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KR102585909B1 - 다능성 줄기 세포로부터 유래된 기능성 희소돌기아교세포 및 이의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

다능성 줄기 세포로부터 유래된 기능성 희소돌기아교세포 및 이의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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KR102585909B1
KR102585909B1 KR1020217036151A KR20217036151A KR102585909B1 KR 102585909 B1 KR102585909 B1 KR 102585909B1 KR 1020217036151 A KR1020217036151 A KR 1020217036151A KR 20217036151 A KR20217036151 A KR 20217036151A KR 102585909 B1 KR102585909 B1 KR 102585909B1
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뉴욕 스템 셀 파운데이션, 인코포레이티드
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Abstract

희소돌기아교세포 전구 세포(OPC) 및 다능성 줄기 세포(PSC)로부터의 희소돌기아교세포의 효과적이고 강력한 생성이 기재된다. 제공된 프로토콜은 이전 프로토콜에서 필요한 120 내지 150일보다 유의미하게 짧은 기간으로, 신경 줄기 세포로부터 OLIG2+ 전구세포로, 그 다음, O4+ OPC로의 희소돌기아교세포 분화의 주요 단계를 개괄한다. 추가로, O4+ OPC는 MBP+ 성숙 희소돌기아교세포로 시험관내 분화될 수 있으며, 면역저하된 시버러 마우스에 주사되는 경우, 생체내 축삭돌기에 수초형성할 수 있고, 재수초형성을 위한 PSC-유래 세포의 이식이 기술적으로 실현 가능하다는 개념의 증거를 제공한다.

Description

다능성 줄기 세포로부터 유래된 기능성 희소돌기아교세포 및 이의 제조 및 사용 방법{FUNCTIONAL OLIGODENDROCYTES DERIVED FROM PLURIPOTENT STEM CELLS AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2014년 5월 22일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/002,048호의 우선권의 이득을 청구하고, 이는 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
이러한 특허 문서의 공개내용 중 일부는 저작권 보호의 대상이 되는 자료를 포함한다. 저작권자는 특허청 특허 서류 또는 기록에서 나타나는 바와 같이 누군가의 특허 문서 또는 특허 공개의 복사에 이의를 갖지 않지만, 그 외에는 어떠한 경우에도 모든 저작권 권리를 보유한다.
서열 목록의 포함
첨부 서열 목록 내의 자료는 여기서 본 출원에 참고로서 포함된다. 명칭 NYSC1250_1WO_Sequence_Listing_ST25의 첨부 서열 목록 텍스트 파일은 2015년 5월 22일자로 생성되었고, 2 kb이다. 파일은 윈도우즈(Windows) OS를 사용하는 컴퓨터에서 마이크로소프트 워드(Microsoft Word)를 사용하여 평가될 수 있다.
기술분야
본 발명은 희소돌기아교세포 전구 세포(OPC) 및 다능성 줄기 세포(PSC)로부터 희소돌기아교세포를 생성하는 효과적인 방법에 관한 것이다.
희소돌기아교세포(oligodendrocyte)는 척추동물에 존재하는 중추 신경계 세포이다. 이들은 뉴런의 축삭돌기를 둘러싸고, 확정된 전기 절연 부분을 생성하는 적층된 지질 풍부 수초 시스를 생성하여 활동 전위 전도의 속도를 최대화한다. 수초는 또한 축삭돌기 보전 및 생존에 중요하고, 심지어 희소돌기아교세포 물질대사에 영향을 미치는 작은 변화는 신경퇴화를 야기할 수 있는 것으로 나타났다. 문헌[Kassmann, C.M. et al., Nature Genet. 39:969-976(2007)]. 인간 뇌가 높은 함량의 수초형성된 뉴런(백질)을 갖고, 수초형성은 출생 후와 일생에 걸쳐 계속되기 때문에, 수초형성 과정은 인간에게 특히 중요하다. 문헌[Bartzokis, G., Adolescent Psychiat. 29:55-96(2005)]. 이는 희소돌기아교세포가 불활성 절연을 제공할 뿐만 아니라 수초형성이 인지 기능 및 심지어 행동에 영향을 미치는 동적 과정이라는 것을 제시한다.
다발성 경화증(MS), 부신백질이영양증, 소멸 백질 질환, 펠리체우스-메르츠바허병, 및 백질이영양증은 탈수초(demyelinating) 또는 수초형성장애(dysmyelinating) 질병의 예이다. 추가로, 희소돌기아교세포의 중요한 역할은 근위축 측삭 경화증, 헌팅톤병, 알츠하이머병, 및 조현병을 포함한 많은 기타 신경 질환 및 신경퇴행성 병태에서 나타난다. 문헌[Bernstein, H.G. et al., Schizophr. Res. 161:4-18(2015); Behrendt, G. et al., Glia 61:273-286(2013); Kang, J. et al., Ann. Vasc. Surg. 27:487-496(2013); Fennema-Notestine, C. et al., Neurology 63:989-995(2004)]. 인간 희소돌기아교세포 전구 세포(oligodendrocyte progenitor cell: OPC)는 수초형성 화합물의 선별을 위한 시험관내 수초형성 검정을 개발하기 위하여 사용될 수 있고, 궁극적으로 자가 세포 대체 요법의 공급원이 될 수 있다. 특히, 자가 세포 요법에 있어서 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)로부터의 환자-특이적 세포의 생성은 유망한 개념으로 최근에 나타났다. 문헌[Wang, S. et al., Cell Stem Cell 12:252-264(2013); Goldman, S.A. et al., Science 338:491-495(2012)].
인간 희소돌기아교세포 생물학 및 인간 수초형성의 연구는 생검 또는 부검으로부터의 1차 세포에 대한 제한된 접근에 의하여 방해되었다. 다능성 줄기 세포(PSC)는 어떠한 목적하는 세포 유형도 생성될 수 있는 대안적이고 유용한 공급원으로서 지난 20년간 사용되어 왔다. 이는 배아 발생의 기본 단계를 시험관내에서 재현함으로써 달성되었다. 문헌[Irion, S. et al., Cold Spring Harb. Sym. 73:101-110(2008)]. 특히, 계통 수임의 대부분의 중요 경로는 마우스와 인간 사이에서 보존되고, 따라서 마우스 발생 생물학으로서 수득된 통찰은 인간 PSC(hPSC)로부터의, 희소돌기아교세포를 포함한 다수의 세포 유형을 생성하는데 성공적으로 적용되어 왔다. 문헌[Murry, C.E. et al., Cell 132:661-680(2008)].
마우스에서, 희소돌기아교세포 전구체는 운동 뉴런 전구(pMN) 도메인 내에서 발생한다. 마우스 배아 발생 동안, 레티노산(RA) 및 소닉 헤지호그(SHH) 경로는 pMN 도메인을 정의하는데 중요하다. 이러한 발견은 신경상피 세포를 전사 인자 OLIG2를 발현하는 pMN 도메인의 전구세포로 전환시키는 시험관내 배양에서 활용되어 왔다. 문헌[Wichterle, H. et al., Cell 110:385-397(2002)]. 10 μM의 농도에서 RA는 인간 배아 줄기 세포(hESC)를 희소돌기아교세포로 분화시키는 대부분의 방법에서 사용되어 왔다. 문헌[Izrael, M. et al., Mol. Cell. Neurosci. 34:310-323(2007); Nistor, G. I. et al., Glia 49:385-396(2005)]. 장(Zhang) 실험실은 SHH가 OLIG2+ NKX2.2+ 전구세포의 유도, 및 SOX10, PDGFRα 및 궁극적으로 O4를 발현하는 희소돌기아교세포 전구 세포(OPC)로의 이의 전환을 위하여 필요하다는 것을 입증하였다. 문헌[Hu, B.Y. et al., Development 136:1443-1452(2009a)]. 시험관내 OPC의 출현은 마우스 모델에 비하여 인간 모델에서 유의미하게 지연되고; 인간 모델에서 OLIG2+ 전구세포의 피크와 OPC의 피크 사이에 10주의 지연된 기간이 존재한다. 문헌[Hu, B.Y. et al., Nat. Protoc. 4:1614-1622(2009b)].
몇몇 그룹은 PSC를 OPC로 분화시키기 위하여 고안된 프로토콜을 갖는다. 문헌[Numasawa-Kuroiwa, Y. et al.; Stem Cell Rep. 2:648-661(2014); Stacpoole, S.R. et al., Stem Cell Rep. 1:437-450(2013); Wang et al.,(2013); Liu, Y. et al., Nat. Protoc. 6:640-655(2011); Sim, F.J. et al., Nat. Biotechnol. 29:934-941(2011)]. 그러나, 이러한 분화 프로토콜은 너무 길고 비효율적이고; 이의 실제 적용은 O4 항원을 발현하는 OPC를 수득하는데 필요한 120일의 배양 시간에 의하여 제한된다. 추가로, 수득된 O4+ 세포의 보고된 효율성은 4% 내지 47% 범위이다. 추가로, 많은 분화 프로토콜은 오직 하나의 또는 둘의 hESC 세포주를 사용하여 최적화되었고, iPSC 세포주에 의한 이의 재현성은 논란의 여지가 있다. 문헌[Alsanie, W. et al., Stem Cell Devel. 22:2459-2476(2013)].
따라서, 비교적 단기간에 다수의 정제된 OPC를 생성하는 개선된 희소돌기아교세포 분화 프로토콜이 매우 바람직하다. 게다가, 이러한 프로토콜은 상이한 PSC 세포주 중에서 재현 가능하여야 하고, 매우 효율적이어야 한다.
본 기재내용의 다른 부분에 기재된 문서 이외에, 하기 참고문헌은 추가의 내용을 제공할 수 있다. 본 기재내용에 기재된 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참고로서 포함된다. 추가로, 본 명세서에 기재되거나 언급된 임의의 제품의 임의의 제조사의 설명서 또는 카탈로그는 참고로서 포함된다. 본문에 참고로서 포함된 문서, 또는 그 안의 임의의 교시는 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 본문에 참고로서 포함된 문서는 선행 기술인 것으로 인정되지 않는다. Antel, J. et al., Acta Neuropathol. 123:627-638(2012). Boulting, G.L. et al., Nat. Biotechnol. 29:279-286(2011). Hauser, S.L. et al., Ann Neurol. 74:317-327(2013). Hu, Z. et al., Differentiation 78:177-184(2009). Miller, R.H. et al., J. Neurosci. Res. 76:9-19(2004). Patani, R. et al., Nature Communications 2:214(2011). Rice, C.M. et al., J. Neurol. Neurosurg. Ps. 84:1100-1106(2013). Tomassy, G.S. et al., Frontiers Cell. Neurosci. 8:201(2014). Yamada M. et al., Nature 510:533-536(2014).
본 발명의 몇몇 주요 측면을 하기 요약한다. 추가 측면은 본 기재내용의 발명을 실시하기 위한 구체적인 설명, 실시예, 도면, 및 청구범위 부분에 기재된다. 본 기재내용의 각각의 부분에서 설명은 다른 부분과 함께 읽혀지는 것이 의도된다. 게다가, 본 기재내용의 각각의 부분에 기재된 다양한 실시형태는 다양한 상이한 방식으로 조합될 수 있고, 모든 이러한 조합은 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
본 발명은 75일 내에 40% 내지 70% O4+ OPC를 생성하는 강력한 분화 프로토콜을 제공한다. 문헌[Douvaras, P. et al., Stem Cell Rep. 3:250-259(2014)](본 명세서에 그 전문이 참고로서 포함됨). 또한 실질적인 비용 감소를 야기하는, 단지 분화 55일 후 약 30% O4+ OPC를 수득하는 전략이 제공된다. 문헌[Douvaras, P. et al., Nat. Protoc.(2015)](본 명세서에 그 전문이 참고로서 포함됨). 정제되는 경우, O4+ 세포는 생착할 수 있고, 단기간(16주)의 시버러(shiverer)(shi/shi) 마우스 모델로의 이식 연구는 인간 태아 OPC와 비슷한 수초형성 가능성을 나타낸다. OPC는 이들이 PDGFRα보다는 O4를 발현하는 단계에서 형광 활성 세포 분류(FACS)에 의해 정제되고, 이는 오염물 세포를 제거하고 종양형성 가능성을 최소화한다. 우리의 프로토콜은 각 세포주에 대하여 보이는 결과가 매우 일치하는, 9종 초과의 hPSC 세포주를 사용하여 입증하였다. 따라서, 본 발명은 효율적으로 OPC를 유도하고, 배아 줄기 세포(ESC) 및 iPSC를 포함한 PSC로부터 희소돌기아교세포를 성숙시키는 매우 재현 가능한 프로토콜을 제공한다.
하나의 측면에 있어서, 본 발명은 OLIG2+ OPC의 생성 방법으로서, (a) (i) PSC를 저밀도로 표면에 접종(seeding)하고; (ii) PSC를 1 내지 2일 동안 부착 배양으로 배양하여 PSC 콜로니를 제조함으로써, PSC 콜로니를 제조하는 단계; (b) PSC 콜로니를 융합(confluence)이 될 때까지 저농도의 RA, 형질전환 성장 인자 베타(TGFβ) 신호전달의 적어도 하나의 저해제, 및 골 형태형성 단백질(BMP) 신호전달의 적어도 하나의 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 배양의 제1 일이 0일인 단계; (c) 융합 세포를 평활화(Smoothened) 효능제(SAG; 3-클로로-N-[(1r,4r)-4-(메틸아미노)사이클로헥실]-N-[3-(피리딘-4-일)벤질]벤조[b]티오펜-2-카복사미드) 및 저농도의 RA를 포함하는 배지에서 세포가 과융합이 될 때까지 배양하는 단계로서, 세포가 OLIG2를 발현하는 단계를 포함하고, 이로써 OLIG2+ OPC를 생성하는, 방법을 제공한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 O4+ OPC의 생성 방법으로서, (a) OLIG2+ OPC의 3차원 세포 응집체를 평활화 효능제 및 저농도의 RA를 포함하는 배지에서 약 8일 동안 현탁 배양하는 단계; (b) 세포 응집체를 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1), 및 뉴로트로핀 3(NT3)을 포함하는 배지에서 약 10일 동안 현탁 배양하는 단계; (c) 세포 응집체를 2 구상체(sphere)/cm2의 밀도로 재플레이팅하는 단계; 및 (d) 세포 응집체를 (i) 아스코르브산(AA) 또는 (ii) PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3을 포함하는 배지에서 세포가 O4+가 될 때까지 부착 배양으로 배양하는 단계를 포함하고, 이로써 O4+ OPC를 생성하는, 방법을 제공한다. 성숙 희소돌기아교세포는 PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3의 부재하에 약 3주 동안 O4+ OPC를 배양함으로써 생성될 수 있고; 이로써 희소돌기아교세포를 생성하고, 여기서 희소돌기아교세포는 수초 염기성 단백질(MBP+)을 발현한다.
추가의 측면에 있어서, 본 발명은 희소돌기아교세포의 생성 방법으로서, (a) (i) PSC를 저밀도로 표면에 접종하고; (ii) PSC를 1 내지 2일 동안 부착 배양으로 배양하여 PSC 콜로니를 제조함으로써, PSC 콜로니를 제조하는 단계; (b) PSC 콜로니를 융합이 될 때까지 저농도의 RA, TGFβ 신호전달의 적어도 하나의 저해제, 및 BMP 신호전달의 적어도 하나의 저해제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 배양의 제1 일이 0일인 단계; (c) 융합 세포를 세포가 과융합이 될 때까지 평활화 효능제 및 저농도의 RA를 포함하는 배지에서 배양하는 단계로서, 세포가 OLIG2+ OPC인 단계; (d) 세포를 표면으로부터 리프팅(lifting)하여 3차원 세포 응집체의 형성을 허용하는 단계; (e) 세포 응집체를 평활화 효능제 및 저농도의 RA를 포함하는 배지에서 약 8일 동안 현탁 배양하는 단계; (f) 세포 응집체를 PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3을 포함하는 배지에서 약 10일 동안 현탁 배양하는 단계; (g) 세포 응집체를 2 구상체/cm2의 밀도로 재플레이팅하는 단계; (h) 세포 응집체를 (i) AA 또는 (ii) PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3을 포함하는 배지에서 세포가 O4+가 될 때까지 부착 배양으로 배양하여 O4+ OPC를 생성하는 단계; 및 (i) O4+ OPC를 AA를 포함하고 PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3이 결핍된 배지에서 세포가 MBP+가 될 때까지 배양하는 단계를 포함하고, 이로써 희소돌기아교세포를 생성하는, 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) PSC를 (i) 0일부터 8일까지 이중 SMAD 저해, 및 (ii) 8일부터 12일까지 SHH 또는 평활화 효능제를 갖는, 저농도의 RA를 포함하는 배지에서 단일층으로서 부착 배양으로 배양하여 OLIG2+ 세포를 생산하는 단계; (b) 단계 (a)의 세포를 (i) 12일부터 20일까지 SHH 또는 평활화 효능제 및 저농도의 RA를 포함하는 배지, 및 (ii) 20일부터 30일까지 PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3을 포함하는 배지에서 현탁 배양함으로써 OLIG2+ 세포를 풍부하게 하는 단계; (c) 단계 (b)의 세포를 30일부터 75일까지 PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3을 포함하는 배지에서 부착 배양으로 배양하여 O4+ OPC를 생산하는 단계; 및 (d) O4+ OPC를 75일부터 95일까지 AA를 포함하고 PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3이 결핍된 배지에서 부착 배양으로 배양하는 단계를 포함하고, 이로써 희소돌기아교세포를 생성하는, 방법을 제공한다.
본 발명의 추가의 측면은 희소돌기아교세포의 생성 방법으로서, (a) PSC를 (i) 0일부터 8일까지 이중 SMAD 저해, 및 (ii) 8일부터 12일까지 SHH 또는 평활화 효능제를 갖는, 저농도의 RA를 포함하는 배지에서 단일층으로서 부착 배양으로 배양하여 OLIG2+ 세포를 생산하는 단계; (b) 단계 (a)의 세포를 (i) 12일부터 20일까지 SHH 또는 평활화 효능제 및 저농도의 RA를 포함하는 배지, 및 (ii) 20일부터 30일까지 PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3을 포함하는 배지에서 현탁 배양함으로써 OLIG2+ 세포를 풍부하게 만드는 단계; 및 (c) 단계 (b)의 세포를 30일부터 60일까지 AA를 포함하고 PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3이 결핍된 배지에서 부착 배양으로 배양하는 단계를 포함하고, 이로써 희소돌기아교세포를 생성하는, 방법을 제공한다.
또한 수초형성을 촉진하는 화합물을 확인하는 방법으로서, (a) 본 발명에 의하여 희소돌기아교세포를 생성하는 단계; (b) 희소돌기아교세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및 (c) 후보 화합물이 뉴런 수초형성을 촉진하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
또 다른 실시형태는 대상체에서 신경 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, (a) 본 발명에 의하여 희소돌기아교세포를 생성하는 단계; 및 (b) 대상체에게 유효량의 희소돌기아교세포를 투여하는 단계로서, 희소돌기아교세포는 대상체의 신경계에서 수초발생을 촉진하는 단계를 포함하고, 이로써 대상체에서 신경 질환을 치료하는, 방법이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산된 희소돌기아교세포 전구 세포 및 희소돌기아교세포, 및 이들을 포함하는 비인간 포유동물을 포함한다.
우리는 화학적으로 정의된, 성장 인자-풍부 배지를 사용하여 PSC로부터 인간 희소돌기아교세포를 생성하는 강력하고 빠르고 재현 가능한 분화 프로토콜을 개발하였다. 우리의 프로토콜은 개발 동안 희소돌기아교세포 분화를 모사한다. 8일 내에 PSC는 PAX6+ 신경 줄기 세포로 분화되고, 이는 12일에 OLIG2+ 전구세포를 발생시킨다. OLIG2+ 세포는 18일쯤에 NKX2.2를 동시발현함으로써 희소돌기아교세포 계통으로 수임된 다음, 40일쯤에 SOX10 및 PDGFRα를 상향 조절함으로써 초기 OPC로 분화된다. O4 항체(O4+)에 의해 인식된 황산화 당지질 항원을 발현하는 후기 OPC는 50일쯤에 나타나고, 분화 75일에 세포 군집의 40 내지 70%에 도달한다. O4+ 희소돌기아교세포 전구 세포는 수초형성 연구를 위하여 세포 분류에 의해 단리될 수 있거나, MBP+ 희소돌기아교세포를 성숙시키기 위하여 최종적으로 분화될 수 있다. 우리의 희소돌기아교세포 분화 프로토콜의 타임라인은 도 1에 도시된다.
우리가 희소돌기아교세포를 생성시키기 위하여 조작하는 신호전달 경로는 설치류 척수 배아 발달의 연구로부터 수득된 지식을 기반으로 선택하였다. 문헌[Hu et al.(2009a)]. 시험관내, RA 및 SHH 신호전달은 pMN 환경을 모사하고, 이는 PSC의 OLIG2 전구 세포로의 분화를 유도한다. 우리의 배양에서, SHH 신호전달은 인간 재조합 SHH 단백질 대신에 평활화 효능제를 통해 활성화된다. 우리는 RA 및 SHH 신호전달과 액티빈/노달/TGFβ 저해(SB431542를 통한) 및 BMP4 저해(LDN193189를 통한)의 조합이 OLIG2+ 전구세포의 가장 높은 수율을 생성하였음을 확인하였다. SB431542와 LDN193189의 상승작용적 작용으로 인하여, 세포의 70% 이상이 12일에 OLIG2를 발현한다. 이는 우리의 프로토콜과 문헌[Wang et al.(2013)]의 프로토콜 사이의 중요한 차이점이다. 액티빈/노달/TGFβ 신호전달 및 BMP 신호전달 둘 다의 저해는 또한 "이중 SMAD 저해"로도 지칭된다.
우리의 방법과 이전에 공개된 프로토콜 사이에 몇몇 다른 중요한 차이점이 존재한다. 예를 들면, 우리는 현탁 배양이 아닌 부착 배양으로 이중 SMAD 저해로 신경 유도를 시작하였다. 문헌[Wang et al.(2013); Hu et al.(2009b); Nistor et al.(2005)]. 이러한 접근법을 사용하여, 우리는 0일에 겨우 10,000 세포/cm2로 시작하였지만, 신경 전구세포의 큰 확장을 달성하였고, 궁극적으로 OPC의 풍부한 생성을 달성하였다. 추가로, 우리 수중의 RA의 최적의 농도는 약 100nM인 것으로 확인되고, 이는 다른 그룹에 의해 사용된 농도보다 100배 낮은 것이다. 문헌[Gil, J.E. et al., FEBS Letters 583:561-567(2009); Izrael et al.(2007); Nistor et al.(2005)]. 추가로, 외인성 SHH 없이 RA 단독에 의한 유도는 놀랍게도 OLIG2+ 세포의 큰 군집을 생성시켰다. 우리는 평활화 효능제가 SHH의 효과적인 대체물임을 확인하였고, 실제로 우리 수중에서 탁월한 효능을 보였다(Stacpoole et al. 2013). 게다가, 우리의 발명은, 현저하게, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호전달의 부재하에 RA를 통한 OLIG2 유도를 처음으로 보여준다. RA와 FGF 신호전달의 조합은 닭 발달 동안 OLIG2 발현을 촉진하는 것으로 알려져 있고, 인간 ESC 및 iPSC 둘 다의 시험관내 분화에 사용되어 왔다. 문헌[Pouya, A. et al., PLoS One 6:e27925(2011); Nistor et al.(2005); Novitch, B.G. et al., Neuron 40:81-95(2003)]. 최근 연구는 염기성 FGF(bFGF)가 복부 전뇌 기원의 희소돌기아교세포의 전문화에 필수적인 반면, 이는 척수로부터의 희소돌기아교세포의 전문화 동안 뉴런 분화를 억제한다고 제시하였다. 문헌[Stacpoole et al.(2013)]. 그렇더라도, 우리는 우리의 시험관내 분화 동안 임의의 외인성 FGF의 부재하에 OPC의 고수율을 달성하였다. 최종적으로, 12일에 세포 구상체의 부착 배양으로부터 현탁 배양으로의 전환은 OLIG2+ 세포의 군집을 풍부하게 하고, 우리의 배양의 분화를 희소돌기아교세포 계통으로 제한하는데 중요한 단계인 것으로 증명하였다.
우리는 또한 수초형성 희소돌기아교세포가 PPMS-환자 피부 섬유아세포의 재프로그래밍을 통해 유래될 수 있다는 첫번째 증거를 제공한다. MS-유래 iPSC에 대한 유일한 이전 보고는 희소돌기아교세포가 35세 연령의 RRMS 환자 단 한명으로부터의 통합 레트로바이러스 재프로그래밍된 iPSC 세포주로부터 시험관내 분화될 수 있음을 보여준다. 문헌[Song, B., et al., Stem Cell Res. 8:259-273(2012)]. 우리는 남녀 양성 및 50 내지 62세 연령의 PPMS 환자로부터의 4 무-통합(integration-free) iPSC 세포주로부터 유래된 OPC에 의해 생체내 수초형성을 입증한다. 따라서, 본 발명은 iPSC-유래 OPC를 사용하는 최근 작업과 상이하고, 여기서 우리의 iPSC 세포주는 PPMS 환자로부터 유래된다. 추가로, 생체내 이식에 사용되는 세포는 분화 가능성을 최대로 제한하는 후기 OPC 마커 O4를 사용하여 분류되었다. 이러한 차이에도 불구하고, PPMS-유래 O4+-분류된 OPC는 유사한 생착 효능, 유사한 유사분열 부분 및 호스트 싸여진(host ensheathed) 축삭돌기의 유사한 비율을 나타낸 반면, 이전에 보고된 미분류된 iPSC-유래 OPC에 비하여 더 적은 GFAP+ 성상세포를 생성시킨다. 종합하면, 우리의 데이터는 PPMS-유래 OPC가 적어도 건강한 iPSC-유래 세포(Wang et al., 2013)만큼 효율적으로 생체내 수행된다는 것을 보여주고, 우리의 iPSC 유래 및 OPC 유도 프로토콜이 한명의 환자 샘플로부터의 수초발생 희소돌기아교세포를 발생시킬 수 있다는 것을 확립하고, 이는 MS를 위한 외인성 세포-대체 요법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 특정한 실시형태는 PSC 콜로니를 먼저 제조함으로써 OLIG2+ OPC를 생성하는 방법이다. PSC는 저밀도로 접종되고(플레이팅되고), 약 1 내지 2일 동안 부착 배양으로 성장한다. "저밀도"는 약 8,000 내지 약 11,000 세포/cm2를 의미한다. 세포는 바람직하게는 약 9,500 내지 약 10,500 세포/cm2, 더 바람직하게는 약 10,000 세포/cm2로 접종된다. 1 내지 2일 후, 콜로니로부터의 PSC는 바람직하게는 직경이 약 75㎛ 내지 약 300㎛, 더 바람직하게는 직경 약 100㎛ 내지 약 250㎛이다.
용어 "PSC"는 당해 분야에서 이의 일반적인 의미를 갖고, 즉, 내배엽, 외배엽, 및 중배엽 세포로 발달할 수 있는 능력을 갖는 자기 복제 세포이다. 바람직하게는, PSC는 hPSC이다. PSC는 ESC 및 iPSC, 바람직하게는 hESC 및 hiPSC를 포함한다. PSC는 기질, 예를 들면, 겔 또는 기저막 기질을 포함하는 표면에 접종될 수 있다. 바람직한 기질은 마트리겔(MATRIGEL®), 쿨트렉스(CULTREX®), 및 겔트렉스(GELTREX®)를 포함하는 상표명하에 판매되는, 엔젤브레스-홈-스왐(Engelbreth-Holm-Swarm)(EHS) 마우스 육종 세포에 의해 분비된 단백질 혼합물이다. 다른 적합한 기질은 콜라겐, 피브로넥틴, 겔라틴, 라미닌, 폴리-리신, 비트로넥틴, 및 이의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
PSC가 배양되는 배지는 바람직하게는 rho-연관 단백질 키나제(ROCK)의 저해제, 예를 들면, GSK269962, GSK429286, H-1152, HA-1077, RKI-1447, 티아조비빈, Y-27632, 또는 이의 유도체를 포함한다.
그 다음, PSC 콜로니를 단일층으로 융합이 될 때까지 저농도의 RA, TGFβ 신호전달의 적어도 하나의 저해제, 및 BMP 신호전달의 적어도 하나의 저해제를 포함하는 배지에서 배양하고, 여기서 이러한 배지의 배양 제1 일은 0일이다. "저농도의 RA"는 약 10nM 내지 약 250nM이다. RA의 농도는 바람직하게는 약 10nM 내지 약 100nM, 또는 약 25nM 내지 약 100nM, 또는 약 20nM, 30nM, 40nM, 50nM, 60nM, 70nM, 80nM, 90nM, 바람직하게는, 약 100nM 이하이다. TGFβ 신호전달의 저해제는, 예를 들면, GW788388, LDN193189, LY2109761, LY2157299, 및 LY364947을 포함한다. 바람직한 TGFβ 신호전달의 저해제는 소분자 SB431542이다. BMP 신호전달의 저해제는, 예를 들면, DMH1, 도르소모르핀, K02288, 및 노긴(Noggin)을 포함한다. 바람직한 BMP 신호전달의 저해제는 소분자 LDN193189이다.
세포는 약 8일에 융합에 도달하고 PAX6를 발현하고, 이 시점에 융합 세포는 SHH 또는 평활화 효능제, 및 저농도의 RA를 포함하는 배지에서 배양된다. 평활화 효능제는, 예를 들면, SAG 및 퍼모르파민을 포함한다. SHH는 재조합 인간 SHH일 수 있다. 바람직하게는, 배지는 SHH 결핍이다. PSC로부터 OLIG2+ 전구세포로의 전환은 배양이 과융합이 되도록 유발하는 대량 증식과 연관이 있고, 이는 이상적으로는 약 12일까지 3차원 구조를 형성하는 세포를 야기한다. "과융합"은 세포가 서로 쌓이기 시작하여, 모든 세포가 배양 표면에 완전히 접촉하지 않고, 일부 세포는 배양 표면과 전혀 접촉하지 않고 다른 세포에만 접촉하고 있는 것을 의미한다. 바람직하게는, 과융합 세포의 적어도 약 50%, 60%, 또는 70%는 약 12일까지 OLIG2+이다.
OLIG2+ 세포가 O4+ 세포로 추가로 분화되는 경우, 과융합 세포는 배양 표면으로부터 리프팅되고, 이는 세포 응집체 또는 구상체의 형성을 가능하게 한다. OLIG2- 세포는 응집체를 형성하지 않고, 따라서 이 과정은 OLIG2+ 군집을 풍부하게 하고, OLIG2- 세포는 후속적인 배지 교체 동안 점진적으로 제거된다. 본 발명의 목적을 위하여, 용어 "응집체" 및 "구상체"는 상호교환적으로 사용되고, 다세포 3차원 구조, 바람직하게는, 필수적이지는 않지만, 적어도 약 100 세포를 의미한다.
리프팅은 세포 스크레이퍼 또는 기타 적합한 도구로 기계적으로, 또는 화학적으로 수행될 수 있다. 화학적 리프팅은 단백질분해 효소, 예를 들면, 콜라게나제, 트립신, 트립신-유사 프로테아제, 재조합 요소, 예를 들면, 상표명 트리플(TRYPLE®)하에 판매되는 것, 천연 유래 효소, 예를 들면, 상표명 아큐타제(ACCUTASE®)하에 판매되는 것, 및 이의 조합을 사용하여 달성될 수 있다. 화학적 리프팅은 또한 킬레이터, 예를 들면, EDTA, 또는 화합물, 예를 들면, 유레아를 사용하여 수행될 수 있다. 기계적 리프팅 또는 탈착은 최소 세포 사멸의 장점을 제공하지만, 가변적인 크기의 응집체를 제조하고, 따라서 적합한 구상체는 수동 픽킹 공정을 통해 선택될 필요가 있다. 우수한 구상체는 더 어두운 코어 및 300㎛ 내지 800㎛의 직경을 갖는, 색상이 금색/갈색인 둥근 형상으로 정의된다. 화학적 방법, 예를 들면, 효소적 소화를 사용하여 세포를 탈착하는 것은 대부분 추가 배양에 적절한 구상체를 제조한다. 따라서 구상체의 수동 픽킹은 필요하지 않으며, 탈착 단계는 자동화를 위해 개조될 수 있고 높은 처리량 연구에서 사용될 수 있다. 그러나, 효소적 소화는 세포 사멸을 증가시키고, 더 낮은 수의 구상체를 야기한다.
우리는 추가로 OLIG2+ OPC로부터 O4+ OPC를 생성하는 방법을 제공한다. 평활화 효능제 및 저농도의 RA를 포함하는 배지에서 약 8일 동안 OLIG2+ OPC의 3차원 응집체를 현탁 배양한다. OLIG2+ OPC는, 예를 들면, 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 방법, 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법으로 생성될 수 있다. 평활화 효능제 및 RA를 포함하는 배지에서 약 8일 후, 배지는 PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3, 및 임의로, 인슐린(바람직하게는 약 10㎍/㎖ 내지 약 50㎍/㎖, 더 바람직하게는 약 25㎍/㎖), T3(바람직하게는 약 20ng/㎖ 내지 약 100ng/㎖, 더 바람직하게는 약 60ng/㎖), 바이오틴(바람직하게는 약 50ng/㎖ 내지 약 150ng/㎖, 더 바람직하게는 약 100ng/㎖), 및/또는 cAMP(바람직하게는 약 100nM 내지 약 5μM, 더 바람직하게는 약 1μM)를 포함하는 것으로 교체된다. 배지는 바람직하게는 bFGF 및 상피 성장 인자(EGF) 결핍이다. OLIG2+ 세포가 본 발명의 방법에 의해 생성되는 경우, 현탁 배양은 바람직하게는 약 12일에 시작되고, PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3을 포함하는 배지에서 배양은 바람직하게는 약 20일에 시작된다.
PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3을 포함하는 배지에서 현탁으로 약 10일 후, 세포 응집체는 약 2 구상체/cm2의 밀도로 부착 배양으로 플레이팅된다(이는 바람직하게는 방법이 RA, TGFβ 신호전달의 적어도 하나의 저해제, 및 BMP 신호전달의 적어도 하나의 저해제를 포함하는 배지에서 배양된 PSC로 0일에 시작되는 경우, 약 30일이다). 세포 응집체를 플레이팅하고 배양하는 표면은 세포외 기질 단백질(예를 들면, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌) 및/또는 양으로 하전된 폴리-아미노산(예를 들면, 폴리-아르기닌, 폴리-리신, 폴리-오르니틴)을 포함할 수 있다. 바람직하게는 표면은 라미닌 및/또는 폴리-오르니틴을 포함한다.
세포 응집체를 플레이팅한 후, PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3을 포함하는 배지는 계속될 수 있거나(옵션 A), AA를 포함하고 성장 인자(예를 들면, PDGF, HGF, IGF-1, NT3, bFGF, 및/또는 EGF)가 결핍된 배지가 사용될 수 있다(옵션 B). AA를 포함하는 배지는 임의로 인슐린, T3, 바이오틴, 및/또는 cAMP를 포함할 수 있다. PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3을 포함하는 배지에서 배양된 세포는 플레이팅 후 약 45일까지 최적으로 O4+이다. 바람직하게는, 이러한 세포의 적어도 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 80%는 플레이팅 후 약 45일까지(75일) O4+이다. AA를 포함하는 배지에서 배양된 세포는 플레이팅 후 약 25일까지 최적으로 O4+이다. 바람직하게는, 이러한 세포의 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40%는 플레이팅 후 약 25일까지(55일) O4+이다. 바람직하게는, 이러한 세포의 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 또는 60%는 플레이팅 후 약 33일까지(63일) O4+이다. 바람직하게는, 이러한 세포의 적어도 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 또는 75%는 플레이팅 후 약 45일까지(75일) O4+이다.
수초 염기성 단백질을 발현하는 성숙 희소돌기아교세포는 PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3의 부재하에 약 3주 동안 세포가 MBP+가 될 때까지 O4+ OPC를 배양함으로써 생성될 수 있다. 바람직하게는, PDGF, HGF, IGF-1 및 NT3이 결핍된 배지에서 배양 약 20일 후, O4+ OPC의 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 45%는 MBP+이다. 이는 "옵션 A" 세포에 있어서 약 95일에, "옵션 B" 세포에 있어서 약 60일에 일어난다. 적어도 약 75일까지 "옵션 B" 세포를 배양하는 것은 MBP+ 발현 세포의 더 높은 효능을 야기한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생성된 OPC, 희소돌기아교세포, 및 수초-생성 세포, 및 이들을 포함하는 비인간 포유동물, 바람직하게는 마우스 및/또는 래트를 포함한다. 수초-생성 세포는 희소돌기아교세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는 수초를 생성하는 임의의 세포이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 수초-생성 세포는 PSC로부터 분화되고, 이러한 실시형태에 있어서, PSC는 iPSC일 수 있다. iPSC는 대상체의 체세포로부터 유래될 수 있다. 하나의 측면에 있어서, 대상체는 탈수초 또는 수초형성장애 질환 또는 장애를 갖는다.
하나의 측면에 있어서, 본 발명은 MS, 특히 PPMS 환자로부터 바이러스성 및 무-통합 iPSC를 생성하는 방법을 제공한다. 시버러 마우스에서 생체내 수초형성에 의해 증명된 바와 같이, 우리의 분화 프로토콜은 이러한 iPSC의 OPC 및 기능성 희소돌기아교세포로의 효율적인 분화를 위하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 신경 질환, 바람직하게는 탈수초 또는 수초형성장애 질환 또는 질병에 대한 모델 시스템을 제공한다. 하나의 측면에 있어서, 모델 시스템은 탈수초 또는 수초형성장애 병태를 가진 대상체로부터 유래된 iPSC로부터 분화된 수초-생성 세포를 포함한다. 모델 시스템은 수초-생성 세포가 이식된 비인간 포유동물을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 비인간 포유동물은 마우스 또는 래트이다. 본 발명에 의해 제공된 모델 시스템은 근본적인 메커니즘의 이해 및 치료 표적의 정의를 포함한, 탈수초 또는 수초형성장애 질환 또는 장애를 연구하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 따른 OPC 또는 희소돌기아교세포를 생성하고; 유효량의 세포를 대상체에게 투여함으로써, 대상체에서 신경 질환 또는 장애를 치료하는 방법 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 이식되면, 희소돌기아교세포, 또는 희소돌기아교세포로 생체내 분화된 OPC는 대상체의 신경계에서 수초발생을 촉진한다. 따라서, 본 발명은 대상체에서 신경 질환 또는 질병의 치료 및/또는 예방에서 본 발명의 OPC 또는 희소돌기아교세포의 사용을 제공한다. 신경 질환 또는 질병은 탈수초 또는 수초형성장애 질환, 또는 신경퇴행성 질환일 수 있다. 신경 질환 또는 질병은 중추 신경계, 말초 신경계, 또는 둘 다에 영향을 미칠 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 탈수초 또는 수초형성장애 질환은 염증성 탈수초 질환(예를 들면, 다발성 경화증, 시신경염, 데빅병, 급성-산재성 뇌척수염 및 횡단성 척수염), 바이러스성 탈수초, 후천적 대사이상에 의한 탈수초, 백질이영양증(저수초형성 질환, 예를 들면, 펠리체우스-메르츠바허병 및 유전성 강직성 하반신마비 포함), 단백지질 단백질 생성의 X 연관 질병, 대사성 탈수초 및 리소좀 축적병(예를 들면, 변색성 백질이영양증-MLD, 테이삭스병, 샌드호프병 및 크라베병), 소멸 백질 질환, 및 뇌실주위 백색연화증이다. MS 및 특히 PPMS는 또한 본 발명의 방법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 병태이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법에 의해 생성된 OPC 또는 희소돌기아교세포는 대상체의 체세포로부터 생성된 iPSC로부터 유래된다.
자가 세포 이식에 대한 이의 가능성과 함께, iPSC 기술은 신규한 약물을 개발하고 질환 발병을 통찰하기 위한 도구로서 부각되고 있다. 문헌[Han, S.S.W. et al., Neuron. 70:626-644(2011)]. 본 발명의 방법 및 세포는 수초형성을 촉진하는 화합물을 위한 고처리량 시험관내 스크린의 발달을 도울 것이다. 문헌[Lee, S. et al., Nat Protoc. 8:771-782(2013)]. 이를 위해, 우리는 수초형성을 촉진하는 화합물을 확인하는 방법으로서, 본 발명에 의하여 수초-생성 세포을 생성하는 단계; 수초-생성 세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및 후보 화합물이 뉴런 수초형성을 촉진하는지 여부를 측정하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 하나의 실시형태에 있어서, 화합물은 신경 질환 또는 질병, 예를 들면, 탈수초 또는 수초형성장애 병태를 치료하기 위한 후보 치료제이고, 방법은 후보 치료제가 뉴런 수초형성에 유리한 효과를 갖는지 여부를 측정하는 것을 포함하고, 이러한 유리한 효과는 탈수초 또는 수초형성장애 질환 또는 질병의 치료를 위한 후보 치료제를 나타낸다. 유리한 효과는, 예를 들면, 뉴런 탈수초의 예방, 뉴런 탈수초의 감소, 증가된 뉴런 전도도, 및/또는 향상된 뉴런 수초형성일 수 있다. 바람직하게는, 방법은 고처리량 형식으로 수행된다.
본 발명의 세포, 시스템, 및 방법은 또한 신경 질환의 연구에 유용할 수 있다. 특히, 본 명세서에 기재된 PPMS iPSC 세포주는 특히 MS에서, 신경퇴화의 과정을 조사하기 위한 신규한 자원을 제공한다(도 16).
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 단수형 "a", "an", 및 "the"는 복수의 대상을 포함한다. 용어 "a"(또는 "an"), 뿐만 아니라 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
게다가, "및/또는"는 각각의 2개의 특정된 성질 또는 성분의 다른 하나와 함께 또는 다른 하나 없이 특정한 기재로서 취해지는 것이다. 따라서, "A 및/또는 B"와 같은 구에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 A 및 B, A 또는 B, A(단독), 및 B(단독)을 포함하는 것이 의도된다. 이와 같이, "A, B, 및/또는 C"와 같은 구에서 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 B; A 또는 C; B 또는 C; A 및 B; A 및 C; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독)를 포함하는 것이 의도된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명의 관련된 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들면, 문헌[The Dictionary of Cell and Molecular Biology(5th ed. J.M. Lackie ed., 2013)], [Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology(2d ed. R. Cammack et al. eds., 2008)], 및 [The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, P-S. Juo,(2d ed. 2002)]은 본 명세서에 사용되는 몇몇 용어의 일반 정의를 숙련가에게 제공할 수 있다.
단위, 접두사, 및 부호는 이의 국제단위계(Systeme International de Unites)(SI) 허용 형태로 기재된다. 수적 범위는 범위를 정의하는 수를 포함한다. 본 명세서에 제공된 제목은 본 발명의 다양한 측면 또는 실시형태의 제한이 아니고, 이는 전체로서 본 명세서에 참고로서 포함될 수 있다. 따라서, 바로 하기에 정의된 용어는 그 전체가 본 명세서에 참고로서 더 완전하게 정의된다.
실시형태가 언어 "포함하다"와 함께 기재되는 모든 경우에 "이루어지다" 및/또는 "본질적으로 이루어지다"의 용어로 기재된 달리 유사한 실시형태가 포함된다.
"대상체" 또는 "개체" 또는 "환자"는 이의 진단, 예측, 또는 치료가 목적되는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 의미한다. 포유동물 대상체는 인간, 가축, 사육 동물, 스포츠 동물, 및 동물원 동물을 포함하고, 예를 들면, 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 돼지 등을 포함한다.
"치료하다" 또는 "치료" 또는 "치료하는 것" 또는 "완화하다" 또는 "완화하는 것"과 같은 용어는 진단된 병리학적 병태 또는 질병의 증상을 치유하고/치유하거나 늦추고/늦추거나 경감하고/경감하거나, 진행을 중단시키는 치료책을 지칭한다. 따라서, 치료가 필요한 이들은 질병이 이미 있는 이들을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 환자가, 예를 들면, 질환 또는 질병과 연관된 증상의 전체적인, 부분적인, 또는 일시적인 완화 또는 제거를 보이는 경우, 대상체는 본 명세서에 제공된 방법에 따라 신경 질환 또는 질병, 특히 탈수초 또는 수초형성장애 질환 또는 질병이 성공적으로 "치료된다".
"예방하다" 또는 "예방"은 표적화된 병리학적 병태 또는 질병의 발병을 예방하고/예방하거나 늦추는 예방학적 또는 예방책을 지칭한다. 따라서, 예방이 필요한 이들은 질환 또는 질병에 걸리기 쉽거나 취약한 이들을 포함한다. 특정한 실시형태에 있어서, 환자가 본 발명의 방법에 대상이 되지 않은 환자보다, 예를 들면, 질환 또는 질병과 연관된 더 적거나 덜 심각한 증상, 또는 질환 또는 질병과 연관된 증상의 더 늦은 개시를 일시적으로 또는 영구적으로 발달시키는 경우, 신경 질환 또는 질병, 특히 탈수초 또는 수초형성장애 질환 또는 질병은 본 명세서에 제공된 방법에 따라 성공적으로 예방된다.
본 발명은 희소돌기아교세포 전구 세포(OPC) 및 다능성 줄기 세포(PSC)로부터 신속하고 효과적으로 희소돌기아교세포를 생성하는 방법을 제공한다.
도 1은 옵션 A(도 1A) 및 옵션 B(도 1B)에 따른 희소돌기아교세포 분화의 타임라인을 나타낸다. 삼각형은 면역형광법을 통해 단계-특이적 마커의 발현을 평가하는 권고된 시간 점을 나타낸다. SB: SB431542; LDN: LDN193189; SAG: 평활화 효능제; T3: 트라이요오도트리오닌; RA: 모든 트랜스 레티노산; PDGF: 혈소판 유래 성장 인자; HGF: 간세포 성장 인자; IGF-I: 인슐린 유사 성장 인자-1; NT3: 뉴로트로핀 3; AA: 아스코르브산.
도 2는 OLIG2+ 전구 세포를 유도하는 RA 및 SHH에 대한 요건을 나타낸다. 도 2A는 RA 및 SHH에 대한 상이한 조건하에 분화 14일에 OLIG2-GFP 세포의 살아있는 이미징 및 유세포분석 정량을 나타낸다. 0일부터의 100nM 농도의 RA가 GFP+ 세포의 가장 높은 수율을 야기한다. 도 2B는 살아있는 이미징 및 FACS-분석을 통해, 가장 우수한 RA 조건에 대한 8일에서 SHH 또는 SAG의 첨가 사이의 비교를 나타낸다. 음성: hESC 세포주 RUES1. 도 2C는 최적의 RA 및 SHH 조건하에 PAX6, OLIG2 및 NKX2.2의 시간적 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 오차 막대는 SEM(N=3)이다. RUES1 세포 및 OLIG2-GFP 리포터 세포주를 사용하여 비슷한 결과가 수득된다. 도 2D는 미분류된 세포, 분류된 GFP+ 세포, 또는 GFP- 세포에 대한 구상체-형성의 평가를 나타낸다. 오직 구상체로부터의 GFP+ 세포 만이 GFP+ 군집에 대한 풍부함을 제공한다.
도 3은 OLIG2+ 전구세포에 대한 SHH 및 이중 SMAD 저해 요건을 나타낸다. 도 3A는 오직 d0부터 RA에만 노출되었던 세포와 비교하여, d0부터 RA 및 d8부터 SHH/SAG를 갖는 배양 사이의 분화 14일에 OLIG2, PTCH1 및 SHH에 대한 mRNA 수준을 나타낸다. 내인성 SHH 수준은 SHH/SAG에 노출되지 않았던 샘플보다 높다. 오차 막대는 SEM(N=3)이다. 도 3B는 분화 12일에 처음으로, RA 단독, 또는 RA 및 SAG에 노출되었던 세포 사이에서 분화 75일에 O4+ 세포에 대한 FACS-분석을 나타낸다. 분화 초기 단계에서 SAG가 제공되지 않았던 세포에서 O4+ 군집의 56% 감소가 관찰되었다. 음성 대조군: APC-접합된 2차 항체 단독. 도 3C는 상이한 SMAD 저해제하에 분화 14일에 살아있는 이미징 및 FACS-분석을 나타낸다. GFP+ 세포의 실질적인 군집은 오직 SMAD 단백질의 이중 저해하에서만 존재하고, 이는 RA와 SMAD의 이중 저해 사이의 상승작용적 효과를 나타낸다. DSi: 이중 SMAD 저해; SB: SB431542; LDN: LDN189193.
도 4는 인간 다능성 줄기 세포로부터의 희소돌기아교세포의 생성을 나타낸다. 도 4A는 희소돌기아교세포를 성숙시키는, hPSC로부터의 분화 프로토콜의 도표를 나타낸다. 도 4B 내지 도 4M은 하기를 나타내는 RUES1 세포의 시험관내 희소돌기아교세포 분화의 순차적 단계이다: 8일에 PAX6+ 신경 줄기 세포(B), 12일에 다층 구조의 위상 대조(C), 18일에 OLIG2+NKX2.2+ 사전-OPC(D), SOX10+OLIG2+ 초기 OPC(E), O4+ 후기 OPC의 살아있는 이미징(F), 분지된(ramified) 과정을 강조하는 O4+ 세포의 잘라낸 이미지(G), OLIG2를 동시발현하는 O4+ OPC(H), SOX10을 동시발현하는 O4+ OPC(I), SOX10 및 NG2를 동시발현하는 분류된 O4+ OPC(J), 최종적으로 분화된 MBP+ 희소돌기아교세포의 낮은 배율(K), 및 높은(x64) 배율(L), 희소돌기아교세포 배양에서 MAP2+ 및 GFAP+ 세포(M). PSC: 다능성 줄기 세포; NSC: 신경 줄기 세포; OPC: 희소돌기아교세포 전구 세포; OL: 희소돌기아교세포; pO/L: 폴리-L-오르니틴/라미닌.
도 5는 증식성 희소돌기아교세포 및 기타 신경 세포 유형을 나타낸다. 도 5A는 OLIG2, SOX10 및 Ki67에 대한 분화 d50에 대표적인 면역형광 염색을 나타낸다. OLIG2와 SOX10 사이에 거의 완전한 공존이 존재한다. 도 5B는 분화 d30와 d50 사이에 증식하는 OLIG2+ 및 SOX10+ 전구세포의 퍼센트를 나타내는 Ki67+ 세포의 시간적 정량을 나타낸다. 오차 막대는 SEM(N=2)이다. 도 5C는 O4+ 세포의 높은 수를 나타내지만 Ki67을 동시발현하는 세포는 거의 없음을 나타내는, d73에 배양의 면역형광 이미지를 나타낸다. 도 5D는 성장 인자 제거 4주 후, MBP를 동시발현하는 O4+ 세포의 퍼센트를 나타낸다(교질 배지). 오차 막대는 SEM(N=4)이다. 도 5E는 분화 d78 내지 d88에 3개의 독립 실험에서 총 세포 수에 대한 MAP2+ 뉴런 및 GFAP+ 성상세포의 퍼센트를 나타낸다. 오차 막대는 SEM(N=3)이다.
도 6은 옵션 B 프로토콜에 따른 분화 53일(도 6A, 도 6D), 63일(도 6B, 도 6E), 및 73일(도 6C, 도 6F)에 살아있는 O4 이미징을 나타낸다. 도 6A 내지 도 6C는 낮은 배율에서 대표적인 필드를 나타내고; O4+ 세포의 수는 시간에 따라 증가한다. 도 6D 내지 도 6F는 세포의 형태학을 강조하는 도 6A 내지 6C의 더 높은 배율 이미지를 각각 나타낸다. 도 6G는 옵션 B("빠른") 프로토콜(55일, 63일 및 75일) 및 옵션 A("원래") 프로토콜을 사용하여 상이한 시간 점에서 유세포분석에 의해 계산된 O4+ 세포 빈도의 대표적인 예를 나타낸다. 축적 막대: 500㎛(6A 내지 6C); 200㎛(6D 내지 6F).
도 7은 희소돌기아교세포로의 hPSC 분화의 기본 단계를 나타낸다. 도 7A는 분화 8일에 PAX6+ 신경 줄기 세포를 나타낸다(PAX6, 녹색; 핵은 DAPI로 염색함, 청색). 도 7B는 3차원 구조를 도시하는, 12일에 배양의 전형적인 형태학을 나타낸다. 도 7C는 면역형광 분석을 통해 나타낸 바와 같이 12일에 OLIG2 및 NKX2.2의 발현을 나타낸다(OLIG2, 녹색; NKX2.2, 적색; 핵을 DAPI로 염색함, 청색). 도 7D는 구상체 선택을 보여주고, 화살표는 더 어두운 코어 및 300㎛ 내지 800㎛의 직경을 갖는, 색상이 금색/갈색인 둥근 형상의 우수한 구상체를 나타낸다. 느낌표는 부드러운 피펫팅에 의하여 단일 구상체로 파쇄될 수 있는 결합된 구상체의 쌍을 나타낸다. 피해야 하는 응집체는 작고 투명한 것(화살촉) 또는 일반적으로 기계적 소화로부터 유래된, 매우 크고 형상이 불규칙한 것(별모양)이다. 도 7E는 NKX2.2(녹색), SOX10(적색) 및 OLIG2(청색)를 동시발현하는 56일에 전구 세포의 면역형광 염색을 나타낸다. 도 7F는 세포의 고도로 분지된 형태학을 나타내는 O4(녹색) 살아있는 염색을 나타낸다. 도 7G는 분화의 끝에 MBP+(적색) 희소돌기아교세포를 나타낸다(핵을 DAPI로 염색함, 청색). 도 7H는 더 높은 배율(64x)에서 MBP+(적색) 희소돌기아교세포의 형태학을 나타낸다. MAP2+(녹색) 및 GFAP+(청색) 세포가 또한 배양에서 존재한다. 도 7I는 전형적인 분지된 형태학을 여전히 유지하는 분류 24시간 후, 정제된 O4+ 세포를 나타낸다. 축적 막대: 500㎛(도 7A, 7B, 7G); 200㎛(도 7C, 7E, 7F, 7I); 1 mm(도 7D).
도 8은 PPMS iPSC 세포주의 생성 및 특성화를 나타낸다. 도 8A는 PPMS 세포주의 mRNA/miRNA 재프로그래밍을 나타내고, 이는 7일에 대표적인 피부 섬유아세포, 12일에 명백한 iPSC-유사 콜로니, 및 재프로그래밍 15일에 TRA-1-60+ 콜로니를 나타낸다. 도 8B는 다능성 마커를 위한 PPMS-iPSC 102의 면역형광을 나타낸다. 도 8C는 내배엽 마커 AFP, 중배엽 마커 αSMA 및 외배엽 마커 βIII-튜불린에 대하여 배양체를 통해 시험관내 자발적인 분화 후, 면역형광을 나타낸다. 핵을 DAPI로 염색한다. 도 8D는 면역결핍 마우스로의 PPMS iPSC 주사 후, 생체내 기형종 형성의 H&E 염색된 구획을 나타내고, 이는 선상 조직(내배엽), 연골(중배엽) 및 색소 상피(외배엽)로부터의 대표적인 구조를 나타낸다. 도 8E는 hESC 세포주와 비교하여, 미분화된 PPMS-iPSC 및 모 섬유아세포의 다능성 유전자 발현을 나타낸다. ANPEP 유전자는 섬유아세포에 특이적이다. 도 8F는 세포유전학 분석를 나타내고; 모든 PPMS-iPSC 세포주는 정상 핵형을 나타낸다.
도 9는 iPSC 세포주에서 기형종 형성의 특성화를 나타낸다. 면역결핍 마우스로 iPSC 세포주 102로부터의 세포의 이식 후, 생체내 기형종 형성의 내배엽(도 9A), 외배엽(도 9B), 및 중배엽(도 9C)로부터의 대표적인 사진이다.
도 10은 PPMS-iPSC가 OPC를 생성하고 희소돌기아교세포를 시험관내 성숙시키는 것을 보여준다. 도 10A 내지 10I는 하기를 나타내는 PPMS iPSC의 시험관내 희소돌기아교세포 분화의 순차적인 단계를 나타낸다: 8일에 PAX6+ 세포(A), 12일에 위상 대조에서 다층 구조(B), 12일에 OLIG2+ 및 NKX2.2+ 세포(C), SOX10+OLIG2+ 초기 OPC(D), 73일에 O4+ 후기 OPC의 살아있는 이미징(E), 분지된 과정을 강조하는, O4+ 세포의 잘라낸 이미지(F), 낮은 배율(G) 및 더 높은(x64) 배율(H)의 최종적으로 분화된 MBP+ 희소돌기아교세포, 희소돌기아교세포 배양에서 MAP2+ 세포(I). 도 10J는 FACS 분석을 통해 RUES1 및 PPMS iPSC로부터의 분화 75일 후, O4+ 세포의 정량을 나타낸다. 게이트는 O4 염색에 대해서만 2차 Ab-APC 및 PDGFRα 염색(음성)에 대한 PE-접합된 동종 대조군을 기반으로 한다. 총 O4+ 세포 빈도(O4 & ++)는 괄호 안에 표시된다.
도 11은 생체내 연구를 위한 이식 전 세포의 특성화를 나타낸다. 도 11A는 MEF에서 성장한 iPSC 세포주에서 다능성 마커, 및 분화 d81에 세포에서 동일한 마커의 부족을 나타내는 FACS 플롯을 나타낸다. 도 11B는 생체내 이식을 위한 단리 및 동결보존 전에 O4+ 세포를 분류하기 위하여 사용되는 더 엄중한 게이트를 나타내는 플롯이다. 도 11C는 48시간의 복구 기간 동안 동결보존 후, 플레이팅된 O4+ 분류된 세포의 명시야 이미지를 나타낸다. 도 11D는 O4의 보유 및 적절하게 분지된 형태학을 나타내는, 분류된 OPC에서 살아있는 O4 염색을 나타낸다.
도 12는 PPMS-유래 OPC 생착 및 생체내 수초발생 희소돌기아교세포로의 분화를 나타낸다. 도 12A는 신생아 시버러/rag2 마우스로 이식된 인간 PPMS iPSC-유래 O4+ OPC를 나타낸다. 16주에, 인간 세포는 뇌량(hNA, 적색)에서 밀도 있는 생착을 나타냈다. 많은 수가 MBP-발현 희소돌기아교세포(녹색)로서 분화되었고, 뇌량 전체에서 확산되어 분포하였다. 도 12B는 마우스 축삭돌기(신경미세섬유; NF, 적색) 및 MBP+ 인간 희소돌기아교세포(녹색)의 공존을 나타내는 공초점 이미지이다. 도 12C 및 도 12D는 주조밀(화살촉) 및 내부기간 선의 변경을 갖는 특징적인 조밀한 수초를 나타내는 수초형성된 축삭돌기의 전자 현미경사진을 나타낸다. 도 12E는 이식된 인간 세포가 OLIG2(녹색; 16주)를 발현하는 hNA+ 세포의 ~ 80%의 전구세포 특징을 보유하였음을 나타낸다. 도 12F는 16주에, 개별적인 NG2 세포가 상부 대뇌 피질 내로 이동하기 시작하였음을 나타낸다. 도 12G는 iPSC-유래 O4-분류된 OPC가 생체내 제한된 양능성을 입증하였고, 다만 몇 안되는 GFAP+ 성상세포가 측뇌실에 근접하여 발견되었음을 나타낸다.
도 13은 이로부터 iPSC 세포주가 유래된 MS 환자 및 건강한 개체의 인구학적 정보를 나타낸다.
도 14는 iPSC로의 피부 섬유아세포의 재프로그래밍을 나타낸다. 도 14A는 이들의 형태학에서 명백한 변화를 갖는 섬유아세포가 재프로그래밍의 d3에 가시적임을 나타낸다. 도 14B는 nGFP mRNA를 사용하여 평가된, d7에서 형질감염 효능을 나타낸다. 도 14C는 d12에서 iPSC-유사 콜로니를 나타낸다. 도 14D는 무-공급장치(feeder-free) 조건에서 확장된 iPSC 클론을 나타낸다.
도 15는 다능성에 대한 나노스트링(nanostring) 분석을 사용하는 iPSC 세포주의 특성화를 나타낸다. 도 15A는 MS 환자 또는 건강한 대조군으로부터 유래된 3종의 hESC 세포주, 2종의 섬유아세포 세포주, 및 5종의 iPSC 세포주의 나노스트링 분석을 나타내고; iPSC 세포주는 hESC 세포주와 구분이 되지 않는다. 도 15B는 시험관내 자발적인 배양체 분화가 모든 배엽으로부터 세포를 발생시킴을 나타낸다. 좌로부터 우로: AFP+ 내배엽 세포, Tuji1+ 외배엽 세포, aSMA+ 중배엽 세포.
도 16은 다발성 경화증을 이해하기 위한 접근법을 나타낸다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에서 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1: hESC 세포주로부터의 희소돌기아교세포의 분화
우리는 살아있는 형광 이미징으로 OLIG2+ 전구세포를 추적하는데 OLIG2-GFP 녹인(knock-in) hESC 리포터 세포주(Liu et al., 2011)를 사용하였다. 먼저, 우리는 부착 배양에서 SMAD 신호전달의 이중 저해를 사용하여 PAX6+ 세포를 유도하였다. 문헌[Chambers, S.M. et al., Nat Biotechnol. 27:275-80(2009)]. 그 다음, 배아 척수 환경을 모사하기 위하여, 우리는 다양한 시간에 RA 및/또는 SHH의 상이한 농도를 적용하였고, 유세포분석(도 2A)을 통해 OLIG2-GFP 발현을 정량하였다. 유도의 시작부터 100nM RA의 적용은 OLIG2+ 전구세포의 40.6%를 생성한 반면, 8일부터 100ng/㎖의 SHH의 첨가는 57.7%로 수율을 증가시켰다(도 2B). 흥미롭게도, 처음 12일 동안 외인성 SHH가 없는 세포는 SHH mRNA의 상향조절을 나타냈고(도 3A), SHH로 처리된 세포에 비하여 낮은 효능임에도 불구하고 O4+ 세포로 분화되었다(도 3B).
그 다음, 우리는 재조합 인간 SHH 단백질을 SAG로 교체하고, 이는 70.1% OLIG2+ 전구세포로 추가로 수율을 증가시켰다(도 2B). 12일에, 세포를 탈착시키고 저부착 플레이트에 놓아 이의 응집체를 구상체로 촉진하였다. 하나의 구상체를 형성하는데 필요한 세포의 최소 수는 적어도 100 세포이었고, 우리는 구상체 중의 다수의 세포가 GFP+라는 것에 주목하였다. 이를 추가로 조사하기 위하여, 우리는 12일 배양을 GFP로 분류하고, 오직 응집체를 형성한 GFP+ 세포만을 관찰하였다(도 2C). 이는 응집 단계 단독으로 OLIG2+ 군집에 풍부를 제공한다는 것을 제시한다.
그 다음, 우리는 제2 hESC 세포주(RUES1)를 분화시키고 qRT-PCR로 PAX6, OLIG2, 및 NKX2.2의 전사 수준을 비교함으로써, 초기 단계가 OLIG2+ 전구세포의 생성을 향하였다는 것을 입증하였다. 이러한 전사 인자의 상향조절은 7일쯤에 PAX6 유도, 13일쯤에 OLIG2 피크, 및 10일 후 NKX2.2의 지속 가능하게 높은 수준을 갖는, OLIG2-GFP 세포주의 것과 유사한 시간적 패턴에 따랐다(도 2D). 이러한 결과들을 기반으로, 우리는 비유전적으로 변형된 RUES1 세포주를 사용하여, OLIG2+ 전구세포로부터 MBP+ 성숙 희소돌기아교세포로의 하기 프로토콜 단계를 발달시켰다(도 4A). PAX6+ 세포가 7일에 발생하였고, 12일까지 이들은 다층 구조로 배열되었다(도 4B, 도 4C). 12일부터 30일까지, 세포는 구상체로서 성장하였고, 그 다음, 이를 나머지 프로토콜을 위하여 폴리-L-오르니틴/라미닌(pO/L)-코팅된 디쉬 위에 플레이팅하였다.
O4+ 단계를 향한 성숙을 촉진하기 위하여, PDGF-AA, HGF, IGF1, 및 NT3을 20일부터 계속 배양 배지에 첨가하였다. OLIG2+ 전구세포를 NKX2.2로 상향조절한 다음, SOX10로 상향조절하고, 최종적으로 O4 살아있는 염색 및 이의 고도로 분지된 과정에 의해 확인되는 후기 OPC로 성숙시켰다(도 4D 내지 도 4G). O4+ OPC 발현 OLIG2, SOX10 및 NG2(도 4H 내지 도 4J)는 50일만큼 초기에 나타났고, 이의 수는 75일쯤에 극적으로 증가하였다. 분화 동안, 전구 세포의 40 내지 50%는 Ki67 염색에 의해 지시된 바, 증식성이었다. 그러나, 고도로 분지된 O4+ 세포는 시험관내에서 분열되지 않았다(도 5A 내지 5C). 추가로, O4+ OPC의 34 ± 4%는 적어도 2주 동안 배지로부터 성장 인자 철회 후, MBP+ 성숙 희소돌기아교세포로 분화되었다(도 4K 내지 도 4L, 도 5D). 이러한 배양은 또한 다른 세포 유형, 즉, 다시 말해 각각 전체 세포의 15 ± 2% GFAP+ 성상세포 및 20 ± 2% MAP2+ 뉴런으로 이루어졌다(도 4M, 도 5E).
우리는 또한 배양 겨우 55일 후, 대략 30% O4+ 세포를 발생시키는 대안적인 전략을 사용하여 유의미하게 분화의 길이와 비용을 감소시켰다. 선택된 구상체가 접종되는 경우, 30일만큼 초기에 미토겐 PDGF, NT3, IGF-1 및 HGF를 배지로부터 철회하였다. 이는 55일에 O4+ 세포의 출현을 야기하였다. 배양을 계속하여 O4+ 세포의 빈도를 더 긴 프로토콜과 비슷한 수준으로 증가시켰다(도 6).
표 1에서 나타낸 바와 같이, O4 효능은 9종의 상이한 PSC 세포주에서 28% 내지 80%의 범위이고, 평균은 4종의 세포주에서 60% 초과였다. 세포를 O4 항체로 염색하고, 유세포분석으로 분석하였다. 1종의 hESC 세포주(RUES1) 및 8종의 hiPSC 세포주를 시험하였다. 기술적 복제는 각각 상이한 계대로 각각의 세포주의 상이한 배치(batch)를 사용하여 수행하였다. 결과는 또한 평균 퍼센트 ± SEM로서 표시한다.
분화 대략 75일 후, O4+ OPC의 퍼센트
세포주 N O4 + (%) 평균 ± SEM (%)
102 4 40, 71, 72, 74 61.8 ± 7.6
104 4 55, 61, 61, 68 61.3 ±2.7
107 1 48
109 3 55, 60, 70 61.7 ± 4.2
110 3 29, 37, 73 46.2 ± 13.7
111 2 46, 47 46.4 ± 0.4
130 4 43, 47, 58, 76 56.1 ± 7.2
197 1 28
RUES1 5 36, 54, 68, 78, 80 62.9 ± 8.2
N = 기술적 반복의 수
두 전략에 있어서, MBP+ 세포가 이러한 배양 조건하에 축삭돌기 섬유에 부합하지 않음에도 불구하고, 미토겐의 철회는 OPC의 MBP 발현 희소돌기아교세포로의 최종 분화를 추진시킨다(도 7G, 도 7H). 수초형성 연구를 위하여, O4+ OPC는 형광 활성 세포 분류(FACS)를 통해 정제될 수 있고, 생체내 이식될 수 있다. O4+ 세포는 또한 분류 직후 동결보존될 수 있고, 이식 24 내지 48시간 전에 해동될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 프로토콜의 다양한 단계에서, qRT-PCR 또는 면역형광으로 적절한 마커의 발현에 대하여 배양을 확인하였다. 배양의 8일에 PAX6에 대하여(도 7A) 및 12에 OLIG2 및 NKX2.2에 대하여(도 7C) 배양의 면역형광 분석을 수행하는 경우, 빈도는 PAX6+에 있어서 90%, OLIG2+에 있어서 70%, 및 OLIG2+/NKX2.2+ 세포에 있어서 30%보다 커야만 한다. 40 내지 50일까지, SOX10은 발현되어야 하고, OLIG2 및 NKX2.2와 공존하여야 한다(도 7E). 50일부터 75일까지, 살아있는 O4 염색을 수행하여 O4+ 세포의 출현 및 이의 확장을 검출할 수 있다(도 6A 내지 도 6F, 도 7F). 인간 발달에 있어서, OPC는 PDGFRα 및 NG2 발현 후, O4의 발현을 특징으로 한다. 문헌[Jakovcevski, I. et al., Front Neuroanat. 3:5(2009)]. 배양 조건하에, 75일까지, 대부분의 O4+ 세포는 PDGFRα를 잃었지만 NG2 발현을 보유하였다. 이 단계에서 우리는 배양에서 임의의 잔여 다능성 세포를 관찰하지 못하였다.
최종적으로, O4+ 세포를 FACS를 통해 단리할 수 있거나, 추가로 MBP+ 희소돌기아교세포로 분화시킬 수 있다(도 7G, 도 7H). 기타 세포 유형이 또한 낮은 퍼센트지만 75일 배양에 존재한다. 우리는 일반적으로 전체 세포 군집의 약 15%인 GFAP+ 세포 및 약 20% βIII-튜불린+ 세포를 확인하였다(도 7H). 최종 분화 단계 후, 세포를 교질 배지에서 2주 동안 배양하는 경우, O4+ 세포의 약 35%는 또한 MBP를 발현하여야 한다.
실시예 2: PPMS-iPSC 세포주로부터의 희소돌기아교세포의 분화
우리의 프로토콜이 iPSC 세포주에 적용될 수 있다는 것을 보여주기 위하여, 우리는 4명의 PPMS 환자로부터 피부 생검을 수득하였다. 섬유아세포 배양을 생검으로부터 확립하고, 대부분의 불응성 세포주(refractory line)(스템젠트(Stemgent))에 대한 재프로그래밍 효능을 개선하는 miRNA의 클러스터와 함께, 변형된 mRNA의 칵테일에 의한 일일 형질감염을 사용하여 iPSC를 생성하였다(Warren et al., Cell Stem Cell. 7:618-30(2010)). 재프로그래밍의 12일부터 15일까지, TRA-1-60+ 콜로니(도 8A)는 살아있는 염색으로 확인되고, 픽킹되고, 확장되고, 다능성 마커에 대한 면역형광에 의해 특성화된다(도 8B).
7종의 다능성 유전자에 대한 발현 프로파일은 모든 4종의 iPSC 세포주가 참고(reference) hESC 세포주와 비슷한 프로파일을 나타내고, 모 섬유아세포로부터 분기되는 것을 확인해주었다(도 8C). 모든 iPSC 세포주는 정상 핵형을 나타냈고(도 8D), 시험관내 자발적인 배양체 분화를 통해 도 8E) 및 생체내 기형종 검정을 통해서 (도 8F; 도 9) 둘 다에서 세 배엽의 세포 유형으로 분화될 수 있었다.
그 다음, 우리는 프로토콜이 우리의 PPMS-iPSC 세포주로 재현 가능한지 여부를 평가하였다. 시험된 모든 iPSC 세포주는 RUES1 세포주와 유사하게 수행하는 것으로 확인되었다(도 10A 내지 도 10I). RUES1로부터 70% O4+ 세포 이하, 및 PPMS iPSC 세포주로부터 43.6% 내지 62.1%로, 분류된 O4+ OPC의 빈도에 의해 계산된 바, 프로토콜은 크게 재현 가능하였고 매우 효과적이었다. 추가로, 우리는 O4+ 분획이 PDGFRα에 이중 양성인 세포의 하위군집을 함유한다는 것을 확인하였다(도 10J). O4+ 세포는 형광 활성 세포 분류(FACS)로 용이하게 정제될 수 있으며, 이의 형태학을 잃지 않고 냉동 및 해동될 수 있다(도 11D).
실시예 3: PPMS-유래된 후기 OPC에 의한 축삭돌기 수초형성 마우스 뇌
우리의 프로토콜을 통해 수득된 OPC가 기능적으로 수초발생성이라는 것을 확인하기 위하여, 우리는 75일 FACS-정제된 O4+ 세포(105 세포/동물)를 면역저하된(immuno-compromised) 시버러 마우스의 신생아 전뇌에 주사하였다(도 11A). 다능성 마커 SSEA4 및 TRA-1-60의 유세포분석 분석에 의해 나타낸 바에 따르면, 주사된 세포는 임의의 오염물질 iPSC이 감소되었다(도 11B). 그러나, 우리는 생체내 이식 전에 우리의 배양을 정제하여 임상 연구로의 변형을 위한 가능성을 보유하였다. 세포를 냉동하고, 해동하고, 이식 24 내지 48시간 전에 회수하는 것을 허용하였다(도 11C). 동물을 12 내지 16주에 희생시키고, 이 시점에 인간 hNA+ 세포는 뇌량 및 전뇌 백질 전체에 분포되어 있었다. 12주에 뇌량에서 hNA+ 세포의 밀도는 34,400 ± 3,090 세포/mm3이었고, 16주까지, 인간 세포의 수는 대략 12주 이후로 대략 2배가 되었다. 우리는 세포 클러스터 또는 명백한 종양형성의 존재를 관찰하지 못했고, 생착된 hNA+ 세포의 증식성 분획은 12주에서 17%였고, 겨우 세포의 5%가 PCNA+인 경우, 16주에 겨우 8% Ki67+로 감소하였다. 중요하게, 뇌량에서 hNA+ 세포의 80% 초과의 OLIG2 단백질을 동시발현하였고, 이는 생착된 세포가 희소돌기아교세포 계통으로 제한되었다는 것을 제시한다(도 12E). 추가로, 인간 MBP+ 희소돌기아교세포는 12 및 16주에 생착된 뇌량 전체에서 확산되어 발견되었다(도 12A). 16주에, 호스트 마우스 축삭돌기의 31 ± 3%는 생착된 마우스 뇌량 내에 싸여져 있었다(도 12B).
16주 연령의 뇌량에서 투과 전자 현미경은 주조밀 및 내부기간 선의 변경의 존재하에 성숙 조밀한 수초를 나타냈고(도 12C, 도 12D); 주사되지 않은 시버러/rag2 마우스는 얇고 느슨하게 싸여진 수초를 가졌다. 이와 같이, g-비 측정에 의해 평가된 바에 따르면, 수초 피포의 두께는 몇몇 뇌량 축삭돌기에서 정상 수초의 복구를 반영하였다.
12주에, 이식된 hNA+ 세포는 뇌량에서 NG2+ OPC로서 남아 있고(도 12E), 16주에 이들은 상부 대뇌 피질로 이동하기 시작하였다(도 12F). 매우 적은 O4-분류된 세포 hGFAP+ 성상세포로서 분화를 겪었고, hGFAP+ 세포의 다수는 SVZ 및 뇌실 근처에 편재되었고(도 12G), 이는 국지적 환경이 이들 지역에서 성상세포의 분화를 유도할 수 있다는 것을 제시한다. 유사하게, hNESTIN-발현 세포는 뇌량에서 거의 발견되지 않고, 이와 같이 SVZ에서 집중되어 있었다. 중요하게, βIII-튜불린+ 뉴런은 어떠한 생착된 동물에서도 검출되지 않았다. 종합하면, 우리의 데이터는 PPMS-유래 O4-분류된 세포가 생체내 성숙 희소돌기아교세포 분화, 및 뇌에서 정상 수초과 유사한 밀도있는 조밀한 수초의 형성이 가능하다는 것을 증명한다.
실시예 4: 실시예 1 내지 3에 대한 상세한 실험 과정
세포주
3종의 hESC 세포주 및 4종의 hiPSC 세포주를 사용하였다. RUES1 및 HUES 45는 둘 다 NIH-인증된 hESC 세포주이고; OLIG2-GFP 리포터 세포주는 BG01 hESC 세포주(텍사스 대학 보건 과학 센터, 휴스톤에 소재)로부터 유도된다. 4종의 iPSC 세포주는 mRNA/miRNA 방법(스템젠트)을 통해 PPMS 환자의 피부 생검으로부터 우리의 실험실에서 유도되었다.
hPSC 배양 조건
hESC 및 hiPSC 세포주를 배양하고 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 층 위에서 HUESM(인간 배아 줄기 배지) 배지 및 10 ng/㎖ bFGF(스템셀 테크놀로지스(Stemcell Technologies))로 확장시켰다. 희소돌기아교세포 분화를 위하여, 세포를 마트리겔®-코팅된 디쉬 및 mTeSR1 배지(스템셀 테크놀로지스) 위의 배양에 적응시켰다. HUESM은 녹아웃(Knockout)-DMEM, 20% 녹아웃 혈청, 글루타맥스 2mM, NEAA 0.1mM, 1X P/S 및 β-머캅토에탄올 0.1mM로 구성되고, 모두 라이프 테크놀로지스(라이프 테크놀로지스)(뉴욕주의 그랜드 아일랜드에 소재)로부터 구입하였다. 분화의 모든 단계에서 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 배양한다.
상세한 분화 프로토콜
24시간 동안 10μM ROCK 저해제, Y-27632(스템젠트; 매사추세츠주의 캠브릿지에 소재)를 함유하는 mTeSR1 배지(스템셀 테크놀로지스; 캐나다의 브리티시 컬럼비아주의 벤쿠버에 소재)에서 PSC를 10x103 세포/cm2의 밀도로 마트리겔®(BD 바이오사이언시스(BD Biosciences); 캘리포니아주의 산 호세에 소재) 위에 플레이팅하였다. 플레이팅된 hPSC의 이러한 밀도는 8일까지 융합 웰 및 분화 12일에 다층 구조를 제공하는데 최적화되었다. 이러한 설정은 유의미한 PSC 확장을 필요로 하지 않으며, 6-웰 플레이트의 단지 하나의 웰(80% 융합)만으로 적어도 2x106의 희소돌기아교세포를 분화시키고 단리하는데 충분한 세포를 함유한다. hPSC 콜로니가 직경 100 내지 250㎛에 도달할 때까지 세포를 1 내지 2일 동안 배양하였다.
분화 유도일(0일)에, 배지를 소분자 SB431542 10μM(스템젠트) 및 LDN193189 250nM(스템젠트), 뿐만 아니라 100nM 올-트랜스-RA(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich); 미주리주의 세인트 루이스에 소재)를 함유하는 mTeSR 커스텀 배지(스템셀 테크놀로지스)인 신경 유도 배지로 변경하였다. mTeSR 커스텀 배지는 다능성을 지속시키는 5개의 인자, 즉, 다시 말해 염화리튬, GABA, 피페콜산, bFGF, 및 TGFβ1(스템셀 테크놀로지스)을 갖지 않는, 상업적으로 이용 가능한 mTeSR-1 배지와 동일한 조성물을 갖는다. mTeSR 커스텀 배지 대신에, 우리는 또한 약 25㎍/㎖ 인슐린의 첨가와 함께 DMEM/F12를 사용할 수 있었다. 배지 교체는, 신선한 RA, SB431542, 및 LDN193189를 배지에 매일 첨가하여, 8일까지 매일 수행하였다.
8일까지 세포는 융합이 되어야 하고, PAX6 발현은 이의 피크에 있어야 한다(도 7A). 8일에, 배지를 100nM RA, 1μM SAG(EMD 밀리포어(EMD Millipore); 매사추세츠주의 빌러리카에 소재) 또는 100ng/㎖ rhSHH(R&D 시스템즈(R&D Systems); 미네소타주의 미니애폴리스에 소재)를 함유하는 N2 배지로 변경하였고, 이는 신선한 RA 및 SAG를 매일 배지에 첨가함으로써 매일 교체하였다.
12일까지, 과융합 세포가 쌓이고, 3D 구조가 명백하게 가시화되었고(도 7B); 이는 분화로 진행되기 전에 중요한 확인점이다. 세포는 OLIG2 및 NKX2.2를 발현하였다(도 7C). 12일에, 부착 세포를 기계적으로 또는 효소적으로 탈착시켜 구상체 형성을 허용하였다. 구상체-형성은 OLIG2+ 전구세포를 풍부하게 하였다. 오직 OLIG2+ 세포는 구상체로 응집되는 반면, OLIG2- 세포는 단일 세포로서 남아 있었다. 우리는 단일층의 기계적 분산을 사용하여 가장 높은 수의 구상체, 및 궁극적으로 O4+ 세포를 수득하였다. 우리는 단일층의 효소적 분산을 사용하여 더 적은 수의 더 단일한 구상체를 수득하였다. 기계적 탈착을 위하여, 영양소가 응집체 사이의 모든 세포에 도달할 수 있도록 하는 세포의 단일층을 작은 덩어리로 분쇄하는 세포 리프터를 사용하여 세포를 탈착하였다. 현미경하에 웰을 조사하여 세포가 부착된 채로 남지 않도록 보장하였다. 효소적 소화를 위하여, 아큐타세(ACCUTASE®)(1㎖/2㎖ DMEM/F12 배지)를 웰에 가하여 배양을 단일 세포 현탁액으로 해리시켰다.
응집체를 1μM SAG를 함유하는 N2B27 배지의 초저 부착 플레이트에 재플레이팅하고, 이를 격일로 교체하였다. 20일에, 배지를 PDGF 배지로 변경하고, 2/3 배지 변경을 격일로 수행하였다. 배지 교체 동안, 부드러운 피펫팅을 사용하여 서로 들러붙은 임의의 응집체를 분리하였다. 30일에, 구상체를 폴리-L-오르니틴 하이드로브로마이드(50㎍/㎖; 시그마-알드리치) 및 라미닌(20㎍/㎖; 라이프 테크놀로지스)로 코팅된 플레이트 위에 2 구상체/cm2(6-웰 플레이트에서 웰당 약 20 구상체)의 밀도로 플레이팅하였다. 이러한 밀도는 세포를 구상체 밖으로 이동시키고, 증식시키고, 계대의 필요 없이 프로토콜의 종료에 의해 전체 디쉬로 확산되는 것을 허용하도록 최적화되었다. 우리는 300㎛ 내지 800㎛의 직경을 갖는, 더 어두운 코어를 갖는 금색/갈색인 둥근 응집체를 픽킹하는데 p200 피펫을 사용하였다(도 7D). 우리는 이들은 희소돌기아교세포로 분화되지 않기 때문에 완전하게 투명인 구상체를 회피하였다.
이 단계에서, 플레이팅된 구상체를 미토겐을 함유하는 배지(옵션 A) 또는 임의의 미토겐이 없는 배지(옵션 B)에서 배양하였다. 옵션 A는 O4+ 세포의 가장 높은 수율을 수득하도록 최적화되었고, 옵션 B는 프로토콜의 더 짧고 덜 비용이 드는 버전을 제공하도록 개발되었다.
옵션 A
구상체를 상기 기재된 바와 같이, 30일에 PDGF 배지에서, pO/L 플레이트 위에 플레이팅하였고, PDGF 배지의 2/3를 분화 75일까지 격일로 교체하였다. O4+ 세포의 출현을 55일부터 계속 살아있는 O4 염색으로 평가하였다(도 6). 75일에, O4+ OPC를 FACS로 단리할 수 있었다(도 7I). 대안적으로, 최종 희소돌기아교세포 분화를 위하여(도 7G, 7H), 세포를 75일부터 교질 배지에서 배양하고, 배지의 2/3을 2주 동안 3일마다 교체하였다.
옵션 B
구상체를 상기 기재된 바와 같이, 30일에 교질 배지에서, pO/L 플레이트 위에 플레이팅하였고, 교질 배지의 2/3를 분화 55일까지 격일로 교체하였다. 55일에, O4+ 세포는 살아있는 O4 염색에 의해 가시화되었거나(도 6A 내지 도 6F, 도 7F), FACS에 의해 단리되었다(도 6G). 75일에, O4+ OPC는 FACS에 의해 단리될 수 있었다. 대안적으로, 교질 배지에서 75일까지 배양을 유지하여 O4+ 세포의 효능을 증가시켰다(도 6). 우리는 MBP+ 세포가 약 60일에 시작되는 것을 관찰하였다.
옵션 A 및 옵션 B 프로토콜 둘 다에 있어서, 30일의 응집체, 및 분화 끝에 세포를 생존능 > 70%로 동결보존하였다. 응집체 생존능은 해동 후 pO/L 코팅된 디쉬에 재부착된 해동된 구상체의 수를 기반으로 한다. 분류된 O4+ 세포를 분류 직후 냉동할 수 있다. 분류된 O4+ 세포의 예상된 해동 후 생존능은 70 내지 80%이다.
표 2는 프로토콜에서 사용되는 배지 조성물의 목록을 제공한다.
배양 배지의 상세한 조성물
배지 구성분 제공자 최종 농도
N 2 배지 DMEM/F12
글루타맥스(100X)
비필수 아미노산(100X)
β-머캅토에탄올(1000X)
페니실린-스트렙토마이신(100X)
N2 보충물(100X)		 라이프 테크놀로지스
라이프 테크놀로지스
라이프 테크놀로지스
라이프 테크놀로지스
라이프 테크놀로지스

라이프 테크놀로지스
1X
1X
1X
1X

1X
N 2 B 27 N 2 배지
B27 보충물(50X)
라이프 테크놀로지스
1X
PDGF 배지 N 2 B 27 배지
PDGF
IGF-1
HGF
NT3
인슐린
바이오틴
cAMP
T3
R&D 시스템즈
R&D 시스템즈
R&D 시스템즈
EMD 밀리포어
시그마-알드리치
시그마-알드리치
시그마-알드리치
시그마-알드리치
10ng/ml
10ng/ml
5ng/ml
10ng/ml
25㎍/ml
100ng/ml
1μM
60ng/ml
교질 배지 N 2 B 27 배지
아스코르브산
HEPES
인슐린
바이오틴
cAMP
T3
시그마-알드리치
시그마-알드리치
시그마-알드리치
시그마-알드리치
시그마-알드리치
시그마-알드리치
20㎍/ml
10mM
25㎍/ml
100ng/ml
1μM
60ng/ml
펀치 생검으로부터 피부 섬유아세포의 유도
피부 생검을 MS 환자 및 건강한 개체로부터 수득하였다(도 13). 뉴욕의 티쉬 다발성 경화증 연구 센터(Tisch Multiple Sclerosis Research Center of New York)에서 4명의 식별되지 않은 환자를 표준 진단 기준에 따라 PPMS로 진단하였다. 이의 생검을 제도적 재검토 이사회 승인(BRANY) 및 고지된 동의하에 수득하였다. 모든 환자는 백인이다. 환자 102 및 107은 남성이며 각각 56세 및 61세 연령이고; 환자 104 및 109는 여성이며 각각 62세 및 50세 연령이다.
3mm의 피부 생검을 RPMI 1460(라이프 테크놀로지스) 및 1X 항생제-항진균제(라이프 테크놀로지스)로 이루어진 생검 수집 배지에서 수집하였다. 생검을 더 작은 조각(<1mm)으로 절단하고, 5분 동안 TC-처리된 35mm 디쉬 위에 플레이팅하여 건조시키고, 최종적으로 이들을 녹아웃 DMEM, 2mM 글루타맥스™, 0.1mM NEAA, 0.1mM β-머캅토에탄올, 10% 태아 소 혈청(FBS), 1X 페니실린-스트렙토마이신(P/S; 모두 라이프 테크놀로지스로부터 입수) 및 1% 뉴클레오시드(EMD 밀리포어)로 구성된 생검 플레이팅 배지에서 5일 동안 또는 제1 섬유아세포가 생검으로부터 성장할 때까지 배양하였다. 대안적으로, 생검을 1000U/㎖ 콜라게나제 1A(시그마-알드리치)로 1.5시간 동안 37℃에서 소화시키고, 세척하고, 수집하고, 생검 플레이팅 배지에서 5일 동안 1% 겔라틴-코팅된 35mm 디쉬 위에 플레이팅하였다. 그 다음, 섬유아세포를 DMEM(라이프 테크놀로지스), 2mM 글루타맥스™, 0.1mM NEAA, 0.1mM β-머캅토에탄올, 10% FBS 및 1X P/S로 이루어진 배양 배지로 확장시키고, 배지를 격일로 교체하였다.
피부 섬유아세포의 재프로그래밍
계대 3 내지 5에서 피부 섬유아세포를 스템젠트 mRNA/miRNA 키트를 사용하여 재프로그래밍하였고, 이는 OCT4, SOX2, KLF4, cMYC 및 LIN28에 있어서 변형된 RNA를 통하여, 무-통합, 바이러스 무함유 인간 iPSC의 생성을 야기하였다(도 14). miRNA의 특이적 클러스터의 첨가는 재프로그래밍(스템젠트)의 효능을 증가시키는 것으로 확인되었다. 간략하게, 섬유아세포를 배양 배지에서 5.5x103 세포/cm2 밀도로 마트리겔-코팅된 6-웰 또는 12-웰 플레이트 위에 플레이팅하였다. 다음 날, 배지를 B18R을 함유하는 NuFF-컨디셔닝된 플루리톤(Pluriton) 재프로그래밍 배지로 교체하였다. 하기와 같이 스템펙트(STEMFECT)™를 사용하여 세포를 연속 11일 동안 형질감염시켰다: 0일 miRNA 단독, 1일부터 3일까지 mRNA 칵테일 단독, d4 miRNA와 mRNA 칵테일의 합, 5일부터 11일까지 mRNA 칵테일 단독. 11일 후, 살아있는 TRA-1-60으로 양성으로 염색된 가시적인 콜로니를 픽킹하고, HUESM 배지를 갖는 MEF에서 재플레이팅하였다.
기형종 검정
콜롬비아 기관 동물 관리 및 이용 위원회(IACUC)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 실험을 수행하였다.
iPSC 콜로니를 콜라게나제(시그마-알드리치)를 사용하여 15분 동안 37℃에서 해리시키고, 세척하고, 수집하고, HUESM 200㎕ 중에 재현탁시켰다. 그 다음, 세포를 얼음 위에서 마트리겔™(BD 바이오사이언시스) 200㎕와 혼합하고, 면역결핍 마우스(잭슨 라보라토리(Jackson Laboratory); 메인주의 바 하버에 소재)에 피하 주사하였다. 기형종을 9 내지 12주 동안 성장하도록 허용하고, 해부로 단리하고, 4% PFA 중에 밤새 4℃에서 고정시켰다. 고정된 조직을 파라핀에 삽입하고, 10㎛ 두께로 절개하고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다.
시험관내 자발적인 분화
iPSC를 아큐타세®(라이프 테크놀로지스)로 5분 동안 37℃에서 해리시키고, bFGF이 없는 HUESM에서 초저부착 6-웰 플레이트에 접종하고, 배지를 격일로 변경하였다. 배양 3주 후, 배양체(EB)를 추가 2주 동안 1% 겔라틴-코팅된 TC-처리된 디쉬 위에 플레이팅하였다. EB 및 이의 파생물을 4% PFA 중에 8분 동안 실온에서 고정하고, 적절한 마커로 면역염색하였다.
RNA 단리 및 qRT-PCR
RNA 단리를 퀴아쉬레터(QIAshredder)(퀴아젠(Qiagen); 독일의 힐덴에 소재)와 함께 RNeasy 플러스 미니 키트(RNeasy Plus Mini Kit)를 사용하여 수행하였다. 간략하게, 세포를 펠렛화하고, PBS로 세척하고, 용해 완충액 중에 재현탁시켰다. 그 다음, 제조사의 설명에 따라 추가로 처리할 때까지 샘플을 -80℃에서 저장하였다. RNA를 RNase 무함유 ddH2O 30㎕ 중에서 용출시키고, 나노드롭 8000(NanoDrop 8000) 분광광도계(써모 사이언티픽(Thermo Scientific); 뉴저지주의 서머셋에 소재)로 정량하였다.
qRT-PCR을 위하여, cDNA를 RNA 0.5㎍ 및 무작위 프라이머로 고스크립트(GoScript)™ 역전사 시스템(프로메가(Promega); 위스콘신주의 매디슨에 소재)을 사용하여 합성하였다. 그 다음, cDNA 20ng을 96-웰 반응 플레이트에 20㎕ 반응 중에 GoTaq® qPCR 마스터 믹스 10㎕ 및 각각의 프라이머(10nM) 1㎕와 함께 로딩하고, 플레이트를 스트라타젠 Mx300P qPCR(Stratagene Mx300P qPCR) 시스템(애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies); 캘리포니아주의 산타 클라라에 소재)에서 작동시켰다. 표 3에 프라이머 서열을 열거한다.
qRT-PCR에 사용된 프라이머의 서열
서열 번호 표적
유전자 		정방향 프라이머 서열 번호 역방향 프라이머
1 PAX6 TTTGCCCGAGAAAGACTAGC 2 CATTTGGCCCTTCGATTAGA
3 OLIG2 TGCGCAAGCTTTCCAAGA T 4 CAGCGAGTTGGT GAGCATGA
5 NKX2.2 GACAACTGGTGGCAGATTTCGCTT 6 AGCCACAAAGAAAGGAGTTGGACC
7 PTCH1 ATCTGCACCGGCCCAGCTACT 8 CCACCGCGAAGGCCCCAAATA
9 SHH AAACACCGGAGCGGACAGGC 10 GGTCGCGGTCAGACGTGGTG
다능성에 대한 나노스트링 분석
RNA를 이전에 기재된 바와 같이 미분화된 iPSC 및 hESC HUES45로부터 단리하였다. RNA(100ng/샘플)를 제조사의 설명에 따라 특이적인 리포터 코드 세트 및 포획 프로브 세트(나노스트링 테크놀로지스(NanoString Technologies); 워싱턴주의 시애틀에 소재)로 혼성화를 위하여 로딩하였다. 데이터를 하기 하우스키핑 유전자에 정규화시켰다: ACTB, POLR2A, ALAS1. 데이터를 hESC 세포주(HUES45=1)의 발현에 대한 배수 변화로서 표시하였다. 도 15를 참조한다.
핵형분석
모든 iPSC-세포주를 세포주 유전학으로 세포유전학 분석을 수행하여 정상 핵형을 확인하였다.
면역염색 및 이미징
세포를 PBS-T(0.1% 트리톤-X100을 함유한 PBS) 중에서 10분 동안 3회 세척하고, 2시간 동안 차단 혈청(5% 염소 또는 당나귀 혈청을 갖는 PBS-T) 중에서 배양하고, 1차 항체를 밤새 4℃에서 적용하였다(표 4). 다음 날, 세포를 PBS-T 중에서 15분 동안 3회 세척하고, 2차 항체와 2시간 동안 실온(RT)에서 배양하고, 10분 동안 PBS-T 중에서 3회 세척하고, DAPI로 15분 동안 실온에서 대비염색하고, PBS 중에서 2회 세척하였다. 인비트로젠(Invitrogen)™ 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 2차 항체, 염소 또는 당나귀 항-마우스, 래트, 토끼, 염소 및 닭 488, 555, 568, 및 647을 1:500 희석으로 사용하였다(라이프 테크놀로지스).
이미지를 형광을 위한 올림푸스(Olympus) DP30BW 흑백 디지탈 카메라 및 H&E 염색을 위한 DP72 디지탈 칼라 카메라가 장착된 올리푸스 IX71 도립 현미경을 사용하여 수득하였다. 형광 색상을 올림푸스 소프트웨어 DP 매니저(DP Manager) 또는 이미지제이(ImageJ)를 사용하여 디지탈로 적용하였다. 계수를 위하여, 적어도 3개의 겹치지 않는 필드를 이미지제이에 불러오고, 쓰레홀드(threshold)하고, 수동으로 점수화하였다.
유세포분석
세포를 25분 동안 37℃에서 아큐타세® 처리로 효소적으로 수확하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 그 다음, 세포를 1차 항체 또는 형광-접합된 항체의 적절한 양을 함유한 이의 각각의 배지 100㎕에 재현탁시키고, 빛이 차단된 30분 동안 얼음 위에서 배양하였다. 2차 항체가 사용되는 경우, 1차 항체를 PBS로 세척하고, 2차 항체를 30분 동안 얼음 위에서 적용하였다. 염색된 또는 GFP 발현 세포를 PBS로 세척하고, 100㎛ 세라믹 노즐 및 20 psi를 사용하여 5 레이저 BD 바이오사이언시스 ARIA-IIu™ 세포 분류기에서 즉시 분류하였다. DAPI를 죽은 세포 배제에 사용하였다. BD FACSDiva™ 소프트웨어를 사용하여 유세포분석 데이터를 분석하였다.
시버러( shi/shi ) x Rag2 -/- 마우스로의 이식
시버러/rag2 마우스(로체스터 대학; 문헌[Windrem, M.S. et al., Cell Stem Cell. 2:553-565(2008)])를 사용하는 모든 실험을 버팔로 대학 기관 동물 관리 및 이용 위원회(IACUC)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다. 이전에 동결보존되었던 FACS-분류된 O4+ OPC를 해동시키고, PDGF 배지에서 pO/L 디쉬 위에 플레이팅함으로써 수술 전에 1 내지 2일 동안 복구를 허용하였다. 세포를 ㎕당 1 x 105 세포로 재현탁시킴으로써 세포를 주사용으로 제조하였다.
이전에 기재된 바와 같이 주사를 수행하였다. 문헌[Sim, F.J. et al.(2011)]. 저체온을 사용하여 새끼들을 마취하고, 5 x 104 세포를 출생 2-3일의 새끼의 뇌량으로 1.1mm 깊이로 양측으로 각 부위에 주사하였다. 세포를 당겨진 유리 피펫을 통해 주사하고, 추정되는 표적 부위로 두개골을 통해 직접 삽입하였다. 동물을 희생시키고, 12 내지 16주에 염수 후, 4% 파라포름알데하이드를 관류시켰다. 동결보존된 마우스 전뇌의 관상 절편(16㎛)을 절개하고, 160㎛ 마다 샘플링하였다. 문헌[Sim, F.J. et al.(2011)]. 인간 세포를 마우스 항인간 핵(hNA)로 확인하였고, 수초 염기성 단백질-발현 희소돌기아교세포를 MBP로 표지화하였다. 인간 성상세포 및 OPC를 각각 hGFAP 및 hNG2에 대항하는 인간-특이적 항체로 염색하였다. 마우스 신경미세섬유(NF)를 SMI311와 SMI312의 1:1 혼합물로 염색하였다. 인비트로젠™ 알렉사 플루오르 2차 항체, 염소 항-마우스 488, 594, 및 647을 1:500 희석으로 사용하였다(라이프 테크놀로지스). 투과 전자 현미경을 위하여, 조직을 이전에 기재된 바와 같이 처리하였다. 문헌[Sim, F.J. et al., Molec. Cell. Neurosci. 20:669-682(2002)]. 표 4는 사용된 1차 항체의 목록을 제공한다.
1차 항체
항원 희석 호스트 제공자 항원 희석 호스트 제공자
OCT4 1:250 토끼 스템젠트 SOX10 1:100 염소 R&D 시스템즈
TRA-1-60 1:250 마우스 밀리포어 NG2 1:200 마우스 BD 바이오사이언시스
SOX2 1:250 토끼 스템젠트 PDGFRα-PE 1:5 마우스 BD 바이오사이언시스
TRA-1-81 1:250 마우스 밀리포어 O4 1:30 마우스 골드만 랩
(Goldman lab)
NANOG 1:100 토끼 셀 시그널
(Cell Signal.)		 MBP 1:200 래트 밀리포어
SSEA4 1:250 마우스 앱캠(Abcam) MAP2 1:5000 닭 앱캠
AFP 1:300 토끼 다코(Dako) GFAP 1:750 토끼 다코
αSMA 1:300 마우스 시그마(Sigma) hNA 클론 235-1 1:100 마우스 밀리포어
βIII-튜불린 1:500 닭 뉴로믹스
(Neuromics)		 GFAP(생체내) 1:800 마우스 코반스
PAX6 1:250 토끼 코반스
(Covance)		 NG2(생체내) 1:800 마우스 밀리포어
OLIG2 1:500 토끼 밀리포어 SMI311, SMI312(엠뉴로필라멘트(mNeurofilament)) 1:800 마우스 코반스
NKX2.2 1:75 마우스 DSHB
특정한 실시형태의 상기 설명은 본 발명의 일반적인 성질을 완전히 드러내어, 다른 이들이 과도한 실험 없이 당해 분야의 숙련가 내에서 본 발명의 일반적인 개념으로부터 벗어나지 않고 다양한 적용을 위한 이러한 특정한 실시형태를 용이하게 변형 및/또는 개조하는 지식을 적용할 수 있도록 한다. 따라서, 이러한 개조 및 변형은 본 명세서에 나타낸 교시 및 지도를 기반으로, 기재된 실시형태의 등가물의 의미 및 범위 내에 속하는 것이 의도된다. 본 명세서의 용어 또는 어법이 교시 및 지도의 관점에서 숙련가에게 해석되도록 본 명세서의 어법 또는 용어는 한정이 아닌 설명을 목적으로 하는 것으로 이해된다. 본 발명은 하기 청구범위에 의해 추가로 설명된다.
SEQUENCE LISTING <110> NEW YORK STEM CELL FOUNDATION, INC. <120> FUNCTIONAL OLIGODENDROCYTES DERIVED FROM PLURIPOTENT STEM CELLS AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME <130> IPA161521-US-D1 <150> US 62/002,048 <151> 2014-05-22 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 tttgcccgag aaagactagc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 catttggccc ttcgattaga 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 tgcgcaagct ttccaagat 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 cagcgagttg gtgagcatga 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 gacaactggt ggcagatttc gctt 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 agccacaaag aaaggagttg gacc 24 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 atctgcaccg gcccagctac t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ccaccgcgaa ggccccaaat a 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 aaacaccgga gcggacaggc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ggtcgcggtc agacgtggtg 20

Claims (86)

  1. O4-항원-발현 (O4+) 희소돌기아교세포 전구 세포 (OPCs)를 생성하는 방법으로서, 상기 방법이:
    (a) 평활화 효능제 (smoothened agonist, SAG) 및 레티노산 (RA)을 포함하는 배지에서 현탁 상태로 OLIG2+ OPCs의 3차원 세포 응집체를 배양하는 단계;
    (b) 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF), 간세포 성장 인자 (HGF), 인슐린-유사 성장 인자 1 (IGF-1), 및 뉴로트로핀 3 (NT3)을 포함하는 배지에서 현탁 상태로 세포 응집체를 배양하는 단계;
    (c) 세포 응집체를 재-도말하는 단계; 및
    (d) 세포가 O4+일 때까지 (i) 아스코르브산 (AA) 또는 (ii) PDGF, HGF, IGF-1, 및 NT3을 포함하는 배지에서 부착 배양으로 세포 응집체를 배양하는 단계를 포함하고,
    그로써 O4+ OPCs를 생성하는, 방법.
  2. 수초 염기성 단백질-발현 (MBP+) 희소돌기아교세포를 생성하는 방법으로서,
    제1항의 방법에 따라 O4+ OPCs를 생성하는 단계; 및
    희소돌기아교세포가 MBP+일 때까지 PDGF, HGF, IGF-1, 및 NT3의 부재하에서 O4+ OPCs를 배양하는 단계를 포함하고,
    그로써 MBP+ 희소돌기아교세포를 생성하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, RA의 농도가 10 nM과 250 nM 사이 (10 nM과 250 nM도 포함)인, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, RA의 농도가 10 nM과 100 nM 사이 (10 nM과 100 nM도 포함)인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, RA의 농도가 100 nM인, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, SAG 및 RA를 포함하는 배지가 소닉 해지호그 (SHH)가 결여된 것인, 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (a)가 8일간 세포 응집체를 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (b)가 10일간 세포 응집체를 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (c)가 2 구상체/cm2의 밀도로 세포 응집체를 재-도말하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 응집체가 세포외 기질 단백질 및 양으로 하전된 폴리-아미노산을 포함하는 표면에 재-도말되는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 세포외 기질 단백질이 라미닌인, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 폴리-아미노산이 폴리-오르니틴인, 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, PDGF, HGF, IGF-1, 및 NT3을 포함하는 배지가 인슐린을 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, PDGF, HGF, IGF-1, 및 NT3을 포함하는 배지가 트리요오드-L-티로닌 (triiodo-L-thyronine, T3)을 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, PDGF, HGF, IGF-1, 및 NT3을 포함하는 배지가 비오틴을 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, PDGF, HGF, IGF-1, 및 NT3을 포함하는 배지가 사이클릭 AMP (cAMP)를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, PDGF, HGF, IGF-1, 및 NT3을 포함하는 배지가 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF)가 결여된 것인, 방법.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, PDGF, HGF, IGF-1, 및 NT3을 포함하는 배지가 상피 성장 인자 (EGF)가 결여된 것인, 방법.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, AA를 포함하는 배지가 인슐린을 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제1항 또는 제2항에 있어서, AA를 포함하는 배지가 T3을 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, AA를 포함하는 배지가 비오틴을 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서, AA를 포함하는 배지가 cAMP를 추가로 포함하는, 방법.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    (i) 세포 응집체가 AA를 포함하는 배지에서 배양되고, 여기서 상기 세포의 적어도 25%가 AA를 포함하는 배지에서 배양 25일 후 O4+이거나;
    (ii) 세포 응집체가 AA를 포함하는 배지에서 배양되고, 여기서 상기 세포의 적어도 30%가 AA를 포함하는 배지에서 배양 25일 후 O4+이거나;
    (iii) 세포 응집체가 AA를 포함하는 배지에서 배양되고, 여기서 상기 세포의 적어도 40%가 AA를 포함하는 배지에서 배양 45일 후 O4+이거나;
    (iv) 세포 응집체가 AA를 포함하는 배지에서 배양되고, 여기서 상기 세포의 적어도 50%가 AA를 포함하는 배지에서 배양 45일 후 O4+이거나; 또는
    (v) 세포 응집체가 AA를 포함하는 배지에서 배양되고, 여기서 상기 세포의 적어도 60%가 AA를 포함하는 배지에서 배양 45일 후 O4+인, 방법.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 응집체가 PDGF, HGF, IGF-1, 및 NT3을 포함하는 배지에서 배양되고, 여기서 상기 세포의 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 또는 적어도 70%가 PDGF, HGF, IGF-1, 및 NT3을 포함하는 배지에서 배양 45일 후 O4+인, 방법.
  25. 제2항에 있어서, O4+ OPCs가 3주간 PDGF, HGF, IGF-1, 및 NT3의 부재하에서 배양되는, 방법.
  26. 제2항에 있어서, O4+ OPCs의 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 또는 적어도 35%가 PDGF, HGF, IGF-1, 및 NT3이 결여된 배지에서 배양 20일 후 MBP+인, 방법.
  27. 다음 단계를 포함하는, 수초형성 (myelination)을 촉진하는 화합물을 확인하는 방법:
    (a) 제2항의 방법에 의해 MBP+ 희소돌기아교세포를 생성하는 단계;
    (b) MBP+ 희소돌기아교세포를 후보 화합물과 접촉시키는 단계; 및
    (c) 후보 화합물이 MBP+ 희소돌기아교세포에 의해 뉴런 수초형성을 촉진하는지 여부를 결정하는 단계.
  28. 제27항에 있어서, 방법이 고처리량 방법인, 방법.
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