KR102563568B1

KR102563568B1 - 렙틴 수용체에 길항하는 항원-결합 단백질

Info

Publication number: KR102563568B1
Application number: KR1020197016377A
Authority: KR
Inventors: 제스퍼 그로마다; 파나이이오티스 스테비스; 주디스 알타레요스
Original assignee: 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2016-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2023-08-04
Also published as: WO2018089532A1; JP2024109952A; CO2019004672A2; IL272358B; EA201991075A1; US20180127508A1; CL2019001263A1; EP3538554A1; JP2023093753A; MX2019005397A; CL2020001023A1; UA127678C2; US20230235068A1; IL266426B; IL266426A; US10550192B2; MA45801A1; JP2022031969A; US20200123264A1; MY191256A

Abstract

본 발명은 항체 및 렙틴 수용체 (LEPR)에 결합하는 항체의 항원-결합 단편, 및 그것의 사용 방법을 제공한다. 특정 구체예에 따르면, 본 발명은 항체 및 LEPR에 결합하여 LEPR 신호 전달에 길항하는 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 항체 및 렙틴의 존재 또는 부재 하에 LEPR에 결합하는 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 항체 및 LEPR 신호 전달의 부분적 아고니즘을 나타내는 항체의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은, 제한되는 것은 아니지만, 울혈성 심부전 악액질, 폐 악액질 및 암 악액질, 자가면역 장애, 예컨대 염증성 장 질환, 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 건선, 심혈관 질환, 상승된 혈압, 신경 퇴행성 장애, 우울증, 암, 예컨대 간세포 암종, 흑색종, 유방암, 및 상승된 렙틴 신호 전달과 관련이 있거나 또는 이것에 의해 유발되는 다른 질환 및 장애를 포함하는 다양한 병태의 치료에 유용하다.

Description

렙틴 수용체에 길항하는 항원-결합 단백질

본 발명은 항체 및 렙틴 수용체 (LEPR)에 결합하는 항체의 항원-결합 단편, 및 그것의 사용 방법을 제공한다.

렙틴은 대부분 지방 조직에 의해 발현되는 폴리펩타이드 호르몬이고 대사 조절, 에너지 균형 및 음식 섭취와 관련이 있다. 렙틴 활성은 렙틴 수용체와의 상호작용, 및 렙틴 수용체를 통한 신호 전달에 의해 매개된다. 렙틴 수용체 ("LEPR", "WSX", "OB 수용체", "OB-R", 및 "CD295"로도 알려져 있음)는 큰 (818개의 아미노산) 세포외 도메인을 가진 부류 I 사이토카인 수용체 패밀리의 단일 패스(single-pass) 막관통 수용체이다. 렙틴, Ob-R 렙틴 수용체 또는 둘 다의 높아진 발현은, 제한되는 것은 아니지만, 거식증(anorexia) 또는 기타 정신의학적 식이 장애, 만성 신장 질환 악액질(cachexia), 기타 악액질, 예컨대 울혈성 심부전(congestive heart failure) 악액질, 폐 악액질, 방사선 악액질, 및 암 악액질, 자가면역 장애, 예컨대 염증성 장 질환, 홍반성 낭창(lupus erythematosus), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 건선(psoriasis), 심혈관 질환, 상승된 혈압, 우울증(depression), 비알콜성 지방간 질환, 신경 퇴행성 장애, 우울증, 암, 예컨대 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 흑색종(melanoma) 및 유방암을 포함하는 다수의 장애에 기여할 수 있다.

높은 렙틴 신호 전달을 해결하기 위해 제안된 치료적 접근법은 렙틴 수용체 펩타이드 안타고니스트(ant아고니스트) 및 안타고니스트 돌연변이, 예컨대 수용성 렙틴 수용체 변이체, 경쟁적 LEPR 안타고니스트, 예컨대 항체 9F8 (Fazeli et al. (2006) J Immunological Methods 312, 190-200) 또는 나노바디 표적화 렙틴 수용체 (McMurphy et al., PLOS One (2014) 9(2):e89895), 피브로넥틴 III 도메인, 식욕 유발 물질 (예를 들어, 그렐린 및 NPY)의 사용, 렙틴의 다운스트림 매개자 (예를 들어, 멜라노코르틴 수용체 4)의 차단 및/또는 생활 방식의 변화를 포함한다. 하지만, 이러한 접근법은 일반적으로 제한된 효능을 나타냈다. 따라서, 렙틴 저항성 및 상승된 혈청 렙틴 수준, 및/또는 과도한 LEPR 신호 전달과 관련된 다른 병태를 치료하기 위한 대안의 접근법이 해당 분야에 필요하다.

서열 목록

서열 목록의 공식 사본은 2017_11_08_10271WO01_SEQ_LIST_ST25.TXT라는 파일명, 2017년 11월 8일의 생성일, 및 약 87.4 킬로바이트의 크기를 가진 ASCII 포맷의 서열 목록으로서 명세서와 함께 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된다. 이 ASCII 포맷의 서류에 함유된 서열 목록은 명세서의 일부이며 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본 발명은 인간 렙틴 수용체 (LEPR)에 결합하는 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 제공한다. 본 발명의 항체는 안타고니스트 항체이다; 즉, LEPR로의 본 발명의 항-LEPR 항체의 결합은 세포에서 렙틴 수용체 신호 전달의 차단 또는 하향 조절을 일으킨다. 따라서, 다양한 구체예에서, 본 발명의 안타고니스트 항체는 약하고 부분적인 아고니스트 활성을 나타낸다. 대신에, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 대상체에서 렙틴의 생물학적 활성을 하향 조절하는데 유용하다. 그러므로 본 발명의 항체 및 항원-결합 단편은 상승된 렙틴 신호 전달과 관련된 질환 및 장애의 치료적 처치에 유용하다.

본 발명의 항체는 전장 (예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체)일 수도 있거나 또는 단지 항원-결합 부분 (예를 들어, Fab, F(ab')₂ 또는 scFv 단편)만을 포함할 수도 있고, 기능성에 영향을 미치도록, 예를 들어, 잔여 효과기 기능을 제거하기 위해 변형될 수도 있다 (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164:1925-1933).

본 발명의 예시적인 LEPR 안타고니스트 항체는 본원에서 표 1 및 2에 나열된다. 표 1은 예시적인 LEPR 안타고니스트 항체의 중쇄 가변 영역 (HCVR), 경쇄 가변 영역 (LCVR), 중쇄 상보성 결정 영역 (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 및 경쇄 상보성 결정 영역 (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 표 2는 예시적인 LEPR 안타고니스트 항체의 HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 핵산 서열 식별자를 제시한다.

본 발명은 표 1에 나열된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그것에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는, LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 그것에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는, LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 것과 쌍을 형성하는 표 1에 나열된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 것을 포함하는 HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 쌍 (HCVR/LCVR)을 포함하는, LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 구체예에 따르면, 본 발명은 표 1에 나열된 예시적인 항-LEPR 항체 중 어느 것 내에 함유된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 구체예에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열 번호: 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/10, 66/10, 및 74/82로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 HCDR1 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 (HCDR1)을 포함하는, LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 HCDR2 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 (HCDR2)를 포함하는, LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 (HCDR3)을 포함하는, LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 LCDR1 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 (LCDR1)을 포함하는, LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 LCDR2 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 (LCDR2)를 포함하는, LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 (LCDR3)을 포함하는, LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 것과 쌍을 형성하는 표 1에 나열된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 것을 포함하는 HCDR3 및 LCDR3 아미노산 서열 쌍 (HCDR3/LCDR3)을 포함하는, LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 구체예에 따르면, 본 발명은 표 1에 나열된 예시적인 항-LEPR 항체 중 어느 것 내에 함유된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 구체예에서, HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍은 서열 번호: 8/16, 24/16, 32/16, 40/16, 48/16, 56/16, 64/16, 72/16, 80/16 및 80/88로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 예시적인 항-LEPR 항체 중 어느 것 내에 함유된 여섯 개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)를 포함하는, LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다. 특정 구체예에서, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열 세트는 서열 번호: 4, 6, 8, 12, 14, 16; 20, 22, 24, 12, 14, 16; 28, 30, 32, 12, 14, 16; 36, 38, 40, 12, 14, 16; 52, 54, 56, 12, 14, 16; 60, 62, 64, 12, 14, 16; 68, 70, 72, 12, 14, 16; 및 76, 78, 80, 84, 86, 88로 이루어진 군으로부터 선택된다.

관련 구체예에서, 본 발명은 표 1에 나열된 예시적인 항-LEPR 항체 중 어느 것에 의해 한정된 바와 같이 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 여섯 개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3)를 포함하는, LEPR에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 서열 번호: 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/10, 66/10, 및 74/82로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍 내에 함유된 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열 세트를 포함하는, LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함한다. HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내에서 CDR을 확인하기 위한 방법 및 기술은 해당 분야에 널리 알려져 있고 본원에 개시되어 있는 명시된 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내에서 CDR을 확인하는데 사용될 수 있다. CDR의 경계를 확인하는데 사용될 수 있는 예시적인 관례는, 예를 들어, Kabat 정의, Chothia 정의, 및 AbM 정의를 포함한다. 일반적인 표현으로, Kabat 정의는 서열 가변성을 기반으로 하고, Chothia 정의는 구조적 루프 영역의 위치를 기반으로 하며, AbM 정의는 Kabat 및 Chothia 접근법 사이의 절충안이다. 예를 들어, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol . Biol . 273:927-948 (1997); 및 Martin et al., Proc . Natl. Acad . Sci . USA 86:9268-9272 (1989) 참조. 공용 데이터베이스가 또한 항체 내에서 CDR 서열을 확인하는데 이용 가능하다.

본 발명은 또한 항-LEPR 항체 또는 그 일부를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 표 1에 나열된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구체예에서, 핵산 분자는 표 2에서 나열된 HCVR 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구체예에서 핵산 분자는 표 2에서 나열된 LCVR 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 HCDR1 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구체예에서 핵산 분자는 표 2에서 나열된 HCVR1 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 HCDR2 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구체예에서 핵산 분자는 표 2에서 나열된 HCVR2 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구체예에서 핵산 분자는 표 2에서 나열된 HCVR3 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 LCDR1 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구체예에서 핵산 분자는 표 2에서 나열된 LCDR1 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 LCDR2 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구체예에서 핵산 분자는 표 2에서 나열된 LCDR2 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 표 1에 나열된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구체예에서 핵산 분자는 표 2에서 나열된 LCDR3 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 HCVR을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, HCVR은 세 개의 CDR의 세트 (즉, HCDR1, HCDR2, HCDR3)를 포함하고, HCDR1, HCDR2, HCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 나열된 예시적인 항-LEPR 항체 중 어느 것에 의해 한정된 바와 같다.

본 발명은 또한 LCVR을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, LCVR은 세 개의 CDR의 세트 (즉, LCDR1, LCDR2, LCDR3)를 포함하고, LCDR1, LCDR2, LCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 나열된 예시적인 항-LEPR 항체 중 어느 것에 의해 한정된 바와 같다.

본 발명은 또한 HCVR 및 LCVR 둘 다를 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, HCVR은 표 1에 나열된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 표 1에 나열된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 것의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 핵산 분자는 표 2에 나열된 HCVR 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열, 및 표 2에 나열된 LCVR 핵산 서열 중 어느 것으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 그것에 대하여 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 실질적으로 유사한 서열을 포함한다. 본 발명의 이 양태에 따르는 특정 구체예에서, 핵산 분자는 HCVR 및 LCVR을 암호화하며, HCVR 및 LCVR은 둘 다 표 1에 나열된 동일한 항-LEPR 항체로부터 유래된다.

본 발명은 또한 항-LEPR 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 상기 언급된 핵산 분자 중 어느 것, 즉, 표 1에서 제시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 서열 중 어느 것을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 또한 이러한 벡터가 도입되는 숙주 세포, 뿐만 아니라 항체 또는 항체 단편의 생산을 허용하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 그 일부를 생산하고, 그렇게 생산된 항체 및 항체 단편을 회수하는 방법이 본 발명의 범위 내에 포함된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 LEPR에 특이적으로 결합하는 재조합 인간 항체 또는 이것의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 생산한다. 관련된 양태에서, 본 발명은 항-LEPR 항체 및 제2 치료제의 조합인 조성물을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 제2 치료제는 항-LEPR 항체와 유리하게 조합되는 임의의 작용제이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항-LEPR 항체 또는 항체의 항원-결합 부분을 사용하여 LEPR 신호 전달을 하향 조절하거나 폐지하기 위한 치료적 방법을 제공한다. 본 발명의 이 양태에 따르는 치료적 방법은 필요로 하는 대상체에게 본 발명의 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 치료되는 장애는 LEPR 신호 전달을 하향 조절하거나 폐지함으로써, 또는 렙틴의 활성을 차단함으로써 개선되거나, 호전되거나, 억제되거나 또는 예방되는 임의의 질환 또는 병태이다.

다른 구체예는 다음 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.

도 1은 30 mg/kg의 항-LEPR 항체 H4H17322P2, H4H18457P2, 또는 H4H18464, 또는 동위원소 대조군 항체로 처리된 마우스의 음식 섭취의 퍼센트 변화를 나타낸다.
도 2는 30 mg/kg의 항-LEPR 항체 H4H17322P2, H4H18457P2, 또는 H4H18464, 또는 동위원소 대조군 항체로 처리된 마우스의 체중의 평균 퍼센트 변화를 나타낸다.
도 3은 30 mg/kg의 항-LEPR 항체 H4H17322P2, H4H18457P2, 또는 H4H18464, 또는 동위원소 대조군 항체로 처리된 마우스의 평균 지방량을 나타낸다.

본 발명이 기술되기 전에, 본 발명은 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 제한되지 않으며, 이러한 방법 및 조건은 달라질 수도 있다는 것을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 기술하기 위한 목적을 위한 것이며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되기 때문에, 제한하려는 의도가 없음을 이해해야 한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은, 특정한 나열된 수치에 관하여 사용될 때, 그 값이 나열된 값과 1% 이하만큼 다를 수도 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "약 100"은 99와 101 및 그 사이의 모든 값 (예를 들어, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 등)을 포함한다.

본원에서 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료는 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 기술된다. 이 명세서에서 언급된 모든 특허, 출원, 및 비-특허 간행물은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

정의

표현 "렙틴 수용체", "LEPR", 등은, 본원에서 사용된 바와 같이, 서열 번호: 89 (또한 UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. P48357 참조)에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 인간 렙틴 수용체를 말한다. 과학 문헌에 사용된 LEPR에 대한 대체 명칭은 "OB 수용체", "OB-R", 및 "CD295"를 포함한다. LEPR은 "WSX"라고도 불린다 (예를 들어, 미국 특허 번호 7,524,937 참조). 표현 "LEPR"은 모노머 및 멀티머 (예를 들어, 다이머) LEPR 분자 모두를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "모노머 인간 LEPR"은 임의의 멀티머화 도메인을 함유 또는 소유하지 않고 정상 조건 하에서 또 다른 LEPR 분자와의 직접적인 물리적 연결이 없는 단일 LEPR 분자로서 존재하는 LEPR 단백질 또는 그 일부를 의미한다. 예시적인 모노머 LEPR 분자는 서열 번호:90의 아미노산 서열을 포함하는, 본원에서 "hLEPR.mmh"라고 불리는 분자이다 (예를 들어, 본원의 실시예 3 참조). 본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "다이머 인간 LEPR"은 링커, 공유 결합, 비-공유 결합을 통해, 또는 멀티머화 도메인, 예컨대 항체 Fc 도메인을 통해 서로 연결된 두 개의 LEPR 분자를 포함하는 구조체를 의미한다. 예시적인 다이머 LEPR 분자는 서열 번호:91의 아미노산 서열을 포함하는, 본원에서 "hLEPR.mFc"라고 불리는 분자 (예를 들어, 본원의 실시예 3 참조), 또는 서열 번호:92의 아미노산 서열을 포함하는, 본원에서 "hLEPR.hFc"라고 불리는 분자이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "항-LEPR 항체", "LEPR에 특이적으로 결합하는 항체", "LEPR-특이적 결합 단백질", 등과 같은 표현은, 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 전장 인간 LEPR, 모노머 인간 LEPR, 다이머 인간 LEPR, 또는 LEPR 세포외 도메인을 포함하거나 또는 이것으로 이루어진 다른 구조체에 결합하는 분자를 말한다.

본원에서 단백질, 폴리펩타이드 및 단백질 단편에 대한 모든 지시대상은, 비-인간 종으로부터 유래된 것으로 명확하게 명시되지 않는 한, 각각의 단백질, 폴리펩타이드 또는 단백질 단편의 인간 버전을 나타내려는 것이다. 따라서, 표현 "LEPR"은, 비-인간 종, 예를 들어, "마우스 LEPR", "원숭이 LEPR", 등으로부터 유래된 것으로 명시되지 않는 한, 인간 LEPR을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "세포 표면-발현된 LEPR"은 LEPR 단백질의 적어도 일부가 세포 막의 세포외 측면에 노출되어 항체의 항원-결합 부분에 접근 가능하도록 시험관 내 또는 생체 내에서 세포의 표면 상에서 발현되는 하나 이상의 LEPR 단백질(들), 또는 이것의 세포외 도메인을 의미한다. "세포 표면-발현된 LEPR"은 정상적으로 (예를 들어, 고유한 또는 야생형 상태에서) LEPR 단백질을 발현하는 세포의 표면 상에서 발현된 LEPR 단백질을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 대안으로, "세포 표면-발현된 LEPR"은 보통 표면 상에서 인간 LEPR을 발현하지 않지만 표면 상에서 LEPR을 발현하도록 인공적으로 조작된 세포의 표면 상에서 발현되는 LEPR 단백질을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "항-LEPR 항체", 또는 "인간 렙틴 수용체에 결합하는 항체"와 같은 표현은 단일 특이성을 가진 1가 항체, 뿐만 아니라 LEPR에 결합하는 제1 아암 및 제2 (표적) 항원에 결합하는 제2 아암을 포함하는 이중특이적 항체 모두를 포함하며, 항-LEPR 아암은 본원의 표 1에서 제시된 HCVR/LCVR 또는 CDR 서열 중 어느 것을 포함한다.

용어 "항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 특정 항원 (예를 들어, LEPR)에 특이적으로 결합하거나 이것과 상호작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는 네 개의 폴리펩타이드 사슬, 이황화 결합에 의해 서로 연결된 두 개의 중쇄 (H) 및 두 개의 경쇄 (L)를 포함하는 면역글로불린 분자, 뿐만 아니라 이것의 멀티머 (예를 들어, IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 V_H로 축약됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, C_H1, C_H2 및 C_H3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 V_L로 축약됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 (C_L1)을 포함한다. V_H 및 V_L 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라고 불리는, 더 보존되는 영역이 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 불리는 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 상이한 구체예에서, 항-LEPR 항체 (또는 이것의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식계열 서열과 동일할 수 있거나, 또는 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 둘 이상의 CDR의 사이드-바이-사이드(side-by-side) 분석에 기초하여 정의될 수 있다.

용어 "항체"는 또한, 본원에서 사용된 바와 같이, 전체 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편", 등은, 본원에서 사용된 바와 같이, 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생한, 효소에 의해 획득 가능한, 합성, 또는 유전적으로 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은 임의의 적합한 표준 기술, 예컨대 단백질 가수분해 또는 항체 가변 도메인 및 선택적으로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 수반하는 재조합 유전자 조작 기술을 사용하여, 예를 들어, 전체 항체 분자로부터 유래될 수도 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고 및/또는 예를 들어, 상업적 공급원, DNA 라이브러리 (예를 들어, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 쉽게 이용 가능하거나, 또는 합성될 수 있다. DNA는, 예를 들어, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 구성형태로 배열하거나, 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성하거나, 아미노산을 변형시키거나, 추가하거나 또는 결실시키는 것, 등을 위해 시퀀싱되고 화학적으로 또는 분자 생물학적 기술을 사용하여 조작될 수도 있다.

항원-결합 단편의 비-제한적 예는 (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일 사슬 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역 (예를 들어, 단리된 상보성 결정 영역 (CDR), 예컨대 CDR3 펩타이드), 또는 제한된 FR3-CDR3-FR4 펩타이드를 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 유닛을 포함한다. 다른 조작된 분자, 예컨대 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실된 항체, 키메라 항체, CDR-이식된 항체, 디아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디 (예를 들어, 1가 나노바디, 2가 나노바디, 등), 소형 모듈 면역 약제 (SMIP), 및 상어 가변 IgNAR 도메인이 또한 본원에서 사용된 바와 같이 표현 "항원-결합 단편" 내에 포함된다.

항체의 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 가변 도메인은 임의의 크기일 수도 있거나 또는 아미노산 조성물은 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 이것들의 프레임 내에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. V_L 도메인과 회합된 V_H 도메인을 가진 항원-결합 단편에서, V_H 및 V_L 도메인은 서로에 관하여 임의의 적합한 배열로 위치할 수도 있다. 예를 들어, 가변 영역은 다이머일 수도 있고 V_H-V_H, V_H-V_L 또는 V_L-V_L 다이머를 함유할 수도 있다. 대안으로, 항체의 항원-결합 단편은 모노머 V_H 또는 V_L 도메인을 함유할 수도 있다.

특정 구체예에서, 항체의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 결합된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수도 있다. 본 발명의 항체의 항원-결합 단편 내에서 발견될 수도 있는 가변 및 불변 도메인의 비-제한적이고, 예시적인 구성형태는 다음을 포함한다: (i) V_H-C_H1; (ii) V_H-C_H2; (iii) V_H-C_H3; (iv) V_H-C_H1-C_H2; (v) V_H-C_H1-C_H2-C_H3; (vi) V_H-C_H2-C_H3; (vii) V_H-C_L; (viii) V_L-C_H1; (ix) V_L-C_H2; (x) V_L-C_H3; (xi) V_L-C_H1-C_H2; (xii) V_L-C_H1-C_H2-C_H3; (xiii) V_L-C_H2-C_H3; 및 (xiv) V_L-C_L. 상기 나열된 예시적인 구성형태 중 어느 것을 포함하는, 가변 및 불변 도메인의 임의의 구성형태에서, 가변 및 불변 도메인은 서로 직접적으로 결합될 수도 있거나 또는 전체적 또는 부분적 힌지 또는 링커 영역에 의해 결합될 수도 있다. 힌지 영역은 적어도 2개 (예를 들어, 5, 10, 15, 20, 40, 60개 이상)의 아미노산으로 이루어질 수 있으며, 이것은 단일 폴리펩타이드 분자에서 인접한 가변 도메인 및/또는 불변 도메인 사이에서 플렉시블(flexible) 또는 세미-플렉시블(semi-flexible) 결합을 발생시킨다. 또한, 본 발명의 항체의 항원-결합 단편은 서로 및/또는 하나 이상의 모노머 V_H 또는 V_L 도메인과의 비-공유 회합 (예를 들어, 이황화 결합(들)에 의해)에서 상기 나열된 가변 및 불변 도메인 구성형태 중 어느 것의 호모다이머 또는 헤테로다이머 (또는 다른 멀티머)를 포함할 수도 있다.

전체 항체 분자와 같이, 항원-결합 단편은 단일특이적 또는 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적)일 수도 있다. 항체의 다중특이적 항원-결합 단편은 전형적으로 적어도 두 개의 상이한 가변 도메인을 포함할 것이며, 각각의 가변 도메인은 별도의 항원에 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에서 개시된 예시적인 이중특이적 항체 포맷을 포함한 임의의 다중특이적 항체 포맷은 해당 분야에서 이용 가능한 일상적인 기술을 사용하여 본 발명의 항체의 항원-결합 단편과 관련된 사용을 위해 조정될 수도 있다.

본 발명의 특정 구체예에서, 본 발명의 항-LEPR 항체는 인간 항체이다. 용어 "인간 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 가진 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들어, CDR에서, 특히 CDR3에서, 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기 (시험관 내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수도 있다. 하지만, 용어 "인간 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 또 다른 포유류 종, 예컨대 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되는 것은 아니다.

본 발명의 항체는, 일부 구체예에서는, 재조합 인간 항체일 수도 있다. 용어 "재조합 인간 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 모든 인간 항체, 예컨대 숙주 세포로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현되는 항체 (하기 더 기술됨), 재조합, 조합성 인간 항체 라이브러리로부터 단리되는 항체 (하기 더 기술됨), 인간 면역글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 단리되는 항체 (예를 들어, Taylor et al. (1992) Nucl . Acids Res. 20:6287-6295 참조) 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열의 다른 DNA 서열로의 스플라이싱(splicing)을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 하지만, 특정 구체예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이 유발 (또는 인간 Ig 서열에 대한 트랜스제닉 동물이 사용될 때에는, 생체 내 체세포 돌연변이 유발)되고 따라서 재조합 항체의 V_H 및 V_L 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 V_H 및 V_L 서열로부터 유래되고 이것들과 관련이 있지만, 생체 내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수도 있는 서열이다.

본 발명은 힌지, C_H2 또는 C_H3 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 가진 항체를 포함하며, 이것들은, 예를 들어, 생산시, 원하는 항체 형태의 수율을 개선하기 위해 바람직할 수도 있다.

본 발명의 항체는 단리된 항체일 수도 있다. "단리된 항체"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 자연 발생적 환경의 적어도 하나의 구성요소로부터 확인되고 분리 및/또는 회수된 항체를 의미한다. 예를 들어, 유기체의 적어도 하나의 구성요소로부터, 또는 항체가 자연적으로 존재하거나 자연적으로 생산되는 조직 또는 세포로부터 분리되거나 제거된 항체가 본 발명의 목적을 위한 "단리된 항체"이다. 단리된 항체는 또한 재조합 세포 내 제자리에서(in situ) 항체를 포함한다. 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 거친 항체이다. 특정 구체예에 따르면, 단리된 항체는 다른 세포 재료 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수도 있다.

본 발명은 항체가 유래되는 상응하는 생식계열 서열과 비교하여 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 및/또는 CDR 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는, 본원에서 개시된 항-LEPR 항체의 변이체를 포함한다. 이러한 돌연변이는 본원에서 개시된 아미노산 서열을, 예를 들어, 공용 항체 서열 데이터베이스로부터 이용 가능한 생식계열 서열과 비교함으로써 쉽게 확인될 수 있다. 본 발명은 본원에서 개시된 아미노산 서열 중 어느 것으로부터 유래된 항체, 및 이것의 항원-결합 단편을 포함하며, 하나 이상의 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에서 하나 이상의 아미노산은 항체가 유래된 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 또 다른 인간 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로, 또는 상응하는 생식계열 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이된다 (이러한 서열 변화는 본원에서 일괄적으로 "생식계열 돌연변이"라고 불림). 당업자는, 본원에서 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열로 시작하여, 하나 이상의 개개의 생식계열 돌연변이 또는 이것들의 조합을 포함하는 많은 항체 및 항원-결합 단편을 쉽게 생산할 수 있다. 특정 구체예에서, V_H 및/또는 V_L 도메인 내에서 모든 프레임워크 및/또는 CDR 잔기는 항체가 유래된 원래의 생식계열 서열에서 발견되는 잔기로 역돌연변이된다. 다른 구체예에서는, 특정한 잔기 만이, 예를 들어, FR1의 처음 8개의 아미노산 내에서 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 발견된 돌연변이된 잔기, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내에서 발견된 돌연변이된 잔기 만이 원래의 생식계열 서열로 역돌연변이된다. 다른 구체예에서, 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상은 상이한 생식계열 서열 (즉, 원래 항체가 유래된 생식계열 서열과는 상이한 생식계열 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이된다. 또한, 본 발명의 항체는 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내에서 둘 이상의 생식계열 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수도 있는데, 예를 들어, 특정한 개개의 잔기가 특정한 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이되는 한편, 원래의 생식계열 서열과 상이한 특정한 다른 잔기가 유지되거나 또는 상이한 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이된다. 획득되면, 하나 이상의 생식계열 돌연변이를 함유하는 항체 및 항원-결합 단편은 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 개선된 또는 향상된 길항적 또는 작용적 생물학적 성질 (경우에 따라), 감소된 면역원성, 등과 같은 하나 이상의 원하는 성질에 대하여 쉽게 테스트될 수도 있다. 이러한 일반적인 방식으로 획득된 항체 및 항원-결합 단편은 본 발명 내에 포함된다.

본 발명은 또한 하나 이상의 보존적 치환을 가진 본원에서 개시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 것의 변이체를 포함하는 항-LEPR 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본원의 표 1에서 제시된 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 것에 관하여, 예를 들어, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하, 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열을 가진 항-LEPR 항체를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 본원의 표 1에서 제시된 서열에 관하여 변이체 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 포함하는 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 포함하는) 항-LEPR 항체를 포함하며, 그럼에도 이러한 변이체 항체는 본원에서 개시된 예시적인 항-LEPR 항체의 하나 이상의 기능 및/또는 성질을 나타낸다.

용어 "에피토프"는 파라토프로 알려져 있는 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호작용하는 항원 결정요인을 말한다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수도 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원 상의 상이한 구역에 결합할 수 있고 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 입체구조적이거나 선형일 수도 있다. 입체구조적 에피토프는 선형 폴리펩타이드의 상이한 세그먼트로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생산된다. 선형 에피토프는 폴리펩타이드 사슬에서 인접한 아미노산 잔기에 의해 생산된 것이다. 특정한 상황에서, 에피토프는 항원 상의 당류, 포스포릴 기, 또는 설포닐 기의 모이어티를 포함할 수도 있다.

본 발명은 본원에서 개시된 예시적인 항-LEPR 항체 중 어느 것에서 발견되는 하나 이상의 가변 도메인 또는 CDR 아미노산 서열과 실질적으로 유사하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-LEPR 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 포함한다.

폴리펩타이드에 적용된 바와 같이, 용어 "실질적 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은 두 개의 펩타이드 서열이, 예컨대 기본 갭 중량(default gap weight)을 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때, 적어도 95% 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유한다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환마다 다르다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 (R 기)를 가진 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 둘 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, 치환의 보존적 성질을 교정하기 위해 퍼센트 서열 동일성 또는 유사성의 정도가 상향 조정될 수도 있다. 이러한 조정 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, Pearson (1994) Methods Mol . Biol . 24: 307-331 참조 (본원에 참조로 포함됨). 유사한 화학적 성질을 가진 측쇄를 가진 아미노산의 군의 예는 (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드-함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르테이트 및 글루타메이트, 및 (7) 황-함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 기는 발린-류신-아이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트, 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안으로, 보존적 대체는 Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445 (본원에 참조로 포함됨)에 개시된 PAM250 로그-우도 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "적당히 보존적인" 대체는 PAM250 로그-우도 매트릭스에서 비음의 값을 갖는 임의의 변화이다.

서열 동일성이라고도 불리는, 폴리펩타이드에 대한 서열 유사성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함한 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 할당된 유사성의 측정값을 사용하여 유사한 서열을 매치시킨다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는 밀접하게 관련된 폴리펩타이드, 예컨대 상이한 종의 유기체의 상동성 폴리펩타이드 사이에서 또는 야생형 단백질 및 이것의 돌연변이 단백질(mutein) 사이에서 서열 상동성 또는 서열 동일성을 결정하기 위해 기본 파라미터와 함께 사용될 수 있는 Gap 및 Bestfit과 같은 프로그램을 함유한다. 예를 들어, GCG 버전 6.1 참조. 폴리펩타이드 서열은 또한 GCG 버전 6.1의 프로그램인, 기본 또는 권장 파라미터를 사용하는 FASTA를 사용하여 비교될 수 있다. FASTA (예를 들어, FASTA2 및 FASTA3)는 의문 및 검색 서열 간의 최선의 중첩 영역의 정렬 및 퍼센트 서열 동일성을 제공한다 (Pearson (2000) supra). 본 발명의 서열을 상이한 유기체의 다수의 서열을 함유하는 데이터베이스와 비교할 때 또 다른 바람직한 알고리즘은 기본 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들어, Altschul et al. (1990) J. Mol . Biol . 215:403-410 및 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402 참조 (각각 전문이 참조로 포함됨).

Fc 변이체를 포함하는 항- LEPR 항체

본 발명의 특정 구체예에 따르면, 예를 들어, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 FcRn 수용체로의 항체 결합을 향상시키거나 약화시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-LEPR 항체가 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 Fc 도메인의 C_H2 또는 C_H3 영역에서 돌연변이를 포함하는 항-LEPR 항체를 포함하며, 돌연변이(들)는 산성 환경에서 (예를 들어, pH가 약 5.5 내지 약 6.0의 범위에 있는 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 돌연변이는 동물에게 투여될 때 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수도 있다. 이러한 Fc 변형의 비-제한적 예는, 예를 들어, 위치 250 (예를 들어, E 또는 Q); 250 및 428 (예를 들어, L 또는 F); 252 (예를 들어, L/Y/F/W 또는 T), 254 (예를 들어, S 또는 T), 및 256 (예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 위치 428 및/또는 433 (예를 들어, H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434 (예를 들어, H/F 또는 Y)에서의 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308 (예를 들어, 308F, V308F), 및 434에서의 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 변형은 428L (예를 들어, M428L) 및 434S (예를 들어, N434S) 변형; 428L, 259I (예를 들어, V259I), 및 308F (예를 들어, V308F) 변형; 433K (예를 들어, H433K) 및 434 (예를 들어, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256 (예를 들어, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형 (예를 들어, T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형 (예를 들어, 308F 또는 308P)을 포함한다.

예를 들어, 본 발명은 250Q 및 248L (예를 들어, T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E (예를 들어, M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S (예를 들어, M428L 및 N434S); 및 433K 및 434F (예를 들어, H433K 및 N434F)로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이의 하나 이상의 쌍 또는 군을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-LEPR 항체를 포함한다. 상기 언급된 Fc 도메인 돌연변이와 본원에서 개시된 항체 가변 도메인 내 다른 돌연변이의 모든 가능한 조합은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

본 발명의 항-LEPR 항체는 효과기 기능이 감소된 변형된 Fc 도메인을 포함할 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "효과기 기능이 감소된 변형된 Fc 도메인"은 변형된 Fc를 포함하는 분자가 Fc 부분의 야생형, 자연 발생 버전을 포함하는 비교기 분자에 관하여 세포 살해 (예를 들어, ADCC 및/또는 CDC), 보체 활성화, 식세포 작용(phagocytosis) 및 옵소닌화로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효과의 심각도 또는 정도의 감소를 나타내도록, 야생형, 자연 발생한 Fc 도메인에 관하여, 변형, 돌연변이, 절단, 등이 된 면역글로불린의 임의의 Fc 부분을 의미한다. 특정 구체예에서, "효과기 기능이 감소된 변형된 Fc 도메인"은 Fc 수용체 (예를 들어, FcγR)로의 결합이 감소되거나 또는 약화된 Fc 도메인이다.

본 발명의 특정 구체예에서, 변형된 Fc 도메인은 힌지 영역에서 치환을 포함하는 변이체 IgG1 Fc 또는 변이체 IgG4 Fc이다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서 사용을 위한 변형된 Fc는 IgG1 Fc 힌지 영역의 적어도 하나의 아미노산이 IgG2 Fc 힌지 영역의 상응하는 아미노산과 대체된 변이체 IgG1 Fc를 포함할 수도 있다. 대안으로, 본 발명의 맥락에서 사용을 위한 변형된 Fc는 IgG4 Fc 힌지 영역의 적어도 하나의 아미노산이 IgG2 Fc 힌지 영역의 상응하는 아미노산으로 대체된 변이체 IgG4 Fc를 포함할 수도 있다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 비-제한적, 예시적인 변형된 Fc 영역은 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0243504 (개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 제시되며, 뿐만 아니라 변형된 Fc 영역의 임의의 기능적으로 동등한 변이체가 그 안에 제시되어 있다.

본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 다른 변형된 Fc 도메인 및 Fc 변형은 US 2014/0171623; US 8,697,396; US 2014/0134162; WO 2014/043361 (그 개시물은 본원에 참조로 포함됨)에서 제시된 변형들 중 임의의 것을 포함한다. 본원에서 기술된 바와 같이 변형된 Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 다른 항원-결합 융합 단백질을 구성하는 방법은 해당 분야에 공지되어 있다.

항체의 생물학적 특성

본 발명은 인간 LEPR에 결합하여 LEPR 신호 전달을 길항하는 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 포함한다. 이러한 항체는 본원에서 "안타고니스트 항체"라고 불릴 수도 있다. 본 발명의 맥락에서, "LEPR 신호 전달의 안타고니스트"는 LEPR에 결합하여, 일반적으로 LEPR을 발현하는 세포에서 렙틴과 LEPR의 상호작용으로부터 발생하는 세포 내 효과를 억제하는 항체 또는 이것의 단편을 의미한다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 안타고니스트 항체는 LEPR 아고니스트의 기능, 및/또는 LEPR 부분적 아고니스트의 기능을 억제한다. 특정 구체예에서, "LEPR 신호 전달을 길항하는 것"은 STAT3의 렙틴-자극된 전사 활성화의 억제를 의미하며, 이것은 STAT3 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 측정하거나 확인할 수 있는 임의의 방법을 사용하여, 예를 들어, 리포터 세포주에서 발현된 STAT3의 표지된 버젼을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 실시예 6에서 기술된 세포-기반 리포터 검정, 또는 실질적으로 유사한 검정에서 LEPR 신호 전달을 하향 조절하는 안타고니스트 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 포함한다. 본 발명은 또한 실시예 6의 검정, 또는 실질적으로 유사한 검정에서 723pM 내지 1.8nM의 범위에 있는 IC₅₀ 값으로 렙틴 유도된 LEPR 신호 전달의 완전한 억제를 입증하는 안타고니스트 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원의 실시예 5에서 기술된 검정과 같이, LEPR을 발현하는 세포로의 항체 결합을 검출하는 세포-기반 결합 검정은 렙틴 없이 824- 내지 3187-배 및 1μM 렙틴의 존재 하에 398- 내지 3106-배의 결합 비율로 HEK293/hLEPR-GPI 세포에 대한 결합을 입증하였다. 본 발명의 항체는 1 μM에서 과도한 렙틴의 존재 하에서도 LEPR에 결합하는 것으로 발견되으며, 본 발명의 LEPR 항체는 렙틴 결합 부위와 중첩되지 않는 hLEPR 상의 부위에 결합한다는 것을 나타낸다. 본 발명은 또한 렙틴 신호 전달을 길항할 뿐만 아니라 렙틴 부재 하에 부분적 LEPR 신호 전달을 촉진하는 항-LEPR 항체를 포함한다; 이러한 항체는 본원에서 "부분적 아고니스트" 또는 "LEPR 신호 전달의 아고니즘을 억제하는 항체"라고도 불린다.

본 발명의 특정한 예시적 구체예에서, 렙틴의 존재 또는 부재 하에 인간 다이머 LEPR (hLEPR.hFc, 서열 번호:92)에 결합하는 항-LEPR 항체가 제공되며, 본 발명의 항체 중 어느 것도, 예를 들어, 본원의 실시예 4에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 LEPR:렙틴 상호작용의 40% 초과의 차단을 입증하지 못 했다.

본 발명은 높은 친화도로 모노머 인간 LEPR에 결합하는 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 모노머 인간 LEPR (예를 들어, hLEPR.mmh, 서열 번호:90)에 결합하는 항-LEPR 항체를 포함하며, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 약 10 nM 미만의 K_D, 또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 약 25 nM 미만의 K_D를 갖는다. 특정 구체예에 따르면, 모노머 인간 LEPR에 결합하는 항-LEPR 항체가 제공되며, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 12 nM 미만, 약 11 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 9 nM 미만, 약 8 nM 미만, 약 7 nM 미만, 약 6 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 900 pM 미만, 약 800 pM 미만, 약 700 pM 미만, 약 600 pM 미만, 약 500 pM 미만, 약 400 pM 미만, 약 300 pM 미만, 약 200 pM 미만 또는 약 100 pM 미만의 K_D를 갖는다.

본 발명은 또한 모노머 인간 LEPR (예를 들어, hLEPR.mmh, 서열 번호:90)에 결합하는 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 포함하며, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 5분 초과 또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 1분 초과의 해리성 반감기 (t½)를 갖는다. 특정 구체예에 따르면, 25℃에서 모노머 인간 LEPR에 결합하는 항-LEPR 항체가 제공되며, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 5분 초과, 약 10분 초과, 약 20분 초과, 약 40분 초과, 약 50분 초과 또는 그 이상의 t½을 갖는다.

본 발명은 또한 높은 친화도로 다이머 인간 LEPR (예를 들어, hLEPR.mFc, 서열 번호:91)에 결합하는 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 다이머 인간 LEPR (예를 들어, hLEPR.mFc, 서열 번호:91)에 결합하는 항-LEPR 항체를 포함하며, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 4 nM 미만의 K_D를 갖는다. 특정 구체예에 따르면, 다이머 인간 LEPR에 결합하는 항-LEPR 항체가 제공되며, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 25℃에서 약 15 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 9.0 nM 미만, 약 8.0 nM 미만, 약 7.0 nM 미만, 약 6.0 nM 미만, 약 5.0 nM 미만, 약 4.0 nM 미만, 약 3.0 nM 미만, 약 2.0 nM 미만, 약 1.0 nM 미만, 약 900 pM 미만, 약 800 pM 미만, 약 700 pM 미만, 약 600 pM 미만, 약 500 pM 미만, 약 400 pM 미만, 약 300 pM 미만, 약 200 pM 미만, 또는 약 100 pM 미만의 K_D를 갖는다.

본 발명은 또한 다이머 인간 LEPR (예를 들어, hLEPR.mFc, 서열 번호:91)에 결합하는 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 포함하며, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 25℃ 또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 10분 초과의 해리성 반감기 (t½)를 갖는다. 특정 구체예에 따르면, 다이머 인간 LEPR에 결합하는 항-LEPR 항체가 제공되며, 예를 들어, 본원의 실시예 3에서 정의된 검정 포맷, 또는 실질적으로 유사한 검정을 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이 약 15분 초과, 약 20분, 약 30분 초과, 약 40분 초과, 50분 초과, 약 60분 초과, 약 70분 초과, 80분 초과, 90분 초과, 100분 초과, 또는 그 이상의 t½을 갖는다.

본 발명은 또한 인간 렙틴과 복합체가 형성된 LEPR ("인간 렙틴과 복합체가 형성된 LEPR"은 표현 "렙틴:LEPR"로 표현될 수도 있다)에 결합하는 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 hLEPR 및 인간 렙틴을 포함하는 사전 형성된 복합체에 결합할 수 있는 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 포함한다. 즉, 특정 구체예에 따르면, 항-LEPR 항체와 LEPR 사이의 상호작용은 LEPR과 복합체가 형성된 렙틴의 존재에 의해 억제되지 않으며; 유사하게는, 렙틴 및 LEPR 사이의 상호작용은, 본 발명의 이 양태에 따르면, 항-LEPR 항체의 존재에 의해 억제되지 않는다. 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 인간 렙틴과 복합체가 형성된 LEPR에 결합하는지를 결정하기 위한 예시적인 검정 포맷은 본원의 실시예 4에서 제시된다.

본 발명은 또한 인간 렙틴의 존재 및/또는 부재 하에 세포 표면-발현된 LEPR에 결합하는 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 포함한다. 세포 표면-발현된 LEPR은 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 LEPR 분자에 결합할 수 있도록 자연적으로 또는 조작된 세포주에서 세포의 표면 상에서 발현되는 LEPR 또는 그 일부 (예를 들어, LEPR의 세포외 부분)를 의미한다. 특정 구체예에서, 세포 표면-발현된 LEPR은 태그 또는 앵커 (예를 들어, 본원의 실시예 6에서 예시된 GPI 앵커)를 통해 세포에 연결된 LEPRDML 세포외 도메인을 포함하는 재조합 복합체를 포함한다. 본 발명의 이 양태에 따르면, 렙틴의 부재 하에 세포 표면-발현된 LEPR에 결합할 수 있고, 또한 렙틴의 존재 하에 (즉, 렙틴이 세포 표면-발현된 LEPR에 결합할 수 있는 상황에서) 세포 표면-발현된 LEPR에 결합할 수 있는 항체가 제공된다. 즉, 특정 구체예에 따르면, 항-LEPR 항체와 세포 표면-발현된 LEPR 사이의 상호작용은 세포 표면-발현된 LEPR과 복합체가 형성된 렙틴의 존재에 의해 억제되지 않는다. 본 발명의 이 양태에 따르는 항체는 항체, 세포 표면-발현된 LEPR 및 렙틴을 포함하는 세포의 표면 상에서 3원 복합체를 형성할 수 있다. 항체 또는 이것의 항원-결합 단편이 인간 렙틴의 존재 및 부재 하에 세포 표면-발현된 LEPR에 결합할 수 있는지를 결정하기 위한 예시적인 검정 포맷이 본원의 실시예 5에서 제시된다.

본 발명의 항체는 상기 언급된 생물학적 특성들 중 하나 이상, 또는 이것들의 임의의 조합을 소유할 수도 있다. 본 발명의 항체의 생물학적 특성의 상기 언급된 목록은 완전한 것은 아니다. 본 발명의 항체의 다른 생물학적 특성은 본원의 작동예를 포함한, 본 개시물의 검토로부터 당업자에게 명백해질 것이다.

에피토프 맵핑 및 관련 기술

본 발명의 항체가 결합하는 에피토프는 LEPR 단백질의 3개 이상 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 및 그 이상)의 아미노산의 단일 인접한 서열로 이루어질 수도 있다. 대안으로, 에피토프는 LEPR의 복수의 비-인접한 아미노산 (또는 아미노산 서열)으로 이루어질 수도 있다. 일부 구체예에서, 에피토프는 LEPR의 렙틴-결합 도메인에 또는 그 근처에 위치한다. 다른 구체예에서, 에피토프는 LEPR의 렙틴-결합 도메인과 별개의 영역에, 예를 들어, 항체가 이러한 에피토프에 결합될 때, LEPR로의 렙틴 결합을 방해하지 않는 LEPRDML 표면 상의 위치에 위치한다.

당업자에게 공지된 다양한 기술은 항체에 의해 인식되는 에피토프 내에서 아미노산을 확인하는데 사용될 수 있다. 예시적인 기술은, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩타이드 블롯 분석, 및 펩타이드 분열 분석을 포함한다. 이에 더하여, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 이용될 수 있다 (Tomer (2000) Protein Science 9:487-496). 상체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내에서 아미노산을 확인하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분석법에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 일반적인 표현으로, 수소/중수소 교환 방법은 관심있는 단백질을 중수소-라벨링한 후 이어서, 중수소-라벨링된 단백질에 항체를 결합시키는 단계를 수반한다. 그 다음에, 단백질/항체 복합체는 물로 옮겨져서 항체에 의해 보호되는 잔기 (중수소-라벨링된 상태로 유지됨)를 제외하고 모든 잔기에서 수소-중수소 교환이 일어난다. 항체의 해리 후, 표적 단백질은 프로테아제 분열되고 질량 분석법으로 분석되어, 항체가 상호작용하는 특이적 아미노산에 상응하는 중수소-라벨링된 잔기를 나타낸다. 예를 들어, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem . 73:256A-265A 참조. 항원과 복합체가 형성된 항체의 X-선 결정학 분석이 또한 항체가 상호작용하는 폴리펩타이드 내에서 아미노산을 확인하는데 사용될 수도 있다.

본 발명은 본원에 기술된 특이적인 예시적 항체 중 임의의 것과 같은 에피토프에 결합하는 항-LEPR 항체 (예를 들어, 본원의 표 1에서 제시된 아미노산 서열 중 임의의 것을 포함하는 항체)를 더 포함한다. 유사하게, 본 발명은 또한 본원에 기술된 특이적인 예시적 항체 중 임의의 것과 LEPR로의 결합에 대하여 경쟁하는 항-LEPR 항체 (예를 들어, 본원의 표 1에서 제시된 아미노산 서열 중 임의의 것을 포함하는 항체)를 포함한다.

업계에 공지되어 있고 본원에서 예시된 일상적인 방법을 사용함으로써 참조 항-LEPR 항체와 같은 에피토프에 결합하는지, 또는 참조 항-LEPR 항체와 결합에 대하여 경쟁하는지를 결정할 수 있다. 예를 들어, 테스트 항체가 본 발명의 참조 항-LEPR 항체와 같은 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해서, 참조 항체를 LEPR 단백질에 결합시켰다. 그 다음에, LEPR 분자에 결합할 수 있는 테스트 항체의 능력이 평가된다. 테스트 항체가 참조 항-LEPR 항체와의 포화 결합 이후에 LEPR에 결합할 수 있으면, 테스트 항체는 참조 항-LEPR 항체보다 상이한 에피토프에 결합한다는 결론을 내릴 수 있다. 다른 한편으로, 테스트 항체가 참조 항-LEPR 항체와의 포화 결합 이후에 LEPR 분자에 결합할 수 없으면, 테스트 항체는 본 발명의 참조 항-LEPR 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 관찰된 테스트 항체 결합의 부족이 사실상 참조 항체와 동일한 에피토프로의 결합으로 인한 것인지 또는 입체적 차단 (또는 또 다른 현상)이 관찰된 결합의 부족의 원인인지를 확인하기 위해서 추가의 일상적인 실험 (예를 들어, 펩타이드 돌연변이 및 결합 분석)이 수행될 수 있다. 이런 종류의 실험은 ELISA, RIA, Biacore, 유동 세포 분석법 또는 해당 분야에서 이용 가능한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체-결합 검정을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에 따르면, 예를 들어, 한 항체의 1배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 초과량이 다른 것의 결합을 경쟁적 결합 검정에서 측정된 바와 같이 적어도 50%, 하지만 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어는 99%만큼 억제하면, 두 개의 항체는 동일한 (또는 중첩) 에피토프에 결합한다 (예를 들어, Junghans et al. (1990) Cancer Res. 50:1495-1502 참조). 대안으로, 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 항원에서 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 두 개의 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 한 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 아미노산 돌연변이의 서브세트만이 다른 것의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우 두 개의 항체는 "중첩 에피토프"를 갖는 것으로 간주된다.

항체가 참조 항-LEPR 항체와 결합에 대하여 경쟁하는지 (또는 결합에 대하여 교차-경쟁하는지)를 결정하기 위해서, 상기 기술된 결합 방법론은 두 가지 방향으로 수행된다: 첫 번째 방향으로, 참조 항체는 포화 조건 하에서 LEPR 단백질에 결합된 후 이어서 LEPR 분자로의 테스트 항체의 결합이 평가된다. 두 번째 방향으로, 테스트 항체는 포화 조건 하에서 LEPR 분자에 결합된 후 이어서 LEPR 분자로의 참조 항체의 결합이 평가된다. 두 방향 모두에서, 단지 첫 번째 (포화) 항체가 LEPR 분자에 결합할 수 있는 경우, 테스트 항체 및 참조 항체는 LEPRF로의 결합에 대하여 경쟁하는 것으로 결론 내려진다. 당업자에 의해 인정되는 바와 같이, 참조 항체와 결합에 대하여 경쟁하는 항체는 반드시 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합할 필요는 없지만, 중첩 또는 인접한 에피토프에 결합함으로써 참조 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수도 있다.

인간 항체의 제조

본 발명의 항-LEPR 항체는 완전한 인간 항체일 수 있다. 완전한 인간 단클론성 항체를 포함한 단클론성 항체를 생성하는 방법은 해당 분야에 공지되어 있다. 이러한 임의의 공지된 방법은 본 발명의 맥락에서 인간 LEPR에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 제조하는데 사용될 수 있다.

예를 들어, VELOCIMMUNE™ 기술, 또는 완전한 인간 단클론성 항체를 생성하기 위한 임의의 다른 유사한 공지된 방법을 사용하여, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 가진, LEPR에 대한 고 친화도 키메라 항체는 초기에 단리된다. 하기 실험 섹션에서와 같이, 항체는 특성화되고 친화도, 결합 차단 활성, 선택성, 에피토프, 등을 포함한 바람직한 특징에 대하여 선택된다. 필요한 경우, 마우스 불변 영역은 원하는 인간 불변 영역, 예를 들어 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4와 대체되어 완전한 인간 항-LEPR 항체를 생성한다. 선택된 불변 영역은 특이적인 용도에 따라 달라질 수도 있지만, 고 친화도 항원-결합 및 표적 특이성 특성은 가변 영역에 있다. 어떤 경우에는, 완전한 인간 항-LEPR 항체는 항원-양성 B 세포로부터 직접적으로 단리된다.

생물학적 동등물

본 발명의 항-LEPR 항체 및 항체 단편은 기술된 항체와 다른 아미노산 서열을 갖지만 인간 LEPR에 결합하는 능력을 보유한 단백질을 포함한다. 이러한 변이체 항체 및 항체 단편은 모체 서열과 비교할 때 아미노산의 하나 이상의 추가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 기술된 항체와 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 유사하게, 본 발명의 항-LEPR 항체-암호화 DNA 서열은 개시된 서열과 비교할 때 뉴클레오타이드의 하나 이상의 추가, 결실, 또는 치환을 포함하지만, 본 발명의 항-LEPR 항체 또는 항체 단편과 본질적으로 생물학적으로 동등한 항-LEPR 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함한다. 이러한 변이체 아미노산 및 DNA 서열의 예는 상기 논의된다.

두 개의 항원-결합 단백질, 또는 항체는, 예를 들어, 그것들이 약학적 동등물 또는 단일 용량이든 다회수 용량이든, 유사한 실험 조건 하에 동일한 몰 용량으로 투여될 때 흡수 속도 및 정도가 유의한 차이를 나타내지 않는 약학적 대안인 경우 생물학적으로 동등한 것으로 간주된다. 일부 항체는 그것들이 흡수 속도는 아니지만 흡수의 정도에서 동등한 경우 동등물 또는 약학적 대안으로 간주될 것이며 흡수 속도의 이러한 차이가 의도적이고 라벨링에 반영되고, 예를 들어, 만성 사용시 효과적인 체내 약물 농도의 달성에 필수적이지 않으며, 연구된 특정 약품에 대하여 의학적으로 유의하지 않은 것으로 간주되기 때문에 생물학적으로 동등한 것으로 간주될 수도 있다.

한 구체예에서, 두 개의 항원-결합 단백질은 안전성, 순도, 및 효능에 있어서 임상적으로 유의한 차이가 없는 경우 생물학적 동등물이다.

한 구체예에서, 두 개의 항원-결합 단백질은 환자가 참조 생성물과 생물학적 생성물 사이의 전환이 없는 지속적인 요법과 비교하여 면역원성의 임상적으로 유의한 변화, 또는 감소된 효과를 포함하는 부작용의 위험의 예상된 증가 없이 참조 생성물과 생물학적 생성물 사이에서 1회 이상 전환될 수 있으면 생물학적 동등물이다.

한 구체예에서, 두 개의 항원-결합 단백질은 그것들이 모두 사용 조건 또는 조건들에 대한 작용의 공통 메커니즘 또는 메커니즘들에 의해 이러한 메커니즘이 공지된 정도로 작용하는 경우 생물학적 동등물이다.

생물학적 동등성은 생체 내 및 시험관 내 방법에 의해 입증될 수 있다. 생물학적 동등성 측정은, 예를 들어, (a) 시간의 함수로서 혈액, 혈장, 혈청, 또는 생물학적 유동체에서 항체의 농도 또는 대사산물의 농도가 측정되는, 인간 또는 다른 포유동물에서의 생체 내 테스트; (b) 인간 생체 내 생물학적 이용 가능성 데이터와 연관성이 있고 이것을 합리적으로 예측하는 시험관 내 테스트; (c) 항체 (또는 그 표적)의 적절한 급성 약리학적 효과가 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유동물에서의 생체 내 테스트; 및 (d) 항체의 안전성, 효능, 또는 생물학적 이용 가능성 또는 생물학적 동등성을 입증하는 잘 제어된 임상 시험을 포함한다.

본 발명의 항-LEPR 항체의 생물학적으로 동등한 변이체는, 예를 들어, 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 제조하거나 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실시킴으로써 구성될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성에 필수적이지 않은 시스테인 잔기는 재생시 불필요하거나 부정확한 분자간 이황화 브릿지의 형성을 방지하기 위해 결실되거나 다른 아미노산으로 대체될 수 있다. 다른 맥락에서, 생물학적으로 동등한 항체는 항체의 글리코실화 특성을 변형시키는 아미노산 변화, 예를 들어, 글리코실화를 제거하거나 없애는 돌연변이를 포함하는 항-LEPR 항체 변이체를 포함할 수도 있다.

종 선택성 및 종 교차-반응성

본 발명은, 특정 구체예에 따르면, 인간 LEPR에 결합하지만 다른 종의 LEPR에 결합하지 않는 항-LEPR 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 인간 LEPR 및 하나 이상의 비-인간 종의 LEPR에 결합하는 항-LEPR 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항-LEPR 항체는 인간 LEPR에 결합할 수도 있고, 경우에 따라, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 져빌, 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 게먹이 원숭이, 마모셋, 붉은 털 원숭이 또는 침팬지 LEPR 중 하나 이상에 결합하거나 또는 결합하지 않을 수도 있다. 본 발명의 특정한 예시적인 구체예에 따르면, 인간 LEPR 및 게먹이 원숭이 (cynomolgus monkey, 예를 들어, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) LEPR에 특이적으로 결합하는 항-LEPR 항체가 제공된다. 본 발명의 다른 항-LEPR 항체는 인간 LEPR에 결합하지만, 게먹이 원숭이 LEPR에 결합하지 않거나, 약하게만 결합한다.

다중특이적 항체

본 발명의 항체는 단일특이적 또는 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적)일 수도 있다. 다중특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩타이드의 상이한 에피토프에 특이적일 수도 있거나 또는 하나 이상의 표적 폴리펩타이드에 특이적인 항원-결합 도메인을 함유할 수도 있다. 예를 들어, Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al. (2004) Trends Biotechnol. 22:238-244 참조. 본 발명의 항-LEPR 항체는 또 다른 기능적 분자, 예를 들어, 또 다른 펩타이드 또는 단백질에 결합되거나 동시-발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이것의 단편은 하나 이상의 다른 분자적 실체물, 예컨대 또 다른 항체 또는 항체 단편에 기능적으로 결합되어 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 회합 또는 다른 방법들에 의해) 제2의 결합 특이성을 가진 이중-특이적 또는 다중특이적 항체를 생산할 수 있다.

본 발명은 면역글로불린의 한 아암은 인간 LEPR에 결합하고, 면역글로불린의 다른 아암은 제2 항원에 특이적인 이중특이적 항체를 포함한다. LEPR-결합 아암은 본원의 표 1에서 제시된 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열 중 임의의 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적인 이중특이적 항체 포맷은 제1 면역글로불린 (Ig) C_H3 도메인 및 제2 Ig C_H3 도메인의 사용을 수반하며, 제1 및 제2 Ig C_H3 도메인은 서로 적어도 하나의 아미노산이 상이하고, 적어도 하나의 아미노산 차이는 아미노산 차이가 없는 이중-특이적 항체와 비교하여 단백질 A로의 이중특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 한 구체예에서, 제1 Ig C_H3 도메인은 단백질 A에 결합하고 제2 Ig C_H3 도메인은 H95R 변형 (IMGT 엑손 넘버링(numbering)에 의해; EU 넘버링에 의해서는 H435R)과 같은 단백질 a 결합을 감소시키거나 폐지하는 돌연변이를 함유한다. 제2 C_H3은 Y96F 변형 (IMGT에 의해; EU에 의해서는 Y436F)을 더 포함할 수도 있다. 제2 C_H3 내에서 발견될 수도 있는 추가의 변형은 다음을 포함한다: IgG1 항체의 경우에 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, 및 V82I (IMGT에 의해; EU에 의해서는 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 및 V422I); IgG2 항체의 경우에 N44S, K52N, 및 V82I (IMGT; EU에 의해서는 N384S, K392N, 및 V422I); 및 IgG4 항체의 경우에 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, 및 V82I (IMGT에 의해; EU에 의해서는 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, 및 V422I). 상기 기술된 이중특이적 항체 포맷에 대한 변화는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.

본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 다른 예시적인 이중특이적 포맷은, 제한 없이, 예를 들어, scFv-기반 또는 디아바디 이중특이적 포맷, IgG-scFv 융합체, 이중 가변 도메인 (DVD)-Ig, 콰드로마(Quadroma), 놉-인투-홀(knobs-into-holes), 공통 경쇄 (예를 들어, 놉-인투-홀, 등을 가진 공통 경쇄), CrossMab, CrossFab, (SEED)body, 류신 지퍼(zipper), 듀오바디, IgG1/IgG2, 이중 작용 Fab (DAF)-IgG, 및 Mab² 이중특이적 포맷 (상기 언급된 포맷의 검토를 위해서, 예를 들어, Klein et al. (2012) mAbs 4:6, 1-11 및 그 안에 나열된 참고문헌들 참조)을 포함한다. 이중특이적 항체는 또한 펩타이드/핵산 컨쥬게이션(conjugation)을 사용하여 구성될 수 있으며, 예를 들어, 직교 화학 반응성을 가진 비천연 아미노산은 한정된 조성, 원자가 및 기하학적 구조를 가진 멀티머 복합체로 자가-조립되는 부위-특이적 항체-올리고뉴클레오타이드 컨쥬게이트를 생성하는데 사용된다 (예를 들어, Kazane et al., J. Am. Chem . Soc. [Epub: Dec . 4, 2012] 참조).

치료적 제제 및 투여

본 발명은 본 발명의 항-LEPR 항체 또는 이것의 항원-결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 담체, 부형제, 및 개선된 수송, 전달, 내성, 등을 제공하는 다른 작용제로 제제화된다. 다수의 적절한 제제는 모든 약사에게 알려져 있는 의약품집에서 발견될 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. 이들 제제는, 예를 들어, 분말, 페이스트, 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질들, 소포 함유 지질 (양이온성 또는 음이온성) (예컨대 LIPOFECTIN™, Life Technologies, Carlsbad, CA), DNA 컨쥬게이트, 무수 흡수 페이스트, 수중유 및 유중수 에멀젼, 에멀젼 카보왁스 (다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고체 겔, 및 카보왁스 함유 반고체 혼합물을 포함한다. 또한 Powell et al. "Compendium of excipients for 비경구 formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311 참조.

환자에게 투여되는 항체의 용량은 환자의 나이 및 크기, 표적 질환, 병태, 투여 경로, 등에 따라 다를 수도 있다. 바람직한 용량은 전형적으로 체중 또는 체표면적에 따라 계산된다. 성인 환자에서, 본 발명의 항체를 보통 약 0.01 내지 약 20 mg/kg 체중, 더 바람직하게는 약 0.02 내지 약 7, 약 0.03 내지 약 5, 또는 약 0.05 내지 약 3 mg/kg 체중의 단일 용량으로 정맥내로 투여하는 것이 유리할 수도 있다. 병태의 심각도에 따라, 치료 반도 및 기간이 조정될 수 있다. 항-LEPR 항체를 투여하는데 유효한 투약량 및 일정은 경험적으로 결정될 수도 있다; 예를 들어, 환자 진행은 주기적인 평가에 의해 모니터링되고, 따라서 용량이 조정될 수 있다. 더욱이, 투약량의 종간 스케일링은 해당 분야에서 덜리 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, Mordenti et al. (1991) Pharmaceut . Res. 8:1351).

다양한 전달 시스템, 예를 들어, 리포솜 내 캡슐화, 미세입자, 마이크로캡슐, 돌연변이 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 세포 내 이입(endocytosis)이 공지되어 있고 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, Wu et al. (1987) J. Biol . Chem . 262:4429-4432 참조). 도입 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 및 경구 경로를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 조성물은 임의의 편리한 경로로, 예를 들어, 주입 또는 볼루스(bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 라이닝(lining) (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막, 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수도 있다. 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수도 있다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 이용하여 피하로 또는 정맥내로 전달될 수 있다. 이에 더하여, 피하 전달에 관해서, 펜 전달 디바이스가 본 발명의 약학적 조성물을 전달하는데 쉽게 적용된다. 이러한 펜 전달 디바이스는 재사용 가능하거나 1회용일 수 있다. 재사용 가능한 펜 전달 디바이스는 일반적으로 약학적 조성물을 함유하는 교체 가능한 카트리지를 활용한다. 카트리지 내 약학적 조성물 전부가 투여되어 카트리지가 비게 되면, 빈 카트리지는 쉽게 폐기되고 약학적 조성물을 함유하는 새로운 카트리지로 교체될 수 있다. 이어서 펜 전달 디바이스가 재사용될 수 있다. 1회용 펜 전달 디바이스에서는, 교체 가능한 카트리지가 없다. 대신에, 1회용 펜 전달 디바이스는 디바이스 내 레저버에 보유된 약학적 조성물로 미리 채워진다. 레저버에 약학적 조성물이 비게 되면, 전체 디바이스가 폐기된다.

많은 재사용 가능한 펜 및 자가주사기 전달 디바이스가 본 발명의 약학적 조성물의 피하 전달에 적용된다. 예는 몇 개만 언급하자면 AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ 펜 (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Switzerland), HUMALOG MIX 75/25™ 펜, HUMALOG™ 펜, HUMALIN 70/30™ 펜 (Eli Lilly and Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II 및 III (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Denmark), BD™ 펜 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™, 및 OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Germany)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물의 피하 전달에 적용되는 1회용 펜 전달 디바이스의 예는 몇 개만 언급하자면 SOLOSTAR™ 펜 (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), 및 KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICK™ Autoinjector (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Germany), EPIPEN (Dey, L.P.), 및 HUMIRA™ Pen (Abbott Labs, Abbott Park IL)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

어떤 상황에서도, 약학적 조성물은 제어된 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 한 구체예에서, 펌프가 사용될 수도 있다 (Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed . Eng . 14:201 참조). 또 다른 구체예에서, 폴리머 재료가 사용될 수 있다; Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.) (1974) CRC Pres ., Boca Raton, Florida 참조. 또 다른 구체예에서, 제어된 방출 시스템은 조성물의 표적에 근접하여 배치될 수 있으며, 따라서 전신 용량의 일부만이 필요하다 (예를 들어, Goodson (1984) in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 참조). 다른 제어된 방출 시스템은 Langer (1990) Science 249:1527-1533에 의한 검토에서 논의된다.

주사 가능 조제물은 정맥내, 피하, 피내 및 근육내 주사, 점적 주입, 등을 위한 투약 형태를 포함할 수도 있다. 이들 주사 가능 조제물은 공개적으로 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사 가능한 조제물은, 예를 들어, 주사에 통상적으로 사용되는 멸균 수성 배지 또는 유성 배지에서 상기 기술된 항체 또는 그 염을 용해시키거나, 현탁시키거나 또는 에멀젼화시킴으로써 제조될 수도 있다. 주사용 수성 배지로서, 예를 들어, 생리 식염수, 글루코스 및 다른 보제를 함유하는 등장성 용액이 존재하며, 이것들은 적절한 가용화제, 예컨대 알콜 (예를 들어, 에탄올), 폴리알콜 (예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제 [예를 들어, 폴리소르베이트 80, HCO-50 (수소 첨가 피마자 오일의 폴리옥시에틸렌 (50 mol) 부가물)], 등과 조합하여 사용될 수도 있다. 유성 배지로서, 예를 들어, 참깨 오일, 대두 오일 등이 이용되며, 이것들은 가용화제, 예컨대 벤질 벤조에이트, 벤질 알콜, 등과 조합하여 사용될 수도 있다. 이렇게 제조된 주사액은 바람직하게는 적절한 앰플에 채워진다.

유리하게는, 상기 기술된 경구 또는 비경구 사용을 위한 약학적 조성물은 활성 성분의 용량에 적합한 단위 용량의 투약 형태로 제조된다. 단위 용량의 이러한 투약 형태는, 예를 들어, 타블렛, 알약, 캡슐, 주사액 (앰플), 좌제, 등을 포함한다. 함유된 상기 언급된 항체의 양은 일반적으로 단위 용량의 투약 형태 당 약 5 내지 약 500 mg이고; 특히 주사의 형태에서, 상기 언급된 항체는 약 5 내지 약 100 mg으로 함유되고 다른 투약 형태에 대해서는 약 10 내지 약 250 mg으로 함유되는 것이 바람직하다.

항체의 치료적 사용

본 발명은 필요로 하는 대상체에게 안타고니스트 항-LEPR 항체 (예를 들어, 본원의 표 1에서 제시된 HCVR/LCVR 또는 CDR 서열 중 임의의 것을 포함하는 항-LEPR 항체)를 포함하는 치료적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 치료적 조성물은 본원에서 개시된 항-LEPR 항체, 또는 이것의 항원-결합 단편 중 임의의 것, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.

본 발명의 항체는, 그 중에서도, 상승된 렙틴 수준 (고렙틴혈증(hyperleptinemia)) 및/또는 과도한 LEPR 신호 전달을 일으키는 OB-R 렙틴 수용체의 상승된 발현과 관련이 있거나 이것에 의해 매개된 임의의 질환 또는 장애의 치료, 예방 및/또는 호전에 유용하다. 다양한 구체예에서, 질환 또는 장애는 거식증 또는 다른 정신의학적 식이 장애, 만성 신장 질환 악액질, 다른 악액질, 예컨대 울혈성 심부전 악액질, 폐 악액질, 방사선 악액질, 및 암 악액질, 자가면역 장애, 예컨대 염증성 장 질환, 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 건선, 심혈관 질환, 상승된 혈압, 우울증, 신경 퇴행성 장애, 암, 예컨대 간세포 암종, 흑색종 및 유방암으로부터 선택되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 정상 또는 높은 렙틴 수준을 발현하는 세포, 조직 및 장기에서 LEPR 신호 전달을 길항하는데 유용한 항-LEPR 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 렙틴의 존재 하에 향상된 신호 전달을 나타내는 LEPR 돌연변이 (야생형 LEPR과 비교하여)는 "신호 전달 향상된 LEPR 돌연변이"라고 불린다. 예시적인 신호 전달-향상된 LEPR 돌연변이는 LEPR-Q223R이다 (Chagnon et al. (2009) Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 85(1):29-34). 따라서, 본 발명은 향상된 신호 전달 LEPR 돌연변이에 의해 유발되거나 또는 이것과 관련된 질환 및 장애의 치료, 예방 및/또는 호전에 유용한 항-LEPR 항체 및 이것의 항원-결합 단편을 포함한다.

본원에서 기술된 치료 방법의 맥락에서, 항-LEPR 항체는 단일 요법으로서 (즉, 유일한 치료제로서) 또는 하나 이상의 추가적인 치료제 (이것의 예는 본원의 다른 곳에서 기술되어 있다)와 조합하여 투여될 수도 있다.

조합 요법 및 제제

본 발명은 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 구성요소와 조합된 본원에서 기술된 항-LEPR 항체 중 어느 것을 포함하는 조성물 및 치료적 제제, 및 필요로 하는 대상체에게 이러한 조합을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 포함한다.

본 발명의 항-LEPR 안타고니스트 항체는, 예를 들어, 울혈성 심부전 악액질, 폐 악액질 및 암 악액질, 자가면역 장애, 예컨대 염증성 장 질환, 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 건선, 심혈관 질환, 상승된 혈압, 신경 퇴행성 장애, 우울증, 암, 예컨대 간세포 암종, 흑색종, 유방암, 및 감소된 렙틴 신호 전달과 관련이 있거나 이것에 의해 유발된 다른 질환 및 장애의 치료를 위해 처방된 약제와 같은 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 구성요소(들)과 동시-제제화되고 및/또는 이것과 조합하여 투여될 수도 있다. 이러한 추가적인 치료적 활성 구성요소의 예는, 예를 들어, 안지오텐신-전환 효소 억제자 (예를 들어, ACE, ACE-I, 베나제프릴, 카프토프릴, 에날라프릴, 포시노프릴, 리시노프릴, 모엑시프릴, 페린도프릴, 퀴나프릴, 라마프릴, 트란돌라프릴), 안지오텐신 수용체 차단제 (예를 들어, ARB), 평활근 이완제 (예를 들어, 하이드랄라진), 장기간 작용성 나이트레이트 (예를 들어, ACE-I 및 ARB가 있거나 없는 아이소소르비드 다이나이트레이트), 이뇨제 (예를 들어, 루프 이뇨제, 티아지드-유사 이뇨제 및 칼륨-보전 이뇨제), 철분-결핍 빈혈증 치료 (예를 들어, 비경구 철), 장기간- 또는 단기간-작용성 기관지 확장제 (예를 들어, β2 아고니스트, 예컨대 아르포르모테롤, 부페닌, 클렌부테롤, 도펙사민, 에피네프린, 펜토테롤, 포르모테롤, 아이소에타린, 아이소프레날린, 아이소프로테레놀, 레보살부타몰, 오르시프레날린, 피르부테롤, 프로카테롤, 리토드린, 살부타몰, 알부테롤, 테르부탈린, 티오트로퓸), 항콜린제 (예를 들어, 히오사이아민, 아트로핀, 페노바비탈, 스코폴라민, 다이사이클로민, 페노바비탈, 메펜졸레이트 및 조합, 예컨대 아트로핀, 히오사이아민, 페노바비탈 및 스코폴라민), 코르티코스테로이드 (예를 들어, 하이드로코르티손, 하이드로코르티손-17-발레레이트, 하이드로코르티손-17-부티레이트, 프레드니손, 프레드니솔론, 트라이암시놀론 아세토니드, 트라이암시놀론 알콜, 베타메타손, 덱사메타손, 플루오코르톨론, 플루니솔리드, 부데소니드), 장기간 항생제 (예를 들어, 매크롤리드, 예컨대 에리트로마이신, 아지트로마이신, 및 메틸잔틴, 예컨대 테오필린) 비스테로이드성 항염증제 (NSAID) (예를 들어, 아스피린, 셀레콕시브, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 나프록센, 옥사프로진, 피록시캄, 살살레이트, 술린닥, 톨메틴, 등), 5-아미노살리실산 (5-ASA) (예를 들어, 메살라진), 면역저해제 (예를 들어, 프레드니손, TNF 억제자, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린), 재발-경감 다발성 경화증 요법 (예를 들어, 인터페론 베타-1a, 인터페론 베타-1b, 글라티라머 아세테이트, 미톡산트론, 나탈리쥬맙, 핀골리모드, 테리플루노미드, 다이메틸 푸마레이트, 알엠투쥬맙, 다클리쥬맙, CD20 단클론성 항체, 예컨대 리툭시맙, 오크렐리쥬맙 및 오파투무맙), 건선 치료용 국부 작용제 (예를 들어, 국부 작용제, 예컨대 파라-아미노벤조산, 코코넛 오일, 콜 타르, 디트라놀, 코르티코스테로이드, 예컨대 데스옥시메타손, 플루오시노니드, 비타민 D₃ 및 다른 비타민 D 유사체, 소랄렌, 및 전신 작용제, 예컨대 메토트렉세이트, 시클로스포린, 하이드록시카르바미드, 푸마레이트, 예컨대 다이메틸 푸마레이트 및 레티노이드), TNF-α 안타고니스트 (예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 골리무맙 및 세르톨리쥬맙 페골), T-세포를 표적으로 하는 건선 치료 (예를 들어, 에팔리쥬맙 및 알레파셉트), 고혈압 및 심혈관 질환에 대한 치료 (예를 들어, 아스피린, 스타틴, 예컨대 아토르바스타틴, 플루마스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴 및 조합들, 예컨대 심바스타틴+에제티밉, 로바스타틴+니아신, 및 아토르바스타틴+암로디핀), 신경 퇴행성 장애에 대한 요법 (예를 들어, 디메본, 및 프롤린-풍부 펩타이드 (PRP)-1), 항우울증제 (예를 들어, 세르트랄린, 시탈로프람, 플루옥세틴, 에스시탈로프람, 트라조돈, 벤라팍신, 부프로피온, 듈록세틴, 파록세틴, 아미트리프틸린, 벤라파신, 데스벤라팍신, 및 노르트립틸린), 및 항암 요법 (예를 들어, 소라페닙, JX-594, 인터류킨-2, 이필리무맙 (Yervoy), 니볼루맙 (Opdivo), 펨브롤리쥬맙 (Keytruda), 베무라페닙 (Zelboraf), 다브라페닙 (Tafinlar), 트라메티닙 (Mekinist), 안트라사이클린, 예컨대 독소루비신 (Adriamycin®), 에피루비신 (Ellence®), 탁산, 예컨대 파클리탁셀 (Taxol®) 및 도세탁셀 (Taxotere®), 5-플루오로유라실 (5-FU), 사이클로포스파미드 (Cytoxan®), 카르보플라틴 (Paraplatin®) 또는 이것들의 조합)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

투여 양생법

본 발명의 특정 구체예에 따르면, 항-LEPR 안타고니스트 항체 (또는 항-LEPR 안타고니스트 항체와 본원에서 언급된 추가적인 치료적 활성제 중 어느 것의 조합을 포함하는 약학적 조성물)의 다회수 용량이 한정된 시간 과정에 걸쳐 대상체에게 투여될 수도 있다. 본 발명의 이 양태에 따르는 방법은 대상체에게 본 발명의 항-LEPR 항체의 다회수 용량을 순차적으로 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "순차적으로 투여하는 것"은 항-LEPR 항체의 각각의 용량이 상이한 시점에, 예를 들어, 미리 결정된 간격 (예를 들어, 시간, 일, 주 또는 월)으로 분리된 상이한 날에 대상체에게 투여되는 것을 의미한다. 본 발명은 환자에게 항-LEPR 항체의 단일 처음 용량에 이어서, 항-LEPR 항체의 1회 이상의 2차 용량, 이어서 선택적으로 항-LEPR의 1회 이상의 3차 용량을 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.

용어 "처음 용량", "2차 용량", 및 "3차 용량"은 본 발명의 항-LEPR 항체 투여의 시간적인 순서이다. 따라서, "처음 용량"은 치료 요법의 시작시 투여되는 용량 ("기저 용량", "로딩 용량", "시작 용량", 등으로도 불림)이고; "2차 용량"은 처음 용량 이후에 투여되는 용량이고; "3차 용량"은 2차 용량 이후에 투여되는 용량이다. 처음, 2차, 및 3차 용량은 모두 동일한 양의 항-LEPR 항체를 함유할 수도 있지만, 일반적으로 투여 빈도에 관하여 서로 다를 수도 있다. 하지만, 특정 구체예에서, 처음, 2차 및/또는 3차 용량에 함유된 항-LEPR 항체의 치료의 과정 동안에 양은 서로 달라진다 (예를 들어, 적절하게 상향 또는 하향 조정됨). 특정 구체예에서, 2회 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5회)의 용량이 치료 양생법의 시작시 "로딩 용량"에 이어서, 덜 빈번하게 투여되는 후속 용량 (예를 들어, "유지 용량")이 투여된다.

항체의 진단적 및 분석적 용도

본 발명의 항-LEPR 항체는 또한, 예를 들어, 진단 목적을 위해, 샘플에서 LEPR, 또는 LEPR-발현 세포를 검출 및/또는 측정하는데 사용될 수도 있다. 예를 들어, 항-LEPR 항체, 또는 이것의 단편은 LEPR의 비정상적인 발현 (예를 들어, 과다발현, 과소발현, 발현 부족, 등)을 특징으로 하는 병태 또는 질환을 진단하는데 사용될 수도 있다. LEPR에 대한 예시적인 진단 검정은, 예를 들어, 환자로부터 얻은 샘플을 검출 가능한 라벨 또는 리포터 분자로 라벨링된 본 발명의 항-LEPR 항체와 접촉시키는 것을 포함할 수도 있다. 대안으로, 라벨링되지 않은 항-LEPR 항체는 자체로 검출 가능하게 라벨링된 2차 항체와 조합하여 진단 용도로 사용될 수 있다. 검출 가능한 라벨 또는 리포터 분자는 방사성 동위원소, 예컨대 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, 또는 ¹²⁵I; 형광 또는 화학발광 모이어티, 예컨대 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 또는 로다민; 또는 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 홀스래디쉬 퍼옥시다아제, 또는 루시퍼라아제일 수 있다. 샘플에서 LEPR을 검출 또는 측정하는데 사용될 수 있는 특이적이고 예시적인 검정은 효소-결합된 면역 흡착 검정 (ELISA), 방사선 면역 검정 (RIA), 및 형광-활성화된 세포 분류 (FACS)를 포함한다.

본 발명에 따FMS LEPR 진단 검정에 사용될 수 있는 샘플은 정상 또는 병리학적 조건 하에서 검출 가능한 양의 LEPR 단백질, 또는 그 단편을 함유하는 환자로부터 얻을 수 있는 임의의 조직 또는 유동체 샘플을 포함한다. 일반적으로, 건강한 환자 (예를 들어, 비정상적인 LEPR 수준 또는 활성과 관련된 질환 또는 병태에 영향을 받지 않는 환자)로부터 얻어진 특정 샘플에서 LEPR의 수준은 처음에 LEPR의 베이스라인, 또는 기준 수준을 확립하기 위해 측정될 것이다. LEPR의 이 베이스라인 수준은 LEPR 관련 질환 또는 병태에 걸린 것으로 의심되는 개체로부터 얻어진 샘플에서 측정된 LEPR의 수준과 비교될 수 있다.

실시예

다음 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 기술내용을 당업자에게 제공하기 위해서 제시되고, 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

사용된 수치 (예를 들어, 양, 온도, 등)에 관하여 정확도를 보장하기 위한 노력이 이루어졌지만 일부 실험적 오차 및 편차는 설명되어야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 그 근처이다.

실시예 1. 렙틴 수용체 ( LEPR )에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단백질의 생성

VELOCIMMUNE^® 마우스 (즉, 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 조작된 마우스)를 LEPR의 세포외 도메인을 포함하는 면역원으로 면역화하여 항-LEPR 항체를 얻었다. 항체 면역 반응을 LEPR-특이적 면역 검정으로 모니터링하였다. 이전에 기술된 기술을 사용하여, 완전한 인간 항-LEPR 항체를 단리시키고 정제하였다.

이 실시예의 방법에 따라 생성된 예시적인 항-LEPR 항체의 특정 생물학적 성질을 하기 제시된 실시예에서 상세히 기술하였다.

실시예 2. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 및 핵산 서열

표 1은 본 발명의 선택된 항-LEPR 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 CDR의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 상응하는 핵산 서열 식별자를 표 2에서 제시한다.

아미노산 서열 식별자

	서열 번호:
항체 명칭	HCVR	HCDR1	HCDR2	HCDR3	LCVR	LCDR1	LCDR2	LCDR3
H4H17322P2	2	4	6	8	10	12	14	16
H4H18437P2	18	20	22	24	10	12	14	16
H4H18439P2	26	28	30	32	10	12	14	16
H4H18440P2	34	36	38	40	10	12	14	16
H4H18457P2	42	44	46	48	10	12	14	16
H4H18462P2	50	52	54	56	10	12	14	16
H4H18464P2	58	60	62	64	10	12	14	16
H4H18466P2	66	68	70	72	10	12	14	16
H4H18508P2	74	76	78	80	82	84	86	88

핵산 서열 식별자

	서열 번호:
항체 명칭	HCVR	HCDR1	HCDR2	HCDR3	LCVR	LCDR1	LCDR2	LCDR3
H4H17322P2	1	3	5	7	9	11	13	15
H4H18437P2	17	19	21	23	9	11	13	15
H4H18439P2	25	27	29	31	9	11	13	15
H4H18440P2	33	35	37	39	9	11	13	15
H4H18457P2	41	43	45	47	9	11	13	15
H4H18462P2	49	51	53	55	9	11	13	15
H4H18464P2	57	59	61	63	9	11	13	15
H4H18466P2	65	67	69	71	9	11	13	15
H4H18508P2	73	75	77	79	81	83	85	87

항체를 전형적으로 다음 명명법에 따라 본원에서 언급한다: Fc 접두사 (예를 들어 "H4H", "H1M", "H2M", 등), 이어서 수치 식별자 (예를 들어 "17322", 18457"", 등), 이어서 "P" 또는 "N" 접미사. 따라서, 이 명명법에 따라, 본원에서 항체는, 예를 들어, " H4H17322P2", "H4H18457P2", 등으로 불릴 수도 있다. 본원에서 사용된 항체 명칭에서 Fc 접두사 (H4H, H1M 및 H2M)는 항체의 특정 Fc 영역 아이소타입을 나타낸다. 예를 들어, "H4H" 항체는 인간 IgG4 Fc를 갖는 반면, "H1M" 항체는 마우스 IgG1 Fc를 갖는다 (모든 가변 영역은 항체 명칭의 처음 'H'가 의미하는 바와 같이 완전한 인간이다). 당업자에 의해 인정되는 바와 같이, 특정 Fc 아이소타입을 가진 항체는 상이한 Fc 아이소타입을 가진 항체로 전환될 수 있지만 (예를 들어, 마우스 IgG1 Fc를 가진 항체는 인간 IgG4, 등을 가진 항체로 전환될 수 있다), 어떠한 경우에도, 가변 도메인 (CDR 포함) - 표 1 및 2에서 나타난 수치 식별자로 표시된다 - 은 동일한 것으로 유지되고, 결합 성질은 Fc 도메인의 성질과 관계없이 동일하거나 실질적으로 유사한 것으로 예상된다.

비교기 항체. 다음 실시예에서 사용된 비교기 항체는 Fazeli et al. (2006) J Immunol Methods 312:190-200 및 Carpenter et al. (2012) Structure 20(3):487-97에서 기술된 Fab 9F8을 말한다.

실시예 3. 인간 단클론성 항- LEPR 항체의 표면 플라스몬 공명 유래된 결합 친화도 및 역학 상수

본 발명의 정제된 항-LEPR 단클론성 항체로의 항원 결합에 대한 평형 해리 상수 (K _D 값)을 Biacore 4000 기구를 사용하는 실시간 표면 플라스몬 공명 바이오센서를 사용하여 결정하였다. 모든 결합 연구를 25℃ 및 37℃에서 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 및 0.05 부피% 계면활성제 Tween-20, pH 7.4를 함유하는 러닝 버퍼 (HBS-ET 러닝 버퍼)에서 수행하였다. Biacore 센서 표면을 먼저 단클론성 마우스 항-인간 Fc 항체 (GE, # BR-1008-39)와의 아민 커플링에 의해 캡쳐 항-LEPR 단클론성 항체로 유도체 합성하였다. 항-LEPR 단클론성 항체로의 결합에 대하여 테스트된 LEPR 시약은 C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그 (hLEPR.MMH; 서열 번호:90)와 함께 발현된 재조합 인간 LEPR 세포외 도메인, C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그 (mfLEPR.MMH; 서열 번호:93)와 함께 발현된 재조합 게먹이 원숭이 LEPR 세포외 도메인, C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그 (mLEPR.MMH; 서열 번호:94)와 함께 발현된 재조합 마우스 LEPR 세포외 도메인, C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그 (rLEPR.MMH; 서열 번호:95)와 함께 발현된 재조합 래트 LEPR 세포외 도메인, 및 C-말단 마우스 IgG2a Fc 태그 (hLEPR.mFc; 서열 번호:91)와 함께 발현된 재조합 인간 LEPR 세포외 도메인을 포함하였다. MMH 태그를 포함하는 LEPR 구조체는 모노머 LEPR 구조체이고, mFc 태그를 포함하는 LEPR 구조체는 다이머 LEPR 구조체이다. 상이한 농도의 LEPR 시약을 먼제 제조하였다.

상이한 농도의 LEPR 시약을 먼저 HBS-ET 러닝 버퍼에서 3배 단계 희석으로 100nM 내지 3.7nM의 범위의 최종 농도로 제조하였고 이어서 30μL/분의 유속으로 4분 동안 항-LEPR 단클론성 항체 캡쳐된 표면 위에 주사하였다. 단클론성 항체 결합된 LEPR 시약의 해리를 HBS-ET 러닝 버퍼에서 10분 동안 모니터링하였다. 역학 결합 (k _a ) 및 해리 (k _d ) 속도 상수를 Scrubber 2.0c 곡선-맞춤 소프트웨어를 사용하여 실시간 결합 센서그램을 질량 이동 제한이 있는 1:1 결합 모델에 맞춰 결정하였다. 결합 해리 평형 상수 (K_D) 및 해리 반감기 (t½)를 다음과 같은 역학 속도 상수로부터 계산하였다:

및

25℃ 및 37℃에서 본 발명의 상이한 항-LEPR 단클론성 항체로의 hLEPR-MMH, mfLEPR-MMH, hLEPR.mFc, mLEPR-MMH 또는 rLEPR-MMH 결합에 대한 결합 역학 파라미터는 표 3 내지 13에서 나타난다.

25℃에서 hLEPR-MMH로의 항-LEPR 항체 결합의 결합 역학 파라미터

캡쳐된 mAb	mAb 캡쳐 수준 ( RU )	결합된 100nM hLEPR-MMH (RU)	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K _D (M)	t½ (min)
H4H17322P2	178 ± 1.2	66	4.38E+04	2.24E-04	5.11E-09	52
H4H18437P2	171 ± 0.5	56	5.74E+04	3.75E-03	6.53E-08	3.1
H4H18439P2	156 ± 0.7	21	1.07E+04	1.13E-03	1.06E-07	10
H4H18440P2	170 ± 0.5	71	4.23E+04	4.97E-04	1.18E-08	23
H4H18457P2	166 ± 0.9	119	2.55E+05	2.52E-03	9.89E-09	5
H4H18462P2	175 ± 0.6	34	6.79E+04	7.65E-03	1.13E-07	1.5
H4H18464P2	160 ± 0.4	60	1.24E+05	1.13E-03	9.09E-09	10
H4H18466P2	161 ± 0.5	24	2.64E+04	5.11E-03	1.94E-07	2.3
H4H18508P2	180 ± 1.5	127	1.76E+05	1.67E-03	9.53E-09	7
비교기 항체	380 ± 8.2	26	4.48E+04	7.46E-05	1.66E-09	155
아이소타입 대조군 항체	171 ± 0.4	4	NB*	NB*	NB*	NB*

*NB는 현재 실험 조건 하에서 결합이 관찰되지 않았음을 나타낸다.

37℃에서 hLEPR-MMH로의 항-LEPR 항체 결합의 결합 역학 파라미터

캡쳐된 mAb	mAb 캡쳐 수준 ( RU )	결합된 100nM hLEPR-MMH (RU)	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K _D (M)	t½ (min)
H4H17322P2	225 ± 3	99	6.95E+04	8.12E-04	1.17E-08	14
H4H18437P2	213 ± 3	55	1.14E+05	8.84E-03	7.76E-08	1.3
H4H18439P2	180 ± 1.5	19	2.32E+04	4.69E-03	2.02E-07	2.5
H4H18440P2	207 ± 1.2	95	6.34E+04	1.73E-03	2.73E-08	7
H4H18457P2	198 ± 1.6	108	3.45E+05	8.55E-03	2.48E-08	1.4
H4H18462P2	204 ± 2.1	31	4.58E+04	1.14E-02	2.48E-07	1.0
H4H18464P2	185 ± 1.2	68	1.54E+05	3.15E-03	2.05E-08	3.7
H4H18466P2	184 ± 1.3	26	4.55E+04	6.74E-03	1.48E-07	1.7
H4H18508P2	204 ± 1.4	117	2.69E+05	6.88E-03	2.55E-08	1.7
비교기 항체	315 ± 7.6	37	5.39E+04	4.81E-04	8.92E-09	24
아이소타입 대조군 항체	193 ± 1.5	6	NB*	NB*	NB*	NB*

표 3에서 나타난 바와 같이, 25℃에서, 본 발명의 모든 항-LEPR 단클론성 항체는 5.11nM 내지 194nM의 범위의 K _D 값으로 hLEPR-MMH에 결합하였다. 표 4에서 나타난 바와 같이, 37℃에서, 본 발명의 모든 항-LEPR 단클론성 항체는 11.7nM 내지 248nM의 범위의 K _D 값으로 hLEPR-MMH에 결합하였다.

25℃에서 mfLEPR-MMH로의 항-LEPR 항체 결합의 결합 역학 파라미터

캡쳐된 mAb	mAb 캡쳐 수준 (RU)	결합된 100nM mfLEPR-MMH (RU)	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K_D (M)	t½ (min)
H4H17322P2	177 ± 0.5	102	7.02E+04	2.92E-04	4.16E-09	40
H4H18437P2	171 ± 0.3	70	6.87E+04	4.05E-03	5.89E-08	2.9
H4H18439P2	155 ± 0.5	22	1.57E+04	1.52E-03	9.63E-08	8
H4H18440P2	170 ± 0.9	67	4.95E+04	2.68E-03	5.41E-08	4.3
H4H18457P2	165 ± 0.4	133	2.73E+05	3.31E-03	1.22E-08	3.5
H4H18462P2	174 ± 0.4	42	7.42E+04	1.33E-02	1.79E-07	0.9
H4H18464P2	159 ± 0.4	15	3.82E+04	2.31E-03	6.04E-08	5.0
H4H18466P2	161 ± 0.5	30	4.50E+04	6.69E-03	1.48E-07	1.7
H4H18508P2	178 ± 0.4	145	2.04E+05	1.63E-03	8.00E-09	7
비교기 항체	359 ± 4.8	1	NB*	NB*	NB*	NB*
아이소타입 Control 항체	171 ± 0.4	0	NB*	NB*	NB*	NB*

37℃에서 mfLEPR-MMH로의 항-LEPR 항체 결합의 결합 역학 파라미터

캡쳐된 mAb	mAb 캡쳐 수준 (RU)	결합된 100nM mfLEPR-MMH (RU)	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K_D (M)	t½ (min)
H4H17322P2	218 ± 1.7	142	1.43E+05	1.10E-03	7.72E-09	10
H4H18437P2	207 ± 1.4	58	8.69E+04	1.27E-02	1.47E-07	0.9
H4H18439P2	178 ± 1.4	14	4.69E+04	7.92E-03	1.69E-07	1.5
H4H18440P2	204 ± 1	66	7.15E+04	7.24E-03	1.01E-07	1.6
H4H18457P2	195 ± 1.4	117	3.47E+05	1.04E-02	3.00E-08	1.1
H4H18462P2	199 ± 1.1	28	1.29E+05	3.37E-02	2.61E-07	0.3
H4H18464P2	183 ± 0.6	13	3.92E+04	8.41E-03	2.15E-07	1.4
H4H18466P2	181 ± 0.9	27	8.43E+04	1.38E-02	1.64E-07	0.8
H4H18508P2	200 ± 1	125	2.85E+05	7.89E-03	2.77E-08	1.5
비교기 항체	298 ± 3.2	-1	NB*	NB*	NB*	NB*
아이소타입 대조군 항체	190 ± 1	1	NB*	NB*	NB*	NB*

표 5에서 나타난 바와 같이, 25℃에서, 본 발명의 모든 항-LEPR 단클론성 항체는 4.16nM 내지 179nM의 범위의 K _D 값으로 mfLEPR-MMH에 결합하였다. 표 6에서 나타난 바와 같이, 37℃에서, 본 발명의 모든 항-LEPR 단클론성 항체는 7.72nM 내지 261nM의 범위의 K _D 값으로 mfLEPR-MMH에 결합하였다.

25℃에서 hLEPR-mFc로의 항-LEPR 항체 결합의 결합 역학 파라미터

캡쳐된 mAb	mAb 캡쳐 수준 (RU)	결합된 100nM hLEPR-mFc (RU)	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K_D (M)	t½ (min)
H4H17322P2	176 ± 0.4	74	6.45E+04	1.14E-04	1.77E-09	102
H4H18437P2	169 ± 1.1	70	1.02E+05	5.36E-04	5.27E-09	22
H4H18439P2	155 ± 0.2	53	4.87E+04	1.80E-04	3.69E-09	64
H4H18440P2	169 ± 0.5	140	1.54E+05	6.82E-05	4.43E-10	169
H4H18457P2	165 ± 0.8	149	4.91E+05	4.23E-04	8.63E-10	27
H4H18462P2	173 ± 0.5	68	9.08E+04	2.96E-04	3.26E-09	39
H4H18464P2	159 ± 0.4	84	2.11E+05	1.88E-04	8.91E-10	61
H4H18466P2	160 ± 0.2	37	3.97E+04	4.72E-04	1.19E-08	24
H4H18508P2	178 ± 0.4	138	2.21E+05	2.99E-04	1.35E-09	39
비교기 항체	344 ± 4.9	36	1.56E+05	1.45E-05	9.28E-11	798
아이소타입 대조군 항체	170 ± 0.7	-2	NB*	NB*	NB*	NB*

37℃에서 hLEPR-mFc로의 항-LEPR 항체 결합의 결합 역학 파라미터

캡쳐된 mAb	mAb 캡쳐 수준 (RU)	결합된 100nM hLEPR-mFc (RU)	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K_D (M)	t½ (min)
H4H17322P2	214 ± 1.8	105	1.33E+05	4.40E-04	3.31E-09	26
H4H18437P2	202 ± 1.1	88	1.29E+05	5.56E-04	4.30E-09	21
H4H18439P2	176 ± 0.7	67	6.09E+04	9.23E-04	1.51E-08	13
H4H18440P2	200 ± 1.4	181	2.12E+05	1.12E-04	5.27E-10	103
H4H18457P2	193 ± 1	166	5.56E+05	7.04E-04	1.27E-09	16
H4H18462P2	196 ± 0.9	84	1.28E+05	5.43E-04	4.26E-09	21
H4H18464P2	182 ± 0.4	105	4.04E+05	5.17E-04	1.28E-09	22
H4H18466P2	179 ± 1	52	5.87E+04	5.20E-04	8.86E-09	22
H4H18508P2	198 ± 1	146	4.71E+05	1.02E-03	2.16E-09	11
비교기 항체	288 ± 2.5	50	1.50E+05	7.74E-05	5.14E-10	149
아이소타입 대조군 항체	188 ± 0.8	1	NB*	NB*	NB*	NB*

표 7에서 나타난 바와 같이, 25℃에서, 본 발명의 모든 항-LEPR 단클론성 항체는 443pM 내지 11.9nM의 범위의 K _D 값으로 hLEPR-mFc에 결합하였다. 표 8에서 나타난 바와 같이, 37℃에서, 본 발명의 모든 항-LEPR 단클론성 항체는 527pM 내지 15.1nM의 범위의 K _D 값으로 hLEPR-mFc에 결합하였다.

25℃에서 mLEPR-MMH로의 항-LEPR 항체 결합의 결합 역학 파라미터

캡쳐된 mAb	mAb 캡쳐 수준 (RU)	결합된 100nM mLEPR-MMH (RU)	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K_D (M)	t½ (min)
H4H17322P2	176	0	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18437P2	169	6	1.58E+04	4.18E-03	2.64E-07	2.8
H4H18439P2	155	-2	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18440P2	169	-3	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18457P2	164	1	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18462P2	173	2	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18464P2	159	-1	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18466P2	160	1	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18508P2	177	25	2.78E+05	6.07E-02	2.18E-07	0.19
비교기 항체	334 ± 2.5	2	NB*	NB*	NB*	NB*
아이소타입 대조군 항체	169	-2	NB*	NB*	NB*	NB*

37℃에서 mLEPR-MMH로의 항-LEPR 항체 결합의 결합 역학 파라미터

캡쳐된 mAb	mAb 캡쳐 수준 (RU)	결합된 100nM mLEPR-MMH (RU)	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K_D (M)	t½ (min)
H4H17322P2	212	-1	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18437P2	201	6	1.15E+04	1.33E-02	1.16E-06	0.9
H4H18439P2	175	-1	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18440P2	200	-1	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18457P2	191	-1	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18462P2	194	3	IC*	IC*	IC*	IC*
H4H18464P2	181	1	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18466P2	178	3	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18508P2	196	17	5.12E+05	1.05E-01	2.05E-07	0.11
비교기 항체	283 ± 1.1	0	NB*	NB*	NB*	NB*
아이소타입 대조군 항체	187	0	NB*	NB*	NB*	NB*

*IC는 관찰된 결합이 포괄적이고 현재 실험 조건 하에서 실시간 결합 데이터에 적합하지 않다는 것을 나타낸다.

표 9에서 나타난 바와 같이, 25℃에서, 본 발명의 항-LEPR 단클론성 항체 9개 중 2개는 218nM 내지 264nM의 K _D 값으로 mLEPR-MMH에 결합하였다. 표 10에서 나타난 바와 같이, 37℃에서, 본 발명의 항-LEPR 단클론성 항체 9개 중 2개는 205nM 내지 1.16μM의 K _D 값으로 mLEPR-MMH에 결합하였다.

25℃에서 rLEPR-MMH로의 항-LEPR 항체 결합의 결합 역학 파라미터

캡쳐된 mAb	mAb 캡쳐 수준 (RU)	결합된 100nM rLEPR-MMH (RU)	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K_D (M)	t½ (min)
H4H17322P2	176 ± 0.9	10	IC*	IC*	IC*	IC*
H4H18437P2	169 ± 0.2	13	4.21E+04	1.38E-02	3.28E-07	0.8
H4H18439P2	155 ± 0.2	-1	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18440P2	169 ± 0.4	-2	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18457P2	164 ± 0.5	18	2.83E+04	2.06E-02	7.30E-07	0.6
H4H18462P2	173 ± 0.2	5	3.21E+04	1.08E-02	3.36E-07	1.1
H4H18464P2	159 ± 0	-1	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18466P2	160 ± 0.6	5	2.10E+04	1.98E-02	9.43E-07	0.6
H4H18508P2	177 ± 0.1	22	1.39E+05	4.76E-02	3.41E-07	0.24
비교기 항체	328 ± 1.6	1	NB*	NB*	NB*	NB*
아이소타입 대조군 항체	170 ± 0.2	-1	NB*	NB*	NB*	NB*

37℃에서 rLEPR-MMH로의 항-LEPR 항체 결합의 결합 역학 파라미터

캡쳐된 mAb	mAb 캡쳐 수준 (RU)	결합된 100nM rLEPR-MMH (RU)	k _a (1/Ms)	k _d (1/s)	K_D (M)	t½ (min)
H4H17322P2	212 ± 0.3	9	9.32E+04	3.28E-02	3.52E-07	0.4
H4H18437P2	200 ± 0	10	3.07E+04	1.93E-02	6.29E-07	0.6
H4H18439P2	175 ± 0.8	0	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18440P2	200 ± 0.1	0	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18457P2	192 ± 0.3	16	3.02E+04	1.75E-02	5.80E-07	0.7
H4H18462P2	194 ± 0.9	5	IC*	IC*	IC*	IC*
H4H18464P2	181 ± 0.1	1	NB*	NB*	NB*	NB*
H4H18466P2	177 ± 0.7	6	3.26E+04	2.52E-02	7.71E-07	0.5
H4H18508P2	196 ± 1.6	17	2.71E+05	4.57E-02	1.68E-07	0.25
비교기 항체	279 ± 0.4	-1	NB*	NB*	NB*	NB*
아이소타입 대조군 항체	186 ± 0.1	0	NB*	NB*	NB*	NB*

표 11에서 나타난 바와 같이, 25℃에서, 본 발명의 항-LEPR 단클론성 항체 9개 중 5개는 328nM 내지 943nM의 K _D 값으로 rLEPR-MMH에 결합하였다. 표 12에서 나타난 바와 같이, 37℃에서, 본 발명의 항-LEPR 단클론성 항체 9개 중 5개는 168nM 내지 771nM의 K _D 값으로 rLEPR-MMH에 결합하였다.

실시예 4. 본 발명의 항- LEPR 항체는 h렙틴으로의 hLEPR -hFc 결합을 차단하지 않는다.

천연 리간드, 인간 렙틴으로의 다이머 인간 LEPR의 결합을 차단할 수 있는 본 발명의 항-LEPR 단클론성 항체의 능력을 경쟁 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정하였다.

ELISA를 위해서, 인간 렙틴 (h렙틴; R&D Systems, # 398-LP-01M)을 96-웰 미세역가 플레이트에서 5 mg/mL의 농도로 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. 그 이후에 비특이적 결합 부위를 PBS 중의 0.5% (w/v) BSA 용액을 사용하여 차단하였다. C-말단 인간 Fc 태그와 함께 발현되는 LEPR 단백질 (hLEPR.hFc; 서열 번호:92)의 세포외 도메인 부분의 10nM의 일정한 양을 단계 희석에서 8.5pM 내지 500nM의 범위에 있는 항-LEPR 항체, h렙틴 단백질, 또는 아이소타입 대조군 항체로 적정하였다. 이어서 이들 항체-단백질 또는 단백질-단백질 복합체를 실온 (RT)에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 그 이후에 복합체를 h렙틴로 코팅된 미세역가 플레이트로 옮기고 RT에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 웰을 세척하고, 플레이트-결합된 EPR-hFc를 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 (Jackson ImmunoResearch Inc, #109-035-098)와 컨쥬게이션된 항-인간 IgG 다클론성 항체로 검출하였다. 샘플을 비색 반응을 생산하기 위해 TMB 용액 (BD Biosciences, #555214; substrate A and B mixed at 1:1 ratio as per manufacturer's instructions)으로 현상한 다음 Victor X5 플레이트 판독기 상에서 450nm에서 흡광도를 측정하기 전에 1M 황산으로 중성화하였다. Prism™ 소프트웨어 (GraphPad) 내에서 S자 모양의 용량-반응 모델을 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 플레이트 상에서 인간 렙틴으로의 10nM hLEPR-hFc의 결합을 차단할 수 있는 항체의 능력에 대한 지표로서 테스트된 항체의 최대 농도에서 퍼센트 차단을 계산하였다. 계산시, 항체 없이 10nM의 hLEPR-hFc의 결합 신호는 100% 결합 또는 0% 차단을 나타내고; hLEPR-hFc의 존재 없이 버퍼 단독의 베이스라인 신호는 0% 결합 또는 100% 차단을 나타낸다. 500nM 항체 농도에서 차단 데이터를 표 13에서 요약한다.

항- LEPR 항체에 의한 h렙틴으로의 hLEPR -hFc 결합의 ELISA 차단

항체	h렙틴으로의 10nM hLEPR -hFc 결합의 500nM Ab 차단 ( % 차단)
H4H18440P2	3
H4H18466P2	2
H4H18457P2	4
H4H18437P2	9
H4H18464P2	-5
H4H17322P2	13
H4H18439P2	-1
H4H18462P2	14
H4H18508P2	40
대조군
아이소타입 대조군 항체	-3
인간 렙틴	99
비교기 항체	99
마우스 IgG2a 아이소타입 대조군	32

표 13에서 나타난 바와 같이 본 발명의 항-LEPR 항체 중 아무것도 h렙틴 코팅된 표면으로의 hLEPR-hFc의 결합의 >40% 차단을 입증할 수 없었다. 하지만, 비교기 항체 및 h렙틴은 양성 대조군으로서 h렙틴 코팅된 표면으로의 hLEPR-hFc 결합의 99%를 차단할 수 있었다. 아이소타입 대조군 항체는 최대 500nM 의 농도에서 측정 가능한 차단이 없음을 입증하였다.

실시예 5. HEK293 / Mycx2 - hLEPR ( ecto )- GPI 고정된 세포로의 FACS 분석에 의한 세포 결합

렙틴 수용체, LEPR은 큰, 818개 아미노산 길이의 세포외 도메인을 가진 부류 I 사이토카인 수용체 패밀리의 단일 패스 막관통 수용체이다 (Tartaglia (1997) J. Biol. Chem 7:272(10):6093-6). LEPR은 대부분 음식 섭취 및 대사의 조절에 수반되는 지방 조직에 의해 발현되는 단백질인 렙틴에 결합할 수 있다 (Friedman (2014) J Endocrinol 223(1):T1-8). 가용성 또는 막-결합된 형태의 수용체를 수득하는 상이한 아이소폼의 LEPR이 존재하고 막-결합된 형태는 세포내 도메인의 길이가 상이하다. 가장 긴 세포내 도메인을 가진 아이소폼은 비만에 관하여 렙틴 작용의 중요한 부위인 시상하부에서 고도로 발현된다 (Friedman and Halaas (1998) Nature 395(6704):763-70). LEPR은 대부분 세포체 내에 위치하고 세포 표면 상에서는 더 작은 정도로 위치한다. LEPR은 리간드-유도된 내재화를 거쳐서 렙틴 신호 전달의 추가적인 수준의 조절을 더한다 (Sweeney (2002) Cell Signal 14(8):655-63).

본 발명의 항-LEPR 항체에 의한 세포 결합을 평가하기 위해서, HEK293 세포주를 생성하여, 단백질이 막에 GPI-고정될 수 있도록 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI)의 추가를 유도하는 인간 카르복시펩티다아제 M의 N-말단 myc-myc 태그 및 C-말단 펩타이드 서열을 가진 인간 LEPR (hLEPR; accession # P48357의 아미노산 22-839, Isoform B)의 세포외 도메인을 안정하게 발현시켰다 (Marcic et al. (2000) J Biol Chem . 275(21):16110-8). 세포주의 hLEPR은 세포내 도메인을 갖지 않기 때문에, 리간드 결합시 내재화되지 않으며, 항체 및/또는 리간드 결합에 이용 가능한 LEPRDML 양을 크게 증가시킨다. 10% FBS, NEAA, 페니실린/스트렙토마이신, 및 500μg/mL G418을 함유하는 DMEM에서 세포주를 선택한 다음, 항-Myc 항체를 사용하여 수용체의 높은 발현에 대하여 분류하였다. HEK293/hLEPR-GPI라고 불리는, 결과로 생성된 안정한 세포주를 10% FBS, NEAA, 및 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM에서 유지하였다.

FACS 분석을 위해서, HEK293 모체 세포 및 HEK293/hLEPR-GPI 세포를 단리시키고 96-웰 v-바닥 플레이트에 2% FBS를 함유하는 PBS (FACS 버퍼) 중에 5 x 10⁵ 세포/웰로 평판 배양하였다. 세포로의 항-hLEPR 항체 결합이 렙틴의 존재에 영향을 받는지를 테스트하기 위해, 1μM 인간 렙틴 (R&D Systems, # 398-LP)이 있거나 없는 FACS 버퍼를 세포와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후 이어서, FACS 버퍼 중의 10nM로 항-LEPR 항체 또는 대조군 항체를 추가하였다. 그 이후에 세포를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후 이어서, 세척한 다음 16μg/mL의 Alexa Fluor®-647 컨쥬게이션된 2차 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., # 109-547-003)와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 이후에 세포를 BD CytoFix™ (Becton Dickinson, # 554655)를 사용하여 고정하고, 여과하고, HyperCyt Flow Cytometer (Beckman Coulter)에서 분석하였다. 미염색 2차 항체 단독 대조군을 또한 모든 세포주에 대하여 테스트하였다. 결과를 ForeCyt (IntelliCyt) 및 FlowJo 버전 10 소프트웨어를 사용하여 분석하여 살아있는 세포에 대한 형광의 기하학적 평균을 결정하였다. 각 샘플에 대한 형광의 기하학적 평균을 미염색 세포의 기하학적 평균에 대하여 표준화하여 "결합 비율"이라고 불리는 조건 당 상대적 결합을 얻었고, 테스트된 각각의 항체에 대한 이들 결합 비율을 표 14에서 기록하였다.

표 14에서 나타난 바와 같이, 10nM에서 테스트된 본 발명의 9개의 항-LEPR 항체는 렙틴 없이 824배 내지 3187배 및 1μM 렙틴의 존재시 398배 내지 3590배의 범위에 있는 결합 비율로 HEK293/hLEPR-GPI 세포로의 결합을 입증하였다. 이들 결합 비율의 유사성에 기초하여, 세포에서 발현된 LEPR에 결합할 수 있는 본 발명의 항-LEPR 항체의 능력은 1μM에서 과도한 렙틴의 존재에 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타나며, LEPR 상의 항-LEPR 항체의 결합 부위는 LEPR 상의 렙틴 결합 부위와 중첩되지 않는다는 것을 암시한다. 본 발명의 항-LEPR 항체는 HEK293 모체 세포로의 임의의 유의한 결합을 입증하지 못했으며, 결합 비율은 1μM 렙틴의 유무에 관계없이 1- 내지 9배의 범위에 있다. GPI-고정된 LEPR을 발현하는 세포로의 비교기의 결합은 렙틴의 존재 하에 크게 감소하였다. 아이소타입 대조군 항체 및 2차 항체 단독 샘플은 또한 렙틴 유무에 관계없이 세포주로의 유의한 결합을 입증하지 못했으며, 결합 비율은 1 내지 6배의 범위에 있다.

+/- 1 μM 인간 렙틴에서 HEK293 / hLEPR - GPI 및 HEK293 모체 세포로의 10nM 항-LEPR 항체의 결합

	결합 비율: 각각의 세포주의 미염색 샘플에 대하여 표준화됨
	추가된 렙틴 없음		1μM 렙틴
항체	HEK293 모체	HEK293 / hLEPR-GPI	HEK293 모체	HEK293 / hLEPR-GPI
H4H17322P2	3	1307	6	1317
H4H18457P2	2	3187	3	3106
H4H18464P2	5	2318	7	3590
H4H18437P2	1	1314	2	1441
H4H18439P2	4	1533	6	2477
H4H18440P2	3	1640	7	2557
H4H18462P2	2	1173	3	759
H4H18466P2	1	824	2	398
H4H18508P2	1	1311	2	1873
비교기 항체	6	2349	3	112
인간 IgG 아이소타입 대조군 항체	1	6	2	4
항-인간 IgG 2차 항체 단독	1	3	2	3
마우스 IgG 아이소타입 대조군 항체	2	2	3	3
항-마우스 IgG 2차 항체 단독	2	2	2	2
미염색	1	1	1	1

실시예 6: 본 발명의 항- LEPR 항체는 h렙틴의 존재 하에 렙틴 신호 전달의 완전한 억제를 입증하였다

IMR-32 세포주, 인간 신경아세포종(neuroblastoma) 세포주에서 루시퍼라아제 리포터 (STAT3-Luc; Qiagen, # CLS-6028L)와 함께 전장 인간 LEPR (hLEPR; 등록 번호 NP_002294.2의 아미노산 1 내지 1165)을 안정하게 발현하는 리포터 세포주를 사용하여 LEPR 활성화를 통한 STAT3의 전사 활성화를 검출하기 위한 생물학적 검정을 개발하였다. IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR이라고 불리는 결과로 생성된 안정한 세포주를 단리시키고 10% FBS, NEAA, 1ug/mL 퓨로마이신, 100ug/mL 하이그로마이신 B 및 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민으로 보충된 MEM-Earl 배지 (완전 배지)에서 유지하였다.

결과의 생물학적 검정을 사용하여 렙틴의 존재 또는 부재 하에서 LEPR 신호 전달에 대한 본 발명의 항-LEPR 항체의 효과를 측정하였다. 생물학적 검정을 위해서, IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR 세포를 완전 배지에서 96웰 포맷에 대하여 20,000 세포/100ul/웰의 밀도로 평판 배양한 후 다음 날 배지를 1% BSA 및 0.1% FBS로 보충된 적절한 부피의 Opti-MEM (검정 부피)으로 30분 동안 대체하였다. 렙틴의 부재 하에 본 발명의 항체의 효과를 측정하기 위해서, 항-LEPR 항체 또는 아이소타입 대조군 항체를 검정 버퍼에서 100nM 내지 300fM의 범위에 있는 최종 농도로 반-로그 단계 희석한 다음 세포에 추가하고 그 이후 5% CO₂에서 37℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 렙틴의 존재 하에 본 발명의 항체의 효과를 측정하기 위해서, 검정 버퍼 중에 200pM으로 고정된 농도의 인간 렙틴 (h렙틴; R&D Systems, #398-LP)을 세포에 추가한 직후, 100nM 내지 300fM의 범위에 있는 최종 농도로 반-로그 단계 희석된 항-LEPR 항체 또는 아이소타입 대조군 항체를 추가하였다. 그 다음에 샘플을 5% CO₂에서 37℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. OneGlo 시약 (Promega, # E6051)을 샘플에 추가하고 루시퍼라아제 활성을 발광 모드의 Envision Multilable Plate Reader (Perkin Elmer)에서 측정하였다. 상대적 광 유닛 (RLU) 값을 얻었고 결과를 GraphPad Prism 소프트웨어 (GraphPad)로 비선형 회귀분석을 사용하여 분석하였다. h렙틴 용량 반응으로부터 얻어진 최대 RLU 값을 IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR 검정에서 100% 활성화로 정의하였다.

표 15에서 나타난 바와 같이, h렙틴의 부재 하에, 테스트된 항-LEPR 항체는 IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR 세포의 약한 자극을 입증하였으며, 최대 활성화는 h렙틴 용량 반응으로부터 얻어진 최대 활성화의 각각 4% 내지 8%였다. 약한 자극을 받은 한 항체는 1.27nM의 EC₅₀ 값을 갖는 한편, 또 다른 항체, H4H18440P2는 측정 가능한 EC₅₀ 값을 갖지 않았다. 200pM h렙틴의 존재 하에, 테스트된 항-LEPR 항체 중 3개는 IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR 세포에서 렙틴의 완전한 억제를 입증하였으며, IC₅₀ 값은 723pM (항체 H4H18457P2) 내지 1.83nM (항체 H4H17322P2) 또는 2.9 nM (항체 H4H18464P2)의 범위에 있다. 테스트된 항-LEPR 항체 중 6개는 200pM의 인간 렙틴의 존재 하에 어떠한 측정 가능한 억제도 입증하지 못했다. 아이소타입 대조군 항체는 검정들 중 어떤 것에서도 IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR 세포의 측정 가능한 자극을 입증하지 못했다.

항- LEPR 항체에 의한 hLEPR의 활성화 및 억제

	인간 렙틴 없는 IMR-32/LEPR		200pM 인간 렙틴이 있는 IMR-32/LEPR
항체	EC ₅₀ (M)	% 활성화	IC ₅₀ (M)	% 억제
H4H18457P2	N/A	N/A	7.23E-10	100
H4H17322P2	1.27E-09	8	1.83E-09	100
H4H18464P2	1.30E-10	6	2.9E-09	100
H4H18437P2	N/A*	N/A*	N/A*	N/A*
H4H18439P2	N/A*	N/A*	N/A*	N/A*
H4H18440P2	IC*	4	N/A*	N/A*
H4H18462P2	N/A*	N/A*	N/A*	N/A*
H4H18466P2	N/A*	N/A*	N/A*	N/A*
H4H18508P2	N/A*	N/A*	N/A*	N/A*
비교기 항체	N/A*	N/A*	1.03E-09	100

*N/A는 검정에서 측정 가능한 억제 및/또는 활성화가 없음을 나타낸다.

*IC는 계산된 EC₅₀ 값이 결정될 수 없다는 점에서 결정적이지 못한 결과를 나타낸다.

실시예 7. 상이한 항- LEPR 단클론성 항체 간의 옥텟 (Octet) 교차-경쟁

상이한 항-LEPR 단클론성 항체의 패널 간의 결합 경쟁을 Octet HTX 바이오센서 플랫폼 (Pall ForteBio Corp.)에서 실시간, 무 라벨 생체 층 간섭 측정 검정을 사용하여 결정하였다. 25℃에서 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 및 0.05 부피% 계면활성제 Tween-20, 1mg/mL BSA, pH7.4 (HBS-EBT)를 함유하는 버퍼에서 전체 실험을 수행하였으며, 플레이트를 1000 rpm의 속도로 흔들었다.

2개의 항체가 C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그와 함께 발현된 재조합 인간 LEPR (hLEPR.MMH; SEQ ID:90)로의 결합에 대하여 서로 경쟁할 수 있는지를 평가하기 위해서, 약 0.25nm의 hLEPR-MMH를 먼저 20μg/mL의 hLEPR-MMH를 함유하는 웰에서 5분 동안 바이오센서 팁을 담금으로써 항-펜타-His 항체 코팅된 옥텟 바이오센서 팁 (Fortebio Inc, # 18-5122)에 캡쳐하였다. 그 다음에 항원 캡쳐된 바이오센서 팁을 210초 동안 mAb-1의 50μg/mL 용액을 함유하는 웰에 담금으로써 제1 항-LEPR 단클론성 항체 (이후 mAb-1로 불림)로 포화시켰다. 그 이후에 바이오센서 팁을 제2 항-LEPR 단클론성 항체 (이후 mAb-2로 불림)의 50μg/mL 용액을 함유하는 웰에 150초 동안 담근다. 바이오센서 팁을 실험의 모든 단계 사이에 HBS-EBT 버퍼로 세척하였다. 실험의 전체 과정 동안에 실시간 결합 반응을 모니터링하였고 모든 단계의 끝에 결합 반응을 기록하였다. mAb-1과 미리 복합체 형성된 hLEPR-MMH로의 mAb-2 결합의 반응을 비교하였고 상이한 항-LEPR 단클론성 항체의 경쟁적/비-경쟁적 행동을 표 16에서 나타난 바와 같이 결정하였다.

항- LEPR 단클론성 항체 간의 교차-경쟁

캡쳐된 hLEPR - MMH에 결합하는 제1 항체 (mAb-1)	mAb - 1와 경쟁하는 것으로 나타난 제2 항체 (mAb-2)
H4H18439P2	H4H18440P2
H4H18440P2	H4H18439P2
H4H18457P2	H4H18462P2 H4H18437P2 H4H18466P2 H4H18508P2
H4H18462P2	H4H18457P2H4H18437P2 H4H18466P2
H4H18437P2	H4H18457P2H4H18462P2 H4H18466P2
H4H18466P2	H4H18457P2H4H18462P2 H4H18437P2
H4H17322P2	없음
H4H18464P2	없음

표 16에서 나타난 바와 같이, 항체 H4H18439P2 및 H4H18440P2는 각각의 에피토프로의 결합에 대하여 서로 경쟁한다. LEPR 항체 H4H18457P2, H4H18462P2, H4H18437P2, H4H18466P2 및 H4H18508P2는 각각의 에피토프로의 결합에 대하여 서로 경쟁한다. 항체 H4H17322P2 및 H4H18464P2는 H4H18439P2, H4H18440P2, H4H18457P2, H4H18462P2, H4H18437P2, 및 H4H18466P2의 각각의 에피토프로의 결합에 대하여 경쟁하지 않는다.

실시예 8: 인간화된 LEPR 마우스에서 LEPR 안타고니스트 항체의 생체내 효능 테스트

음식 섭취, 체중 및 지방 과다에 대한 본 발명의 3개의 특이적 안타고니스트 항-LEPR 항체, H4H17322P2, H4H18457P2 및 H4H18464P2의 효과를 쥐 LEPR 엑토도메인 서열 대신에 인간 LEPR 엑토도메인 서열로 구성된 렙틴 수용체를 발현하는 단독 사육된 유전적으로 조작된 LEPR ^Hu/Hu 마우스에서 결정하였다.

베이스라인 1일 음식 섭취를 처리 전 5일 및 1일 (제-5 일 및 제-1 일) 사이에 측정하였다. 처리 전 4일 및 처리 후 6일 (제-4 일 및 제-6 일)에 지방 과다를 포함한 체성분을 μCT로 정량화하였다. 제0 일에, 32마리의 12- 내지 13주령 수컷 LEPR ^HuHu 마우스를 처리 전 1일 (제-1 일)의 체중일 기준으로 8마리씩 4개의 군으로 무작위로 분류하였다. 제0 일에, 각 군에 30 mg/kg의 아이소타입 대조군 항체, 30 mg/kg의 H4H17322P2, 30 mg/kg의 H4H18457P2, 또는 30 mg/kg의 H4H18464P2의 단일 용량을 피하 주사를 통해 투여하였다. 아이소타입 대조군 항체는 임의의 공지된 마우스 단백질에 결합하지 않는다. 각각의 동물에 대한 연구 기간 동안 음식 섭취 및 체중을 측정하였다. 도 1은 각각의 시점에 각각의 처리군에 대한 평균 베이스라인 1일 음식 섭취로부터 음식 섭취의 퍼센트 변화를 요약한다. 제0 일의 체중의 퍼센트 변화를 각각의 시점에 각 동물에 대하여 계산하였다. 도 2는 각각의 처리군의 동물에 대한 평균 퍼센트 체중 변화를 요약한다. 도 3은 항체 처리 전 6일 및 처리 후 6일에 μCT에 의해 정량화된, 각각의 항체 처리군의 동물에 대한 평균 지방량을 요약한다. 모든 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다.

도 1 및 2에서 나타난 바와 같이, 항-LEPR 안타고니스트 항체로 처리된 마우스는 퍼센트 음식 섭취 변화 및 퍼센트 체중 변화의 증가를 입증하였다. 이 증가는 아이소타입 대조군 항체 처리로는 관찰할 수 없었다. 도 1에서 나타난 바와 같이, 30 mg/kg의 H4H17322P2로 처리된 마우스는 아이소타입 대조군 항체로 주사된 마우스와 비교하여 처리 후 1일 (제1 일)에 시작하고 이후 시점에서 음식 섭취의 큰 증가를 나타냈다. 30 mg/kg의 H4H18457P2로 처리된 마우스는 아이소타입 대조군 항체로 주사된 마우스와 비교하여 제2 일에 시작하고 이후 시점에서 음식 섭취의 큰 증가를 나타냈다. 30 mg/kg의 H4H18464P2로 처리된 마우스는 아이소타입 대조군 항체로 주사된 마우스와 비교하여 제2 일에 시작하고 이후 시점에서 음식 섭취의 큰 증가를 나타냈지만 제4 일에는 그렇지 않았다. 도 2에서 나타난 바와 같이, 30 mg/kg의 H4H17322P2로 처리된 마우스는 아이소타입 대조군 항체로 주사된 마우스와 비교하여 처리 후 4일 (제4 일)에 시작하고 이후 시점에서 퍼센트 체중 변화의 큰 증가를 나타냈다. 30 mg/kg의 H4H18457P2로 처리된 마우스는 아이소타입 대조군 항체로 주사된 마우스와 비교하여 제3 일에 시작하고 이후 시점에서 퍼센트 체중 변화의 큰 증가를 나타냈다. 30 mg/kg의 H4H18464P2로 처리된 마우스는 아이소타입 대조군 항체로 주사된 마우스와 비교하여 제4 일에 시작하고 이후 시점에서 퍼센트 체중 변화의 큰 증가를 나타냈다. 도 3에서 도시된 바와 같이, 처리 전 (제-4 일) 군 사이에는 지방량의 차이가 없었다. 30 mg/kg의 H4H17322P2, H4H18457P2 및 H4H18464P2 항체로 처리된 마우스는 아이소타입 대조군 항체와 비교하여 처리 후 6일 (제6 일)에 지방량의 큰 증가를 입증하였다. 결론으로서, 아이소타입 대조군 항체가 아닌 LEPR 안타고니스트 항체의 처리가 마우스에서 음식 섭취, 체중 및 지방 과다를 증가시켰다.

실시예 9: 본 발명의 항- LEPR 항체가 결합하는 인간 LEPR의 에피토프의 결정

본 발명의 항-LEPR 항체가 결합하는 인간 LEPR의 에피토프를 결정하기 위해서, Luminex FLEXMAP (FM3DD, LuminexCorp) 유동 세포 분석법 기반 분석을 이용하여 재조합 인간 LEPR 단백질 도메인과 항-LEPR 항체의 상호작용을 특성화하였다. 검정을 위해서, 대략 3백만 개의 카르복시화된 Microplex^R 미소구체 (Luminex, Cat# LC1000A)를 세척하고, 보텍싱하고 0.1 M NaPO₄, pH 6.2 (활성화 버퍼)에서 초음파 처리한 다음 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 미소구체를 활성화 버퍼 120 μL에서 재현탁시키고 카르복실레이트 기(-COOH)를 25℃에서 15 μL의 50 mg/mL N-하이드록시숙신이미드 (NHS, Thermo Scientific, Cat# 24500)를 추가한 후 이어서 15 μL의 50 mg/mL 1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필]카르보다이이미드 (EDC, ThermoScientific, Cat# 22980)를 추가하여 활성화시켰다. 10분 후, 50 mM MES, pH 5 (커플링 버퍼) 600 μL의 추가로 반응의 pH를 5.0으로 감소시켰고, 미소구체를 보텍싱하고, 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 활성화된 비드를 즉시 커플링 버퍼에서 마우스 IgG 또는 인간 IgG를 가진 20 μg/mL 단클론성 항-myc 항체 500 μL와 혼합하였고 25℃에서 에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 커플링 반응을 50 μL의 1M Tris-HCl, pH 8.0을 추가함으로써 퀸칭(quench)하였고 미소구체를 신속하게 보텍싱하고, 원심분리하고, DPBS 1 mL로 4회 세척하여 커플링되지 않은 단백질 및 다른 반응 구성요소를 제거하였다.

C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그와 함께 발현되는 인간 LEPR 세포외 도메인 (인간 LEPR-MMH, 서열 번호: 89), C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그와 함께 발현되는 인간 LEPR CRH1 (D1) (myc-myc 헥사히스티딘 태그, 서열 번호: 89의 아미노산 209-236을 가진 인간 LEPR CRH1 (D1)-MMH, 서열 번호: 89의 아미노산 1-208), C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그와 함께 발현되는 인간 LEPR CRH1 (D1,D2) 도메인 (myc-myc 헥사히스티딘 태그, 서열 번호: 89의 아미노산 319-346을 가진 인간 LEPR CRH1 (D1,D2)-MMH, 서열 번호: 89의 아미노산 1-318), C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그와 함께 발현되는 인간 LEPR CRH1-Ig (D1,D2,D3) 도메인 (myc-myc 헥사히스티딘 태그, 서열 번호: 89의 아미노산 279-306을 가진 인간 LEPR CRH1 (D1,D2,D3)-MMH, 서열 번호: 89의 아미노산 1-278), C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그와 함께 발현되는 인간 LEPR CRH1-Ig (D2,D3) 도메인 (myc-myc 헥사히스티딘 태그, 서열 번호: 89의 아미노산 199-226을 가진 인간 LEPR CRH1-Ig (D2,D3)-MMH, 서열 번호: 89의 아미노산 1-198), C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그와 함께 발현되는 인간 LEPR Ig (D3) 도메인 (myc-myc 헥사히스티딘 태그, 서열 번호: 89의 아미노산 89-116을 가진 인간 LEPR Ig (D3)-MMH, 서열 번호: 89의 아미노산 1-88), C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그와 함께 발현되는 인간 LEPR CRH2 도메인 (myc-myc-헥사히스티딘 태그, 서열 번호: 89의 아미노산 208-235를 가진 인간 LEPR CRH2-MMH, 서열 번호: 89의 아미노산 1-207), C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그와 함께 발현되는 인간 LEPR FNIII 도메인 (myc-myc 헥사히스티딘 태그, 서열 번호: 89의 아미노산 205-232를 가진 인간 LEPR FNIII-MMH, 서열 번호: 89의 아미노산 1-204), 및 C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그와 함께 발현되는 인간 LEPR Ig-CRH2-FNIII 도메인 (myc-myc-헥사히스티딘 태그, 서열 번호: 89의 아미노산 511-538를 가진 인간 LEPR Ig-CRH2-FNIII-MMH, 서열 번호: 89의 아미노산 1-510)을 포함하여, 일과성으로 발현된 LEPR 단백질을 무 혈청 CHO-S-SFM II Medium (Thermo Fisher, Cat # 31033020)에 현탁시킨 다음 원심분리로 정화시켰다. 상기 기술된 바와 같이 제조된 고정화 항-myc 단클론성 항체를 가진 미소구체의 앨리쿼트를 각각의 이들 단백질 상층액 1 mL에 개별적으로 추가하였다. 미소구체를 부드럽게 혼합하고, 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, DPBS 1mL로 2회 세척하고, 원심분리하여 상층액을 제거하고 마지막으로 DPBS 버퍼 1mL에 재현탁시켰다. 전장 인간 LEPR 및 각각의 인간 LEPR 도메인 단백질과의 개개의 반응으로부터 항-myc IgG 커플링된 미소구체 48 μL를 회수하고 PBS + 20mg/mL BSA+0.05% 나트륨 아지드 (차단 버퍼) 3.6 mL에서 함께 혼합하였다.

혼합된 풀(pool)로부터, 미소구체 75 μL를 96 웰 필터 플레이트 (Millipore, Cat. No: MSBVN1250)의 웰마다 평판 배양하고 개개의 항- 인간 LEPR 단클론성 항체 (0.5 또는 5 μg/mL) 25 μL와 혼합하고, 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음 0.05% Tween 20이 들어있는 DPBS (세척 버퍼) 200 μL로 2회 세척하였다. 개개의 미소구체에 결합된 항-LEPR 항체 수준을 검출하고 그 양을 정량화하기 위해서, 차단 버퍼 중의 2.5 μg/mL R-피코에리트린 컨쥬게이션된 염소 F(ab')2 항-인간 카파 (Southern Biotech, Cat# 2063-09) 100 μL 또는 차단 버퍼 중의 1.25 μg/mL R-피코에리트린 AffiniPure F(ab') 100 μL 또는 차단 버퍼 중의 1.25 μg/mL R-피코에리트린 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-마우스 IgG, F(ab')2 단편 특이성 (Jackson Immunoresearch, Cat. No: 115-116-072) 100 μL를 추가하고, 25℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 30분 후, 샘플을 세척 버퍼 200 μL로 2회 세척하고 세척 버퍼 150 μL에 재현탁시켰다. 미소구체의 중간 형광 강도 (Median Fluorescence intensity; MFI)를 Luminex Analyzer에서 측정하였다.

Luminex 기반 분석의 결과를 표 17에서 표로 작성하였다. Luminex MFI 신호 강도는 9개의 본 발명의 항-LEPR 항체가 완전한 인간 LEPR 세포외 도메인에 결합했음을 나타낸다. 항-LEPR 항체 H4H18439P2 및 H4H18440P2는 인간 LEPR의 CRH1 D2 도메인 내에서 에피토프에 결합하였다. 항-LEPR 항체 H4H17322P2 및 COMP3551은 인간 LEPR은 CRH2 도메인 내에서 에피토프에 결합하였다. 항-LEPR 항체, H4H18437P2, H4H18457P2, H4H18508P2, H4H18466P2 및 H4H18462P2는 인간 LEPR의 FNIII 도메인 내에서 에피토프에 결합하였다. 항-LEPR 항체, H4H18464P2는 인간 LEPR의 Ig(D3) 도메인 내에서 에피토프에 결합하였다.

*5 μg/mL 대신에 0.5 μg/mL에서 테스트된 항체

본 발명은 본원에서 기술된 특정 구체예에 의해 범위가 제한되는 것은 아니다. 사실, 본원에서 기술된 것 외에도 본 발명의 다양한 변형이 상기 언급된 기술내용 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Gromada, Jesper Stevis, Panayiotis Altarejos, Judith <120> Antigen-Binding Proteins That Antagonize Leptin Receptor <130> 10271WO01 <140> TBD <141> 2017-11-08 <150> 62/419,062 <151> 2016-11-08 <160> 95 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgc ctctatcagc agtagtcgtt tctacggggg ctggatccgc 120 cagcccccag ggaagggtct ggagtggatt ggggatatct attatagtgg gaatacctac 180 tacaacccgt ccctccagag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gaatcagttc 240 tccctgaagc tgagctctgt gaccgccgca gacacggctg tgtattactg tgcgagacac 300 cttatgatta cgtttggggg acttatcgtc gagggttttg atatttgggg ccaagggaca 360 atggtcaccg tctcttca 378 <210> 2 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Arg Phe Tyr Gly Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Asp Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Gln Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg His Leu Met Ile Thr Phe Gly Gly Leu Ile Val Glu Gly 100 105 110 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 ggtgcctcta tcagcagtag tcgtttctac 30 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 4 Gly Ala Ser Ile Ser Ser Ser Arg Phe Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 5 atctattata gtgggaatac c 21 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 6 Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr 1 5 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 7 gcgagacacc ttatgattac gtttggggga cttatcgtcg agggttttga tatt 54 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 8 Ala Arg His Leu Met Ile Thr Phe Gly Gly Leu Ile Val Glu Gly Phe 1 5 10 15 Asp Ile <210> 9 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 9 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccgtca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctccgat caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324 <210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 10 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 11 cagagcatta gcagctat 18 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 12 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 13 gctgcatcc 9 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 14 Ala Ala Ser 1 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 15 caacagagtt acagtacccc tccgatcacc 30 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 16 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr 1 5 10 <210> 17 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Glu Trp Leu Phe His Gly Met Gly Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 19 ggattcactt tcagtagcta tggc 24 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 20 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 21 atatcatatg atggaaataa taaa 24 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 22 Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys 1 5 <210> 23 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 23 gcgaaagatc tatttttgga gtggttattt cacggtatgg gcgtc 45 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 24 Ala Lys Asp Leu Phe Leu Glu Trp Leu Phe His Gly Met Gly Val 1 5 10 15 <210> 25 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 25 cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctagtgaagc 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Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser Val Val 500 505 510 Lys Pro Leu Pro Pro Ser Asn Val Lys Ala Glu Ile Thr Val Asn Thr 515 520 525 Gly Leu Leu Lys Val Ser Trp Glu Lys Pro Val Phe Pro Glu Asn Asn 530 535 540 Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Lys Glu Ile Gln Trp 545 550 555 560 Lys Thr His Glu Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys Ser Ala Ser Leu Leu 565 570 575 Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gln Val Arg Cys Arg Arg 580 585 590 Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser Ser Pro Ala Tyr Thr 595 600 605 Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg 610 615 620 Lys Met Asp Gly Asp Val Thr Lys Lys Glu Arg Asn Val Thr Leu Leu 625 630 635 640 Trp Lys Pro Leu Thr Lys Asn Asp Ser Leu Cys Ser Val Arg Arg Tyr 645 650 655 Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr Trp Ser Glu Asp Val 660 665 670 Gly Asn Arg Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Thr Glu Pro Ala His Thr 675 680 685 Val Thr Val Leu Ala Val Asn Ser Leu Gly Ala Ser Leu Val Asn Phe 690 695 700 Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val Ser Ala Val Glu Ser 705 710 715 720 Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val Ile Leu Ser Trp Thr 725 730 735 Leu Ser Pro Asp Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu Val Ile Glu Trp Lys 740 745 750 Ile Leu Asn Glu Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu Arg Ile Pro Ser Asn 755 760 765 Val Lys Lys Phe Tyr Ile His Asp Asn Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr 770 775 780 Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Val Phe Met Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys 785 790 795 800 Ile Ile Asn Gly Phe Thr Lys Asp Ala Ile Asp Lys Gln Gln Asn Asp 805 810 815 Ala Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln 820 825 830 Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His 835 840 845 <210> 95 <211> 846 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rLEPR-mmh aa 1-818: rat LEPR (L22-G839 of NP_036728.1) aa 819-846: myc-myc-hexahistidine tag <400> 95 Leu Asn Leu Ala Tyr Pro Thr Ser Pro Trp Arg Phe Lys Leu Phe Cys 1 5 10 15 Ala Pro Pro Ser Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu Ser Pro Ala Gly Val 20 25 30 Pro Asn 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Claims

인간 렙틴 수용체 (LEPR)에 결합하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은 (a) 서열 번호:2, 서열 번호:42, 및 서열 번호: 58로 이루어진 군으로부터 선택된 서열 번호에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (HCVR)의 상보성 결정 영역 (CDR) 및 (b) 서열 번호:10에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (LCVR)의 CDR을 포함하는, 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제1 항에 있어서, 항체 또는 이것의 항원-결합 단편은
서열 번호: 12에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; 서열 번호: 14에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 서열 번호: 16에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
을 포함하는 경쇄 가변 영역;
및
(i)
서열 번호: 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
서열 번호: 6에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및
서열 번호: 8에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
(ii)
서열 번호: 44에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
서열 번호: 46에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및
서열 번호: 48에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
또는
(iii)
서열 번호: 60에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
서열 번호: 62에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및
서열 번호: 64에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제2 항에 있어서, 서열 번호: 2에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 10에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 전체 항체인 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제2 항에 있어서, 서열 번호: 42에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 10에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 전체 항체인 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제2 항에 있어서, 서열 번호: 58에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호: 10에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 전체 항체인 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항의 항체 또는 이것의 항원-결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 렙틴 신호 전달과 관련이 있거나 이것에 의해 유발되는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 질환 또는 병태는 거식증, 정신의학적 식이 장애, 악액질, 만성 신장 질환 악액질, 울혈성 심부전 악액질, 폐 악액질, 방사선 악액질, 암 악액질, 자가면역 장애, 염증성 장 질환, 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 건선, 심혈관 질환, 상승된 혈압, 우울증, 비알콜성 지방간 질환, 신경 퇴행성 장애, 우울증, 암, 간세포 암종, 흑색종 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된, 약학적 조성물.
제6 항에 있어서, 렙틴 신호 전달은 활성화 LEPR 돌연변이와 관련이 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제7 항에 있어서, LEPR 돌연변이는 LEPR Q223R인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제7 항에 있어서, 질환 또는 병태는 악액질인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제6 항에 있어서, 조성물은 제2 치료제와 치료적으로 조합되고 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 더 포함하며, 제2 치료제는 항우울증제, 식욕 자극제, 거식증 및 악액질 치료, COX-2 억제자, NSAID, 악액질 유무에 관계없이 근육량, 근육 기능 및/또는 근육 강도 손실을 반전시키기 위한 치료, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 치료, HIV/AIDS 감염 치료, TNF-알파 생산의 차단 물질, 항산화제, 종양 괴사 인자 (TNF)의 안타고니스트, B-림프구 자극 물질, 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제자, 키나아제 억제자, 및 화학치료제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제3 항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 인간 IgG4 Fc에 결합되는 것을 특징으로 하는 항체.
제4 항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 인간 IgG4 Fc에 결합되는 것을 특징으로 하는 항체.
제5 항에 있어서, 중쇄 가변 영역은 인간 IgG4 Fc에 결합되는 것을 특징으로 하는 항체.
제11 항의 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 렙틴 신호 전달과 관련이 있거나 이것에 의해 유발되는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 질환 또는 병태는 거식증, 정신의학적 식이 장애, 악액질, 만성 신장 질환 악액질, 울혈성 심부전 악액질, 폐 악액질, 방사선 악액질, 암 악액질, 자가면역 장애, 염증성 장 질환, 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 건선, 심혈관 질환, 상승된 혈압, 우울증, 비알콜성 지방간 질환, 신경 퇴행성 장애, 우울증, 암, 간세포 암종, 흑색종 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된, 약학적 조성물.
제12 항의 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 렙틴 신호 전달과 관련이 있거나 이것에 의해 유발되는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 질환 또는 병태는 거식증, 정신의학적 식이 장애, 악액질, 만성 신장 질환 악액질, 울혈성 심부전 악액질, 폐 악액질, 방사선 악액질, 암 악액질, 자가면역 장애, 염증성 장 질환, 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 건선, 심혈관 질환, 상승된 혈압, 우울증, 비알콜성 지방간 질환, 신경 퇴행성 장애, 우울증, 암, 간세포 암종, 흑색종 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된, 약학적 조성물.
제13 항의 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 렙틴 신호 전달과 관련이 있거나 이것에 의해 유발되는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 질환 또는 병태는 거식증, 정신의학적 식이 장애, 악액질, 만성 신장 질환 악액질, 울혈성 심부전 악액질, 폐 악액질, 방사선 악액질, 암 악액질, 자가면역 장애, 염증성 장 질환, 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 건선, 심혈관 질환, 상승된 혈압, 우울증, 비알콜성 지방간 질환, 신경 퇴행성 장애, 우울증, 암, 간세포 암종, 흑색종 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택된, 약학적 조성물.
제1 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은
서열 번호: 12에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
서열 번호: 14에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
서열 번호: 16에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
을 포함하는 경쇄 가변 영역;
및
서열 번호: 4에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
서열 번호: 6에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및
서열 번호: 8에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제1 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은
서열 번호: 12에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
서열 번호: 14에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
서열 번호: 16에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
을 포함하는 경쇄 가변 영역;
및
서열 번호: 44에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
서열 번호: 46에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및
서열 번호: 48에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제1 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은
서열 번호: 12에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
서열 번호: 14에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
서열 번호: 16에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3
을 포함하는 경쇄 가변 영역;
및
서열 번호: 60에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
서열 번호: 62에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및
서열 번호: 64에서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3
을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항체 또는 이것의 항원-결합 단편.
제11 항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 카파 경쇄 불변 도메인에 결합되는 것을 특징으로 하는 항체.
제12 항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 카파 경쇄 불변 도메인에 결합되는 것을 특징으로 하는 항체.
제13 항에 있어서, 경쇄 가변 영역은 카파 경쇄 불변 도메인에 결합되는 것을 특징으로 하는 항체.
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