KR102625793B1

KR102625793B1 - 전립선 특이적 막 항원 결합 피브로넥틴 iii형 도메인

Info

Publication number: KR102625793B1
Application number: KR1020177034904A
Authority: KR
Inventors: 로사 카르도소; 마이클 디엠; 샬롬 골드버그; 라이너스 현; 스티븐 제이콥스; 도나 클레인; 카린 오닐; 트레이시 스핀카-돔스
Original assignee: 얀센 바이오테크 인코포레이티드
Priority date: 2015-05-06
Filing date: 2016-05-06
Publication date: 2024-01-15
Also published as: EP3292222A4; IL255425A0; AU2016258174B2; US20160326232A1; CN107849116A; US12054534B2; HK1253005A1; JP2022002526A; BR112017023798A2; MA42060A; AU2016258174A1; US10844111B2; US20210147510A1; AU2022202637A1; JP7366518B2; CA2985138A1; IL255425B1; JP7307133B2; EP3292222A2; KR20180002780A

Abstract

PSMA 결합 FN3 도메인, 그의 접합체, 이들 분자를 인코딩하는 단리된 뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 및 이들의 제조 방법이 치료적(therapeutic) 분자의 생성 및 질병 및 장애의 치료 및 진단에 유용하다.

Description

전립선 특이적 막 항원 결합 피브로넥틴 III형 도메인

본 발명은 전립선 특이적 막 항원(prostate specific membrane antigen)(PSMA) 결합 분자 및 이러한 분자의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

글루타메이트 카르복시펩티다제 II 또는 N-아세틸화 알파-연결 산성 다이펩티다제 1로도 알려진 전립선 특이적 막 항원(PSMA)은 이량체 2형 막관통 당단백질이다. PSMA는 엽산염 및 N-아세틸-L-아스파르틸-L-글루타메이트를 포함한 몇몇 기질을 절단하고, 다수의 조직에서 발현되는데, 이때 최고의 발현은 전립선에서 나타나고, 더 적은 정도로 소장, 중추 및 말초 신경계, 신장 및 폐에서 나타난다. PSMA는 클라트린 피막 홈(clathrin coated pit)을 통해 구성적으로 내재화된다.

PSMA는, 일부 전립선 세포가 비정상적으로 보이고 거동하기 시작한 질환인 전립선 상피내 신생종(PIN), 원발성 및 전이성 전립선암, 및 다른 고형 종양(예를 들어, 유방, 폐, 방광, 신장)의 신생혈관계에서 빈번하게 과발현되는 잘 확립된 전립선암 관련 세포막 항원이다(문헌[Chang et al., Clin Cancer Res 5: 2674-2681, 1999], 문헌[Liu et al., Cancer Res 57: 3629-3634, 1997], 문헌[Silver et al., Clin Cancer Res 3: 81-85, 1997]; 문헌[Bostwick et al., Cancer 82:2256-2261, 1998]). PSMA 발현은 질병 진행 및 글리슨 점수(Gleason score)와 상관된다. PSMA 발현은 전이성 질병, 호르몬 불응성 사례, 및 더 높은 등급의 병변에서 증가되고, 그것은 안드로겐-불감성 종양에서 추가로 상향조절된다(문헌[Su et al., Cancer Res 55: 1441-1443, 1995], 문헌[Kawakami et al., 57:2321-2324, 1997], 문헌[Wright et al., Urology 48: 326-334, 1996]).

전립선암은 남성 중에서의 암의 주요 원인이고, 암-유도 사망의 두 번째 주요 원인이다. 전세계적으로, 매해마다 대략 1,100,000건의 새로운 사례 및 300,000건의 사망이 있으며, 이는 모든 암 사망의 약 4%에 해당된다. 6명의 남성마다 1명은 이 질병으로 진단될 것으로 추정된다. 미국에서는, 전립선암의 90% 초과가 국소기 또는 국부기에서 발견된다. 이들 초기 단계에서, 5년 생존율은 100%에 가깝다. 그러나, 암이 전이되었을 때, 5년 생존율은 약 28%로 감소된다. 국소화된 전립선암은 종종 호르몬 결핍에 의해 제어될 수 있다.

전립선암에 대한 현재의 치료는 수술, 방사선 및 호르몬 요법을 포함한다. 그러나, 종양 세포는 종종 안드로겐 불감성이 되었고, 제한된 치료 선택사항이 남게 된다. 전형적으로, 방사성 약제학적 작용제인 암 백신 시풀류셀(sipuleucel)-T(예컨대, 라듐-223 클로라이드), 2차 호르몬 요법(예컨대, 아비라테론 또는 엔잘루타미드), 및/또는 화학요법(도세탁셀 및 카바지탁셀)이 순차적으로 호르몬 요법에 첨가된다.

PSMA를 표적화하는 단일클론성 항체가 진단용 조영제 및 항체-약물 접합체로서 임상에서 평가되어 왔다. PSMA를 표적화하는 가장 광범위하게 평가되는 항체-약물 접합체(ADC)는 동일한 인간화/탈면역화 항-PSMA mAb, J591을 이용한다. J591을 이용하는 적어도 3개의 상이한 ADC가 다양한 링커(linker) 및 워헤드(warhead)를 이용하여 임상 시험에서 평가되어 왔다. Millenium Pharmaceuticals는 이황화물 연결된 메이탄신에 접합된 항-PSMA mAb인 MLN2704를 평가하는 1상 임상 시험을 완료하였고; Progenics는 Seattle Genetics 기술을 이용하여, 발린-시트룰린 링커를 사용하여 J591을 MMAE에 연결하였고, ADCT는 J591에 접합된 PBD에 대한 임상 시험을 개시하고 있다. 지금까지는, 제한된 임상 효능이 심각한 독성 및 짧은 혈청 반감기와 결합되어 왔는데, 이는 상당한 간 흡수율에 기인될 가능성이 높다(문헌[Morris et al., Clin Cancer Res 13: 2707-2713, 2007]). 그럼에도 불구하고, 2개의 별개의 임상 연구에서는, 특히 더 높은 용량에서, 항-PSMA ADC에 의한 반복 치료 후에 감소된 PSA/CTC 수준에 대한 증거가 있었다(문헌[D Petrylak, Genitourinary Cancers Symposium, 2014], 문헌[Galsky et al., J Clin Oncol 26: 2147-2154, 2008, D Petrylak, ASCO 2014]). Progenics의 경우에는, 2개의 용량-제한 독성이 호중구감소증으로 인한 패열증 후에 사망을 초래하였다(문헌[D Petrylak, ASCO 2014]).

이들 치료 각각은 수개월 동안 암의 성장을 지연시키고 이 질병에 의해 야기된 증상을 고식시킬 수 있지만, 이 질병은 궁극적으로 그들에 저항성을 갖게 된다.

따라서, 전립선암 및 PSMA를 과발현하는 다른 암을 치료하기 위한 추가의 그리고 개선된 치료제에 대한 필요성이 있다.

본 발명의 일 실시 형태는 서열 번호 144의 인간 전립선 특이적 막 항원과 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인이다.

본 발명의 다른 실시 형태는 서열 번호 144의 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인이며, FN3 도메인은 서열 번호 32의 마카카 파스키쿨라리스(Macaca Fascicularis) PSMA 또는 서열 번호 33의 판 트로글로디테스(Pan troglodytes) PSMA와 교차반응한다.

본 발명의 다른 실시 형태는 서열 번호 144의 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인이며, FN3 도메인은 서열 번호 41의 아미노산 서열과 89% 동일하거나, 또는 서열 번호 41의 아미노산 서열과 비교할 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 실시 형태는 서열 번호 144의 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인이며, FN3 도메인은 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 또는 140의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 일 실시 형태는 세포독성제 또는 검출가능 표지에 접합된 서열 번호 144의 인간 전립선 특이적 막 항원(PSMA)과 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인이다.

본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 FN3 도메인을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다.

본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.

본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 FN3 도메인을 생성하는 방법으로서, 본 방법은 본 발명의 FN3 도메인이 발현되도록 하는 조건 하에서 본 발명의 단리된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 FN3 도메인을 정제하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 FN3 도메인 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 발명의 다른 실시 형태는 PSMA의 과발현을 특징으로 하는 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 본 방법은 세포독성제에 접합된 본 발명의 FN3 도메인의 치료적 유효량을 상기 암의 치료를 필요로 하는 환자에게 상기 암을 치료하기에 충분한 시간 동안 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 FN3 도메인을 포함하는 진단 키트이다. 본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 FN3 도메인을 포함하는 암 진단제 또는 포획제(capture agent)이다.

본 발명의 다른 실시 형태는 생물학적 샘플 내의 PSMA-발현 세포를 검출하는 방법으로서, 본 방법은 생물학적 샘플을 본 발명의 FN3 도메인을 포함하는 진단제로 처리하는 단계 및 본 발명의 FN3 도메인을 포함하는 그러한 진단제에 대한 생물학적 샘플의 결합을 평가하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 실시 형태는 생물학적 샘플 내의 PSMA-발현 세포를 단리하는 방법으로서, 본 방법은 생물학적 샘플을 본 발명의 FN3 도메인을 포함하는 포획제로 처리하는 단계 및 FN3 도메인을 포함하는 그러한 포획제에 결합하는 생물학적 샘플의 부분을 단리하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 실시 형태는 대상체에서 PSMA-발현 종양 세포를 검출하는 방법으로서, 본 방법은 본 발명의 FN3 도메인을 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체 내의 PSMA-발현 종양 세포에 대한 FN3 도메인의 결합을 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 실시 형태는 치료적(therapeutic) 분자를 PSMA-발현 종양 세포에 전달하는 방법으로서, 본 방법은 본 발명의 FN3 도메인을 PSMA-발현 종양을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

도 1은 수컷 NSG 마우스에서의 정맥내 주사 후의 비표적화된 ⁸⁹Zr-표지 센티린(Centyrin)의 생체내분포(biodistribution)를 나타낸다.
도 2a는 사이노몰거스 PSMA 이량체와 복합체를 형성한 P233FR9_H10 PSMA 결합 FN3 도메인(H10)의 전체 결정 구조를 나타내는데, 이는 H10이 PSMA 활성 부위 부근의 영역에 결합함을 보여준다. 아연 원자(Zn)는 PSMA 활성 부위의 위치를 나타낸다. PSMA 및 H10 분자의 N- 및 C-말단이 복합체들 중 하나에 대해 표시되어 있다. 세포막의 대략적인 위치가 표시되어 있다.
도 2b는 사이노몰거스 PSMA와 복합체를 형성한 H10 FN3 도메인의 결정 구조를 나타낸다. H10 FN3 도메인 내의 A, B, C, D, E, F 및 G 베타 가닥이 나타나 있다. PSMA 활성 부위의 양으로 하전된 입구 내로 삽입되는 H10의 CD 루프 내의 음으로 하전된 잔기(잔기 W38, D39, D40, D41 및 E43)가 나타나 있다. H10 잔기 넘버링은 서열 번호 41에 따른다.
도 2c는 사이노몰거스 PSMA와 복합체를 형성한 H10 FN3 도메인의 결정 구조를 나타낸다. H10 접촉 잔기 W38, D39, D40, D41 및 E43이 도면에 나타나 있다. 사이노 PSMA 잔기들 중 일부는 H10과 접촉하거나(R511, K514 및 K545), 아연 원자를 배위하거나(H377, D387, E424, E425, D453, 및 H553), 또는 활성 부위 공동(cavity)을 구성하는(R536 및 R534) 것으로 나타나 있다. H10 베타 가닥 C, D, F 및 G가 도면에 표시되어 있다. H10 및 사이노몰거스 PSMA 잔기 넘버링은 각각 서열 번호 41 및 141에 따른다.
도 3a는 H10 FN3 도메인과 사이노몰거스 PSMA 사이의 결정 구조 결합 부위의 상세도를 나타낸다. H10 FN3 도메인 접촉 잔기 A32, W36, W38-D41, E43, A44, V46, G64, P68, Y70, A72, W79, F81, P82, A85, 및 I86이 나타나 있다. 사이노 PSMA 접촉 잔기 Y460, K499-P502, P504, R511, K514, N540, W541, K545, F546, F488, K610, N613, 및 I614가 나타나 있다. H10 및 사이노몰거스 PSMA 잔기 넘버링은 각각 서열 번호 41 및 141에 따른다.
도 3b는 H10 FN3 도메인 접촉 잔기와 사이노몰거스 PSMA 접촉 잔기 사이의 상호작용 맵을 나타낸다. 4 Å의 거리 컷오프(cut-off)를 사용하여 접촉 잔기를 규정하였다. 센티린 잔기 및 사이노 PSMA 잔기는 각각 회색 및 백색 박스로 표시되어 있고, 반데르발스 상호작용은 파선으로 나타나 있고, H 결합은 실선이며, 화살표는 골격 H 결합을 나타내고 골격 원자를 가리킨다. 잔기 넘버링은 서열 번호 41(H10) 및 서열 번호 141(사이노 PSMA)에 따른다.
도 4a는 인간(h) PSMA 세포외 도메인과 사이노몰거스(c) PSMA 세포외 도메인 사이의 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. H10 접촉 잔기는 밑줄 그어져 있고 볼드체이다. 인간 PSMA와 사이노몰거스 PSMA 사이의 상이한 잔기들은 음영처리되어 있다. H10과 상호작용하는 모든 사이노(cyno) PSMA 잔기는 하기를 제외하고는 인간 PSMA에서 보존된다: N613. 인간 PSMA ECD; 서열 번호 143. 사이노 PSMA ECD: 서열 번호 32.
도 4b는 사이노몰거스 PSMA와 접촉된 H10 FN3 도메인 잔기를 나타낸다. 접촉 잔기는 밑줄 그어져 있고 볼드체이다. H10 아미노산 서열은 서열 번호 41에 나타나 있다.
도 5는, 사이노몰거스 PSMA에 결합된 H10의 결정 구조에서, 화학적 접합이 가능한 부위인, H10 센티린 잔기 N6, R11, T22, D25, A26, S52, E53, K62, 및 N- 및 C-말단의 위치를 나타낸다. 센티린/PSMA 접촉 영역이 흑색으로 나타나 있다. H10 베타 가닥 C, D, F 및 G가 도면에 표시되어 있다. 잔기 넘버링은 서열 번호 41(H10)에 따른다.
도 6은 항 PSMA 센티린-PE(흑색) 및 항 PSMA 항체-PE(백색)로 염색된 상이한 종양 세포주들의 평균 형광 세기(MFI)의 비교를 나타낸다.
도 7a는 DAPI, 항-사이토케라틴-FITC, 항-CD45-APC 및 항 PSMA 센티린-PE로 염색된 LNCaP 세포들의 일련의 CellTracks Analyzer II 브라우저 이미지를 나타낸다. 섬네일(thumbnail) 이미지들은 우측에서 좌측으로 PSMA-PE 염색, CD45-APC 신호, DAPI 염색된 핵, 사이토케라틴-FITC 반응성, 및 마지막으로 사이토케라틴-FITC 및 DAPI 염색의 오버레이를 나타낸다. 세포는 핵을 가져야 하고, 사이토케라틴을 발현해야 하고, CTC로서 계수되는 CD45에 대해 음성이어야 한다. CTC는 PSMA 양성 CTC로서 점수화되는 PSMA에 대해 양성 신호를 가져야 한다.
도 7b는 DAPI, 항-사이토케라틴-FITC, 항-CD45-APC 및 항 PSMA 센티린-PE로 염색된 22Rv1 세포들의 일련의 CellTracks Analyzer II 브라우저 이미지를 나타낸다. 섬네일(thumbnail) 이미지들은 우측에서 좌측으로 PSMA-PE 염색, CD45-APC 신호, DAPI 염색된 핵, 사이토케라틴-FITC 반응성, 및 마지막으로 사이토케라틴-FITC 및 DAPI 염색의 오버레이를 나타낸다. 세포는 핵을 가져야 하고, 사이토케라틴을 발현해야 하고, CTC로서 계수되는 CD45에 대해 음성이어야 한다. CTC는 PSMA 양성 CTC로서 점수화되는 PSMA에 대해 양성 신호를 가져야 한다.
도 7c는 DAPI, 항-사이토케라틴-FITC, 항-CD45-APC 및 항 PSMA 센티린-PE로 염색된 PC3 세포들의 일련의 CellTracks Analyzer II 브라우저 이미지를 나타낸다. 섬네일(thumbnail) 이미지들은 우측에서 좌측으로 PSMA-PE 염색, CD45-APC 신호, DAPI 염색된 핵, 사이토케라틴-FITC 반응성, 및 마지막으로 사이토케라틴-FITC 및 DAPI 염색의 오버레이를 나타낸다. 세포는 핵을 가져야 하고, 사이토케라틴을 발현해야 하고, CTC로서 계수되는 CD45에 대해 음성이어야 한다. CTC는 PSMA 양성 CTC로서 점수화되는 PSMA에 대해 양성 신호를 가져야 한다.
도 7d는 DAPI, 항-사이토케라틴-FITC, 항-CD45-APC 및 항 PSMA 센티린-PE로 염색된 SKBR3 세포들의 일련의 CellTracks Analyzer II 브라우저 이미지를 나타낸다. 섬네일(thumbnail) 이미지들은 우측에서 좌측으로 PSMA-PE 염색, CD45-APC 신호, DAPI 염색된 핵, 사이토케라틴-FITC 반응성, 및 마지막으로 사이토케라틴-FITC 및 DAPI 염색의 오버레이를 나타낸다. 세포는 핵을 가져야 하고, 사이토케라틴을 발현해야 하고, CTC로서 계수되는 CD45에 대해 음성이어야 한다. CTC는 PSMA 양성 CTC로서 점수화되는 PSMA에 대해 양성 신호를 가져야 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "피브로넥틴 III형(FN3) 도메인"(FN3 도메인)은 피브로넥틴, 테나신, 세포내 세포골격 단백질, 사이토카인 수용체 및 원핵생물성 효소를 포함하는 단백질에서 자주 나타나는 도메인을 지칭한다(문헌[Bork and Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89: 8990-8994, 1992]; 문헌[Meinke et al., J Bacteriol 175, 1910-1918, 1993]; 문헌[Watanabe et al., J Biol Chem 265:15659-15665, 1990]). 예시적인 FN3 도메인은 인간 테나신 C에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인, 인간 피브로넥틴(FN)에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인, 및 예를 들어 미국 특허 제8,278,419호에 기재된 바와 같은 비천연 합성 FN3 도메인이다. 개별적인 FN3 도메인은 도메인 번호 및 단백질 명칭(예를 들어, 테나신의 제3 FN3 도메인(TN3), 또는 피브로넥틴의 제10 FN3 도메인(FN10))에 의해 지칭된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "센티린"은 인간 테나신 C에 존재하는 15개의 상이한 FN3 도메인들의 공통 서열(consensus sequence)에 기초한 FN3 도메인을 지칭한다.

용어 "포획제"는, 특정 유형의 세포에 결합하고 다른 세포로부터의 그 세포의 단리를 가능하게 하는 물질을 지칭한다. 포획제의 예에는 자성 비드, 페로플루이드(ferrofluid), 캡슐화 시약 등이 포함되지만 이로 한정되지 않는다.

용어 "생물학적 샘플"은 혈액, 조직, 골수, 가래 등을 지칭한다.

용어 "진단 시약"은 생물학적 샘플을 분석하는 데 사용될 수 있는 임의의 물질을 지칭하는데, 그러한 물질이 단일 물질로서 분포되든지 진단 키트 내의 다른 물질과 병용하여 분포되든지 어느 것이든 간에 상관 없다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치환하는" 또는 "치환된" 또는 "돌연변이화하는" 또는 "돌연변이화된"은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 내에 그 서열의 변이체를 생성시키기 위해 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 변경, 결실, 또는 삽입하는 것을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "무작위화하는" 또는" 무작위화된" 또는 "다양화된(diversified)" 또는 "다양화하는"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 내에 적어도 하나의 치환, 삽입, 또는 결실을 실행하는 것을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "변이체"는 하나 이상의 변형(modification), 예를 들어 치환, 삽입, 또는 결실에 의해 기준 폴리펩티드 또는 기준 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 "특이적 결합"은 본 발명의 FN3 도메인이 일정 해리 상수(K_D)로 사전결정된 항원에 결합하는 능력을 지칭하는데, 이때 해리 상수는 약 1x10^-6 M 이하, 예를 들어 약 1x10^-7 M 이하, 약 1x10^-8 M 이하, 약 1x10^-9 M 이하, 약 1x10^-10 M 이하, 약 1x10^-11 M 이하, 약 1x10^-12 M 이하, 또는 약 1x10^-13 M 이하이다. 전형적으로, 본 발명의 FN3 도메인은, 예를 들어 Proteon 기기(BioRad)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)에 의해 측정할 때 비특이적 항원(예를 들어, BSA 또는 카세인)에 대한 그의 K_D보다 적어도 10배 더 적은 K_D로 사전결정된 항원(즉, 인간 PSMA)에 결합한다. 그러나, 인간 PSMA에 특이적으로 결합하는 본 발명의 단리된 FN3 도메인은 다른 관련 항원들과의, 예를 들어 다른 종(상동체), 예컨대 마카카 파스키쿨라리스(사이노몰거스 원숭이, 사이노) 또는 판 트로글로디테스(침팬지)로부터의 동일한 사전결정된 항원과의 교차-반응성을 가질 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "에피토프"는 본 발명의 FN3 도메인이 특이적으로 결합하는 항원의 부분을 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 다당류 측쇄와 같은 모이어티(moiety)의 화학적으로 활성(예컨대, 극성, 비극성 또는 소수성)인 표면 그룹화(grouping)로 이루어지며, 특이적인 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 입체구조 공간 단위(conformational spatial unit)를 형성하는 연속 및/또는 불연속 아미노산으로 구성될 수 있다. 불연속 에피토프의 경우, 항원의 선형 서열의 상이한 부분으로부터의 아미노산이 단백질 분자의 접힘을 통해 3차원 공간에서 아주 근접하게 된다.

용어 "라이브러리"는 변이체들의 수집을 지칭한다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 변이체들로 구성될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "안정성"은 분자가 그의 정상적인 기능적 활성들 중 적어도 하나, 예를 들어 인간 PSMA와 같은 사전결정된 항원에 결합하는 활성을 유지하도록, 생리학적 조건 하에서 접힌 상태를 유지하는 분자의 능력을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 인간 PSMA는 짧은 세포내 도메인(잔기 1-18), 막관통 도메인(잔기 19-43) 및 세포외 도메인(잔기 44-750)을 갖는 약 100 kD의 잘 알려진 II형 당단백질을 지칭한다. 성숙 인간 PSMA의 아미노산 서열은 서열 번호 144에 나타나 있다.

본 명세서에 상호교환적으로 사용되는 바와 같이, "과발현", "과발현된" 및 "과발현하는"은 동일한 조직 유형의 정상 세포와 비교하여 표면 상에 측정가능할 정도로 더 높은 수준의 PSMA를 갖는 암 또는 악성 세포를 지칭한다. 그러한 과발현은 유전자 증폭에 의해 또는 증가된 전사 또는 번역에 의해 야기될 수 있다. PSMA 과발현은 잘 알려진 검정을 사용하여, 예를 들어 살아 있거나 또는 용해된 세포에 대해 ELISA, 면역형광, 유세포측정 또는 방사면역검정을 사용하여 측정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, PSMA 핵산 분자의 수준이, 예를 들어 형광 계내 혼성화(in situ hybridization), 서던 블롯팅(Southern blotting), 또는 PCR 기법을 사용하여 세포에서 측정될 수 있다. 세포의 표면 상에서의 PSMA의 수준이 정상 세포와 비교할 때 적어도 1.5배 초과인 경우, PSMA는 과발현된다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "텐콘(Tencon)"은, 서열 번호 1에 나타내고 미국 특허 출원 공개 제2010/0216708호에 기재된 서열을 갖는 합성 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "암 세포" 또는 "종양 세포"는 생체내(in vivo)에서의, 생체외(ex vivo)에서의, 그리고 조직 배양물에서의 암성, 전-암성(pre-cancerous) 또는 형질전환된 세포를 지칭하며, 이러한 세포는 자발적 또는 유도된 표현형 변화를 갖는데, 이러한 변화는 반드시 새로운 유전 물질의 흡수를 수반하지는 않는다. 형질전환이 형질전환 바이러스에 의한 감염 및 새로운 게놈 핵산의 도입, 또는 외인성 핵산의 흡수로부터 일어날 수 있기는 하지만, 이는 또한 자발적으로 또는 발암물질에 대한 노출 후에 일어날 수 있으며, 그럼으로써 내인성 유전자를 돌연변이화할 수 있다. 형질전환/암은, 예를 들어, 시험관내(in vitro)에서, 생체내에서, 그리고 생체외에서 누드 마우스 등과 같은 적합한 동물 숙주에서 형태학적 변화, 세포의 불멸화, 비정상 성장 제어, 병소 형성, 증식, 악성종양, 종양 특이적 마커 수준, 침습성, 종양 성장 또는 억제에 의해 예시된다(문헌[Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)]).

(예를 들어, 세포, 예컨대 종양 세포와 관련하여) "성장을 억제한다"는, 치료제 또는 치료제들 또는 약물의 병용물과 접촉될 때 시험관내 또는 생체내 세포 성장에 있어서, 당업자에게 잘 알려진 적절한 제어 조건에서 성장된 동일한 세포의 성장과 대비할 때, 측정가능한 감소를 지칭한다. 시험관내 또는 생체내 세포 성장의 억제는 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 세포 성장의 억제는 다양한 기전에 의해, 예를 들어 아폽토시스(apoptosis), 괴사에 의해, 또는 세포 증식의 억제, 또는 세포 용해에 의해 일어날 수 있다.

용어 "벡터"는 생물 시스템 내에서 복제될 수 있는 또는 그러한 시스템들 사이에서 이동할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 전형적으로 벡터 폴리뉴클레오티드는 생물 시스템에서 이들 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 유지를 용이하게 하는 기능을 하는 복제 기점, 폴리아데닐화 신호 또는 선택 마커와 같은 요소들을 포함한다. 그러한 생물 시스템의 예에는 벡터를 복제할 수 있는 생물 구성요소들을 이용하는 세포 시스템, 바이러스 시스템, 동물 시스템, 식물 시스템 및 재구성된 생물 시스템이 포함될 수 있다. 벡터를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA 분자 또는 이들의 혼성체일 수 있다.

용어 "발현 벡터"는 발현 벡터 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 번역을 유도하기 위하여 생물 시스템 또는 재구성된 생물 시스템에서 이용될 수 있는 벡터를 의미한다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는 당-인산 골격 또는 다른 균등한 공유결합적 화학적 특성에 의해 공유 결합된 뉴클레오티드의 사슬을 포함하는 분자를 의미한다. 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA 및 RNA가 폴리뉴클레오티드의 전형적인 예이다.

용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 폴리펩티드를 형성하도록 펩티드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. 약 50개 미만의 아미노산의 작은 폴리펩티드는 "펩티드"로 지칭될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "결합가(valent)"는 분자 내의 항원에 특이적인 명시된 수의 결합 부위의 존재를 지칭한다. 그렇기 때문에, 용어 "1가", "2가", "4가", 및 "6가"는 분자 내의 항원에 특이적인 각각 1개, 2개, 4개, 및 6개의 결합 부위의 존재를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "와 병용하여"는 둘 이상의 치료제가 대상체에게 혼합물 상태로 함께 투여되거나, 단제(single agent)로서 동시에 투여되거나, 또는 단제로서 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있음을 의미한다.

"상승효과", "상승작용" 또는 "상승적"은 병용물의 예측된 부가적 효과보다 더 높은 것을 의미한다.

조성물

본 발명은 인간 PSMA 결합 FN3 도메인 및 독소 또는 검출가능 표지에 접합된 PSMA 결합 FN3 도메인을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 FN3 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및 이들의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

PSMA 결합 분자

본 발명은, 인간 전립선 특이적 막 항원(PSMA)에 특이적으로 결합하고, 선택적으로 독소 또는 검출가능 표지에 접합된 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인을 제공한다. 이들 분자는 치료적 및 진단적 응용에 널리 사용될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 FN3 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및 이들의 제조 및 사용 방법을 제공한다.

본 발명의 FN3 도메인은 고친화성으로 PSMA와 결합하고 PSMA 발현 세포 내로 내재화되고, 그럼으로써 치료적 약물을 종양 세포 내로 전달하는 효율적인 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시 형태는 서열 번호 144의 인간 전립선 특이적 막 항원(PSMA)과 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인이다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 FN3 도메인은 서열 번호 32의 마카카 파스키쿨라리스 PSMA 또는 서열 번호 33의 판 트로글로디테스와 교차반응한다.

본 발명의 FN3 도메인은, 당업자에 의해 실시되는 바와 같이, 표면 플라즈몬 공명 또는 키넥사 방법(Kinexa method)에 의해 결정될 때, 약 1x10^-7 M 미만, 예를 들어 약 1x10^-8 M 미만, 약 1x10^-9 M 미만, 약 1x10^-10 M 미만, 약 1x10^-11 M 미만, 약 1x10^-12 M 미만, 또는 약 1x10^-13 M 미만의 해리 상수(K_D)로 인간, 마카카 파스키쿨라리스 및/또는 판 트로글로디테스 PSMA와 결합할 수 있다. 특정 FN3 도메인-항원 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건(예를 들어, 삼투성, pH) 하에서 측정된다면 변동될 수 있다. 따라서, 친화도 및 기타 항원-결합 파라미터(예를 들어, K_D, K_on, K_off)의 측정은 단백질 스캐폴드 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충액, 예컨대 본 명세서에 기재된 완충액을 사용하여 행해진다.

일부 실시 형태에서, PSMA 결합 FN3 도메인은 분자의 N-말단에 연결된 개시자 메티오닌(Met)을 포함한다.

일부 실시 형태에서, PSMA 결합 FN3 도메인은 FN3 도메인의 C-말단에 연결된 시스테인(Cys)을 포함한다.

N-말단 Met 및/또는 C-말단 Cys의 부가는 반감기 연장 분자의 발현 및/또는 접합을 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 다른 실시 형태는 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인이며, FN3 도메인은 인간 PSMA 효소 활성을 억제한다. PSMA 효소 활성은 표준 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, PSMA의 검출가능하거나 표지화된 PSMA 기질의 가수분해가 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 PSMA 기질은 N-아세틸 아스파르틸 글루타메이트(NAAG), 폴레이트 폴리글루타메이트, 메토트렉세이트 트라이-감마 글루타메이트, 메토트렉세이트 다이-감마 글루타메이트, 프테로일펜타글루타메이트 및 이들의 유도체이다. 기질은, 예를 들어 방사성 마커, 화학발광 마커, 효소 마커, 발색성 마커, 또는 다른 검출가능 마커로 표지화될 수 있다. PSMA 활성을 검출하기에 적합한 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,981,209호 또는 미국 특허 출원 공개 제2006/0009525호에 기재되어 있다. 본 발명의 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인은, 분자가 인간 PSMA 활성을 FN3 도메인의 부재 하에 있는 샘플과 대비하여 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 그 이상 초과하여 억제할 때, 인간 PSMA 효소 활성을 억제한다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 단리된 FN3 도메인은 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 또는 140의 아미노산 서열을 포함한다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 단리된 FN3 도메인은 서열 번호 41의 아미노산 서열과 89% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 단리된 FN3 도메인은 서열 번호 41의 아미노산 서열과 비교할 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인은 서열 번호 1의 잔기 위치 6, 11, 22, 25, 26, 52, 53, 61에 상응하는 적어도 하나의 잔기 위치에서, 또는 C-말단에서 시스테인 잔기를 포함한다.

단백질 서열 내로의 시스테인의 도입을 가져오는 치환은 표준 화학을 사용하여 소분자, 예컨대 세포독성제, 검출가능 표지, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 핵산을 FN3 도메인에 화학적으로 접합하는 데 이용될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 인간 PSMA에 결합하기 위하여 서열 번호 41의 FN3 도메인과 경쟁한다.

일부 실시 형태에서, 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 인간 PSMA의 영역 KKSPSPEFSGMPRISK(서열 번호 159) 및 NWETNKF(서열 번호 160)에 결합한다.

본 발명의 FN3 도메인에 의해 결합되는 인간 PSMA 에피토프는 서열 번호 159 또는 서열 번호 160에 나타낸 아미노산 서열 내의 잔기들 중 일부 또는 모두를 포함한다. 본 명세서에 개시된 일부 실시 형태에서, 본 발명의 FN3 도메인에 의해 결합되는 에피토프는 인간 PSMA(서열 번호 144)의 영역 KKSPSPEFSGMPRISK(서열 번호 159) 및 NWETNKF(서열 번호 160) 내의 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. 본 명세서에 개시된 일부 실시 형태에서, 본 발명의 FN3 도메인에 의해 결합되는 에피토프는 인간 PSMA(서열 번호 144)의 영역 KKSPSPEFSGMPRISK(서열 번호 159) 내의 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개의 아미노산 및 영역 NWETNKF(서열 번호 160) 내의 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산을 포함한다.

본 명세서에 개시된 일부 실시 형태에서, 본 발명의 FN3 도메인은 잔기 K499, K500, S501, P502, P504, R511, K514, N540, W541, E542, N544, K545 및 F546(잔기 넘버링은 서열 번호 144에 따름)에서 인간 PSMA와 결합한다.

본 명세서에 개시된 일부 실시 형태에서, 본 발명의 FN3 도메인은 잔기 R181, Y460, F488, K610 및/또는 I614에서 인간 PSMA와 추가로 결합한다.

FN3 도메인 P233FR9_H10의 결정 구조는 사이노PSMA와 복합체를 형성한 상태에서 해석하였다. 인간 PSMA와 사이노 PSMA 사이의 접촉 잔기들은 하나의 잔기를 제외하고는 동일하기 때문에, P233FR9_H10은 동일한 에피토프 잔기들에서 사이노 PSMA와 결합하기보다는 인간 PSMA와 결합할 것으로 예상된다.

FN3 도메인은 잘 알려진 시험관내 방법을 사용하여 인간 PSMA와 결합하는 데 있어서의 참조 분자와의 그의 경쟁에 대해 평가될 수 있다. 예시적인 방법에서는, 인간 PSMA를 재조합적으로 발현하는 CHO 세포를 비표지된 참조 분자와 4℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 과량의 형광 표지된 시험 FN3 도메인과 4℃에서 45분 동안 인큐베이션할 수 있다. PBS/BSA 중에서 세척한 후에, 표준 방법을 사용하여 유세포측정에 의해 형광을 측정할 수 있다. 다른 예시적인 방법에서는, 인간 PSMA의 세포외 부분을 ELISA 플레이트의 표면 상에 코팅할 수 있다. 과량의 비표지된 참조 분자를 약 15분 동안 첨가하고, 이어서 비오티닐화 시험 FN3 도메인을 첨가할 수 있다. PBS/Tween 중에서 세척한 후에, 고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 스트렙타비딘 및 표준 방법을 사용하여 검출된 신호를 사용하여 비오티닐화 시험 FN3 도메인의 결합을 검출할 수 있다. 경쟁 검정에서, 참조 분자가 표지되고 시험 FN3 도메인이 비표지될 수 있음이 용이하게 명백하다. 시험 FN3 도메인은, 참조 분자가 시험 FN3 도메인의 결합을, 또는 시험 FN3 도메인이 참조 분자의 결합을 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%로 억제할 때 참조 분자와 경쟁한다. 시험 FN3 도메인의 에피토프는, 예를 들어 알려진 방법을 사용하여 펩티드 맵핑 또는 수소/중수소 보호 검정에 의해, 또는 결정 구조의 결정에 의해 추가로 규정될 수 있다. 예시적인 참조 FN3 도메인은 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 도메인이다.

인간 PSMA 상에서 서열 번호 41의 FN3 도메인과 동일한 영역에 결합하는 FN3 도메인은, 예를 들어 표준 방법을 사용하여 그리고 본 명세서에 기재된 바와 같이 서열 번호 159 및 160에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 마우스를 면역화함으로써 생성될 수 있다. FN3 도메인은, 예를 들어, 전술된 바와 같이 그리고 잘 알려진 시험관내 방법을 사용하여 인간 PSMA에 결합하기 위한 서열 번호 41의 FN3 도메인과 시험 FN3 도메인 사이의 경쟁을 검정함으로써 추가로 평가될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 단리된 FN3 도메인은 검출가능 표지에 접합된다.

검출가능 표지는, 본 발명의 FN3 도메인에 접합될 때, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 또는 화학적 수단을 통해 FN3 도메인이 검출가능하게 하는 조성물을 포함한다. 예시적인 표지는 방사성 동위원소, 자성 비드, 금속 비드, 콜로이드성 입자, 형광 염료, 전자-고밀도 시약, 효소(예를 들어, 일반적으로 ELISA에서 사용되는 바와 같은 효소), 비오틴, 디곡시게닌, 또는 합텐을 포함한다. 특정 방사성 표지는 가장 일반적인 구매가능한 동위원소를 포함하는데, 이에는, 예를 들어 ³H, ⁿC, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁸F, ¹⁹F, ¹²³1, ¹²⁴1, ¹²⁵I, ¹³¹1, ⁸⁶Y, ⁸⁹Zr, ^{U 1}ln, ^94mTc, ^99mTc, ⁶⁴Cu 및 ⁶⁸Ga가 포함된다. 적합한 염료는, 예를 들어 5(6)-카르복시플루오레세인, IRDye 680RD 말레이미드 또는 IRDye 800CW, 루테늄 폴리피리딜 염료 등과 같은 임의의 구매가능한 염료를 포함한다.

검출가능 표지에 접합된 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 종양 분포, 종양 세포의 존재에 대한 진단 및/또는 종양의 재발을 평가하기 위한 조영제로서 사용될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 FN3 도메인은 세포독성제에 접합된다.

일부 실시 형태에서, 세포독성제는 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 세균, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 접합체(radioconjugate))이다.

세포독성제에 접합된 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 PSMA 발현 종양 세포로의 세포독성제의 표적화된 전달, 및 그 안에서의 세포내 축적에 사용될 수 있는데, 이때 이러한 접합되지 않은 세포독성제의 전신 투여는 정상 세포에 대해 허용 불가능한 수준의 독성을 초래할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 세포독성제는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 빈데신, 세균 독소, 예컨대 디프테리아 독소, 리신, 겔다나마이신, 메이탄시노이드 또는 칼리케아미신이다. 세포독성제는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포아이소머라제 억제를 포함하는 기전에 의해 그의 세포독성 및 세포분열억제(cytostatic) 효과를 끌어낼 수 있다.

일부 실시 형태에서, 세포독성제는 효소적으로 활성인 독소, 예컨대 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합성 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아이루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오프피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센이다.

일부 실시 형태에서, 세포독성제는 방사성 핵종, 예컨대 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y, 및 ¹⁸⁶Re이다.

본 발명의 FN3 도메인 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이작용성 단백질-커플링제, 예컨대 N-석신이미딜-3-(2-피리딜다이티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이작용성 유도체(예컨대, 다이메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예컨대, 다이석신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예컨대, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트(예컨대, 톨루엔 2,6-다이아이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대, 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠)을 사용하여 제조된다.

일부 실시 형태에서, 세포독성제는 돌라스타틴 또는 돌로스타틴 펩티드 유사체 및 유도체, 오리스타틴 또는 모노메틸 오리스타틴 페닐알라닌이다. 예시적인 분자는 미국 특허 제5,635,483호 및 제5,780,588호에 개시되어 있다. 돌라스타틴 및 오리스타틴은 미소관 동태, GTP 가수분해, 및 핵 및 세포 분열을 방해하는 것으로 밝혀져 있고(문헌[Woyke et al (2001) Antimicrob Agents and Chemother. 45(12):3580-3584]), 항암 및 항진균 활성을 갖는다. 돌라스타틴 또는 오리스타틴 약물 모이어티는 펩티드 약물 모이어티의 N(아미노) 말단 또는 C(카르복실) 말단을 통해(국제 특허 출원 공개 WO 02/088172호), 또는 FN3 도메인 내로 조작된 임의의 시스테인을 통해 본 발명의 FN3 도메인 함유 분자에 부착될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 신장 클리어런스를 통해 혈액으로부터 제거된다.

텐콘 서열에 기초한 라이브러리로부터의 PSMA 결합 FN3 도메인의 단리

텐콘(서열 번호 1)은 인간 테나신-C로부터의 15개의 FN3 도메인의 공통 서열로부터 설계된, 비천연 발생 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인이다(문헌[Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012]; 미국 특허 출원 공개 제2010/0216708호). 텐콘의 결정 구조는 FN3 도메인들에 특징적인 바와 같은 7개의 베타-가닥을 연결시키는 6개의 표면-노출된 루프를 보여주며, 이때 베타-가닥은 A, B, C, D, E, F, 및 G로 지칭되고, 루프는 AB, BC, CD, DE, EF, 및 FG 루프로 지칭된다(문헌[Bork and Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89:8990-8992, 1992]; 미국 특허 제6,673,901호). 이들 루프, 또는 각각의 루프 내의 선택된 잔기들은 PSMA와 결합하는 신규한 분자들을 선택하는 데 사용될 수 있는 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인의 라이브러리를 작제하기 위하여 무작위화될 수 있다. 표 1은 텐콘(서열 번호 1) 내의 각각의 루프 및 베타-가닥의 위치 및 서열을 나타낸다.

따라서, 텐콘 서열에 기초하여 설계된 라이브러리는 무작위화된 FG 루프, 또는 무작위화된 BC 및 FG 루프를 가질 수 있으며, 예컨대 하기에 기재된 바와 같은 라이브러리 TCL1 또는 TCL2이다. 텐콘 BC 루프는 7개의 아미노산 길이이며, 이에 따라 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 아미노산이, BC 루프에서 다양화되고 텐콘 서열에 기초하여 설계된 라이브러리에서 무작위화될 수 있다. 텐콘 FG 루프는 7개의 아미노산 길이이며, 이에 따라 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 7개의 아미노산이, FG 루프에서 다양화되고 텐콘 서열에 기초하여 설계된 라이브러리에서 무작위화될 수 있다. 텐콘 라이브러리 내의 루프들에서의 추가의 다양성(diversity)이 루프들에서의 잔기들의 삽입 및/또는 결실에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, FG 및/또는 BC 루프는 1 내지 22개의 아미노산만큼 연장되거나, 또는 1 내지 3개의 아미노산만큼 감소될 수 있다. 텐콘 내의 FG 루프는 7개의 아미노산 길이인 반면에, 항체 중쇄 내의 상응하는 루프는 4 내지 28개 잔기의 범위이다. 최대 다양성을 제공하기 위하여, FG 루프는 서열에 있어서 뿐만 아니라 4 내지 28개 잔기의 항체 CDR3 길이 범위에 상응하도록 길이에 있어서도 다양화될 수 있다. 예를 들어, FG 루프는 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 추가 아미노산에 의해 루프를 연장시킴으로써 길이에 있어서 추가로 다양화될 수 있다.

텐콘 서열에 기초하여 설계된 라이브러리는 또한, FN3 도메인의 일측에 형성되고 2개 이상의 베타 가닥과 적어도 하나의 루프를 포함하는 무작위화된 대체 표면들을 가질 수 있다. 하나의 그러한 대체 표면은 C 및 F 베타-가닥과 CD 및 FG 루프 내의 아미노산들에 의해 형성된다(C-CD-F-FG 표면). 텐콘 대체 C-CD-F-FG 표면에 기초한 라이브러리 설계가 미국 특허 출원 공개 제2013/0226834호에 기재되어 있다. 텐콘 서열에 기초하여 설계된 라이브러리는 또한 텐콘 변이체들, 예컨대 잔기 위치 11, 14, 17, 37, 46, 73, 또는 86(잔기 넘버링은 서열 번호 1에 상응함)에서 치환을 갖는, 개선된 열 안정성을 나타내는 텐콘 변이체들에 기초하여 설계된 라이브러리들을 포함한다. 예시적인 텐콘 변이체가 미국 특허 출원 공개 제2011/0274623호에 기재되어 있으며, 서열 번호 1의 텐콘과 비교할 때 치환 E11R, L17A, N46V 및 E86I를 갖는 텐콘27(서열 번호 4)을 포함한다.

[표 1]

텐콘 및 다른 FN3 서열 기반 라이브러리들은, 무작위 또는 규정된 세트의 아미노산들을 사용하여, 선택된 잔기 위치들에서 무작위화될 수 있다. 예를 들어, 20개의 천연 발생 아미노산 모두를 인코딩하는 NNK 코돈을 사용하여 무작위 치환을 갖는 라이브러리 내의 변이체를 생성할 수 있다. 다른 다양화 계획(scheme)에서는, DVK 코돈을 사용하여 아미노산 Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, 및 Cys를 인코딩할 수 있다. 대안적으로, NNS 코돈을 사용하여 20개의 아미노산 잔기 모두를 발생시킴과 동시에 정지 코돈의 빈도를 감소시킬 수 있다. 예를 들어, Slonomics® 기술(http:_//www_sloning_com)을 사용하여, 다양화하고자 하는 위치에 편향된 아미노산 분포를 가진 FN3 도메인의 라이브러리를 합성할 수 있다. 이 기술은, 수천 개의 유전자 합성 과정에 충분한 보편적 구성 요소(building block)로서 작용하는 사전제조된 이중 가닥 트리플렛(pre-made double stranded triplet)들의 라이브러리를 사용한다. 트리플렛 라이브러리는 임의의 원하는 DNA 분자를 구성하는 데 필요한 모든 가능한 서열 조합을 나타낸다. 코돈 표기는 잘 알려진 IUB 코드에 따른다.

인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 FN3 도메인은, cis 디스플레이를 사용하여 스캐폴드 단백질들을 인코딩하는 DNA 단편들을 RepA를 인코딩하는 DNA 단편에 연결하여, 시험관내 번역 후에 형성되는 단백질-DNA 복합체들의 풀(pool) - 여기서, 각각의 단백질은 그것을 인코딩하는 DNA와 안정하게 회합됨 - 을 생성함으로써 텐콘 라이브러리와 같은 FN3 라이브러리를 생성하고(미국 특허 제7,842,476호; 문헌[Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101, 2806-2810, 2004]), 당업계에 알려져 있고 실시예에 기재된 임의의 방법에 의해 PSMA에 대한 특이적 결합에 대해 라이브러리를 검정함으로써 단리될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 잘 알려진 방법은 ELISA, 샌드위치 면역검정, 및 경쟁적 및 비경쟁적 검정이다(예를 들어, 문헌[Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York] 참조). PSMA와 특이적으로 결합하는 확인된 FN3 도메인들은 PSMA 활성에 대한 그들의 억제, 내재화, 안정성, 및 다른 원하는 특성에 대해 추가로 특성화된다.

인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 FN3 도메인은, 템플릿으로서 임의의 FN3 도메인을 사용하여 라이브러리를 생성하고, 내부에 제공된 방법을 사용하여 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 분자들을 위해 라이브러리를 스크리닝함으로써 생성될 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 FN3 도메인은 테나신 C의 제3 FN3 도메인(TN3)(서열 번호 145), 피브콘(Fibcon)(서열 번호 146), 및 피브로넥틴의 제10 FN3 도메인(FN10)(서열 번호 147)이다. 표준 클로닝 및 발현 기법을 사용하여 라이브러리를 벡터 내로 클로닝하거나 또는 라이브러리의 이중 가닥 cDNA 카세트를 합성하거나, 라이브러리를 시험관내에서 번역하거나, 또는 발현시킨다. 예를 들어, 리보솜 디스플레이(문헌[Hanes and Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 4937-4942, 1997]), mRNA 디스플레이(문헌[Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297-12302, 1997]), 또는 다른 무세포(cell-free) 시스템(미국 특허 제5,643,768)이 사용될 수 있다. FN3 도메인 변이체의 라이브러리는, 예를 들어 임의의 적합한 박테리오파지의 표면 상에 디스플레이되는 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 박테리오파지의 표면 상에 융합 폴리펩티드를 디스플레이하는 방법은 잘 알려져 있다(미국 특허 출원 공개 제2011/0118144호; 국제 특허 출원 공개 WO2009/085462호; 미국 특허 제6,969,108호; 미국 특허 제6,172,197호; 미국 특허 제5,223,409호; 미국 특허 제6,582,915호; 미국 특허 제6,472,147호).

본 명세서에 기재된 본 발명의 일부 실시 형태에서, 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 서열 번호 1의 텐콘 서열 또는 서열 번호 4의 텐콘27 서열에 기초하며, 서열 번호 1 또는 서열 번호 4는 잔기 위치 11, 14, 17, 37, 46, 73, 및/또는 86에서 치환을 선택적으로 갖는다.

인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 FN3 도메인은 그의 특성을 개선하도록, 예컨대 열 안정성 및 열 접힘과 풀림의 가역성을 개선하도록 변형될 수 있다. 단백질 및 효소의 겉보기 열 안정성을 증가시키기 위하여 몇몇 방법이 적용되어 왔으며, 이는 고도로 유사한 열 안정성 서열들에 대한 비교를 기반으로 하는 합리적인 설계, 이황화물 가교를 안정화하는 설계, 알파-나선 성향을 증가시키는 돌연변이, 염 가교의 조작(engineering), 단백질의 표면 전하의 변경, 지향 진화(directed evolution), 및 공통 서열들의 조성을 포함한다(문헌[Lehmann and Wyss, Curr Opin Biotechnol, 12, 371-375, 2001]). 높은 열 안정성은 발현 단백질의 수율을 증가시키고, 용해도 또는 활성을 개선하고, 면역원성을 감소시키고, 제조 중에 콜드 체인(cold chain)의 필요성을 최소화할 수 있다. 텐콘(서열 번호 1)의 열 안정성을 개선하기 위해 치환될 수 있는 잔기는 잔기 위치 11, 14, 17, 37, 46, 73, 또는 86이며, 미국 특허 출원 공개 제2011/0274623호에 기재되어 있다. 이들 잔기에 상응하는 치환이 본 발명의 FN3 도메인 함유 분자에 도입될 수 있다.

단백질 안정성 및 단백질 불안정성의 측정은 단백질 완전성(integrity)의 동일하거나 상이한 양상이라고 볼 수 있다. 단백질은 열에 의해, 자외 또는 이온화 방사선, 액체 용액 중에 있는 경우에는 주위 삼투성 및 pH의 변화, 작은 기공-크기 여과에 의해 부과되는 기계적 전단력, 자외 방사선, 이온화 방사선, 예컨대 감마 조사에 의한 이온화 방사선, 화학적 탈수 또는 열 탈수, 또는 단백질 구조 붕괴를 야기할 수 있는 임의의 다른 작용 또는 힘에 의해 야기되는 변성에 민감하거나 또는 "불안정"하다. 분자의 안정성은 표준 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 표준 방법을 사용하여 열 용융("T_m") 온도 - 분자의 절반이 풀리게 되는 섭씨 도(℃) 단위의 온도 - 를 측정함으로써 분자의 안정성을 결정할 수 있다. 전형적으로, T_m이 높을수록 분자가 더 안정하다. 열에 부가하여, 화학적 환경 또한 단백질이 특정 3 차원 구조를 유지하는 능력을 변화시킨다.

일 실시 형태에서, 인간 PSMA에 특이적으로 결합하는 본 발명의 FN3 도메인은, T_m의 증가에 의해 측정할 때, 조작 전의 동일한 도메인과 대비하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 그 이상으로 증가된 안정성을 나타낼 수 있다.

화학적 변성을 다양한 방법에 의해 마찬가지로 측정할 수 있다. 화학적 변성제는 구아니디늄 하이드로클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 우레아, 아세톤, 유기 용매(DMF, 벤젠, 아세토니트릴), 염(황산암모늄, 브롬화리튬, 염화리튬, 브롬화나트륨, 염화칼슘, 염화나트륨); 환원제(예를 들어, 다이티오트레이톨, 베타-메르캅토에탄올, 다이니트로티오벤젠, 및 수소화물, 예컨대 붕수소화나트륨), 비이온성 및 이온성 표면활성제(detergent), 산(예를 들어, 염산(HCl), 아세트산(CH₃COOH), 할로겐화 아세트산), 소수성 분자(예를 들어, 인지질), 및 표적화 변성제를 포함한다. 변성 정도의 정량화는 기능적 특성, 예컨대 표적 분자에 결합하는 능력의 손실에 의존할 수 있거나, 또는 물리화학적 특성, 예컨대 응집에 대한 경향, 이전에는 용매에 접근 불가능했던 잔기의 노출, 또는 이황화물 결합의 붕괴 또는 형성에 의해 행할 수 있다.

예를 들어 결합가(valency)를 증가시킴으로써 표적 분자 결합의 결합력(avidity)을 증가시키기 위한 수단으로서, 또는 2개 이상의 상이한 표적 분자에 동시에 결합하는 이중특이성 또는 다중특이성 스캐폴드를 생성하기 위하여, 본 발명의 FN3 도메인을 단량체, 이량체, 또는 다량체로서 생성할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 링커, 예를 들어 폴리-글리신, 글리신 및 세린, 또는 알라닌 및 프롤린을 함유하는 링커의 포함에 의해 단일특이성, 이중특이성, 또는 다중특이성 단백질 스캐폴드를 연결함으로써 이량체 및 다량체를 생성할 수 있다. 예시적인 링커는 (GS)₂(서열 번호 148), (GGGS)₂(서열 번호 149), (GGGGS)₅(서열 번호 150), (AP)₂(서열 번호 151), (AP)₅(서열 번호 152), (AP)₁₀(서열 번호 153), (AP)₂₀(서열 번호 154) 및 A(EAAAK)₅AAA(서열 번호 142)를 포함한다. 이량체들 및 다량체들은 N으로부터 C로의 방향으로 서로 연결될 수 있다. 폴리펩티드를 신규의 연결된 융합 폴리펩티드 내로 연결하기 위하여 천연 발생 펩티드 링커뿐만 아니라 인공 펩티드 링커를 사용하는 것에 대해서도 문헌에 잘 알려져 있다(문헌[Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989]; 문헌[Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995]; 문헌[Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996]; 미국 특허 제5,856,456호).

반감기 연장 모이어티(half-life extending moiety)

인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 FN3 도메인은, 예를 들어 공유적 상호작용을 통해 다른 서브유닛을 도입시킬 수 있다. 본 발명의 일 태양에서, 본 발명의 FN3 도메인은 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함한다. 예시적인 반감기 연장 모이어티는 알부민, 알부민 변이체, 알부민-결합 단백질 및/또는 도메인, 트랜스페린 및 그의 단편 및 유사체, 및 Fc 영역이다. 예시적인 알부민 변이체가 서열 번호 155에 나타나 있다. 인간 Fc 영역의 아미노산 서열은 잘 알려져 있으며, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA 및 IgE Fc 영역을 포함한다.

항체 불변 영역의 전부 또는 일부를 본 발명의 FN3 도메인에 부착하여 항체-유사 특성, 특히 Fc 영역과 관련된 특성, 예컨대 Fc 효과기 기능, 예컨대 C1q 결합, 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity)(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)(ADCC), 식작용, 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절을 부여할 수 있으며, 이들 활성을 담당하는 Fc 내의 잔기를 변형시킴으로써 추가로 변형시킬 수 있다(검토를 위해서는 문헌[Strohl, Curr Opin Biotechnol. 20, 685-691, 2009] 참조).

원하는 특성을 위해 추가 모이어티, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자, 예컨대 PEG5000 또는 PEG20,000, 상이한 쇄 길이의 지방산 및 지방산 에스테르, 예를 들어 라우레이트, 미리스테이트, 스테아레이트, 아라키데이트, 베헤네이트, 올레에이트, 아라키도네이트, 옥탄이산, 테트라데칸이산, 옥타데칸이산, 도코산이산 등, 폴리라이신, 옥탄, 탄수화물(덱스트란, 셀룰로스, 올리고당 또는 다당)을 본 발명의 FN3 도메인 내로 도입시킬 수 있다. 이들 모이어티는 단백질 스캐폴드 코딩 서열과의 직접 융합일 수 있으며, 표준 클로닝 및 발현 기법에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 잘 알려진 화학적 커플링 방법을 사용하여 본 발명의 재조합적으로 생성된 분자에 이러한 모이어티를 부착할 수 있다.

예를 들어, 시스테인 잔기를 분자의 C-말단에 도입시키거나, 시스테인을 분자의 인간 PSMA 결합 면으로부터 멀어지도록 향하는 잔기 위치 내로 조작하고, 잘 알려진 방법을 사용하여 페길 기를 시스테인에 부착함으로써, 페길 모이어티를 본 발명의 FN3 도메인에 부가할 수 있다. 추가 모이어티를 도입시킨 본 발명의 FN3 도메인은 몇몇 잘 알려진 검정에 의해 기능성에 대해 비교될 수 있다. 예를 들어, Fc 도메인 및/또는 Fc 도메인 변이체의 도입으로 인해 변경된 특성은, Fc 수용체 결합 검정에서, 가용성 형태의 수용체, 예컨대 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 또는 FcRn 수용체를 사용하여, 또는, 예를 들어 ADCC 또는 CDC를 측정하거나 또는 생체내 모델에서 본 발명의 분자의 약동학적 특성을 평가하는 잘 알려진 세포-기반 검정을 사용하여 검정될 수 있다.

폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포

본 발명은, 시험관내 전사/번역에 사용되는 선형 DNA 서열, 그의 조합 또는 지정 돌연변이원(directed mutagen)의 원핵생물, 진핵생물, 또는 사상 파아지 발현, 분비, 및/또는 디스플레이와 상용성인 벡터를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 또는 발현 벡터의 일부로서, 또는 선형 DNA 서열의 일부로서, 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 FN3 도메인을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 소정의 예시적인 폴리뉴클레오티드가 본 명세서에 개시되지만, 주어진 발현 시스템에서의 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy) 또는 코돈 선호도를 고려하여, 본 발명의 FN3 도메인을 인코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드도 또한 본 발명의 범주 내에 있다.

본 발명의 일 실시 형태는 서열 번호 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 또는 140의 아미노산 서열을 포함하는 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 FN3 도메인을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명의 일 실시 형태는 서열 번호 156, 157, 158 또는 159의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 자동화 폴리뉴클레오티드 합성기 상에서 고상(solid phase) 폴리뉴클레오티드 합성과 같은 화학적 합성에 의해 제조되고 완전한 단일 또는 이중 가닥 분자로 조립될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 PCR 후의 일상적인 클로닝과 같은 다른 기법에 의해 생성될 수 있다. 주어진 알려진 서열의 폴리뉴클레오티드를 생성하거나 얻는 기법은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 비코딩 서열, 예컨대 프로모터 또는 인핸서 서열, 인트론, 폴리아데닐화 신호, RepA 결합을 촉진시키는 cis 서열 등을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열은 또한, 예를 들어, 마커 또는 태그 서열, 예컨대 단백질의 정제 또는 검출을 용이하게 하기 위한 히스티딘 태그 또는 HA 태그, 신호 서열, 융합 단백질 파트너, 예컨대 RepA, Fc 또는 박테리오파지 외피 단백질, 예컨대 pIX 또는 pIII을 인코딩하는 추가 아미노산을 인코딩하는 추가 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시형태는 본 발명의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 그러한 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 배큘로바이러스(baculovirus) 발현용 벡터, 트랜스포손(transposon) 기반 벡터, 또는 임의의 수단에 의해 주어진 유기체 또는 유전적 백그라운드(genetic background) 내로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 도입시키기에 적합한 임의의 다른 벡터일 수 있다. 그러한 벡터는 그러한 벡터에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 발현을 제어하거나, 조절하거나, 야기하거나, 허용할 수 있는 핵산 서열 요소를 포함하는 발현 벡터일 수 있다. 그러한 요소는 전사 인핸서 결합 부위, RNA 폴리머라제 개시 부위, 리보솜 결합 부위, 및 주어진 발현 시스템에서 인코딩된 폴리펩티드의 발현을 용이하게 하는 기타 부위를 포함할 수 있다. 그러한 발현 시스템은 당업계에 잘 알려진 세포 기반 시스템 또는 무세포 시스템일 수 있다.

본 발명의 다른 실시 형태는 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포이다. 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 FN3 도메인은, 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이, 세포주, 혼합 세포주, 불멸화 세포, 또는 불멸화 세포의 클론 집단(clonal population)에 의해 선택적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001)]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; 문헌[Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)]을 참조한다.

발현용으로 선택된 숙주 세포는 포유류 기원의 것일 수 있거나, 또는 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, He G2, SP2/0, HeLa, 골수종, 림프종, 효모, 곤충 또는 식물 세포, 또는 이들의 임의의 유도체, 불멸화 또는 형질전환 세포로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는, 폴리펩티드를 글리코실화할 수 없는 종 또는 유기체, 예를 들어 원핵 세포 또는 유기체, 예컨대 BL21, BL21(DE3), BL21-GOLD(DE3), XL1-Blue, JM109, HMS174, HMS174(DE3), 및 천연 또는 조작된 E. 콜라이 종(E. coli spp.), 클렙시엘라 종(Klebsiella spp.), 또는 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.) 균주 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 실시 형태는 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 단리된 FN3 도메인을 생성하는 방법으로서, 본 방법은 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 단리된 FN3 도메인이 발현되도록 하는 조건 하에서 본 발명의 단리된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 FN3 도메인을 정제하는 단계를 포함한다.

인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 FN3 도메인은 잘 알려진 방법에 의해, 예를 들어 단백질 A 정제, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피, 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 재조합 세포 배양물로부터 정제될 수 있다.

본 발명의 인간 PSMA 결합 FN3 도메인의 용도

인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 FN3 도메인은 인간 질병 또는 세포, 조직, 기관, 체액, 또는 일반적으로 숙주에서의 특정 병상의 증상을 진단하거나, 모니터링하거나, 조절하거나, 치료하거나, 경감시키거나, 그의 발생의 방지를 돕거나, 또는 감소시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 임의의 분류에 속하는 동물 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 동물의 예에는 포유동물, 예를 들어 인간, 설치류, 개, 고양이 및 가축이 포함된다.

본 발명의 일 실시 형태는 PSMA의 과발현을 특징으로 하는 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 본 방법은 세포독성제에 접합된 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 FN3 도메인을 대상체를 치료하기에 충분한 시간 동안 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 암은 전립선암, 결직장암, 위암, 투명 세포 신장 암종(clear cell renal carcinoma), 방광암, 폐암 또는 신장암이다.

일부 실시 형태에서, 암은 고형 종양이다.

일부 실시 형태에서, 암은 전립선 장애, 예컨대 전립선암 또는 양성 전립선 과형성(BPH)이다.

일부 실시 형태에서, 암은 전립선암이다.

일부 실시 형태에서, 암은 결직장암이다.

일부 실시 형태에서, 암은 위암이다.

일부 실시 형태에서, 암은 투명 세포 신장 암종이다.

일부 실시 형태에서, 암은 방광암이다.

일부 실시 형태에서, 암은 신장암이다.

일부 실시 형태에서, 암은 신생혈관성 장애, 예컨대 고형 종양 성장을 특징으로 하는 암이다. PSMA 과발현을 특징으로 하고 본 발명에 따른 치료에 적합한 종양 혈관계를 갖는 예시적인 암은, 예를 들어 투명 세포 신장 암종(CCRCC), 결직장암, 유방암, 방광암, 폐암, 및 췌장암을 포함한다(예를 들어, 문헌[Baccala et al., Urology 70:385.390, 2007](CCRCC에서의 PSMA의 발현); 문헌[Liu et al., Cancer Res. 57:3629-3634, 1997](신장암, 요로암, 폐암, 결장암, 유방암, 및 간에 대한 선암종을 포함한 다양한 비전립선암에서의 PSMA의 발현); 및 문헌[Milowsky et al., J. Clin. Oncol. 25:540-547, 2007] 참조).

본 발명의 일 실시 형태는 PSMA의 과발현을 특징으로 하는 전립선암을 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 본 방법은 세포독성제에 접합된 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 FN3 도메인을 대상체를 치료하기에 충분한 시간 동안 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 FN3 도메인의 투여를 위한 대상체는 PSMA 과발현을 특징으로 하는 특정 장애의 발생에 대해 고위험에 있는 환자뿐만 아니라 기존에 그러한 장애를 갖는 환자를 포함한다. 전형적으로, 대상체는 치료가 모색되고 있는 장애를 갖는 것으로 진단받아 왔다. 또한, 대상체는 장애의 임의의 변화에 대하여(예를 들어, 장애의 임상 증상의 증가 또는 감소에 대하여) 치료 과정 동안 모니터링될 수 있다.

예방적 응용에서는, 약제학적 조성물 또는 의약품이 특정 장애에 취약하거나 달리 위험에 있는 환자에게 장애의 위험을 제거하거나 감소시키기에 또는 그의 개시를 지연시키기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 응용에서는, 조성물 또는 의약품이 그러한 장애가 의심되거나 그러한 장애를 이미 앓고 있는 환자에게 장애 및 그의 합병증의 증상을 치유하거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이것을 달성하기에 적절한 양은 치료적 유효 용량 또는 치료적 유효량으로 지칭된다. 예방적 및 치료적 계획(regime) 둘 모두에서는, 작용제가 충분한 반응(예를 들어, 부적절한 혈관생성 활성의 억제)이 달성될 때까지 수회 투여량으로 통상 투여된다. 전형적으로, 반응은 모니터링되고, 원하는 반응이 감쇠(fade)되기 시작한다면 반복된 투여량이 제공된다.

본 발명의 방법에 따른 치료의 대상 환자를 확인하기 위하여, 허용된 스크리닝 방법이 특정 장애와 관련된 위험 인자를 결정하는 데 또는 대상체에서 확인된 기존 장애의 상태를 결정하는 데 사용될 수 있다. 그러한 방법은, 예를 들어, 개체가 특정 장애를 갖는 것으로 진단받아 온 친족들을 갖는지의 여부를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 스크리닝 방법은 또한, 예를 들어, 유전성 구성요소(heritable component)를 갖는 것으로 알려진 특정 장애에 대하여 가족성 상태(familial status)를 결정하기 위하여 종래의 워크업(work-up)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 다양한 암이 또한 소정의 유전성 구성요소를 갖는 것으로 알려져 있다. 암의 유전성 구성요소는, 예를 들어 형질전환을 나타내는 다수의 유전자(예를 들어, Ras, Raf, EGFR, cMet, 및 기타)에서의 돌연변이, 소정의 HLA 및 살해 억제 수용체(killer inhibitory receptor)(KIR) 분자의 존재 또는 부재, 또는 암 세포가 직접적으로 또는 간접적으로 NK 세포 및 T 세포와 같은 세포의 면역 억제를 조절할 수 있는 기전을 포함한다(예를 들어, 문헌[Ljunggren and Malmberg, Nature Rev. Immunol. 7:329-339, 2007]; 문헌[Boyton and Altmann, Clin. Exp. Immunol. 149:1-8, 2007] 참조). 이 목적을 위하여, 뉴클레오티드 프로브가 관심 있는 특정 장애와 관련된 유전자적 마커를 갖는 개체를 확인하는 데 일상적으로 사용될 수 있다. 게다가, 특정 장애에 대한 마커를 확인하는 데 유용한 매우 다양한 면역학적 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 단일클론 항체 프로브를 사용하여 특정 종양과 관련된 항원을 검출하는 다양한 ELISA 면역검정 방법이 이용가능하고 당업계에 잘 알려져 있다. 스크리닝은 알려진 환자 증상, 연령 인자, 관련 위험 인자 등에 의해 나타나는 바와 같이 구현될 수 있다. 이들 방법은 임상의가 치료를 위하여 본 명세서에 기재된 방법을 필요로 하는 환자를 일상적으로 선택할 수 있게 한다. 이들 방법에 따르면, 병리학적 PSMA-발현 세포의 표적화가 독립적인 치료 프로그램으로서 또는 다른 치료에 대한 추적(follow-up), 보조적, 또는 협동적 치료 계획으로서 구현될 수 있다.

본 명세서에 기재된 일부 방법에서, 세포독성제에 접합된 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 FN3 도메인은 제2 치료제와 병용하여 전립선암을 갖는 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 일부 방법에서, 세포독성제에 접합된 인간 PSMA와 특이적으로 결합하는 본 발명의 FN3 도메인은 제2 치료제에 의한 치료에 대해 저항성을 나타내거나 저항성을 획득한 대상체를 치료하는 데 사용될 수 있다.

제2 치료제는 전립선암의 치료에 대한 승인된 약물, 예컨대 아비라테론 아세테이트(Abiraterone Acetate)(자이티가(Zytiga)), 바이칼루타미드(Bicalutamide), 카바지탁셀(Cabazitaxel), 카소덱스(Casodex)(바이칼루타미드), 데가렐릭스(Degarelix), 도세탁셀(Docetaxel), 엔잘루타미드(Enzalutamide), 고세렐린 아세테이트(Goserelin Acetate), 제브타나(Jevtana)(Cabazitaxel), 류프롤라이드 아세테이트(Leuprolide Acetate), 루프론(Lupron)(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포(Lupron Depot)(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포-3개월(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포-4개월(류프롤라이드 아세테이트), 루프론 데포-페드(Ped)(류프롤라이드 아세테이트), 미톡산트론 하이드로클로라이드(Mitoxantrone Hydrochloride), 프레드니손(Prednisone), 프로벤지(Provenge)(시풀류셀(Sipuleucel)-T), 라듐 223 다이클로라이드, 시풀류셀-T, 탁소테레(Taxotere)(도세탁셀), 비아두르(Viadur)(류프롤라이드 아세테이트), 조피고(Xofigo)(라듐 223 다이클로라이드), 엑스탄디(Xtandi)(엔잘루타미드(Enzalutamide)) 또는 졸라덱스(Zoladex)(고세렐린 아세테이트)일 수 있다(출처: 미국 국립 암 연구소(National Cancer Institute)).

대상체는 치료에 대해 저항성을 나타내거나, 저항성이 발생되었거나, 또는 저항성 발생에 취약한지를 결정하기 위해 다양한 정성적 및/또는 정량적 방법이 사용될 수 있다. 저항성과 관련될 수 있는 증상은, 예를 들어 환자의 웰빙(well-being)의 감소 또는 정체, 종양 크기의 증가, 종양 성장의 정지성 또는 지연성 감소, 및/또는 체내에서 한 위치로부터 다른 기관, 조직 또는 세포로의 암성 세포의 확산을 포함한다. 암과 관련된 다양한 증상의 재확립 또는 악화는 또한, 대상체가 치료에 대해 저항성이 발생되었거나 또는 저항성 발생에 취약하다는 것을 나타낼 수 있으며, 예컨대 식욕부진, 인지 기능이상, 우울증, 호흡곤란, 피로, 호르몬 교란, 호중구감소증, 통증, 말초 신경병증, 및 성기능이상이다. 암과 관련된 증상은 암의 유형에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 전립선암과 관련된 증상은 소변이 시원찮거나 잦은 소변 욕구, 통증성 배뇨, 소변 또는 정액 중 혈액, 골반, 허리 및/또는 엉덩이에서의 계속되는 통증을 포함할 수 있다. 폐암과 관련된 증상은 지속적인 기침, 객혈, 숨참, 천명, 흉통, 식욕 상실, 시도 없이도 체중 감량, 및 피로를 포함할 수 있다. 종양학에서 숙련된 자는 특정 암 유형과 관련된 증상을 용이하게 확인할 수 있다.

용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 치료 및 예방학적 또는 예방적 조치 둘 모두를 지칭하며, 여기서 목적은 원치 않는 생리적 변화 또는 장애, 예컨대 암의 발생 또는 확산을 예방 또는 둔화(감퇴)시키는 것이다. 본 발명의 목적을 위하여, 유익하거나 원하는 임상 결과는, 검출가능하든 검출 불가능하든 어느 것이든 간에, 증상의 경감, 질병 정도의 저하, 안정화된(즉, 악화되지 않는) 질병 상태, 질병 진행의 지연 또는 감속, 질병 상태의 개선 또는 고식, 및 관해(부분 또는 전체 어느 것이든)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우에 예측되는 생존과 비교할 때 연장되는 생존을 의미할 수 있다. 치료가 필요한 자들은 이미 질환 또는 장애를 가진 자들뿐만 아니라 질환 또는 장애를 갖기 쉬운 자들 또는 질환 또는 장애가 예방되어야 하는 자들을 포함한다.

"치료적 유효량"은 필요한 투여량에서 그리고 필요한 시간 동안 원하는 치료 결과를 달성하는 데 유효한 양을 지칭한다. 본 발명의 PSMA 결합 FN3 도메인의 치료적 유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 및 체중, 그리고 본 발명의 PSMA 결합 FN3 도메인이 개체에서 원하는 반응을 유도하는 능력과 같은 인자들에 따라 변동될 수 있다. 저항성과 관련하여 감소 또는 약화시킬 수 있는 유효한 PSMA 결합 FN3 도메인의 예시적인 지표는, 예를 들어 환자의 개선된 웰빙, 종양 크기의 감소 또는 축소, 종양의 정지성 또는 지연성 성장, 및/또는 체내의 다른 위치로의 암 세포의 전이의 부재를 포함한다.

투여/약제학적 조성물

본 발명은 인간 PSMA와 특이적으로 결합하고, 선택적으로 제2 분자에 접합된 본 발명의 FN3 도메인 및 약제학적으로 허용되는 담체의 약제학적 조성물을 제공한다. 치료적 용도를 위하여, 본 발명의 FN3 도메인은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 도메인 또는 분자의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물로서 제조될 수 있다. 용어 "담체"는 활성 화합물과 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트(adjuvant), 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 비히클은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 것들, 예컨대 낙화생유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하는, 물 및 오일과 같은 액체일 수 있다. 예를 들어, 0.4% 염수 및 0.3% 글리신이 사용될 수 있다. 이들 용액은 무균성이고 일반적으로 미립자 물질이 없다. 이들은 종래의 잘 알려진 멸균 기법(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 pH 조정제 및 완충제, 안정제, 증점제, 윤활제 및 착색제 등과 같은 생리학적 조건에 근접시키기 위하여 필요한, 약제학적으로 허용되는 보조 물질을 함유할 수 있다. 그러한 약제학적 제형에서 본 발명의 분자의 농도는 광범위하게, 즉 약 0.5 중량% 미만, 통상 적어도 약 1 중량%부터 많게는 15 또는 20 중량%까지 변동될 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식에 따라, 필요 용량, 유체 부피, 점도 등에 기초하여 주로 선택될 것이다. 다른 인간 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민을 포함하는 적합한 비히클 및 제형이, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, 특히 pp. 958-989 참조]에 기재되어 있다.

본 발명의 FN3 도메인의 치료적 용도를 위한 투여 방식은 이러한 작용제를 숙주에게 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있으며, 예컨대 비경구 투여, 예를 들어 진피내, 근육내, 복막내, 정맥내 또는 피하, 폐; 경점막(구강, 비강내, 질내, 직장) 투여로서, 이러한 투여에서는 정제, 캡슐, 용액, 분말, 겔, 입자 형태의 제형, 주사기, 이식 디바이스, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로펌프 내에 담긴 제형; 또는 당업자에 의해 인식되는 다른 수단을 사용하는데, 이는 당업계에 잘 알려진 바와 같다. 부위 특이적 투여는, 예를 들어, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 혈관내, 방광내, 병변내, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 전달에 의해 달성될 수 있다.

따라서, 근육내 주사를 위한 본 발명의 약제학적 조성물은 1 ml의 멸균 완충수, 및 약 1 ng 내지 약 100 mg, 예를 들어 약 50 ng 내지 약 30 mg 또는 더 바람직하게는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 FN3 도메인을 함유하도록 제조될 수 있다.

본 발명의 FN3 도메인은 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어 정맥내(IV) 주입 또는 볼루스 주사에 의해 비경구로, 근육내로 또는 피하로 또는 복막내로 환자에게 투여될 수 있다. IV 주입은 짧게는 15분에 걸쳐서, 그러나 더 흔하게는 30분, 60분, 90분 또는 심지어 2시간 또는 3시간 동안 제공될 수 있다. 본 발명의 PSMA 결합 FN3 도메인은 또한 질병의 부위(예를 들어, 종양 그 자체) 내로 직접 주사될 수 있다. 암을 갖는 환자에게 제공되는 용량은 치료되는 질병을 경감시키거나 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분하며("치료적 유효량"), 때때로 0.1 내지 10 mg/㎏ 체중, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/㎏일 수 있지만, 더욱 더 클 수 있으며, 예를 들어 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 mg/㎏일 수 있다. 고정 단위 용량, 예를 들어 50, 100, 200, 500 또는 1000 mg이 또한 제공될 수 있거나, 또는 이러한 용량은 환자의 표면적을 기준으로, 예를 들어 400, 300, 250, 200, 또는 100 mg/m²일 수 있다. 암을 치료하기 위해 통상 1 내지 8회(예를 들어, 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회 또는 8회)의 용량이 투여될 수 있지만, 10회, 12회, 20회 또는 그 이상의 용량이 제공될 수 있다. 본 발명의 FN3 도메인의 투여는 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 5주, 6주, 7주, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 그 이상 후에 반복될 수 있다. 만성 투여인 바와 같이, 반복된 치료 과정이 또한 가능하다. 반복 투여는 동일한 용량으로 또는 상이한 용량으로 행해질 수 있다.

예를 들어, 정맥내 주입을 위한 본 발명의 FN3 도메인의 약제학적 조성물은 80 ㎏의 환자에 대한 투여의 경우 약 200 ml의 멸균 링거액 및 약 8 mg 내지 약 2400 mg, 약 400 mg 내지 약 1600 mg, 또는 약 400 mg 내지 약 800 mg의 PSMA 결합 FN3 도메인을 함유하도록 구성될 수 있다. 비경구로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 방법이 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Science", 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA]에 더 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 FN3 도메인은 저장을 위해 동결건조되고, 사용 전에 적합한 담체 중에 재구성될 수 있다. 이 기법은 종래의 단백질 제제에 유효한 것으로 밝혀져 있으며, 당업계에 공지된 동결건조 및 재구성 기법이 사용될 수 있다.

본 발명의 FN3 도메인은 단회 용량으로 대상체에게 투여될 수 있거나, 또는, 예를 들어 1일, 2일, 3일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 5주, 6주, 7주, 2개월 또는 3개월 후에 투여가 반복될 수 있다. 반복 투여는 동일한 용량으로 또는 상이한 용량으로 행해질 수 있다. 투여는 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 또는 그 이상 반복될 수 있다.

본 발명의 FN3 도메인은 제2 치료제와 동시에, 순차적으로 또는 별개로 병용하여 투여될 수 있다.

본 발명의 FN3 도메인은, 선택적으로 제2 치료제와 병용하여, 외부 빔 방사, 세기 조절 방사선 요법(intensity modulated radiation therapy)(IMRT) 및 임의의 형태의 방사선 수술 - 감마 나이프(Gamma Knife), 사이버나이프(Cyberknife), 리낙(Linac), 및 조직내 방사(interstitial radiation)(예를 들어, 이식된 방사성 시드, 글리아사이트 벌룬(GliaSite balloon))를 포함함 - 을 포함하는 임의의 형태의 방사선 요법과 함께 그리고/또는 수술과 함께 투여될 수 있다.

고형 종양의 치료에 특히 관련하여, 종점 및 항종양 활성을 평가하기 위한 프로토콜이 당업계에 잘 알려져 있다. 각각의 프로토콜은 종양 반응 평가들을 상이하게 규정할 수 있지만, RECIST(고형 종양에서의 반응 평가 기준(Response evaluation Criteria in solid tumors)) 기준이 현재 미국 국립 암 연구소에 의한 종양 반응의 평가를 위한 권장된 가이드라인인 것으로 여겨진다(문헌[Therasse et al., J. Natl. Cancer Inst. 92:205-216, 2000] 참조). RECIST 기준에 따르면, 종양 반응은 모든 측정가능한 병변 또는 전이의 감소 또는 제거를 의미한다. 질병은, 종래의 기법을 사용하여 그것의 적어도 하나의 치수가 20 mm 이상이거나 나선 CT 스캔을 사용하여 10 mm 이상인 것으로 정확하게 측정될 수 있으면서, 의학적 사진 또는 X-선, 컴퓨터 축 단층촬영(CT), 자기 공명 이미징(MRI), 또는 임상 조사(병변이 표재성인 경우)에 의한 명확하게 규정된 주변부를 갖는 병변을 포함하는 경우, 측정가능한 것으로 대체로 여겨진다. 측정 불가능한 질병은, 질병이 종래의 기법으로 20 mm 미만의 또는 나선 CT 스캔으로 10 mm 미만의 병변, 및 (너무 작아서 정확하게 측정할 수 없는) 진정으로 측정 불가능한 병변을 포함함을 의미한다. 측정 불가능한 질병은 흉막 삼출물, 복수, 및 간접 증거에 의해 문서에 기재된 질병을 포함한다.

객관적인 상태에 대한 기준은 고형 종양 반응을 평가하기 위한 프로토콜을 필요로 한다. 대표적인 기준은 하기를 포함한다: (1) 모든 측정가능한 질병의 완전한 소멸; 새로운 병변이 없음; 질병 관련 증상이 없음; 측정 불가능한 질병에 대한 증거가 없음으로 규정된 완전 반응(CR); (2) 표적 병변들의 최장 직경의 합에 있어서의 30% 감소로 규정된 부분 반응(PR); (3) 표적 병변들의 최장 직경의 합에 있어서의 20% 증가 또는 임의의 새로운 병변의 출현으로 규정된 진행성 질병(PD); (4) CR, PR, 또는 진행성 질병이 아닌 것으로 규정된 안정된 반응 또는 무반응(상기 문헌[Therasse et al.] 참조).

종양학 기술 내에서 받아들여져 있는 추가의 종점은 전체 생존율(OS), 무질병 생존율(DFS), 객관적 반응 속도(ORR), 진행까지의 시간(TTP), 및 무진행 생존율(PFS)을 포함한다(문헌[Guidance for Industry: Clinical Trial Endpoints for the Approval of Cancer Drugs and Biologics, April 2005, Center for Drug Evaluation and Research, FDA, Rockville, Md.] 참조).

약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물을 포함하는 용기를 포함하는 키트로서 공급될 수 있다. 약제학적 조성물은, 예를 들어, 단회 또는 다회 용량을 위한 주사용 용액의 형태로, 또는 주사 전에 재구성될 멸균 분말로서 제공될 수 있다. 대안적으로, 그러한 키트는 약제학적 조성물의 투여를 위한 건조-분말 분산기, 액체 에어로졸 발생기, 또는 네뷸라이저를 포함할 수 있다. 그러한 키트는 약제학적 조성물에 대한 지시사항 및 용법에 대한 서면 정보를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명을 일반적인 개념으로 설명하였지만, 본 발명의 실시 형태는 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이며, 이때 실시예는 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

시약 및 작제물:

사이노몰거스(사이노 원숭이 단백질 데이터베이스 ref# EHH56646.1, 서열 번호 32) 및 침팬지(Uniprot, Ref#H2Q3K5, 서열 번호 33) PSMA의 세포외 도메인을 6His 및 Avi 태그와 함께 pUnder 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 단백질을 293HEK-expi 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 상층액을 수거하고 원심분리에 의해 청징화하였다. 단백질을 2-단계 정제 공정을 사용하여 정제하였다: 1) HisTrap HP 컬럼에 의한 IMAC 정제 및 2) PSMA 이량체화를 안정화하기 위한 크기 배제 정제(Superdex 200), 여기서는 용리 완충액이 Mg²⁺, Ca²⁺, 및 0.5 mM ZnCl₂를 함유하는 DPBS임. 관심 단백질을 함유하는 분획들을 풀링하고, 단백질 농도를 A280에 의해 결정하였다.

S. 아우레우스(S. aureus) 소르타제(sortase) A를 인코딩하는 유전자를 DNA2.0에 의해 생성하고, T5 프로모터 하에서의 발현을 위하여 pJexpress401 벡터(DNA2.0) 내로 하위클로닝하였다. 가용성 발현을 위한 소르타제 작제물은 25개 아미노산으로 이루어진 천연 단백질의 N-말단 도메인이 결여되어 있는데, 이 도메인은 막 관련 도메인이기 때문이다(문헌[Ton-That et al., Proc Natl Acad Sci U S A 96: 12424-12429, 1999]). 소르타제를 N-말단 His6-태그(HHHHHH, 서열 번호 34)로서 발현시킨 후, 태그 제거를 위한 TEV 프로테아제 부위(ENLYFQS, 서열 번호 54)로서 발현시켜, 서열 번호 52의 아미노산 서열을 갖는 소르타제를 생성하였다. 사용된 소르타제 단백질은 또한 야생형 단백질(서열 번호 53)과 비교할 때 효소의 촉매 효율을 증가시키는 것으로 보고된 5개의 돌연변이 서열을 포함한다(문헌[Chen et al., Proc Natl Acad Sci U S A 108: 11399-11404, 2011]). 플라스미드를 발현을 위하여 E.coli BL21 Gold 세포(Agilent) 내로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 취출하고, 카나마이신이 보충된 루리아 브로스(Luria Broth)(Teknova) 중에서 성장시키고 37℃, 250 RPM으로 18시간 인큐베이션하였다. 카나마이신이 보충된 테리픽 브로스(Terrific Broth)(Teknova) 250 mL를 이들 계대배양물로부터 접종시키고, 진탕하면서 37℃에서 약 4시간 동안 성장시켰다. 1 mM IPTG를 사용하여 단백질 발현을 유도하고, 단백질을 30℃에서 18시간 동안 발현시켰다. 세포를 6000 g로 원심분리하여 수거하고, 정제될 때까지 -20℃에서 저장하였다. 동결된 세포 펠릿을 실온에서 30분 동안 해동시키고, 세포 페이스트 g당 5 ml로, 30 mL당 1 uL의 재조합 라이소자임(EMD Millipore)이 보충된 BugBusterHT 단백질 추출 시약(EMD Millipore) 중에 현탁시키고, 실온에서 진탕기 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 용해물을 30분 동안 74,600 g로 원심분리에 의해 청징화하였다.

상층액을 완충액 A(0.5 M NaCl 및 10 mM 이미다졸을 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충액, pH 7.0)로 사전-평형을 이룬 3 mL의 Qiagen Superflow Ni-NTA 수지로 패킹된 중력 컬럼(gravity column) 상에 적용하였다. 로딩 후에, 컬럼을 100 mL의 완충액 A로 세척하였다. 단백질을 250 mM 이미다졸이 보충된 완충액 A로 용출시키고, PBS(Gibco) 중에서 평형을 이룬 분취용 겔-여과 컬럼, TSK Gel G3000SW 21.5 x 600 mm(Tosoh) 상에 로딩하였다. 겔-여과 크로마토그래피를 AKTA-AVANT 크로마토그래피 시스템을 사용하여 10 ml/min의 유량으로 PBS 중에서 실온에서 수행하였다. 이어서, 정제된 소르타제를 TEV 프로테아제로 분해(digest)하여 His6 태그를 제거하였다. 28 mg의 소르타제를 30C에서 2시간 동안 1 mM DTT가 보충된 공급 완충액 중에서 3000 단위의 AcTEV 프로테아제(Invitrogen)와 함께 10 mL 중에서 인큐베이션하였다. 태그 없는 소르타제를 Ni-NTA 수지로 정제하였다. 반응물을 PD-10 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 TBS 완충액(50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl) 중으로 교환하고, 완충액 A로 사전-평형을 이룬 0.5 mL의 Qiagen Superflow Ni-NTA 수지로 패킹된 중력 컬럼 상에 적용하였다. 통과액(flowthrough)을 수집하고, 수지를 3 mL의 완충액 A로 세척하였으며, 이것을 통과액에 첨가하였다. 통과액을 10 kDa 컷오프를 갖는 Amicon 15 농축기(EMD Millipore) 내에서 약 0.5 mL로 농축시켰다. 추가의 TBS 완충액을 첨가하고, 샘플을 (2회 반복하여) 다시 농축시켜 완충액을 TBS로 교환시켰다. 1/3 부피의 40% 글리세롤을 첨가하고(10% 글리세롤의 최종 농도), 소르타제를 단기간 동안 -20C 또는 장기간 동안 -80C에서 저장하였다.

실시예 1. 무작위화된 루프를 갖는 텐콘 라이브러리의 작제

텐콘(서열 번호 1)은 인간 테나신-C로부터의 15개의 FN3 도메인의 공통 서열로부터 설계된, 면역글로불린-유사 스캐폴드 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인이다(문헌[Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012]; 미국 특허 제8,278,419호). 텐콘의 결정 구조는 7개의 베타-가닥을 연결시키는 6개의 표면-노출된 루프를 보여준다. 이들 루프, 또는 각각의 루프 내의 선택된 잔기들은, 특정 표적에 결합하는 신규한 분자들을 선택하는 데 사용될 수 있는 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인의 라이브러리를 작제하기 위하여 무작위화될 수 있다.

텐콘:

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(서열 번호 1):

텐콘 스캐폴드 및 다양한 설계 전략을 사용하여 다양한 라이브러리를 생성하였다. 일반적으로, 라이브러리 TCL1 및 TCL2는 우수한 결합제를 생성하였다. TCL1 및 TCL2 라이브러리의 생성이 국제 특허 출원 공개 WO2014081944A2호에 상세히 기재되어 있다.

TCL1 라이브러리의 작제

텐콘(서열 번호 1)의 FG 루프만을 무작위화하도록 설계된 라이브러리, TCL1을 cis-디스플레이 시스템과 함께 사용하기 위해 작제하였다(문헌[Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012]). 이 시스템에서는, Tac 프로모터를 위한 서열들, 텐콘 라이브러리 코딩 서열, RepA 코딩 서열, cis-요소, 및 ori 요소를 도입시킨 단일-가닥 DNA를 생성한다. 시험관내 전사/번역 시스템에서의 발현 시에, 텐콘-RepA 융합 단백질의 복합체를 생성하는데, 이는 cis에서 그것을 인코딩하는 DNA에 결합된다. 이어서, 표적 분자에 결합하는 복합체를 단리하고 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키는데, 이는 하기에 기재된 바와 같다.

cis-디스플레이와 함께 사용하기 위한 TCL1 라이브러리의 작제를 PCR의 연속 라운드에 의해 2개의 절반 부분에서 최종 선형 이중 가닥 DNA 분자를 생성함으로써 달성하였으며; 5' 단편은 프로모터 및 텐콘 서열을 함유하며, 한편 3' 단편은 repA 유전자와 cis- 및 ori 요소를 함유한다. 전체 작제물을 생성하기 위하여 제한 분해(restriction digest)에 의해 이들 2개의 절반 부분을 조합한다. 텐콘의 FG 루프, KGGHRSN(서열 번호 55)에만 무작위 아미노산을 도입시키도록 TCL1 라이브러리를 설계하였다. 이 라이브러리의 작제에서는 NNS 코돈을 사용하였으며, 그 결과 FG 루프 내로의 모두 20개의 아미노산 및 하나의 정지 코돈의 도입이 가능하게 되었다. TCL1 라이브러리는 6개의 별개의 서브-라이브러리를 함유하며, 이들 각각은 다양성을 더욱 증가시키기 위하여 7 내지 12개 잔기의 상이한 무작위화된 FG 루프 길이를 갖는다.

TCL1 라이브러리(서열 번호 2)

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX_7-12PLSAEFTT;

상기 식에서,

X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇은 임의의 아미노산이고;

X₈, X₉, X₁₀, X₁₁ 및 X₁₂는 임의의 아미노산이거나 결실된다.

TCL2 라이브러리의 작제

텐콘의 BC 루프 및 FG 루프 둘 모두를 무작위화하고 각각의 위치에서의 아미노산들의 분포를 엄격하게 제어한 TCL2 라이브러리를 작제하였다. 표 3은 TCL2 라이브러리 내의 원하는 루프 위치들에서의 아미노산 분포를 나타낸다. 설계된 아미노산 분포는 2가지 목적을 가졌다. 첫째, 텐콘 결정 구조의 분석에 기초하여 그리고/또는 상동성 모델링으로부터 텐콘 접힘 및 안정성에 있어서 구조적으로 중요할 것으로 예측되는 잔기들 쪽으로 라이브러리를 편향시켰다. 예를 들어, 단지 소수성 아미노산들의 서브세트이도록 위치 29를 고정시켰는데, 이는 이 잔기를 텐콘 접힘부의 소수성 코어 내에 매립하였을 때이다. 설계의 제2 단계는, 고친화성 결합제(high-affinity binder)를 효율적으로 생성하기 위해, 항체의 중쇄 HCDR3에서 우선적으로 발견되는 잔기들의 아미노산 분포 쪽으로 아미노산 분포를 편향시키는 것을 포함하였다(문헌[Birtalan et al., J Mol Biol 377:1518-28, 2008]; 문헌[Olson et al., Protein Sci 16:476-84, 2007]). 이러한 목적을 위하여, 표 2에서의 "설계된 분포"는 하기와 같은 분포를 지칭한다: 6% 알라닌, 6% 아르기닌, 3.9% 아스파라긴, 7.5% 아스파르트산, 2.5% 글루탐산, 1.5% 글루타민, 15% 글리신, 2.3% 히스티딘, 2.5% 아이소류신, 5% 류신, 1.5% 라이신, 2.5% 페닐알라닌, 4% 프롤린, 10% 세린, 4.5% 트레오닌, 4% 트립토판, 17.3% 티로신, 및 4% 발린. 이 분포에는 메티오닌, 시스테인, 및 정지 코돈이 없다.

TCL2 라이브러리(서열 번호 3)

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃SX₁₄X₁₅LSAEFTT; 상기 식에서,

X₁은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;

X₂는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;

X₃은 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;

X₄는 Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;

X₅는Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;

X₆은Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;

X₇은 Phe, Ile, Leu, Val 또는 Tyr이고;

X₈은 Asp, Glu 또는 Thr이고;

X₉는Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;

X₁₀은Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;

X₁₁은Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;

X₁₂는Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;

X₁₃은Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;

X₁₄는Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이고;

X₁₅는Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 또는 Val이다.

[표 2]

후속으로, 이들 라이브러리를 다양한 방식으로 개선하였는데, 이러한 방식에는 야생형 텐콘과 비교할 때 치환 E11R/L17A/N46V/E86I(텐콘27; 서열 번호 4)를 포함하는, 안정화된 텐콘 프레임워크 상에의 라이브러리의 구축(미국 특허 제8,569,227호)뿐만 아니라, BC 및 FG 루프에서 무작위화된 위치의 변경이 포함된다. 텐콘27이 국제 특허 출원 공개 WO2013049275호에 기재되어 있다. 이로부터, 텐콘의 FG 루프(라이브러리 TCL9)만을, 또는 BC 및 FG 루프의 조합(라이브러리 TCL9)을 무작위화하도록 설계된 새로운 라이브러리를 생성하였다. 이들 라이브러리를 cis-디스플레이 시스템과 함께 사용하기 위하여 작제하였다(문헌[Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101: 2806-2810, 2004]). 이 설계의 세부사항이 하기에 나타나 있다:

안정화된 텐콘(텐콘27)(서열 번호 4)

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT

TCL7(무작위화된 FG 및 BC 루프)(서열 번호 5)

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWX₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉FDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX₁₀X₁₁X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇X₁₈X₁₉SNPLSAIFTT;

상기 식에서,

X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X₁₃,X₁₄, X₁₅및 X₁₆은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고;

X₇, X₈, X₉, X₁₇, X₁₈ 및 X₁₉는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y이거나 결실된다.

TCL9(무작위화된 FG 루프)(서열 번호 6)

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉ X₁₀X₁₁X₁₂SNPLSAIFTT;

X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆ 및 X₇은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고;

X₈,X₉, X₁₀, X₁₁및 X₁₂는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y이거나 결실된다.

라이브러리 작제를 위하여, 무작위화된 BC 루프(길이 6-9 위치) 또는 FG 루프(길이 7-12 위치)를 인코딩하는 DNA 단편을, 라이브러리의 아미노산 분포를 제어하고 정지 코돈을 제거하도록 하기 위하여 Slonomics 기술(Sloning Biotechnology GmbH)을 사용하여 합성하였다. BC 루프 또는 FG 루프를 무작위화하는 DNA 분자들의 2개의 상이한 세트를 독립적으로 합성하고, 추후에 PCR을 사용하여 조합시켜 완전한 라이브러리 생성물을 생성하였다.

FG 루프 라이브러리(TCL9)의 작제

5' Tac 프로모터에 뒤이어서 FG 루프 내의 무작위화된 코돈들을 제외한 텐콘의 완전한 유전자 서열로 이루어진 합성 DNA 분자들의 세트를 생성하였다(서열 번호 26-31). FG 루프 무작위화를 위하여, 시스테인 및 메티오닌을 제외한 모든 아미노산을 동일한 백분율로 인코딩하였다. 다양화된 부분의 길이는, 이러한 길이가 FG 루프 내의 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 아미노산을 인코딩하도록 하는 것이다. 각각의 길이 변이의 서브-라이브러리들을 2 ug의 규모로 개별적으로 합성하고, 이어서 올리고 Sloning-FOR(서열 번호 9) 및 Sloning-Rev(서열 번호 10)를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다.

이 라이브러리의 3' 단편은 디스플레이를 위한 요소들을 함유하는 불변 DNA 서열이며, 이러한 요소들은 PspOMI 제한 부위, repA 유전자의 코딩 영역, 그리고 cis- 및 ori 요소를 포함한다. M13 순방향 및 M13 역방향 프라이머를 이용하여, 주형으로서 플라스미드(pCR4Blunt)(Invitrogen)를 사용하여 PCR 반응을 수행하여 이 단편을 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 PspOMI에 의해 하룻밤 분해하고 겔 정제하였다. 라이브러리 DNA의 5' 부분을 repA 유전자를 함유하는 3' DNA에 연결하기 위하여, 37℃에서 하룻밤 NotI 및 PspOMI 효소 및 T4 리가제의 존재 하에서 2 pmol(약 540 ng 내지 560 ng)의 5' DNA를 등몰량(약 1.25 ㎍)의 3' repA DNA에 연결하였다. 연결된 라이브러리 생성물을 올리고 POP2250(서열 번호 11)과 DigLigRev(서열 번호 12)를 이용하여, 12회 사이클의 PCR을 사용하여 증폭시켰다. 각각의 서브-라이브러리의 경우, 12회의 PCR 반응으로부터 생성된 DNA를 조합하고 Qiagen 스핀 컬럼에 의해 정제하였다. TCL9의 각각의 서브-라이브러리에 대한 산출량은 32 내지 34 ㎍의 범위였다.

FG/BC 루프 라이브러리(TCL7)의 작제

TCL7 라이브러리는 무작위화된 텐콘 BC 및 FG 루프를 갖는 라이브러리를 제공한다. 이 라이브러리에서, 길이 6-9 아미노산의 BC 루프들을 길이 7-12 아미노산의 무작위화된 FG 루프들과 조합적으로 혼합하였다. BC 루프가 6, 7, 8, 또는 9개의 무작위화된 아미노산으로 대체되도록 잔기 VX를 포함하여 최대로 잔기 VX까지 단백질의 N-말단 부분을 인코딩하는 텐콘 유전자를 포함하도록 합성 텐콘 단편 BC6, BC7, BC8, 및 BC9(서열 번호 13-16)를 생성하였다. 이들 단편을 L17A, N46V 및 E83I 돌연변이(CEN5243)의 발견 전에 합성하였지만, 이들 돌연변이를 하기에 기재된 분자 생물학 단계에서 도입하였다. 이 단편을 무작위화된 FG 루프들을 인코딩하는 단편들과 조합하기 위하여, 하기 단계들을 실시하였다.

먼저, Tac 프로모터 및 아미노산 A17을 인코딩하는 뉴클레오티드(130mer-L17A, 서열 번호 17)에 이르기까지의 텐콘의 5' 서열을 인코딩하는 DNA 단편을 올리고 POP2222ext(서열 번호 18) 및 LS1114(서열 번호 19)를 사용하여 PCR에 의해 생성하였다. 이것을 행하여 라이브러리 내에 L17A 돌연변이(CEN5243)를 포함시켰다. 다음으로, 무작위화된 BC 루프들을 포함하는 텐콘 잔기 R18-V75를 인코딩하는 DNA 단편들을, 주형으로서 BC6, BC7, BC8, 또는 BC9를 그리고 올리고 LS1115(서열 번호 20) 및 LS1117(서열 번호 21)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 이 PCR 단계는 3' 말단에 BsaI 부위를 도입시켰다. 이들 DNA 단편을, 프라이머로서 올리고 POP2222ext 및 LS1117을 사용하여 중첩(overlapping) PCR에 의해 순차적으로 결합시켰다. 240 bp의 생성된 PCR 생성물을 풀링하고 Qiagen PCR 정제 키트에 의해 정제하였다. 정제된 DNA를 BsaI-HF로 분해하고, 겔 정제하였다.

FG 루프를 인코딩하는 단편들을, 올리고뉴클레오티드 SDG10(서열 번호 22) 및 SDG24(서열 번호 23)를 이용하여, 주형으로서 FG7, FG8, FG9, FG10, FG11, 및 FG12를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켜, BsaI 제한 부위 및 N46V 및 E86I 변이(CEN5243)를 도입시켰다.

분해된 BC 단편들 및 FG 단편들을 3-방향 연결을 사용하여 단일 단계로 함께 연결하였다. 16개의 가능한 조합 중 4개의 연결 반응을 셋업하였으며, 이때 각각의 연결 반응은 2개의 BC 루프 길이를 2개의 FG 루프 길이와 조합하였다. 각각의 연결은 약 300 ng의 총 BC 단편 및 300 ng의 FG 단편을 함유하였다. 이어서, 이들 4개의 연결 풀을 올리고 POP2222(서열 번호 24) 및 SDG28(서열 번호 25)을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 이어서, 7.5 ㎍의 각각의 반응 생성물을 Not1로 분해하고, Qiagen PCR 정제 컬럼으로 세정하였다. 5.2 ㎍의 이 DNA를 PspOMI로 분해된 등몰량의 RepA DNA 단편(약 14 ㎍)에 연결하고, 생성물을 올리고 POP2222를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다.

실시예 2: 대체 결합 표면을 갖는 텐콘 라이브러리의 생성

특정 라이브러리 설계에서 무작위화될 잔기의 선택은 생성되는 상호작용 표면의 전반적인 형상을 지배한다. BC, DE, 및 FG 루프가 무작위화된 라이브러리로부터 말토스 결합 단백질(MBP)에 결합하도록 선택된 스캐폴드 단백질을 함유하는 FN3 도메인의 X-선 결정학적 분석은 MBP의 활성 부위에 적합되는 대체로 만곡된 계면을 갖는 것으로 나타났다(문헌[Koide et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 104, 6632-6637, 2007]). 대조적으로, MBP에 결합하도록 선택된 안키린 반복 스캐폴드 단백질은 훨씬 더 평면인 상호작용 표면을 갖고 활성 부위로부터 멀리 떨어진 MBP의 외측 표면에 결합하는 것으로 확인되었다(문헌[Binz et al., Nat Biotechnol, 22, 575-582, 2004]). 이들 결과는, 어느 표적 단백질 또는 그들 표적 단백질 상의 특이적 에피토프가 스캐폴드에 의해 효과적으로 결합될 수 있는지를 스캐폴드 분자의 결합 표면의 형상(곡면 대 평면)이 좌우할 수 있다는 것을 시사한다. 단백질 결합을 위한 FN3 도메인을 함유하는 단백질 스캐폴드의 조작을 둘러싼 공개된 노력은 표적 결합을 위해 인접한 루프를 조작함으로써 만곡된 결합 표면을 생성시키는 것에 의존해 왔다. 이러한 접근법은 이러한 스캐폴드에 의해 접근가능한 표적 및 에피토프의 수를 제한할 수 있다.

텐콘 및 다른 FN3 도메인은 분자의 대향면 상에 있는 2개 세트의 CDR-유사 루프를 함유하며, 제1 세트는 BC, DE, 및 FG 루프에 의해 형성되고, 제2 세트는 AB, CD, 및 EF 루프에 의해 형성된다. 2개의 루프 세트는 FN3 구조의 중심을 형성하는 베타-가닥에 의해 분리된다. 텐콘의 이미지가 90도 회전된다면, 대체 표면이 시각화될 수 있다. CD 및 FG 루프 및 2개의 역평행 베타-가닥, C 및 F 베타-가닥에 의해 이러한 약간 오목한 표면이 형성되며, 본 명세서에서는 이를 C-CD-F-FG 표면이라고 칭한다. C-CD-F-FG 표면을 주형으로 사용하여, 표면을 형성하는 잔기의 서브세트를 무작위화함으로써 단백질 스캐폴드 상호작용 표면의 라이브러리를 설계할 수 있다. 베타-가닥은, 하나 걸러서 잔기의 측쇄가 단백질의 표면에 노출된 반복 구조를 갖는다. 따라서, 베타 가닥 내의 표면 노출된 잔기의 일부 또는 전부를 무작위화함으로써 라이브러리를 제조할 수 있다. 베타-가닥 내의 적절한 잔기를 선택함으로써, 다른 단백질과 상호작용하기 위한 독특한 스캐폴드 표면을 제공하면서도 텐콘 스캐폴드의 내재적 안정성의 훼손을 최소화해야 한다.

라이브러리 TCL14(서열 번호 7)를 텐콘27 스캐폴드(서열 번호 4) 내로 설계하였다.

이 라이브러리를 작제하는 데 사용되는 방법에 대한 충분한 설명이 미국 특허 출원 공개 제2013/0226834호에 기재되어 있다.

TCL14 라이브러리(서열 번호 7):

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX₁IX₂YX₃EX₄X₅X₆X₇GEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX₈VX₉IX₁₀GVKGGX₁₁X₁₂SX₁₃PLSAIFTT;

상기 식에서,

X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉, X₁₀, X₁₁, X₁₂ 및 X₁₃은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W,Y, C 또는 M이다.

텐콘27 내의 C-CD-F-FG 표면을 형성하는 2개의 베타 가닥은 무작위화될 수 있는 하기의 총 9개의 표면 노출된 잔기를 가지며: C-가닥: S30, L32, Q34, Q36; F-가닥: E66, T68, S70, Y72, 및 V74, 한편 CD 루프는 하기의 6개의 잠재적 잔기를 가지며: S38, E39, K40, V41, G42, 및 E43; FG 루프는 하기의 7개의 잠재적 잔기를 갖는다: K75, G76, G77, H78, R79, S80, 및 N81. 선택된 잔기는, 22개 잔기 전부가 무작위화되었을 경우에 라이브러리의 이론적 크기가 더 크기 때문에 TCL14 설계 내에 포함되도록 선택되었다.

텐콘 내의 13개의 위치를 무작위화를 위해 선택하였다: C-가닥 내의 L32, Q34, 및 Q36, CD-루프 내의 S38, E39, K40, 및 V41, F-가닥 내의 T68, S70, 및 Y72, FG-루프 내의 H78, R79, 및 N81. C 및 F 가닥 내에서 S30 및 E66은 무작위화하지 않았는데, 이는 그들이 CD 및 FG 루프 바로 너머에 있고, 외견상 C-CD-F-FG 표면의 일부인 것으로 보이지 않기 때문이다. CD 루프의 경우, G42 및 E43은 무작위화되지 않았는데, 이는 유연성을 제공하는 글리신이 루프 영역 내에서 유익할 수 있고, E43이 표면의 접합부에 있기 때문이다. FG 루프에서 K75, G76, G77, 및 S80은 배제되었다. 글리신은 상기 이유로 배제된 반면에, 결정 구조의 신중한 조사에 의해 S80이 코어와 중요한 접촉을 이루어서 안정한 FG 루프의 형성을 돕는 것으로 밝혀졌다. K75는 C-CD-F-FG 표면의 표면으로부터 다른 쪽을 향하며, 무작위화를 위해 덜 흥미로운 후보였다. 원래의 TCL14 설계에서 상기 잔기는 무작위화되지 않았지만, 그들은 후속의 라이브러리 설계에 포함되어 드노보 선택을 위해, 또는 예를 들어, 선택된 TCL14 표적 특이적 히트(target specific hit)에 대한 친화성 성숙 라이브러리(affinity maturation library)를 위해, 부가적인 다양성을 제공할 수 있을 것이다.

TCL14의 생성에 후속하여, 유사한 설계의 3개의 추가 텐콘 라이브러리를 생성하였다. 이들 2개의 라이브러리, TCL19, TCL21 및 TCL23을 TCL14와 동일한 위치에서 무작위화하지만(상기 참조), 이들 위치에서 발생하는 아미노산의 분포는 변경된다(표 3) TCL19 및 TCL21은, 단지 시스테인 및 메티오닌을 제외한 모든 위치에서(각각 5.55%) 18개의 천연 아미노산의 동일한 분포를 포함하도록 설계하였다. TCL23은 각각의 무작위화된 위치가 표 3에 기재된 바와 같이 기능성 항체의 HCDR3 루프에서 발견된 아미노산 분포와 근사해지도록 설계하였다(문헌[Birtalan et al., J Mol Biol 377: 1518-1528, 2008]). TCL21 라이브러리와 마찬가지로, 시스테인 및 메티오닌을 제외시켰다.

제3의 추가의 라이브러리를 구축하여 다른 라이브러리의 잠재적인 표적 결합 표면을 확대시켰다. 이 라이브러리, TCL24에서는, 라이브러리 TCL14, TCL19, TCL21, 및 TCL23과 대비하여 4개의 추가의 텐콘 위치를 무작위화하였다. 이들 위치는 D 가닥으로부터의 N46 및 T48 그리고 G 가닥으로부터의 S84 및 I86을 포함한다. 위치 46, 48, 84, 및 86을 특별히 선택하였는데, 이들 잔기의 측쇄가 베타-가닥 D 및 G로부터 표면 노출되어 있고 C 및 F 가닥의 무작위화된 부분에 구조적으로 인접하게 놓여 있어서, 이에 따라 표적 단백질에 결합하기 위해 접근가능한 표면적을 증가시키기 때문이다. TCL24의 경우 각각의 위치에서 사용된 아미노산 분포는 표 3에서의 TCL19 및 TCL21에 대해 기재된 것과 동일하다.

TCL24 라이브러리(서열 번호 8)

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX₁IX₂YX₃EX₄X₅X₆X₇GEAIX₈LX₉VPGSERSYDLTGLKPGTEYX₁₀VX₁₁IX₁₂GVKGGX₁₃X₁₄SX₁₅PLX₁₆AX₁₇FTT;

상기 식에서,

X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X_13,X₁₄, X₁₅, X₁₆및 X₁₇은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, Y 또는 W이다.

[표 3]

TCL21, TCL23, 및 TCL24 라이브러리의 생성

아미노산 분포를 제어하기 위하여 Colibra 라이브러리 기술(Isogenica)을 사용하여 TCL21 라이브러리를 생성하였다. 아미노산 분포를 제어하기 위하여 Slonomics 기술(Morphosys)을 사용하여 TCL19, TCL23, 및 TCL24 유전자 단편을 생성하였다. PCR을 사용하여 초기 합성 후의 각각의 라이브러리를 증폭시킨 후, RepA에 대한 유전자에 연결하여, CIS-디스플레이 시스템을 사용하는 선택에 사용되도록 하였는데(Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101: 2806-2810, 2004), 이는 루프 라이브러리에 대해 전술된 바와 같다.

실시예 3: PSMA와 결합하는 피브로넥틴 III형(FN3) 도메인의 선택

플레이트-기반 선택

CIS-디스플레이를 사용하여 TCL7, TCL9, TCL19, 및 TCL21 라이브러리로부터 PSMA 결합 센티린을 선택하였다. 시험관내 전사 및 번역(ITT)을 위해, 3 ㎍의 라이브러리 DNA를, 50 μL의 총 부피로 0.1 mM 완전 아미노산, 1X S30 프리믹스 성분들, 및 15 μL의 S30 추출물(Promega)과 함께 30℃에서 인큐베이션하였다. 1시간 후, 375 μL의 블로킹 용액(1x TBS pH 7.4, 0.01% I-블록(Life Technologies, #T2015), 100 ug/ml 청어 정자 DNA)을 첨가하고, 반응물을 15분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. ITT 반응물을 재조합 단백질인 침팬지(pan 229) 또는 사이노몰거스 원숭이 PSMA(pan 230), 또는 사이노몰거스 원숭이 PSMA-Fc 융합체(pan 231)와 함께 인큐베이션하였으며, 이것을 항-인간 PSMA 항체(Lifespan Bioscience, 카탈로그 # LC-C150527) 코팅된 96웰 Maxisorb 플레이트 상에 고정화하였다. 결합되지 않은 라이브러리 구성원들을 TBST 및 TBS를 사용하여 연속 세척에 의해 제거하였다. 세척 후, 10분 동안 85℃로 가열함으로써 표적 단백질로부터 DNA를 용출시키고, 추가의 패닝(panning) 라운드 동안 PCR에 의해 증폭시켰다. 각각의 라운드 동안 400 nM로부터 100 nM까지 표적 PSMA의 농도를 연속해서 낮추고 세척 엄격성(washing stringency)을 증가시킴으로써 고친화성 결합제를 단리하였다.

패닝 후에, 선택된 FN3 도메인을 PCR에 의해 증폭시키고, 리가제 비의존성 클로닝 부위를 포함하도록 변형된 pET 벡터 내로 하위클로닝하고, 표준 분자 생물학 기법을 사용하여 E. 콜라이(E. coli) 내에서의 가용성 발현을 위하여 BL21-GOLD(DE3)(Stratagene) 세포 내로 형질전환시켰다. C-말단 폴리-히스티딘 태그를 인코딩하는 유전자 서열을 각각의 FN3 도메인에 부가하여 정제 및 검출을 가능하게 하였다. 37℃에서 1 mL 96웰 블록들 내에서, 100 ㎍/mL의 카르베니실린이 보충된 TB 배지 중에서 배양물을 0.6 내지 0.8의 광학 밀도로 성장시켰으며, 그 후에 IPTG를 1 mM까지 첨가하였으며, 이 시점에서 온도를 30℃로 감소시켰다. 세포를 원심분리에 의해 대략 16시간 후에 수거하고, -20℃에서 동결시켰다. 45분 동안 실온에서 진탕하면서 0.6 mL의 BugBuster® HT 용해 완충액(Novagen EMD Biosciences) 중에서 각각의 펠릿을 인큐베이션함으로써 세포 용해를 달성하였다.

비드-기반 선택

비드-기반 포획 셋업을 사용하여 센티린을 또한 선택하였다. ITT 반응물을 전술된 바와 같이 제조하고, 이어서 비오티닐화 재조합 단백질인 침팬지 또는 사이노몰거스 원숭이 PSMA와 함께 인큐베이션하였다. 비오티닐화 재조합 단백질 및 결합된 라이브러리 구성원을 뉴트라비딘 또는 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드 상에 포획하였다. 결합되지 않은 라이브러리 구성원들을 TBST 및 TBS를 사용하여 연속 세척에 의해 제거하였다. 세척 후, 10분 동안 85℃로 가열함으로써 표적 단백질로부터 DNA를 용출시키고, 추가의 패닝 라운드 동안 PCR에 의해 증폭시켰다. 각각의 라운드 동안 400 nM로부터 100 nM까지 표적 PSMA의 농도를 연속해서 낮추고 세척 엄격성을 증가시킴으로써 고친화성 결합제를 단리하였다.

해리 속도(off-rate) 선택

비드-기반 선택의 제5 라운드로부터의 산출물을 4회 라운드의 해리 속도 선택에 적용시켰다. ITT 반응물을 비오티닐화 재조합 침팬지 또는 사이노몰거스 원숭이 단백질과 함께 인큐베이션한 후에, 단백질 및 결합된 라이브러리 구성원을 뉴트라비딘 또는 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드 상에 포획하고, TBST 중에서 광범위하게 세척하고, 결합된 복합체를 5 μM 차가운 재조합 PSMA 단백질 중에서 1시간 동안 세척하였다. 이어서, 비드에 결합된 ITT를 TBST 및 TBS 중에서 광범위하게 세척한 후 용출시켰다. 비오티닐화 표적 항원 농도를 라운드 6 및 7에서의 25 nM로부터 라운드 8 및 9에서의 2.5 nM까지 단계적으로 낮추었다. 라운드 7 및 9로부터의 선택 산출물을 발현 및 스크리닝을 위하여 변형된 pET15 벡터 내로 하위클로닝하였다.

친화성 성숙 라이브러리 선택

클론 P229CR9P819-H11(서열 번호 40)의 서열을 기반으로 한 친화성 성숙 라이브러리(TCL25)를 Morphosys(독일 뮌휀 소재)에서 Slonomics 기술을 사용하여 생성하였는데, 이 기술에서는 BC 루프로부터의 위치 23-30 및 FG 루프로부터의 위치 78-83을 무작위화하였다. 각각의 무작위화된 위치에서 65%의 목표 빈도로 모 아미노산(P229CR9P819-H11 유래)을 인코딩하는 뉴클레오티드를 도핑함으로써, 라이브러리에서의 표적 결합의 유지를 달성하였다. 나머지 35%의 뉴클레오티드는, 포함되지 않은 시스테인 및 메티오닌을 제외하고, 동일한 확률의 모든 다른 20개의 천연 아미노산을 인코딩하는 코돈들의 혼합을 함유하도록 설계하였다. 표 4는 TCL25 성숙 라이브러리의 설계를 나타낸다. 표에서, 괄호 안의 숫자는 각각의 위치에서 상응하는 아미노산을 함유하도록 설계된 라이브러리 내의 분자들의 백분율을 나타낸다.이러한 도핑 계획(14개의 위치에서 65% 모)은 모 분자와 대비하여 대개 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 변화를 함유하는 분자들의 이론상의 분포를 생성한다.

[표 4]

CIS-디스플레이를 사용하여 TCL25 라이브러리로부터 PSMA 결합 센티린을 선택하였다. ITT 반응물을 비오티닐화 재조합 단백질인 침팬지 또는 사이노 원숭이 PSMA와 함께 인큐베이션하였다. 비오티닐화 재조합 단백질 및 결합된 라이브러리 구성원을 뉴트라비딘 또는 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드 상에 포획하였다. 결합되지 않은 라이브러리 구성원들을 TBST 및 TBS를 사용하여 연속 세척에 의해 제거하였다. 세척 후, 10분 동안 85℃로 가열함으로써 표적 단백질로부터 DNA를 용출시키고, 추가의 패닝 라운드 동안 PCR에 의해 증폭시켰다. 각각의 라운드 동안 400 nM로부터 100 nM까지 표적 PSMA의 농도를 연속해서 낮추고 세척 엄격성을 증가시킴으로써 센티린 결합제를 단리하였다.

제2 라운드 선택으로부터의 산출물을 4회 라운드의 해리 속도 선택에 적용시켰다. ITT 반응물을 비오티닐화 재조합 PSMA 단백질과 인큐베이션한 후에, 단백질 및 결합된 라이브러리 구성원을 뉴트라비딘 또는 스트렙타비딘 코팅된 자성 비드 상에 포획하고, TBST 중에서 광범위하게 세척하고, 결합된 복합체를 5 μM 차가운 재조합 PSMA 단백질 중에서 1시간 동안 세척하였다. 이어서, 비드에 결합된 ITT를 TBST 및 TBS 중에서 광범위하게 세척한 후 용출시켰다. 비오티닐화 표적 항원 농도를 라운드 3 및 4에서의 25 nM로부터 라운드 5 및 6에서의 2.5 nM까지 단계적으로 낮추었다. 라운드 7 및 9로부터의 선택 산출물을 발현 및 스크리닝을 위하여 변형된 pET15 벡터 내로 하위클로닝하였다.

PSMA와 결합하는 센티린에 대한 생화학적 스크리닝

뉴트라비딘-코팅된 플레이트를 Starting Block T20(Pierce) 중에서 1시간 동안 블로킹하고, 이어서 1시간 동안 비오티닐화 PSMA(패닝에서와 동일한 항원을 사용함) 또는 음성 대조군으로 코팅하였다. 플레이트를 TBST로 헹구고, 희석된 용해물을 1시간 동안 플레이트에 적용하였다. 추가 헹굼 후, 웰들을 HRP-접합된 항-센티린 항체(PAB25)로 1시간 동안 처리하고, 이어서 POD(Roche)로 검정하였다. 백그라운드보다 적어도 10배 큰 신호를 갖는 센티린을 추가 분석을 위하여 선택하였다.

크기 배제 크로마토그래피 분석

크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 PSMA 결합 센티린의 응집 상태를 결정하였다. 각각의 정제된 센티린의 분취물들(10 μL)을 PBS pH 7.4의 이동상에서 0.3 mL/min의 유량으로 Superdex 75 5/150 컬럼(GE Healthcare) 상에 주입하였다. 컬럼으로부터의 용출을 280 nm에서의 흡광도에 의해 모니터링하였다. 야생형 텐콘을 대조군으로서 각각의 실시에 포함시켰다. Agilent ChemStation 소프트웨어(Rev. B. 04.02)를 사용하여 용출 프로파일을 분석하였다. 동일한 실시에서 야생형 단백질과 유사한 용출 프로파일을 갖는 단백질만을 추가의 특성화에 대해 고려하였다.

센티린의 대용량(high-throughput) 발현, 접합 및 정제

생화학적 결합 ELISA에 의해 확인된 특유의 히트로부터 단리된 클론을 96웰 블록 플레이트에서의 성장을 위하여 단일 히트 플레이트 내로 조합하였으며; 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 1 mL의 배양물(선택을 위하여 카나마이신이 보충된 LB 배지) 중에서 클론은 성장하였다. 96-블록 플레이트 내에서의 단백질 발현을 위하여, 카나마이신이 보충된 1 mL의 TB 배지를 50 uL의 하룻밤 배양물로 접종시키고, OD600이 0.6 내지 1이 될 때까지 300 rpm으로 연속 진탕하면서 37℃에서 성장시켰다. 일단 목표 OD에 도달하였으면, IPTG를 1 mM까지 첨가하여 단백질 발현을 유도하였으며; 플레이트를 하룻밤 성장을 위하여 30℃(300 rpm)로 옮겼다. 하룻밤 배양물을 원심분리하여 세포를 수거하였으며; 세균 펠릿을 사용할 준비가 될 때까지 -80℃에서 저장하였다. 양성 및 음성 대조군 둘 모두를 플레이트마다 반복 실시로 포함시켰다.

소르타제 태그에 대한 접합을 위하여, 세균 펠릿을 해동시키고, 재현탁하고, 재조합 인간 라이소자임(EMD, 카탈로그 # 71110)이 보충된 BugBusterHT(EMD 카탈로그 #70922) 중에 용해시켰다. 용해는 온화하게 교반하면서 실온에서 진행되었으며, 이후에 플레이트를 42℃로 옮겨서 숙주 단백질을 침전시켰다. 잔해(debris)를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 상층액을 소르타제-촉매 표지화를 위하여 새로운 블록 플레이트에 옮겼다. Gly3-vc-MMAF(Concortis), 태그 없는 소르타제A, 및 소르타제 완충액(Tris, 염화나트륨, 및 염화칼슘)을 함유하는 마스터 믹스를 2X 농도로 제조하고, 용해물 상층액에 등부피로 첨가하였다. 표지화 반응을 실온에서 2시간 동안 진행하였으며, 이후에 Ni-NTA 멀티-트랩 HP 플레이트(GE 카탈로그 #28-4009-89)를 사용하여 단백질을 정제하였다. 단백질 접합체를 이미다졸-함유 용출 완충액(50 mM Tris pH 7.5, 500 mM NaCl, 250 mM 이미다졸)에 의한 단계적 용출에 의해 회수하고, 필터 멸균하고, 세포 기반 세포독성 검정에 직접 사용하였다.

센티린-약물 접합체의 대용량 세포독성 검정

96웰 흑색 조직 배양물-코팅된 플레이트(BD/Corning 카탈로그 # 353219)에 검정 배지(5% 소태아 혈청이 보충된 페놀 레드-무함유 RPMI(Life Technologies 카탈로그 #11835-030)) 중에서 10,000개 세포/웰의 밀도로 LNCaP FGC 세포(ATCC, 카탈로그 #CRL-1740)를 시딩(seeding)하였다. 시딩된 플레이트를 5% CO₂ 하에서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하여 세포 부착을 가능하게 하였다. 24시간 후에, CDC를 검정 배지 중에 희석시키고(1:100, 1:300, 1:1000, 또는 1:3000), LNCaP 세포에 직접 적용하였다. 이어서, LNCaP 세포를 37℃, 5% CO₂에서 66 내지 72시간 동안 인큐베이션하였다. CellTiter-Glo 시약(Promega, 카탈로그 #G7571)을 사용하여 세포 독성을 평가하였는데; 100 μL의 준비된 시약을 처리된 웰에 직접 첨가하고, 광으로부터 보호된 상태에서 온화하게 진탕하면서 10분 동안 인큐베이션하였다. SpectraMax M5 플레이트 판독기를 사용하여 발광을 측정하였다. 값들을 비처리 대조군에 대해 정규화하고, 50% 초과의 독성이 달성되었다면 추가의 분석을 위해 선택하였다.

실시예 4: 항-PSMA 센티린의 특성화

대규모 발현 및 정제

센티린 돌연변이체를 인코딩하는 유전자 서열을 패닝을 통해 찾아내고 T7 프로모터 하에서의 발현을 위하여 pET15b 벡터 내로 클로닝하거나 또는 DNA2.0에 의해 생성하고 T5 프로모터 하에서의 발현을 위하여 pJexpress401 벡터(DNA2.0) 내로 하위클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 발현을 위하여 E.coli BL21 Gold(Agilent) 또는 BL21DE3 Gold(Agilent) 내로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 취출하고, 카나마이신이 보충된 루리아 브로스(Luria Broth)(Teknova) 중에서 성장시키고 37℃, 250 RPM으로 18시간 인큐베이션하였다. 카나마이신이 보충된 테리픽 브로스(Teknova) 1 리터를 이들 계대배양물로부터 접종시키고, 진탕하면서 37℃에서 4시간 동안 성장시켰다. 일단 600 nm의 흡광도에서의 광학 밀도가 1.0에 도달하면, 단백질 발현을 1 mM IPTG로 유도하였다. 단백질을 37℃에서 4시간 동안 또는 30℃에서 18시간 동안 발현시켰다. 세포를 6000 g로 원심분리하여 수거하고, 정제될 때까지 -20℃에서 저장하였다. 동결된 세포 펠릿(약 15 내지 25 g)을 실온에서 30분 동안 해동시키고, 세포 페이스트 g당 5 ml로, 0.2 mg/ml의 재조합 라이소자임(Sigma)이 보충된 BugBusterHT 단백질 추출 시약(EMD Millipore) 중에 현탁시키고, 실온에서 진탕기 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 용해물을 25분 동안 74,600 g로 원심분리에 의해 청징화하였다. AKTA AVANT 크로마토그래피 시스템을 사용하여 4 ml/min의 유량으로 얼음 중에 침지된 5 ml의 Qiagen Ni-NTA 카트리지 상에 상층액을 적용하였다. 모든 다른 Ni-NTA 크로마토그래피 단계를 5 ml/min의 유량으로 수행하였다. Ni-NTA 컬럼을 0.5 M NaCl 및 10 mM 이미다졸을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.0(완충액 A) 25.0 ml 중에서 평형에 이르게 하였다. 로딩 후에, 컬럼을 100 ml의 완충액 A에 이어서, 10 mM 이미다졸, 1% CHAPS 및 1% n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드 표면활성제를 함유하는 100 ml의 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.0, 및 100 ml의 완충액 A로 세척하였다. 단백질을 250 mM 이미다졸이 보충된 완충액 A로 용출시키고, PBS(Gibco) 중에서 평형을 이룬 분취용 겔-여과 컬럼, TSK Gel G3000SW 21.5 x 600 mm(Tosoh) 상에 로딩하였다. 겔-여과 크로마토그래피를 AKTA-AVANT 크로마토그래피 시스템을 사용하여 10 ml/min의 유량으로 PBS 중에서 실온에서 수행하였다.

열 안정성의 결정

열 안정성을 모세관 DSC에 의해 측정하였다. 각각의 샘플을 PBS pH 7.4 중에 1 mg/ml의 농도로 희석시켰다. 오토샘플러가 장착된 VP-DSC 기기(MicroCal, LLC)를 사용하여 이들 샘플에 대하여 용융 온도를 측정하였다. 샘플을 10℃로부터 95℃ 또는 100℃까지 1℃/분의 속도로 가열하였다. 적분용 기준선을 계산하기 위하여 각각의 샘플 스캔 사이에 완충제 단독 스캔을 완료하였다. 완충제 단독 신호를 차감한 후 데이터를 2-상태 풀림 모델에 적합시켰다. 각각의 샘플을 셀로부터 제거하지 않으면서 그에 대한 스캔을 반복함으로써 열 변성의 가역성을 결정하였다.

PSMA+ 세포에 대한 항-PSMA 센티린 약물 접합체의 선택적 세포독성

센티린을 시스테인-말레이미드 화학(문헌[Brinkley, Bioconjugate Chemistry 3: 2-13, 1992])을 통해 또는 전술된 소르타제 반응을 사용하여 vc-MMAF에 접합시켰다. 센티린-vcMMAF 접합체의 세포독성을 시험관내에서 LNCaP, VCAP, MDA-PC-2B, 및 PC3 세포에서 평가하였다. 세포를 24시간 동안 96웰 흑색 플레이트 내에서 플레이팅하고, 이어서 가변 용량의 센티린-vcMMAF 접합체로 처리하였다. 세포를 66 내지 72시간 동안 센티린 약물 접합체(CDC)와 함께 인큐베이션되게 하였다. 전술된 바와 같이, CellTiterGlo를 사용하여 독성을 평가하였다. 발광 값들을 엑셀로 내보내기 하였으며, 그래픽 분석을 위하여 이로부터 그들을 Prism에 복사 및 붙여넣기 하였다. 데이터를 X=Log(x)를 사용하여 변환시키고, 이어서 3-파라미터 모델을 적용하여 비선형 회귀를 사용하여 분석하여 IC₅₀을 결정하였다.

표 6은 다수의 서열 패밀리들을 스패닝하는, 패닝을 통해 확인된 특유의 히트들을 요약한다. 센티린은 55° 내지 85℃에서 열 안정성을 나타내었으며, 22.6 내지 0.38 nM의 IC₅₀ 값으로 vcMMAF에 접합될 때 LNCaP 세포에 대해 세포독성을 나타내었다.

실시예 4: 항-PSMA 센티린의 특성화

대규모 발현 및 정제

센티린 돌연변이체를 인코딩하는 유전자 서열을 패닝을 통해 찾아내고 T7 프로모터 하에서의 발현을 위하여 pET15b 벡터 내로 클로닝하거나 또는 DNA2.0에 의해 생성하고 T5 프로모터 하에서의 발현을 위하여 pJexpress401 벡터(DNA2.0) 내로 하위클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 발현을 위하여 E.coli BL21 Gold(Agilent) 또는 BL21DE3 Gold(Agilent) 내로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 취출하고, 카나마이신이 보충된 루리아 브로스(Luria Broth)(Teknova) 중에서 성장시키고 37℃, 250 RPM으로 18시간 인큐베이션하였다. 카나마이신이 보충된 테리픽 브로스(Teknova) 1 리터를 이들 계대배양물로부터 접종시키고, 진탕하면서 37℃에서 4시간 동안 성장시켰다. 일단 600 nm의 흡광도에서의 광학 밀도가 1.0에 도달하면, 단백질 발현을 1 mM IPTG로 유도하였다. 단백질을 37℃에서 4시간 동안 또는 30℃에서 18시간 동안 발현시켰다. 세포를 6000 g로 원심분리하여 수거하고, 정제될 때까지 -20℃에서 저장하였다. 동결된 세포 펠릿(약 15 내지 25 g)을 실온에서 30분 동안 해동시키고, 세포 페이스트 g당 5 ml로, 0.2 mg/ml의 재조합 라이소자임(Sigma)이 보충된 BugBusterHT 단백질 추출 시약(EMD Millipore) 중에 현탁시키고, 실온에서 진탕기 상에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 용해물을 25분 동안 74,600 g로 원심분리에 의해 청징화하였다. AKTA AVANT 크로마토그래피 시스템을 사용하여 4 ml/min의 유량으로 얼음 중에 침지된 5 ml의 Qiagen Ni-NTA 카트리지 상에 상층액을 적용하였다. 모든 다른 Ni-NTA 크로마토그래피 단계를 5 ml/min의 유량으로 수행하였다. Ni-NTA 컬럼을 0.5 M NaCl 및 10 mM 이미다졸을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.0(완충액 A) 25.0 ml 중에서 평형에 이르게 하였다. 로딩 후에, 컬럼을 100 ml의 완충액 A에 이어서, 10 mM 이미다졸, 1% CHAPS 및 1% n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드 표면활성제를 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.0 100 ml, 및 100 ml의 완충액 A로 세척하였다. 단백질을 250 mM 이미다졸이 보충된 완충액 A로 용출시키고, PBS(Gibco) 중에서 평형을 이룬 분취용 겔-여과 컬럼, TSK Gel G3000SW 21.5 x 600 mm(Tosoh) 상에 로딩하였다. 겔-여과 크로마토그래피를 AKTA-AVANT 크로마토그래피 시스템을 사용하여 10 ml/min의 유량으로 PBS 중에서 실온에서 수행하였다.

열 안정성의 결정

센티린을 시스테인-말레이미드 화학(문헌[Brinkley, Bioconjugate Chemistry 3: 2-13, 1992])을 통해 또는 전술된 소르타제 반응을 사용하여 vc-MMAF에 접합시켰다. 센티린-vcMMAF 접합체의 세포독성을 시험관내에서 LNCaP, VCAP, MDA-PC-2B, 및 PC3 세포에서 평가하였다. 세포를 24시간 동안 96웰 흑색 플레이트 내에서 플레이팅하고, 이어서 가변 용량의 센티린-vcMMAF 접합체로 처리하였다. 세포를 66 내지 72시간 동안 센티린 약물 접합체(CDC)와 함께 인큐베이션되게 하였다. 전술된 바와 같이, CellTiterGlo를 사용하여 독성을 평가하였다. 발광 값들을 엑셀로 내보내기 하였으며, 그래픽 분석을 위하여 이로부터 그들을 Prism에 복사 및 붙여넣기 하였다. 데이터를 X=Log(x)를 사용하여 변환시키고, 이어서 3-파라미터 모델을 적용하여 비선형 회귀를 사용하여 분석하여 IC50을 결정하였다.

표 5는 다수의 서열 패밀리들을 스패닝하는, 패닝을 통해 확인된 특유의 히트들을 요약한다. 센티린은 55° 내지 85℃에서 열 안정성을 나타내었으며, 22.6 내지 0.38 nM의 IC₅₀ 값으로 vcMMAF에 접합될 때 LNCaP 세포에 대해 세포독성을 나타내었다. 표 6, 표 7 및 표 8은 선택된 클론들의 BC, C, CD, F 및 FG 루프 아미노산 서열을 나타낸다. 표 9는 클론들의 아미노산 서열을 나타낸다.

[표 5]

[표 6]

[표 7]

[표 8]

[표 9]

선택된 센티린 약물 접합체들을 세포주 패널 전체에 걸쳐 시험하였다. 표 10은 vcMMAF에 접합된 몇몇 센티린에 대한 IC₅₀ 값을 나타낸다. 데이터는 1개의 곡선 적합과 9개의 곡선 적합 사이의 평균을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 제시되어 있다. CDC가 고수준의 PSMA를 발현하는 것으로 알려진 세포주인 LNCaP 세포에서 가장 강력하다. CDC는 또한 더 낮은 수준의 PSMA를 갖는 전립선암 세포주인 MDA-PCA-2B 및 VCAP 세포에서 활성이었다. PSMA 음성 세포주인 PC3 세포에서는 활성이 관찰되지 않았는데, 이는 선택성을 입증한다.

[표 10]

실시예 5: 항-PSMA 센티린의 조작

시스테인 스캔

항-PSMA 센티린인, 시스테인 잔기가 단백질 내의 다양한 위치에 도입된 P233FR9_10을 인코딩하는 유전자를 DNA2.0으로부터 획득하고, 이를 사용하여 전술된 바와 같은 단백질을 발현 및 정제하였다. 생성된 센티린을 전술된 바와 같이 열 안정성(vcMMAF 접합의 존재 및 부재 하에서) 및 LNCaP 세포독성에 대해 평가하였다. 결과가 표 11에 요약되어 있다.

[표 11]

실시예 6: 비표적화된 센티린의 생체내분포의 이미징

위치 62에 시스테인을 함유하도록 조작된 표적 항원에 대한 특이적 결합을 갖지 않는 센티린을 DOTA에 접합하고, 이어서 IsoTherapeutics Group, LLC(미국 텍사스주 앵글턴 소재)에서 지르코늄-89 방사성 동위원소를 접합하였다. 거세된 수컷 NSG 마우스(Jackson laboratories)를 1.5% 아이소푸란으로 마취하고, Siemens Inveon microPET/CT에서 이미징하였다. 마우스에 꼬리 정맥 주사(차가운 센티린을 사용하여 최대 1 mg/㎏ 용량으로 행해짐)를 통해 대략 0.2 mCi [89Zr] 센티린(서열 번호 51)을 투여하고, 센티린의 주사 후 처음 60분 동안, 그리고 이어서 3, 6 및 14시간째에 연속해서 이미징하였다.

3차원 PET 이미지를 2D 배열된-부분집합 기대값 최대화 알고리즘(2D ordered-subsets expectation maximization algorithm)(미국 테네시주 녹스빌 소재의 Siemens Healthcare)을 사용하여 복셀(voxel) 크기가 0.107 mm x 0.107 mm x 0.107 mm인 768 x 768 x 512 토포그래픽 부피(tomographic volume)로 재작성하였다. 이미지를 처리하고, PMOD v3.0 소프트웨어(스위스 취리히 소재의 PMOD Technologies)를 사용하여 분석하였다. 알려진 활성의 실린더를 PET 스캐너에서 스캐닝하여, 용량 보정기에 의해 측정된 주사된 용량과 PET 이미지에서의 복셀당 카운트 사이의 교차-보정을 제공하였다. 각각의 PET 이미지를 PMOD 이미지 융합 소프트웨어를 사용하여 CT-이미지에 코-레지스터(co-register)하여, 해부학적 레퍼런스를 제공하였다. 관심 영역(region of interest)(ROI)을 분석되는 각각의 조직에 대하여 4번째 섹션마다 그 주위에 그렸다. 복셀당 평균 카운트를 도출하고, 알려진 활성의 보정 실린더로부터 도출된 보정 계수를 사용하여 체중 그램당 주사된 용량(%)으로 변환시켰다. 방사능의 모든 측정치를 Zr-89의 알려진 반감기(78.41시간)를 사용하여 감쇠에 대해 보정하였다.

도 1은 시간 경과에 따른 방사성 표지 FN3 도메인의 조직 분포를 나타낸다. 신장 및 방광에서는 신속한 누적이 관찰되며, 간에서는 단지 제한된 누적이 관찰되는데, 이는 센티린이 신장을 통해 제거됨을 시사한다.

실시예 7: 사이노 PSMA와 복합체를 형성한 항-PSMA P233FR9-H10의 결정 구조

His-태깅된 P233FR9-H10 센티린(본 명세서에서는 H10 센티린으로 칭해짐)을 E. 콜라이에서 발현시키고, 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 센티린을 dPBS, pH 7.2 중에 수용하였다.

huIgG1 Fc 도메인에 대한 C-말단 융합체로서의 사이노몰거스 PSMA 세포외 도메인을 GnTI^- 세포에서 발현시키고, 친화성 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 융합 단백질을 dPBS, 0.5 mM ZnCl₂, pH 7.2 중에 수용하였다. 이어서, Prescission 프로테아제 처리 후 친화성 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해 Fc 도메인을 제거하였다. 단리된 사이노몰거스 PSMA(사이노PSMA) 세포외 도메인을 dPBS, 0.5 mM ZnCl₂, pH 7.2 중에 저장하였다.

20 mM Hepes pH 7.0, 0.5 mM ZnCl₂에 대해 4℃에서 48시간 동안 투석하면서 사이노PSMA를 H10 센티린과 1:3(과량의 센티린)의 몰비로 혼합함으로써 H10 센티린/사이노PSMA 복합체를 제조하였다. 이어서, 복합체를 48 내지 68 mM NaCl, 20 mM Hepes pH 7.5, 10% 글리세롤의 구배로 monoS 컬럼으로부터 용출시키고, 3.4 mg/mL로 농축시켰다. 20℃에서 시팅 드롭 증기-확산법(sitting drop vapor-diffusion method)을 사용하여 25% PEG 3 kDa, 0.2 M NH₄Cl, 0.1 M 소듐 아세테이트 pH 4.5로부터 X-회절에 적합한 결정을 얻었다.

X-선 데이터 수집을 위하여, 결정을 20% 글리세롤이 보충된 모액을 함유하는 동결보호 용액 중에 수초 동안 액침하고, 이어서 액체 질소 중에서 동결시켰다. 아르곤 국립 연구소(Argonne National Laboratory)에 있는 APS(Advanced Photon Source)의 빔라인 17-ID의 Dectris Pilatus 6M 픽셀 어레이(Pixel Array) 검출기를 사용하여 X-선 회절 데이터를 수집하였다. 회절 데이터를 프로그램 HKL2000(문헌[Otwinowski & Minor,1997])을 사용하여 처리하였다. X-선 데이터 통계가 표 12에 제공되어 있다.

이 구조를 Phaser(문헌[Read, 2001])를 사용하여 분자 대체(molecular replacement)(MR)에 의해 해석하였다. MR에 대한 검색 모델은 인간 PSMA(PDB 코드 2C6G)의 결정 구조 및 P114AR7P94-A3 W33A 센티린의 구조였다. PHENIX(문헌[Adams et al, 2004])를 사용하여 구조를 정밀화하고, COOT(문헌[Emsley & Cowtan, 2004])를 사용하여 모델 조정을 수행하였다. 모든 다른 결정학적 계산은 CCP4 프로그램 제품군(suite)(문헌[CCP4, 1994])을 사용하여 수행하였다. 모든 분자 그래픽은 PyMol(문헌[DeLano, 2002])을 사용하여 생성하였다. 구조 정밀화 통계가 표 12에 제공되어 있다.

[표 12]

동종이량체성 사이노PSMA의 구조는 프로테아제(잔기 57-116 및 352-590), 정점(잔기 117-351) 및 나선(잔기 591-750) 도메인에 상응하는 잔기 57-750, 및 이량체 하위단위당 11개의 가능한 N-연결 글리칸 중 8개(Asn-76, -121, -140, -195, -459, -476, -613, 및 -638에서)를 포함한다. 사이노PSMA 활성 부위는 3개의 도메인들 사이의 계면에 위치해 있고, 그것은 히스티딘(H377 및 H553) 및 글루타메이트/아스파르테이트(D387, 촉매적 E424, E425, 및 D453) 잔기 및 물 분자에 의해 배위된 2개의 아연 원자를 함유한다. H10 센티린(서열 번호 41) 구조는 잔기 2-92를 함유한다. H10 잔기는 서열 번호 41에 따라 순차적으로 넘버링된다. 사이노PSMA 잔기는 서열 번호 141의 전장 사이노 PSMA 서열에 따라 넘버링된다. 성숙 사이노PSMA(신호 펩티드를 갖지 않음)는 서열 번호 141의 잔기 44에서 시작한다.

하나의 H10 센티린이 각각의 PSMA 하위단위에 결합된 비대칭 단위 내에는 하나의 사이노PSMA 동종이량체가 있다(도 2a). 2개의 센티린/PSMA 복합체는 PSMA 하위단위들 내의 모든 등가의 원자들의 중첩에 대해 0.72 Å의 제곱평균제곱근 편차(r.m.s.d.)에 의해 나타나는 바와 같이 구조적으로 매우 유사하다. 또한, 인간 PSMA와 사이노몰거스 PSMA 사이에는 고도의 구조적 유사성이 있고, 센티린 복합체 내의 사이노PSMA 분자와 결합되지 않은 인간 PSMA(PDB 코드 2OOT, 1.6Å 분해능에서의 구조) 사이의 Cα 원자 중첩에 대하여 0.5 Å의 r.m.s.d에 의해 나타나는 바와 같이 센티린 결합에 의해 유도된 큰 입체구조 변화가 부재한다. 흥미로운 특징은 루프 영역 541-547이 센티린과의 상호작용을 통한 루프 입체구조의 안정화로 인해 단지 사이노몰거스 단백질에서만 가시적이라는 것이다.

센티린/PSMA 결합 부위는 2F _obs-F _calc 전자 밀도 맵에 의해 명확한데, 이는 결합 잔기들의 신뢰성 있는 위치결정을 가능하게 한다. B 쇄와 C 쇄(각각 PSMA 쇄 및 센티린 쇄) 사이의 상호작용만이 다음 섹션에 기재된다.

H10 센티린은 PSMA 활성 부위 부근의 영역에 결합하고(도 2a), 약 1,170 Å²의 사이노PSMA 영역을 커버한다. 구체적으로는, 센티린은 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이 프로테아제(Y460, F488, K499-P502, P504, R511, K514, N540-E542, 및 N544-F546), 정점(잔기 R181), 및 나선(잔기 K610, N613, 및 I614) 도메인 내의 사이노PSMA 잔기를 인식한다.

센티린의 면(face)은 PSMA 표면 상의 β-시트 팩들을 네 가닥화하였는데, 이때 CD 루프가 활성 부위 입구 내로 깊숙이 삽입되었다(도 2b 및 도 2c). 구체적으로는, PSMA 결합에 관여하는 H10 센티린 잔기는 C(A32 및 G34), D(V46), F(G64, P68, Y70, 및 A72), 및 G(S84-I86) β-가닥 및 CD(W36, W38-D41, E43, 및 A44) 및 FG 루프(W79, F81, 및 P82) 내에 위치된다. 잔기 D39, D40, D41, 및 E43은 센티린 CD 루프에 음전하를 부여하고, 이들 잔기는, 활성 부위 내의 아연 이온으로 이어지는, 약 20 Å 깊이의 양으로 하전된 퓨넬(funnel) 내로 삽입되어, 퓨넬 내로의 기질 입구 및 PSMA 효소 활성을 차단할 가능성이 높다(도 2b 및 도 2c). 그러나, 센티린은 아연 이온 또는 그의 배위 잔기와 직접 상호작용하지는 않는다.

보존된 PSMA 잔기 W541, Y460, F488, P502 및 P504는 센티린 잔기 W36, P68, Y70, W79, F81, 및 P82와의 코밍 부위(combing site)를 가로질러 방향족 클러스터를 형성한다(도 3a). 보존된 R511은 결합 부위의 중심 위치 내에 있고, H는 센티린 네 가닥 β-시트의 중심 잔기인 Y70과 결합한다. 도 3b는 파라토프 및 에피토프 잔기의 간략도를 나타낸다.

인간 PSMA와 사이노몰거스 PSMA는 97% 동일하며, S613N 변경을 제외하고, H10과 상호작용하는 모든 잔기는 2개의 종 사이에서 보존된다(도 4). S613N 변경은 사이노PSMA에서의 N613 글리코실화 및 이 탄수화물과 센티린 잔기 E66, I86, T88(F 및 G β-가닥) 사이의 반데르 발스 접촉의 획득(gain)을 가져오는데, 이는 인간 효소에서는 존재하지 않을 것이다.

접합을 위한 센티린 잔기

결합 부위 외측의 다양한 H10 센티린 잔기는 PSMA 결합 또는 센티린 접힘을 방해하지 않고서 소분자(독성 페이로드(payload))의 접합을 위하여 변형될 수 있다. 시스테인은 (His-태그 이후의) C-말단에서 그리고 위치 R11, E53, 및 K62에서 페이로드에 이미 위치시키고 접합하였으며, 이들 변이체 모두는 유사하게 강력한 세포독성을 나타내는 것으로 입증되었다. 게다가, BC 루프 내의 잔기 T22, D25, 및 A26, DE 루프 내의 말단 잔기 N6, 및 S52는 돌연변이생성 후 화학적 접합을 위한 잠재적으로 우수한 부위이다(도 5). 이러한 용매 노출 잔기들은 센티린/PSMA 계면으로부터 떨어져 있고, 구조적으로 유연한 영역에 위치되어 있다.

더욱이, N- 및 C-말단 영역 둘 모두는 다른 단백질 도메인과의 융합에 있어서 자유롭다. N-말단은 PSMA 프로테아제 도메인을 향해 배향되고 융합 링커를 사용하여 도달가능하며, 한편, 또한 접근가능한 C-말단은 PSMA 나선 도메인을 향해 간다. 센티린 융합 파트너에 대한 최적의 링커 길이는 융합 파트너의 구조 및 표적 분자 상의 그의 결합 부위의 위치에 좌우될 것이다.

작용 기전

H10 센티린은 센티린/PSMA 복합체의 내재화에 기인하는 전립선암 세포 내로의 페이로드(독성 소분자, 핵산 등)의 표적화된 전달을 위한 후보이다. 더욱이, H10 센티린은 다중특이성 포맷인 경우 전립선암 세포로의 면역 세포의 방향전환을 위한 후보이다.

H10 센티린은, 감소된 세포 피트니스(fitness) 및 생존율에 기여할 수 있는 PSMA의 효소 활성을 또한 억제할 가능성이 높다. 센티린/사이노PSMA 구조는 활성 부위의 입구에 결합된 센티린을 나타내는데, 이는 입체 폐색(steric occlusion) 및 결합 부위에 대한 직접적인 경쟁을 통하여 PSMA와의 기질 상호작용을 방지할 수 있다.

실시예 8: 추가의 항-PSMA 센티린 변이체의 생성

선택된 항-PSMA 센티린을 추가로 조작하여 모 센티린의 특성을 개선하였다. 이는, PSMA에 결합하는 FN3 도메인을 전술된 라이브러리를 사용하여 생성하고, PSMA에 대한 그들의 결합에 대해 시험하였다.

표 13은 생성된 분자의 아미노산 서열을 나타낸다.

[표 13]

실시예 9: 형광 염료에 접합된 항 PSMA 센티린을 사용하여 종양 세포 상에서의 PSMA 발현의 검출

이 실시예는 형광 염료에 접합된 항 PSMA 센티린을 사용하여 세포 상에 존재하는 PSMA를 검출하는 것을 나타낸다. 아미노산 53에 유리 시스테인을 갖는 C-말단 His-태깅된 항 PSMA 센티린 P233FR9_H10(서열 번호 49)을 R-피코에리트린(PE)(Prozyme 카탈로그 # PB31)에 접합시켰다. PE를 60분 동안 설포-SMCC(Pierce 카탈로그 # 22122)를 사용하여 활성화하고, 활성화된 PE를 Sephadex G25 및 PBS/EDTA 완충액을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해 유리 설포-SMCC로부터 분리하였다. 센티린을 30분 동안 TCEP(Sigma, cat. # 646547)를 사용하여 환원시켰다. 환원된 센티린을 Sephadex G25 및 PBS/EDTA 완충액을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해 유리 TCEP로부터 분리하였다. 활성화된 R-PE를 환원된 센티린에 90분 동안 공유 결합시킨 후, 20분 동안 N-에틸말레이미드(Sigma 카탈로그# 04260)를 사용하여 켄칭하였다. "PE-접합된 센티린"을 AKTA Explorer FPLC(General Electric) 상에서 100 mM 인산나트륨, 100 mM 황산나트륨, 0.05% 아지드화나트륨, pH 6.5 중에서 Tosoh TSKgel G3000SW 컬럼을 사용하여 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 정제하였다.

PE-접합된 센티린을 유세포측정 및 CellSearch 순환 종양 세포(Circulating Tumor Cell)(CTC) 검정에 의해 PSMA 양성 및 음성 세포주를 사용하여 감수성 및 특이성에 대해 시험하였다. 하기의 전립선 세포주를 ATCC로부터 구매하고, 항-PSMA 센티린의 특이성을 검증하는 데 사용하였다: LNCaP(고 PSMA 발현), 22Rv1(저 PSMA 발현) 및 PC3(PSMA 발현 없음).

유세포측정에 의한 세포주 상의 PSMA의 검출

표준 세포 배양 절차를 사용하여 전립선 세포주를 수거하였다. 세포(약 30,000개)를 PE-접합된 센티린으로 1% 소혈청 알부민(BSA)을 함유하는 0.1 ml의 PBS 중에서 20분 동안 염색하였다. Biolegend로부터의 항 PSMA 항체-PE 접합체(클론 LNI-17 카탈로그 # 342504)를 양성 대조군으로서 사용하였다. 인큐베이션 후에, 3 ml의 PBS/BSA 완충액을 첨가하고, 결합되지 않은 PE 접합체를 5분 동안 800 g로 원심분리에 의해 제거하였다. 상층액을 흡인하고, 세포를 0.3 ml의 PBS/BSA 중에 재현탁시켰다. 샘플을 BD Biosciences FACSCalibur에 의해 분석하였다. 각각의 세포주로부터의 PSMA 염색의 평균 형광 세기(MFI)를 결정하고, 항 PSMA 항체에 의한 MFI와 대비하였다. MFI는 PSMA 발현 수준에 직접 관련되어서, 높은 PSMA 발현 세포주로부터의 MFI가 더 높다. 도 6은 PE-접합된 센티린에 의해 검출된 상이한 세포주들로부터의 MFI 값을 항 PSMA 항체-PE에 의한 MFI 값과 대비한 것을 나타낸다.

결과는 PE-접합된 센티린이 PSMA 양성 세포주에 결합하고, PSMA 음성 세포에 비특이적으로 결합하지 않음을 나타낸다. MFI는, 예상된 바와 같이, 낮은 PSMA 발현 세포주(22Rv1)의 경우 낮은 MFI에 비하여 높은 PSMA 발현 세포주(LNCaP)의 경우 더 높다. PSMA 음성 세포주(PC3)의 경우의 MFI는 백그라운드 신호에 가깝다. 게다가, 상이한 세포주들에 결합함에 있어서의 PE-접합된 센티린의 성능은, 센티린 및 항체 접합체 둘 모두에 대해 유사한 MFI 값이 획득된 바와 같이, 항-PSMA 항체-PE와 유사하다. 이 실시예는 PE-접합된 센티린이 종양 세포 상의 PSMA의 검출에 있어서 감수성 및 특이성을 보여줌을 나타낸다.

순환 종양 세포 검정에 의한 PSMA의 검출

CELLSEARCH 검정에서 PE-접합된 센티린을 시험하여 7.5 ml의 혈액으로부터 순환 종양 세포(CTC)를 검출 및 계수함으로써 상기 결과를 추가로 확인하였다. CELLSEARCH(미국 뉴저지주 라리탄 소재의 Veridex LLC)를 사용한 순환 종양 세포 계수를 제조자의 프로토콜 및 트레이닝에 따라 수행하였다. CELLSEARCH 검정은, 포획을 위하여 페로플루이드 자성 입자에 접합된 항-EpCAM을 사용하고, CTC의 시각화를 위하여 플루오레세인에 접합된 사이토케라틴 8, 18 및 19에 특이적인 항-사이토케라틴을 사용한다. CELLSEARCH 검정은 샘플 제조를 위한 CELLSEARCH AutoPrep 및 분석을 위한 CELLTRACKS Analyzer II®(CTA II)를 사용한다. CTA II는 4색 반자동화 형광 현미경이고, CTC를 확인 및 계수하는 데 3개의 색을 사용한다. CTA II 상에서의 제4 색은 추가의 관심 마커를 사용하여 표현형 CTC에 이용가능하다. 이 실시예에서는, 조직 배양된 종양 세포를 정상 혈액 중으로 스파이킹하여 혈액 중 CTC를 모방하였다. 대략 500개의 종양 세포(LNCaP, 22Rv1, PC3-9 또는 SKBR3 세포)를 CELLSAVE 튜브(Janssen Diagnostics) 내에 수집된 7.5 ml의 정상 공여자 혈액 중으로 스파이킹하였다. 유방암 세포주(SKBR3)는 또한 PSMA 음성 세포주로서 사용하였다. CELLSEARCH CXC 키트 및 마커로서의 PE-접합된 센티린을 사용하여 샘플을 AutoPrep 상에서 처리하였다. AutoPrep 샘플 제조 시스템은 항 EpCAM 페로플루이드를 사용하여 종양 세포를 포획함으로써 종양 세포를 풍부화한다. CTC 풍부화된 샘플을, 핵산 염료(DAPI)로 염색하여 핵형성 세포를 확인하고, 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC)에 접합된 항-사이토케라틴 항체로 염색하여 종양 세포를 확인하고, 알로피코시아닌(APC)에 접합된 항-백혈구 항체로 염색하여 백혈구를 확인하였다. 샘플을 0.32 ml의 최종 부피로 처리하고, MagNest® 세포 제시 장치 내에 있는 상태로 샘플 챔버에 옮겼다. MagNest® 장치는 CELLTRACKS Analyzer II®에 의한 분석을 위하여 자성 표지 세포를 제시한다. 샘플을 CTA II를 사용하여 분석하여 CTC를 계수하고 CTC 상의 PSMA를 검출하였다. 분석기는 샘플을 자동으로 분석하고, 후보 종양 세포들을 제시하는데, 후보 종양 세포들은 검토를 위한 섬네일 이미지로서 DAPI 및 사이토케라틴에 대해 양성이다. CellSearch 검정에서 PE-접합된 센티린으로 염색된 종양 세포들로부터의 결과가 도 7에 나타나 있다. PE-접합된 센티린으로 염색된 이미지 CTC는 PSMA-PE로 표시된 난에 있다.

도 7a는 LNCaP 종양 세포 상에서의 PSMA의 발현을 나타내고, 이들 세포의 100%는 PSMA에 대해 양성이다. 낮은 PSMA 발현 세포주(22Rv1)는 PSMA에 대해 26% 양성이다(도 7b). 한편, PSMA 음성 세포주(PC3-9 및 SKBR3)는 PSMA에 대해 음성이다(도 7c 및 도 7d). 이들 결과는 유세포측정 결과와 일치한다. 이 실시예는 항 PSMA 센티린이 CTC 상에서의 PSMA 발현을 검출하고, 항 PSMA 센티린의 감수성 및 특이성을 추가로 확인하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.

서열

서열 번호 1= 원래의 텐콘 서열

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT

서열 번호 2= TCL1 라이브러리

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV(X)_7-12PLSAEFTT;

상기 식에서,

X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₇은 임의의 아미노산이고;

서열 번호 3= TCL2 라이브러리

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈SFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVX₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃SX₁₄X₁₅LSAEFTT;

상기 식에서,

X₇은 Phe, Ile, Leu, Val 또는 Tyr이고;

X₈은 Asp, Glu 또는 Thr이고;

서열 번호 4= 안정화된 텐콘

서열 번호 5= TCL7(FG 및 BC 루프)

상기 식에서,

X₁, X₂, X₃, X₄, X₅, X₆, X₁₀, X₁₁, X₁₂, X_13,X_14,X₁₅ 및 X₁₆은 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y이고;

서열 번호 6= TCL9 (FG 루프)

상기 식에서,

X_8,X_9, X_10,X₁₁및 X₁₂는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y이거나 결실된다.

TCL14 라이브러리(서열 번호 7):

상기 식에서,

TCL24 라이브러리(서열 번호 8)

상기 식에서,

서열 번호 9 = Sloning-FOR

GTGACACGGCGGTTAGAAC

서열 번호 10 = Sloning-REV

GCCTTTGGGAAGCTTCTAAG

서열 번호 11 = POP2250

CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATAC

서열 번호 12 = DigLigRev

CATGATTACGCCAAGCTCAGAA

서열 번호 13 = BC9

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC

서열 번호 14 = BC8

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC

서열 번호 15 = BC7

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC

서열 번호 16 = BC6

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTGAAGTTACCGAAGACTCTCTGCGTCTGTCTTGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNTTYGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCAACCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTCTTAGAAGCTTCCCAAAGGC

서열 번호 17 = 130mer-L17A

CGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTG

서열 번호 18 = POP222ext

CGG CGG TTA GAA CGC GGC TAC AAT TAA TAC

서열 번호 19 = LS1114

CCA AGA CAG ACG GGC AGA GTC TTC GGT AAC GCG AGA AAC AAC CAG GTT TTT CGG CGC CGG CAG CAT GGT AGA TCC TGT TTC

서열 번호 20 = LS1115

CCG AAG ACT CTG CCC GTC TGT CTT GG

서열 번호 21 = LS1117

CAG TGG TCT CAC GGA TTC CTG GTA CTG GAT CAG GAA AGA GTC GAA

서열 번호 22 = SDG10

CATGCGGTCTCTTCCGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTCCTGACCGTTCCGGGT

서열 번호 23 = SDG24

GGTGGTGAAGATCGCAGACAGCGGGTTAG

서열 번호 24 = POP2222

CGGCGGTTAGAACGCGGCTAC

서열 번호 25 = SDG28

AAGATCAGTTGCGGCCGCTAGACTAGAACCGCTGCCACCGCCGGTGGTGAAGATCGCAGAC

서열 번호 26 = FG12

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC

서열 번호 27 = FG11

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC

서열 번호 28 = FG10

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC

서열 번호 29 = FG9

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC

서열 번호 30 = FG8

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC

서열 번호 31 = FG7

GTGACACGGCGGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCTACCATGCTGCCGGCGCCGAAAAACCTGGTTGTTTCTCGCGTTACCGAAGACTCTGCGCGTCTGTCTTGGACCGCGCCGGACGCGGCGTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACCAGGAATCTGAAAAAGTTGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTCTTACGACCTGACCGGTCTGAAACCGGGTACCGAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCTAACCCGCTGTCTGCGATCTTCACCACCGGCGGTCACCATCACCATCACCATGGCAGCGGTTCTAGTCTAGCGGCCGCAACTGATCTTGGC

서열 번호 32 = PSMW1 (N'-AviTag-HisTag-GS-사이노 PSMA_ECD)

KSSSEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLHNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELTHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPAGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGATGVILYSDPDDYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGMAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSASPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTSEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGMLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVYNLTKELESPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSSYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSVVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYNISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLRDFDKSNPILLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSQAWGEVKRQISIATFTVQAAAETLSEVA

서열 번호 33 = PSMW8 (N'-AviTag-HisTag-GS-침프 PSMA_ECD)

KSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVLDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRHGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVYNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYNISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFTERLQDFDKSNPILLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGDVKRQISVAAFTVQAAAETLSEVA

서열 번호 34: 헥사히스티딘 태그

HHHHHH

서열 번호 35 = P258AR6P1071_G03

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWDIDEQRDWFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT

서열 번호 36 = P258AR6P1070_A05

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTIDEQRDWFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT

서열 번호 37 = P258AR6P1071_F04

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWVIDEQRDWFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT

서열 번호 38 = P258AR6P1070_F09

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTIDEQRDWFESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT

서열 번호 39 = P258AR6P1071_D02

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWAIDEQRDWFESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT

서열 번호 40 = P229CR5P819_H11

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWDIDEQRDWFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSSNPLSAIFTT

서열 번호 41 = P233FR9_H10

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFAIGYWEWDDDGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYPVYIAGVKGGQWSFPLSAIFTT

서열 번호 42= P233FR9P1001_B5-5

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFTIGYWEWDDDGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYPVYIAGVKGGQWSFPLSAIFTT

서열 번호 43 = P233FR9P1001_H3-1

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFPIGYWEWDDDGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYHVYIAGVKGGQWSFPLSAIFTT

서열 번호 44 = P233FR9P1001_D9

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFPIGYWEWDDDGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWVYIAGVKGGQWSFPLSAIFTT

서열 번호 45 = P234CR9_A07

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWGEQFTIFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGASGYEWFHAFGSSNPLSAIFTT

서열 번호 46 = P234CR9_H01

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWEWWVIPGDFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVVNSGQWNDTSNPLSAIFTT

서열 번호 47 = P233FR9_H10 (cterm cys)

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFAIGYWEWDDDGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYPVYIAGVKGGQWSFPLSAIFTTC

서열 번호 48 = P233FR9_H10 (K62C)

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFAIGYWEWDDDGEAIVLTVPGSERSYDLTGLCPGTEYPVYIAGVKGGQWSFPLSAIFTT

서열 번호 49 = P233FR9_H10 (E53C)

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFAIGYWEWDDDGEAIVLTVPGSCRSYDLTGLKPGTEYPVYIAGVKGGQWSFPLSAIFTT

서열 번호 50 = P233FR9_H10 (R11C)

LPAPKNLVVSCVTEDSARLSWTAPDAAFDSFAIGYWEWDDDGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYPVYIAGVKGGQWSFPLSAIFTT

서열 번호 51 = 비표적화된 센티린 (K62C)

LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLCPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTTGGHHHHHH

서열 번호 52 = 소르타제 A

MSHHHHHHSSGENLYFQSKPHIDNYLHDKDKDEKIEQYDKNVKEQASKDKKQQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATREQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRNVKPTAVEVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEETGVWETRKIFVATEVK

서열 번호 53 = 태그 없는 소르타제 A

SKPHIDNYLHDKDKDEKIEQYDKNVKEQASKDKKQQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATREQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRNVKPTAVEVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEETGVWETRKIFVATEVK

서열 번호 54 TEV 프로테아제 절단 부위

ENLYFQS

텐콘의 서열 번호 55 FG 루프

KGGHRSN

서열 번호 56 BC 루프

DIDEQRDW

서열 번호 57 BC 루프

TIDEQRDW

서열 번호 58 BC 루프

VIDEQRDW

서열 번호 59 BC 루프

AIDEQRDW

서열 번호 60 BC 루프

EWWVIPGD

서열 번호 61 BC 루프

GEQFTI

서열 번호 62 BC 루프

TAPDAA

서열 번호 63 C 루프

FDSFLIQYQE

서열 번호 64 C 루프

FESFLIQYQE

서열 번호 65 C 루프

FDSFAIGYWE

서열 번호 66 C 루프

FDSFPIGYWE

서열 번호 67 C 루프

FDSFTIGYWE

서열 번호 68 CD 루프

SEKVGE

서열 번호 69 CD 루프

WDDDGE

서열 번호 70 F 루프

TEYTVSIYGV

서열 번호 71 F 루프

TEYTVSIYG

서열 번호 72 F 루프

TEYPVYIAGV

서열 번호 73 F 루프

TEYWVYIAGV

서열 번호 74 F 루프

TEYHVYIAGV

서열 번호 75-140은 상기 표들에 있다

서열 번호 141 전장 사이노PSMA

MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSSEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLHNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELTHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPAGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGATGVILYSDPDDYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGMAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSASPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTSEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGMLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVYNLTKELESPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSSYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSVVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYNISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLRDFDKSNPILLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKY

>142 링커

AEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAA

>143 인간 PSMA ECD

KSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA

>144 신호 서열을 갖는 인간 FL PSMA

MWNLLHETDSAVATARRPRWLCAGALVLAGGFFLLGFLFGWFIKSSNEATNITPKHNMKAFLDELKAENIKKFLYNFTQIPHLAGTEQNFQLAKQIQSQWKEFGLDSVELAHYDVLLSYPNKTHPNYISIINEDGNEIFNTSLFEPPPPGYENVSDIVPPFSAFSPQGMPEGDLVYVNYARTEDFFKLERDMKINCSGKIVIARYGKVFRGNKVKNAQLAGAKGVILYSDPADYFAPGVKSYPDGWNLPGGGVQRGNILNLNGAGDPLTPGYPANEYAYRRGIAEAVGLPSIPVHPIGYYDAQKLLEKMGGSAPPDSSWRGSLKVPYNVGPGFTGNFSTQKVKMHIHSTNEVTRIYNVIGTLRGAVEPDRYVILGGHRDSWVFGGIDPQSGAAVVHEIVRSFGTLKKEGWRPRRTILFASWDAEEFGLLGSTEWAEENSRLLQERGVAYINADSSIEGNYTLRVDCTPLMYSLVHNLTKELKSPDEGFEGKSLYESWTKKSPSPEFSGMPRISKLGSGNDFEVFFQRLGIASGRARYTKNWETNKFSGYPLYHSVYETYELVEKFYDPMFKYHLTVAQVRGGMVFELANSIVLPFDCRDYAVVLRKYADKIYSISMKHPQEMKTYSVSFDSLFSAVKNFTEIASKFSERLQDFDKSNPIVLRMMNDQLMFLERAFIDPLGLPDRPFYRHVIYAPSSHNKYAGESFPGIYDALFDIESKVDPSKAWGEVKRQIYVAAFTVQAAAETLSEVA

>145 테나신 C의 제3 FN3 도메인

DAPSQIEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGIELTYGIKDVPGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTEYEVSLISRRGDMSSNPAKETFTT

>146 피브콘(Fibcon)

Ldaptdlqvtnvtdtsitvswtppsatitgyritytpsngpgepkeltvppsstsvtitgltpgveyvvslyalkdnqespplvgtqtt

>147 피브로넥틴의 제10 FN3 도메인

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT

>148

GSGS

>149

GGGSGGGS

>150

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

>151

APAP

>152

APAPAPAPAP

>153

APAPAPAPAPAPAPAPAPAP

>154

APAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPAP

>155 알부민 변이체

DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

>156 cDNA H10

CTGCCAGCCCCGAAGAATTTGGTCGTTTCCCGTGTCACTGAGGACTCTGCACGTCTGAGCTGGACCGCACCGGACGCGGCGTTCGACAGCTTTGCAATCGGCTACTGGGAGTGGGATGATGACGGCGAGGCCATTGTGCTGACCGTTCCGGGTAGCGAGCGCAGCTACGATCTGACCGGTCTGAAGCCGGGTACGGAATATCCGGTGTATATTGCGGGCGTGAAGGGTGGCCAGTGGAGCTTCCCGCTGAGCGCGATCTTTACCACC

>157 cDNA P258AR6P1071_D02

CTGCCGGCTCCGAAAAACCTGGTCGTTTCCCGTGTCACTGAAGATTCTGCACGCTTGAGCTGGGCGATCGACGAGCAGCGTGACTGGTTTGAGAGCTTCCTGATTCAGTATCAAGAATCGGAAAAAGTTGGCGAGGCCATCGTGCTGACCGTTCCGGGTAGCGAGCGCAGCTATGATCTGACGGGTCTGAAGCCAGGCACCGAGTATACGGTGAGCATTTACGGTGTCTACCATGTGTACCGTAGCAATCCGCTGAGCGCGATCTTCACCACC

>158 cDNA

P233FR9P1001_H3-1

CTGCCAGCCCCGAAAAACTTAGTTGTCTCCCGCGTGACCGAAGATTCTGCTCGTCTGAGCTGGACTGCACCGGACGCGGCGTTCGACAGCTTTCCGATTGGCTACTGGGAGTGGGATGATGACGGTGAAGCGATCGTGCTGACCGTTCCGGGTAGCGAGCGTAGCTATGACCTGACGGGTTTGAAACCTGGTACCGAGTATCACGTTTACATTGCGGGCGTCAAGGGTGGCCAGTGGTCGTTCCCGCTGAGCGCAATCTTTACGACC

>159 PSMA 에피토프

KKSPSPEFSGMPRISK

>160 PSMA 에피토프

NWETNKF

SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN BIOTECH, INC. JACOBS, STEVEN KLEIN, DONNA O'NEIL, KARYN DIEM, MICHAEL HYUN, LINUS GOLDBERG, SHALOM CARDOSO, ROSA SPINKA-DOMS, TRACY <120> PROSTATE SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN (PSMA) BINDING AGENTS AND USES THEREOF <130> JBI5064WOPCT <140> PCT/US2016/031295 <141> 2016-05-06 <150> 62/157,789 <151> 2015-05-06 <160> 160 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 2 <211> 94 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(86) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(86) <223> This region may encompass 7-12 residues <400> 2 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 90 <210> 3 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(27) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (28)..(28) <223> Phe, Ile, Leu, Val or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (29)..(29) <223> Asp, Glu or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(79) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(82) <223> Ala, Arg, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr or Val <400> 3 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser 65 70 75 80 Xaa Xaa Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 4 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 5 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(30) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(30) <223> This region may encompass 6-9 residues <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(87) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (78)..(87) <223> This region may encompass 7-9 residues <400> 5 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Asp 20 25 30 Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile 35 40 45 Val Leu Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu 50 55 60 Lys Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr 85 90 95 Thr <210> 6 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(86) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (75)..(86) <223> This region may encompass 7-12 residues <400> 6 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 65 70 75 80 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 95 <210> 7 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(41) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (70)..(70) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(72) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(79) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(81) <223> Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr or Met <400> 7 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Xaa 20 25 30 Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Xaa Val Xaa Ile Xaa Gly Val Lys Gly Gly Xaa Xaa Ser 65 70 75 80 Xaa Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 8 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <221> MOD_RES <222> (32)..(32) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (34)..(34) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (36)..(36) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (38)..(41) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (46)..(46) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (48)..(48) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (68)..(68) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (70)..(70) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (72)..(72) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (78)..(79) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (81)..(81) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (84)..(84) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (86)..(86) <223> Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Tyr or Trp <400> 8 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Xaa 20 25 30 Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Ala Ile Xaa Leu Xaa 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 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gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnttygac tctttcctga 240 tccagtacca ggaatctgaa aaagttggtg aagcgatcaa cctgaccgtt ccgggttctg 300 aacgttctta cgacctgacc ggtctgaaac cgggtaccga atacaccgtt tctatctacg 360 gtgttcttag aagcttccca aaggc 385 <210> 14 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (198)..(221) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 14 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nttygactct ttcctgatcc 240 agtaccagga atctgaaaaa gttggtgaag cgatcaacct gaccgttccg ggttctgaac 300 gttcttacga cctgaccggt ctgaaaccgg gtaccgaata caccgtttct atctacggtg 360 ttcttagaag cttcccaaag gc 382 <210> 15 <211> 379 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (198)..(218) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 15 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntt ygactctttc ctgatccagt 240 accaggaatc tgaaaaagtt ggtgaagcga tcaacctgac cgttccgggt tctgaacgtt 300 cttacgacct gaccggtctg aaaccgggta ccgaatacac cgtttctatc tacggtgttc 360 ttagaagctt cccaaaggc 379 <210> 16 <211> 376 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (198)..(215) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 16 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctgaagtt accgaagact 180 ctctgcgtct gtcttggnnn nnnnnnnnnn nnnnnttyga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatca acctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttctta 360 gaagcttccc aaaggc 376 <210> 17 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 17 cggcggttag aacgcggcta caattaatac ataaccccat ccccctgttg acaattaatc 60 atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacaggat 120 ctaccatgct g 131 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 18 cggcggttag aacgcggcta caattaatac 30 <210> 19 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 ccaagacaga cgggcagagt cttcggtaac gcgagaaaca accaggtttt tcggcgccgg 60 cagcatggta gatcctgttt c 81 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 ccgaagactc tgcccgtctg tcttgg 26 <210> 21 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 cagtggtctc acggattcct ggtactggat caggaaagag tcgaa 45 <210> 22 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 22 catgcggtct cttccgaaaa agttggtgaa gcgatcgtcc tgaccgttcc gggt 54 <210> 23 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 23 ggtggtgaag atcgcagaca gcgggttag 29 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 cggcggttag aacgcggcta c 21 <210> 25 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 25 aagatcagtt gcggccgcta gactagaacc gctgccaccg ccggtggtga agatcgcaga 60 c 61 <210> 26 <211> 485 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(392) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 26 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nntctaaccc gctgtctgcg atcttcacca 420 ccggcggtca ccatcaccat caccatggca gcggttctag tctagcggcc gcaactgatc 480 ttggc 485 <210> 27 <211> 482 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(389) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 27 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt ctaacccgct gtctgcgatc ttcaccaccg 420 gcggtcacca tcaccatcac catggcagcg gttctagtct agcggccgca actgatcttg 480 gc 482 <210> 28 <211> 479 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(386) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 28 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnntcta acccgctgtc tgcgatcttc accaccggcg 420 gtcaccatca ccatcaccat ggcagcggtt ctagtctagc ggccgcaact gatcttggc 479 <210> 29 <211> 476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(383) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 29 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg aatacaccgt ttctatctac ggtgttnnnn 360 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntctaacc cgctgtctgc gatcttcacc accggcggtc 420 accatcacca tcaccatggc agcggttcta gtctagcggc cgcaactgat cttggc 476 <210> 30 <211> 473 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (357)..(380) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 30 gtgacacggc ggttagaacg cggctacaat taatacataa ccccatcccc ctgttgacaa 60 ttaatcatcg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 120 caggatctac catgctgccg gcgccgaaaa acctggttgt ttctcgcgtt accgaagact 180 ctgcgcgtct gtcttggacc gcgccggacg cggcgttcga ctctttcctg atccagtacc 240 aggaatctga aaaagttggt gaagcgatcg tgctgaccgt tccgggttct gaacgttctt 300 acgacctgac cggtctgaaa ccgggtaccg 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 51 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Cys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr Gly Gly His His His His His 85 90 95 His <210> 52 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 52 Met Ser His His His His His His Ser Ser Gly Glu Asn Leu Tyr Phe 1 5 10 15 Gln Ser Lys Pro His Ile Asp Asn Tyr Leu His Asp Lys Asp Lys Asp 20 25 30 Glu Lys Ile Glu Gln Tyr Asp Lys Asn Val Lys Glu Gln Ala Ser Lys 35 40 45 Asp Lys Lys Gln Gln Ala Lys Pro Gln Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys 50 55 60 Val Ala Gly Tyr Ile Glu Ile Pro Asp Ala Asp Ile Lys Glu Pro Val 65 70 75 80 Tyr Pro 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Synthetic polypeptide <400> 91 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Asp Ile Asp Glu Gln Arg Asp Trp Phe Asp Ser 20 25 30 Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val 35 40 45 Leu Thr Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Tyr His Val Tyr 65 70 75 80 Arg Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 90 <210> 92 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 92 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Asp Ile Asp Glu Gln Arg Asp Trp Phe Glu Ser 20 25 30 Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val 35 40 45 Leu Thr Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Tyr His Val Tyr 65 70 75 80 Arg Ser Ser Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 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Synthetic polypeptide <400> 102 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala 20 25 30 Ile Gly Tyr Trp Glu Trp Asp Asp Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Leu Val Tyr Ile Ala Gly Val Lys Gly Gly Gln Trp Ser 65 70 75 80 Phe Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 103 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 103 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala 20 25 30 Ile Gly Tyr Trp Glu Trp Asp Asp Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Ile Val Tyr Ile Ala Gly Val Lys Gly Gly Gln Trp Ser 65 70 75 80 Phe Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 104 <211> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 126 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Glu 20 25 30 Ile Gly Tyr Trp Glu Trp Asp Asp Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr His Val Tyr Ile Ala Gly Val Lys Gly Gly Gln Trp Ser 65 70 75 80 Phe Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 127 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 127 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe His 20 25 30 Ile Gly Tyr Trp Glu Trp Asp Asp Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr His Val Tyr Ile Ala Gly Val Lys Gly Gly Gln Trp Ser 65 70 75 80 Phe Pro Leu Ser Ala 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 137 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Gln 20 25 30 Ile Gly Tyr Trp Glu Trp Asp Asp Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr His Val Tyr Ile Ala Gly Val Lys Gly Gly Gln Trp Ser 65 70 75 80 Phe Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 138 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 138 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ser 20 25 30 Ile Gly Tyr Trp Glu Trp Asp Asp Asp Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Cys Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr His Val Tyr Ile Ala Gly Val Lys Gly Gly Gln Trp Ser 65 70 75 80 Phe Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 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Claims

서열 번호 88의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 전립선 특이적 막 항원(prostate specific membrane antigen)(PSMA) 결합 FN3 도메인.
제1항에 있어서, 상기 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인이 N-말단에 메티오닌을 추가로 포함하는, 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인.
제1항에 있어서, 상기 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인이 반감기 연장 모이어티(half-life extending moiety)에 커플링되는 것인, 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인.
제3항에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 알부민 결합 분자(albumin binding molecule), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 알부민, 알부민 변이체 및 면역글로불린의 Fc 영역의 적어도 일부분으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인.
제1항에 있어서, 상기 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인이 제2 분자에 접합된 것인, 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인.
제5항에 있어서, 상기 제2 분자는 세포독성제, 검출가능 표지, 폴리에틸렌 글리콜 및 핵산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인.
제6항에 있어서, 상기 세포독성제는 오리스타틴, 모노메틸 오리스타틴 페닐알라닌, 돌로스타틴, 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 및 방사성 동위원소로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인.
제6항에 있어서, 상기 검출가능 표지는 방사성 동위원소, 자성 비드, 금속 비드, 콜로이드성 입자, 형광 염료, 전자-고밀도 시약, 효소, 비오틴, 디곡시게닌 및 합텐으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인.
제1항의 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인을 인코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
제9항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
제10항의 벡터를 포함하는, 단리된 숙주 세포.
단리된 PSMA 결합 FN3 도메인을 생성하는 방법으로서,
폴리펩티드가 발현되는 조건 하에서 제11항의 단리된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항의 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
제1항의 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인을 포함하는, 암을 진단하기 위한 진단 키트.
제1항의 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인을 포함하는, 암 진단제 또는 포획제(capture agent).
생물학적 샘플 내의 PSMA-발현 세포를 검출하는 방법으로서,
상기 생물학적 샘플을 제15항의 암 진단제로 처리하는 단계 및 그러한 암 진단제의, PSMA 결합 FN3 도메인에 대한 상기 생물학적 샘플의 결합을 평가하는 단계를 포함하는 것인, 방법.
제5항에 있어서, 제2 분자는 서열 번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 것인, 단리된 PSMA 결합 FN3 도메인.
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