KR102613646B1

KR102613646B1 - 항생제 내성을 갖는 장내세균에 대해 항균 활성을 갖는 신규한 바실러스 벨레젠시스 균주

Info

Publication number: KR102613646B1
Application number: KR1020220161124A
Authority: KR
Inventors: 송호연; 서훈희; 김수경
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2022-11-28
Filing date: 2022-11-28
Publication date: 2023-12-14
Also published as: KR102613646B9

Abstract

본 발명은 신규한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 신규한 바실러스 벨레젠시스는 병원성 장내세균뿐만 아니라 항생제 내성을 갖는 장내세균, 특히, 카바페넴에 내성을 갖는 장내세균을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있어, 치료제, 항균제 등의 다양한 용도로 사용될 수 있다.

Description

항생제 내성을 갖는 장내세균에 대해 항균 활성을 갖는 신규한 바실러스 벨레젠시스 균주{NOVEL BACILLUS VELEZENSIS WITH ANTIVACTERIAL ACTIVITY FOR ANTIBIOTICS RESISTANT ENTEROBACTEIA}

본 발명은, 항생제 내성을 갖는 장내세균에 대해 항균 활성을 갖는 신규한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 및 이의 용도에 관한 것이다.

항생제 저항성(Antimicrobial resistance)은 항생제 처리에 의해 사라졌던 병원균들이 내성이 생겨 더 이상 동일한 항생제로 치료할 수 없게 된 것으로, 2022년 발표된 보고서에 따르면, 2019년에 항생제 저항성과 관련되어 495만명의 사망자가 발생했으며, 이중 127만명은 항생제 저항성에 의해 직접적으로 사망하였다. 더구나, 다제 내성(multidrug resistant) 박테리아 감염을 치료할 수 있는 가장 바람직한 최후의 약물인 카바페넴(carbapenem)에 대한 내성이 1990년 초반에 장내세균(Enterobacteriaceae) 균주에서 보고된 이후, 카바페페네마아제-생성 장내세균(Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae; CRE)이 전 세계로 퍼져나가 전세계 건강 관리에 위기를 일으키고 있다.

한편, CRE를 가장 많이 발생시키는 종은 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae)로, 2019년에 55,700명 이상의 사망자를 발생시켰다. 이와 같이 임상에서 카바페넴의 사용이 증가하는 가운데 카바페넴-내성균의 진화는 상당히 우려되는 상황이다. CRE 감염을 치료하기 위한 기준이 기발되고 있지만, 내성, 치료 실패 및 독성과 같은 문제는 여전히 남아 있어, 효과적인 항-CRE 약물의 개발이 절실히 필요하다.

대한민국 공개특허 제10-2020-0126261호

이에, 본 발명의 발명자는 신규한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주가 병원성 장내세균뿐만 아니라 항생제 내성을 갖는 장내세균의 감염 및 치료에 효과적임을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

이에 따라, 본 발명의 목적은 신규한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주, 상기 균주를 포함하는 병원성 장내 세균 유발성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 항균용 조성물 및 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KCTC 15186BP로 기탁된 신규한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 균주, 이의 파쇄물 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 병원성 장내 세균 유발성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 균주, 이의 파쇄물 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 항생제 내성 장내세균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 균주, 이의 파쇄물 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 병원성 장내 세균 유발성 질환의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.

본 발명의 신규한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주는 병원성 장내세균뿐만 아니라 항생제 내성을 갖는 장내세균에도 항균 활성을 가지므로, 항생제 내성 문제를 해결할 수 있는 새로운 치료제를 제공할 수 있다.

도 1은 식품 단계 배지에서 시간에 따른 박테리아 성장 및 pH 측정 결과를나타낸 것이다. 프로바이오틱스 균주를 접종하고 배양하여 2시간 성장(A) 및 pH (B)를 확인하였다.
도 2는 예방적 감염 마우스 모델에서 CRKP의 임상 분리물에 대한 B. velezensis의 효과를 나타낸 것이다. 실험 기간 동안의(A) 체중 및 (B) 질환 중증도. 질환 중증도는 1, 건강함; 2, 약간 아픔; 3, 중간 정도의 아픔; 4,심각하게 아픔; 5, 사망으로 평가하였다. (C) 실험 기간 동안의 생존율. (D)CRKP 처리 그룹(좌측 이미지), CRKP + B. velezensis 처리 그룹(우측 이미지). 대조와의 통계적 유의성은 unpaired Student’s t-test을 사용하여 분석하였다(*** p < 0.001; **p < 0.01; * p < 0.05).
도 3은 치료학적 감염 마우스 모델에서 CRKP의 임상 분리물에 대한 B. velezensis의 효과를 나타낸 것이다. 실험 기간 동안의(A) 체중 및 (B) 질환 중증도. 질환 중증도는 1, 건강함; 2, 약간 아픔; 3, 중간 정도의 아픔; 4,심각하게 아픔; 5, 사망으로 평가하였다. (C) 실험 기간 동안의 생존율. (D)CRKP 처리 그룹(좌측 이미지), CRKP + B. velezensis 처리 그룹(우측 이미지).대조와의 통계적 유의성은 unpaired Student’s t-test을 사용하여 분석하였다(*** p < 0.001; ** p < 0.01; * p < 0.05).
도 4는 기니어피그에서 B. velezensis의 2주 반복 경구 투여 독성 테스트 결과를 나타낸 것이다. 기니어피그의 체중은1, 3, 5, 7, 9, 10, 및 14일에 측정하였다. 후보 프로바이오틱스를 2주간 매일 1회 동물 당 200μl로 2×10⁸CFU/마우스/day을 투여하였다.

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.

따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명은 기탁번호 KCTC 15186BP로 기탁된 신규한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주에 관한 것이다.

상기 바실러스 벨레젠시스는 복분자 식초 유래의 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 바실러스 벨레젠시스는 병원성 장내세균에 대한 항균 활성을 가질 수 있으며, 상기 장내 병원성 세균은 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피머리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스 (Salmonella cholerasuis), 살모넬라 더비 (Salmonella derby), 포도상 구균 (Staphylococcus aureus), 장독성 대장균 (enterotoxigenic E. coli), 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes), 캠필러박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 시겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri), 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 콜로스트리듐 디피실리 (Clostridium difficile), 반코마이신 내성 엔터로코커스 (vancomycin resistant enterococcus), 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 바실러스 벨레젠시스는 항생제 내성 장내세균에 대한 항균 활성을 가질 수 있으며, 상기 항생제 내성 장내 세균은 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae)일 수 있고, 상기 항생제는 카바페넴(carbapenem)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 벨레젠시스 균주, 이의 파쇄물 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 병원성 장내 세균 유발성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 상기 바실러스 벨레젠시스 균주, 이의 파쇄물 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 항생제 내성 장내세균에 대한 항균용 조성물에 관한 것이다.

상기 병원성 장내 세균 유발성 질환은 식중독, 장티푸스, 복막염, 궤양성 대장염, 크론병, 장관 베체트병, 감염성 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장관 급이성 설사 또는 허혈성 장염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 항생제 내성 장내세균은 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 “배양액”은 미생물이 증식하기에 적합한 요소가 포함된 배지에, 목적 미생물을 종균하여, 일정시간 배양한 후 수득되는 것으로서, 미생물 및 배지를 포함하는 개념이다.

본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 효과를 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에 0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 벨레젠시스, 이의 파쇄물 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 병원성 장내 세균 유발성 질환의 예방 또는 개선을 위한 식품조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 본 발명의 유효성분을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 기능성 식품 조성물은 결핵의 예방 또는 치료 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능성 식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예]

<실시예 1> CRKP

CRKP (carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae)는 순천향대 병원의 Pathogenic Resource Bank (Tajdozian et al. 2021)에서 입수하여 MacConkey broth (BD Difco, USA)에서 배양하고 37 ℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 박테리아 성장을 spectrophotometer (DR 1900, HACH, USA)를 사용해 측정하고, 600 nm (OD600 nm)에서 광학 밀도를 1.0으로 조정하였다. 그런 다음, colony-forming unit(CFU) assay으로 박테리아 수를 셌다. 다음 사용을 위해, 60% 글리세롤 내의 스톡 배양을 제조하여 -80 ℃에서 보관하였다.

<실시예 2>

자연적으로 발효된 식초로부터 프로바이오틱스 균주의 분리 및 동정

전라도 고창에서 입수한 14일간 발효된 고창 복분자 식초로부터 후보 프로바이오틱스를 얻었다. 후보 프로바이오틱스를 MRS agar (BD Difco, USA) 플레이트로 옮기고 37 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 단일 콜로니를 선택하여 MRS broth (BD Difco, USA)에서 하위배양하였다. 호기성 조건 하 37℃의 진탕 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션한 후, 박테리아 성장을 spectrophotometer로 측정하였다. 다음 사용을 위해, 60% 글리세롤 내의 스톡을 제조하여 -80 ℃에서 보관하였다. 상기 프로바이오틱스 균주를 16S rRNA 시퀀싱 및 종 확인을 위해 전문업체 (Biofact Co, Daejeon, Korea)에 의뢰하였다.

생화학적 테스트

API 50CH kit (bioMerieux, France)를 사용해 생화학적 테스트를 실시하여 다른 기준 균주와 프로바이오틱스 균주의 탄수화물 발현 양상을 비교하였다. 후보 프로바이오틱스 균주를 MRS 아가 플레이트에 배양한 후, 단일 콜로니를 선택하여 1 ml 현탁 배지와 혼합하였다. 그런 다음, 현탁액의 탁도를 2 McFarland를 사용하여 결정하고 0.1 ml의 현탁액을 10 ml의 CHB 배지(bioMerieux, France)에 희석하였다. 그런 다음, API kit로부터 스트립을 제거하여 트레이에 놓았다. 마지막으로 제조된 박테리아 현탁액을 스트립의 웰로 옮기고 37 ℃에서 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 각 웰의 색 변화를 관찰하고 식별표를 (+/-)로 작성하였다.

정량 RT-PCR 검정

qRT-PCR을 실시하여 분리된 균주를 확인하였다. QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Germany)를 사용하여 분리된 후보 프로바이오틱스 균주로부터 게놈DNA를 추출하였다. B. velezensis KCTC 13417, Bacillus amyloliquefaciens KCTC 3002, Bacillus subtilis KCTC 3135, 및 Bacillus lichenoformis KCTC 1659에서도 게놈 DNA를 추출하였다. 상기 균주들은 바실러스 속에서 밀접하게 관련된 종을 구별하기 위한 기준 미생물로서 Korean Collection for Type Cultures (KCTC)에서 입수하였다. 그런 다음 추출된 DNA를 희석하여 종 특이 프라이머를 사용하여 qRT-PCR을 실시하였다. B. velezensis 및 B. amyloliquefaciens를 구별하기 위해 마크로락틴(macrolactin) 유전자용 프라이머를 사용하였다. 사용된 프라이머는 표 1에 나타냈다. 10μl의 SYBER Green Supermix (BIO-RAD, USA), 4μl nuclease-free water, 5μl의 게놈 DNA, 및 각 0.5μl의 포워드 및 리버스 프라이머로 구성된 20μl의 최종 부피로 qRT-PCR을 실시하였다. 하기 열 사이클 단계에 따라 증폭을 실시하였다: 95 ℃에서 3분간 초기 DNA 변성 단계, 변성을 위해 95 ℃에서 10초간 39 사이클, 어닐링을 위해 55 ℃에서 10초, 및 연장을 위해 72 ℃에서 30초.

결과

16S rRNA 유전자 시퀀싱에 기반한 동정

16S rRNA 유전자 시퀀싱 분석을 분리된 균주에 대해 실시하고(표 2), 결과를 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 데이터베이스의 서열과 비교하였다. 프로바이오틱스 균주의 16S rRNA 유전자 시퀀싱은 B. velezensis 균주FZB42, B. velezensis 균주CBMB205, B. amyloliquefaciens 균주 NBRC 15535, 및 B. subtilis subsp. subtilis 균주의 16S rRNA 유전자 서열과 99%의 서열 상동성을 가졌으며, B. licheniformis 균주 DSM 13 및 B. licheniformis 균주 BCRC 11702과도98%의 서열 상동성을 보였다. 이러한 발견은 분리된 균주가 Bacillus 속에 속함을 제시하는 것이다.

API kit에 의한 분리된 프로바이오틱스 균주의 탄소 사용 검정

프로바이오틱스 균주의 표현형을 확인하고 특성화하기 위해, API 50CH Biochemical Kit를 사용하여 생화학적 특성화를 실시하였다. 분리된프로바이오틱스 균주의 탄소원의 사용 양상을 B. velezensis KCTC 13417, B. amyloliquefaciens KCTC3002, 및 B. lichenoformis KCTC 1659와 비교하고, 그 결과를 표 3에 나타냈다. 후보 균주는 B. licheniformis 및 B. amyloliquefaciens보다는 B. velezensis와 더 비슷한 탄소원 사용 양상을 보였으나 KCTCB. velezensis와는 약간의 차이가 있었다.

qRT-PCR 검정에 의한 분리된 프로바이오틱스 균주의 동정

종 특이 프라이머 세트를 사용해 qRT-PCR 검정을 실시하여 후보 프로바이오틱스 균주를 동정하고 (표 4), 결과적으로 생성된 역치 사이클(Ct 수치)를 분석하였다. B. velezenesis 특이프라이머가 B. velezensis KCTC 13417 및 본 발명의 후보 프로바이오틱스 균주 둘 다에 특이적임을 발견하였으나, 밀접하게 관련된 다른 종은 검출되지 않았다. B. amyloliquefaciens 특이 프라이머를 사용하여 B. amyloliquefaciens KCTC 3002, B.velezensis KCTC 13417, 및 후보 프로바이오틱스 균주의 증폭 결과를 관찰하였으나, 프라이머는 특이적으로 작동하지 않았다. 그러므로, B. amyloliquefaciens 및 B. velezensis를 구별하기 위해, 마크로락틴-특이 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였다. 마크로락틴은 B. velezensis에서만 검출되는 유전자 클러스터이다. 마크로락틴-특이 프라이머를 사용하여 PCR을 실시한 후, B. velezensis KCTC 13417 및 후보 프로바이오틱스 균주의 증폭 사이클이 유사하나 B. amyloliquefaciens KCTC 3002와는 유사하지 않음을 확인하였다. 이러한 결과는 후보 프로바이오틱스 균주가 B. velezensis임을 명백하게 입증하는 것이다. B. lichenoformis 및 B.subtilis에 대한 종-특이 프라이머는 각각 B. lichenoformis KCTC 1659 및 B. subtilis KCTC 3135에서 증폭되었으며, 다른 균주에 대해서는 증폭되지 않았다. 이러한 결과들에 의해 분리된 프로바이오틱스 균주가 B. velezensis임이 확인되었으며, 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주(KCTC 15186BP)를 2022년 11월 9일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 특허미생물 기탁을 실시하였다.

<실시예 3>

연구실 규모의 식품-등급 배지에 기반한 발효조를 사용한 B. velezensis 의 배양

항-CRE 치료제 가능성이 있는 본 발명의 균주를 배양하기 위해 식품-등급 배지(FGM)을 사용하였다. 본 발명의 균주가 FGM에서 잘 성장하므로 배양에 사용하였다. 또한, FGM은 인간에게 무해하며 MRS 배지에 기반한 글루코스, 효모 펩톤, Tween 80, 및 황산 마그네슘으로 구성되어 있다(표 5). 최적화된 FGM의 pH는 7.5이며, 6 N HCl을 사용하여 pH를 6.3으로 조정하였다. 발효조 시스템에서 성장시키기 전에, 30 ml FGM에 균주를 배양하였다. 37 ℃에서 18시간 동안 인큐베이션한 후, 인큐베이션 기간 동안 2시간 마다 배양 브로스의 OD 및 pH를 각각spectrophotometer 및 pH meter (METTLER TOLEDO, Switzerland)로 확인하였다. 박테리아 성장 및 pH를 확인한 후, 프로바이오틱스 균주를 연구실 규모 발효조 시스템(FMT-ST-S07, Fermentec, South Korea)에서 성장시켰다. 발효조를 우선2L의FGM으로 채웠다. 그런 다음 FGM가 채워진 발효조를 121℃에서 15분간 오토클레이브하였다. 그런 다음, 배지가 최적 온도에 다다르면, 1.0%의 프로바이오틱스 배양을 발효조 시스템으로 무균성으로 첨가하고 발효조 임펠러를 사용하여 37 ℃에서 10시간 동안 배양하였다. 인큐베이션한 후, 배양을 살균 컨테이너에서 회복시키고 원심분리하고 세척한 후 각 치료 모델 마우스용으로 1.5×10⁹CFU/200μl에서 배양 상청액으로 재현탁하였다. FGM-배양된 프로바이오틱스를 치료 모델에 사용하였으나, MRS-배양된 프로바이오틱스는 예방 모델 및 독성 실험에 사용하였다.

결과

프로바이오틱스 균주를FGM에서 배양하고 박테리아 성장 및 pH를 2시간마다 확인하였다(도 1). 도 1a는 후보 프로바이오틱스 균주의 성장 곡선을 나타낸 것이다. 이의 OD는 10시간 인큐베이션 후에 0.8에 도달하였다. 브로스 배양액의 pH 또한 확인하였으며, 2시간 인큐베이션 후 pH가 감소됨을 확인하였으며 18시간까지 천천히 감소가 계속되었다(도 1b). 이러한 결과에 근거하여 본 발명의 균주를 실험실 규모 발효조 시스템에서 배양하였다.

<실시예 4>

CRKP-감염 마우스 모델에서 바실러스 벨레젠시스의 효과

CRKP-감염 마우스 모델에서 프로바이오틱스의 효능을 평가하기 위해 9주령 암컷 BALB/c 마우스(Dooyeol Biotech, Korea)를 예방 및 치료 모델을 사용하였다. 예방 모델은 감염 전 프로바이오틱스의 투여에 의한 예방 효과를 확인하기 위한 것이고, 치료 모델은 감염 후 프로바이오틱스를 투여하여 치료 효과를 확인하기 위한 것이다. 두 모델 모두에서 프로바이오틱스의 처리 시점에, 프로바이오틱스-처리 그룹은 B. velezensis을 투여받았다. 그러나, 감염 및 대조 그룹은 동일한 치료 조건을 위해 증류수를 경구 섭식시켰다. 두 모델 모두에서, 위장 중화를 위해 중탄산나트륨(NaHCO₃)을 경구 투여하여 생 병원균의 장 내 도착을 증가시켜 동물의 중증도를 증가시켰다. 또한, 감염 3일 전에 시클로포스마이드를 복강내 주입하여 호중구감소증을 유도하였다. Fluorouracil (5-FU) 또한 복강내 투여하여 추가적으로 면역억제를 유도했다. 실험 기간 동안 두 모델 둘 다의 질환 중증도 스코어, 체중 및 생존율을 확인하였다.

후보 프로바이오틱스 균주인 B. velezensis의CRKP185 감염 BALB/c 마우스에서의 예방 효과를 확인하였다. 감염 3일 전에 경구 섭식으로 단일 투여로 매일 200 μl의 1.5×10⁹CFU/마우스로 프로바이오틱스 균주를 투여하였다. 450 mg/kg (200μl)의 시클로포스마이드(SigmaAldrich, USA)를 감염 3일 전에 복강내 투여하였다. 호중구감소증 유도 후 3일째에, 0일에 6.7×10⁹CFU/200μl/마우스의 투여량 및 2, 10, 및 12일에 9×10⁹CFU/200μl/마우스의 투여량으로 경구 투여를 통해 주 2회 감염을 유도하였다. NaHCO₃(0.2M,200μl)(SigmaAldrich,USA)를 감염과 함께 투여하였다. 5-FU (50mg/kg, 200μl) (Sigma Aldrich, USA)를 감염 유도 후 13일 및 15일에 복강내 투여하였다.

CRKP-감염BALB/c 마우스에서 후보 프로바이오틱스 균주인 B. velezensis의 치료 능성을 연구하였다. 치료 마우스 모델에서, 200μl의 시클로포스마이드(450 mg/kg)를 감염 3일 전에 복강내 주입하였다. 그런 다음 NaHCO₃(0.2M,200μl)을 전처리한 후 0, 2, 및 6일에 9×10⁹CFU/마우스로 200μl CRKP을 경구 투여하여 감염을 유도하였다. 감염 처리 후 다음날에 마우스에 1.5×10⁹CFU/200μl/마우스로 B. velezensis을 2회 처리하였다. 그런 다음, 5- FU (50mg/kg, 200μl)를 10일 및 14일에 1회 투여로 복강내 주입하였다.

결과

CRKP-감염 마우스에서 B. velezensis 의 예방 효과 평가.

후보 균주의 예방 효과를 평가하였다(도 2). 실험 기간 동안 비처리된 마우스의 체중은 B.velezensis를 처리한 마우스에 비해 상당히 더 감소하였다(도 2a). 18 및 20일에 처리 그룹의 체중감소 비율은 8.4%인 반면, 비처리 그룹은35.8%였다. 프로바이오틱스 처리 그룹 및 질환 중증도 스코어도 0일부터 21일까지 확인하였다(도 2b). 프로바이오틱스를 처리하지 않은 그룹은 실험 기간 동안 꾸준히 중증도 스코어가 증가하다가 2주 내지 3주차에 급격히 증가였으나, 프로바이오틱스-처리 그룹에서는 증가율이 더 낮았다. 두 그룹의 마우스의 생존율을 도 2c에 나타냈다. 비처리된 그룹은 20일에 60%의 생존율을 보였으며 21일에 모든 마우스가 사망한 반면, 처리 그룹은 80%의 마우스가 실험 마지막까지 생존하였다. 도 2d는 다른 그룹의 마우스의 이미지를 나타낸 것이다. 실험 종료 후, 프로바이오틱스를 처리하지 않은 감염 그룹은 모두 사망하였으나(좌측 이미지), 프로바이오틱스-처리 그룹의 마우스는 건강함을 (우측 이미지) 발견하였다. 이러한 결과는 후보 프로바이오틱스 균주가 마우스 모델에서 CRKP 감염에 대해 예방 효과를 보임을 나타내는 것이다.

CRKP-감염 마우스에서 B. velezensis 의 치료 효과 평가.

치사 CRKP-감염 마우스에서의 B. velezensis의 치료 효과를 평가하였다(도3). 13 및 18일에, 비처리된 그룹은 체중의 29.5%가 감소한 반면에, 처리 그룹은 아주 적은 체중 감소를 보였다(도 3a). 실험 0일 및 20일에 프로바이오틱스-처리 그룹 및 감염 그룹의 질환 중증도를 측정하였다(도 3b). 그룹 사이의 질병 스코어의 차이가 관찰되었다. 마우스의 생존율을 도 3c에 나타냈다. 비처리된 그룹의 생존율은 50.2%까지 감소한 반면, 처리 그룹의 모든 마우스는 생존하였다. 도 3d는 CRKP 감염 후의 이미지를 나타낸 것으로, 감염 그룹은 질병에 걸려있거나 결국에는 사망하였으며(좌측 이미지), 프로바이오틱스 처리 그룹의 모든 마우스는 건강하였다(우측 이미지).

<실시예 5>

기니어피그에서 프로바이오틱스의 반복된 경구 급성 독성의 평가

기니어피그에서 프로바이오틱스의 2주 반복 경구 급성 독성 평가를 실시하였다. 성체 수컷 기니어피그(1,000 내지 1,280 g의 체중 범위)에게 경구 투여하였으며, 멸균수를 부형제로 사용하였다. 처리 그룹은, 프로바이오틱스(2× 10⁸CFU/ml/200μl)를 매일 1회 투여하고 임상 증상, 사망률 및 체중 변화를 전체 기간 동안 관찰하였다.

그 결과, 그룹에서 체중의 유의미한 변화는 관찰되지 않았다(도 4). 또한, B. velezensis를 처리한 기니어피그에서 특이한 임상 증상이나 사망은 관찰되지 않았다(표 6).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원 생물자원센터

KCTC15186BP

20221109

Claims

기탁번호 KCTC 15186BP로 기탁된 복분자 식초 유래의 신규한 바실러스 벨레젠시스(Bacillus velezensis) 균주.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 바실러스 벨레젠시스는 병원성 장내세균에 대한 항균 활성을 갖는 것인, 균주.
제 3항에 있어서,
상기 병원성 장내세균은 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 살모넬라 갈리나룸 (Salmonella gallinarum), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis), 살모넬라 타이피머리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 콜레라수이스 (Salmonella cholerasuis), 살모넬라 더비 (Salmonella derby), 포도상 구균 (Staphylococcus aureus), 장독성 대장균 (enterotoxigenic E. coli), 리스테리아 모노사이토제네스 (Listeria monocytogenes), 캠필러박터 제주니 (Campylobacter jejuni), 시겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri), 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 콜로스트리듐 디피실리 (Clostridium difficile), 반코마이신 내성 엔터로코커스 (vancomycin resistant enterococcus) 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 (Clostridium perfringens), 으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 균주.
제 1항에 있어서,
상기 바실러스 벨레젠시스는 항생제 내성 장내세균에 대한 항균 활성을 갖는 것인, 균주.
제 5항에 있어서,
상기 항생제 내성 장내 세균은 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae)를 감소시키는 것인, 균주.
제 5항에 있어서,
상기 항생제는 카바페넴(carbapenem)인 것인, 균주.
제 1항의 바실러스 벨레젠시스 균주(KCTC 15186BP), 이의 파쇄물 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 병원성 장내 세균 유발성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 8항에 있어서,
상기 병원성 장내 세균 유발성 질환은 식중독, 장티푸스, 복막염, 궤양성 대장염, 크론병, 장관 베체트병, 감염성 설사, 위장염, 염증성 장질환, 신경성 장염 증후군, 소장 미생물 과성장증, 장관 급이성 설사 및 허혈성 장염으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 조성물.
제 1항의 바실러스 벨레젠시스(KCTC 15186BP), 이의 파쇄물 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 항생제 내성 장내세균에 대한 항균용 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 항생제 내성 장내세균은 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae)인 것인, 조성물.
제 1항의 바실러스 벨레젠시스(KCTC 15186BP), 이의 파쇄물 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 병원성 장내 세균 유발성 질환의 예방 또는 개선을 위한 식품조성물.