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KR102624409B1 - 품질 제어 트레이서를 갖는 어레이 - Google Patents

품질 제어 트레이서를 갖는 어레이 Download PDF

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KR102624409B1
KR102624409B1 KR1020197020967A KR20197020967A KR102624409B1 KR 102624409 B1 KR102624409 B1 KR 102624409B1 KR 1020197020967 A KR1020197020967 A KR 1020197020967A KR 20197020967 A KR20197020967 A KR 20197020967A KR 102624409 B1 KR102624409 B1 KR 102624409B1
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cleavable
gel material
control tracer
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KR1020197020967A
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페이턴 쉬
존 엠. 베얼
마이클 에스. 그레이지
알렉산더 퍼먼
랜달 스미스
웨이 웨이
나이치안 잔
Original Assignee
일루미나, 인코포레이티드
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Abstract

어레이는 복수의 개별 웰을 포함하는 지지체, 복수의 개별 웰의 각각 내에 위치한 겔 물질, 및 복수의 개별 웰의 각각에서 겔 물질에 그래프팅된 품질 제어 트레이서를 포함한다. 품질 제어 트레이서는 (a) 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 검출 가능한 표지를 포함하고; 몇몇 양상에 있어서, 검출 가능한 표지 및 비-반응성 뉴클레오타이드 서열 또는 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 갖는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열이다.

Description

품질 제어 트레이서를 갖는 어레이
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 12월 22일에 출원된 미국 가특허 출원 제62/438,284호의 이득을 주장하고, 이의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참고로 원용된다.
서열 목록에 대한 참조
EFS-Web를 통해 함께 제출된 서열 목록은 본 명세서에서 그 전문이 참고로 포함된다. 파일의 명칭은 ILI104BPCT_IP-1477-PCT_Sequence_Listing_ST25.txt이고, 파일 크기는 7,477 바이트이고, 파일 작성일은 2017년 12월 20일이다.
생물학적 어레이는 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 분자를 검출, 분석, 및/또는 서열화하는데 사용되는 광범위한 도구 중 하나이다. 이들 응용에서, 어레이는 서열화 또는 증폭 프라이머로서 또는 인간 및 다른 유기체의 유전자에 존재하는 뉴클레오타이드 서열을 위한 프로브로서 수용한 핵산 서열을 포함하도록 조작된다. 이들 응용 이외에, 생물학적 어레이는 광범위한 분자, 분자의 패밀리, 유전자 발현 수준, 단일 뉴클레오타이드 다형성, 및 유전형분석의 검출 및 평가를 위하여 사용될 수 있다.
일반적으로, 유전자 서열화는 유전 물질의 가닥, 예를 들면, DNA 또는 RNA의 단편에서 뉴클레오타이드 또는 핵산의 순서를 결정하는 것을 포함한다. 염기 쌍의 점점 더 긴 서열은 분석되고, 수득된 서열 정보는 단편이 유래된 유전 물질의 넓은 가닥의 서열을 신뢰할 수 있게 결정하기 위한 것과 함께 단편을 논리적으로 맞추기 위하여 다양한 생물정보학 방법에서 사용될 수 있다. 특성화 단편의 자동화된 컴퓨터 기반의 검사가 개발되었고, 게놈 맵핑, 유전자 및 이들의 기능의 동정, 특정한 병태 및 질환 상태의 위험성의 평가 등에서 사용되었다. 특정한 응용에서, 예를 들면, 변형된 표적 핵산은 어레이의 표면 상에서 서열화 또는 증폭 프라이머에 혼성화되고, 증폭되고, 이들의 유전 서열이 결정된다.
다른 예에서, 개별적인 DNA 및 RNA 프로브는 어레이 지지체 상에 기하학적 그리드에서(또는 무작위로) 작은 위치에서 부착될 수 있다. 시험 샘플, 예를 들면, 공지된 인간 또는 유기체로부터의 시험 샘플은 상보적 단편이 어레이의 개별적인 부위에서 프로브에 혼성화되도록 그리드에 노출될 수 있다. 그 다음, 어레이는 부위에 대한 광의 특이적인 빈도를 스캐닝함으로써 단편이 혼성화되는 부위의 형광성에 의해, 단편이 샘플 중에 존재하는지를 확인할 수 있다.
핵산-작용화된 어레이의 적절한 기능성 및 재생력은 이에 결합된 핵산 서열의 일정한 디스플레이에 따라 좌우된다. 본 출원은 어레이 표면 상의 핵산 서열의 일정한 증착 및 서열의 유지 후, 어레이의 후속적인 제조 및 저장을 보장하는 품질 제어 조성물, 어레이, 및 방법에 관한 것이다.
소정의 양상에 있어서, 본 개시내용은 복수의 개별 웰을 포함하는 지지체, 복수의 개별 웰의 각각 내에 위치한 겔 물질, 및 복수의 개별 웰의 각각 내의 겔 물질에 그래프팅된 품질 제어 트레이서를 포함하는 어레이에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 겔 물질에 그래프팅된 품질 제어 트레이서는 (a) 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 검출 가능한 표지를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 품질 제어 트레이서는 트레이서의 제1 말단에서 겔 물질에 그래프팅된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 그래프팅된 영역을 포함하고, 여기서 제1 말단은 겔 물질에 그래프팅되고, 제2 말단은 검출 가능한 표지에 연결되고 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 영역에 연결된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 비-반응성 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 몇몇 경우, 그래프팅된 영역은 비-반응성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 몇몇 경우, 그래프팅된 영역은 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 검출 가능한 표지는 절단 부위에서 품질 제어 트레이서 또는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열에 연결된다. 다른 실시형태에 있어서, 검출 가능한 표지는 절단 부위 및 그래프팅된 제1 말단에 원위인 위치에서 품질 제어 트레이서 또는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열에 연결되고(예를 들면, 지지체 - 트레이서의 그래프팅된 제1 말단 - 트레이서의 절단 부위 - 트레이서 상의 검출 가능한 표지), 추가의 실시형태에 있어서, 그 위치는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열의 3' 말단이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 검출 가능한 표지는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열의 3' 말단에서 또는 근처에서 부착된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 이의 5' 말단에서 겔 물질에 그래프팅된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 검출 가능한 표지는 품질 제어 트레이서와 엑소뉴클레아제의 반응에 의해 절단 가능하다. 다른 실시형태에 있어서, 검출 가능한 표지는 품질 제어 트레이서와 글리코실라제 및 엔도뉴클레아제의 반응에 의해 절단 가능하다.
몇몇 실시형태에 있어서, 절단 부위는 절단 가능한 핵염기이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 절단 가능한 핵염기는 효소적으로 절단 가능한 핵염기이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 효소적으로 절단 가능한 핵염기는 절제 부위를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 절단 가능한 핵염기는 글리코실라제 및 엔도뉴클레아제와의 반응, 또는 엑소뉴클레아제와의 반응에 의해 절단되기 쉽다. 몇몇 실시형태에 있어서, 절단 부위는 화학적으로 절단 가능한 연결기를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 화학적으로 절단 가능한 연결기는 이웃한 다이올, 다이설파이드, 실란, 아조벤젠, 광절단 가능한 기, 또는 아지도를 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 검출 가능한 표지는 형광성 표지이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 품질 제어 트레이서는 (a) 이의 3' 말단에서 형광성 표지로 태깅된 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열 또는 (b) 이에 부착된 형광성 표지를 갖는 절단 가능한 핵염기를 포함하는 비-반응성 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 몇몇 양상에 있어서, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서를 갖는 어레이는 복수의 개별 웰의 각각 내의 겔 물질에 그래프팅된 표지화되지 않은 프라이머를 더 포함하고, 여기서 프라이머는 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이러한 어레이는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에서 사용이 고려된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 품질 제어 트레이서는 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않고, 어레이는 복수의 개별 웰의 각각에서 겔 물질에 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 표지화되지 않은 프라이머를 더 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 품질 제어 트레이서 및 표지화되지 않은 프라이머(및 따라서, 프라이머 뉴클레오타이드 서열)는 미리 결정된 비율로 겔 물질 상에 존재한다.
본 출원은 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도 및/또는 분포를 결정하는 방법으로서, 복수의 개별 웰을 포함하는 지지체 및 복수의 개별 웰의 각각 내에 위치한 겔 물질 및 품질 제어 트레이서 및 복수의 개별 웰의 각각 내의 겔 물질에 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 단계로서, 품질 제어 트레이서가 (a) 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 검출 가능한 표지를 포함하는 단계; 및 검출 가능한 표지로부터 신호를 검출하는 단계; 검출 가능한 표지로부터 신호를 적어도 부분적으로 기반으로 하는 품질 제어 트레이서의 밀도 및/또는 분포를 결정하는 단계; 및 결정된 품질 제어 트레이서의 밀도 및/또는 분포를 적어도 부분적으로 기반으로 하는 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도 및/또는 분포를 결정하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 방법은 품질 제어 트레이서를 겔 물질에 그래프팅하는 단계를 더 포함한다. 몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 비-반응성 뉴클레오타이드 서열을 포함하고(프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않고), 품질 제어 트레이서의 그래프팅 전에 또는 동시에, 그리고 검출 단계 전에 프라이머 뉴클레오타이드 서열은 겔 물질에 그래프팅된다. 다른 실시형태에 있어서, 품질 제어 트레이서의 그래프팅이 트레이서 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열 둘 다를 겔 물질에 그래프팅하는데 도움이 되도록, 품질 제어 트레이서는 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 품질 제어 트레이서 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열은 미리 결정된 비율로 겔 물질에 그래프팅되고, 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도 및/또는 분포의 결정은 검출된 신호 및 미리 결정된 비율을 기반으로 한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 방법은 절단 부위에서 절단 반응에 의해 검출 가능한 표지를 품질 제어 트레이서로부터 제거하는 단계를 더 포함한다. 몇몇 경우, 제거는 효소 절단 또는 화학 절단에 의해 달성된다. 몇몇 경우, 제거는 절단 부위에서 글리코실라제 및 엔도뉴클레아제와의 반응 또는 엑소뉴클레아제와의 반응에 의해 수행된다. 다른 경우, 제거는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열을 검출 가능한 표지에 부착하는 연결기 분자의 화학 반응에 의해 달성된다.
본 명세서에 개시된 방법의 예에서, 품질 제어 트레이서는 지지체 상의 웰 내의 겔 물질에 그래프팅된다. 품질 제어 트레이서는, 예를 들면, 형광성을 사용하여 검출되고, 여기서 검출 가능한 표지는 형광성 표지이고, 검출된 신호 또는 형광성을 적어도 부분적으로 기반으로 하여, 겔 물질에 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도, 또는 분포, 또는 밀도 및 분포가 결정된다. 몇몇 양상에 있어서, 방법은 품질 제어 트레이서를 지지체 상의 웰 내의 겔 물질에 그래프팅하는 단계, 형광성을 사용하여 품질 제어 트레이서를 검출하는 단계, 및 형광성을 적어도 부분적으로 기반으로 하여 겔 물질에 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도, 또는 분포, 또는 밀도 및 분포를 결정하는 단계를 포함한다. 몇몇 양상에 있어서, 방법은 검출 가능한 표지를 절단 부위에서 품질 제어 트레이서로부터 절단하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 양상에 있어서, 본 개시내용은 품질 제어 트레이서 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 어레이에 공동-그래프팅(co-grafting)하는 방법으로서, 품질 제어 트레이서 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 미리 결정된 비율로 조합하여 그래프팅 혼합물을 형성하는 단계; 그래프팅 혼합물을 지지체 상의 웰 내의 겔 물질에 노출시키는 단계; 및 그래프팅 혼합물 및 겔 물질을 배양하여, 품질 제어 트레이서 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 겔 물질에 공동-그래프팅하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 이의 3' 말단에서 형광성 표지로 태깅된 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열 또는 절단 가능한 핵염기에 부착된 형광성 표지를 갖는 비-반응성 뉴클레오타이드 서열이다. 몇몇 양상에 있어서, 방법은 검출 가능한 표지로부터 신호를 검출함으로써 그래프팅된 품질 제어 트레이서를 검출하는 단계; 및 검출된 신호 및 미리 결정된 비율을 적어도 부분적으로 기반으로 하여, 겔 물질에 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도, 또는 분포, 또는 밀도 및 분포를 결정하는 단계를 더 포함한다. 몇몇 양상에 있어서, 그래프팅된 품질 제어 트레이서는 형광성을 사용하여 검출되고, 형광성 및 미리 결정된 비율을 적어도 부분적으로 기반으로 하여, 겔 물질에 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도, 또는 분포, 또는 밀도 및 분포가 결정된다. 추가의 양상에 있어서, 그 다음, 공동-그래프팅된 겔 물질을 포함하는 지지체는 본 명세서에 기재된 바와 같은 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도 및/또는 분포를 결정하는 방법에서 사용된다. 다른 양상에 있어서, 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 절단 부위에서 효소 절단 또는 화학 절단을 통해 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열로부터 검출 가능한 표지를 제거하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 양상에 있어서, 본 개시내용은 품질 제어 트레이서를 어레이에 그래프팅하는 방법으로서, 품질 제어 트레이서를 지지체 상의 웰 내의 겔 물질에 그래프팅하는 단계를 포함하고, 여기서 품질 제어 트레이서는 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열 및 검출 가능한 표지를 포함하고, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 그래프팅된 영역을 포함하고, 제1 말단은 겔 물질에 그래프팅되고, 제2 말단은 검출 가능한 표지에 연결되고 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 영역에 연결되는 방법에 관한 것이다. 몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 그래프팅된 영역에서, 즉, 품질 제어 트레이서 그래프팅된 영역의 그래프팅된 제1 말단과 절단 부위 사이에 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이 배열에서, 절단 부위에서 절단은 겔 물질에 그래프팅된 표지화되지 않은 프라이머 서열을 남긴다. 몇몇 양상에 있어서, 방법은 본 명세서에 기재된 절단 방법에 따라, 절단 부위에서 품질 제어 트레이서를 절단하여, 겔 물질에 그래프팅된 검출 가능한 표지가 없는 프라이머 서열을 제공하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 양상에 있어서, 본 발명은 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 및 품질 제어 트레이서를 포함하는 그래프팅 혼합물에 관한 것이고, 여기서 프라이머 및 품질 제어 트레이서는 혼합물 중에 미리 결정된 비율로 존재한다.
본 발명의 개시내용의 예의 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 도면을 참조하여 자명해질 것이고, 여기서 비슷한 참조 번호는 동일하지는 않지만 유사한 구성원에 해당한다. 간결성을 위하여, 참조 번호 또는 미리 기재된 기능을 갖는 특징부는 이들이 나타난 다른 도면과 연결하여 기재될 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
도 1은 본 발명의 개시내용에 따른 예시적인 어레이의 도식적인 묘사이고, 이는 어레이의 전체 배치를 도시하고 개별적인 부위의 배열을 설명한 도면;
도 2A 내지 도 2D는 어레이를 형성하는 방법의 예를 함께 도시하는 단면도;
도 3A 내지 도 3D는 본 명세서에 개시된 품질 제어 트레이서의 상이한 예의 도식적인 도면;
도 4는 연결기 분자를 포함하는 품질 제어 트레이서의 몇몇 예 및 연결기 분자를 절단하는데 사용될 수 있는 화학물질의 예를 도시한 도면;
도 5는 품질 제어 방법의 예를 도시하는 흐름도;
도 6A 및 도 6B는, 각각, 프라이머에 그래프팅되고 상보적 염료-함유 올리고뉴클레오타이드(TET QC)와 혼성화된 제어 플로우 셀의 형광 이미지 및 본 명세서에 개시된 품질 제어 트레이서의 예에 그래프팅된 플로우 셀의 형광 이미지;
도 6C는 도 5A 및 도 5B의 그래프팅된 표면에 있어서 품질 제어 트레이서 형광성 대 TET 형광성을 도시하는 그래프;
도 7A 및 도 7B는, 각각, 본 명세서에 개시된 품질 제어 트레이서의 예와 그래프팅된 플로우 셀의 초기 형광 이미지(클러스터 발생 전) 및 클러스터 형성-후 형광 이미지(클러스터 발생 후)를 도시한 도면;
도 8A 및 도 8B는 도 7A 및 도 7B의 그래프팅된 플로우 셀에 있어서, 각각, 품질 제어 트레이서 형광성 그래프팅-후의 플롯 및 품질 제어 트레이서 형광성 클러스터 형성-후의 플롯을 나타낸 도면;
도 9A 및 도 9B는 도 7A 및 도 7B의 그래프팅된 플로우 셀을 사용하는 하나의 서열화 주기(C1) 후, 적색 채널에 있어서, 각각, 리드 1(R1) 형광성 강도의 플롯 및 리드 2(R2) 형광성 강도의 플롯을 나타낸 도면;
도 10A 및 도 10B는 도 7A 및 도 7B의 그래프팅된 플로우 셀을 사용하는 하나의 서열화 주기(C1) 후, 녹색 채널에 있어서, 각각, 리드 1(R1) 형광성 강도의 플롯 및 리드 2(R2) 형광성 강도의 플롯을 나타낸 도면;
도 11A 및 도 11B는 도 7A 및 도 7B의 그래프팅된 플로우 셀에 있어서, 참조 게놈에 대하여, 각각, 리드 1(R1) 서열 정렬의 플롯 및 리드 2(R2) 서열 정렬의 플롯을 나타낸 도면;
도 12A 및 도 12B는 각각 도 7A 및 도 7B의 그래프팅된 플로우 셀에 있어서 리드 1(R1) 서열화 착오율의 플롯 및 리드 2(R2) 서열화 착오율의 플롯을 나타낸도면.
본 명세서에서 사용되는 용어는, 달리 특정되지 않는 한, 관련 분야에서 이들의 일반적인 의미를 가질 것으로 이해된다. 본 명세서에서 사용되는 몇몇 용어 및 이들의 의미는 하기 기재된다.
단수형 표현은, 맥락에서 달리 명확하게 기재되지 않는 한, 복수의 대상을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "알킬"은 완전히 포화된(즉, 이중 또는 삼중 결합을 함유하지 않는) 직쇄 또는 측쇄 탄화수소를 지칭한다. 알킬기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 예시적인 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, 3급 부틸, 펜틸, 헥실 등을 포함한다. 예로서, 명칭 "C1-4 알킬"은 알킬 쇄에 1 내지 4개의 탄소 원자가 있다는 것, 즉, 알킬 쇄가 메틸, 에틸, 프로필, 아이소-프로필, n-부틸, 아이소부틸, sec-부틸, 및 t-부틸로 이루어진 군으로부터 선택된다는 것을
알킬은 할라이드 또는 할로겐으로 치환될 수 있고, 이는 원소 주기율표의 7족의 방사선-안정성 원자, 예를 들면, 플루오린, 염소, 브로민, 또는 요오드 중 임의의 하나를 의미한다. 이러한 기는 "알킬 할라이드"로 지칭된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "알켄일" 또는 "알켄"은 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소를 지칭한다. 알켄일기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 예시적인 알켄일 기는 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐 등을 포함한다. 알켄일 기는. 예를 들면, 알켄일 쇄에 2 내지 4개의 탄소 원자가 있다는 것을 나타내는 "C2-4 알켄일"으로 지정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "알킨일" 또는 "알킨"은 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 직쇄 또는 측쇄 탄화수소를 지칭한다. 알킨 기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 알킨기는, 예를 들면, 알킨쇄에 2 내지 4개의 탄소 원자가 있다는 것을 나타내는 "C2-4 알킨일"로 지정된다.
"아미도" 작용기는 을 지칭하고, 여기서 R은 형광성 표지에 부착될 수 있는 임의의 기이고, R'은 H이고, R"은 뉴클레오타이드 서열에 부착될 수 있는 임의의 기이다.
"아미노" 작용기는 -NRaRb 기를 지칭하고, 여기서 Ra 및 Rb는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 수소, C1-6 알킬, C2-6 알켄일, C2-6 알킨일, C3-7 카보사이클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴, 및 5-10원 헤테로사이클릴로부터 각각 독립적으로 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "아릴"은 고리 골격에 오직 탄소만을 함유하는 방향족 고리 또는 고리계(즉, 2개의 인접한 탄소 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)을 지칭한다. 아릴이 고리계인 경우, 시스템의 모든 고리는 방향족이다. 아릴 기는 6 내지 18개의 탄소 원자를 가질 수 있고, C6-18로 지정될 수 있다. 아릴 기의 예는 페닐, 나프틸, 아줄레닐, 및 안트라세닐을 포함한다.
"아자이드" 또는 "아지도" 작용기는 -N3을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "부착된"은 2개의 것의 상태가 서로 이어지거나 묶이거나 접착되거나 연결되거나 결합되는 것을 지칭한다. 예를 들면, 핵산은 공유 또는 비공유 결합에 의해 물질, 예를 들면, 겔 물질에 부착될 수 있다. 공유 결합은 원자 사이에 전장 쌍을 공유하는 것을 특징으로 한다. 비공유 결합은 전자 쌍의 공유를 포함하지 않고, 예를 들면, 수소 결합, 이온 결합, 반데르발스 힘, 친수성 상호작용 및 소수성 상호작용을 포함할 수 있는 화학 결합이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "카보사이클릴"은 고리 골격에 탄소 원자를 함유하는 고리 또는 고리계를 의미한다. 카보사이클릴이 고리계인 경우, 2개 이상의 고리는 융합되거나 브리징되거나 스피로-연결된 방식으로 함께 연결될 수 있다. 카보사이클릴은 얼마든지 포화를 가질 수 있고, 단, 고리계의 적어도 하나의 고리는 방향족이 아니다. 따라서, 카보사이클릴은 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 및 사이클로알킨일을 포함한다. 카보사이클릴기는 3 내지 20개의 탄소 원자(즉, C3-20)를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "사이클로알켄일" 또는 "사이클로알켄"은 적어도 하나의 이중 결합을 갖는 카보사이클릴 고리 또는 고리계를 의미하고, 여기서 고리계의 고리는 방향족이 아니다. 예는 사이클로헥세닐 또는 사이클로헥센 및 노보넨 또는 노보닐()을 포함한다. 또한 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "헤테로사이클로알켄일" 또는 "헤테로사이클로알켄"은 고리 골격에서 적어도 하나의 헤테로원자를 갖고, 적어도 하나의 이중 결합을 갖는 카보사이클릴 고리 또는 고리계를 의미하고, 여기서 고리계의 고리는 방향족이 아니다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "사이클로알킨일" 또는 "사이클로알킨"은 적어도 하나의 삼중 결합을 갖는 카보사이클릴 고리 또는 고리계를 의미하고, 여기서 고리계의 고리는 방향족이 아니다. 예는 사이클로옥틴()이다. 또 다른 예는 바이사이클로노닌(즉, 바이사이클릭 고리계, 예를 들면, )이다. 또한 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "헤테로사이클로알킨일" 또는 "헤테로사이클로알킨"은 고리 골격에서 적어도 하나의 헤테로원자를 갖는 카보사이클릴 고리 또는 고리계를 의미하고, 여기서 고리계의 고리는 방향족이 아니다.
용어 "화학 절단"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 품질 제어 트레이서 또는 이의 부분을 지지로부터 제거하는 화학 반응을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "절단 가능한 뉴클레오타이드 서열"은 절제 부위 또는 연결기 분자에서 파괴될 수 있는 단일 가닥 핵산 서열을 지칭한다.
용어 "각각"은 물품의 집합을 참조하여 사용되는 경우 집합 중의 개별적인 물품을 확인하지만 집합에서 모든 물품을 지칭할 필요는 없다는 것을 의도한다. 분명한 개시내용 또는 맥락이 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 예외가 발생할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효소 절단"은 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제를 이용하여 품질 제어 트레이서 또는 이의 부분을 지지체로부터 제거하는 과정을 지칭한다.
용어 "절제 부위"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 효소에 의해 표적화되는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드의 염기(즉, 핵염기)를 지칭한다. 품질 제어 트레이서 또는 이의 부분은 절제 부위에서 절단될 수 있다. 이러한 절단은 단일 효소 단계 또는 다중 효소 단계(예를 들면, 염기 변형 또는 절제 후 절단)를 포함할 수 있다.
용어 "형광성 표지"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 뉴클레오타이드 서열에 화학적으로 부착되는 형광단을 지칭한다. 형광성 표지는 뉴클레오타이드 서열의 3' 말단, 비-반응성 뉴클레오타이드 서열의 절단 가능한 핵염기, 또는 뉴클레오타이드 서열에 부착되는 연결기 분자에 부착될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "겔 물질"은 액체 및 기체를 투과할 수 있는 반경성 물질을 의미하는 것으로 의도된다. 전형적으로, 겔 물질은 액체를 흡수했을 때 팽창할 수 있고 건조에 의해 액체가 제거되었을 때 수축할 수 있는 하이드로겔이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "그래프팅된"은 공유적으로 결합하고, 단독으로 비-공유 상호작용, 예를 들면, 혼성화를 통해서 부착되지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 몇몇 경우, 품질 제어 트레이서, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열, 비-반응성 뉴클레오타이드 서열, 및/또는 프라이머 또는 프라이머 뉴클레오타이드 서열은 겔 물질 중에 작용기를 갖는 트레이서 또는 서열 상에서 작용기 사이의 공유 결합 형성을 통해 겔 물질에 그래프팅된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "공동-그래프팅"은 하나 이상의 엔티티의 그래프팅을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "헤테로아릴"은 고리 골격에서 하나 이상의 헤테로원자, 즉, 질소, 산소 및 황을 포함하지만 이에 한정되지 않는 탄소가 아닌 원소를 함유하는 방향족 고리 또는 고리계(즉, 2개의 인접한 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)를 지칭한다. 헤테로아릴이 고리계인 경우, 시스템의 모든 고리는 방향족이다. 헤테로아릴 기는 5-18개의 고리 일원을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "헤테로사이클릴"은 고리 골격에서 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 비-방향족 환형 고리 또는 고리계를 의미한다. 헤테로사이클릴은 융합되거나 브리징되거나 스피로-연결된 방식으로 함께 연결될 수 있다. 헤테로사이클릴은 얼마든지 포화를 가질 수 있고, 단, 고리계의 적어도 하나의 고리는 방향족이 아니다. 고리계에서, 헤테로원자(들)는 비-방향족 또는 방향족 고리에 존재할 수 있다. 헤테로사이클릴기는 3 내지 20개의 고리 일원(즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 포함하여 고리 골격을 구성하는 원자의 수)을 가질 수 있다. 헤테로사이클릴기는 "3-6원 헤테로사이클릴" 또는 유사한 명칭으로서 지정될 수 있다. 몇몇 예에서, 헤테로원자(들)는 O, N 또는 S이다.
용어 "하이드라진" 또는 "하이드라지닐"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 -NHNH2 기를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "하이드라존" 또는 "하이드라조닐"은 Ra(Rb)C=N-NH2기를 지칭하고, 여기서 Ra 및 Rb는 본 명세서에서 상기 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "하이드록실"은 -OH기이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "사이 영역"은 기판/지지체 내의 영역 또는 기판 또는 표면의 다른 영역과 분리된 표면 상의 영역을 지칭한다. 예를 들면, 사이 영역은 어레이의 하나의 특징부를 어레이의 또 다른 특징부와 분리할 수 있다. 서로 분리된 2개의 특징부는 개별적일 수 있고, 즉, 서로 접촉하지 않는다. 또 다른 예에서, 사이 영역은 특징부의 제1 부분을 특징부의 제2 부분으로부터 분리할 수 있다. 다수의 예에서, 사이 영역은 연속적인 반면, 특징부는 개별적이고, 예를 들면, 다른 연속 표면에서 정의된 복수의 웰의 경우와 마찬가지이다. 사이 영역에 의해 제공된 분리는 부분적 또는 완전한 분리일 수 있다. 사이 영역은 표면에서 정의된 특징부의 표면 물질과 상이한 표면 물질을 가질 수 있다. 예를 들면, 어레이의 특징부는 사이 영역에 존재하는 양 또는 농도를 초과하지 않는 겔 물질 및 품질 제어 트레이서의 양 또는 농도를 가질 수 있다. 몇몇 예에서, 겔 물질 및 품질 제어 트레이서(들)는 사이 영역에서 존재하지 않을 수 있다.
용어 "연결기 분자"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 하나의 말단에 검출 가능한 또는 형광성 표지에 부착될 수 있는 작용기를 포함하고, 다른 말단에 뉴클레오타이드 서열에 부착될 수 있는 작용기를 포함하는 분자를 지칭한다. 부착점은 공유 결합이다. 유사하게, 용어 "연결된"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 하나 이상의 공유 결합을 통해, 직접적으로 또는 연결기 분자를 통해 연결되는 2개의 엔티티를 지칭한다.
"나이트릴 옥사이드"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "RaC≡N+O-" 기를 의미하고, 여기서 Ra는 수소, C1-6 알킬, C2-6 알켄일, C2-6 알킨일, C3-7 카보사이클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴, 및 5-10원 헤테로사이클릴로부터 선택된다. 나이트릴 옥사이드의 제조의 예는 클로르아마이드-T에 의한 처리에 의하거나 이미도일 클로라이드[RC(Cl)=NOH] 상의 염기의 작용을 통한 알독심으로부터 동일 반응계 발생을 포함한다.
"나이트론"(nitrone)은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "RaRbC=NRc +O-"기를 의미하고, 여기서 Ra 및 Rb는 본 명세서에서 상기 정의되고, Rc는 본 명세서에서 정의된 바와 같이 C1-6 알킬, C2-6 알켄일, C2-6 알킨일, C3-7 카보사이클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴, 및 5-10원 헤테로사이클릴로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "뉴클레오타이드"는 복소환식 염기, 당, 및 하나 이상의 포스페이트기를 함유하는 질소를 포함한다. 뉴클레오타이드는 핵산 서열의 단량체 단위이다. RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서 데옥시리보스, 즉, 리보스에서 2' 위치에 존재하는 하이드록실기가 없는 당이다. 질소 함유 복소환식 염기(즉, 핵염기)는 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기일 수 있다. 퓨린 염기는 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 이의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 피리미딘 염기는 시토신(C), 티민(T), 및 유라실(U), 및 이의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다.
"비-반응성 뉴클레오타이드 서열"은 수행되는 특정한 DNA 또는 RNA 합성에서 활발히 참여하지 않는 임의의 핵산 서열일 수 있다. 몇몇 예에서, 비-반응성 뉴클레오타이드 서열은 품질 제어 트레이서의 일부분을 구성할 수 있다. 예를 들면, 비-반응성 뉴클레오타이드 서열은 또한 절제 부위를 포함하는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열의 부분인 폴리 T 서열 또는 폴리 A 서열일 수 있다. 또 다른 예에서, 비-반응성 뉴클레오타이드 서열은 사용되는 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)에 직교할 수 있고, 따라서 비-반응성 뉴클레오타이드 서열은 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)을 이용하는 DNA 또는 RNA 합성에 참여하지 않을 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "미리 결정된 비율"은 혼합물 중의 2개의 화합물 사이의 비율을 지칭한다. 비율은 혼합물이 제조되기 전에 결정된다. 비율은 혼합물 중의 화합물의 농도 또는 몰 농도의 비율이거나, 혼합되어 혼합물을 구성하는 2개의 구성원의 용액의 부지의 비율이다. 몇몇 양상에 있어서, "미리 결정된 비율"은 겔 물질 상의 트레이서 및 프라이머의 비율을 지칭하고, 이러한 경우, 비율은 겔 물질과 반응된 구성원의 비율을 기반으로 하고, 임의로 2개의 구성원의 임의의 상이한 반응성을 고려한다. 몇몇 양상에 있어서, 트레이서 및 프라이머의 혼합물에 대한 미리 결정된 비율은 프라이머(또는 프라이머 혼합물, 여기서 하나 이상의 프라이머 서열이 사용됨)의 퍼센트 부피로서 설정된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "프라이머 뉴클레오타이드 서열"은 DNA 또는 RNA 합성의 출발점을 제공하는 단일 가닥 핵산 서열(예를 들면, 단일 가닥 DNA 또는 단일 가닥 RNA)로서 정의된다. 서열화 프라이머의 5' 말단은 겔 물질과의 커플링 반응을 허용하도록 변형될 수 있다. 서열화 프라이머 길이는 임의의 수의 염기 길이일 수 있고, 다양한 비-천연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예에서, 서열화 프라이머는 20개의 염기 내지 50개의 염기를 포함하는 짧은 가닥이다.
용어 "태깅되지 않은"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 뉴클레오타이드 서열이 이에 부착된 형광성 표지를 갖지 않는다는 것을 의미한다.
"품질 제어 트레이서"는 뉴클레오타이드 서열 및 뉴클레오타이드 서열에 부착된 형광성 표지를 포함한다. 품질 제어 트레이서의 형광성 표지는 품질 제어 방법으로 검출될 수 있다. 품질 제어 트레이서의 형광성 표지는 또한 제거될 수 있고, 트레이서의 잔여 부분은 서열화 방법에 참여할 수 있거나 서열화 방법 동안 비-반응성이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "부위"는 겔 물질 및 품질 제어 트레이서가 부착될 수 있는 지지체 상 또는 내에 정의된 위치를 지칭한다.
용어 "기판" 및 "지지체"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 부위가 위치한 표면을 지칭한다. 지지체는 일반적으로 단단하고, 수성 액체 중에 불용성이다. 지지체는 겔 물질을 변형하는데 사용되는 화학물질에 불활성일 수 있다. 예를 들면, 지지체는 본 명세서에 기재된 방법으로 품질 제어 트레이서를 겔 물질에 부착하는데 사용되는 화학물질에 불활성일 수 있다. 적합한 지지체의 예는 유리 및 변형되거나 작용화된 유리, 플라스틱(아크릴, 폴리스타이렌 및 스타이렌과 다른 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 폴리테트라플루오로에틸렌(예를 들면, 케모우르스(Chemours)로부터의 TEFLON®), 환형 올레핀/사이클로-올레핀 중합체(COP)(예를 들면, 제온(Zeon)으로부터의 ZEONOR®), 폴리이미드 등 포함), 나일론, 세라믹, 실리카 또는 실리카계 물질, 실록산, 실리콘 및 변형된 실리콘, 탄소, 금속, 무기 유리, 및 광학 섬유 번들을 포함한다.
"티올" 작용기는 -SH(예를 들면, )를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "테트라진" 및 "테트라진일"은 4개의 질소 원자를 포함하는 6원 헤테로아릴기를 지칭한다. 테트라진은 임의로 치환될 수 있다.
"테트라졸"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 4개의 질소 원자를 포함하는 5원 복소환식 기를 지칭한다. 테트라졸은 임의로 치환될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "웰"은 지지체 표면의 사이 영역(들)에 의해 완전히 둘러싸인 표면 개구를 갖는 지지체 내의 개별 오목 특징부를 지칭한다. 웰은, 예로서, 원형, 타원형, 사각형, 다각형, 별모양(임의의 수의 정점을 가짐) 등을 포함하는, 표면 내의 이들의 개구에서 임의의 다양한 형상을 가질 수 있다. 표면을 직교하는 웰의 단면은 곡선형, 사각형, 다각형, 쌍곡선형, 원뿔형, 각형 등일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 효소 절단 또는 화학 절단을 통해 절단 가능하다.
몇몇 경우, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 형광성 표지를 부착하는 연결기 분자를 포함하고, 여기서 연결기 분자는 효소 절단 또는 화학 절단을 통해 절단 가능한 잔기를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 연결기 분자는 이웃한 다이올을 포함하고, 화학 절단은 산화 조건, 예를 들면, 과요오드산나트륨(NaIO4)에 의해 달성된다. 다른 실시형태에 있어서, 연결기 분자는 다이설파이드를 포함하고, 화학 절단은 티올 또는 3급 포스핀에 의해 달성되거나; 연결기 분자는 실란이고, 화학 절단은 산 또는 플루오라이드 이온에 의해 달성되거나; 연결기 분자는 아조벤젠이고, 화학 절단은 나트륨 다이티오네이트(Na2S2O4)에 의해 달성되거나; 연결기 분자는 광절단 가능한 기이고, 화학 절단은 광에 의해 달성되거나; 연결기 분자는 아지도이고, 화학 절단은 3급 포스핀에 의해 달성된다. 제2 양상의 또 다른 예에서, 방법은 엑소뉴클레아제를 사용하는 비-반응성 뉴클레오타이드 서열의 절단 가능한 핵염기로부터 형광성 표지를 절단하는 단계를 더 포함한다.
이러한 양상의 하나의 예에서, 품질 제어 트레이서는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 절제 부위를 포함한다. 예에서, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 프라이머 뉴클레오타이드 서열이다.
이러한 특면의 또 다른 예에서, 품질 제어 트레이서는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열이고, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 형광성 표지를 부착하는 연결기 분자를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 연결기 분자는 다이올, 다이설파이드, 실란, 아조벤젠, 광절단 가능한 기, 및 아지도로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다. 이러한 양상의 이러한 또 다른 예에서, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 연결기 분자에 부착된 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 더 포함한다.
이러한 양상의 또 다른 예에서, 품질 제어 트레이서는 비-반응성 뉴클레오타이드 서열이고, 비-반응성 뉴클레오타이드 서열은 절제 부위를 더 포함한다.
어레이의 이러한 양상은 복수의 개별 웰의 각각에서 겔 물질에 그래프팅된 태깅되지 않은 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 더 포함할 수 있고, 여기서 품질 제어 트레이서 및 태깅되지 않은 프라이머 뉴클레오타이드 서열은 미리 결정된 비율로 존재한다.
어레이의 이러한 양상의 임의의 특징은 임의의 바람직한 방식 및/또는 구성으로 함께 조합될 수 있다는 것이 이해된다.
방법의 제1 양상의 예에서, 품질 제어 트레이서는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열이고, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 프라이머 뉴클레오타이드 서열이다. 이러한 예에서, 방법은 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도, 또는 분포, 또는 밀도 및 분포가 결정된 후, 형광성 표지를 프라이머 뉴클레오타이드 서열로부터 절단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
방법의 제1 양상의 또 다른 예에서, 품질 제어 트레이서는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열이고; 프라이머 뉴클레오타이드 서열은 검출 전에 태깅되지 않고; 방법은 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 겔 물질에 그래프팅하는 단계를 더 포함하고; 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열은 미리 결정된 비율로 존재하고; 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도, 또는 분포, 또는 밀도 및 분포을 결정하는 것은 형광성 및 미리 결정된 비율을 기반으로 한다. 방법의 제1 양상의 이러한 다른 예는 형광성 표지를 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열로부터 절단하는 단계를 더 포함할 수 있다. 절단은 효소 절단 및/또는 화학 절단을 통해 달성된다.
방법의 제1 양상의 또 다른 예에서, 품질 제어 트레이서는 비-반응성 뉴클레오타이드 서열이고; 프라이머 뉴클레오타이드 서열은 태깅되지 않고; 검출 전에, 방법은 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 겔 물질에 그래프팅하는 단계를 더 포함하고, 여기서 비-반응성 뉴클레오타이드 서열 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열은 미리 결정된 비율로 존재하고; 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도, 또는 분포, 또는 밀도 및 분포의 결정은 형광성 및 미리 결정된 비율을 기반으로 한다. 방법의 제1 양상의 이러한 다른 예는 엑소뉴클레아제를 사용하여 비-반응성 뉴클레오타이드 서열의 절단 가능한 핵염기로부터 형광성 표지를 절단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
방법의 제1 양상의 임의의 특징은 임의의 바람직한 방식으로 함께 조합될 수 있다는 것이 이해된다. 게다가, 방법의 제1 양상 및/또는 어레이의 특징의 임의의 조합은 함께 사용될 수 있고/있거나 이들 양상의 하나 또는 둘 다로부터의 임의의 특징은 본 명세서에 개시된 임의의 예와 조합될 수 있는 것으로 이해된다.
제2 양상의 하나의 예에서, 방법은 효소 절단 또는 화학 절단을 통해 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열로부터 형광성 표지를 절단하는 단계를 더 포함한다. 제2 양상의 이러한 하나의 예의 몇몇 경우에, 품질 제어 트레이서는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열이고, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 형광성 표지를 부착하는 연결기 분자를 포함하고; 연결기 분자는 다이올를 포함하고, 화학 절단은 과요오드화나트륨(NaIO4)에 의해 달성되거나; 연결기 분자는 다이설파이드를 포함하고, 화학 절단은 티올 또는 3급 포스핀에 의해 달성되거나; 연결기 분자는 실란이고, 화학 절단은 산 또는 플루오라이드 이온에 의해 달성되거나; 연결기 분자는 아조벤젠이고, 화학 절단은 나트륨 다이티오네이트(Na2S2O4)에 의해 달성되거나; 연결기 분자는 광절단 가능한 기이고, 화학 절단은 광에 의해 달성되거나; 연결기 분자는 아지도이고, 화학 절단은 3급 포스핀에 의해 달성된다.
제2 양상의 또 다른 예에서, 방법은 엑소뉴클레아제를 사용하여 비-반응성 뉴클레오타이드 서열의 절단 가능한 핵염기로부터 형광성 표지를 절단하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 이러한 제2 양상의 임의의 특징은 임의의 바람직한 방식으로 함꼐 조합될 수 있다는 것이 이해된다. 게다가, 제1 양상 및/또는 제2 양상의 특징의 임의의 조합은 함께 사용될 수 있고/있거나 이들 양상 중 하나 또는 둘 다로부터의 임의의 특징은 어레이의 임의의 특징 및/또는 본 명세서에 기재된 임의의 예와 조합될 수 있다는 것이 이해된다.
본 명세서에 개시된 어레이의 예는 각각이 겔 물질에 부착된 품질 제어 트레이서의 예를 갖는 몇몇 부위를 포함한다. 품질 제어 트레이서는 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 프라이머 뉴클레오타이드 서열과 함께 미리 결정된 비율로 존재하고, 따라서 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도 및/또는 분포를 결정하는 품질 제어 방법에서 사용될 수 있다. 품질 제어 트레이서는 품질 제어 방법에서 사용될 수 있고 서열화를 방해하지 않도록 트레이서로부터 절단될 수 있는 형광성 표지를 포함한다. 몇몇 예에서 품질 제어 트레이서의 포함은 품질 제어 목적을 위하여 혼성화 및 탈혼성화를 수행할 필요성을 완화시킨다. 본 명세서에 개시된 예는 지지체 상의 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도 및/또는 분포를 서열화 시약 및 샘플을 로딩하지 않고 서열화 작업 흐름에서 초기 단계를 수행하지 않고 평가하는 것을 가능하게 한다.
본 명세서에 기재되고 청구항에 기재된 양상 및 예는 상기 정의의 관점에서 이해될 수 있다.
이제 도 1을 참조하여, 어레이(10)의 예가 도시된다. 일반적으로, 어레이(10)는 기판 또는 지지체(12) 및 지지체(12)를 가로지르는 라인 또는 플로우 채널(14)을 포함한다. 각각의 플로우 채널(14)은 사이 영역(18)에 의해 서로 분리되는 다중 부위(16)를 포함한다. 각각의 부위(16)에서, 적어도 품질 제어 트레이서(22)는 겔 물질(예를 들면, 도 2D에서 24, 24')에 부착된다. 몇몇 경우, 품질 제어 트레이서(22) 이외에, 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')은 또한 겔 물질(24)에 부착된다.
도 1에 도시되고 본 개시내용에서 논의되는 어레이(10)는 플로우 셀에 위치하거나 이의 부분으로서 형성될 수 있고, 이는 이를 가로질러 다양한 담체 유체, 시약 등이 흐를 수 있는 고체 표면을 포함하는 챔버이다. 예에서, 플로우 셀은 밀봉 물질(예를 들면, 블랙 폴리이미드 또는 또 다른 적합한 결합 물질)을 통해 상부 기판에 결합된 어레이(10)를 포함할 수 있다. 결합은 지지체(12), 밀봉 물질, 및 상부 기판의 결합 영역에서 발생한다. 결합 영역은 밀봉 물질이 하나의 흐름 채널(14)을 인접한 흐름 채널(14)과 물리적으로 분리하도록(교차 오염을 방지하기 위하여 플로우 채널 사이에 위치할 수 있고, (외부 오염으로부터 플로우 셀을 밀봉하기 위하여) 플로우 셀의 주변에 위치할 수 있다. 그러나, 결합 영역 및 밀봉 물질은 실시에 따라 임의의 목적하는 영역에 위치할 수 있다는 것이 이해된다. 결합은 레이저 결합, 확산 결합, 양극 결합, 공융 결합, 플라즈마 활성화 결합, 유리 프릿 결합, 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법을 통해 달성될 수 있다.
어레이(10)와 통합될 수 있고/있거나 본 발명의 개시내용의 방법에서 용이하게 사용되는 플로우 셀 및 관련된 유체 시스템 및 검출 플랫폼의 다른 예는, 예를 들면, 문헌[Bentley et al., Nature 456:53-59(2008)], 제WO 04/018497호; 미국 특허 제7,057,026호; 제WO 91/06678호; 제WO 07/123744호; 미국 특허 제7,329,492호; 미국 특허 제7,211,414호; 제7,315,019호; 및 제7,405,281호, 및 미국 특허 공보 제2008/0108082호에 기재되어 있고, 각각은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.
몇몇 응용에서, 플로우 셀은 반응 자동화 장치, 예를 들면, 뉴클레오타이드 시퀀서에서 제어된 화학 또는 생화학 반응을 수행하는데 사용된다. 포트(26)는 지지체(12)를 통해 천공될 수 있다. 포트(26)에 연결함으로써, 반응 자동화 장치는 밀봉된 플로우 채널(14)에서 시약(들) 및 생성물(들)의 흐름을 제어할 수 있다. 반응 자동화 장치는, 몇몇 응용에서, 플로우 셀의 압력, 온도, 기체 조성 및 기타 환경 조건을 조절할 수 있다. 추가로, 몇몇 응용에서, 포트(26)는 상부 기판 또는 지지체(12) 및 상부 기판 둘 다에서 천공될 수 있다. 몇몇 응용에서, 밀봉된 플로우 채널(14)에서 일어나는 반응은 영상화 또는 열 측정, 발광 및/또는 형광성에 의해 상부 기판 및/또는 지지체(12)를 통해 모니터링될 수 있다.
플로우 채널(14), 부위(16) 등의 특정한 방향은 도 1에 도시된 것들과 상이할 수 있다는 것이 이해된다. 몇몇 예에서, 부위(16)는 근접하고, 따라서 사이 영역(18)에 의해 분리될 필요가 없다.
도 1의 어레이(10) 및 어레이(10)이 어떻게 만들어질 수 있는지의 예는 도 2A 내지 도 2D를 참조하여 이제 더 상세히 기재될 것이다.
도 2A는 그 안에 정의되고 사이 영역(18)에 의해 분리된 부위(16)를 갖는 지지체(12)를 도시한다. 이러한 지지체(12)는 패턴화된 표면을 갖는다. "패턴화된 표면"은 고체 지지체(12)의 노출된 층 내의 또는 그 위의 상이한 영역(즉, 부위(16))의 배열을 지칭한다. 예를 들면, 하나 이상의 부위(16)는 하나 이상의 품질 제어 트레이서(22), 및, 몇몇 경우, 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(22)이 존재하는 특징부일 수 있다. 특징부는 사이 영역(18)에 의해 분리될 수 있고, 여기서 품질 제어 트레이서(22) 및 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20)은 존재하지 않는다. 부위(16)의 많은 상이한 레이아웃은 사각형, 반복, 및 비사각형 패턴을 포함하여 구상될 수 있다. 예에서, 부위(16)는 폐쇄 패킹 및 개선된 밀도를 위한 육각형 그리드에 위치한다. 다른 레이아웃은, 예를 들면, 직선형(즉, 직사각형) 레이아웃, 삼각형 레이아웃 등을 포함할 수 있다. 예로서, 레이아웃 또는 패턴은 열과 행이 있는 부위(16)의 x-y 형식일 수 있다. 몇몇 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 부위(16) 및/또는 사이 영역(18)의 반복 배열일 수 있다. 여전히 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 부위(16) 및/또는 사이 영역(18)의 무작위 배열일 수 있다. 패턴은 스팟, 패드, 웰, 포스트, 스트라이프, 스월(swirl), 라인, 삼각형, 직사각형, 원형, 호, 체크, 격자, 대각선, 화살표, 사각형, 및/또는 크로스-해치를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 예에서 사용될 수 있는 패턴화된 표면의 다른 예는 미국 특허 제8,778,849호; 제9,079,148호; 및 제8,778,848호, 및 미국 특허 공보 제2014/0243224호에 기재되고, 각각은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.
레이아웃 또는 패턴은 정의된 면적에서 부위(16)의 밀도(즉, 부위(16)의 수)에 관하여 특성화될 수 있다. 예를 들면, 부위(16)는 약 2백만/㎟의 밀도로 존재할 수 있다. 밀도는, 예를 들면, 적어도 약 100/㎟, 약 1,000/㎟, 약 0.1백만/㎟, 약 1백만/㎟, 약 2백만/㎟, 약 5백만/㎟, 약 10백만/㎟, 약 50백만/㎟, 또는 그 이상의 밀도를 포함하는 상이한 밀도로 조정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 밀도는 약 50백만/㎟, 약 10백만/㎟, 약 5백만/㎟, 약 2백만/㎟, 약 1백만/㎟, 약 0.1백만/㎟, 약 1,000/㎟, 약 100/㎟ 이하, 또는 그 미만으로 조정될 수 있다. 지지체(12) 상의 부위(16)의 밀도는 상기 범위로부터 선택되는 하한 값 중 하나와 상한 값 중 하나 사이일 수 있다는 것이 추가로 이해된다. 예로서, 고밀도 어레이는 약 100㎚ 미만에 의해 분리된 부위(16)를 갖는 것을 특징으로 할 수 있고, 중밀도 어레이는 약 400㎚ 내지 약 1㎛에 의해 분리된 부위(16)를 갖는 것을 특징으로 할 수 있고, 저밀도 어레이는 약 1㎛ 초과에 의해 분리된 부위(16)를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
레이아웃 또는 패턴은 또한 또는 대안적으로 평균 피치의 관점에서, 즉, 부위(16)의 중심으로부터 인접한 사이 영역(18)의 중심까지의 간격(중심-대-중심 간격)을 특징으로 할 수 있다. 패턴은 평균 피치 주변의 변동 계수가 작도록 직사각형일 수 있거나, 패턴이 비-직사각형일 수 있고, 그 경우, 변동 계수가 상대적으로 클 수 있다. 어느 경우든, 평균 피치는, 예를 들면, 적어도 약 10㎚, 약 0.1㎛, 약 0.5㎛, 약 1㎛, 약 5㎛, 약 10㎛, 약 100㎛, 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 평균 피치는, 예를 들면, 최대한 약 100㎛, 약 10㎛, 약 5㎛, 약 1㎛, 약 0.5㎛, 약 0.1㎛, 또는 그 미만일 수 있다. 부위(16)의 특정한 패턴에 대한 평균 피치는 상기 범위로부터 선택된 하한 값 중 하나와 상한 값 중 하나 사이일 수 있다. 예에서, 부위(16)는 약 1.5㎛의 피치(중심-대-중심 간격)을 갖는다.
몇몇 예에서, 부위(16)는 웰(16')이고, 따라서 지지체(12)는 이의 표면에서 웰(16')의 어레이를 포함한다. 웰(16')(또는 상이한 구성, 예를 들면, 형상, 단면 등을 갖는 다른 부위(16))은, 예를 들면, 사진석판술, 나노임프린트 리소그래피, 스탬핑 기술, 엠보싱 기술, 성형 기술, 마이크로에칭 기술, 인쇄 기술 등을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 조작될 수 있다. 당해 분야의 것들에 의해 인식될 것인 바와 같이, 사용되는 기술은 지지체(12)의 조성 및 형상에 따라 좌우될 것이다.
웰(16')은 마이크로웰(미크론 규모, 예를 들면, 약 1㎛ 내지 약 1000㎛에서 적어도 하나의 치수를 갖는) 또는 나노웰(나노규모, 예를 들면, 약 1㎚ 내지 약 1000㎚에서 적어도 하나의 치수를 갖는)일 수 있다. 각각의 웰(16')은 이의 부피, 웰 개방 면적, 깊이, 및/또는 직경을 특징으로 할 수 있다.
각각의 웰(16')은 액체를 국한할 수 있는 임의의 부피를 가질 수 있다. 최소 또는 최대 부피는, 예를 들면, 어레이(10)의 다운스트림 사용에 대하여 예상되는 처리량(예를 들면, 다중방식), 분할, 분석물 조성물, 또는 분석물 반응성을 수용하기 위하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 부피는 적어도 약 1×10-3㎛3, 약 1×10-2㎛3, 약 0.1㎛3, 약 1㎛3, 약 10㎛3, 약 100㎛3, 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 부피는 최대한 약 1×104㎛3, 약 1×103㎛3, 약 100㎛3, 약 10㎛3, 약 1㎛3, 약 0.1㎛3, 또는 그 미만일 수 있다. 겔 물질(24)은 웰(16')의 부피의 모두 또는 부분을 채울 수 있다는 것이 이해된다. 개별적인 웰(16')에서 겔 물질(24)의 부피는 상기 특정된 값보다 크거나, 작거나, 그 사이일 수 있다.
표면 상의 각각의 웰 개구에 의해 점유된 면적은 웰 부피에 대하여 상기 기재된 것들과 유사한 기준을 기반으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 표면 상의 각각의 웰 개구에 대한 면적은 적어도 약 1×10-3㎛3, 약 1×10-2㎛3, 약 0.1㎛3, 약 1㎛3, 약 10㎛3, 약 100㎛3, 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 면적은 최대한 약 1×103㎛3, 약 100㎛3, 약 10㎛3, 약 1㎛3, 약 0.1㎛3, 약 1×10-2㎛3 또는 그 미만일 수 있다.
각각의 웰(16')의 깊이는 적어도 약 0.1㎛, 약 1㎛, 약 10㎛, 약 100㎛, 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 깊이는 최대한 약 1×103㎛, 약 100㎛, 약 10㎛, 약 1㎛, 약 0.1㎛, 또는 그 미만일 수 있다.
몇몇 경우, 각각의 웰(16')의 직경은 적어도 약 50㎚, 약 0.1㎛, 약 0.5㎛, 약 1㎛, 약 10㎛, 약 100㎛, 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 직경은 최대한 약 1×103㎛, 약 100㎛, 약 10㎛, 약 1㎛, 약 0.5㎛, 약 0.1㎛, 약 50㎚, 또는 그 미만일 수 있다.
형성된 어레이(10)에서, 겔 물질(24)은 각각의 개별 웰(16')에 위치한다. 각각의 웰(16')에서 겔 물질(24)의 위치는 도 2B에 도시된 바와 같이 지지체(12)의 패턴화된 표면을 겔 물질(24)로 제1 코팅하고, 겔 물질(24)을, 예를 들면, 화학 또는 기계적 연마를 통해, 적어도 웰(16') 사이의 건설된 지지체(12)의 표면 상의 사이 영역(18)으로부터 제거함으로써 달성될 수 있다. 이들 과정은 웰(16')에서 적어도 몇몇의 겔 물질(24)을 유지하지만, 적어도 실질적으로 모든 겔 물질(24)을 웰(16') 사이의 건설된 지지체(12)의 표면 상의 사이 영역(18)으로부터 제거하거나 불활성화한다. 마찬가지로, 이들 과정은 많은 수의 주기를 갖는 서열화 작동에 대하여 안정할 수 있는 서열화에 사용되는 겔 패드(24')(도 2D)를 생성한다.
특히 유용한 겔 물질(24)은 이것이 거주하는 부위(16)의 형상을 확인할 것이다. 몇몇 유용한 겔 물질(24)은 (a) 이것이 거주하는 부위(16)의 형상(예를 들면, 웰(16') 또는 기타 오목 특징부)을 확인할 수 있고, (b) 이것이 거주하는 부위(16)의 부피를 적어도 실질적으로 초과하지 않는 부피를 가질 수 있다.
적합한 겔 물질(24)의 하나의 예는 화학식 (I)로 대표되는 중합체를 포함한다:
식 중,
R1은 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
R A 는 아지도, 임의로 치환된 아미노, 임의로 치환된 알켄일, 임의로 치환된 하이드라존, 임의로 치환된 하이드라진, 카복실, 하이드록시, 임의로 치환된 테트라졸, 임의로 치환된 테트라진, 나이트릴 옥사이드, 나이트론, 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되고; R5는 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 -(CH2)p-는 임의로 치환될 수 있고;
p는 1 내지 50 범위의 정수이고;
n은 1 내지 50,000 범위의 정수이고;
m은 1 내지 100,000 범위의 정수이다.
화학식 (I)의 구조에서, 당해 분야의 숙련가는 "n" 및 "m" 하위단위가 중합체 전체에서 무작위 순서로 존재하는 순환하는 하위단위라는 것으로 이해할 것이다. 당해 분야의 숙련가는 또한 기타 단량체 구성원이 중합체에 존재할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
겔 물질(24)의 특정한 예는 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아마이드-코-아크릴아마이드("PAZAM")(예를 들면, 미국 특허 공보 제2014/0079923 A1호 및 제2015/0005447 A1호에 기재되고, 각각은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)이고, 이는 하기 구조를 포함한다:
식 중, n은 1 내지 20,000 범위의 정수이고, m은 1 내지 100,000 범위의 정수이다. 화학식 (I)과 같이, 당해 분야의 숙련가는 "n" 및 "m" 하위단위가 중합체 구조 전체에서 무작위 순서로 존재하는 순환하는 하위단위라는 것으로 이해할 것이다.
PAZAM의 분자량은 약 10 kDa 내지 약 1500 kDa 범위일 수 있거나, 특정한 예에서, 약 312 kDa일 수 있다.
몇몇 예에서, PAZAM은 선형 중합체이다. 몇몇 다른 실시형태에 있어서, PAZAM은 가볍게 가교결합된 중합체이다. 다른 예에서, PAZAM은 분지를 포함한다.
적합한 겔 물질(24)의 다른 예는 콜로이드성 구조를 갖는 것들, 예를 들면, 아가로스; 또는 중합체 매쉬 구조, 예를 들면, 젤라틴; 또는 가교결합된 중합체 구조, 예를 들면, 폴리아크릴아마이드 중합체 및 공중합체, 실란 무함유 아크릴아마이드(SFA, 예를 들면, 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함되는 미국 특허 공보 제2011/0059865호 참조), 또는 SFA의 아지도화 버전을 포함한다. 적합한 폴리아크릴아마이드 중합체의 예는, 예를 들면, 제WO 2000/031148호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이 아크릴아마이드 및 아크릴산 또는 비닐 기를 함유한 아크릴산으로부터 형성될 수 있거나, 예를 들면, 제WO 2001/001143호 또는 제WO 2003/0014392호(각각 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이 [2+2] 광-고리화첨가 반응을 형성하는 단량체로부터 형성될 수 있다.
겔 물질(24)은 미리 형성된 겔 물질일 수 있다. 미리 형성된 겔 물질은 스핀 코팅, 또는 침지, 또는 양압 또는 부압하에 겔의 흐름, 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함되는 미국 특허 제9,012,022호에 기재된 기술을 사용하여 코팅될 수 있다. 침지 또는 딥 코팅은 사용되는 지지체(12) 및 겔 물질(24)에 따라 선택적 증착 기술일 수 있다. 예로서, 패턴화된 지지체(12)는 미리 형성된 겔 물질(24)에 침지되고, 겔 물질(24)은 부위(16)를 선택적으로 채울 수 있고(즉, 겔 물질(24)은 사이 영역(18)에 위치하지 않음), 연마(또는 또 다른 제거 공정)는 필요하지 않을 수 있다.
미리 형성된 PAZAM은 스핀 코팅, 또는 침지, 또는 양압 또는 부압하에 겔의 흐름, 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함되는 미국 특허 제9,012,022호에 기재된 기술을 사용하여 패턴화된 지지체(12) 상에 코팅될 수 있다. PAZAM의 부착은 또한 공유 결합을 형성하는 화학 반응에 의해, 또는 실란화된 표면으로의 표면 개시된 원자 이동 라디칼 중합(SI-ATRP)을 통해 발생할 수 있다.
몇몇 예에서, 지지체 표면은 알켄-유도체화된 실란으로 처리되고, 여기서 알켄 부분은 선형, 분지형, 또는 환형일 수 있다. 몇몇 예에서, 실란 시약은 (RO)3Si-연결기-알켄이고, 다른 예에서, 실란 시약은 (RO)3Si-C2-6알킬렌-사이클로알켄이고, 다른 예에서, 실란 시약은 (RO)3Si-CH2CH2-보노넨이고, 여기서 각각의 R은 C1-4알킬 또는 메틸 또는 에틸이다. 겔 물질(24), 예를 들면, PAZAM은 열 또는 uv 조건하에 알켄-유도체화된 실란에 공유 결합된다.
다른 예에서, 지지체(12) 표면은 아미노-유도체화된 실란, 예를 들면, 아미노프로필-트라이알콕시실란(APTS), 예를 들면, 3-아미노프로필-트라이메톡시실란(APTMS) 또는 3-아미노프로필-트라이에톡시실란(APTES)으로 미리 처리하여 규소를 표면 상의 하나 이상의 산소 원자에 공유 결합시킬 수 있다(메커니즘에 의해 유지되는 것을 의도하지 않고, 각각의 규소는 1, 2 또는 3개의 산소 원자에 결합될 수 있음). 이러한 화학적으로 처리된 표면을 베이킹하여 아민기 단층을 형성한다. 그 후, 아민기를 설포-HSAB와 반응시켜 아지도 유도체를 형성한다. 21℃에서 1 J/㎠ 내지 30 J/㎠의 에너지의 UV 활성화는 활성 니트렌 종을 발생시키고, 이는 PAZAM과의 다양한 삽입 반응을 겪을 수 있다.
지지체(12) 상의 PAZAM 코팅에 대한 다른 예는 미국 특허 공보 제2014/0200158호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재되어 있고, PAZAM 단량체의 아민-작용화된 표면의 자외선(UV) 매개된 연결, 또는 PAZAM의 후속적인 증착 및 열의 적용에 의한 활성 기(아크릴로일 클로라이드 또는 다른 알켄 또는 알킨-함유 분자)를 포함하는 열 연결 반응을 포함한다.
겔 물질(24)은 겔 물질(24)을 후속적으로 형성하는 액체를 적용함으로써 형성될 수 있다. 겔 물질(24)을 후속적으로 형성하는 적용 액체의 예는 액체 형태의 실란-무함유 아크릴아마이드 및 N-[5-(2-브로모아세틸)아미노펜틸]아크릴아마이드(BRAPA)로 부위(16)의 어레이의 코팅 및 시약이 표면 상에 중합에 의해 겔을 형성하도록 하는 것이다. 이러한 방식의 어레이 코팅은 미국 특허 공보 제2011/0059865호에 기재된 바와 같은 화학 시약 및 과정을 사용할 수 있다.
겔 물질(24)은 지지체(12)(부위(16)에서)에 공유 결합될 수 있거나 지지체(12)에 공유 결합되지 않을 수 있다. 중합체의 부위(16)에 대한 공유 결합은 다양한 사용 동안 어레이(10)의 수명 전체에서 겔을 건설된 부위(16)에 유지하는데 도움이 된다. 그러나, 상기 기재된 바와 많은 예시에서, 겔 물질(24)은 부위(16)에 공유 결합될 필요가 없다. 예를 들면, 실란 무함유 아크릴아마이드, SFA는 지지체(12)의 어떠한 부분에도 공유적으로 부착되지 않는다.
상기 언급된 바와 같이, 도 2C는 겔 물질(24)의 사이 영역(18)으로부터의 제거를 도시한다. 제거는 연마를 통해 달성될 수 있다. 연마는 기계적 및/또는 화학적 처리 공정일 수 있다.
기계적 연마는 고체 지지체(12)(그 위에 겔 물질(24)을 가짐)의 표면에 연마재 힘을 적용함으로써 수행될 수 있다. 예시적인 방법은 비드의 슬러리, 시트 또는 천으로 닦기, 긁기 등에 의한 연마를 포함한다. 연마에 사용되는 비드는 구형일 수 있거나 아닐 수 있으며, 불규칙적인 형상, 다각형 형상, 타원형 형상, 길쭉한 형상, 원통형 형상 등을 가질 수 있다고 이해될 것이다. 비드의 표면은 부드럽거나 거칠 수 있다. 임의의 다양한 입자가 연마용 비드로서 유용할 수 있다. 연마의 하나의 예는 3㎛ 실리카 비드 슬러리(물 중의 10% w/v)로 코팅된 린트리스(lintless)(청정실 등급) 와이프를 사용하여 겔 물질(24)을 사이 영역(18)으로부터 제거하는 것을 포함한다. 연마 휠/그라인더는 또한 이러한 슬러리와 함께 사용될 수 있다. 기계적인 연마는 또한 유체 제트 또는 기체(예를 들면, 공기 또는 비활성 기체, 예를 들면, 아르곤 또는 질소) 제트를 사용하여 겔을 사이 영역(18)으로부터 제거하여 달성될 수 있다.
화학적 연마 기술, 예를 들면, 아크릴아마이드의 가수분해 또는 라디칼 기반 분해(예를 들면, 과산화벤조일 또는 희석된 과산화수소에 대한 노출을 통해)가 사용될 수 있다. 연마의 이러한 형태 동안, 화학물질은 고체, 액체, 기체 또는 플라즈마 상태로 제공될 수 있다. 따라서, 플라즈마 연마는 몇몇 예에서 유용할 수 있다.
연마는 또한 화학적 및 기계적 연마 방법의 조합을 포함할 수 있고, 여기서 입자의 콜로이드성 현탁액을 함유하는 화학적 슬러리는 기계적으로 박리한 다음, 겔 물질(24)의 나타난 부분을 사이 영역(18)으로부터 화학적으로 용해시키는데 사용될 수 있다.
사이 영역(18)을 연마하거나 세정하는 다른 방법은 접착제 기반 기술, 예를 들면, 겔 물질(24)에 친화력을 갖는 단단하고 평면인 접착제 필름을 적용하고, 이로써 사이 영역(18)에서 겔 물질(24)과 친밀한 접촉(예를 들면, 화학적 연결을 통해)을 만드는 기술을 포함한다. 이러한 접착제 필름의 기계적 제거/박리는 겔 물질(24)의 사이 영역(18)으로부터의 기계적 제거를 야기할 것이고, 겔 물질(24)은 부위(16)에 남는다.
하나의 예에서, 티오포스페이트-그래프팅된 SFA는 하기와 같이 지지체(12) 표면 상의 사이 영역(18)으로부터 제거될 수 있다: 물로 적신 와트만(Whatman) 와이프를 산화알루미늄(대략 100㎎, 0.3㎛) 또는 스틸 비드에 두드릴 수 있고, 그 다음, 형성된 슬러리를 지지체(그 위에 티오포스페이트-그래프팅된 SFA를 가짐)의 표면을 고른 압력을 사용하여 작은 동심원으로 문지를 수 있고, 그 다음, 깨끗한 물에 젖은 와트만 와이프를 사용하여 슬러리 및 티오포스페이트-그래프팅된 SFA를 표면으로부터 제거할 수 있다.
본 명세서에 예시화된 겔 물질(24)을 사이 영역(18)으로부터 제거하는 기계적 및 화학적 연마 방법은 또한 겔 물질(24)이 제거되는지 여부와 관계 없이 불활성 사이 영역(18)에서 겔 물질을 불활성화하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 겔 물질(24)은 품질 제어 트레이서(22) 및 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')에 부착되는 능력과 관련하여 불활성화될 수 있다.
겔 물질(24)이 각각의 웰(16')에 위치한 후, 품질 제어 트레이서(22), 및, 몇몇의 경우, 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')은 겔 물질(24)에 그래프팅된다. 부착 기술이 사용되고, 분리된, 프라이머 뉴클레오타이드 서열(20, 20')이 포함되는지 여부는 사용되는 품질 제어 트레이서(22)에 따라 부분적으로 좌우될 것이다. 품질 제어 트레이서(22)의 다양한 예는 도 3A 내지 도 3D 및 도 4에 도시된다. 각각의 예는 이제 기재될 것이다.
도 3A는 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')을 갖는 겔 물질(24)/겔 패드(24') 상에 포함되는 품질 제어 트레이서(22A)의 예를 도시한다. 이러한 예에서, 품질 제어 트레이서(22A)는 이의 3' 말단에서 형광성 표지(28)로 태깅된 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열(27)이고, 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')은 태깅되지 않은 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)이다.
도 3A의 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열(27)은 이의 5' 말단에서 겔 물질(24)에 부착될 수 있는 작용기를 포함할 수 있다. 이러한 작용기의 예는 알킨, 노보닐(또는 다른 사이클로알켄일), 구리 무함유 클릭 잔기(예를 들면, 디벤조사이클로옥틴(DIBO), 다른 사이클로알킨, 또는 기타 등등), 및 티올을 포함한다. 이러한 작용기는 사용되는 겔 물질(24)을 기반으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 알킨, 노보닐, 및 구리 무함유 클릭 잔기는 클릭 반응을 통해 PAZAM의 아자이드와 반응할 수 있고, 티올은 SFA와 반응할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 작용기는 알킨이다.
도 3A의 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열(27)은 또한 형광성 표지(28)에 부착될 수 있는 작용기를 이의 3' 말단에서 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 합성 동안 사용될 수 있는 이러한 작용기의 예는 5'-다이메톡시트리틸-5-[N-(트라이플루오로아세틸아미노헥실)-3-아크릴이미도]-2'-데옥시유리딘, 3'-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)]-포스포르아미다이트(즉, 아미노 변형제 C6 dT)이다. 다른 예는 5'-다이메톡시트리틸-N-다이메틸폼아미딘-5-[N-(트라이플루오로아세틸아미노헥실)-3-아크릴이미도]-2'-데옥시사이티딘, 3'-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)]-포스포르아미다이트(아미노 변형제 C6 dC) 및 고체 지지체, 예를 들면, (2-다이메톡시트리틸옥시메틸-6-플루오레닐메톡시카보닐아미노-헥산-1-석시노일)-장쇄 알킬아미노-CPG의 사용을 포함한다. 3' 말단에서 작용기는 사용되는 형광성 표지(28)에 따라 선택될 수 있다.
검출 가능한 또는 형광성 표지(28)는, 예를 들면, 3' 말단에서(또는 3' 말단에서 또는 그 근처에서) 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열(27)에 부착할 수 있는 임의의 적합한 형광단일 수 있다. 적합한 형광성 표지(28)의 예는 텍사스 레드(Texas Red)®(설포닐 클로라이드 염료, 서모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific)), Cy7®, Cy7.5® 또는 설포-시아닌7 NHS 에스터(루미프로브(Lumiprobe)로부터의 시아닌 염료), 적색 파장 염료, 예를 들면, TEX™ 615(Exiqon), 형광 염료, 예를 들면, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 시리즈의 것들(서모피셔 사이언티픽), 아토 염료(예를 들면, 아토(Atto) 488, 이의 구조는
이고; 아토-테크(Atto-Tec)로부터의 아토-테크 시리즈), FAM™ 염료(플루오레세인의 유도체, 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지(Integrated DNA Technologies)), 잔텐 형광단, 예를 들면, CAL 플루오르(Fluor)® 염료(예를 들면, 엘쥐씨 바이오서치 테크놀로지스(LGC Biosearch Technologies)로부터의 CAL 플루오르® 골드(Gold) 540, CAL 플루오르® 오렌지(Orange) 460, CAL 플루오르® 레드(Red) 590, CAL 플루오르® 레드 610, 및 CAL 플루오르® 레드 635), 인도카보시아닌 염료, 예를 들면, 콰사르(Quasar)® 염료(예를 들면, 엘쥐씨 바이오서치 테크놀로지스로부터의 콰사르® 570, 콰사르® 670, 및 콰사르® 705), 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 다른 적합한 형광단을 포함한다. 다른 예는 다이라이트(Dylight)™ 488(아민 반응성 염료), 또는 약 518㎚에서 방출 최대값을 갖는 형광단을 포함한다. 몇몇 양상에 있어서, 형광성 표지는 잔텐 형광단이다. 몇몇 양상에 있어서, 잔텐 형광단은 540 내지 640㎚, 또는 540 내지 570㎚, 또는 580 내지 640㎚ 범위에서 방출 최대값을 갖는다. 다른 양상에 있어서, 잔텐 형광단은 585 내지 640㎚ 범위에서 방출 최대값을 갖는다. 다른 양상에 있어서, 잔텐 형광단은 스펙트럼의 적색 영역에서 방출한다. 다른 양상에 있어서, 잔텐 형광단은 약 591㎚, 또는 610㎚, 또는 637㎚의 방출 최대값을 갖는다. 다른 적합한 검출 가능한 표지는 비-형광성 표지, 예를 들면, 플라즈몬 나노입자(예를 들면, SPR 감지에 의해 검출됨) 또는 양자점을 포함한다. 몇몇 양상에 있어서, 검출 가능한 표지는 아미노-반응성 기, 예를 들면, NHS에 의해 유도체화되어 올리고뉴클레오타이드 서열에 커플링을 가능하게 한다.
형광성 표지(28)는 임의의 적합한 방법, 예를 들면, 주형 관련 결찰, 폴리머라제-매개된 올리고뉴클레오타이드 신장, 화학 합성 등을 사용하여 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열(27)에 부착될 수 있다. 형광성 표지(28)의 부착은 뉴클레오타이드 합성(예를 들면, 상보적, 형광단-표지화된 DNA의 합성을 허용하는 돌연변이 DNA 폴리머라제를 사용하거나 고체 상 올리고뉴클레오타이드 합성 동안 형광성 표지-변형된 단량체를 사용하여) 동안 또는 뉴클레오타이드 합성(예를 들면, 3' 위치에 위치한 미리 설치된 작용기 상에 표지(28)에 접합하는 커플링 화학을 통해) 후 발생할 수 있다.
절단 가능한 뉴클레오타이드 서열(27)의 이러한 예는 절단 가능한 부분(31) 및 잔여 부분(29)을 포함한다. 절단 가능한 부분(31)은 형광성 표지(28)(및 형광성 표지(28)에 부착되는데 사용된 임의의 작용기), 뉴클레오타이드의 임의의 서열, 및 절제 부위(30)를 포함한다. 마찬가지로, 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열(27)의 절단 가능한 부분(31)은 서열(27)이 절제 부위(30)에 위치한 뉴클레오타이드를 표적화하는 효소에 노출될 때 제거될 수 있다. 효소 절단 후, 겔 물질(24)에 부착된 채로 남아 있는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열(27)의 부분(29)은 비-반응성 뉴클레오타이드 서열이고, 따라서 수행될 것이거나 수행 중인 서열화 작업에 참여하지 않거나 이를 방해하지 않을 것이다. 잔여 부분은 짧은 폴리 T 또는 폴리 A 서열일 수 있거나, 또한 겔 물질(24)에 부착된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')에 직교하는 서열일 수 있다.
도 3A에서 품질 제어 트레이서(22A)는 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')과 조합으로 사용된다(예를 들면, 본 명세서에 개시된 품질 제어 방법의 예에서). 적합한 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')의 예는 상보적 서열의 혼성화 및 서열의 증폭을 위한 정방향 증폭 프라이머 또는 역방향 증폭 프라이머를 포함한다. 적합한 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')의 몇몇 특정한 예는 P5 및/또는 P7 프라이머를 포함한다. P5 및 P7 프라이머는 HiSeq®, HiSeqX®, MiSeq®, NextSeq®, 게놈 애널라이저(Genome Analyzer)®, 및 기타 장비 플랫폼에서 서열화를 위하여 일루미나 인크(Illumina, Inc.)에 의해 판매되는 상업적인 플로우 셀의 표면 상에서 사용된다. P5 및 P7 프라이머 뿐만 아니라 다른 서열화 프라이머(20, 20')는 겔 물질(24)의 작용기와 반응할 수 있는 기에 의해 5' 말단에서 변형될 수 있다. 적합한 작용기의 하나의 예는 바이사이클로[6.1.0] 논-4-인(BCN)이고, 이는 겔 물질(24)의 아자이드와 반응할 수 있다. 말단화된 프라이머의 하나의 예는 테트라진 말단화된 프라이머, 노보넨 말단화된 프라이머, 알킨 말단화된 프라이머, 아미노 말단화된 프라이머, 에폭시 또는 글리시딜 말단화된 프라이머, 티오포스페이트 말단화된 프라이머, 및 트리아졸린디온 말단화된 프라이머를 포함한다. 알킨 말단화된 P5 및 P7 프라이머의 예는 하기 및 이의 유도체를 포함한다:
P5: 5'-알킨-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3'(서열 번호 1)
P7: 5'-알킨-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT-3'(서열 번호 2)
몇몇 예에서, P7 서열은 G* 위치에서 변형된 구아닌, 예를 들면, 8-옥소-구아닌을 포함한다. 다른 예에서, *는 G*와 인접한 3' A 사이의 결합이 포스포로티오에이트 결합이라는 것을 나타낸다. 몇몇 예에서, P5 및/또는 P7 프라이머는 비천연 연결기를 포함한다.
임의로, P5 및 P7 프라이머 중 하나 또는 둘은 폴리 T 테일을 포함할 수 있다. 폴리 T 테일은 일반적으로 서열의 5' 말단에(예를 들면, 5' 말단 염기와 알킨 단위 사이) 위치하지만, 몇몇 경우에, 3' 말단에 위치할 수 있다. 폴리 T 서열은 임의의 수의 T 뉴클레오타이드, 예를 들면, 2 내지 20개를 포함할 수 있다.
P5 및 P7 프라이머가 예로서 제공되지만, 임의의 적합한 증폭 프라이머가 본 명세서에 제시된 예에서 사용될 수 있다는 것이 이해된다. 당해 분야의 숙련가는 본 명세서에 제시된 핵산의 포획 및 증폭에 적합한 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')을 어떻게 설계하고 사용하는지를 이해할 것이다.
품질 제어 트레이서(22A)의 예는 P5 및 P7 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')에 직교한다. 몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 유라실 절제 부위를 포함한다.
몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 하기 서열 중 하나를 포함한다:
(1) 5' CATCTAGGCATCTAAGCATCAAUCTTACA 3'(서열 번호 3)
(2) 5' ACATACATACATACATACAUACATACA 3'(서열 번호 4)
(3) 5' ATTGATTGATTGATTGATUGATTGAT 3'(서열 번호 5)
여기서, U는 절단 부위이다. 몇몇 양상에 있어서, U는 유라실 절제 부위이다.
몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 서열의 5' 말단에서 폴리T 서열을 포함한다. 몇몇 양상에 있어서, 폴리T 영역은 2 내지 20, 또는 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 T 뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 양상에 있어서, 폴리T 영역은 4, 5, 또는 6개의 T 염기를 포함한다. 다른 양상에 있어서, 폴리T 영역은 6개의 T 뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 양상에 있어서, 서열은 하기와 같다:
(1) 5' 폴리T-CATCTAGGCATCTAAGCATCAAUCTTACA 3'(서열 번호 6) 또는
(2) 5' 폴리T-ACATACATACATACATACAUACATACA 3'(서열 번호 7) 또는
(3) 5' 폴리T-ATTGATTGATTGATTGATUGATTGAT 3'(서열 번호 8).
몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 형광성 표지로서 텍사스 레드®를 포함한다. 몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 하기와 같다:
5'-알킨-CATCTAGGCATCTAAGCATCAAUCTTACA[아미노 C6 dT-텍사스 레드]-3'(서열 번호 9) 또는
5'-알킨-ACATACATACATACATACAUACATACA[아미노 C6 dT-텍사스 레드]-3'(서열 번호 10) 또는
5'-알킨-ATTGATTGATTGATTGATUGATTGAT[아미노 C6 dT-텍사스 레드]-3'(서열 번호 11).
몇몇 양상에 있어서, 이들 트레이서는 또한 본 명세서에 기재된 바와 같이 알킨과 서열의 나머지 사이의 폴리T 영역을 포함한다.
몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 하기와 같다:
5'-알킨-CATCTAGGCATCTAAGCATCAAUCTTACA[아미노 6 dT-잔텐 형광단]-3'(서열 번호 12) 또는
5'-알킨-ACATACATACATACATACAUACATACA[아미노 C6 dT-잔텐 형광단]-3'(서열 번호 13) 또는
5'-알킨-ATTGATTGATTGATTGATUGATTGAT[아미노 C6 dT-잔텐 형광단]-3'(서열 번호 14).
몇몇 양상에 있어서, 이들 트레이서는 또한 본 명세서에 기재된 바와 같이 알킨과 서열의 나머지 사이의 5' 말단에서 폴리T 영역을 포함한다.
몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 알킨 말단을 포함하고, 몇몇 양상에 있어서, 그것은 5'-헥신 말단이다. 적합한 말단은 트레이서를 겔 물질에 부착하는데 사용된다.
몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 하기와 같다:
5'-알킨-TTTTTTACATACATACATACATACAUACATACA[아미노 6 dT-잔텐 형광단]-3'(서열 번호 15).
몇몇 양상에 있어서, 알킨은 헥신이다. 몇몇 양상에 있어서, U 절단 부위는 유라실 절제 부위이다. 몇몇 양상에 있어서, 잔텐 형광단은 585 내지 640㎚ 범위의 방출 최대값을 갖는다. 다른 양상에 있어서, 잔텐 형광단은 스펙트럼의 적색 영역에서 방출한다. 다른 양상에 있어서, 잔텐 형광단은 약 591㎚, 또는 610㎚, 또는 637㎚의 방출 최대값을 갖는다. 몇몇 양상에 있어서, 형광단은 텍사스 레드®이다.
몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서가 프라이머 서열 및 검출 가능한 표지 둘 다를 포함하는 경우, 품질 제어 트레이서는 하기 서열 중 하나를 포함한다:
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACA-3'(서열 번호 16)
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCACAC-3'(서열 번호 17)
5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3'(서열 번호 1).
몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 상기 기재된 바와 같은 폴리T 영역을 포함한다. 몇몇 예에서, 품질 제어 트레이서는 하기 서열 중 하나를 포함한다:
5'-(폴리T 또는 TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACA-3'(서열 번호 18)
5'-(폴리T 또는 TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCACAC-3'(서열 번호 19)
5'-(폴리T 또는 TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3'(서열 번호 20).
몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 겔 물질에 대한 그래프팅을 허용하는 말단을 포함한다. 몇몇 예에서, 말단은 알킨 또는 헥신 잔기이다. 따라서, 몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 하기 서열 중 하나를 포함한다:
5'-(알킨)-(폴리T 또는 TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACA-3'(서열 번호 18)
5'-(알킨)-(폴리T 또는 TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCACAC-3'(서열 번호 19)
5'-(알킨)-(폴리T 또는 TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3'(서열 번호 20).
몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 본 명세서에 기재된 바와 같은 잔텐 형광단, 또는 텍사스 레드를 포함한다. 몇몇 양상에 있어서, 품질 제어 트레이서는 하기 서열 중 하나를 포함한다:
5'-(알킨)-(폴리T 또는 TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACA(아미노 C6 dT-잔텐 형광단)-3'(서열 번호 21)
5'-(알킨)-(폴리T 또는 TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUC(아미노 C6 dT-잔텐 형광단)ACAC-3'(서열 번호 22)
5'-(알킨)-(폴리T 또는 TTTTTT)AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC(아미노 C6 dT 잔텐 형광단)-3'(서열 번호 23).
도 3A에서 품질 제어 트레이서(22A)가 사용되는 경우, 이것은 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')에 대하여 미리 결정된 비율로 존재하는 것으로 이해된다. 미리 결정된 비율은 본 명세서에 개시된 품질 제어 방법의 예에서 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')의 밀도 및/또는 분포를 간접적으로 결정하는데 사용될 수 있다.
도 3A에 나타낸 예를 형성하기 위하여, 순차적인 그래프팅 또는 공동-그래프팅이 사용될 수 있다.
순차적인 그래프팅은 지지체(12)(부위(16)에 겔 물질(24)을 가짐)를 품질 제어 트레이서(22A)를 함유하는 용액 또는 혼합물에 노출하고 배양한 다음, 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')을 함유하는 용액 또는 혼합물에 노출하고 배양함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 순차적인 그래프팅은 지지체(12)(부위(16)에서 겔 물질(24)을 가짐)를 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')을 함유하는 용액 또는 혼합물에 노출하고 배양한 다음, 품질 제어 트레이서(22A)를 함유하는 용액 또는 혼합물에 노출하고 배양함으로써 달성될 수 있다.
공동-그래프팅은 지지체(12)(부위(16)에서 겔 물질(24)을 가짐)를 품질 제어 트레이서(22A) 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')을 함유하는 용액 또는 혼합물에 노출한 다음, 배양함으로써 달성될 수 있다. 지지체(12)의 이러한 용액 또는 혼합물에의 노출은 품질 제어 트레이서(22A) 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')이 혼합물을 지지체(12) 상에 침착시킴으로써 달성될 수 있다. 예에서, 용액 또는 혼합물은 겔 물질(24) 코팅된 지지체(12)를 가로질러 그려질 수 있다(도 2C에 나타냄).
도 3A에 도시된 예를 형성하는데 사용되는 임의의 그래프팅 예에서, 배양은 사용되는 품질 제어 트레이서(22A) 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')에 부분적으로 따라 예정된 온도에서 발생한다. 예로서, 배양은 약 50℃ 내지 약 70℃ 범위의 온도에서 달성될 수 있다.
또한 도 3A에 도시된 예를 형성하는데 사용되는 임의의 그래프팅에서, 용액은 품질 제어 트레이서(22A) 및/또는 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20'), 물, 완충제, 및 촉매를 포함할 수 있다. 품질 제어 트레이서(22A) 및/또는 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')은 동일한 용액/혼합물 또는 분리된 용액/혼합물 중에 존재하는지 여부와 상관없이 임의의 목적하는 미리 결정된 비율로 존재할 수 있다.
도 3B는 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')와 함께 겔 물질(24)/겔 패드(24') 상에 포함된 품질 제어 트레이서(22B)의 또 다른 예를 도시한다. 이러한 예에서, 품질 제어 트레이서(22B)는 절단 가능한 핵염기에 부착된 형광성 표지(28)를 갖는 비-반응성 뉴클레오타이드 서열(32)이고, 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')은 태깅되지 않은 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)이다.
품질 제어 트레이서(22B)의 이러한 예의 비-반응성 뉴클레오타이드 서열(32)은 품질 제어 방법이 수행된 후와 서열화가 수행되는 동안에 적어도 실질적으로 온전하게 남아 있고, 따라서 서열(32)은 겔 물질(24)에 또한 부착된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')에 직교한다.
도 3B의 비-반응성 뉴클레오타이드 서열(32)은 겔 물질(24)에 부착할 수 있는 이의 5' 말단에서 작용기를 포함할 수 있다. 이러한 작용기의 예는 알킨, 노보닐(또는 다른 사이클로알켄일), 구리 무함유 클릭 잔기(예를 들면, 다이벤조사이클로옥틴(DIBO), 다른 사이클로알킨, 또는 기타 등등), 및 티올을 포함한다. 이러한 작용기는 사용되는 겔 물질(24)을 기반으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 알킨, 노보닐, 및 구리 무함유 클릭 잔기는 클릭 반응을 통해 PAZAM의 아자이드와 반응할 수 있고, 티올은 SFA와 반응할 수 있다.
품질 제어 트레이서(22B)의 이러한 예에서, 형광성 표지(28)는 서열(32)의 절단 가능한 핵염기에 부착된다. 형광성 표지(28)가 부착되는 핵염기는 엑소뉴클레아제에 의해 절단될 수 있는 것이고, 이는 특정한 염기의 절제를 촉매화하고, 포스포다이에스터 골격을 온전하게 남긴다.
이러한 예에서, 형광성 표지(28)는 서열(32)의 3' 말단에 직접적이지는 않지만 근처에(예를 들면, 이의 10개의 염기 내에) 부착될 수 있다. 선택된 표지가 비-반응성 뉴클레오타이드 서열(32)의 목적하는 핵염기에 공유적으로 부착될 수 있는 한, 임의의 상기 기재된 형광성 표지(28)가 사용될 수 있다.
도 3B에서 품질 제어 트레이서(22B)는 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')과 조합으로 사용된다(예를 들면, 본 명세서에 개시된 품질 제어 방법의 예에서). 적합한 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')의 예는 상보적 서열의 혼성화 및 서열의 증폭을 위하여 정방향 증폭 프라이머 또는 역방향 증폭 프라이머를 포함한다. 적합한 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')의 몇몇 특정한 예는 상기 기재된 P5 또는 P7 프라이머를 포함한다.
도 3B에서 품질 제어 트레이서(22B)가 사용되는 경우, 이것은 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')에 대하여 미리 결정된 비율로 존재하는 것으로 이해된다. 미리 결정된 비율은 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')의 밀도 및/또는 분포를 간접적으로 결정하기 위하여 본 명세서에 개시된 품질 제어 방법의 예에서 사용될 수 있다.
도 3B에 도시된 예를 형성하기 위하여, 순차적인 그래프팅 또는 공동-그래프팅은 품질 제어 트레이서(22B)가 품질 제어 트레이서(22A) 대신에 사용되는 것을 제외하고 상기 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 도 3B에 도시된 예를 형성하는데 사용되는 임의의 그래프팅 예에서, 배양은 사용되는 품질 제어 트레이서(22B) 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')에 부분적으로 따라 예정된 온도에서 발생한다. 또한 도 3B에 도시된 예를 형성하는데 사용되는 임의의 그래프팅 예에서, 용액은 품질 제어 트레이서(22B) 및/또는 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20'), 물, 완충제, 및 촉매를 포함할 수 있다. 품질 제어 트레이서(22B) 및/또는 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')은 동일한 용액/혼합물 또는 분리된 용액/혼합물 중에 존재하는지 여부와 상관없이 임의의 목적하는 미리 결정된 비율로 존재할 수 있다.
도 3C는 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')을 갖는 겔 물질(24)/겔 패드(24') 상에 포함되는 품질 제어 트레이서(22C)의 또 다른 예를 도시한다. 이러한 예에서, 품질 제어 트레이서(22C)는 절단 가능한 핵염기(3' 말단 근처)에 부착된 형광성 표지(28) 및 절제 부위(30)를 갖는 비-반응성 뉴클레오타이드 서열(32')이고, 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')은 태깅되지 않은 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)이다.
품질 제어 트레이서(22C)의 이러한 예가 절단 가능한 핵염기에 부착된 형광성 표지(28)를 포함하기 때문에, 엑소뉴클레아제는 품질 제어 방법이 수행된 후, 형광성 표지(28)를 제거하는데 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 비-반응성 뉴클레오타이드 서열(32')은, 품질 제어 방법이 수행된 후, 적어도 실질적으로 온전하게 남고, 따라서 비-반응성 뉴클레오타이드 서열(32')은 겔 물질(24)에 또한 부착된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')에 직교할 수 있다.
게다가, 품질 제어 트레이서(22C)의 이러한 예는 또한 절제 부위(30)를 포함하기 때문에, 효소 절단은, 품질 제어 방법이 수행된 후, 비-반응성 서열(32')의 절단 가능한 부분(31')을 제거하는데 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 절단 가능한 부분(31')은 올리고뉴클레오타이드의 임의의 서열, 서열에 따라 핵염기에 부착된 형광성 표지(28), 및 절제 부위(30)를 포함한다. 효소 절단 후, 겔 물질(24)에 부착된 채로 남아 있는 비-반응성 뉴클레오타이드 서열(32')의 부분(29')은 또한 비-반응성 뉴클레오타이드 서열이고, 따라서, 수행될 것이거나 수행 중인 서열화 작업에 참여하지 않거나 이를 방해하지 않을 것이다. 잔여 부분(29')은 짧은 폴리 T 또는 폴리 A 서열일 수 있거나, 겔 물질(24)에 또한 부착된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')에 직교하는 서열일 수 있다.
도 3C의 비-반응성 뉴클레오타이드 서열(32')은 겔 물질(24)에 부착될 수 있는 이의 5' 말단에서 작용기를 포함할 수 있다. 이러한 작용기의 예는 알킨, 노보닐(또는 다른 사이클로알켄일), 구리 무함유 클릭 잔기(예를 들면, 다이벤조사이클로옥틴(DIBO), 다른 사이클로알킨, 또는 기타 등등), 및 티올을 포함한다. 이러한 작용기는 사용되는 겔 물질(24)을 기반으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 알킨, 노보닐, 및 구리 무함유 클릭 잔기는 클릭 반응을 통해 PAZAM의 아자이드와 반응할 수 있고, 티올은 SFA와 반응할 수 있다.
이러한 예에서, 형광성 표지(28)는 서열(32')의 3' 말단에 직접적이지는 않지만 근처에(예를 들면, 이의 10개의 염기 내에) 부착될 수 있다. 선택된 표지가 비-반응성 뉴클레오타이드 서열(32')의 목적하는 핵염기에 공유적으로 부착될 수 있는 한, 임의의 상기 기재된 형광성 표지(28)가 사용될 수 있다.
도 3C에서 품질 제어 트레이서(22C)는 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')과 조합으로 사용된다(예를 들면, 본 명세서에 개시된 품질 제어 방법의 예에서). 적합한 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')의 예는 상보적 서열의 혼성화 및 서열의 증폭을 위하여 정방향 증폭 프라이머 또는 역방향 증폭 프라이머를 포함한다. 적합한 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')의 몇몇 특정한 예는 상기 기재된 P5 또는 P7 프라이머를 포함한다.
도 3C에서 품질 제어 트레이서(22C)가 사용되는 경우, 이것은 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')에 대하여 미리 결정된 비율로 존재하는 것으로 이해된다. 미리 결정된 비율은 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')의 밀도 및/또는 분포를 간접적으로 결정하기 위하여 본 명세서에 개시된 품질 제어 방법의 예에서 사용될 수 있다.
도 3C에 도시된 예를 형성하기 위하여, 순차적인 그래프팅 또는 공동-그래프팅은 품질 제어 트레이서(22C)가 품질 제어 트레이서(22A) 대신에 사용되는 것을 제외하고 상기 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 도 3C에 도시된 예를 형성하는데 사용되는 임의의 그래프팅 예에서, 배양은 사용되는 품질 제어 트레이서(22C) 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')에 부분적으로 따라 예정된 온도에서 발생한다. 또한 도 3C에 도시된 예를 형성하는데 사용되는 임의의 그래프팅 예에서, 용액은 품질 제어 트레이서(22C) 및/또는 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20'), 물, 완충제, 및 촉매를 포함할 수 있다. 품질 제어 트레이서(22C) 및/또는 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')은 동일한 용액/혼합물 또는 분리된 용액/혼합물 중에 존재하는지 여부와 상관없이 임의의 목적하는 미리 결정된 비율로 존재할 수 있다.
도 3D는 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')을 갖는 겔 물질(24)/겔 패드(24') 상에 포함되는 품질 제어 트레이서(22C)의 또 다른 예를 도시한다. 이러한 예에서, 품질 제어 트레이서(22D)는 이의 3' 말단에서 형광성 표지(28)로 태깅된 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열(27')이다. 형광성 표지(28)는 임의의 상기 기재된 형광단일 수 있다.
절단 가능한 뉴클레오타이드 서열(27')의 이러한 예는 절단 가능한 부분(31") 및 잔여 부분(29")을 포함한다. 절단 가능한 부분(31")은 형광성 표지(28), 임의의 서열의 뉴클레오타이드, 및 3' 말단 근처의 절제 부위(30)를 포함한다. 절단 가능한 부분(31")은 또한 형광성 표지(28)를 뉴클레오타이드의 서열에 부착하는 작용기를 포함할 수 있다. 이러한 작용기의 예는 5'-다이메톡시트리틸-5-[N-(트라이플루오로아세틸아미노헥실)-3-아크릴이미도]-2'-데옥시유리딘,3'-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)]-포스포르아미다이트(즉, 아미노 변형제 C6 dT)이다. 다른 예는 5'-다이메톡시트리틸-N-다이메틸폼아미딘-5-[N-(트라이플루오로아세틸아미노헥실)-3-아크릴이미도]-2'-데옥시사이티딘, 3'-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)]-포스포르아미다이트(아미노 변형제 C6 dC) 및 고체 지지체, 예를 들면, (2-다이메톡시트리틸옥시메틸-6-플루오레닐메톡시카보닐아미노-헥산-1-석시노일)-장쇄 알킬아미노-CPG의 사용을 포함한다. 이러한 작용기는 사용되는 형광성 표지(28)를 기반으로 선택될 수 있다. 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열(27')의 절단 가능한 부분(31")은 서열(27')이 절제 부위(30)에 위치한 뉴클레오타이드를 표적화하는 효소에 노출될 때 제거될 수 있다.
효소 절단 후, 겔 물질(24)에 부착된 채로 남아 있는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열(27')의 부분(29")은 프라이머 뉴클레오타이드 서열(20, 20')이다. 절단 가능한 부분(31")이 제거된 후, 남아 있는 프라이머 뉴클레오타이드 서열(20, 20')은 수행될 것이거나 수행 중인 서열화 작업에 참여할 것이다. 본 명세서에 개시된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')의 임의의 예는 품질 제어 트레이서(22D)에서 사용될 수 있다.
도 3D의 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열(27')은 겔 물질(24)에 부착될 수 있는 이의 5' 말단에서 작용기를 포함할 수 있다. 이러한 작용기의 예는 알킨, 노보닐(또는 다른 사이클로알켄일), 구리 무함유 클릭 잔기(예를 들면, 다이벤조사이클로옥틴(DIBO), 다른 사이클로알킨, 또는 기타 등등), 및 티올을 포함한다. 이러한 작용기는 사용되는 겔 물질(24)을 기반으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 알킨, 노보닐, 및 구리 무함유 클릭 잔기는 클릭 반응을 통해 PAZAM의 아자이드와 반응할 수 있고, 티올은 SFA와 반응할 수 있다.
3' 말단에서, 형광성 표지, 텍사스 레드®로 태깅된 P5 프라이머의 예는 하기와 같다:
5'-알킨-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACA[아미노 C6 dT-텍사스 레드]-3'(서열 번호 24)
도 3D에서 품질 제어 트레이서(22D)는 트레이서(22D)의 부분인 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')의 밀도 및/또는 분포를 직접적으로 결정하는데 본 명세서에 개시된 품질 제어 방법의 예에서 사용될 수 있다.
도 3D에 도시된 예를 형성하기 위하여, 하나의 유형의 품질 제어 트레이서(22D)의 그래프팅(각각 동일한 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20 또는 20')을 포함함) 또는 상이한 유형의 품질 제어 트레이서(22D)의 공동-그래프팅(예를 들면, 몇몇은 프라이머 뉴클레오타이드 서열(20)을 포함하고, 다른 몇몇은 상이한 프라이머 뉴클레오타이드 서열(20')을 포함함)이 사용될 수 있다. 그래프팅 또는 공동-그래프팅은 품질 제어 트레이서(22D)가 품질 제어 트레이서(22A) 대신에 사용되는 것을 제외하고 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
품질 제어 트레이서(22E)의 다른 예는 도 4에 도시된다. 이들 예에서, 품질 제어 트레이서(22E)는 이의 3' 말단에서 형광성 표지(28)로 태깅된 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열이다. 각각의 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열의 이들 예는 뉴클레오타이드 서열(X), 연결기 분자(34), 및 형광성 표지(28)를 포함한다.
뉴클레오타이드 서열(X)은 비-반응성 뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 서열(32)) 또는 프라이머 뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 서열(20 또는 20'))일 수 있다. 뉴클레오타이드 서열(X)이 비-반응성 뉴클레오타이드 서열인 경우, 품질 제어 트레이서(22E)는 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')과 조합으로 사용될 수 있다(도 3A 내지 도 3C에 도시된 예들과 유사함). 뉴클레오타이드 서열(X)이 프라이머 뉴클레오타이드 서열인 경우, 품질 제어 트레이서(22E)는 단독으로 사용될 수 있다(즉, 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20') 없이)(도 3D에 도시된 예와 유사함).
도 4의 뉴클레오타이드 서열(X)은 겔 물질(24)에 부착될 수 있는 이의 5' 말단에서 작용기를 포함할 수 있다. 이러한 작용기의 예는 알킨, 노보닐(또는 다른 사이클로알켄일), 구리 무함유 클릭 잔기(예를 들면, 다이벤조사이클로옥틴(DIBO), 다른 사이클로알킨, 또는 기타 등등), 및 티올을 포함한다. 이러한 작용기는 사용되는 겔 물질(24)을 기반으로 선택될 수 있다. 예를 들면, 알킨, 노보닐, 및 구리 무함유 클릭 잔기는 클릭 반응을 통해 PAZAM의 아자이드와 반응할 수 있고, nd 티올은 SFA와 반응할 수 있다.
연결기 분자(34)는 하나의 말단에서 형광성 표지(28)에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착될 수 있는 작용기를 포함하고, 다른 말단에서 뉴클레오타이드 서열(X)에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착될 수 있는 (예를 들면, 3' 말단에서 또는 서열(X)에서 특정한 핵염기에서) 작용기를 포함한다. 품질 제어 트레이서(22E)의 연결기 분자(34)는 품질 제어 방법의 예가 수행된 후, 품질 제어 트레이서(22E)로부터 형광성 표지(28)를 적어도 제거하는 절단 반응을 겪을 수 있는 화학 연결을 제공한다. 수행되는 절단 반응은 사용되는 연결기 분자(34)에 따라 좌우된다. 예시적인 연결기 분자(34)는 다이올, 다이설파이드, 실란, 아조벤젠, 광절단 가능한 기, 및 아지도를 포함한다.
다이올은 2개의 하이드록실기를 함유하는 임의의 화학적 화합물이다. 선형 또는 환형 다이올이 사용될 수 있다. 적합한 다이올의 예는 하이드록실기가 인접한 탄소 원자에 부착된 이웃한 다이올이다. 이웃한 다이올은 산화 조건하에, 예를 들면, 과옥소산염(예를 들면, 과옥소산나트륨)에 대한 노출하에 또는 효소 조건하에 절단 가능하다. 적합한 다이올의 예는 도 4에서 34A로 도시된 타르타르산-유도된 다이올이다. 이러한 예에서, 다이올의 각각의 말단에서 아민기는 각각의 잔기에 부착되고, 이들 중 하나는 뉴클레오타이드 서열(X)의 3' 말단에 부착되고, 다른 하나는 임의의 적합한 부착 부위(예를 들면, 알코올, 아민, 카복실산)를 통해 형광성 표지(28)에 부착된다. 다이올은 품질 제어 트레이서(22E)를 다이올을 2개의 알데하이드로 산화적으로 절단할 수 있는 과옥소산나트륨(NaIO4)에 노출시켜 절단될 수 있다.
다이설파이드는 일반 구조식 R1-S-S-R2를 갖고, 여기서 R1 및 R2는 임의의 알킬 또는 아릴 기일 수 있다. 다이설파이드 결합은 환원 조건하에 절단된다. 적합한 다이설파이드의 예는 도 4에 34B로서 도시된다. 이러한 예에서, 다이설파이드의 하나의 말단에서 아민기는 연결기, 예를 들면, 알킬 쇄를 통해 3' 말단에서 뉴클레오타이드 서열(X)에 부착되고, 다이설파이드의 다른 말단에서 아민기는 아미도 연결()을 형성하고, 여기서 R은 -(CH2)4-O-형광성 표지(28)이고, R'은 H이고, R"은 -(CH2)2-S-S-(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)3-X이다. 형광성 표지(28)는 임의의 적합한 부착 부위(예를 들면, 알코올, 아민, 카복실산)을 통해 부착된다. 예에서, 다이설파이드는 품질 제어 트레이서(22E)를 환원 조건, 예를 들면, 티올(R3SH, 여기서 R3은 임의의 적합한 알킬기일 수 있음) 또는 3급 포스핀(R4 3P, 여기서 R4는 임의의 적합한 알킬기임)에 노출시킴으로써 절단될 수 있다. 티올과 다이설파이드의 반응은 다이설파이드 결합을 파괴할 것이고, 새로운 다이설파이드 및 원래 다이설파이드로부터 유래된 티올을 생성할 것이다. 3급 포스핀과 다이설파이드의 반응은 다이설파이드 결합을 파괴하고 2개의 황-함유 생성물을 생성할 것인 이분자 친핵성 치환(SN2) 반응이다.
본 명세서에서 사용되고 도 4에서 34C로 도시된 바와 같이, 실란은 2개의 산소 원자 및 2개의 R 기(예를 들면, 각각은 알킬 또는 아릴 기일 수 있음)에 결합된 규소 원자를 포함한다. 이러한 예에서, 실란의 산소 원자는 각각 연결기, 예를 들면, 알킬 쇄에 부착되고, 이는 3' 말단에서 뉴클레오타이드 서열(X)에 부착되고 임의의 적합한 부착 부위(예를 들면, 알코올, 아민, 카복실산)를 통해 형광성 표지(28)에 부착되된다. 실란은 품질 제어 트레이서(22E)를 산(도 4에서 H+ 로 도시됨)에 노출되거나 플루오라이드 이온에 의한 처리(도 4에 도시되지 않음)에 의해 Si-O 결합 중 하나에서 절단될 수 있다.
아조벤젠은 N=N 이중 결합에 의해 연결된 2개의 페닐 고리로 구성된 화학적 화합물이다. 상이한 작용기는 N=N 이중 결합에 대하여 파라 위치에서 페닐 고리롤부터 확장될 수 있다. 이들 작용기는 동일하거나 상이할 수 있고, 예는 아미도 기, 알킬 아민, 또는 하이드록실기를 포함한다. 적합한 아조벤젠의 예는 도 4에서 34D로 도시된다. 이러한 예에서, 작용기는 아미도 기 및 에틸아민을 포함한다. 아미도 기는 연결기, 예를 들면, 3' 말단에서 뉴클레오타이드 서열(X)에 부착되는 알킬 쇄에 부착되고, 에틸아민의 아민기는 아미도 연결()을 형성하고, 여기서 R은 -(CH2)4-O-형광성 표지(28)이고, R'은 H이고, R"은 -(CH2)2-아조벤젠-(C=O)-NH-(CH2)3-X이다. 형광성 표지(28)는 임의의 적합한 부착 부위(예를 들면, 알코올, 아민, 카복실산)를 통해 부착된다. 예에서, 아조벤젠은 품질 제어 트레이서(22E)를 나트륨 다이티오네이트(Na2S2O4)에 노출시킴으로써 절단될 수 있다. 나트륨 다이티오네이트와 아조벤젠의 반응은 아조벤젠을 2개의 아닐린 기로 환원시킨다.
광절단 가능한 기는 광 절단 부위를 포함하는 비-뉴클레오타이드 잔기이고, 여기서 절단은 예정된 시간 동안 광의 예정된 파장에 의한 조사에 의해 발생한다. 광절단 가능한 기는 또한 임의의 이용 가능한 포스포르아미다이트 변형을 뉴클레오타이드 서열(X)의 3' 말단에서 형광성 표지(28)에 부착된 작용기에 부착하는 중간체로서 사용될 수 있다. 적합한 광절단 가능한 기의 예인 오르토-니트로벤질기는 도 4에 34E로서 도시된다. 이러한 예에서, 광절단 가능한 기는 말단에 아민기를 포함한다. 이러한 예에서, 광절단 가능한 기의 하나의 말단에서 아민기는 뉴클레오타이드 서열(X)에 부착된 연결기, 예를 들면, 알킬 쇄에 부착되고, 광절단 가능한 기의 다른 말단에서의 아민기는 -(CH2)4-O-를 통해 형광성 표지(28)에 부착된 아미도 연결을 형성한다. 형광성 표지(28)는 적합한 부착 부위(예를 들면, 알코올, 아민, 카복실산)를 통해 부착된다. 예에서, 적어도 형광성 표지(28)는 예정된 시간 동안 예정된 파장의 광에 품질 제어 트레이서(22E)를 노출시켜 광절단 가능한 부위에서 품질 제어 트레이서(22E)로부터 절단된다.
본 명세서에 언급된 바와 같이, 아지도는 N3 기를 포함하는 임의의 분자이다. 적합한 아지도의 예는 도 4에서 O-아지도알킬기(34F)로서 도시된다. 이러한 예에서, 아지도의 하나의 말단에서 아민기는 3' 말단에서 뉴클레오타이드 서열(X)에 부착되는 연결기, 예를 들면, 알킬 쇄에 부착되고, 아지도의 다른 말단에서 아민기는 아미도 연결()을 형성하고, 여기서(이러한 예에서) R은 -(CH2)4-O-형광성 표지(28)이고, R'은 H이고, R"은 -(CH2)3-O-(CN3)-(CH2)-(O(CH2)2)2-(CH2)-(C=O)-NH-(CH2)3-X이다. 형광성 표지(28)는 임의의 적합한 부착 부위(예를 들면, 알코올, 아민, 카복실산)를 통해 부착된다. 예에서, 아지도는 품질 제어 트레이서(22E)를 3급 포스핀(R6 3P, 여기서 R6은 적절하게 치환된 알킬 또는 아릴 기임)에 노출함으로써 절단될 수 있다. 3급 포스핀 및 아지도는 슈타우딩거(Staudinger) 환원 반응을 겪는다.
본 명세서에 개시된 각각의 연결기 분자(34)는 품질 제어 방법의 예가 수행된 후, 품질 제어 트레이서(22E)로부터 적어도 형광성 표지(28)를 제거하는 화학 절단 반응을 겪을 수 있다. 잔여 부분은 비-반응성 뉴클레오타이드 서열(서열화에 참여하지 않을 것임) 또는 프라이머 뉴클레오타이드 서열(서열화에 참여할 것임)일 수 있다.
품질 제어 트레이서(22E)의 뉴클레오타이드 서열(X)이 비-반응성인 경우, 품질 제어 트레이서(22E)는 상기 본 명세서에 기재된 바와 같이 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')와 순차적으로 그래프팅되거나 공동-그래프팅될 수 있다. 품질 제어 트레이서(22E)의 뉴클레오타이드 서열(X)이 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')인 경우, 하나의 유형의 품질 제어 트레이서(22E)(각각은 동일한 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20 또는 20')을 포함함)는 그래프팅될 수 있거나, 상이한 유형의 품질 제어 트레이서(22E)(예를 들면, 이들 중 몇몇은 프라이머 뉴클레오타이드 서열(20)을 포함하고, 다른 것들은 상이한 프라이머 뉴클레오타이드 서열(20')을 포함함)는 공동-그래프팅될 수 있다. 그래프팅 또는 공동-그래프팅은 품질 제어 트레이서(22E)가 품질 제어 트레이서(22A) 대신에 사용되는 것을 제외하고 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
도 2D를 다시 참조하면, 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')을 갖는 품질 제어 트레이서(들)(22)의 예가 도시된다. 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')을 포함하는 트레이서(22)(예를 들면, 트레이서(22D) 및 트레이서(22E)의 몇몇 예)의 예에서, 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')은 트레이서(들)(22)와 함께 존재할 것이다.
본 명세서에 개시된 어레이(10)는 품질 제어 방법에서 사용될 수 있다. 품질 제어 방법의 예는 도 5에 도시된다. 방법(50)은 일반적으로 품질 제어 트레이서(22)를 지지체(12) 상의 웰(16')에서 겔 물질(24)에 그래프팅하는 단계로서, 품질 제어 트레이서가 이의 3' 말단에서 형광성 표지(28)로 태깅된 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열(27, 27') 및 절단 가능한 핵염기에 부착된 형광성 표지(28)를 갖는 비-반응성 뉴클레오타이드 서열(32, 32')로 이루어진 군으로부터 선택되는 단계(참조 번호 52로 도시됨); 형광성을 사용하여 품질 제어 트레이서(22)를 검출하는 단계(참조 번호 54로 도시됨); 및 적어도 부분적으로 형광성을 기반으로 하여, 겔 물질(24)에 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(20, 20')의 밀도, 또는 분포, 또는 밀도 및 분포를 결정하는 단계(참조 번호 56으로 도시됨)를 포함한다.
품질 제어 방법은 단독으로 또는 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')과 조합으로 품질 제어 트레이서(22)가 겔 물질(24)에 그래프팅된 후, 그리고 플로우 셀 제조의 완료 전에(예를 들면, 어레이(10)의 상부 기판 플로우 셀에 대한 결합 전에) 수행될 수 있다. 품질 제어 방법은 또한 또는 대안적으로 완전히 제조된 플로우 셀의 최종 사용자에 의해 수행될 수 있다. 품질 제어 방법이 플로우 셀의 최종 사용자에 의해 수행되는 경우, 방법은 임의의 서열화 작업흐름 시약 및 DNA 샘플을 플로우 셀 상에 로딩하기 전에 수행될 수 있다는 것이 이해된다. 각각의 품질 제어 트레이서(22A, 22B, 22C, 22D, 22E)가 검출 가능한 형광성 표지(28)를 포함하기 때문에, 형광-표지화된 상보적 뉴클레오타이드의 혼성화는 본 명세서에 개시된 품질 제어 방법의 부분으로서 수행될 필요가 없다.
방법(50)에서, 품질 제어 트레이서(22A, 22B, 22C, 22D, 22E)의 다양한 예의 그래프팅은 상기 기재된 바와 같이 달성될 수 있다.
각각의 예시적인 품질 제어 트레이서(22A, 22B, 22C, 22D, 22E)는 형광성 표지(28)를 포함하고, 이는 더 짧은 파장(들)의 입사 방사선에 노출되는 경우, 더 긴 파장(들)의 광을 방출할 것이다. 마찬가지로, 품질 제어 트레이서(22)의 검출은 레이저에 의해 방출된 방사선에 어레이(10)(또는 어레이(10)를 포함하는 플로우 셀)를 노출시킴으로써 달성될 수 있다. 레이저 여기 후, 각각의 품질 제어 트레이서(22A, 22B, 22C, 22D, 22E)의 형광성 표지(28)로부터의 방출된 형광성(강도의 관점에서)은 적합한 형광성 검출기를 통해 캡쳐된다.
품질 제어 트레이서(22A, 22B, 22C), 또는 트레이서(22E)의 몇몇 예가 분리된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')와 함께 미리 결정된 비율로 이용되는 경우, 이들 품질 제어 트레이서(22A, 22B, 22C, 22E)로부터의 형광성 강도 및 미리 결정된 비율은 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')의 밀도 및/또는 분포를 평가하거나 간접적으로 결정하는데 사용될 수 있다. 형광성 강도는 품질 제어 트레이서(22A, 22B, 22C, 22E)의 밀도 및/또는 분포를 나타내고, 미리 결정된 비율은 품질 제어 트레이서(22A, 22B, 22C, 22E)에 대한 데이터가 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')과 상관관계가 있게 만든다.
품질 제어 트레이서(22D) 또는 트레이서(22E)(프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')을 포함함)의 다른 예가 이용되는 경우, 형광성 결과는 단독으로 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')의 밀도 및/또는 분포를 평가하거나 직접적으로 결정하는데 사용될 수 있다. 품질 제어 트레이서(22D, 22E)의 이들 예는 트레이서(22D, 22E)의 부분으로서 서열(20, 20')을 포함하고, 따라서 형광성 강도는 단독으로 프라이머 뉴클레오타이드 서열(들)(20, 20')의 밀도 및/또는 분포를 나타낸다.
품질 제어 방법의 완료 후(예를 들면, 작업흐름의 최종 사용자 부분에서), 형광성 표지(28)는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 품질 제어 트레이서(22A, 22B, 22C, 22D, 22E)로부터 절단될 수 있다.
도 3A을 참조하여 상기 언급된 바와 같이, 품질 제어 트레이서(22A)는 절제 부위(30)를 포함한다. 마찬가지로, 형광성 표지(28)의 절단은 이러한 예시적인 서 트레이서(22A)에서 효소 절단을 통해 달성될 수 있따. 품질 제어 트레이서(22A)는 절제 부위(30)에 위치한 뉴클레오타이드를 표적화하는 효소에 노출된다. 효소는 서열화를 개시하기 전에 도입될 수 있거나, 서열화 작업흐름의 클러스터 발생 공정의 부분으로서 도입될 수 있다. 적합한 효소의 예는 엑소뉴클레아제(서열의 말단으로부터 연속적인 뉴클레오타이드를 제거함), 엔도뉴클레아제(서열 내에 포스포다이에스터 결합을 절단함), 염기 절제 회복 효소(특정한 염기를 제거하여 아푸리닉/아피리미디닉(AP) 부위를 형성한 다음, AP 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 수 있음), 제한 효소(단일 가닥 서열을 절단하는 4 내지 6개의 뉴클레오타이드의 특정한 서열을 위하여 품질 제어 트레이서(22A)를 스캐닝함) 등을 포함한다. 몇몇 특정한 예는 하기 표 1에 도시된다.
효소 QC 트레이서 절단
USER 효소 5'-NNNNUNNNN-*- 3' 서열화 작업흐름의 리드 1 전
FPG(폼아미도 피리미딘 DNA 글리코실라제) 5'-NNNN(옥소-G)NNNN-*- 3' 서열화 작업흐름의 리드 1 또는 리드 2 전
표 1에서, *는 형광성 표지(28)를 나타내고, N은 뉴클레오타이드를 나타내고, 절제 부위는 굵은 글씨이다.
표 1에서 하나의 예에서, 절제 부위(30)는 USER 효소에 의해 표적화되는 유라실(dU)이다. USER 효소는 유라실 DNA 글리코실라제(UDG) 및 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII의 혼합물이다. UDG는 유라실 염기의 절제를 촉매화하고, 이는 무염기(아피리미디닉) 부위를 형성하고, 포스포다이에스터 골격을 온전하게 남긴다. 엔도뉴클레아제 VIII의 리아제 활성은 염기 무함유 데옥시리보스가 방출되도록 무염기 부위의 3´ 및 5´ 면에서 포스포다이에스터 골격을 파괴한다. 마찬가지로, 절제 부위(30)에서 트레이서(22A)의 절단은 서열(27)의 부분(31) 및 형광성 표지(28)를 지지체(12)로부터 제거한다. 표 1의 다른 예에서, 절제 부위(30)는 FPG에 의해 표적화된 산화된 퓨린(예를 들면, oxoG)이다. FPG는 산화된 구아닌을 인식하고 제거한다. FPG는 N-글리코실라제 및 AP-리아제 둘 다로서 작용한다.
효소 절단 후, 겔 물질(24)에 부착된 채로 남아 있는 품질 제어 트레이서(22A)의 부분(29)은 비-반응성 뉴클레오타이드 서열이고, 따라서 수행될 것이거나 수행 중인 서열화 작업에 참여하지 않거나 이를 방해하지 않을 것이다.
도 3B를 참조하여 상기 언급된 바와 같이, 품질 제어 트레이서(22B)는 서열(32)의 절단 가능한 핵염기에 부착된 형광성 표지(28)를 포함한다. 품질 제어 트레이서(22B)는 포스포다이에스터 절단에 의해 특정한 염기의 절제를 촉매화하는 엑소뉴클레아제에 노출된다. 엑소뉴클레아제는 서열화의 개시 전에 도입될 수 있거나, 서열화 작업흐름의 클러스터 발생 공정의 부분으로서 도입될 수 있다. 예로서, 엑소뉴클레아제 I은 이에 부착된 형광성 표지(28)를 갖는 유라실 염기의 절제를 촉매화한다.
핵염기 절단 후, 겔 물질(24)에 부착된 채로 남아 있는 품질 제어 트레이서(22B)의 서열(32)은 비-반응성이고, 따라서 수행될 것이거나 수행 중인 서열화 작업에 참여하지 않거나 이를 방해하지 않을 것이다.
도 3C를 참조하여 상기 언급된 바와 같이, 품질 제어 트레이서(22C)는 서열(32')의 절단 가능한 핵염기에 부착된 형광성 표지(28) 뿐만 아니라 절제 부위(30)를 포함한다. 마찬가지로, 형광성 표지(28)의 절단은 이러한 예시적인 트레이서(22C)에서 효소 절단의 상기 기재된 임의의 예를 통해 달성될 수 있다. 하나의 예에서, 엑소뉴클레아제는 이에 부착된 형광성 표지(28)를 갖는 염기의 절제를 촉매화하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 절제 부위(30)에 위치한 뉴클레오타이드를 표적화하는 효소는 서열(32')의 부분(31')의 절제를 촉매화하는데 사용될 수 있다. 이들 예에서, 효소는 서열화의 개시 전에 도입될 수 있거나, 서열화 작업흐름의 클러스터 발생 공정의 부분으로서 도입될 수 있다.
핵염기 또는 부분(31') 절단 후, 겔 물질(24)에 부착된 채로 남아 있는 품질 제어 트레이서(22C)의 서열(32')의 부분(29')은 비-반응성이고, 따라서 수행될 것이거나 수행 중인 서열화 작업에 참여하지 않거나 이를 방해하지 않을 것이다.
도 3D를 참조하여 상기 언급된 바와 같이, 품질 제어 트레이서(22D)는 절제 부위(30)를 포함한다. 마찬가지로, 이러한 예시적인 트레이서(22D)에서 형광성 표지(28)의 절단은 효소 절단의 상기 기재된 임의의 예를 통해 달성될 수 있다. 이러한 예에서, 부분(31") 절단 후, 겔 물질(24)에 부착된 채로 남아 있는 서열(27')의 부분(29")은 프라이머 뉴클레오타이드 서열(20, 20')이고, 따라서 수행될 것이거나 수행 중인 서열화 작업에 참여할 것이다.
도 4를 참조하여 상기 언급된 바와 같이, 품질 제어 트레이서(22E)의 다양한 예는 연결기 분자(34)를 포함한다. 이들 예시적인 트레이서(22E)에서 형광성 표지(28)의 절단은 트레이서(22E)를 트레이서(22E)에 존재하는 연결기 분자(34)를 절단하는데 적합한 화학물질에 노출시킴으로써 화학 절단을 통해 달성될 수 있다. 연결기 분자(34A, 34B, 34C, 34D, 34E, 34F)의 다양한 예 및 관련된 절단 화학물질은 도 4를 참조하여 기재된다. 이들 예에서, 절단 화학물질은 서열화의 개시 전에 도입될 수 있다.
화학 절단 후, 겔 물질(24)에 부착된 채로 남아 있는 품질 제어 트레이서(22E)의 부분은 뉴클레오타이드 서열(X) 및 화학 절단이 발생하는 곳에 따라 좌우될 것이다. 잔여 부분은 비-반응성 뉴클레오타이드 서열(서열화에 참여하지 않거나 방해하지 않을 것임) 또는 프라이머 뉴클레오타이드 서열(서열화에 참여할 것임)을 포함할 수 있다.
도면에 도시되지 않았지만, 방법의 또 다른 예는 품질 제어 트레이서의 예(예를 들면, 22A, 22B, 22C, 및 22E의 몇몇 예)를 프라이머 뉴클레오타이드 서열(20, 20')과의 그래프팅 혼합물로 미리 결정된 비율로 도입하는 단계; 그래프팅 혼합물을 지지체(23) 상의 웰(16') 내의 겔 물질(24)에 노출하는 단계; 그래프팅 혼합물을 배양하여, 품질 제어 트레이서(22A, 22B, 22C), 및 22E의 몇몇 예 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열(20, 20')을 겔 물질(24)에 공동-그래프팅하는 단계; 형광성을 사용하여 품질 제어 트레이서를 검출하는 단계; 및 형광성 및 미리 결정된 비율을 적어도 부분적으로 기반하여, 겔 물질(24)에 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(20, 20')의 밀도, 또는 분포, 또는 밀도 및 분포를 결정하는 단계를 포함한다.
합성에 의한 서열화(SBS), 결찰에 의한 서열화, 파이로서열화 등으로 종종 언급되는 기술을 포함하는 다양한 서열화 접근법 또는 기술은 형광성 표지(28)가 절단된 후 수행될 수 있다. 임의의 이들 기술과 함께, 겔 물질(24) 및 부착된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(20, 20')이 부위(16)에 존재하고 사이 영역(18) 상에 존재하지 않기 때문에, 증폭은 다양한 부위(16)로 국한될 것이다.
간략하게, 합성에 의한 서열화(SBS) 반응은 시스템, 예를 들면, 일루미나(Illumina, 미국 캘리포니아주 산디에고 소재)로부터의 HiSeq®, HiSeqX®, MiSeq® 또는 NextSeq® 시퀀서 시스템 상에서 작동될 수 있다. 서열화되는 한 세트의 표적 DNA 분자는 결합된 프라이머 뉴클레오타이드 서열(20, 20')(그리고 임의의 비-반응성 뉴클레오타이드 서열이 아님)에 혼성화된 다음, 브릿지 증폭 또는 동역학적 배제 증폭에 의해 증폭된다. 변성은 겔 물질(24)에 앵커링된 단일 가닥 주형을 남기고, 이중 가닥 DNA의 수백만 밀도의 클러스터가 발생한다(즉, 클러스터 발생). 그 다음, 서열화 반응을 수행한다. 데이터를 정렬하고, 참조와 비교하여, 서열화 차이를 확인한다.
본 발명의 개시내용을 추가로 설명하기 위하여, 본 명세서에 실시예를 제공한다. 이러한 실시예는 설명의 목적을 위하여 제공되며 본 발명의 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다는 것으로 이해될 것이다.
실시예
하기 품질 제어 트레이서를 사용하였다:
5'-헥신-폴리 T 테일-CATCTAGGCATCTAAGCATCAAUCTTACA[아미노 C6 dT-텍사스 레드]-3'(서열 번호 25)
기판 표면 상의 P5/P7 프라이머 그래프팅의 품질 제어를 위한 QC 트레이서의 예를 평가하기 위하여, P5/P7 프라이머 그래프팅 혼합물을 QC 트레이서의 10% 스파이크와 함께 QC 트레이서 스파이크(대조군) 없이 제조하였다. QC 트레이서의 10% 스파이크를 포함하는 P5/P7 프라이머 혼합물로 그래프팅된 기판 표면을 트레이서 형광성을 측정함으로써 결정하였다. 대조군 표면(QC 트레이서 스파이크 없음)을 혼성화 기반의 TET QC에 의해 평가하였다. TET는 P5/P7 프라이머에 대한 상보적 서열을 갖는 염료 표지화된 올리고뉴클레오타이드이다. TET를 표면 상에 P5/P7 프라이머와 혼성화하고, 과량의 TET는 세척하고, 부착된 염료 농도는 형광성 검출에 의해 측정한다.
도 6A 및 도 6B는 각각 상보적 염료-함유 올리고뉴클레오타이드(TET QC)와 혼성화된 그래프팅된 대조군 기판 표면의 형광 이미지 및 QC 트레이서를 포함하는 그래프팅된 기판 표면의 형광 이미지를 보여준다. 도 6C는 도 6A 및 도 6B의 그래프팅된 표면에 대하여 QC 트레이서 형광성 대 TET 형광성의 플롯을 보여준다. 도 6A-6C에서 데이터는 QC 트레이서로부터의 형광성 강도가 기판 표면 상의 P5/P7 밀도와 상관 관계가 있는 것으로 보여준다.
표준 클러스터 발생 공정 동안 플로우 셀의 표면으로부터 그래프팅된 QC 트레이서의 절단을 평가하기 위하여, 상이한 QC 트레이서와 그래프팅된 플로우 셀을 사용하였다. 도 7A는 초기 형광 이미지를 보여주고, 이는 클러스터 발생 전에 QC 트레이서와 그래프팅된 플로우 셀을 보여준다. 도 7B는 클러스터-후 형광 이미지를 보여주고, 이는 클러스터 발생 후, QC 트레이서와 그래프팅된 플로우 셀을 보여준다. QC 트레이서(200 nM에서)는 하기와 같다:
5'-헥신-폴리 T 테일-CATCTAGGCATCTAAGCATCAAUCTTACA[아미노 C6 dT-텍사스 레드]-3'(서열 번호 25)(200 nM 트레이서)
5'-헥신-폴리 T 테일-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACA[아미노 C6 dT-텍사스 레드]-3'(서열 번호 26)(200 nM P5) 및
1:1.(200 nM Pg(1:1))의 보정한 최종 P5/P7을 갖는 5'-헥신-폴리 T 테일-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACA[아미노 C6 dT-텍사스 레드]-3'(서열 번호 26).
도 7A의 초기 형광 이미지를 참조하여, 플로우 셀의 어두운 면적은 QC 트레이서로부터의 신호이고; 더 밝은 면적은 대조군 레인(즉, QC 트레이서가 존재하지 않았음)이다. 도 7B의 클러스터 형성-후 형광 이미지를 참조하여, QC 트레이서로부터의 신호는 실질적으로 감소하고, 이는 클러스터 형성 동안 QC 트레이서의 절단을 나타낸다.
도 8A 및 도 8B는 도 7A 및 도 7B의 그래프팅된 플로우 셀에 있어서 각각 QC 트레이서 형광성 그래프팅-후의 플롯 및 QC 트레이서 형광성 클러스터 형성-후의 플롯을 나타낸다. 클러스터 형성 후, 잔여 형광성이 최소임을 보여준다. 절단 효율은 약 97% 내지 약 99% 범위이다.
QC 트레이서 그래프팅 및 다운스크림 서열화 메트릭스 상의 후속적인 절단의 효과를 평가하기 위하여, 도 7A 및 도 7B의 플로우 셀을 서열화를 위하여 사용하였다.
도 9A 및 도 9B는 서열화 주기(C1) 후, 적색 채널에 있어서 각각 리드 1(R1) 형광성 강도의 플롯 및 리드 2(R2) 형광성 강도의 플롯을 나타낸다. 데이터는 적색 채널에서 C1 강도가 QC 트레이서의 사용에 의해 최소로 영향을 받는다는 것을 보여준다.
도 10A 및 도 10B는 서열화 주기(C1) 후, 녹색 채널에 있어서 각각 리드 1(R1) 형광성 강도의 플롯 및 리드 2(R2) 형광성 강도의 플롯을 나타낸다. 데이터는 적색 채널에서 C1 강도가 QC 트레이서의 사용에 의해 최소로 영향을 받는다는 것을 보여준다.
도 11A 및 도 11B는 참조 게놈에 대하여, 각각 리드 1(R1) 서열 정렬의 플롯 및 리드 2(R2) 서열 정렬의 플롯을 나타낸다. 데이터는 서열 정렬 메트릭스에 대한 QC 트레이서의 사용에 의해 영향을 받지 않거나 거의 받지 않는다는 것을 보여준다.
도 12A 및 도 12B는 각각 리드 1(R1) 서열화 착오율의 플롯 및 리드 2(R2) 서열화 착오율의 플롯을 보여준다. 데이터는 서열화 착오율 메트릭스에 대한 QC 트레이서의 사용에 의해 영향을 받지 않거나 거의 받지 않는다는 것을 보여준다.
추가 사항
상기 개념의 모든 조합(이러한 개념이 상호간에 모순되지 않는 한)은 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 부분으로 고려된다는 것이 인식되어야 한다. 특히, 본 개시내용의 끝에 나타나는 청구된 주제의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 부분으로 고려된다. 또한 참고로 포함된 임의의 개시내용에서 나타날 수 있는 본 명세서에서 명백하게 사용된 용어는 본 명세서에 개시된 특정한 개념과 가장 일치하는 의미로 받아들여진다는 것이 인식되어야 한다.
본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허, 및 특허 출원은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.
명세서 전체에서 "하나의 예", "또 다른 예", "예" 등에 대한 언급은 예와 연결되어 기재된 특정한 원소(예를 들면, 특징, 구조, 및/또는 특성)가 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 예에 포함되고, 다른 예에 존재할 수 있거나 존재할 수 없다는 것을 의미한다. 추가로, 문맥에서 달리 명백하게 기재되지 않는 한, 임의의 예에 있어서 기재된 원소는 다양한 예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다는 것이 이해된다.
본 명세서에 제공된 범위는 기재된 범위 및 기재된 범위 내의 임의의 값 또는 하위범위를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들면, 약 10 kDa 내지 약 1500 kDa의 범위는 약 10 kDa 내지 약 1500 kDa의 명백하게 기재된 한계 뿐만 아니라 개별적인 값, 예를 들면, 약 18 kDa, 약 325 kDa, 약 425 kDa, 약 1075.5 kDa 등 및 하위범위, 예를 들면, 약 425 kDa 내지 약 990 kDa, 약 235 kDa 내지 약 780 KDa 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 추가로, "약" 및/또는 "실질적으로"가 값을 기재하는데 사용되는 경우, 이들은 기재된 값으로부터 작은 변동(+/- 10% 이하)을 포함하는 것을 의미한다.
몇몇 예가 상세하게 기재되었지만, 개시된 예는 변형될 수 있다는 것이 이해된다. 따라서, 상기 설명은 비제한적으로 간주된다.
SEQUENCE LISTING <110> Illumina, Inc. <120> ARRAYS WITH QUALITY CONTROL TRACERS <130> WO2018/119063 <140> PCT/US2017/067575 <141> 2017-12-20 <150> US 62/438,2842 <151> 2016-12-22 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_bind <400> 1 aatgatacgg cgaccaccga gauctacac 29 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_bind <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> 8-oxo-guanine <400> 2 caagcagaag acggcatacg anat 24 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 3 catctaggca tctaagcatc aaucttaca 29 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 4 acatacatac atacatacau acataca 27 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthesized <400> 5 attgattgat tgattgatug attgat 26 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> misc_feature <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> poly 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<220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> poly Thymine with a number of T bases ranging from 2-20 <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> red fluorescent dye attached to adenine through Amino-modifier C6 dT linker <400> 25 ncatctaggc atctaagcat caaucttaca n 31 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> misc_feature <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> poly Thymine with a number of T bases ranging from 2-20 <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> red fluorescent dye attached to adenine through Amino-modifier C6 dT linker <400> 26 naatgatacg gcgaccaccg agauctacan 30

Claims (56)

  1. 어레이로서,
    복수의 개별 웰을 포함하는 지지체;
    상기 복수의 개별 웰의 각각 내에 위치한 겔 물질; 및
    상기 복수의 개별 웰의 각각 내의 상기 겔 물질에 그래프팅된 품질 제어 트레이서를 포함하되;
    상기 품질 제어 트레이서는 (a) 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 검출 가능한 표지를 포함하고,
    상기 품질 제어 트레이서는 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 그래프팅된 영역을 포함하고, 상기 제1 말단은 상기 겔 물질에 그래프팅되고, 상기 제2 말단은 상기 검출 가능한 표지에 연결되고 상기 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 영역에 연결되고,
    상기 그래프팅된 영역은 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함하며,
    상기 품질 제어 트레이서는, 상기 검출 가능한 표지로서의 형광성 표지, 및 상기 형광성 표지를 갖는 비-반응성 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 비-반응성 뉴클레오타이드 서열은 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열에 부착되며,
    상기 검출 가능한 표지는 상기 절단 부위에서 상기 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열에 또는 상기 절단 부위에 원위인 상기 절단 가능한 영역에서 위치에 부착되는, 어레이.
  2. 제1항에 있어서, 상기 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 비-반응성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 어레이.
  3. 제1항에 있어서, 상기 그래프팅된 영역은 비-반응성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 어레이.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 절단 부위는 효소적으로 절단 가능한 핵염기를 포함하는, 어레이.
  6. 제5항에 있어서, 상기 효소적으로 절단 가능한 핵염기는 절제 부위를 포함하는, 어레이.
  7. 제5항에 있어서, 상기 효소적으로 절단 가능한 핵염기는 글리코실라제 및 엔도뉴클레아제와의 반응 또는 엑소뉴클레아제와의 반응에 의해 절단 가능한, 어레이.
  8. 제7항에 있어서, 상기 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 이의 5' 말단에서 상기 겔 물질에 그래프팅되는, 어레이.
  9. 제8항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 상기 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열의 이의 3' 말단에 또는 그 근처에 부착되는, 어레이.
  10. 제9항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 상기 품질 제어 트레이서와 상기 엑소뉴클레아제의 반응에 의해 절단 가능한, 어레이.
  11. 제9항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 상기 품질 제어 트레이서와 상기 글리코실라제 및 상기 엔도뉴클레아제의 반응에 의해 절단 가능한, 어레이.
  12. 제1항에 있어서, 상기 절단 부위는 화학적으로 절단 가능한 연결기를 포함하는, 어레이.
  13. 제12항에 있어서, 상기 화학적으로 절단 가능한 연결기는 이웃한 다이올, 다이설파이드, 실란, 아조벤젠, 광절단 가능한 기 또는 아지도를 포함하는, 어레이.
  14. 제1항에 있어서, 상기 복수의 개별 웰의 각각에서 상기 겔 물질에 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 표지화되지 않은 프라이머를 더 포함하되, 상기 품질 제어 트레이서 및 상기 표지화되지 않은 프라이머는 미리 결정된 비율로 존재하는, 어레이.
  15. 제1항에 있어서, 상기 겔 물질은 하기 화학식 (I)의 중합체를 포함하는, 어레이:

    식 중,
    R1은 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    R A 는 아지도, 임의로 치환된 아미노, 임의로 치환된 알켄일, 임의로 치환된 하이드라존, 임의로 치환된 하이드라진, 카복실, 하이드록시, 임의로 치환된 테트라졸, 임의로 치환된 테트라진, 나이트릴 옥사이드, 나이트론, 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R5는 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    각각의 -(CH2)p-는 임의로 치환될 수 있고;
    p는 1 내지 50 범위의 정수이고;
    n은 1 내지 50,000 범위의 정수이고;
    m은 1 내지 100,000 범위의 정수이다.
  16. 제15항에 있어서, 상기 겔 물질은 PAZAM을 포함하는, 어레이.
  17. 제1항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 형광성 표지인, 어레이.
  18. 제17항에 있어서, 상기 형광성 표지는 염화설포닐 염료, 시아닌 염료, 적색 파장 염료, 형광 염료, 플루오레세인의 유도체, 잔텐 형광단, 및 인도카보시아닌 염료로 이루어진 군으로부터 선택되는, 어레이.
  19. 지지체에 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도, 분포, 또는 밀도 및 분포를 결정하는 방법으로서,
    복수의 개별 웰을 포함하는 지지체 및 복수의 개별 웰의 각각 내에 위치한 겔 물질 및 품질 제어 트레이서 및 복수의 개별 웰의 각각에서 상기 겔 물질에 그래프팅된 상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 단계로서, 상기 품질 제어 트레이서는 (a) 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 검출 가능한 표지를 포함하는 단계;
    상기 검출 가능한 표지로부터 신호를 검출하는 단계;
    적어도 부분적으로 상기 검출 가능한 표지로부터의 상기 신호를 기반으로 상기 품질 제어 트레이서의 밀도 및 분포 중 적어도 하나를 결정하는 단계; 및
    적어도 부분적으로 상기 품질 제어 트레이서의 상기 결정된 밀도 및 분포 중 적어도 하나를 기반으로 상기 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도 및 분포 중 적어도 하나를 결정하는 단계를 포함하고,
    상기 품질 제어 트레이서를 상기 겔 물질에 그래프팅하는 단계를 더 포함하며,
    상기 품질 제어 트레이서는 상기 겔 물질에 그래프팅된 제1 말단 및 상기 검출 가능한 표지에 연결되고 상기 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 영역에 연결된 제2 말단을 포함하고,
    상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열이, 상기 품질 제어 트레이서의 상기 그래프팅 전에 또는 동시에, 그리고 상기 검출 단계 전에, 상기 겔 물질에 그래프팅되며,
    상기 품질 제어 트레이서 및 상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열은 상기 겔 물질에 미리 결정된 비율로 그래프팅되고, 상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도 및 분포 중 적어도 하나의 결정이 상기 검출된 신호 및 미리 결정된 비율을 기반으로 하며,
    상기 검출 가능한 표지는 상기 절단 부위에서 상기 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열에 또는 상기 절단 부위에 원위인 상기 절단 가능한 영역에서 위치에 부착되는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 품질 제어 트레이서는 비-반응성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 품질 제어 트레이서는 상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 품질 제어 트레이서의 상기 그래프팅은 또한 상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 상기 겔 물질에 그래프팅하는 것을 돕는, 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 그래프팅된 영역을 포함하고, 상기 제1 말단은 상기 겔 물질에 그래프팅되고, 상기 제2 말단은 상기 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 영역에 연결되고, 상기 그래프팅된 영역의 상기 제2 말단은 상기 절단 가능한 영역의 절단 부위에 연결되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 그래프팅된 영역은 비-반응성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  24. 삭제
  25. 제19항에 있어서, 상기 절단 부위에서 절단 반응에 의해 상기 품질 제어 트레이서로부터 상기 검출 가능한 표지를 제거하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 제거는 효소 절단 또는 화학 절단에 의해 달성되는, 방법.
  27. 제19항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 형광성 표지이고, 검출된 상기 신호는 형광성인, 방법.
  28. 겔 물질에 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도, 분포, 또는 밀도 및 분포를 결정하는 방법으로서,
    품질 제어 트레이서를 지지체 상의 웰 내의 겔 물질에 그래프팅하는 단계로서, 상기 품질 제어 트레이서는 상기 겔 물질에 그래프팅된 제1 말단 및 형광성 표지에 연결되고 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 영역에 연결된 제2 말단을 포함하는, 상기 품질 제어 트레이서를 그래프팅하는 단계;
    형광성을 사용하여 상기 품질 제어 트레이서를 검출하는 단계; 및
    적어도 부분적으로 상기 형광성을 기반으로, 상기 겔 물질에 그래프팅된 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도, 또는 분포, 또는 밀도 및 분포를 결정하는 단계를 포함하고,
    상기 품질 제어 트레이서는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열이고, 상기 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열이며,
    상기 방법은,
    상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도, 또는 분포, 또는 밀도 및 분포가 결정된 후, 상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열로부터 상기 형광성 표지를 절단하는 단계; 및
    상기 검출 전에, 상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 상기 겔 물질에 그래프팅하는 단계로서, 상기 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열 및 상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열은 미리 결정된 비율로 존재하는, 상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 그래프팅하는 단계를 더 포함하며,
    상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열는 태깅되지 않고,
    상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도, 또는 분포, 또는 밀도 및 분포의 상기 결정이 상기 형광성 및 상기 미리 결정된 비율을 기반으로 하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 형광성 표지를 상기 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열로부터 절단하는 단계를 더 포함하되, 상기 절단은 효소 절단 또는 화학 절단에 의해 달성되는, 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 형광성 표지를 상기 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열로부터 절단하는 것은 엑소뉴클레아제를 사용하여 달성되는, 방법.
  31. 품질 제어 트레이서 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 어레이에 공동-그래프팅하는 방법으로서,
    상기 품질 제어 트레이서 및 상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 미리 결정된 비율로 조합하여 그래프팅 혼합물을 형성하는 단계로서, 상기 품질 제어 트레이서는 (a) 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 검출 가능한 표지를 포함하는, 상기 그래프팅 혼합물을 형성하는 단계; 및
    상기 그래프팅 혼합물을 지지체 상의 웰 내의 겔 물질에 노출시키는 단계; 및
    상기 그래프팅 혼합물 및 상기 겔 물질을 배양하여, 상기 품질 제어 트레이서 및 상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 상기 겔 물질에 공동-그래프팅하는 단계를 포함하고,
    상기 검출 가능한 표지는 상기 절단 부위에서 상기 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열에 또는 상기 절단 부위에 원위인 절단 가능한 영역에서 위치에 부착되는, 품질 제어 트레이서 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 어레이에 공동-그래프팅하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 품질 제어 트레이서는,
    이의 3' 말단에서 형광성 표지로 태깅된 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열; 또는
    절단 가능한 핵염기에 부착된 상기 형광성 표지를 갖는 비-반응성 뉴클레오타이드 서열인, 품질 제어 트레이서 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 어레이에 공동-그래프팅하는 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서,
    신호를 상기 검출 가능한 표지로부터 검출함으로써 상기 그래프팅된 품질 제어 트레이서를 검출하는 단계; 및
    적어도 부분적으로 상기 검출된 신호 및 상기 미리 결정된 비율을 기반으로, 상기 겔 물질에 그래프팅된 상기 프라이머 뉴클레오타이드 서열의 밀도, 또는 분포, 또는 밀도 및 분포를 결정하는 단계를 더 포함하는, 품질 제어 트레이서 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 어레이에 공동-그래프팅하는 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 절단 부위에서 효소 절단 또는 화학 절단을 통해 상기 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열로부터 상기 검출 가능한 표지를 제거하는 단계를 더 포함하는, 품질 제어 트레이서 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 어레이에 공동-그래프팅하는 방법.
  35. 제31항에 있어서, 상기 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 상기 검출 가능한 표지를 부착하는 연결기 분자를 포함하는, 품질 제어 트레이서 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 어레이에 공동-그래프팅하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 연결기 분자는 다이올, 다이설파이드, 실란, 아조벤젠, 광절단 가능한 기, 또는 아지도를 포함하는, 품질 제어 트레이서 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 어레이에 공동-그래프팅하는 방법.
  37. 제31항에 있어서, 상기 절단 부위는 절단 가능한 핵염기를 포함하는, 품질 제어 트레이서 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 어레이에 공동-그래프팅하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 절단 가능한 핵염기와 글리코실라제 및 엔도뉴클레아제의 반응 또는 엑소뉴클레아제와의 반응에 의해 상기 검출 가능한 표지를 제거하는 단계를 더 포함하는, 품질 제어 트레이서 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 어레이에 공동-그래프팅하는 방법.
  39. 제31항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 형광성 표지인 품질 제어 트레이서 및 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 어레이에 공동-그래프팅하는 방법.
  40. 품질 제어 트레이서를 어레이에 그래프팅하는 방법으로서,
    품질 제어 트레이서를 지지체 상의 웰 내의 겔 물질에 그래프팅하는 단계를 포함하고;
    상기 품질 제어 트레이서는 (a) 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열 및 (b) 검출 가능한 표지를 포함하고; 그리고
    상기 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열은 제1 말단 및 제2 말단을 갖는 그래프팅된 영역을 포함하고, 상기 제1 말단은 상기 겔 물질에 그래프팅되고, 상기 제2 말단은 상기 검출 가능한 표지에 연결되고 상기 절단 부위를 포함하는 절단 가능한 영역에 연결되며,
    상기 검출 가능한 표지는 상기 절단 부위에서 상기 절단 가능한 뉴클레오타이드 서열에 또는 상기 절단 부위에 원위인 상기 절단 가능한 영역에서 위치에 부착되는, 품질 제어 트레이서를 어레이에 그래프팅하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 그래프팅된 영역은 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 품질 제어 트레이서를 어레이에 그래프팅하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 절단 부위에서 상기 품질 제어 트레이서를 절단하여, 상기 검출 가능한 표지를 제거하고, 상기 겔 물질에 그래프팅된 표지화되지 않은 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 단계를 더 포함하는, 품질 제어 트레이서를 어레이에 그래프팅하는 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 그래프팅된 영역은 비-반응성 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 품질 제어 트레이서를 어레이에 그래프팅하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 프라이머 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머를 상기 겔 물질에 상기 품질 제어 트레이서와의 미리 결정된 비율로 그래프팅하는 단계를 더 포함하는, 품질 제어 트레이서를 어레이에 그래프팅하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 절단 부위에서 절단 반응에 의해 상기 검출 가능한 표지를 상기 품질 제어 트레이서로부터 제거하는 단계를 더 포함하는, 방법.
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