을 시험하는데 특히 유용하다.
본 발명의 다양한 다른 실시예에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 간 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 장 등가물을 포함하며, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 피부 등가물을 포함한다.
본 발명의 다양한 다른 실시예에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 간 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 장 등가물을 포함하며, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 기도, 바람직하게는 폐, 등가물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 간 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 장 등가물을 포함하며, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 피부 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 기도, 바람직하게는 폐, 등가물을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 간 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 장 등가물을 포함하며, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 피부 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 기도, 바람직하게는 폐, 등가물을 포함하며, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 신경 등가물을 포함한다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 간 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 장 등가물을 포함하며, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 신경 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 피부 등가물을 포함한다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 간 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 장 등가물을 포함하며, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 신경 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 기도, 바람직하게는 폐, 등가물을 포함한다.
바람직한 장기 등가물은 신장 등가물, 간 등가물, 장 등가물, 바람직하게는 소장 등가물, 신경 (뇌) 등가물, 기도/폐 등가물, 및 피부 등가물을 포함한다. 신장 (또는 신장의) 등가물의 경우, 등가물은 구체적으로 사구체 및 세뇨관의 등가물을 의미한다. 더 구체적으로, 이러한 사구체 및 세뇨관의 등가물은 본 명세서에 제공된 신규한 미세유체 장치의 제 2 회로의 별도의 유닛 (각각, 여과 유닛 및 재흡수 유닛)으로 배열된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "세포 배양 구획"은 장기 기능을 모방하는 세포 및 조직을 포함하는 장기 등가물을 포함하거나 또는 함유한다. 따라서, 다양한 실시예에서, 용어 "장기 등가물" 및 "장기 기능을 모방하는 세포/조직"은 본 명세서에서 통용될 수 있다.
다양한 실시예에서, 장기 기능을 모방하는 장기 등가물 또는 조직은 원발성 장기 조직, 예를 들어, 원발성 간 조직 또는 원발성 장 조직이다. 바람직하게는, 원발성 장기 조직은 각각의 장기의 상피 세포, 즉 위장관, 피부 또는 기도의 상피 세포를 포함한다.
다양한 실시예에서, 장기 기능을 모방하는 조직은 각각의 장기의 상피 세포, 즉 위장관, 피부 또는 기도의 상피 세포를 포함하는 조직일 수 있다. 다양한 다른 실시예에서, 장기 기능을 모방하는 조직은 시판되는 세포주로부터 얻을 수 있는 세포를 포함하여, 세포주의 세포를 포함하는 조직일 수 있다.
다양한 다른 실시예에서, 장기 기능을 모방하는 조직은 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)로부터 유래된 세포를 포함하는 조직이다. 구체적으로, 세포는 단일 유형의 체세포로부터 얻어진 (즉, 재프로그래밍된), 단일 (즉, 하나의 동일한) 공여자 iPSC로부터 유래 (즉, 분화)될 수 있다. 예를 들어, 세포는 체성 피부 세포, 백혈구, 신장 세포, 지방 세포 등으로부터 얻어진 (즉, 재프로그래밍된), 단일 (즉, 하나의 동일한) iPSC로부터 유래 (즉, 분화)될 수 있다.
본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 장기 기능을 모방하는 세포 또는 조직은 장기유사체 및 구상체를 포함한다. 따라서, 다양한 실시예에서, 장기 등가물은 구체적으로 특정 장기 기능성의 장기유사체 또는 구상체, 예를 들어, 장 세포 또는 간세포의 장기유사체, 또는 장 세포 또는 간세포의 구상체를 의미한다.
본 발명에 의해 제공된 미세유체 장치의 세포, 조직 및/또는 장기는 2-차원 (2D), 3-차원 (3D) 또는 장기형 복잡도(organotypic complexity)로 모델링될 수 있다. 2D는 단층 세포 배양의 현탁액을 의미하는 반면, 3D는 장기유사체 및 구상체를 포함하는 상이한 기하구조의 다층 배양을 포함한다. 장기형은 in vivo 장기 아키텍처(organ architecture)의 추가 특징을 포착함으로써 3D와 다르다.
다양한 실시예에서, 장기 등가물을 포함하는 세포 배양 구획은 장기유사체를 포함하는 세포 배양 구획이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "장기유사체"는 가장 작은 기능성 장기 또는 조직 유닛을 의미하거나 또는 나타내는 것으로 간주될 수 있다. 마르크스(Marx) 등 (Marx et al. 2012, Altern Lab Anim 40, 235-257)에 의해 15가지 주요 인간 장기에 대해 모든 관련 기능성 및 매우 다양한 집합체 기하구조(conglomerate geometry)를 갖는 장기유사체 조직학의 발췌가 공개되었다. 이의 내용은 참조로 본 명세서에 명백히 포함된다. 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 장기유사체는 구체적으로 iPSC-유래 세포의 장기유사체를 의미하나, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 장기유사체는 장기 기능을 모방하는 세포/조직 배양물로 간주될 수 있다. 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 장기유사체는 일반적으로 하기 특성 중 어느 하나에 의해 특징지어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다: (i) (적어도) 3-차원 다세포 구조체 또는 구조물; (ii) 장기-특이적 세포 유형의 수집; (iii) 줄기 세포 (바람직하게는, iPSCs)에서 생성되는 경우, 일반적으로 발생학적 장기형성(developmental organogenesis) 프로그램을 요약함; (iv) 자기-조직화(self-organization) (세포가 조직으로 자기-조립 및/또는 자기-조직화하는 능력).
다양한 실시예에서, 장기 등가물을 포함하는 세포 배양 구획은 장기 기능을 모방하는 구상체를 포함하는 세포 배양 구획이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 구상체는 구체적으로 iPSC-유래 세포의 구상체를 의미하나, 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 구상체는 in vivo 장기 조직과 매우 유사한, (구형 클러스터(spherical clusters)의) 세포의 응집 또는 자기-조립으로 간주될 수 있다. 구상체는 장기유사체처럼 3-차원 구조 아키텍처를 가진다. 장기유사체와 비교하여, 구상체 배양과는 대조적으로 장기유사체에는 고차의 자기-조립이 있는 것으로 여겨진다. 다양한 실시예에서, 장기유사체는 장기 기능을 모방하는 세포/조직 배양물로 간주될 수 있다.
바람직한 장기유사체는 신장 장기유사체, 간 장기유사체, 장 장기유사체, 바람직하게는 소장 장기유사체, 신경 (뇌) 장기유사체, 기도/폐 장기유사체, 및 피부 장기유사체를 포함한다. 신장 (또는 신장의) 장기유사체의 경우, 장기유사체는 구체적으로 사구체 및 세뇨관의 장기유사체를 의미한다. 더 구체적으로, 이러한 사구체 및 세뇨관의 장기유사체는 본 명세서에 제공된 신규한 미세유체 장치의 제 2 회로의 별도의 유닛 (각각, 여과 유닛 및 재흡수 유닛)으로 배열된다.
본 발명의 다양한 측면에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 iPSC-유래 간 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 iPSC-유래 장 등가물을 포함하며, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 iPSC-유래 신경 등가물을 포함하고, 신규한 미세유체 장치의 제 2 회로는 신장 근위 세뇨관 상피 세포 (RPTEC), 더 구체적으로 재흡수 유닛에 씨딩된 RPTECs를 포함한다. 바람직하게는, iPSC-유래 장 등가물을 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은 iPSC-유래 장 세포의 장기유사체를 포함한다. 더 바람직하게는, iPSC-유래 장 세포의 장기유사체는 세포외 매트릭스, 바람직하게는 세포외 겔 매트릭스, 더 바람직하게는 기저막-유사 세포외 (겔) 매트릭스 추출물 (일반적으로 조직 세포외 환경과 유사)에 끼워 넣는다. 다양한 실시예에서, 기저막-유사 세포외 (겔) 매트릭스 추출물은 젤라틴 단백질 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 기저막-유사 세포외 매트릭스는 Matrigel® 기저막 매트릭스 (Corning)이다.
다른 바람직한 실시예에서, iPSC-유래 장 등가물, 구체적으로 iPSC-유래 장 세포의 장기유사체를 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은 iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포, 또는 iPSC-유래 섬유아세포 및 원발성 미세혈관 내피 세포를 더 포함한다. 원발성 미세혈관 내피 세포 또는 iPSC-유래 내피 세포는 바람직하게는 세포 배양 구획의 기저측면에 씨딩된다.
또한, iPSC-유래 신경 등가물을 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은 바람직하게는 iPSC-유래 신경 구상체를 포함한다. 더 바람직하게는, iPSC-유래 신경 등가물, 구체적으로 iPSC-유래 신경 구상체를 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은 인쇄된 (생체인쇄된) 혈액 뇌 장벽을 포함한다. 더 구체적으로, iPSC-유래 신경 등가물, 구체적으로 iPSC-유래 신경 구상체를 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은, 신경 구상체 하에서 인쇄된 (생체인쇄된) 내피 세포, 바람직하게는 iPSC-유래 내피 세포가 풍부하다.
또한, iPSC-유래 간 등가물을 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은 바람직하게는 iPSC-유래 간세포의 구상체를 포함한다. 더 바람직하게는, iPSC-유래 간 등가물, 구체적으로 iPSC-유래 간세포의 구상체를 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은 섬유아세포, 바람직하게는 iPSC-유래 섬유아세포를 더 포함한다. 바람직한 실시예에서, iPSC-유래 간 등가물은 iPSC-유래 섬유아세포를 갖는 iPSC-유래 간세포의 구상체를 각각의 세포 배양 구획에 놓음으로써 달성된다.
다양한 실시예에서, RPTECs는 신장 근위 세뇨관 상피 세포주를 포함한다.
본 발명의 다양한 측면에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 원발성 간 조직을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 원발성 장 조직, 바람직하게는 원발성 소장 조직을 포함하며, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 iPSC-유래 신경 등가물을 포함하고, 신규한 미세유체 장치의 제 2 회로는 신장 근위 세뇨관 상피 세포 (RPTECs), 더 구체적으로 재흡수 유닛 및/또는 여과 유닛에 씨딩된 RPTECs를 포함한다. 다양한 실시예에서, 원발성 간 조직은 원발성 (인간) 간세포를 포함한다. 원발성 간 조직은 시판되는 간 모델, 예를 들어 3D InSight™ Human Liver Microtissues XL, InSphero일 수 있다. 다양한 실시예에서, 원발성 간 조직 또는 간 모델은 각각 3,000개의 원발성 간세포를 함유하는 50개의 구상체를 포함할 수 있다. 또한, 바람직한 실시예에서, 원발성 장 조직은 원발성 (인간) 세포-유래 장 상피 세포 및 내피 세포를 포함하며, 더 바람직하게는 (인간) 섬유아세포를 더 포함한다. 원발성 장 조직은 시판되는 장 모델, 예를 들어 3D Epilntestinal® 조직 모델 (MatTek Corporation)일 수 있다.
또한, iPSC-유래 신경 등가물을 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은 바람직하게는 iPSC-유래 신경 구상체를 포함한다. 더 바람직하게는, iPSC-유래 신경 등가물, 구체적으로 iPSC-유래 신경 구상체를 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은 인쇄된 (생체인쇄된) 혈액 뇌 장벽을 포함한다. 더 구체적으로, iPSC-유래 신경 등가물, 구체적으로 iPSC-유래 신경 구상체를 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은, 신경 구상체 하에서 인쇄된 (생체인쇄된) 내피 세포, 바람직하게는 iPSC-유래 내피 세포가 풍부하다.
다양한 실시예에서, RPTECs는 신장 근위 세뇨관 상피 세포주를 포함한다.
본 발명의 다양한 측면에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 iPSC-유래 간 등가물을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 iPSC-유래 장 등가물을 포함하며, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 iPSC-유래 신경 등가물을 포함하고, 신규한 미세유체 장치의 제 2 회로는 iPSC-유래 신장 등가물을 포함한다. 바람직하게는, iPSC-유래 장 등가물을 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은 iPSC-유래 장 세포의 장기유사체를 포함한다. 더 바람직하게는, iPSC-유래 장 세포의 장기유사체는 세포외 매트릭스, 바람직하게는 세포외 겔 매트릭스, 더 바람직하게는 기저막-유사 세포외 (겔) 매트릭스 추출물 (일반적으로 조직 세포외 환경과 유사)에 끼워 넣는다. 다양한 실시예에서, 기저막-유사 세포외 (겔) 매트릭스 추출물은 젤라틴 단백질 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 기저막-유사 세포외 매트릭스는 Matrigel® 기저막 매트릭스 (Corning)이다.
다른 바람직한 실시예에서, iPSC-유래 장 등가물, 구체적으로 iPSC-유래 장 세포의 장기유사체를 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은 iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포, 또는 iPSC-유래 섬유아세포 및 원발성 미세혈관 내피 세포를 더 포함한다. 원발성 미세혈관 내피 세포 또는 iPSC-유래 내피 세포는 바람직하게는 세포 배양 구획의 기저측면에 씨딩된다.
또한, iPSC-유래 신경 등가물을 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은 바람직하게는 iPSC-유래 신경 구상체를 포함한다. 더 바람직하게는, iPSC-유래 신경 등가물, 구체적으로 iPSC-유래 신경 구상체를 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은 인쇄된 (생체인쇄된) 혈액 뇌 장벽을 포함한다. 더 구체적으로, iPSC-유래 신경 등가물, 구체적으로 iPSC-유래 신경 구상체를 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은, 세포 배양 구획의 기저측면에 씨딩된 내피 세포, 바람직하게는 iPSC-유래 내피 세포가 풍부하다.
또한, iPSC-유래 간 등가물을 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은 바람직하게는 iPSC-유래 간세포의 구상체를 포함한다. 더 바람직하게는, iPSC-유래 간 등가물, 구체적으로 iPSC-유래 간세포의 구상체를 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은 섬유아세포, 바람직하게는 iPSC-유래 섬유아세포를 더 포함한다. 바람직한 실시예에서, iPSC-유래 간 등가물은 iPSC-유래 섬유아세포를 갖는 iPSC-유래 간세포의 구상체를 각각의 세포 배양 구획에 놓음으로써 달성된다.
본 발명의 다양한 측면에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 원발성 간 조직을 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 원발성 장 조직, 바람직하게는 원발성 소장 조직을 포함하며, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 원발성 신경 조직을 포함하고, 신규한 미세유체 장치의 제 2 회로는 원발성 신장 조직, 바람직하게는 재흡수 유닛에서 원발성 신장 조직, 더 바람직하게는 재흡수 유닛에서 원발성 세뇨관 (상피 세포) 조직 및 여과 유닛에서 원발성 사구체 조직을 포함한다. 바람직하게는, 원발성 신장 조직은 신장 상피 세포, 더 구체적으로 신장 근위 세뇨관 상피 세포 (RPTECs)를 포함하고, 신장 상피 세포 또는 RPTECs는 재흡수 유닛에 씨딩될 수 있으며, 원발성 사구체 조직은 여과 유닛에 씨딩될 수 있는 족세포를 포함한다. 원발성 간 조직은 시판되는 간 모델, 예를 들어 3D InSight™ Human Liver Microtissues XL, InSphero일 수 있다. 또한, 바람직한 실시예에서, 원발성 장 조직은 원발성 (인간) 세포-유래 장 상피 세포 및 내피 세포를 포함하며, 더 바람직하게는 (인간) 섬유아세포를 더 포함한다. 원발성 장 조직은 시판되는 장 모델, 예를 들어 3D Epilntestinal® 조직 모델 (MatTek Corporation)일 수 있다.
또한, 원발성 신경 조직은 바람직하게는 원발성 신경 세포를 포함한다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 원발성 신경 조직, 구체적으로 원발성 신경 세포를 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은 인쇄된 (생체인쇄된) 혈액 뇌 장벽을 더 포함한다. 더 구체적으로, 원발성 신경 조직, 구체적으로 원발성 신경 세포를 포함하는 적어도 하나의 세포 배양 구획은, 세포 배양 구획의 기저측면에 씨딩될 수 있는 또는 신경 구상체 하에서 인쇄된 (생체인쇄된) 내피 세포가 풍부하다.
본 발명의 다양한 측면에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 간 장기유사체를 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 장 장기유사체, 바람직하게는 소장 장기유사체를 포함하며, 신규한 미세유체 장치의 제 2 회로는 재흡수 유닛 및/또는 여과 유닛에서 신장 장기유사체를 포함한다. 다양한 실시예에서, 제 1 회로의 적어도 하나의 추가 세포 배양 구획은 간 장기유사체, 장 장기유사체 (소장 장기유사체 포함), 및 신장 장기유사체와 다른 추가 장기유사체를 더 포함한다. 이러한 추가 장기유사체는 "비-ADME" 장기유사체로 간주될 수 있는 반면, 간 장기유사체, 장 장기유사체 (소장 장기유사체 포함), 및 신장 장기유사체는 "ADME" 장기유사체로 간주될 수 있다. 다양한 실시예에서, 이러한 추가 (비-ADME) 장기유사체는 신경 장기유사체, 피부 장기유사체, 또는 기도 (바람직하게는, 폐) 장기유사체 중 어느 하나일 수 있다. 다양한 실시예에서, 제 1 회로의 적어도 2개의 추가 세포 배양 구획은 간 장기유사체, 장 장기유사체 (소장 장기유사체 포함), 및 신장 장기유사체와 다른 2개의 추가 "비-ADME" 장기유사체 (추가 세포 배양 구획 당 하나의 장기유사체)를 더 포함한다. 다양한 실시예에서, 2개의 추가 (비-ADME) 장기유사체는 신경 장기유사체, 피부 장기유사체, 및/또는 기도 (바람직하게는, 폐) 장기유사체 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 제 1 회로의 적어도 3개의 추가 세포 배양 구획은 3개의 추가 "비-ADME" 장기유사체 (추가 세포 배양 구획 당 하나의 장기유사체)를 더 포함한다. 다양한 실시예에서, 3개의 추가 "비-ADME" 장기유사체는 신경 장기유사체, 피부 장기유사체, 및/또는 기도 (바람직하게는, 폐) 장기유사체이다. 바람직하게는, 장기유사체는 iPSC-유래 장기 세포의 장기유사체이다. 구체적으로, 간 장기유사체는 바람직하게는 iPSC-유래 간세포의 장기유사체이고, 장 장기유사체는 바람직하게는 iPSC-유래 장 세포의 장기유사체, 더 바람직하게는 iPSC-유래 소장 세포의 장기유사체이며, 신경 장기유사체는 바람직하게는 iPSC-유래 신경 세포의 장기유사체이고, 신장 장기유사체는 바람직하게는 iPSC-유래 신장 세포의 장기유사체이다.
본 발명의 다양한 측면에서, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 간 구상체를 포함하고, 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나는 장 구상체, 바람직하게는 소장 구상체를 포함하며, 신규한 미세유체 장치의 제 2 회로는 재흡수 유닛 및/또는 여과 유닛에서 신장 구상체를 포함한다. 다양한 실시예에서, 제 1 회로의 적어도 하나의 추가 세포 배양 구획은 간 구상체, 장 구상체 (소장 구상체 포함), 및 신장 구상체와 다른 추가 구상체를 더 포함한다. 이러한 추가 구상체는 "비-ADME" 구상체로 간주될 수 있는 반면, 간 구상체, 장 구상체 (소장 구상체 포함), 및 신장 구상체는 "ADME" 구상체로 간주될 수 있다. 다양한 실시예에서, 이러한 추가 (비-ADME) 구상체는 신경 구상체, 피부 구상체, 및/또는 기도 (바람직하게는, 폐) 구상체 중 어느 하나일 수 있다. 다양한 실시예에서, 제 1 회로의 적어도 2개의 추가 세포 배양 구획은 간 구상체, 장 구상체 (소장 구상체 포함), 및 신장 구상체와 다른 2개의 추가 "비-ADME" 구상체 (추가 세포 배양 구획 당 하나의 구상체)를 더 포함한다. 다양한 실시예에서, 2개의 추가 (비-ADME) 구상체는 신경 구상체, 피부 구상체, 및/또는 기도 (바람직하게는, 폐) 구상체 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 제 1 회로의 적어도 3개의 추가 세포 배양 구획은 3개의 추가 "비-ADME" 구상체 (추가 세포 배양 구획 당 하나의 구상체)를 더 포함한다. 다양한 실시예에서, 3개의 추가 "비-ADME" 구상체는 신경 구상체, 피부 구상체, 및/또는 기도 (바람직하게는, 폐) 구상체이다. 바람직하게는, 구상체는 iPSC-유래 장기 세포의 구상체이다. 구체적으로, 간 구상체는 바람직하게는 iPSC-유래 간세포의 구상체이고, 장 구상체는 바람직하게는 iPSC-유래 장 세포의 구상체, 더 바람직하게는 iPSC-유래 소장 세포의 구상체이며, 신경 구상체는 바람직하게는 iPSC-유래 신경 세포의 구상체이고, 신장 구상체는 바람직하게는 iPSC-유래 신장 세포의 구상체이다.
다양한 실시예에서, 세포 배양 구획은 하나 이상의 장기 등가물, 예를 들어 장 등가물과 함께 또는 조합한 신경 등가물을 포함할 수 있다. 다양한 다른 실시예에서, 각각의 세포 배양 구획 (또는 단일 세포 배양 구획)은 세포 배양 구획 당 하나의 개별 장기 등가물 원칙에 따라, 단지 하나의 장기 등가물을 포함할 수 있다. 반면에, 예를 들어, 신규한 미세유체 장치의 제 1 회로의 세포 배양 구획 중 적어도 하나가 간 등가물을 포함하는 경우, 이것은 각각 간 등가물을 포함하는 제 1 회로의 2개의 세포 배양 구획이 있을 수 있음을 의미한다. 그러나, 바람직한 실시예에서, 신규한 미세유체 장치는 미세유체 장치 당 (또는 미세생리학적 시스템 당) 하나의 개별 장기 등가물 원칙에 따라, 각각의 장기 등가물을 한 번만 포함한다.
본 발명은 분석 시험, 진단, 연구, 표적 검증, 독성 연구, 조직 공학, 조직 제조, 약물 스크리닝 및/또는 약동학적-약력학적 분석, 구체적으로 ADME(T) 프로파일링에서 본 명세서에 기재된 신규한 미세유체 장치의 용도를 제공한다.
본 발명은 미세생리학적 시스템의 작동을 가능하게 하고, 본 명세서에 제공된 신규한 미세유체 장치에 기초하여 소위 ADME 프로파일링을 확립한다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 신규한 미세유체 장치를 이용한 미세생리학적 시스템의 작동 방법을 제공하고, 본 발명에 의해 제공된 신규한 미세유체 장치를 포함하는 ADME (흡수, 분포, 대사, 배설) 어세이를 더 제공한다. 본 명세서에 기재된 신규한 미세유체 장치를 포함하는 ADMET (흡수, 분포, 대사, 배설, 독성) 어세이가 본 명세서에 더 개시된다.
구체적으로, 약물 발견 과정에서, in vitro ADME 프로파일링 (또는 스크리닝)은 약물 후보물질 선택 및 말기 전임상 및 임상 개발에 필요한 바람직한 약물 대사, 약동학 또는 안전성 프로파일을 갖는 새로운 분자 물질 및 선도 화합물의 선택을 위한 근거를 제공한다. 약물 (시험 물질)의 ADME(T) 프로파일 (또는 특성)을 통해 약물 개발자는 규제 승인에 필요한 안전성 및 효능 자료를 이해할 수 있다.
미세생리학적 시스템의 작동 방법에서, 배양 시간은 몇 주 또는 몇 달 지속될 수 있으며, 이는 질환 모델링 및 반복 투여 물질 노출을 가능하게 한다.
본 발명은 본 발명에 의해 제공된 신규한 미세유체 장치를 이용한 ADME (흡수, 분포, 대사, 배설) 프로파일링의 수행 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 신규한 미세유체 장치를 이용한 ADMET (흡수, 분포, 대사, 배설, 독성) 프로파일링의 수행 방법을 제공한다. 본 발명에 의해 제공된 신규한 미세유체 장치를 이용하여 각각 ADME 스크리닝 또는 ADMET 스크리닝을 수행하는 단계를 포함하는 (시험) 약물의 ADME 프로파일, 또는 ADMET 프로파일의 생성 방법이 본 명세서에 더 개시된다.
본 명세서에 개시된 미세생리학적 시스템의 작동 방법은 바람직하게는 위장관 등가물, 바람직하게는 장 등가물, 더 바람직하게는 소장 등가물을 포함하는 세포 배양 구획을 통해 영양액을 미세생리학적 시스템에 선택적으로 첨가하는 단계를 포함한다. 장기 등가물은 바람직하게는 위장관, 더 바람직하게는 장, 더욱 더 바람직하게는 소장의 상피 세포를 포함하는 조직을 포함한다. 생리학적 in vivo 조건을 반영하기 위하여, 본 발명은 바람직하게는 위장관 등가물, 바람직하게는 장 등가물, 더 바람직하게는 소장 등가물을 포함하는 세포 배양 구획을 통해 영양액을 미세생리학적 시스템에 선택적으로 첨가하여 미세생리학적 시스템을 작동시키는 것이다.
다양한 실시예에서, 영양액은 피부 등가물, 및/또는 기도 등가물, 더 구체적으로 폐 등가물을 포함하는 세포 배양 구획을 통해 미세생리학적 시스템에 선택적으로 첨가된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 영양액은 구체적으로 세포 또는 신체의 성장 또는 회복에 필수적인 물질 (영양분) (아미노산, 염 (전해질) 및 글루코오스 포함), 및 탄수화물 형태의 칼로리를 포함한다. 구체적으로, 본 명세서에 기재된 영양액은 세포 증식을 위한 영양액이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 용어 "영양액" 및 "세포 배양 배지"는 본 명세서에서 통용될 수 있다.
놀랍게도, 본 명세서에 제공된 신규한 미세유체 칩은 미세생리학적 시스템에서 항상성을 확립할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이것은 일정한 수준의 글루코오스 및 LDH로 나타났다 (도 3). 일정한 글루코오스 농도는 이용가능한 글루코오스의 일정한 소비 및 능동적 조절(active regulation)을 암시한다. 글루코오스 수준은 모든 구획에서 동일한 수준에 도달하였다. 더 놀랍게도, 선택적으로 장 등가물을 통해 (정점에서 장 등가물을 통해) 공급하는 것이 "혈액" 회로 및 "소변" 회로 둘 다를 공급하기에 충분하다는 것이 밝혀졌다. 또한, LDH 활성은 실험 내내 다소 일정하게 나타났다. 글루코오스와 비교하여, LDH 수준은 각 구획에서 상이하다. 장 등가물 및 신장 등가물의 장벽 기능은 3개의 모든 "구획" (즉, 혈액 회로 -> 배지 저장소 1; 소변 회로 -> 배지 저장소 2; 및 장 구획)에서 상이한 농도의 LDH로 나타난다. 따라서, 장벽은 교차 물질을 구별한다. 다른 물질을 보유하면서, 글루코오스의 능동적 또는 수동적 침투는, 칩 시스템의 서브세트 사이의 실질적인 상호 작용을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 세포 배양 구획을 갖는 제 1 회로 및 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 포함하는 제 2 회로를 포함하는 미세생리학적 시스템을 작동시키는 단계를 포함하는 항상성의 모방 방법을 제공하며, 두 회로는 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 통해 서로 연결된다. 신규한 미세유체 장치와 관련하여 본 명세서의 다른 곳에 기재된 (바람직한) 실시예에 따르면, 미세생리학적 시스템의 제 2 회로에 의해 포함된 여과 유닛은 바람직하게는 분자의 크기 및 전하에 기초하여 제 1 회로에서 제 2 회로로 분자의 통과를 선택적으로 허용하는 여과 장벽을 포함한다. 더 바람직하게는, 여과 장벽은 생물학적 장벽이며, 더욱 더 바람직하게는 생물학적 장벽은 족세포를 포함한다.
또한, 신규한 미세유체 장치와 관련하여 본 명세서의 다른 곳에 기재된 (바람직한) 실시예에 따르면, 미세생리학적 시스템의 제 2 회로에 의해 포함된 재흡수 유닛은 바람직하게는 제 2 회로에서 제 1 회로로 유체의 재흡수를 허용하는 장벽을 포함한다. 더 바람직하게는, 재흡수 장벽은 생물학적 장벽이며, 더욱 더 바람직하게는 생물학적 장벽은 신세뇨관 세포를 포함한다.
신규한 항상성의 모방 방법의 다양한 실시예에서, 영양액은 위장관 등가물,더 구체적으로 장 등가물, 더욱 더 구체적으로 소장 등가물을 포함하는 (제 1 회로의) 세포 배양 구획을 통해 미세생리학적 시스템에 선택적으로 첨가된다. 다양한 실시예에서, 장기 등가물은 위장관, 바람직하게는 장, 더욱 더 바람직하게는 소장의 상피 세포, 또는 상피 세포를 포함하는 조직을 포함한다.
신규한 미세유체 장치와 관련하여 본 명세서에 기재된 (바람직한) 실시예는 마찬가지로 본 명세서에 기재된 미세생리학적 시스템을 작동시키는 단계를 포함하는 신규한 항상성의 모방 방법에 적용된다. 따라서, 신규한 미세유체 장치와 관련하여 본 명세서의 다른 곳에 기재된 (바람직한) 실시예도 미세생리학적 시스템을 작동시키는 단계를 포함하는 신규한 항상성의 모방 방법과 관련하여 바람직한 실시예이다. 더 구체적으로, 신규한 미세유체 장치와 관련하여 본 명세서의 다른 곳에 기재된 (바람직한) 실시예도 신규한 항상성의 모방 방법에 의해 포함된 미세생리학적 시스템의 바람직한 실시예이다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 미세유체 장치를 이용한 미세생리학적 시스템에서 분석물의 검출 방법을 제공한다. 다양한 실시예에서, 방법은 시험 시료를 제 1 회로의 세포 배양 구획에 첨가하는 단계를 포함하고, 바람직하게는 상기 세포 배양 구획은 위장관 등가물, 더 구체적으로 장 등가물, 피부 등가물, 및/또는 기도 등가물, 더 구체적으로 폐 등가물 중 어느 하나로부터 선택된 장기 등가물을 포함한다. 장기 등가물은 바람직하게는 위장관, 피부, 또는 기도의 상피 세포를 포함하는 조직을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 시험 시료는 위장관 등가물, 더 구체적으로 장 등가물을 포함하는 세포 배양 구획에 첨가된다. 더 바람직하게는, 시험 시료는 위장관 등가물, 구체적으로 장 등가물, 더 구체적으로 소장 등가물을 포함하는 세포 배양 구획에 선택적으로 첨가된다.
다양한 실시예에서, 시험 시료는 피부 등가물, 및/또는 기도 등가물, 더 구체적으로 폐 등가물을 포함하는 세포 배양 구획을 통해 미세생리학적 시스템에 선택적으로 첨가된다.
다양한 다른 실시예에서, 시험 시료는 장기 등가물을 포함하는 세포 배양 구획과 다른 공동(cavity)을 통해 미세생리학적 시스템에 선택적으로 첨가된다. 이러한 공동은 혈액 회로 및/또는 소변 회로의 "배지 저장소"일 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 이러한 "배지 저장소"는 미세유체 시스템에서 시료 또는 배양 상청액을 독점적으로 채취하는 역할을 하는 "표본추출 저장소" 또는 "표본추출 챔버/구획"으로 의도되고, 및/또는 미세유체 시스템에 시험 시료를 독점적으로 첨가하는 역할을 하는 "시료 저장소" 또는 "시료 챔버/구획"으로 의도된다.
다양한 실시예에서, 시험 시료는 바람직하게는 위장관 등가물, 구체적으로 장 등가물, 더 구체적으로 소장 등가물을 포함하는 세포 배양 구획을 통해 미세생리학적 시스템에 첨가되는 액체 시험 시료이다. 다양한 실시예에서, 시험 시료는 바람직하게는 피부 등가물을 포함하는 세포 배양 구획을 통해 미세생리학적 시스템에 첨가되는, 크림을 포함하여 화장품 및/또는 소비자 제품이다.
본 발명에 따른 분석물의 검출 방법은 혈액 회로 및/또는 소변 회로의 "배지 저장소"에서 시료를 채취하는 단계를 포함할 수 있다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 이러한 "배지 저장소"는 미세유체 시스템에서 시료 또는 배양 상청액을 채취하는 역할을 하는 "표본추출 저장소" 또는 "표본추출 챔버/구획"으로 의도될 수 있고, 및/또는 미세유체 시스템에 시험 시료를 첨가하는 역할을 하지만 장기 등가물을 위한 세포 배양 구획으로 역할을 하지 않는 "시료 저장소" 또는 "시료 챔버/구획"으로 의도될 수 있다.
본 발명에 따른 분석물의 검출 방법은 대사물질, 바람직하게는 독성 대사물질의 존재에 대해 표본추출 챔버를 통해 미세유체 시스템에서 채취된 시료를 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 분석물의 검출 방법은 구체적으로 미세생리학적 시스템에 시험 시료로서 첨가된 약물의 대사물질을 검출할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 분석물의 검출 방법은 제 1 회로 및/또는 제 2 회로의 유체 흐름에서 분석물을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
분석물의 검출 방법의 바람직한 실시예에서, 영양액이 첨가된 세포 배양 구획과 동일하거나 또는 상이한, 제 1 회로의 세포 배양 구획에 시험 시료가 첨가되거나 또는 침착된다.
본 명세서에 기재된 신규한 미세유체 장치에 세포를 씨딩하는 단계를 포함하는 세포의 배양 및/또는 유지 방법이 본 명세서에 더 개시된다.
본 명세서에 기재된 신규한 미세유체 장치 및 사용 설명서를 포함하는 미세생리학적 시스템을 작동시키기 위한 키트가 본 명세서에 더 개시된다.
본 발명에 의해 제공된 미세유체 장치는 플레이트 또는 칩의 형태일 수 있다. 플레이트는 일반적으로 마이크로타이터 플레이트 치수를 기반으로 하며, 수동적 중력-기반 미세유체 흐름 또는 능동적 탑재된(on-board) 펌핑을 사용한다. 현미경 슬라이드 크기 및 다른 포맷의 칩은 능동적 또는 수동적 미세유체 흐름에 의해 작동될 수 있으며, 이에 의해 생리학적 모세관내 또는 간질성 속도(interstitial rates)에서 전단 응력을 모방한다. 능동적 미세유체 흐름의 경우, 외부 또는 탑재된 미세펌프가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 의해 제공된 미세유체 장치는 칩의 형태이다.
본 명세서에 개시된 신규한 미세유체 장치 또는 신규한 미세생리학적 시스템의 다양한 실시예에서, 제 1 회로는 내피 세포가 줄지어 있는 하나 이상의 미세유체 채널을 포함한다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 본 발명은 전단 응력이 다중 장기 칩의 채널에서 iPSC-유래 내피 세포의 연신을 촉진한다는 것을 나타낸다 (도 11).
다양한 실시예에서, 신규한 미세유체 장치 또는 신규한 미세생리학적 시스템은 미세펌프, 바람직하게는 연동(peristaltic) 미세펌프를 포함한다. 다양한 실시예에서, 2개의 회로 (제 1 및 제 2 회로) 중 하나는 미세펌프 (즉, "혈액 회로 미세펌프" 또는 "소변 회로 미세펌프")를 가질 수 있다. 바람직한 실시예에서, 2개의 회로 (제 1 및 제 2 회로) 각각은 자체 미세펌프 (즉, "혈액 회로 미세펌프" 또는 "소변 회로 미세펌프")를 가진다. 신규한 미세유체 장치 또는 신규한 미세생리학적 시스템이 폐쇄형 채널 시스템이라는 바람직한 실시예에 따르면, 미세펌프는 바람직하게는 "탑재된" 미세펌프이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 명세서에 제공된 신규한 방법은 제 1 회로의 세포 배양 구획에서 장기 등가물, 바람직하게는 각각의 장기의 (상피) 세포 또는 iPSC-유래 (상피) 세포를 포함하는 조직을 침착 및/또는 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
다양한 실시예에서, 장 등가물은 섬유아세포, 특히 iPSC-유래 섬유아세포를 (더) 포함할 수 있다. 바람직하게는, 장 등가물은 섬유아세포, 특히 iPSC-유래 섬유아세포를 더 포함하는 iPSC-유래 장 등가물이다. 더 바람직하게는, 장 등가물은 섬유아세포, 특히 iPSC-유래 섬유아세포를 포함하는, 세포외 매트릭스의 층에 의해 형성된 iPSC-유래 등가물이다. 세포외 매트릭스의 층은 바람직하게는 세포외 매트릭스의 겔-기반 층이다. 더욱 더 바람직하게는, 장 등가물은 iPSC-유래 장 세포의 장기유사체이다. 바람직하게는, 장 등가물은 기저막-유사 세포외 매트릭스 추출물 (일반적으로 조직 세포외 환경과 유사)의 층에 의해 형성된, iPSC-유래 등가물, 바람직하게는 iPSC-유래 장 세포의 장기유사체이고, 층은 섬유아세포, 특히 iPSC-유래 섬유아세포를 포함한다. 다양한 실시예에서, 기저막-유사 세포외 매트릭스 추출물은 젤라틴 단백질 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 기저막-유사 세포외 매트릭스는 Matrigel® 기저막 매트릭스 (Corning)이다.
다양한 실시예에서, 바람직하게는 iPSC-유래 장 세포의 장기유사체인 장 등가물은 상기한 세포외 매트릭스에 포함되거나 또는 끼워 넣는다.
다양한 실시예에서, 바람직하게는 iPSC-유래 장 세포의 장기유사체인 장 등가물은 세포 배양 구획의 기저측면에 원발성 미세혈관 또는 iPSC-유래 내피 세포 (후자가 바람직함)를 포함하는 내피 세포의 (폐쇄된) 층을 포함한다. 다양한 실시예에서, 바람직하게는 iPSC-유래 장 세포의 장기유사체인 장 등가물은 세포 배양 구획의 기저측면에 iPSC-유래 내피 세포의 (폐쇄된) 층을 포함한다.
다양한 실시예에서, 상기 기재된 바와 같이, 장 등가물은 섬유아세포 및 내피 세포, 특히 iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포를 (더) 포함할 수 있다. 따라서, 다양한 실시예에서, 장 등가물은 섬유아세포, 특히 iPSC-유래 섬유아세포를 포함하는, 세포외 매트릭스의 층에 의해 형성된 iPSC-유래 장 등가물이며, 장 등가물은 세포 배양 구획의 기저측면에 내피 세포, 바람직하게는 원발성 미세혈관 내피 세포의 다른 층을 더 포함한다. 대안적으로, 다양한 실시예에서, 장 등가물은 섬유아세포, 특히 iPSC-유래 섬유아세포를 포함하는, 세포외 매트릭스의 층에 의해 형성된 iPSC-유래 장 등가물이며, 장 등가물은 세포 배양 구획의 기저측면에 iPSC-유래 내피 세포의 다른 층을 더 포함한다.
다양한 실시예에서, 장 등가물은 상기한 세포외 매트릭스에 포함되거나 또는 끼워 넣는다.
또한, 상기 기재된 바와 같이, iPSC-유래 장 등가물은 바람직하게는 iPSC-유래 장 세포의 장기유사체이다. 또한, 세포외 매트릭스의 층은 바람직하게는 세포외 매트릭스의 겔-기반 층, 더 바람직하게는 기저막-유사 세포외 매트릭스 추출물 (일반적으로 조직 세포외 환경과 유사)의 층이다. 기저막-유사 세포외 매트릭스 추출물은 젤라틴 단백질 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 기저막-유사 세포외 매트릭스는 Matrigel® 기저막 매트릭스 (Corning)이다.
다양한 실시예에서, 신경 등가물은 내피 세포, 특히 iPSC-유래 내피 세포를 (더) 포함할 수 있다. 바람직하게는, 신경 등가물은 내피 세포, 특히 iPSC-유래 내피 세포를 더 포함하는 iPSC-유래 등가물이다. 더 바람직하게는, 내피 세포, 특히 iPSC-유래 내피 세포는, 신경 등가물을 포함하는 세포 배양 구획의 신경 등가물의 기저측면에 존재한다. 대안적으로, 신경 등가물은 신경 등가물 하에서 인쇄된 (생체인쇄된) (따라서 존재하는) iPSC-유래 내피 세포를 더 포함하는 iPSC-유래 신경 등가물이다. 바람직하게는, iPSC-유래 신경 등가물은 iPSC-유래 신경 세포의 구상체 또는 장기유사체를 포함하며, iPSC-유래 내피 세포는 iPSC-유래 신경 세포의 신경 구상체 또는 장기유사체 하에서 인쇄 (생체인쇄)되고 (따라서 존재한다). 바람직하게는, iPSC-유래 신경 등가물은 세포외 매트릭스의 층에 포함되거나 또는 끼워 넣은 iPSC-유래 신경 세포의 구상체 또는 장기유사체를 포함한다. 바람직하게는, iPSC-유래 내피 세포는 iPSC-유래 신경 세포의 신경 구상체 또는 장기유사체 (기저측) 하에서 세포외 매트릭스에서 인쇄 (생체인쇄)되고 (따라서 존재한다). 상기 기재된 바와 같이, 세포외 매트릭스는 바람직하게는 세포외 겔 매트릭스, 더 바람직하게는 기저막-유사 세포외 매트릭스 추출물 (일반적으로 조직 세포외 환경과 유사)이다. 기저막-유사 세포외 매트릭스 추출물은 젤라틴 단백질 혼합물을 포함한다. 바람직하게는, 기저막-유사 세포외 매트릭스는 Matrigel® 기저막 매트릭스 (Corning)이다.
신경 구상체 또는 장기유사체 하에서 인쇄된 (생체인쇄된), 또는 신경 등가물의 기저측면, 특히 신경 등가물을 포함하는 세포 배양 구획의 기저측면에 씨딩된, 내피 세포는 혈액-뇌-장벽과 유사하며, 이의 견고성은 2주의 칩 배양 후 20-78 Ω x ㎠의 TEER로 나타났다. TEER (Transepithelial/transendothelial electrical resistance)은 내피 및 상피 세포 층의 세포 배양 모델에서 융합막(tight junction) 역학의 무결성을 측정하는 널리 인정된 정량적 기법이다. TEER은 예를 들어 약물 또는 화학물질의 수송에 대해 평가되기 전에 세포 장벽의 무결성을 나타내는 강력한 지표이다. TEER 측정은 세포 손상 없이 실시간으로 수행할 수 있으며, 일반적으로 광범위한 주파수에서 옴 저항(ohmic resistance)의 측정 또는 임피던스(impedance)의 측정을 기반으로 한다. 다양한 세포 유형에 대한 측정은 시판되는 측정 시스템 및 맞춤형(custom-built) 미세유체 시행으로 보고되었다. TEER을 이용하여 광범위하게 특징지어진 장벽 모델 중 일부는 혈액-뇌-장벽 (BBB), 위장관 (GI) 및 폐 모델을 포함한다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 신경 구상체 또는 장기유사체 하에서 인쇄된 (생체인쇄된), 또는 신경 등가물의 기저측면, 특히 신경 등가물을 포함하는 세포 배양 구획의 기저측면에 씨딩된, 내피 세포는 구체적으로 2주의 칩 배양 후 20-78 Ω x ㎠의 TEER를 나타낸다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 장 등가물의 세포는 수크라제-이소말타제, 장 올리고펩티드 수송체 SLC15A1/펩티드 수송체 1 (PEPT1), 및 주요 대사 효소 CYP3A4를 포함하는 장 상피 세포의 특이적 마커의 발현을 특징으로 한다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 장 등가물 및/또는 간 등가물의 세포는 주요 대사 효소 CYP3A4를 포함하는 특이적 마커의 발현을 특징으로 한다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 간 등가물의 세포는 시토케라틴 8/18을 포함하는 특이적 마커의 발현을 특징으로 한다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 간 등가물은 융합막 ZO-1 단백질의 발현을 특징으로 한다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 신경 등가물의 세포는 베타-튜불린 III을 포함하는 특이적 마커의 발현을 특징으로 한다.
본 발명의 다양한 실시예에서, (원발성) 내피 세포는 CD31 및/또는 vWF (von-Willebrand-Faktor)의 발현을 특징으로 한다.
본 발명의 다양한 실시예에서, (iPSC-유래) 섬유아세포는 비멘틴의 발현을 특징으로 한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명에서 사용되고 기재된 모든 유형의 세포는 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)로부터 유래될 수 있다. 구체적으로, 세포는 단일 유형의 체세포로부터 얻어진 (즉, 재프로그래밍된), 단일 (즉, 하나의 동일한) 공여자 iPSC로부터 유래 (즉, 분화)될 수 있다. 예를 들어, 세포는 체성 피부 세포, 백혈구, 신장 세포, 지방 세포 등으로부터 얻어진 (즉, 재프로그래밍된), 단일 (즉, 하나의 동일한) 공여자 iPSC로부터 유래 (즉, 분화)될 수 있다. 따라서, 세포가 iPSC-유래 세포로 아직 확인되지 않은 정도로, 본 발명에서 사용되고 기재된 세포는 다양한 실시예에 따른 iPSC-유래 세포, 바람직하게는 단일 유형의 체세포로부터 얻어진 (즉, 재프로그래밍된), 단일 (즉, 하나의 동일한) 공여자 iPSC로부터 분화된 iPSC-유래 세포일 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "장"에 대한 언급은 바람직한 실시예에 따르면 "소장"에 대한 언급을 의미한다. 예를 들어, "장 등가물" 또는 "장의 세포"에 대한 언급은 바람직한 실시예에 따르면 각각 "소장 등가물" 또는 "소장의 세포"에 대한 언급을 의미한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "세포"에 대한 언급은 "포유류 세포"에 대한 언급을 포함하지만, "인간 세포"에 대한 언급이 바람직하다. 예를 들어, "내피 세포"에 대한 언급은 "포유류 내피 세포"에 대한 언급을 포함하지만, "인간 내피 세포"에 대한 언급이 바람직하다.
본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, "조직"에 대한 언급은 "포유류 조직"에 대한 언급을 포함하지만, "인간 조직"에 대한 언급이 바람직하다. 예를 들어, "간 조직"에 대한 언급은 "포유류 간 조직"에 대한 언급을 포함하지만, "인간 간 조직"에 대한 언급이 바람직하다.
본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이, 다양한 실시예에서, 용어 "조직"은 "조직 배양물"로 간주될 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 바와 같이, "배양 세포"는 바람직하게는 "세포의 유체 배양"을 의미한다.
다양한 실시예에서, 본 발명은 유체의 (또는 유체) 전단 응력, 구체적으로 생리학적으로 관련된 유체의 (또는 유체) 전단 응력을 포함한다.
도 1은 예시적인 ADME-N 칩 밑넓이(footprint) (상단) 및 별개의 층 (separate layers)의 등각투영도(isometrical view) (하단)를 나타낸다. 등각투영도는 두 회로 (혈액 회로 및 소변 회로) 사이의 막의 위치결정(positioning)을 예시한다. ADME-N = ADME 칩 + 신경 등가물.
도 2는 iPSC 칩 및 원발성 조직 칩의 실험 설계를 나타낸다. RPTECs = 신장 근위 세뇨관 상피 세포주 (renal proximal tubule epithelial cell line). iPSC = 유도 만능 줄기 세포. 2A: 실험 1.1 및 1.2의 설계, 2B: 실험 2의 설계.
도 3은 글루코오스 농도 및 LDH 활성의 측정치를 나타낸다. 3A: 실험 1.1 (iPSC 칩)의 글루코오스 농도 및 LDH 활성의 측정치; 3B: 실험 1.2 (원발성 조직 칩)의 글루코오스 농도 및 LDH 활성의 측정치. "혈액" 배지 저장소 (혈액 회로용) 및 "소변" 배지 저장소 (소변 회로용)에서, 장 등가물의 정점 구획(apical compartment)에서 매일 측정하였다.
도 4는 인간 RPTECs로 완전히 씨딩된 ADME-N 칩의 신세뇨관 등가물을 나타낸다 (실험 1.1, 7일). A: 배양 7일째에 명시야 (bright field, BF) 영상. B-D: 14일째에 RPTECs의 면역조직학적 염색 (실험 1.2) B: DAPI (4',6-디아미딘-2-페닐인돌)로 염색된 핵; C: NaK-ATPase로 염색된 세포막; D: 시토케라틴(cytokeratin) 8/18로 염색된 세포골격(cytoskeleton). RPTECs = 신장 근위 세뇨관 상피 세포.
도 5는 배지 저장소 1의 "혈액" 회로 및 배지 저장소 2의 "소변" 회로에서 아스파르테이트 트랜스아미나제 (aspartate transaminase, AST) 농도의 측정치를 나타낸다.
도 6은 ADME-N 칩 배양 7일째에 원발성 내피 세포를 갖는 iPSC-유래 장 등가물의 예시적인 면역조직학적 검사를 나타낸다 (실험 1.1). A: DAPI로 염색된 핵; B: CD31로 염색된 원발성 내피 세포; C: NaK-ATPase로 염색된 iPSC-유래 장 장기유사체. D: DAPI로 염색된 핵; E: Cyp3A4로 염색된 iPSC-유래 장 장기유사체; F: 비멘틴(vimentin)으로 염색된 iPSC-유래 섬유아세포.
도 7은 ADME-N 칩에서 2주 동안 배양된 원발성 간 등가물 (InSphero)의 예시적인 면역조직학적 검사를 나타낸다 (실험 1.2). A: DAPI로 염색된 핵; B: 알부민; C: Cyp3A4.
도 8은 ADME-N 칩에서 3주 동안 배양된 iPSC-유래 간 등가물의 예시적인 면역조직학적 검사를 나타낸다 (실험 2). 모든 세포는 동일한 공여자로부터 유래된다. A: DAPI로 염색된 핵; B: 비멘틴으로 염색된 iPSC-유래 섬유아세포; C: 시토케라틴 8/18로 염색된 간세포의 세포골격, D: DAPI로 염색된 핵; E: ZO-1로 염색된 융합막(tight junctions); F: 알부민.
도 9는 ADME-N 칩에서 2주 동안 배양된 iPSC-유래 신경 등가물의 예시적인 면역조직학적 검사를 나타낸다 (실험 1.2). A: DAPI로 염색된 핵; B: b 튜불린 (Tubulin) III로 염색된 신경 세포; C: vWF (von-Willebrand-Faktor)로 염색된 원발성 내피 세포; D: 원발성 내피 세포를 포함하는 인쇄된 하이드로겔 상에 놓여 있는 신경 구상체(neuronal spheroids)의 명시야 영상.
도 10은 배지 저장소 1의 혈액 회로 및 배지 저장소 2의 소변 회로에서 장 등가물의 정점 구획에서의 LDH 농도의 측정치를 나타낸다 (실험 2). 장 등가물 및 신장 등가물의 장벽 기능은 3개의 모든 구획에서 상이한 농도의 LDH로 나타난다.
도 11은 다중 장기 칩의 채널에서 iPSC-유래 내피 세포의 연신(elongation)을 나타낸다. 칩 배양 8일째에 내피 마커 CD31의 높은 발현.
도 12는 본 발명의 ADME-칩의 개략적인 단면도를 나타낸다. A = 투여, D = 분포, M = 대사, E = 배설.
도 13은 iPSC-유래 간세포의 분화, 및 iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포에 의한 3D 구상체 형성 (간 등가물) 후의 면역형광 영상을 나타낸다. 비멘틴: iPSC-유래 섬유아세포를 갖는 iPSC-유래 간세포 (비멘틴 염색). CD31: iPSC-유래 내피 세포를 갖는 iPSC-유래 간세포 (CD31 염색). 모든 세포는 동일한 iPSC 공여자로부터 유래된다. 척도 = 100 μm.
도 14는 iPSC-유래 간 등가물 (iPSC-유래 간세포)에서 선택된 간 마커 유전자의 전사 수준을 나타낸다. 전사 수준은 qPCR로 분석하였다. iPSC-유래 간 등가물을 2일 동안 배양하여 iPSC-유래 간세포, 섬유아세포 및 내피 세포를 포함하는 3D 간 구상체를 생성하였다. 자료는 하우스키퍼(housekeeper) TBP로 정규화된다.
도 15는 칩 상의 단일 배양에서 프로프라놀롤(propranolol)을 프로프라놀롤-글루코로니드(glucoronide) 및 알파-나프톡시락트산으로 대사하기 위한 iPSC-유래 3D 간 등가물의 대사 능력을 나타낸다.
도 16은 장 삽입물 모델 개발을 나타낸다. 모든 세포는 동일한 iPSC 공여자로부터 유래된다. a): 장 모델 설정의 개략도; b) 및 c): 2주의 정치 배양 후 iPSC-유래 장 장기유사체 및 iPSC-유래 섬유아세포의 공동-배양; d): 삽입물 플라스틱 가장자리 아래, 삽입물 막의 아래에 보이는 iPSC-유래 내피 세포층; e) 및 f): iPSC-유래 장기유사체, 섬유아세포 및 내피 세포를 이용한 장 모델의 추가 3주 정치 배양; g): 3주의 정치 배양 후 플라스틱 삽입물 가장자리 아래의 iPSC-유래 내피 세포층. 척도: 500 μm.
도 17은 iPSC-유래 장 장기유사체, iPSC-유래 섬유아세포 및 원발성 내피 세포를 갖는 생체인쇄된 하이드로겔 장벽을 나타낸다.
도 18은 신경구 및 내피 세포로 구성된 iPSC-유래 혈액-뇌-장벽을 나타낸다. 모든 세포는 동일한 iPSC 공여자로부터 유래된다.
도 19는 ADME-N 칩에서 신장 장기유사체, 간 구상체, 신경구 및 장 장기유사체로의 iPSC 분화, 전이 및 공동-배양의 설정 및 시간표를 나타낸다. 모든 세포는 동일한 iPSC 공여자로부터 유래된다. DE: 완전 내배엽(definitive endoderm); TW: 트랜스웰(Transwell).
도 20은 14일 동안 ADME-N 칩에서 공동-배양된 간, 장, 신장 및 신경 모델의 면역염색 특성을 나타낸다 (실험 2 참조). 모든 세포는 동일한 iPSC 공여자로부터 유래된다. a) - c): 간 모델: a: 알부민, ZO-1, b: HNF4α, SLC10A1, 및 c: Ki67, TUNEL; d) - f): 장 모델: d: CDX2, Na+/K+-ATPase, e: 시토케라틴 8/18, 비멘틴, 및 f: Ki67, TUNEL; g) - i): 신장 모델: g: 시토케라틴 8/18, 비멘틴, h: 아쿠아포린1(Aquaporinl), Na+/K+-ATPase, 및 i: Ki67, TUNEL; j) - l): 신경 모델: j: TUBB3, PAX6, k: 네스틴(Nestin), 및 l: Ki67, TUNEL. 척도 = 50 μm. 점선은 투과성 삽입물 막을 나타낸다.
도 21은 iPSC-유래 장, 간, 신장 및 뇌 모델의 ADME-N 칩에서 공동-배양의 qPCR 결과를 나타낸다. 모든 세포는 동일한 iPSC 공여자로부터 유래된다. 자료는 하우스키퍼 EF1 (a, c) 또는 TBP (b, d)로 정규화된다. 0일, 7일 및 14일의 경우 N = 3-6; iPSCs의 경우 N = 1-3, 및 양성 대조군의 경우 N = 1을 나타낸다. ND: 검출된 신호 없음. Tukey의 다중 비교 시험을 사용한 일반적인 일원분산분석(one-way ANOVA)을 통계 분석에 사용하였다. a) 내지 d) 각각에서, 왼쪽에서 오른쪽으로의 막대는 "iPSCs", "0일", "7일", "14일" 및 각각의 "양성 대조군"이다.
실시예
ADME-N 칩의 칩 설계
인간 생리학으로부터 축소된 제약을 갖는 칩 설계가 실현된다. 흐름 특성뿐만 아니라 치수 자료도 고려된다. 배치는 하기의 장기 등가물: 장, 간, 신장 (사구체 및 세뇨관으로 분리됨) 및 신경 조직의 포함을 위한 공동을 함유하는 2개의 회로 ("혈액" 및 "소변"이라고 함)를 포함한다 (도 1). 전자의 3개의 조직은 소위 ADME 프로파일 (흡수, 분포, 대사, 배설)을 달성하는데 사용된다. 후자는 그 프로파일을 보충하는 추가 조직이다. 따라서, 칩은 ADME-N 칩이라고 한다. 각 회로에서 하나의 저장소 구획은 상청액의 표본추출 ("배지 저장소 1 및 2")을 허용한다. 배지는 2개의 통합된 공압 미세펌프 (각 회로마다 하나씩)에 의해 미세유체 네트워크를 통해 관류된다. 회로는 2개의 신장 구획에서 중첩되고 폴리카보네이트로 구성된 다공성 막에 의해 분리된다.
장 구획
장 등가물은 24-웰 고정된(standing) 세포 배양 삽입물을 각각의 공동 (세포 배양 구획)에 놓음으로써 실현되었다. 삽입물은 시판되는 장 모델 (Epilntestinal®, MatTek) 또는 iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포도 함유하는 마트리겔 내에 끼워 넣은 iPSC-유래 장 세포의 장기유사체를 함유하였다. iPSC-유래 장 등가물 모델에서, 원발성 미세혈관 내피 세포 또는 iPSC-유래 내피 세포는 24-웰 고정된 세포 배양 삽입물의 기저측면에 씨딩되었다. 삽입물의 정점 측면(apical side)은 영양액 (Nutriflex® peri, B. Braun)을 매일 공급하는데 사용되었다. 전체적으로, 정점 측면은 250 μL의 상청액을 함유하였다.
신경 구획
혈액 뇌 장벽을 갖는 신경 등가물은 96-웰 벽걸이(hanging) 세포 배양 삽입물의 기저측면에 씨딩된 또는 신경 구상체 하에서 생체인쇄된 iPSC-유래 내피 세포가 풍부한 iPSC-유래 신경 구상체를 함유하는 96-웰 벽걸이 세포 배양 삽입물로 이루어졌다. 삽입물의 정점 측면은 75 μL의 부피를 함유하였다.
간 구획
간 등가물은 시판되는 간 모델 (3D InSight™ Human Liver Microtissues XL, InSphero) 또는 iPSC=유래 섬유아세포를 갖는 iPSC-유래 간세포의 구상체를 각각의 공동에 놓음으로써 달성되었다. 전자 중 50개의 구상체를 하나의 칩에 놓았으며, 각각은 3,000개의 원발성 간세포를 함유하였다. 후자 중 20개의 구상체를 하나의 칩에 놓았으며, 각각은 50,000개의 세포를 함유하였다.
신장 (신장의) 구획
신장 구획은 신장 근위 세뇨관 상피 세포주 (RPTECs) 또는 iPSC-유래 신장 세포로 씨딩되었다.
iPSC-유래 세포에 사용된 분화 프로토콜은 표 1에 열거된 상이한 논문에서 수정되었다.
[표 1]
iPSC-유래 세포의 목록. 분화 프로토콜은 열거된 논문에서 수정되었다.
"혈액" 회로는 대략 1.37 mL의 전체 부피를 가졌다 (정점 부피는 포함하지 않음). "소변" 회로는 대략 0.58 mL의 전체 부피를 가졌다. 처음에, 칩은 글루코오스 및 혈청이 있는 배지를 함유하였다. 매일, 배지 저장소 및 장 등가물의 정점 측면에서 시료를 채취하였다. 채취한 양을 "혈액" 배지 저장소용 글루코오스-없는 배지 및 "소변" 배지 저장소용 글루코오스- 및 혈청-없는 배지로 대체하였다. 장 구획에 글루코오스-풍부 Nutriflex® peri 용액을 제공하였다. 이러한 방식으로, 장 등가물을 통해서만 1.0 mg의 글루코오스를 시스템에 매일 공급하였다.
칩 세트를 7일, 14일 및 21일 동안 배양하였다 (도 2). 종료점에서, 면역조직학적 검사, qPCR 및 RNA 시퀀싱을 위해 세포 시료를 채취하였다. 이의 글루코오스, 락테이트, LDH, 알부민, 우레아, ALT 및 AST 함량에 대해 상청액을 분석하였다. 제공된 장기 등가물의 정치 배양으로부터의 대조군을 0일, 7일 및 14일에 채취하였다.
실험 1.1: iPSC 칩 - 3개의 칩
- iPSC 간 등가물
- iPSC 장 등가물
- iPSC 인쇄된 혈액 뇌 장벽을 갖는 신경 등가물
- RPTECs 신장
장 구획
장 등가물의 삽입물은 iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포도 함유하는 마트리겔 내에 끼워 넣은 iPSC-유래 장 세포의 장기유사체를 함유한다. iPSC-유래 장 등가물 모델에서, 원발성 미세혈관 내피 세포 또는 iPSC-유래 내피 세포는 24-웰 고정된 세포 배양 삽입물의 기저측면에 씨딩된다.
신경 구획
혈액 뇌 장벽을 갖는 신경 등가물은 신경 구상체 하에서 생체인쇄된 iPSC-유래 내피 세포가 풍부한 iPSC-유래 신경 구상체를 함유하는 세포 배양 삽입물로 이루어진다.
간 구획
간 등가물은 iPSC=유래 섬유아세포를 갖는 iPSC-유래 간세포의 구상체를 각각의 공동에 놓음으로써 달성된다. 20개의 구상체를 하나의 칩에 놓고, 각각은 50,000개의 세포를 함유한다 (간세포:섬유아세포의 24:1 비).
신장 (신장의) 구획
신장 구획은 신장 근위 세뇨관 상피 세포주 (RPTECs)로 씨딩된다.
실험 1.2: 원발성 조직 칩 - 10개의 칩
- 원발성 간 조직
- 원발성 소장
- iPSC 인쇄된 혈액 뇌 장벽을 갖는 신경 등가물
- RPTECs 신장
장 구획
장 등가물의 삽입물은 시판되는 장 모델 (Epilntestinal®, MatTek)을 함유한다.
신경 구획
혈액 뇌 장벽을 갖는 신경 등가물은 신경 구상체 하에서 생체인쇄된 iPSC-유래 내피 세포가 풍부한 iPSC-유래 신경 구상체를 함유하는 세포 배양 삽입물로 이루어진다.
간 구획
간 등가물은 시판되는 간 모델 (3D InSight™ Human Liver Microtissues XL, InSphero)을 각각의 공동에 놓음으로써 달성된다. 50개의 구상체를 하나의 칩에 놓고, 각각은 3,000개의 원발성 간세포를 함유한다.
신장 (신장의) 구획
신장 구획은 신장 근위 세뇨관 상피 세포주 (RPTECs)로 씨딩된다.
실험 2: iPSC 칩 - 21개의 칩
- iPSC 간 등가물
- iPSC 장 등가물
- iPSC 혈액 뇌 장벽을 갖는 신경 등가물
- iPSC 신장 등가물
장 구획
장 등가물의 삽입물은 iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포도 함유하는 마트리겔 내에 끼워 넣은 iPSC-유래 장 세포의 장기유사체를 함유한다. iPSC-유래 장 등가물 모델에서, 원발성 미세혈관 내피 세포 또는 iPSC-유래 내피 세포는 24-웰 고정된 세포 배양 삽입물의 기저측면에 씨딩된다.
신경 구획
혈액 뇌 장벽을 갖는 신경 등가물은 세포 배양 삽입물의 기저측면에 씨딩된 iPSC-유래 내피 세포가 풍부한 iPSC-유래 신경 구상체를 함유하는 세포 배양 삽입물로 이루어진다.
간 구획
간 등가물은 iPSC-유래 섬유아세포를 갖는 iPSC-유래 간세포의 구상체를 각각의 공동에 놓음으로써 달성된다. 20개의 구상체를 하나의 칩에 놓고, 각각은 50,000개의 세포를 함유한다 (간세포:섬유아세포의 24:1 비).
신장 (신장의) 구획
신장 구획은 iPSC-유래 신장 세포로 씨딩된다.
결과
칩은 항상성이었다. 이것은 일정한 수준의 글루코오스 및 LDH로 나타났다 (도 3). 일정한 글루코오스 농도는 이용가능한 글루코오스의 일정한 소비 및 능동적 조절을 암시하였다. 글루코오스 수준은 모든 구획에서 동일한 수준에 도달하였다. 정점에서 장 등가물을 통해서만 공급하는 것은 "혈액" 회로 및 "소변" 회로 둘 다를 공급하기에 충분하였다. 또한, LDH 활성은 실험 내내 다소 일정하게 나타났다. 글루코오스와 비교하여, LDH 수준은 각 구획에서 상이하다. 장 등가물 및 신장 등가물의 장벽 기능은 3개의 모든 구획 (즉, 혈액 회로 -> 배지 저장소 1; 소변 회로 -> 배지 저장소 2; 및 장 구획)에서 상이한 농도의 LDH로 나타난다. 따라서, 장벽은 교차 물질을 구별한다. 다른 물질을 보유하면서, 글루코오스의 능동적 또는 수동적 침투는, 칩 시스템의 서브세트 사이의 실질적인 상호 작용을 나타낸다.
사구체 및 세뇨관 구획은 폴리카보네이트 막과 단단한 신장 세포층의 조합으로 달성되었다 (도 4). 전자는 큰 배지 성분을 여과하기 위한 기술적 장벽을 시행하고 이들의 확산을 지연시킨다. 후자는 물질을 재흡수하고 "혈액" 및 "소변" 회로에 걸쳐 농도 구배의 증가를 야기한다. 이 구배는 LDH 뿐만 아니라 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST, 도 5)에서도 볼 수 있다. 이들의 명백하게 상이한 농도 둘다는 ADME-N 칩의 신장 막의 기능을 나타낸다. AST는 간세포 및 근육 세포에서 발견되는 세포내 효소이므로 간 등가물에서만 유래할 수 있다.
모든 장기 등가물을 면역조직화학적으로 평가하여 동일성, 기능성 및 생존력을 결정하였다 (도 6-9). iPSC-유래 장 등가물은 iPSC-유래 섬유아세포를 포함하는 마트리겔의 층에 의해 형성되었다. 루멘을 둘러싸는 장 장기유사체를 겔 내에 포함시켰다 (도 6). iPSC-유래 장 세포는 NaK-ATPase 및 Cyp3A4를 발현하였다. 실험 1.2에서, 원발성 미세혈관 내피 세포의 폐쇄된 층은 세포 배양 삽입물의 기저측면에 다른 층을 더 형성하였다.
원발성 간 등가물은 2주의 배양 기간이 끝날 무렵 기능성 마커를 나타내었다 (도 7). 또한, iPSC-유래 간 등가물의 기능성 마커는 ADME-N 칩에서 3주의 배양 후 확인되었다 (도 8).
iPSC-유래 신경 등가물은 2주의 배양 기간이 끝날 무렵 β-튜불린 III의 기능성 마커를 발현하였다 (도 9). 하이드로겔에서 인쇄된 내피 세포는 2주의 칩 배양 후 vWF 발현을 나타낸다 (실험 1.2). 혈액 장벽의 견고성은 2주의 칩 배양 후 20-78 Ω x ㎠의 TEER 값으로 나타났다 (실험 2).
실험 3: iPSC-유래 간세포, 내피 세포 및 섬유아세포를 갖는 간 3D 등가물.
간세포 세포 분화는 스콜니카(Szkolnicka) 등 (Szkolnicka et al., 2014)의 변형으로 수행되었다. 섬유아세포 분화는 추(Zou) 등 (Zou et al., 2013)의 변형으로 수행되었다. 내피 분화는 하딩(Harding) 등 (Harding et al., 2017) 후에 수행하였다. 구상체는 초-저 부착 플레이트(ultra-low attachment plates)를 이용하여 형성되었다. 도 13은 iPSC-유래 간세포의 분화 및 3D 구상체 형성 후의 면역형광 영상을 나타낸다. 도 14는 iPSC-유래 간 등가물 (iPSC-유래 간세포)에서 선택된 간 마커 유전자의 전사 수준을 나타낸다. 전사 수준은 qPCR로 분석하였다. iPSC-유래 간 등가물을 2일 동안 배양하여 iPSC-유래 간세포, 섬유아세포 및 내피 세포를 포함하는 3D 간 구상체를 생성하였다. 자료는 하우스키퍼 TBP로 정규화된다. 도 15는 칩 상의 단일 배양에서 프로프라놀롤을 프로프라놀롤-글루코로니드 및 알파-나프톡시락트산으로 대사하기 위한 3D 간 등가물의 대사 능력을 나타낸다.
실시예 4: iPSC-유래 장 장기유사체, iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포로 이루어진 장 등가물.
장 모델은 StemUse101 iPSCs (iPSC-유래 장 장기유사체, iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포)로부터의 iPSC-유래 세포로부터 단독으로 구축되었다. iPSC-유래 섬유아세포 및 장기유사체의 2주의 공동-배양 후 고밀도의 장기유사체가 이미 관찰되었다. 정치 배양에서 3주 후, 장기유사체는 함께 융합되어 크기가 커졌다. iPSC-유래 내피 세포의 시각화는 삽입물 가장자리 아래에서 가능하였다. 3주의 정치 배양 후에도 여전히 iPSC-유래 내피 세포의 단층이 보였다. 도 16은 결과를 나타낸다.
실시예 5: iPSC-유래 장 장기유사체, 섬유아세포 및 내피 세포를 갖는 하이드로겔 장벽.
하이드로겔은 섬유아세포로 생체인쇄되고, 원발성 내피 세포 및 장 장기유사체로 씨딩되었다. 도 17은 결과를 나타낸다.
실시예 6: 칩에서 iPSC-유래 혈액 뇌 장벽.
신경구라고 하는 피질 전구 세포(cortical progenitor cell) 구상체로의 iPSCs의 분화는 DAS box® Mini Bioreactor System (Eppendorf)에서 수행되었다. 배양 프로토콜은 리가몬티(Rigamonti) 등 (Rigamonti et al, 2016)에서 수정되었다. 혈액-뇌 내피 세포 분화는 리프만(Lippmann) 등 (Lippmann et al, 2014)에서 수정되었다. 신경구를 트랜스웰로 옮기고 혈액-뇌 내피 세포를 막 아래에 씨딩하였다. 도 18은 결과를 나타낸다.
실시예 7: ADME-N 공동-배양 실험. (ADME-N = ADME 칩 + 신경 등가물)
개념 증명(proof of concept) 실험에서, StemUse101 iPSC 라인으로부터의 4개의 상이한 iPSC-유래 장기 모델의 조합을 ADME-N 칩에서 2주 동안 배양하였다. 따라서, ADME-N 칩은 4-장기-칩(4-Organ-Chip)이라고도 한다. ADME-N 칩은 인간 생리학을 모방하는 배열에서 장 고정된 24-웰 삽입물 모델, 간 등가물, 신장 장기유사체 및 신경구를 주최하도록 설계되었다. 장 장벽 모델은 24-웰 삽입물에 구축되었다. 장 장기유사체를 섬유아세포와 공동 배양하고, iPSC-유래 내피 세포의 단층을 삽입물 막 아래에 씨딩하였다. 간 모델은 iPSC-유래 섬유아세포를 갖는 iPSC-유래 간세포로부터 조립되었다. 신장 장기유사체의 단일-세포 용액을 사용하여 ADME-N 공동-배양의 개시 전 6일에 두 신장 구획에서 막을 씨딩하였다. 신경 조직을 생물반응기 시스템에서 분화시키고 구상체로서 96-웰 트랜스웰에 넣었다. 이러한 장기의 조합은 화합물 ADME 프로파일을 평가하는 연구를 위해 선택되었다 (= 생리학적-기반 약동학 (PBPK) 순응 칩/프로파일). 이 실험의 복잡한 설정은 도 19에 나타내었다 (실험 2 및 도 2의 해당 부분 참조). 도 20은 14일 동안 ADME-N 칩에서 공동-배양된 간, 장, 신장 및 신경 모델의 면역염색 특성을 나타낸다. 도 21은 iPSC-유래 장, 간, 신장 및 뇌 모델의 ADME-N 칩에서 공동-배양의 qPCR 결과를 나타낸다.
4개의 상이한 iPSC-유래 장기 모델은 ADME-N 칩에서 2주의 공동-배양 후 안정한 것으로 나타났을 뿐만 아니라, 이들의 표현형을 유지하였다. 놀랍게도, 소형화된 인간의 장, 간, 뇌 및 신장 등가물 (이들 모두는 동일한 공여자로부터의 iPSCs로부터 미리-분화됨)을 갖는 4-장기 칩은, 성장 인자가 없는 배양 배지에서 14일 배양 기간 동안 상이한 iPSC-유래 장기 모델의 추가 분화를 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 이 추가 분화는 장기 등가물 사이의 누화에 기인한다. 또한, 시간이 지남에 따라 상이한 조직에 대해 진행성 성숙이 관찰될 수 있다. 중요하게도, 상이한 iPSC-유래 장기 모델이 ADME-N (= ADME 칩 + 신경 등가물)에서 공동-배양 동안 안정한 것으로 나타났다, 즉 이들의 표현형을 유지하고, 시간이 지남에 따라 지시된 조직에 대해 정의되고 일관된 마커 유전자 발현을 나타낸다 (실험 7 및 도 21).
장 모델 (도 21a): NaKATPase - 나트륨-칼륨 아데노신 트리포스파타제 (소장에서 영양분 수송); CDX2 - Caudal Type Homeobox 2 (장 상피의 전사 조절에 중요)
간 모델 (도 21b): 중요한 상향조절된 유전자는 Alb - 알부민 (간에서만 생성됨); MPR2 - 다중약물 내성-관련 단백질 2 (Multidrug resistance-associated protein 2) (MRP2) (간세포의 소관(canalicular) 부분에서 발현되며 담즙 수송 (biliary transport) 동안 기능적임), 및 AFP - 알파-태아단백질 - 태아 간 단백질 (간세포의 성숙) 이다.
뇌 모델 (도 21d): 중요한 상향조절된 유전자는 TBR1 - T-box, brainl (뇌 발달에 중요한 전사 인자), 및 MAPR2 - 미세관(Microtubule)-관련 단백질 2 (신경발생(neurogenesis)에 필수) 이다.
본 발명은 추가 성장 인자의 첨가 없이, 생리학적 기반 약동학 (PBPK) 순응 미세생리학적 시스템 (MPS)에서 배양된 단일 공여자로부터 4개의 상이한 자가 iPSC-유래 장기 모델의 성공적인 전신 장기간 공동-배양을 확립한다.
참고문헌의 목록 (특히, 표 1에서 인용됨)
1. Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-villarin, B. & Hay, D. C. Deriving Functional Hepatocytes from Pluripotent Stem Cells. 1-12 (2014).
doi: 10.1002/9780470151808.sc01g05s30
2. Zou, L. et al. A simple method for deriving functional MSCs and applied for osteogenesis in 3D scaffolds. Sci. Rep. 3, 2243 (2013).
3. Kauffman, A. L. et al, Directed differentiation protocols for successful human intestinal organoids derived from multiple induced pluripotent stem cell lines. 2, 1-10 (2015).
4. Morizane, R. & Bonventre, J. V. Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 12, 195-207 (2016).
5. Rigamonti, A. et al. Stem Cell Reports. Stem Cell Reports 6, 993-1008 (2016).
6. Lippmann Ethan S. et al. Human Blood-Brain Barrier Endothelial Cells Derived from Pluripotent Stem Cells. Nat. Biotechnol. 30, 783-791 (2012).
7. Harding, A. et al. Highly Efficient Differentiation of Endothelial Cells from Pluripotent Stem Cells Requires the MARK and the PI3K Pathways. Stem Cells 35, 909-919 (2017).

Claims (19)

  1. (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 간세포 전구체 세포;
    (ii) iPSC-유래 장 전구체 세포;
    (iii) iPSC-유래 신세뇨관 전구체 세포; 및
    (iv) iPSC-유래 신경 전구체 세포를 포함하는 미세유체 장치로서,
    (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포는 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치.
  2. (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 간세포 장기유사체;
    (ii) iPSC-유래 장 장기유사체; 및
    (iii) iPSC-유래 신세뇨관 장기유사체를 포함하는 미세유체 장치로서,
    (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기유사체는 단일 유형의 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포, 또는 (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기유사체는, 각각, 별도의 세포 배양 구획에서 침착되는 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 미세유체 장치는 제 1 회로 및 제 2 회로를 포함하고, (i), (ii), (iii) 및 (iv)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포, 또는 (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기유사체를 함유하는 세포 배양 구획은, 각각, 제 1 회로의 일부를 형성하며, 제 2 회로는 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 포함하고, 두 회로는 여과 유닛 및 재흡수 유닛을 통해 서로 연결되는 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치.
  5. 제 4항에 있어서, 여과 유닛은 분자의 크기 및 전하에 기초하여 제 1 회로에서 제 2 회로로 분자의 통과를 선택적으로 허용하는 여과 장벽을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세유체 장치.
  6. 간세포 장기유사체, 장 장기유사체 및 신장 신세뇨관 장기유사체의 생성 방법으로서, 방법은 서로 미세유체 연결되어 있는 별도의 세포 배양 구획에서
    (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 간세포 전구체 세포;
    (ii) iPSC-유래 장 전구체 세포; 및
    (iii) iPSC-유래 신장 전구체 세포를 공동-배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제 6항에 있어서, iPSC-유래 내피 세포를 공동-배양하는 단계를 더 포함하고, iPSC-유래 내피 세포는 (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 전구체 세포/구상체(spheroids)와 동일한 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지고, iPSC-유래 내피 세포는 세포 배양 구획을 연결하는 미세유체 채널에서 침착되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, iPSC-유래 간세포 전구체 세포를 함유하는 세포 배양 구획은 iPSC-유래 간세포 전구체 세포와 동일한 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어진 iPSC-유래 섬유아세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 분석 시험, 진단, 연구, 표적 검증, 독성 연구, 조직 공학, 조직 제조, 약물 스크리닝 또는 약동학적-약력학적 분석에서 제 1항 또는 제 2항의 미세유체 장치의 용도.
  10. 제 1항 또는 제 2항의 미세유체 장치를 이용한 미세생리학적 시스템에서 분석물의 검출 방법.
  11. (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 장기유사체;
    (ii) iPSC-유래 섬유아세포; 및
    (iii) iPSC-유래 내피 세포를 포함하는, 생체공학적 결합 조직 구조체로서,
    (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기유사체 및 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 생체공학적 결합 조직 구조체.
  12. 포유류 장기-장벽을 모방하는 결합 조직 구조체의 생체공학 방법으로서,
    방법은
    (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 장기유사체;
    (ii) iPSC-유래 섬유아세포; 및
    (iii) iPSC-유래 내피 세포를
    하이드로겔 내에 생체인쇄하는 단계를 포함하고,
    (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기유사체 및 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. 조직 복구, 조직 공학 또는 조직 제조 중 어느 하나에 사용하기 위한 제 11항의 결합 조직 구조체.
  14. (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 신경구(neurospheres); 및
    (ii) iPSC-유래 내피 세포를
    포함하는 포유류 혈액-뇌-장벽을 모방하는 생체공학적 조직 구조체로서,
    (i) 및 (ii)에 따른 iPSC-유래 신경구 및 내피 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 생체공학적 조직 구조체.
  15. 포유류 혈액-뇌-장벽을 모방하는 조직 구조체의 생체공학 방법으로서,
    방법은
    (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 신경구;
    (ii) iPSC-유래 내피 세포; 및
    (ii) iPSC-유래 섬유아세포를
    하이드로겔 내에 생체인쇄하는 단계를 포함하고,
    (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 신경구, 내피 세포 및 섬유아세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
  16. 제 11항의 결합 조직 구조체; 또는 제 14항의 조직 구조체를 포함하는 미세유체 시스템.
  17. 단일 세포 배양 구획에서,
    (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 장기 전구체 세포,
    (ii) iPSC-유래 섬유아세포, 및
    (iii) iPSC-유래 내피 세포를
    공동-배양하는 단계를 포함하는 성체 장기 구조체의 생체공학 방법으로서,
    (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 장기 전구체 세포 및 iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
  18. 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 내피 전구체 세포를 전단 응력에 노출시키는 단계를 포함하는, 성체 내피 세포의 생체공학 방법으로서,
    iPSC-유래 내피 전구체 세포를 미세유체 시스템의 미세유체 채널에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  19. 단일 세포 배양 구획에서,
    (i) 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)-유래 간세포 전구체 세포;
    (ii) iPSC-유래 섬유아세포; 또는
    (iii) iPSC-유래 내피 세포를
    공동-배양하는 단계를 포함하는 성체 간 장기 구조체의 생체공학 방법으로서,
    (i), (ii) 및 (iii)에 따른 iPSC-유래 간세포 전구체 세포, iPSC-유래 섬유아세포 및 iPSC-유래 내피 세포는 단일 유형의 포유류 체세포로부터 얻은 iPSC의 단일 공여자로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
KR1020207020918A 2017-12-22 2018-12-21 iPSC-유래 세포의 장기 등가물로의 분화를 확립하는 신규한 다중 장기 칩 KR102621919B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762609664P 2017-12-22 2017-12-22
EP17210375.6 2017-12-22
US62/609,664 2017-12-22
EP17210375 2017-12-22
PCT/EP2018/086483 WO2019122291A1 (en) 2017-12-22 2018-12-21 NOVEL MULTI-ORGAN-CHIPS ESTABLISHING DIFFERENTIATION OF iPSC-DERIVED CELLS INTO ORGAN EQUIVALENTS

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200104880A KR20200104880A (ko) 2020-09-04
KR102621919B1 true KR102621919B1 (ko) 2024-01-09

Family

ID=64899361

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207020918A KR102621919B1 (ko) 2017-12-22 2018-12-21 iPSC-유래 세포의 장기 등가물로의 분화를 확립하는 신규한 다중 장기 칩

Country Status (12)

Country Link
US (1) US20200385661A1 (ko)
EP (2) EP3728561B1 (ko)
JP (1) JP7256553B2 (ko)
KR (1) KR102621919B1 (ko)
CN (1) CN111670245B (ko)
AU (1) AU2018386536A1 (ko)
CA (1) CA3086725C (ko)
DK (1) DK3728561T3 (ko)
ES (1) ES2921049T3 (ko)
IL (1) IL275527A (ko)
SG (1) SG11202005063XA (ko)
WO (1) WO2019122291A1 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2569058B (en) 2016-01-12 2021-04-14 Cedars Sinai Medical Center A method of osteogenic differentiation in microfluidic tissue culture systems
WO2018140647A1 (en) 2017-01-25 2018-08-02 Cedars-Sinai Medical Center In vitro induction of mammary-like differentiation from human pluripotent stem cells
US11767513B2 (en) 2017-03-14 2023-09-26 Cedars-Sinai Medical Center Neuromuscular junction
US11981918B2 (en) 2018-04-06 2024-05-14 Cedars-Sinai Medical Center Differentiation technique to generate dopaminergic neurons from induced pluripotent stem cells
US20240067933A1 (en) * 2019-10-22 2024-02-29 Cedars-Sinai Medical Center Mesh chopping of neural progenitor cell aggregates
JP2023540402A (ja) * 2020-09-24 2023-09-22 クリス テクノロジーズ リミテッド Ａｉチップオンチップ臨床予測エンジン
JP2023020221A (ja) * 2021-07-30 2023-02-09 ウシオ電機株式会社 薬剤評価方法
CN113388573B (zh) * 2021-08-17 2021-11-19 天九再生医学(天津)科技有限公司 一种衍生自hPSC的肝脏双表型细胞构成的肝类器官获取方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013086329A1 (en) 2011-12-08 2013-06-13 Research Triangle Institute Human emulated response with microfluidic enhanced systems
WO2014052835A1 (en) 2012-09-29 2014-04-03 Nortis, Inc. Microfluidic system for reproducing functional units of tissues and organs in vitro
WO2017136462A2 (en) 2016-02-01 2017-08-10 EMULATE, Inc. Systems and methods for growth of intestinal cells in microfluidic devices

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110217725A1 (en) * 2008-10-24 2011-09-08 Kuraray Co., Ltd. Cell culture kit, screening method, and method of manufacturing cell culture kit
US20180355298A1 (en) * 2014-12-15 2018-12-13 The Regents Of The University Of California Multi-organ cell culture system and methods of use thereof
GB2570593B (en) * 2016-09-13 2022-10-12 Harvard College Methods relating to intestinal organ-on-a-chip
CN111417716A (zh) * 2017-11-30 2020-07-14 公立大学法人横滨市立大学 由多潜能干细胞进行的立体器官的构建

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013086329A1 (en) 2011-12-08 2013-06-13 Research Triangle Institute Human emulated response with microfluidic enhanced systems
WO2014052835A1 (en) 2012-09-29 2014-04-03 Nortis, Inc. Microfluidic system for reproducing functional units of tissues and organs in vitro
WO2017136462A2 (en) 2016-02-01 2017-08-10 EMULATE, Inc. Systems and methods for growth of intestinal cells in microfluidic devices

Also Published As

Publication number Publication date
EP3728561B1 (en) 2022-05-18
JP7256553B2 (ja) 2023-04-12
ES2921049T3 (es) 2022-08-17
KR20200104880A (ko) 2020-09-04
DK3728561T3 (da) 2022-08-08
CA3086725C (en) 2024-01-09
AU2018386536A1 (en) 2020-06-18
CA3086725A1 (en) 2019-06-27
SG11202005063XA (en) 2020-06-29
EP4092108B1 (en) 2024-02-21
US20200385661A1 (en) 2020-12-10
JP2021508442A (ja) 2021-03-11
CN111670245A (zh) 2020-09-15
CN111670245B (zh) 2024-03-12
EP3728561A1 (en) 2020-10-28
EP4092108A1 (en) 2022-11-23
WO2019122291A1 (en) 2019-06-27
IL275527A (en) 2020-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102621919B1 (ko) iPSC-유래 세포의 장기 등가물로의 분화를 확립하는 신규한 다중 장기 칩
Edington et al. Interconnected microphysiological systems for quantitative biology and pharmacology studies
Pampaloni et al. Three-dimensional cell cultures in toxicology
van de Stolpe et al. Workshop meeting report Organs-on-Chips: human disease models
Park et al. 3D miniaturization of human organs for drug discovery
WO2017096282A1 (en) Devices and methods for simulating a function of a liver tissue
Beißner et al. Organ on chip
US20180355298A1 (en) Multi-organ cell culture system and methods of use thereof
Afflerbach et al. Mesenchymal stem cells as a promising cell source for integration in novel in vitro models
Kim et al. Raman spectroscopy-based 3D analysis of odontogenic differentiation of human dental pulp stem cell spheroids
Tunesi et al. Optimization of a 3D dynamic culturing system for in vitro modeling of frontotemporal neurodegeneration-relevant pathologic features
Koenig et al. A human stem cell-derived brain-liver chip for assessing blood-brain-barrier permeation of pharmaceutical drugs
Mughal et al. Organs‐on‐chips: Trends and challenges in advanced systems integration
Mehta et al. Liver-on-chips for drug discovery and development
Mitrofanova et al. Bioengineered human colon organoids with in vivo-like complexity and function
JP7396678B2 (ja) 恒常性を示す生体模倣システムを模倣するための血液及び尿回路が組み込まれた新規微小流体デバイス
US20240026261A1 (en) Engineering of organoid culture for enhanced organogenesis in a dish
Borah et al. Overcoming the barriers of two-dimensional cell culture systems with three-dimensional cell culture systems: techniques, drug discovery, and biomedical applications
Moghaddam et al. Recent advances and future prospects of functional organ-on-a-chip systems
Kumar et al. Single-cell and spatial analysis of emergent organoid platforms
Son et al. Assembly and disassembly of the micropatterned collagen sheets containing cells for location-based cellular function analysis
Martinez et al. When the Shape Does Matter: Three-Dimensional In Vitro Models of Epithelial Barriers
Tamuly Engineered Basal Lamina Equivalent-Fabrication And Biomedical Applications

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant