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KR102561720B1 - 종양에 대한 직접적인 억제 효과를 갖는 인터페론의 결정 방법 및 그 용도 - Google Patents

종양에 대한 직접적인 억제 효과를 갖는 인터페론의 결정 방법 및 그 용도 Download PDF

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KR102561720B1
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Abstract

본 발명은 rSIFN-co와 대비하여 시험 인터페론의 효능을 결정하거나 비교하는 신규한 방법(인터페론은 고형 종양에 치료 효과를 가짐); 시험 인터페론과 rSIFN-co 사이의 실질적 동등성을 확립하는 방법; 뿐만 아니라 시험 인터페론의 효능을 결정하는 방법, 그러한 방법을 결정하기 위한 키트, 및 상기 활성을 가지는 인터페론 또는 인터페론 대체물을 제공한다.

Description

종양에 대한 직접적 억제 효과를 가지는 인터페론을 결정하는 방법 및 그의 용도
본 발명은 rSIFN-co와 대비하여 시험 인터페론의 효능을 결정하는 신규한 방법, 시험 인터페론과 rSIFN-co 사이의 실질적 동등성(equivalence)을 확립하는 방법, 암 세포 이동, 위족(pseudopod) 형성, 베타-카테닌(beta-catenin)/TCF 매개성 전사 활성 및 베타-카테닌 단백질 레벨을 억제하는 방법, Wnt-관련 수용체 또는 공동수용체(co-receptor)의 발현을 하향조절하는 방법, Wnt 신호전달 경로의 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법, 종양 억제 유전자를 상향조절하는 방법뿐만 아니라, 임의의 및 모든 이러한 방법의 수행을 위한 검정 키트에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 활성을 가지는 인터페론 또는 인터페론 대체물(substitute)에 관한 것이다.
슈퍼 인터페론(Super Interferon)(이하, "rSIFN-co" 또는 "SIFN-I", 고형 종양에 대한 치료 효과를 가지는 인터페론)은 미국 특허 번호 제7,364,724호(재조합 슈퍼-화합물 인터페론) 및 미국 특허 번호 제7,585,647호(재조합 인터페론을 암호화하는 핵산)에 기술되어 있다. rSIFN-co는 미국 특허 번호 제4,695,623호에 개시된 컨센서스 인터페론 알파(consensus interferon alpha)인 인퍼젠(INFERGEN)®(인터페론 알파콘-1(interferon alfacon-1))과 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 조작된 유전자 구조물(engineered gene construct)로부터 발현된다. 그러나, rSIFN-co는 인퍼젠®을 암호화하는 핵산 서열과는 상이한 신규한 핵산 서열에 의해 암호화된다. 인퍼젠®과 비교하여, rSIFN-co 단백질은 신규한 3차 구조를 가지며, 또한 개선된 생물학적 특성을 가진다.
rSIFN-co는 또한 고형 종양에 대한 직접적 억제 효과뿐만 아니라, 미국 특허 번호 제8,114,395호, 미국 특허 번호 제8,287,852호 및 미국 특허 번호 제8,425,896호에 기술되어 있는 바와 같은 항바이러스성 활성 또한 포함하는, 인퍼젠®과 비교하여 보다 광범위한 스펙트럼의 생물학적 활성을 가진다.
발명의 요약
현재 상업적으로 입수 가능한 다른 인터페론과 비교하여 rSIFN-co의 고유한 생물학적 활성 및 인간에의 사용을 위한 rSIFN-co의 잠재력을 고려하여, 예를 들어 제조 공정 동안 품질 제어의 목적으로 또는 다르게는 최종 생성물이 원하는 활성을 유지하거나 가지며 현재 상업적으로 입수 가능한 인터페론과는 다르다는 것을 보장하기 위해, rSIFN-co 및 다른 시험 인터페론의 생물학적 활성 및/또는 효능을 평가하는 방법을 제공하는 것이 바람직하다. rSIFN-co 및 소정의 활성을 가지는 인터페론 또는 인터페론 대체물의 추가 용도를 제공하는 것이 또한 바람직하다.
일 양상에서, 본 발명은 (1) 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 제공하는 단계; 및 (2) 각각 동일한 명시된 조건하에서, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 상에서의 하기 활성: (a) 어느 하나 이상의 종양보유 동물(tumor-bearing animal) 모델에서의 생체 내(in vivo) 암 세포 성장의 억제; (b) 암 세포 생존율(viability)의 감소; (c) 암 세포 이동(migration)의 억제; (d) 암 세포에서의 베타-카테닌(beta-catenin)/TCF 전자 활성의 억제; (e) 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절; (f) 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈(Survivin) 및 ID2 중 어느 하나 이상의 발현의 억제; (g) 암 세포에서의 위족(pseudopod) 형성의 억제; (h) 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; (i) A549 세포 또는 SW620 세포와 같은 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 하나 이상의 발현의 상향조절; (j) IFNα-2b와 비교하여, IFNAR1에 대한 높은 결합 친화성 및/또는 IFNAR2에 대한 낮은 결합 친화성; 및 (k) 암 세포에서의 p-STAT 발현의 상향조절에서 IFNα-2b보다 B18R에 의한 억제에 대한 낮은 감수성(susceptibility) 중 어느 하나 이상을 결정하는 단계를 포함하며, 이에 의해 통계적으로 유의한 방식으로 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)에 명시된 활성들 중 어느 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6개가 시험 인터페론에 존재한다는 것, 및/또는 (g), (h), (i), (j) 및 (k)에 명시된 활성들 중 어느 하나 이상, 예컨대 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5개가 시험 인터페론에의 존재한다는 것은 시험 인터페론과 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능을 가진다는 것, 즉 그것들은 실질적으로 동일한 유효성(effectiveness)를 가지거나 실질적으로 동일한 결과를 생성할 수 있다는 것을 의미하는 것인, rSIFN-co 또는 rSISFN-co 대체물과 대비하여 시험 인터페론의 효능을 결정하거나 비교하는 방법을 제공한다. 본원에서의 목적을 위해, "실질적으로 동일한"은 적어도 약 70% 동일한 것; 선택적으로 적어도 약 80% 동일한 것; 여전히 선택적으로 적어도 약 90% 동일한 것; 추가로 선택적으로 적어도 약 95% 동일한 것을 의미한다.
다른 양상에서, 본 발명은 (1) 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 제공하는 단계; 및 (2) 각각 동일한 명시된 조건하에서, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 상에서의 하기 활성: (a) 어느 하나 이상의 종양보유 동물 모델에서의 생체 내 암 세포 성장의 억제; (b) 암 세포 생존율의 감소; (c) 암 세포 이동의 억제; (d) 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제; (e) 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 활성의 하향조절; (f) 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 하나 이상의 발현의 억제; (g) 암 세포에서의 위족 형성의 억제; (h) 암 세포에서의 베타-카테닌의 억제; (i) A549 세포 또는 SW620 세포와 같은 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 하나 이상의 발현의 상향조절; (j) IFNα-2b와 비교하여, IFNAR1에 대한 높은 결합 친화성 및/또는 IFNAR2에 대한 낮은 결합 친화성; 및 (k) 암 세포에서의 p-STAT 발현의 상향조절에서 IFNα-2b보다 B18R에 의한 억제에 대한 낮은 감수성 중 어느 하나 이상을 결정하는 단계를 포함하며, 이에 의해 통계적으로 유의한 방식으로 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)에 명시된 활성들 중 어느 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6개가 시험 인터페론에 존재한다는 것, 및/또는 (g), (h), (i), (j) 및 (k)에 명시된 활성들 중 어느 하나 이상, 예컨대 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5 또는 6개가 시험 인터페론에 존재한다는 것은 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동등성을 가진다는 것을 의미하는 것인, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 사이의 실질적 동등성을 확립하는 방법을 제공한다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 활성을 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포, 결장암 세포, 자궁경부암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 활성을 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, SMMC-7721 세포, PANC-1 세포, SW620 세포, SPC-A4 세포, H1299 세포, H460 세포 및 HT-29 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다.
일부 실시예에서, 활성 (a), 생체 내 암 세포 성장의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 간암 세포, 자궁경부암 세포, 결장암 세포 및 폐암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 사용된 암 세포는 SMMC-7721 세포, Hela 세포, HT-29 세포, SPC-A4 세포 및 A549 세포 중 어느 하나 이상을 포함하고; 선택적으로 HT-29 세포, SPC-A4 세포 및 A549 세포 중 어느 하나 이상을 포함하고; 추가로 선택적으로 A549 세포를 포함한다. 일부 실시예에서, 생리 식염수 또는 PBS는 활성 (a)에서의 억제를 결정하는데 대조군으로서 사용된다. 일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에 투여된 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 약 0.02 mg 내지 약 0.30 mg; 선택적으로 약 0.05 mg 내지 약 0.15 mg의 범위로 투여된다. 일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에 투여된 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 격일로 투여된다. 일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에 투여된 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 약 2주 내지 약 6주; 선택적으로 약 3주 내지 약 4주 동안 투여된다.
일부 실시예에서, 활성 (b), 암 세포 생존율의 감소를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 각각 약 6.25 mcg/ml 및 약 25 mcg/ml 사이; 선택적으로 약 10 mcg/ml 및 약 18 mcg/ml 사이; 더욱 선택적으로 약 10 mcg/ml 및 약 15 mcg/ml 사이 범위의 농도에서 암 세포의 생존율의 약 50%의 감소를 야기한다. 일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 각각 적어도 약 25 mcg/ml; 선택적으로 적어도 약 50 mcg/ml; 추가로 선택적으로 적어도 약 75 mcg/ml; 더욱 선택적으로 적어도 약 100 mcg/ml 범위의 농도에서 실질적으로 검출 불가능한 수준으로 암 세포 생존율의 감소를 야기한다. 일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 농도는 약 0.2 mcg/ml 및 약 100 mcg/ml 사이 범위의 농도를 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 암 세포는 적어도 약 1일; 선택적으로 적어도 약 2일 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포, 결장암 세포, 자궁경부암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함하고; 선택적으로 폐암 세포, 결장암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, SMMC-7721 세포 및 PANC-1 세포 중 어느 하나 이상을 포함하고; 선택적으로 A549 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, SMMC-7721 세포 및 PANC-1 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다.
일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 1일 내지 약 10일; 선택적으로 약 1일 내지 약 6일 동안 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포 및 SW620 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다.
일부 실시예에서, 활성 (c), 암 세포 이동의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 간암 세포 및 결장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (c)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포 및 SW620 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (c)에서 암 세포 이동의 억제는 트렌스웰(transwell) 방법을 사용하여 결정된다. 일부 실시예에서, 활성 (c)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (c)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 선택적으로 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다.
일부 실시예에서, 활성 (d), 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (d)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, H1299 세포, H460 세포, HT-29 세포 및 SW620 세포 중 어느 하나 이상을 포함하고; 선택적으로 A549 세포, H1299 세포, H460 세포 및 SW620 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (d)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 선택적으로 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (d)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 베타-카테닌/TCF의 전사 활성은 리포터 시스템(reporter system)의 사용에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, 리포터 시스템은 탑플래쉬(TOPFlash) 또는 pSV40-RL 플라스미드를 포함한다.
일부 실시예에서, 활성 (e), 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절을 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (e)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, H460 세포, SW620 세포 및 HT-29 세포 중 어느 하나 이상을 포함하며; 선택적으로 A549 세포, SW620 세포 및 HT-29 세포 중 어느 하나 이상을 포함하며; 더욱 선택적으로 HT-29를 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (e)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 선택적으로 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (e)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (e)를 결정하는데 있어서, LRP6 및/또는 FZD6의 발현은 LRP6 및/또는 FZD6의 mRNA 레벨을 결정함으로써 결정된다.
일부 실시예에서, 활성 (f), Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 하나 이상의 발현의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포를 포함하며; 선택적으로 A549 세포를 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (f)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 선택적으로 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (f)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (f)를 결정하는데 있어서, Axin2, CD24, 서바이빈 및/또는 ID2의 발현은 그것의 상응하는 mRNA 레벨을 결정함으로써 결정된다. 일부 실시예에서, 활성 (f)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 대조군과 비교하여 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 하나 이상의 발현을 적어도 약 30%; 선택적으로 적어도 약 40%; 더욱 선택적으로 적어도 약 50%; 여전히 더욱 선택적으로 적어도 약 60% 감소시키는 경우, 상기 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 실질적으로 동일한 효능 또는 실질적 동등성을 가지는 것으로 간주된다.
일부 실시예에서, 활성 (g), 위족 형성의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포; 선택적으로 A549 세포를 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (g)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 4일; 선택적으로 적어도 약 8일 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 활성 (g)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다.
일부 실시예에서, 활성 (h), 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (h)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포 및 SW480 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (h)를 결정하는데 있어서, 베타-카테닌 발현의 억제는 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, 활성 (h)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 48시간; 선택적으로 적어도 약 72시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (h)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다.
일부 실시예에서, 활성 (i), 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 하나 이상의 발현의 상향조절을 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (i)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, H460 세포, SW620 세포 및 HT-29 세포 중 어느 하나 이상을 포함하며; 선택적으로 A549 세포 및 SW620 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (i)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 선택적으로 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (i)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (i)를 결정하는데 있어서, DKK-3, KLF-4 및/또는 BATF2의 발현은 그것의 상응하는 mRNA 레벨을 결정함으로써 결정된다.
일부 실시예에서, 활성 (j)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 IFNα-2b와 비교하여 IFNAR1에 대해 적어도 약 2배; 선택적으로 적어도 약 3배; 더욱 선택적으로 적어도 약 4배; 여전히 더욱 선택적으로 적어도 약 4.5배, 예컨대 4.72배 높은 결합 친화성을 가질 때, 상기 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 실질적으로 동일한 효능 또는 실질적 동등성을 가지는 것으로 간주된다. 일부 실시예에서, 활성 (j)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 IFNα-2b와 비교하여 IFNAR2에 대해 적어도 약 5배; 선택적으로 적어도 약 7배; 더욱 선택적으로 적어도 약 9배; 여전히 더욱 선택적으로 적어도 약 11배, 예컨대 11.9배 낮은 결합 친화성을 가질 때, 상기 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 실질적으로 동일한 효능 또는 실질적 동등성을 가지는 것으로 간주된다. 일부 실시예에서, 활성 (j)를 결정하는데 있어서, IFNAR1 및/또는 IFNAR2에 대한 IFNα-2b, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 결합 친화성(binding affinity)은 그것의 해리 상수(dissociation constant, KD)를 결정함으로써 결정된다.
일부 실시예에서, 활성 (k)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포 및 Hela 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (k)를 결정하는데 있어서, IFNα-2b, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 암 세포를 접촉시키기 전 약 5 ng/ml 내지 약 20 ng/ml의 범위, 선택적으로 약 10 ng/ml의 B18R과 함께 배양된다. 일부 실시예에서, 활성 (k)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 IFNα-2b와 비교하여 암 세포에서의 p-STAT 발현의 상향조절에서 B18R에 의한 억제에 대한 낮은 감수성을 가지는 경우, 상기 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 실질적으로 동일한 효능 또는 실질적 동등성을 가지는 것으로 간주된다. 일부 실시예에서, 활성 (k)를 결정하는데 있어서, p-STAT 발현의 상향조절은 웨스턴 블롯에 의해 결정된다.
일부 실시예에서, 통계적 유의성(statistical significance)은 대조군과 비교하는 경우에, 0.05 이하, 또는 0.01 이하, 또는 0.005 이하, 또는 0.001 이하, 또는 0.0005 이하, 또는 0.0001 이하의 p 값을 의미한다.
일부 실시예에서, 대조군은 시험 인터페론 또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리되지 않은 것, 또는 생리 식염수 또는 PBS로 처리된 것, 또는 IFNα-2b로 처리된 것이고, 또는 대조군은 비처리 대조군(모의(Mock))이다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) 복수의 농도의 시험 인터페론을 제공하는 단계; (b) 명시된 조건하에서, 복수의 농도의 시험 인터페론을 사용하여 제1 암 세포세트의 생존율에 대한 시험 인터페론의 제1 용량 반응(dose response)을 결정하는 단계; (c) 복수의 농도의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 제공하는 단계; (d) 동일한 명시된 조건하에서, 복수의 농도의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 사용하여 제2 암 세포 세트의 생존율에 대한 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 제2 용량 반응을 결정하는 단계; 및 (e) 제1 용량 반응을 제2 용량 반응과 비교하는 단계를 포함하는, 화합물, 예컨대 시험 인터페론의 효능을 결정하거나 비교하는 방법을 제공한다. 이러한 방식으로, rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물과 대비하여 화합물, 예컨대 시험 인터페론의 효능이 결정된다.
일부 실시예에서, rSIFN-co는 명시된 특정 활성을 포함하고, 특정 활성은 약 4 × 108 IU/mg 내지 약 1 × 109 IU/mg 사이의 범위에 있다. 일부 실시예에서, 특정 활성은 약 4.4 × 108 IU/mg 내지 약 9 × 108 IU/mg 사이의 범위에 있다. 일부 실시예에서, 특정 활성은 약 5 × 108 IU/mg 내지 약 8 × 108 IU/mg 사이의 범위에 있다. 일부 실시예에서, 특정 활성은 약 6 × 108 IU/mg 내지 약 7.5 × 108 IU/mg 사이의 범위에 있다. 선택적으로, 특정 활성은 약 4 × 108 IU/mg 내지 5 × 108 IU/mg 사이의 범위에 있다.
일부 실시예에서, 화합물의 효능을 결정하거나 비교하는 방법에 있어서, 시험 인터페론 또는 rSIFN-co의 농도는 약 0.2 mcg/ml 및 약 100 mcg/ml 사이의 범위에 있다. 일부 실시예에서, 시험 인터페론 또는 rSIFN-co의 농도는 하기 중 적어도 2 이상이다: 0.2 mcg/ml, 0.39 mcg/ml, 0.78 mcg/ml, 1.56 mcg/ml, 3.13 mcg/ml, 6.25 mcg/ml, 12.5 mcg/ml, 25 mcg/ml, 50 mcg/ml 및 100 mcg/ml.
일부 실시예에서, 암 세포는 적어도 약 20시간, 선택적으로 적어도 약 24시간, 여전히 선택적으로 적어도 약 48시간 및 더욱 선택적으로 적어도 약 72시간 동안 시험 인터페론 또는 rSIFN-co로 처리된다.
일부 실시예에서, 본 발명은 rSIFN-co는 암 세포의 유형에 따라 약 6.25 mcg/ml 및 약 25 mcg/ml 사이 범위의 농도에서 암 세포 생존율을 50% 감소시킬 수 있는 효능을 가지는 것인, 본원에 기술된 것과 같은 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, rSIFN-co는 약 6.25 mcg/ml 및 12.5 mcg/ml 사이 범위의 농도에서 세포의 생존율을 50%로 감소시킬 수 있다. 다른 실시예에서, rSIFN-co는 12.5 mcg/ml 및 25 mcg/ml 사이 범위의 농도에서 세포 생존율을 50% 감소시킬 수 있다. 일부 실시예에서, rSIFN-co의 IC50은 약 10 mcg/ml 내지 약 18 mcg/ml, 선택적으로 약 10 mcg/ml 내지 약 15 mcg/ml의 범위에 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) 복수의 암 세포를 제공하는 단계; (b) 명시된 조건하에서, 제1 생존율 데이터 세트를 생성하기 위해 일정량의 시험 인터페론으로 제1 암 세포 세트를 시험하는 단계; (c) 동일한 명시된 조건하에서, 제2 생존율 데이터 세트를 생성하기 위해 일정량의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 제2 암 세포 세트를 처리하는 단계; 및 (d) 제1 생존율 데이터 세트를 제2 생존율 데이터 세트와 비교하는 단계를 포함하며, 이에 의해 시험 인터페론의 효능이 결정되는 것인, rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물과 대비하여 화합물, 예컨대 시험 인터페론의 효능을 결정하거나 비교하는 방법을 제공한다.
일부 실시예에서, 암 세포는 약 1일 내지 약 6일 동안 처리된다. 일부 실시예에서, rSIFN-co는 약 6.25 mcg/ml 내지 약 50 mcg/ml; 선택적으로 7 mcg/ml 내지 약 25 mcg/ml; 추가로 선택적으로 약 8 mcg/ml 내지 약 12.5 mcg/ml; 여전히 선택적으로 약 10 mcg/ml의 농도로 사용된다. 일부 실시예에서, rSIFN-co는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml 범위의 농도로 사용된다. 일부 실시예에서, rSIFN-co는 명시된 특정 활성을 포함한다.
일부 실시예에서, 본원에서 사용된 암 세포는 인간 종양 세포 및 동물 종양 세포 중에서 선택된다. 일부 실시예에서, 종양 세포는 폐 종양 세포, 또는 자궁경부 종양 세포, 또는 간 종양 세포, 또는 결장 종양 세포, 또는 유방 종양 세포, 또는 췌장 종양 세포, 또는 전립선 종양 세포, 또는 바이러스-유발(viral-induced) 종양 세포, 또는 바이러스에 의해 변형된(virally transformed) 세포이다. 일부 실시예에서, 암 세포는 A549 세포, SPC-A4 세포, Calu-1 세포, CL-1 세포, H460 세포, H1299 세포, Hela 세포, HT-29 세포, Huh-7 세포, MDA-MB-231 세포, PANC-1 세포, RAW264.7 세포, SMMC-7721 세포, SW480 세포 및 SW620 세포 중 적어도 하나로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 시험 인터페론은 또한 rSIFN-co와는 상이한 제조 로트(lot)로부터 수득된 인터페론을 포함한 인터페론이다. 일부 실시예에서, 시험 인터페론의 아미노산 서열은 rSIFN-co의 아미노산 서열(서열번호 1)에 대해 적어도 90%, 선택적으로 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 동일하다. 일부 실시예에서, 시험 인터페론을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 rSIFN-co를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)에 대해 적어도 90%, 선택적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 동일하다. 일부 실시예에서, 시험 인터페론 및 rSINF-co는 동일한 아미노산 서열(서열번호 1)을 가지며, 동일한 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)에 의해 암호화된다. 일부 실시예에서, 시험 인터페론 및 rSIFN-co는 실질적으로 동일한 특정 활성을 가진다. 일부 실시예에서, 특정 활성은 약 4 × 108 IU/mg 내지 약 1 × 109 IU/mg 사이의 범위에 있다. 일부 실시예에서, 시험 인터페론은 서열번호 2에 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열을 E. coli 내로 도입하는 것을 포함하는 과정에 의해 얻어질 수 있다. 일부 실시예에서, 시험 인터페론은 E. coli 숙주 내에서, 선택적으로 E. coli 숙주 내에서 프로모터 PBAD의 제어하에, 폴리뉴클레오티드(서열번호 2)의 발현에 의해 제조된다.
다른 양상에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 세포 이동이 억제되는 것인, 세포 이동, 예컨대 종양 전이에서 발생하는 세포 이동을 억제하는 방법을 제공한다.
일부 실시예에서, 유효량의 rSIFN-co는 약 5 mcg/ml 내지 약 100 mcg/ml; 선택적으로 약 8 mcg/ml 내지 약 50 mcg/ml; 여전히 선택적으로 약 10 mcg/ml 내지 약 25 mcg/ml; 추가로 선택적으로 약 12 mcg/ml 내지 약 18 mcg/ml을 포함한다. 일부 실시예에서, 유효량의 rSIFN-co는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml; 선택적으로 10 mcg/ml을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 암 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 위족 형성이 억제되는 것인, 암 세포에서 위족 형성을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 유효량의 rSIFN-co는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml; 선택적으로 약 10 mcg/ml을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하는, 세포에서의 베타-카테닌/TCF-매개성 전사 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 베타-카테닌/TCF-매개성 전사 활성은 리포터 시스템, 선택적으로 루시페라아제(luciferase) 리포터 시스템을 사용하여 결정된다. 일부 실시예에서, 리포터 시스템은 탑플래쉬 리포터이다. 일부 실시예에서, 플라스미드 pSV40-RL이 사용된다.
다른 양상에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하는, 세포에서 베타-카테닌 단백질 레벨을 감소시키는 방법을 추가적으로 제공한다. 일부 실시예에서, 베타-카테닌의 단백질 레벨은 그것의 특정 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 검출된다. 일부 실시예에서, GAPDH는 대조군으로서 사용된다.
다른 양상에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 Wnt-관련 수용체 또는 공동수용체가 하향조절되는 것인, 세포에서의 Wnt-관련 수용체 또는 공동수용체의 발현을 하향조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, Wnt-관련 수용체 또는 공동수용체는 LRP 단백질, 예컨대 LRP6을 포함한다. 일부 실시예에서, Wnt-신호전달 수용체 또는 공동수용체는 FZD 단백질, 예컨대 FZD6을 포함한다. 일부 실시예에서, Wnt-관련 수용체 또는 공동수용체의 발현을 결정하는 것은 이러한 수용체 또는 공동수용체의 mRNA 레벨을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 mRNA 레벨을 결정하기 위해 이러한 mRNA에 상응하는 cDNA가 제조된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 세포에서 Wnt-신호전달 경로의 적어도 하나의 표적 유전자를 포함하는 특정 유전자의 발현을 억제하는 방법, 예컨대 표적 유전자가 과 활성화(over-active)된 질병 또는 상태의 치료를 위한 방법을 제공한다. 이러한 하향조절된 유전자는 Axin2, CD24, 서바이빈 및/또는 ID2를 포함한다. 상기 방법은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 표적 유전자의 발현이 억제된다.
본 발명의 일부 실시예에서, rSIFN-co에의 세포의 노출에 대해 명시된 기간은 적어도 약 12시간; 선택적으로 적어도 약 20시간; 추가로 선택적으로 적어도 약 24시간; 더욱 선택적으로 적어도 약 36시간; 여전히 선택적으로 적어도 약 48시간; 또한 여전히 선택적으로 적어도 약 72시간이다. 일부 실시예에서, rSIFN-co로 처리되는 세포는 암 세포이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 적어도 하나의 종양 억제 유전자 발현의 상향조절이 일어나는 것인, 세포에서 적어도 하나의 종양 억제 유전자를 포함하는 특정 유전자의 발현을 상향조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 상향조절된 유전자는 DKK3, KLF4 및 BATF2 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 실시예에서, 상향조절된 유전자의 발현은 이러한 mRNA 레벨을 측정함으로써 결정된다. 일부 실시예에서, cDNA가 이와 같은 mRNA로부터 합성되고, 이러한 측정 목적을 위해 선택적으로 증폭된다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) 어느 하나 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체 내 암 세포 성장의 억제; (b) 암 세포 생존율의 감소; (c) 암 세포 이동의 억제; (d) 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제; (e) 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6 발현의 하향조절; (f) 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 하나 이상의 발현의 억제; (g) 암 세포에서의 위족 형성의 억제; (h) 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; (i) 암 세포에서 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 하나 이상의 발현의 상향조절; (j) IFNα-2b와 비교하여, IFNAR1에 대한 높은 결합 친화성 및/또는 IFNAR2에 대한 낮은 결합 친화성; 및 (k) 암 세포에서의 p-STAT의 상향조절에서 IFNα-2b보다 B18R에 의한 억제에 대한 낮은 감수성 중 적어도 하나, 선택적으로 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 활성을 비교하고, 실질적으로 동일한 반응을 제시하는 것을 포함하는, 상기 활성에서의 시험 화합물과 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 사이의 실질적 동등성을 확립하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 본 발명은 상기 언급된 활성 중 적어도 2개에 있어서 실질적 동등성을 확립하는 것을 제공하고; 선택적으로 본 발명은 상기 언급된 활성 중 적어도 3개; 선택적으로 상기 언급된 활성 중 적어도 4개; 여전히 선택적으로 상기 언급된 활성 중 적어도 5개; 추가로 선택적으로 상기 언급된 활성 중 적어도 6개; 여전히 추가로 선택적으로 상기 언급된 활성 중 적어도 7개, 또는 8개, 또는 9개, 또는 10개, 또는 11개에 있어서 실질적 동등성을 확립하는 것을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 및 (b) 본원에 기술된 방법 중 하나 이상을 수행하기 위한 설명서 및 이러한 방법을 수행하기 위한 시약 중 적어도 하나를 포함하는, 적어도 하나의 Wnt-관련 표적 유전자의 발현을 억제, 종양 억제 유전자의 상향조절, 및/또는 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절에 대한 시험 인터페론의 효능을 평가하기 위한 검정 키트를 제공한다. 상기 시약은 인산완충용액(PBS) 또는 완충액을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 검정 키트에서의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 명시된 특정 활성을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 어느 하나 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체 내 암 세포 성장의 억제; 암 세포 생존율의 감소; 암 세포에서의 암 세포 이동의 억제, 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제; 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6의 발현의 하향조절; 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 하나 이상의 발현의 억제; 암 세포에서의 위족 형성의 억제; 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 하나 이상의 발현의 상향조절; IFNα-2b와 비교하여, IFNAR1에 대한 높은 결합 친화성 및/또는 IFNAR2에 대한 낮은 결합 친화성; 및 암 세포에서의 p-STAT 발현의 상향조절에서 IFNα-2b보다 B18R에 의한 억제에 대한 낮은 감수성으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 활성, 선택적으로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 활성을 포함하는, 인터페론 또는 인터페론 대체물을 제공하며, 여기에서 상기 인터페론 또는 인터페론 대체물은 rSIFN-co가 아니다.
정의
달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 과학 및 기술 용어는 통상의 기술자에 의해 그들에게 주어진 의미 또는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해하는 의미를 가질 것이다.
추가로, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수의 대상을 포함할 것이고, 복수 용어는 단수의 대상을 포함할 것이다.
또한, 본원에 사용된 용어 "또는"은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "화합물"은 임의의 단백질(임의의 항체, 임의의 활성 항체 단편 및 임의의 이량체 또는 다량체 단백질을 포함), 폴리펩티드, 소분자 및 하나 이상의 생물학적 활성을 가지는 다른 분자를 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "상태" 및 "질병"은 질병, 감염, 염증, 암, 치료에 의해 유발된 부작용, 또는 대상체에서의 불량한 건강상태의 다른 원인을 나타내기 위해 상호교환적으로 또는 함께 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은 목적하는 효과를 생성하는, 예컨대, 세포 생존율의 감소, 단백질의 발현 또는 활성의 하향조절 또는 상향조절, 또는 질병 또는 상태의 치료를 위한 양을 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "실질적 동등성을 확립하는 것"은 특정 시험 또는 시험을 실시하여 실험 오차의 한계(예컨대, ± 표준편차(SD)) 내에서 실질적으로 동일한 수준의 반응, 활성, 유효성 또는 결과를 입증하는 것을 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 동일한"은 적어도 약 70% 동일; 선택적으로 적어도 약 80% 동일; 여전히 선택적으로 적어도 약 90% 동일; 추가로 선택적으로 적어도 약 95% 동일함을 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "약 ~의 범위" 또는 "약 ~내지~사이의 범위"는 범위 플러스 모든 단위로 명시된 수 및 이러한 명시된 범위 사이의 소수점을 의미할 것이다. 예를 들어, "약 4 × 108 IU/mg 내지 약 5 × 108 IU/mg 사이의 범위"는 4 × 108 IU/mg, 4.1 × 108 IU/mg, 4.2 × 108 IU/mg, 4.3 × 108 IU/mg, 4.4 × 108 IU/mg 등을 포함할 것이고, "8 mcg/ml 내지 20 mcg/ml"은 8 mcg/ml, 10 mcg/ml 등을 포함할 것이다.
본원에 사용된 용어 "포함한다" 또는 "포함하는"은 비-제한적으로 해석될 것이고, 명시된 요소들뿐만 아니라 명시되지 않은 요소 또한 구현한다.
본원에 사용된 용어 "인터페론" 또는 "IFN"은 "컨센서스 인간 백혈구 인터페론"이라는 제목의 미국 특허 번호 제4,695, 623호에 기술된 것과 같은 컨센서스 인터페론 알파뿐만 아니라 rSIFN-co 또한 포함하는, 임의의 자연 발생적인 또는 인공적으로 생성된 인터페론을 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "인터페론 활성"은 자연 발생적인 인터페론 및 rSIFN-co를 특징짓는 하나 이상의 생물학적 활성, 예컨대 항-종양 활성 및/또는 항-바이러스 활성을 의미할 것이다.
본원에 사용된 용어 "rSIFN-co"는 문맥상 의미하는 바에 따라, 미국 특허 번호 제7.364,724호, 미국 특허 번호 제7,585,647호에 기술된 것과 같은 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 핵산 분자, 또는 그것의 활성 단편을 의미할 것이다. 상기 미국 특허 번호 제7,364,724호, 미국 특허 번호 제7,585,647호에 기술된 것과 같은 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 하기와 같다:
Figure 112018004064816-pct00001
Figure 112018004064816-pct00002
Figure 112018004064816-pct00003
Figure 112018004064816-pct00004
Figure 112018004064816-pct00005
Figure 112018004064816-pct00006
Figure 112018004064816-pct00007
Figure 112018004064816-pct00008
Figure 112018004064816-pct00009
Figure 112018004064816-pct00010
본원에 사용된 용어 "rSIFN-co 대체물"은 그것의 효능이 rSIFN-co에 대해 측정되었거나 측정되어, 시험 화합물의 효능 또는 활성의 결정에 있어서 비교의 목적으로 rSIFN-co 대신 사용될 수 있는 임의의 화합물을 의미할 것이다. rSIFN-co 대체물은 인터페론 또는 인터페론 특성을 가지는 화합물일 수 있다.
본원에 사용된, 특정 활성은 생물학적 활성 및 단백질의 함량의 비이다. 생물학적 활성은 관련 기술분야에서 통상적인 것으로서 임의의 관련 생물학적 활성, 예컨대 문헌 [Appendix X C in Chinese Pharmacopoeia (the 3rd book), 2010 edition]에서 공개된 세포 병변 억제 방법(cell lesion inhibition method)에 의해 측정된 생물학적 활성일 수 있다. 단백질 함량은 관련 기술분야에서 통상적인 임의의 방법, 예컨대 문헌 [Appendix X C in Chinese Pharmacopoeia (the 3rd book), 2010 edition]에서 공개된 로우리법(Lowry method)에 의해 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 질병의 완전한 또는 부분적인 치유(cure)를 일으키는 것, 질병을 정지 또는 비-진행을 유도하는 것, 질병 또는 증상의 중증도를 개선하거나 감소시키는 것, 질병의 재발을 방지하는 것, 질병의 재발 빈도를 감소시키는 것, 질병의 부작용을 감소시키는 것, 질병을 완화시키는 것, 건강이 개선된 일반적인 느낌을 생성하는 것을 포함할 것이다.
용어 "Wnt-관련 수용체 또는 공동수용체"는 개별적으로 또는 함께 Wnt 패밀리 단백질에 결합하여 세포 내 정규(canonical) Wnt 신호전달 경로 또는 비정규(non-canonical) Wnt 신호전달 경로에서 신호전달을 개시시키는 하나 이상의 분자를 포함할 것이다. 이 용어는, 예를 들어 Wnt-공동수용체인 DKK1 및 Wnt-4 리간드에 대한 수용체인 것으로 여겨지는, 저밀도 지질단백질 수용체-관련 단백질 6인 LRP6를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "Wnt 신호전달 활성"은 프리즐드(Frizzled, FZD) 패밀리 수용체 및 LRP5/LRP6 공동수용체에의 결합을 통해 전달되는 Wnt 신호전달 캐스케이드를 지칭하며, 이는 베타-카테닌의 방출 및 세포 활성화를 위한 그것의 핵 내로의 이동으로 이어진다.
본원에 사용된 용어 "IFNAR1"은 문헌 [Uze et al., Cell, 60: 225-234 (1990)]의 229 페이지 도 5에 나타난 바와 같은 409개 잔기의 세포외 도메인, 21개 잔기의 막관통 도메인 및 100개 잔기의 세포내 도메인을 포함하는, Uze 등에 의해 클로닝된 557개 아미노산 수용체 단백질을 지칭한다. 일부 실시예에서, 앞서 언급한 용어는 IFNAR1의 세포외 도메인(EC 또는 ECD)(또는 EC 또는 ECD의 단편)을 포함하는 IFNAR1의 단편을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "IFNAR2"는 문헌 [Domanski et al., J. Biol. Chem., 37: 21606-21611 (1995)]의 21608 페이지 도 1에 나타난 바와 같이 217개 잔기의 세포외 도메인, 21개 잔기의 막관통 도메인 및 250개 잔기의 세포내 도메인을 포함하는, Domanski 등에 의해 클로닝된 515개 아미노산 수용체 단백질을 지칭한다. 일부 실시예에서, 앞서 말한 용어는 IFNAR2의 세포외 도메인(EC 또는 ECD)(또는 EC 또는 ECD의 단편)을 포함하는 IFNAR2의 단편을 포함한다.
본 발명의 발명자들은 본원에서 rSIFN-co의 투여 또는 처리에 의해 발생하는 특정 생물학적 효과를 발견하였으며, 이들 생물학적 효과는, 특히 제조 공정 동안 효능면에서 일관성이 요구되는 경우에 또는 약물 개발 과정에서 효능면에서 개선이 추구되는 경우에, rSIFN-co 및 유사한 특성을 가질 수 있는 다른 화합물의 효능을 평가하는데 사용될 수 있다. 본 발명자들은 추가로 rSIFN-co를 이용한 처리 시 지금까지 알려지지 않은 특정 생물학적 효과를 발견하였으며, 이러한 생물학적 효과는 특정 유전자의 상향조절 또는 하향조절이 바람직한 다른 상태 또는 질병의 치료를 위한 것을 포함하여, rSIFN-co의 추가 용도를 위해 사용될 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 (1) 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 제공하는 단계; 및 (2) 각각 동일한 명시된 조건하에서, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 하기 활성: (a) 어느 하나 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체 내 암 세포 성장의 억제; (b) 암 세포 생존율의 감소; (c) 암 세포 이동의 억제; (d) 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제; (e) 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6 발현의 하향조절; (f) 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 하나 이상의 발현의 억제; (g) 암 세포에서의 위족 형성의 억제; (h) 암 세포에서의 베타-카테닌의 억제; (i) A549 세포 또는 SW620 세포와 같은 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 하나 이상의 발현의 상향조절; (j) IFNα-2b와 비교하여, IFNAR1에 대한 높은 결합 친화성 및/또는 IFNAR2에 대한 낮은 결합 친화성; 및 (k) 암 세포에서의 p-STAT 발현의 상향조절에서 IFNα-2b보다 B18R에 의한 억제에 대한 낮은 감수성 중 어느 하나 이상을 결정하는 단계를 포함하며, 이에 의해 통계적으로 유의한 방식으로 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)에 명시된 활성들 중 어느 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6개가 시험 인터페론에 존재한다는 것, 및/또는 (g), (h), (i), (j) 및 (k)에 명시된 활성들 중 어느 하나 이상, 예컨대 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5개가 시험 인터페론에 존재한다는 것은 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능을 가진다는 것을 의미하는 것인, rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물과 대비하여 시험 인터페론의 효능을 결정하거나 비교하는 방법을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 (1) 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 제공하는 단계; 및 (2) 각각 동일한 명시된 조건하에서, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 하기 활성: (a) 어느 하나 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체 내 암 세포 성장의 억제; (b) 암 세포 생존율의 감소; (c) 암 세포 이동의 억제; (d) 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제; (e) 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6 발현의 하향조절; (f) 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 하나 이상의 발현의 억제; (g) 암 세포에서의 위족 형성의 억제; (h) 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; (i) A549 세포 또는 SW620 세포와 같은 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 하나 이상의 발현의 상향조절; (j) IFNα-2b와 비교하여, IFNAR1에 대한 높은 결합 친화성 및/또는 IFNAR2에 대한 낮은 결합 친화성; 및 (k) 암 세포에서의 p-STAT 발현의 상향조절에서 IFNα-2b보다 B18R에 의한 억제에 대한 낮은 감수성 중 어느 하나 이상을 결정하는 단계를 포함하며, 이에 의해 통계적으로 유의한 방식으로 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)에 명시된 활성들 중 어느 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5, 또는 6개가 시험 인터페론에 존재한다는 것, 및/또는 (g), (h), (i), (j) 및 (k)에 명시된 활성들 중 어느 하나 이상, 예컨대 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5 또는 6개가 시험 인터페론에 존재한다는 것은 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동등성을 가진다는 것을 의미하는 것인, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 사이의 실질적 동등성을 확립하는 방법을 제공한다. 선택적으로, 모든 시험 인터페론의 처리 또는 투여 시, 예컨대 A549 세포, H1299 세포, H460 세포 및 HT-29 세포 중 어느 하나 이상에서 통계적으로 유의한 방식으로 베타-카테닌/TCF의 전사 활성의 억제와 함께 예컨대, A549 세포 및/또는 SW620 세포에서 시험관 내(in vitro) 종양 세포 생존율의 감소가 존재한다는 것, 및 선택적으로 JAK/STAT 신호전달이 추가적으로 존재한다는 것은 시험 인터페론 및 rSIFN-co 사이의 실질적 동등성을 나타낸다. 추가로 선택적으로, 세포 생존율의 결정은 적절한 세포를 약 1 내지 약 6시간 동안 예를 들어, 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론으로 처리하여 실시할 수 있다. 선택적으로, 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제는 A549, H1299, H460 또는 HT-29의 암 세포들 중 어느 하나 이상에서, 예를 들어 이들 세포를 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론으로 약 24시간 동안 처리하는 것에 의해 결정된다. 선택적으로, JAK/STAT 신호전달은 예컨대 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론으로 다양한 시간, 예컨대 약 5, 15, 30, 60, 120 및/또는 240분 동안 A549 세포 또는 Hela 세포의 처리 시 STAT1, STAT2 및/또는 STAT3과 같은 STAT 단백질의 인산화의 존재를 결정함으로써 결정된다.
일부 실시예에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건하에서 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 활성 중 적어도 2개, 예컨대 (a) 및 (b); (a) 및 (c); (a) 및 (d); (a) 및 (e); (a) 및 (f); (a) 및 (g); (a) 및 (h); (a) 및 (i); (a) 및 (j); (a) 및 (k); (b) 및 (c); (b) 및 (d); (b) 및 (e); (b) 및 (f); (b) 및 (g); (b) 및 (h); (b) 및 (i); (b) 및 (j); (b) 및 (k); (c) 및 (d); (c) 및 (e); (c) 및 (f); (c) 및 (g); (c) 및 (h); (c) 및 (i); (c) 및 (j); (c) 및 (k); (d) 및 (e); (d) 및 (f); (d) 및 (g); (d) 및 (h); (d) 및 (i); (d) 및 (j); (d) 및 (k); (e) 및 (f); (e) 및 (g); (e) 및 (h); (e) 및 (i); (e) 및 (j); (e) 및 (k); (f) 및 (g); (f) 및 (h); (f) 및 (i); (f) 및 (j); (f) 및 (k); (g) 및 (h); (g) 및 (i); (g) 및 (j); (g) 및 (k); (h) 및 (i); (h) 및 (j); (h) 및 (k); (i) 및 (j); (i) 및 (k); (j) 및 (k)가 결정된다.
일부 실시예에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건하에서 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 활성 중 적어도 3개, 예컨대, (a), (b) 및 (c); (a), (b) 및 (d); (a), (b) 및 (e); (a), (b) 및 (f); (a), (b) 및 (g); (a), (b) 및 (h); (a), (b) 및 (i); (a), (b) 및 (j); (a), (b) 및 (k); (a), (c) 및 (d); (a), (c) 및 (e); (a), (c) 및 (f); (a), (c) 및 (g); (a), (c) 및 (h); (a), (c) 및 (i); (a), (c) 및 (j); (a), (c) 및 (k); (a), (d) 및 (e); (a), (d) 및 (f); (a), (d) 및 (g); (a), (d) 및 (h); (a), (d) 및 (i); (a), (d) 및 (j); (a), (d) 및 (k); (a), (e) 및 (f); (a), (e) 및 (g); (a), (e) 및 (h); (a), (e) 및 (i); (a), (e) 및 (j); (a), (e) 및 (k); (a), (f) 및 (g); (a), (f) 및 (h); (a), (f) 및 (i); (a), (f) 및 (j); (a), (f) 및 (k); (a), (g) 및 (h); (a), (g) 및 (i); (a), (g) 및 (j); (a), (g) 및 (k); (a), (h) 및 (i); (a), (h) 및 (j); (a), (h) 및 (k); (a), (i) 및 (j); (a), (i) 및 (k); (a), (j) 및 (k); (b), (c) 및 (d); (b), (c) 및 (e); (b), (c) 및 (f); (b), (c) 및 (g); (b), (c) 및 (h); (b), (c) 및 (i); (b), (c) 및 (j); (b), (c) 및 (k); (b), (d) 및 (e); (b), (d) 및 (f); (b), (d) 및 (g); (b), (d) 및 (h); (b), (d) 및 (i); (b), (d) 및 (j); (b), (d) 및 (k); (b), (e) 및 (f); (b), (e) 및 (g); (b), (e) 및 (h); (b), (e) 및 (i); (b), (e) 및 (j); (b), (e) 및 (k); (b), (f) 및 (g); (b), (f) 및 (h); (b), (f) 및 (i); (b), (f) 및 (j); (b), (f) 및 (k); (b), (g) 및 (h); (b), (g) 및 (i); (b), (g) 및 (j); (b), (g) 및 (k); (b), (h) 및 (i); (b), (h) 및 (j); (b), (h) 및 (k); (b), (i) 및 (j); (b), (i) 및 (k); (b), (j) 및 (k); (c), (d) 및 (e); (c), (d) 및 (f); (c), (d) 및 (g); (c), (d) 및 (h); (c), (d) 및 (i); (c), (d) 및 (j); (c), (d) 및 (k); (c), (e) 및 (f); (c), (e) 및 (g); (c), (e) 및 (h); (c), (e) 및 (i); (c), (e) 및 (j); (c), (e) 및 (k); (c), (f) 및 (g); (c), (f) 및 (h); (c), (f) 및 (i); (c), (f) 및 (j); (c), (f) 및 (k); (c), (g) 및 (h); (c), (g) 및 (i); (c), (g) 및 (j); (c), (g) 및 (k); (c), (h) 및 (i); (c), (h) 및 (j); (c), (h) 및 (k); (c), (i) 및 (j); (c), (i) 및 (k); (c), (j) 및 (k); (d), (e) 및 (f); (d), (e) 및 (g); (d), (e) 및 (h); (d), (e) 및 (i); (d), (e) 및 (j); (d), (e) 및 (k); (d), (f) 및 (g); (d), (f) 및 (h); (d), (f) 및 (i); (d), (f) 및 (j); (d), (f) 및 (k); (d), (g) 및 (h); (d), (g) 및 (i); (d), (g) 및 (j); (d), (g) 및 (k); (d), (h) 및 (i); (d), (h) 및 (j); (d), (h) 및 (k); (d), (i) 및 (j); (d), (i) 및 (k); (d), (j) 및 (k); (e), (f) 및 (g); (e), (f) 및 (h); (e), (f) 및 (i); (e), (f) 및 (j); (e), (f) 및 (k); (e), (g) 및 (h); (e), (g) 및 (i); (e), (g) 및 (j); (e), (g) 및 (k); (e), (h) 및 (i); (e), (h) 및 (j); (e), (h) 및 (k); (e), (i) 및 (j); (e), (i) 및 (k); (e), (j) 및 (k); (f), (g) 및 (h); (f), (g) 및 (i); (f), (g) 및 (j); (f), (g) 및 (k); (f), (h) 및 (i); (f), (h) 및 (j); (f), (h) 및 (k); (f), (i) 및 (j); (f), (i) 및 (k); (f), (j) 및 (k); (g), (h) 및 (i); (g), (h) 및 (j); (g), (h) 및 (k); (g), (i) 및 (j); (g), (i) 및 (k); (g), (j) 및 (k); (h), (i) 및 (j); (h), (i) 및 (k); (h), (j) 및 (k); (i), (j) 및 (k)가 결정된다.
일부 실시예에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건하에서 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 활성 중 적어도 4개, 예컨대 (a), (b), (c) 및 (d); (a), (b), (c), 및 (e); (a), (b), (c) 및 (f); (a), (b), (c) 및 (g); (a), (b), (c) 및 (h); (a), (b), (c) 및 (i); (a), (b), (c) 및 (j); (a), (b), (c) 및 (k); (a), (c), (d) 및 (e); (a), (c), (d) 및 (f); (a), (c), (d) 및 (g); (a), (c), (d) 및 (h); (a), (c), (d) 및 (i); (a), (c), (d) 및 (j); (a), (c), (d) 및 (k); (a), (d), (e) 및 (f); (a), (d), (e) 및 (g); (a), (d), (e) 및 (h); (a), (d), (e) 및 (i); (a), (d), (e) 및 (j); (a), (d), (e) 및 (k); (a), (e), (f) 및 (g); (a), (e), (f) 및 (h); (a), (e), (f) 및 (i); (a), (e), (f) 및 (j); (a), (e), (f) 및 (k); (a), (f), (g) 및 (h); (a), (f), (g) 및 (i); (a), (f), (g) 및 (j); (a), (f), (g) 및 (k); (a), (g), (h) 및 (i); (a), (g), (h) 및 (j); (a), (g), (h) 및 (k); (a), (h), (i) 및 (j); (a), (h), (i) 및 (k); (a), (i), (j) 및 (k); (b), (c), (d) 및 (e); (b), (c), (d) 및 (f); (b), (c), (d) 및 (g); (b), (c), (d) 및 (h); (b), (c), (d) 및 (i); (b), (c), (d) 및 (j); (b), (c), (d) 및 (k); (b), (d), (e) 및 (f); (b), (d), (e) 및 (g); (b), (d), (e) 및 (h); (b), (d), (e) 및 (i); (b), (d), (e) 및 (j); (b), (d), (e) 및 (k); (b), (e), (f) 및 (g); (b), (e), (f) 및 (h); (b), (e), (f) 및 (i); (b), (e), (f) 및 (j); (b), (e), (f) 및 (k); (b), (f), (g), 및 (h); (b), (f), (g), 및 (i); (b), (f), (g), 및 (j); (b), (f), (g), 및 (k); (b), (g), (h), 및 (i); (b), (g), (h), 및 (j); (b), (g), (h), 및 (k); (b), (h), (i), 및 (j); (b), (h), (i), 및 (k); (b), (i), (j), 및 (k); (c), (d), (e), 및 (f); (c), (d), (e), 및 (g); (c), (d), (e), 및 (h); (c), (d), (e), 및 (i); (c), (d), (e), 및 (j); (c), (d), (e), 및 (k); (c), (d), (f) 및 (g); (c), (d), (f) 및 (h); (c), (d), (f) 및 (i); (c), (d), (f) 및 (j); (c), (d), (f) 및 (k); (c), (d), (g), 및 (h); (c), (d), (g) 및 (i); (c), (d), (g), 및 (j); (c), (d), (g), 및 (k); (c), (d), (h), 및 (i); (c), (d), (h), 및 (j); (c), (d), (h), 및 (k); (c), (e), (f) 및 (g); (c), (e), (f) 및 (h); (c), (e), (f) 및 (i); (c), (e), (f) 및 (i); (c), (e), (f) 및 (j); (c), (f), (g) 및 (h); (c), (f), (g) 및 (i); (c), (f), (g) 및 (j); (c), (f), (g) 및 (k); (c), (g), (h) 및 (i); (c), (g), (h) 및 (j); (c), (g), (h) 및 (k); (c), (h), (i), 및 (j); (c), (h), (i), 및 (k); (c), (i), (j), 및 (k); (d), (e), (f) 및 (g); (d), (e), (f) 및 (h); (d), (e), (f) 및 (i); (d), (e), (f) 및 (j); (d), (e), (f) 및 (k); (d), (f), (g), 및 (h); (d), (f), (g), 및 (i); (d), (f), (g), 및 (j); (d), (f), (g), 및 (k); (d), (g), (h) 및 (i); (d), (g), (h) 및 (j); (d), (g), (h) 및 (k); (d), (h), (i), 및 (j); (d), (h), (i), 및 (k); (d), (i), (j), 및 (k); (e), (f), (g) 및 (h); (e), (f), (g) 및 (i); (e), (f), (g) 및 (j); (e), (f), (g) 및 (k); (e), (g), (h) 및 (i); (e), (g), (h) 및 (j); (e), (g), (h) 및 (k); (e), (h), (i), 및 (j); (e), (h), (i), 및 (k); (e), (i), (j), 및 (k); (f), (g), (h) 및 (i); (f), (g), (h) 및 (j); (f), (g), (h) 및 (k); (f), (h), (i), 및 (j); (f), (h), (i), 및 (k); (f), (i), (j), 및 (k); (g), (h), (i), 및 (j); (g), (h), (i), 및 (k); (g), (i), (j), 및 (k); (h), (i), (j), 및 (k)가 결정된다.
일부 실시예에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건하에서 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 활성 중 적어도 5개, 예컨대 (a), (b), (c), (d), 및 (e); (a), (b), (c), (d), 및 (f); (a), (b), (c), (d), 및 (g); (a), (b), (c), (d), 및 (h); (a), (b), (c), (d), 및 (i); (a), (b), (c), (d), 및 (j); (a), (b), (c), (d), 및 (k); (a), (c), (d), (e) 및 (f); (a), (c), (d), (e) 및 (g); (a), (c), (d), (e) 및 (h); (a), (c), (d), (e) 및 (i); (a), (c), (d), (e) 및 (j); (a), (c), (d), (e) 및 (k); (a), (d), (e), (f) 및 (g); (a), (d), (e), (f) 및 (h); (a), (d), (e), (f) 및 (i); (a), (d), (e), (f) 및 (j); (a), (d), (e), (f) 및 (k); (a), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (e), (f), (g) 및 (j); (a), (e), (f), (g) 및 (k); (a), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (f), (g), (h) 및 (j); (a), (f), (g), (h) 및 (k); (b), (c), (d), (e) 및 (f); (b), (c), (d), (e) 및 (g); (b), (c), (d), (e) 및 (h); (b), (c), (d), (e) 및 (i); (b), (c), (d), (e) 및 (j); (b), (c), (d), (e) 및 (k); (b), (d), (e), (f) 및 (g); (b), (d), (e), (f) 및 (h); (b), (d), (e), (f) 및 (i); (b), (d), (e), (f) 및 (j); (b), (d), (e), (f) 및 (k); (b), (e), (f), (g) 및 (h); (b), (e), (f), (g) 및 (i); (b), (e), (f), (g) 및 (j); (b), (e), (f), (g) 및 (k); (b), (f), (g), (h) 및 (i); (b), (f), (g), (h) 및 (j); (b), (f), (g), (h) 및 (k); (c), (d), (e), (f) 및 (g); (c), (d), (e), (f) 및 (h); (c), (d), (e), (f) 및 (i); (c), (d), (e), (f) 및 (j); (c), (d), (e), (f) 및 (k); (c), (e), (f), (g) 및 (h); (c), (e), (f), (g) 및 (i); (c), (e), (f), (g) 및 (j); (c), (e), (f), (g) 및 (k); (c), (f), (g), (h) 및 (i); (c), (f), (g), (h) 및 (j); (c), (f), (g), (h) 및 (k); (d), (e), (f), (g), 및 (h); (d), (e), (f), (g), 및 (i); (d), (e), (f), (g), 및 (j); (d), (e), (f), (g), 및 (k); (d), (f), (g), (h) 및 (i); (d), (f), (g), (h) 및 (j); (d), (f), (g), (h) 및 (k); (f), (g), (h), (i) 및 (j); (f), (g), (h), (i) 및 (k); (g), (h), (i), (j) 및 (k)가 결정된다.
일부 실시예에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건하에서 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 활성 중 적어도 6개, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (g); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (h); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (j); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (k); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (g); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (h); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (i); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (j); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (k); (a), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (d), (e), (f), (g) 및 (j); (a), (d), (e), (f), (g) 및 (k); (a), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (a), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (g); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (h); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (i); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (j); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (k); (b), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (b), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (b), (d), (e), (f), (g) 및 (j); (b), (d), (e), (f), (g) 및 (k); (b), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (b), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (b), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (h); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (j); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (k); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (i); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (j); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (k); (c), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (c), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (c), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (d), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (d), (e), (f), (g), (h) 및 (k)가 결정된다.
일부 실시예에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건하에서 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 활성들 중 적어도 7개, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (g); (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (h); (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (j); (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (k); (a), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (j); (a), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (k); (a), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (a), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (j); (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (k); (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (k)가 결정된다.
일부 실시예에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건하에서 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 활성 중 적어도 8개, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (j); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (k); (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (a), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (a), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (a), (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (a), (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (a), (b), (c), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (a), (b), (c), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (a), (b), (c), (d), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (f), (g), (h) 및 (j); (a), (b), (c), (d), (f), (g), (h) 및 (k); (a), (b), (c), (d), (e), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (g), (h) 및 (j); (a), (b), (c), (d), (e), (g), (h) 및 (k); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (h) 및 (j); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (h) 및 (k); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (j); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (k)가 결정된다.
일부 실시예에서, 상기 방법의 단계 (2)에서, 동일한 명시된 조건하에서 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대해 상기 언급된 활성 중 적어도 9개, 10개 또는 11개 모두, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j) 및 (k)가 결정된다.
일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, 대조군과 비교하였을 때, 통계적으로 유의한 방식(예컨대, p<0.05, 선택적으로 p<0.01, 추가로 선택적으로 p<0.005, 더욱 선택적으로 p<0.001, 여전히 선택적으로 p<0.0005, 여전히 더욱 선택적으로 p<0.0001)으로 (a)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다.
일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 사용된 종양-보유 동물 모델은 마우스, 선택적으로 누드 마우스, 더욱 선택적으로 BALB/cA nu/nu 마우스를 포함한다. 일부 실시예에서, BALB/cA nu/nu 마우스와 같은 마우스는 약 3주령 내지 약 7주령 마우스를 포함하고, 선택적으로 약 4주령 내지 약 6주령을 포함한다. 일부 실시예에서, 마우스, 예컨대 BALB/cA nu/nu 마우스의 체중은 약 15±2 g 내지 약 30±2 g의 범위이고, 선택적으로 약 19±2 g 내지 약 23±2 g의 범위이다.
일부 실시예에서, 활성 (a), 생체 내 암 세포 성장의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 간암 세포, 자궁경부암 세포, 결장암 세포 및 폐암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 사용된 암 세포는 SMMC-7721 세포, Hela 세포, HT-29 세포, SPC-A4 세포 및 A549 세포 중 어느 하나 이상을 포함하고; 선택적으로 HT-29 세포, SPC-A4 세포 및 A549 세포 중 어느 하나 이상을 포함하고; 추가로 선택적으로 A549 세포를 포함한다.
일부 실시예에서, 생리식염수 또는 PBS, 선택적으로 생리식염수는 활성 (a)에 대한 억제를 결정하는데 있어서 대조군으로서 사용된다. 일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서 종양-보유 동물 모델에 투여된 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 약 0.02 mg 내지 약 0.30 mg; 선택적으로 약 0.05 내지 약 0.15 mg; 추가로 선택적으로 약 0.075 mg 내지 약 0.10 mg의 범위로 투여된다. 일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, 종양-보유 동물 모델에 투여된 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 격일로 투여된다. 일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, 종양-보유 동물 모델에 투여된 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 약 2주 내지 약 6주; 선택적으로 약 3주 내지 약 4주 동안 투여된다. 일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, 종양-보유 동물 모델에 투여된 대조군은 약 0.05 ml 내지 약 0.30 ml; 선택적으로 약 0.10 ml 내지 약 0.20 ml의 범위로 투여된다. 일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, 종양-보유 동물 모델에 투여된 대조군은 격일로 투여된다. 일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, 종양-보유 동물 모델에 투여된 대조군은 약 2주 내지 약 6주; 선택적으로 약 3주 내지 약 4주 동안 투여된다. 일부 실시예에서, 시험 인터페론 및/또는 대조군은 종양 내(intratumorally)로 투여된다.
일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, SMMC-7721 세포가 활성 (a)를 결정하는데 사용된 경우, 대조군(예컨대, 생리식염수)과 비교하여 통계적으로 유의한 방식(예컨대, 약 0.05 mg 및 약 0.10 mg에 대해 p<0.05, 선택적으로 약 0.15 mg에 대해 p<0.01)으로 (a)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다. 일부 실시예에서, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 격일로 0.02 mg 내지 약 0.30 mg; 선택적으로 약 0.05 mg 내지 약 0.15 mg; 추가로 선택적으로 약 0.075 mg 내지 약 0.10 mg의 범위로 약 3주 동안 투여된다.
일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, Hela 세포가 활성(a)를 결정하는데 사용된 경우, 대조군(예컨대, 생리식염수)과 비교하여 통계적으로 유의한 방식(예컨대, 약 0.15 mg에 대해 p<0.05, 선택적으로 약 0.05 mg 및 0.10 mg에 대해 p<0.01)으로 (a)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다. 일부 실시예에서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 격일로 약 0.02 mg 내지 약 0.30 mg; 선택적으로 0.05 mg 내지 약 0.15 mg; 추가로 선택적으로 약 0.075 mg 내지 약 0.10 mg의 범위로 약 4주 동안 투여된다.
일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, HT-29 세포가 활성 (a)를 결정하는데 사용된 경우, 대조군(예컨대, 생리식염수)과 비교하여 통계적으로 유의적인 방식(예컨대, 약 0.10 mg 및 0.15 mg에 대해 p<0.01, 선택적으로 약 0.05 mg에 대해 p<0.001)으로 (a)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다. 일부 실시예에서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 격일로 약 0.02 mg 내지 약 0.30 mg; 선택적으로 약 0.05 mg 내지 약 0.15 mg; 추가로 선택적으로 약 0.075 mg 내지 약 0.10 mg의 범위로 약 4주 동안 투여된다.
일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, SPC-A4 세포가 활성 (a)를 결정하는데 사용된 경우, 대조군(예컨대, 생리식염수)과 비교하여 통계학적으로 유의적인 방식(예컨대, 약 0.05 mg, 약 0.10 mg 및 약 0.15 mg에 대해 p<0.01)으로 (a)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다. 일부 실시예에서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 격일로 약 0.02 mg 내지 약 0.30 mg; 선택적으로 약 0.05 mg 내지 약 0.15 mg; 추가로 선택적으로 약 0.075 mg 내지 약 0.10 mg의 범위로 약 3주 동안 투여된다.
일부 실시예에서, 활성 (a)를 결정하는데 있어서, A549 세포가 활성 (a)를 결정하는데 사용된 경우, 대조군(예컨대, PBS)과 비교하여 통계적으로 유의한 방식(예컨대, p<0.0001)으로 (a)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다. 일부 실시예에서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 격일로 약 0.02 mg 내지 약 0.30 mg의 범위; 선택적으로 약 0.05 mg 내지 약 0.15 mg의 범위; 더욱 선택적으로 약 0.10 mg으로 적어도 약 3주 동안 투여된다.
일부 실시예에서, 활성 (b), 암 세포 생존율의 감소를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 약 6.25 mcg/ml 및 약 25 mcg/ml 사이의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml 및 약 18 mcg/ml 사이의 범위; 더욱 선택적으로 약 10 mcg/ml 및 약 15 mcg/ml 사이의 범위의 농도에서 암 세포의 생존율을 약 50% 감소시키는 경우, 이는 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동등한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다. 일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 적어도 약 25 mcg/ml의 범위; 선택적으로 적어도 약 50 mcg/ml의 범위; 추가로 선택적으로 적어도 약 75 mcg/ml의 범위; 더욱 선택적으로 적어도 약 100 mcg/ml의 범위에서 실질적으로 검출 불가능한 레벨로 암 세포 생존율의 감소를 야기하는 경우에, 이는 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다.
일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 농도는 약 0.2 mcg/ml 및 약 100 mcg/ml 사이 범위 농도를 포함한다. 일부 실시예에서, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 농도는 하기 중 적어도 2개 이상이다: 0.2 mcg/ml, 0.39 mcg/ml, 0.78 mcg/ml, 1.56 mcg/ml, 3.13 mcg/ml, 6.25 mcg/ml, 12.5 mcg/ml, 25 mcg/ml, 50 mcg/ml 및 100 mcg/ml. 일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 암 세포는 적어도 약 1일; 선택적으로 적어도 약 2일 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다.
일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포, 결장암 세포, 자궁경부암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함하고; 선택적으로 폐암 세포, 결장암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, SMMC-7721 세포 및 PANC-1 세포 중 어느 하나 이상을 포함하고; 선택적으로 A549 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, SMMC-7721 세포 및 PANC-1 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다.
일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 약 6.25 mcg/ml 및 약 12.5 mcg/ml 사이 범위의 농도에서 SW480 세포, MDA-MB-231 세포 및 PANC-1 중 어느 하나 이상의 생존율의 약 50% 감소를 야기하는 경우, 이는 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다.
일부 실시예에서, 시험 인터페론이 약 12.5 mcg/ml 및 약 25 mcg/ml 사이 범위의 농도에서 A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, Calu-1 세포 및 SMMC-7721 세포 중 어느 하나 이상의 생존율의 약 50% 감소를 야기하는 경우, 이는 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다.
일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, A549 세포 및/또는 SW620 세포가 활성 (b)를 결정하는데 사용된 경우, 대조군(예컨대, IFNα-2b)과 비교하여 통계적으로 유의한 방식(예컨대, p<0.01)으로 (b)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다. 일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 및 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 1일 내지 약 10일; 선택적으로 약 1일 내지 약 6일 동안 처리된다.
일부 실시예에서, 활성 (b)를 결정하는데 있어서, 암 세포 생존율은 AM-Blue 방법 또는 MTT 방법에 의해 결정된다.
일부 실시예에서, 활성 (c)를 결정하는데 있어서, 대조군과 비교하였을 때, 통계적으로 유의한 방식(예컨대, p<0.01)으로 (c)에 명시된 활성이 시험 인터페론에의 존재하다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다. 일부 실시예에서, 대조군은 비처리 대조군(모의)이다.
일부 실시예에서, 활성 (c), 암 세포 이동의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (c)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포 및 SW620 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (c)에서 암 세포 이동의 억제는 트랜스웰 방법을 사용하여 결정된다. 일부 실시예에서, 활성 (c)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (c)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 선택적으로 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다.
일부 실시예에서, 활성 (d)를 결정하는데 있어서, 대조군과 비교하였을 때, 통계적으로 유의한 방식(예컨대, p<0.05, 선택적으로 p<0.01)으로 (d)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다. 일부 실시예에서, 대조군은 비처리 대조군(모의)이다.
일부 실시예에서, 활성 (d), 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (d)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, H1299 세포, H460 세포, HT-29 세포 및 SW620 세포 중 어느 하나 이상을 포함하고; 선택적으로 A549 세포, H1299 세포, H460 세포 및 SW620 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (d)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 선택적으로 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (d)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 베타-카테닌/TCF의 전사 활성은 리포터 시스템의 사용에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, 리포터 시스템은 탑플래쉬 또는 pSV40-RL 플라스미드를 포함한다.
일부 실시예에서, 활성 (e)를 결정하는데 있어서, 대조군과 비교하였을 때, 통계적으로 유의한 방식(예컨대, p<0.005, 선택적으로 p<0.001, 추가로 선택적으로 p<0.0005)으로 (e)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다. 일부 실시예에서, 대조군은 비처리 대조군(모의)이다.
일부 실시예에서, 활성 (e), 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6 발현의 하향조절을 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (e)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, H460 세포, SW620 세포 및 HT-29 세포 중 어느 하나 이상을 포함하고; 선택적으로 A549 세포, SW620 세포 및 HT-29 세포 중 어느 하나 이상을 포함하고; 더욱 선택적으로 HT-29 세포를 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (e)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 선택적으로 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (e)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (e)를 결정하는데 있어서, LRP6 및/또는 FZD6의 발현은 LRP6 및/또는 FZD6의 mRNA 레벨을 결정함으로써 결정된다. 일부 실시예에서, mRNA 레벨을 결정하는 경우, GAPDH가 대조군으로서 사용된다.
일부 실시예에서, 활성 (f)를 결정하는데 있어서, 대조군과 비교하였을 때, 통계적으로 유의한 방식(예컨대, p<0.0005, 선택적으로 p<0.0001)으로 (f)에 명시된 활성이 시험 인터페론에 존재한다는 것은, 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다. 일부 실시예에서, 대조군은 비처리 대조군(모의)이다.
일부 실시예에서, 활성 (f), Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 하나 이상의 발현의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포를 포함하고; 선택적으로 A549 세포를 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (f)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 선택적으로 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (f)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (f)를 결정하는데 있어서, Axin2, CD24, 서바이빈 및/또는 ID2의 발현은 그것의 상응하는 mRNA 레벨을 결정함으로써 결정된다. 일부 실시예에서, mRNA 레벨을 결정하는 경우, GAPDH가 대조군으로서 사용된다.
일부 실시예에서, 활성 (f)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 대조군과 비교하여 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 하나 이상의 발현을 적어도 약 30%; 선택적으로 적어도 약 40%; 더욱 선택적으로 적어도 약 50%; 여전히 더욱 선택적으로 적어도 약 60% 감소시키는 경우, 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가지는 것으로 간주된다.
어떤 실시예에 있어서, 활성 (g)를 결정하는데 있어서, 암 세포에서의 위족 형성이 시험 인터페론에 의해 실질적으로 억제되는 경우, 이는 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다. 본원에서의 목적을 위해, "실질적으로 억제되는"은 적어도 약 60% 억제; 선택적으로 적어도 약 70% 억제; 여전히 선택적으로 적어도 약 80% 억제; 추가로 선택적으로 적어도 약 90% 억제; 여전히 추가로 선택적으로 적어도 약 95% 억제를 의미한다.
일부 실시예에서, 활성 (g), 위족 형성의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포; 선택적으로 A549 세포를 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (g)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 4일; 선택적으로 적어도 약 8일 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (g)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (g)를 결정하는데 사용된 암 세포는 매트리겔(Matrigel) 중에서 배양된다.
일부 실시예에서, 활성 (h)를 결정하는데 있어서, 암 세포에서의 베타-카테닌의 레벨이 시험 인터페론에 의해 유의하게 감소되는 경우, 이는 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다. 본원에서의 목적을 위해, 암 세포에서의 베타-카테닌의 레벨은 처리 후에 예를 들어, 웨스턴 블롯 상에서 단백질을 나타내는 밴드가 처리 전의 밴드와 비교하여 희미하거나 없는 경우에, 유의하게 감소된 것이다.
일부 실시예에서, 활성 (h), 암 세포에서의 베타-카테닌의 억제를 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (h)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포 및 SW480 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 어떤 실시에에서, 활성 (h)를 결정하는데 있어서 베타-카테닌 발현의 억제는 웨스턴 블롯에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, 활성 (h)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 48시간; 선택적으로 적어도 약 72시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (h)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다.
일부 실시예에서, 활성 (i)를 결정하는데 있어서, 시험 인터페론이 암 세포에서 IFNα-2b와 비교하여 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 하나 이상의 발현을 보다 효과적으로 상향조절할 수 있는 경우, 이는 시험 인터페론 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물이 실질적으로 동일한 효능 및/또는 실질적 동등성을 가짐을 의미한다.
어떤 실시예에 있어서, 활성 (i), 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 하나 이상의 발현의 상향조절을 결정하는데 사용된 암 세포는 폐암 세포 및 결장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (i)를 결정하는데 사용된 암 세포는 A549 세포, H460 세포, SW620 세포 및 HT-29 세포 중 어느 하나 이상을 포함하고; 선택적으로 A549 세포 및 SW620 세포 중 어느 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성 (i)를 결정하는데 사용된 암 세포는 적어도 약 20시간; 선택적으로 적어도 약 24시간 동안 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (i)를 결정하는데 사용된 암 세포는 약 5 mcg/ml 내지 약 20 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리된다. 일부 실시예에서, 활성 (i)를 결정하는데 있어서, DKK-3, KLF-4 및/또는 BATF2의 발현은 그것의 상응하는 mRNA 레벨을 결정함으로써 결정된다. 일부 실시예에서, mRNA 레벨을 결정하는 경우, GAPDH가 대조군으로서 사용된다.
일부 실시예에서, 통계적 유의성은 대조군과 비교하는 경우에, 0.05 이하, 또는 0.01 이하, 또는 0.005 이하, 또는 0.001 이하, 또는 0.0005 이하, 또는 0.0001 이하의 p 값을 의미한다.
일부 실시예에서, 대조군은 시험 인터페론 또는 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물로 처리되지 않거나, 생리식염수 또는 PBS로 처리되거나, IFNα-2b로 처리되는 것이고, 또는 대조군은 비처리된 대조군(모의)이다.
일 양상에서, 본 발명은 (a) 복수의 농도의 시험 인터페론을 제공하는 단계; (b) 명시된 조건하에서, 복수의 농도의 시험 인터페론을 사용하여 제1 암 세포 세트의 생존율에 대한 시험 인터페론의 제1 용량 반응을 결정하는 단계; (c) 복수의 농도의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co의 대체물(이하, "rSIFN-co 대체물")을 제공하는 단계; (d) 동일한 명시된 조건하에서, 복수의 농도의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물을 이용하여 제2 암 세포 세트의 생존율에 대한 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물의 제2 용량 반응을 결정하는 단계; 및 (e) 제1 용량 반응을 제2 용량 반응과 비교하는 단계를 포함하는, 화합물, 예컨대 시험 인터페론의 효능을 결정하거나 비교하는 방법을 제공한다. 이러한 방식으로, rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물과 대비하여 화합물, 예컨대 시험 인터페론의 효능이 결정된다.
본 발명의 일부 실시예에서, rSIFN-co(서열번호 1)는 미국 특허 번호 제7,364,724호(재조합 슈퍼-화합물 인터페론)에 기술된 바와 같이, E. coli 숙주에서, 선택적으로 E. coli 숙주에서 프로모터 PBAD의 제어하에, 신규한 폴리뉴클레오티드(서열번호 2)의 발현에 의해 만들어진다. 본 발명의 일부 실시예에서, rSIFN-co는 E.coli 내로 서열번호 2로 나타낸 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하는 것을 포함하는 방법에 의해 얻어질 수 있다. 본 발명의 일부 실시예에서, rSIFN-co는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지고, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되며, 여기에서 인터페론은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되지 않은 인터페론, 예컨대 인터페론 알파콘-1(interferon alfacon-1, INFERGEN®)과 비교하여 B형 간염 바이러스의 B형 간염 표면 항원(hepatitis B surface antigen, HBsAg) 및 B형 간염 e 항원(Hepatitis B e antigen, HBeAg)의 발현에 대해 증가된 억제 활성을 가진다.
일부 실시예에서, 본원의 방법에서 사용된 rSIFN-co는 명시된 특정 활성을 포함하고, 상기 특정 활성은 예를 들어, 약 4 × 108 IU/mg 내지 1 × 109 IU/mg 사이의 범위일 수 있다. 일부 실시예에서, 특정 활성은 약 4.4 × 108 IU/mg 내지 약 9 × 108 IU/mg 사이의 범위에 있다. 일부 실시예에서, 특정 활성은 약 5 × 108 IU/mg 내지 약 8 × 108 IU/mg 사이의 범위에 있다. 일부 실시예에서, 특정 활성은 약 6 × 108 IU/mg 내지 약 7.5 × 108 IU/mg 사이의 범위에 있다. 선택적으로, 특정 활성은 약 4 × 108 IU/mg 내지 5 × 108 IU/mg 사이의 범위에 있다.
일부 실시예에서, 화합물의 효능을 결정하거나 비교하는 방법에 있어서, 시험 인터페론 또는 rSIFN-co의 농도는 약 0.2 mcg/ml 및 약 100 mcg/ml 사이의 범위에 있다. 일부 실시예에서, 시험 인터페론 또는 rSIFN-co의 농도는 0.2 mcg/ml, 0.39 mcg/ml, 0.78 mcg/ml, 1.56 mcg/ml, 3.13 mcg/ml, 6.25 mcg/ml, 12.5 mcg/ml, 25 mcg/ml, 50 mcg/ml 및 100 mcg/ml 중 적어도 2개 이상이다.
일부 실시예에서, rSIFN-co의 효과를 결정하기 위해 본원의 방법에서 사용된 세포는 인간 또는 동물 세포에 관계없이 암 세포이다. 세포는 달리 언급되지 않는 한 표준 배양 조건하에 완전 배지에서 37℃, 5% CO2 분위기하에, 시험 인터페론 또는 rSIFN-co에 의해 적어도 약 24시간, 선택적으로 적어도 약 48시간, 및 여전히 선택적으로 적어도 약 72시간 동안 처리된다. 배양 배지는 종양 세포의 배양에 적합한 임의의 표준 완전 배지, 예컨대 상하이 셀 컬렉션(Shanghai Cell Collection)(Shanghai, China)으로부터 입수 가능하며, 10% 소 태아 혈청(Biochrom, Germany), 4 mM 글루타민, 50 U/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신이 보충된 것일 수 있다. IFN 알파-2b는 상하이 후아-신 하이 바이오테크놀로지(Shanghai Hua-xin Biotechnology, Inc.)(Shanghai, China)로부터 얻을 수 있고, rSIFN-co는 쓰촨 후이양 라이프-엔지니어링 컴퍼니, 리미티드(Sichuan Huiyang Life-Engineering Co., Ltd.)(Chengdu, China)로부터 얻을 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명은 암 세포 유형에 따라 약 6.25 mcg/ml 및 약 25 mcg/ml 사이 범위의 농도에서 암 세포 생존율을 50% 감소시키는 능력을 가지는 rSIFN-co를 제공한다. 일부 실시예에서, rSIFN-co는 약 6.25 mcg/ml 및 12.5 mcg/ml 사이 범위의 농도에서 세포 생존율을 50% 감소시킬 수 있다. 다른 실시예에서, rSIFN-co는 약 12.5 mcg/ml 및 25 mcg/ml 사이 범위의 농도에서 세포 생존율을 50% 감소시킬 수 있다. 일부 실시예에서, rSIFN-co의 IC50은 약 10 mcg/ml 내지 약 18 mcg/ml의 범위에 있다.
일부 실시예에서, 시험 인터페론은 또한 인터페론이지만, 비교에 사용된 rSIFN-co와는 상이한 제조 로트(lot)로부터 얻어진다.
따라서, 예를 들어 화합물, 예컨대 시험 인터페론의 효능을 결정하는데 있어서, 시험 인터페론은 다양한 농도로 희석되고, 사용될 용기에 적절한 특정 수의 제조된 세포, 예컨대 100 마이크로리터의 완전 배지 중 5 × 103 세포가 이러한 다양한 농도의 시험 인터페론과 함께 특정 시간 동안, 예컨대 48시간 동안 배양된다. 배양 후, 세포의 생존율이 결정되고, 유사하게 처리되었지만 시험 인터페론 대신 rSIFN-co로 처리된 세포의 생존율과 비교된다. 각각의 시험 인터페론이 처리된 세포 및 rSIFN-co가 처리된 세포에 대한 용량 반응 곡선이 결과로부터 생성되어 비교될 수 있다. 이러한 방식으로, 시험 인터페론의 효능이 50% 유효량(effective dose) 또는 IC50과 관련하여 rSIFN-co의 효능과 대비하여 결정될 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) 복수의 암 세포를 제공하는 단계; (b) 명시된 조건하에서, 제1 생존율 데이터 세트를 생성하기 위하여 일정량의 시험 인터페론으로 제1 암 세포 세트를 시험하는 단계; (c) 동일한 명시된 조건하에서, 제2 생존율 데이터 세트를 생성하기 위하여 일정한 양의 rSIFN-co로 제2 암 세포 세트를 처리하는 단계; 및 (d) 제1 생존율 데이터 세트를 제2 생존율 데이터 세트와 비교하는 단계를 포함하며, 이에 의해 시험 인터페론의 효능이 결정되는 것인, rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물과 대비하여 화합물, 예컨대 시험 인터페론의 효능을 결정하거나 비교하는 방법을 제공한다.
일부 실시예에서, 암 세포는 약 1일 내지 약 6일의 범위 동안 처리된다. 일부 실시예에서, rSIFN-co는 약 6.25 mcg/ml 내지 약 50 mcg/ml의 범위; 선택적으로 약 7 mcg/ml 내지 약 25 mcg/ml의 범위; 추가로 선택적으로 약 8 mcg/ml 내지 약 12.5 mcg/ml의 범위; 여전히 선택적으로 약 10 mcg/ml의 농도로 사용된다. 일부 실시예에서, rSIFN-co는 명시된 특정 활성을 포함한다.
일부 실시예에서, 본원에 사용된 암 세포는 인간 종양 세포 및 동물 종양 세포 중에서 선택된다. 일부 실시예에서, 종양 세포는 폐 종양 세포, 또는 자궁경부 종양 세포, 또는 간 종양 세포, 또는 결장 종양 세포, 또는 유방 종양 세포, 또는 췌장 종양 세포, 또는 전립선 종양 세포, 또는 바이러스-유발성 종양 세포 또는 바이러스에 의해 변형된 세포이다. 일부 실시예에서, 종양 세포는 A549 세포, Calu-1 세포, CL-1 세포, H460, H1299, Hela 세포, HT29, Huh-7 세포, MDA-MB-231 세포, PANC-1, RAW264.7, SMMC-7721 세포, SW480 세포 및 SW620 세포 중 적어도 하나로부터 선택된다.
따라서, 예를 들어 시험 용기에 적합한 적절한 부피로 특정한 수의 암 세포, 예컨대 100 마이크로리터의 완전 배지 중 2 × 103개의 세포를 96 웰 플레이트에 넣고, 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6일 동안 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 또는 rSIFN-co로 처리하거나 대조군으로서 처리하지 않고 남겨두고, 비처리된 대조군의 생존율과 대비하여 처리된 세포의 생존율을 매일 결정할 수 있다. 실험의 결론에서, 비처리 대조군의 생존율과 대비하여 처리된 세포의 생존율을 인터페론 처리 일수에 대해 플롯팅할 수 있다. 이러한 방식으로, 시험 화합물이 암 세포의 생존율을 감소시키는 능력을 비교할 수 있고, 그것의 효능을 rSIFN-co의 효능과 대비하여 결정할 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명은 세포를 유효량의 rSIFN-co에 명시된 기간 동안 노출시켜 세포 이동을 억제시키는 것을 포함하는, 예컨대 종양 전이에서 발생하는 세포 이동을 억제하는 방법을 제공한다.
일부 실시예에서, 본원에 언급된 바와 같은 세포, 예컨대 종양 세포의 rSIFN-co에 대한 노출은 세포를 유효량의 rSIFN-co의 존재하에 37℃에서 예컨대, 24시간 동안 배양함으로써, 또는 특정 농도의 rSIFN-co가 목적하는 효과, 예컨대 전이에서 종양 세포 이동의 억제, 또는 위족 형성의 억제, 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제, 베타-카테닌 단백질 발현의 억제, Wnt-관련 수용체 및/또는 공동수용체의 하향조절, Wnt 신호전달 하류 표적 유전자의 하향조절, 종양 억제 유전자의 상향조절 및 본원에 기재된 바와 같은 기타의 것들을 수득하기에 충분한 시간 동안 유지되도록 유효량의 rSIFN-co를 동물 또는 대상체에 투여하는 것에 의해, 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 이루어질 수 있다.
세포 이동 검정은 임의의 적절한 상업적으로 입수 가능한 키트를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 벡톤-디킨슨 바이오사이언시즈(Becton-Dickinson Biosciences)(N.J., USA)로부터의 24웰-플레이트 내에 놓인 미세다공성 멤브레인(microporous membrane)을 함유하는 8 마이크로미터 삽입물(insert)을 본원에서 사용할 수 있다. 검정를 위해, FBS를 포함하지 않는 37℃의 가온된 중탄산염 기반 배양 배지를 삽입물의 내부 및 웰의 하부에 첨가하고, 습윤 조직 배양 배양기 내에서 37℃, 5% CO2 분위기 하에 약 2시간 동안 재수화시킬 수 있다. 재수화 후, 배지를 조심스럽게 제거할 수 있고, FBS를 포함하지 않는 배지 중에 현탁된 약 500 마이크로리터의 제조된 세포(예컨대, rSIFN-co로 37℃에서 24시간 동안 사전처리된 세포)를 삽입물 필터의 상부 측면(upper side) 상에 약 0.5 × 104 세포/삽입물의 밀도로 시딩할 수 있다. 그 후, 500 마이크로리터의 10% FBS 함유 완전 배지를 24-웰 플레이트의 하부 구획에 첨가할 수 있다. 세포/삽입물/플레이트를 그 후 24시간 동안 37℃에서 배양하고, 챔버 멤브레인 상부 측면상의 이동하지 않은 세포를 예컨대, 면봉으로 제거할 수 있다. 이동된 세포를 함유하는 배양 삽입물의 하부 표면을 예컨대, 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 2% 크리스탈 바이올렛으로 염색할 수 있다. 챔버 멤브레인의 반대 측면 상에 있는 이동된 세포의 수를 계수하고, 필드당 이동 세포의 평균 수를 결정할 수 있다. 이러한 방식으로, 시험 인터페론이 종양 세포 이동을 억제하는 능력을 입증할 수 있다.
일부 실시예에서, 유효량의 rSIFN-co는 약 5 mcg/ml 내지 약 100 mcg/ml; 선택적으로 약 8 mcg/ml 내지 약 50 mcg/ml; 여전히 선택적으로 약 10 mcg/ml 내지 약 25 mcg/ml; 추가로 선택적으로 약 12 mcg/ml 내지 약 18 mcg/ml을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 암 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 위족 형성이 억제되는 것인, 암 세포에서의 위족 형성을 억제하는 방법을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하는, 세포에서의 베타-카테닌/TCF 매개성 전사 활성을 억제하는 방법을 제공한다.
일부 실시예에서, 베타-카테닌/TCF-매개성 전사 활성은 루시페라아제(luciferase) 리포터 시스템을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, 리포터 시스템은 탑플래쉬 리포터이다. 일부 실시예에서, 플라스미드 pSV40-RL이 사용된다. 따라서, 예를 들어 평가되는 세포는 예컨대, 96-웰 플레이트상에 예컨대, 웰 당 약 1 × 104 세포로 넣어지고, 37℃에서 약 12시간 동안 배양될 수 있고, 그 후 이는 약 100 ng의 탑플래쉬(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)에 의해 일시적으로 형질감염된다. 형질감염 효율의 정규화를 위해, 세포를 SV40 프로모터(pRL-SV40)(Promega, Madison, WI)하에 구동되는 내부 제어(internal control) 리포터 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) 루시페라아제 1 ng으로 추가로 공동-형질감염(co-transfected)시킬 수 있다. 형질감염 6시간 후에, 시험관 내 분석을 위한 세포를 이어서 rSIFN-co로 약 24시간 동안 처리할 수 있다. 시험관 내 분석을 위한 rSIFN-co 처리 후 또는 생체 내 분석을 위한 형질감염 후, 루시페라아제 검정을 제조업체의 프로토콜에 따라 이중 루시페라아제 검정 시스템 키트(Cat#: E1960, Promega)를 사용하여 수행할 수 있다. 상대적 루시페라아제 활성을 반딧불이(firefly)/레닐라(renilla) 루시페라아제 활성의 비로서 결정할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하는, 세포에서 베타-카테닌 단백질 레벨을 감소시키는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시예에서, 베타-카테닌의 단백질 레벨은 그것의 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 검출된다. 일부 실시예에서, GAPDH가 대조군으로서 사용된다.
시험관 내 배양물로부터 얻은 또는 생체 내 종양 샘플로부터 얻은 세포에서의 베타-카테닌의 레벨을 결정하기 위한 웨스턴 블롯 분석을 위해, 표준 방법을 사용될 수 있다. 예를 들어, 추출 시약(Cat#: P0013)을 제조업체(Beyotime, China)의 프로토콜에 따라 사용하여 전체 세포 단백질을 추출할 수 있다. 단백질 농도는 바이오-라드(Bio-Rad)의 로우리 단백질 검정 시스템을 사용하여 결정될 수 있다. 전체 단백질을 10% - 12% 겔 상에서의 SDS-PAGE에 의해 분리할 수 있고, 이어서 이를 0.45 마이크로미터의 니트로셀룰로오스 멤브레인(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)으로 옮길 수 있다. 멤브레인을 차단 완충액(5% 소 혈청 알부민, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0, 150 mol/L NaCl, 및 0.05% Tween 20)으로 4℃에서 밤새 차단시킨 후, 1차 항체(1:1000 희석)에 이어 2차 HRP-컨쥬게이트 항체와 함께 배양할 수 있다. 상기 항체는 임의의 판매업체로부터의 것일 수 있고, 예를 들어 하기의 항체들이 사용될 수 있다: 마우스 모노클로날 항-베타-카테닌(1:1000, Santa Cruz Technology, Santa Cruz, CA), 마우스 모노클로날 항-GAPDH(1:2000, Kangwei Biotechnology, China) 및 항-마우스 HRP-컨쥬게이트 2차 항체(1:2000, Santa Cruz Technology). 블롯은 발광(Luminescence)/형광(Fluorescence) 이미징 LAS4000 시스템(GE Healthcare Life Sciences, USA)을 슈퍼 시그널 웨스트 피코 화학발광 기질 키트(super signal west pico chemiluminescent substrate kit)(Thermo Scientific, USA)와 함께 사용하여 가시화할 수 있다.
다른 양상에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 Wnt-관련 수용체 또는 공동수용체가 하향조절되는 것인, 세포에서의 Wnt-관련 수용체 또는 공동수용체의 발현을 하향조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, Wnt-관련 수용체 또는 공동수용체는 LRP 단백질, 예컨대 LRP6을 포함한다. 일부 실시예에서, Wnt-신호전달 수용체 또는 공동수용체는 FZD 단백질, 예컨대 FZD6을 포함한다. 상기 언급한 바와 같이, rSIFN-co에 세포를 노출시키는 방법은 시험관 내 방법 또는 생체 내 방법일 수 있다.
일부 실시예에서, Wnt-관련 수용체 또는 공동수용체의 발현을 결정하는 것은 이러한 수용체 또는 공동수용체의 mRNA 레벨을 결정하는 것을 포함한다. 이러한 mRNA 레벨은 임의의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, 이러한 mRNA 레벨을 결정하기 위해 이러한 mRNA에 상응하는 cDNA가 제조된다. 예를 들어, 트리졸 시약(Invitrogen, carlsbad, CA)을 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 전체 mRNA를 단리할 수 있다. RT-PCT 키트(Cat#: FSQ-101, TOYOBO, Japan)를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 상보적 DNA(cDNA)를 합성한 후, SYBR 그린 PCR 키트(Cat#: QPK-201, TOYOBO, Japan)와 함께 정량적 PCR(qPCR)에 적용할 수 있다. 적절한 프라이머를 사용할 수 있다. 예를 들어, LRP6를 위한 프라이머는 센스 프라이머(sense primer): 5'-TGAAGAACCAGCACCACAGG-3' (서열번호 4); 및 안티센스 프라이머(antisense primer): 5'-CATAACCAAGAGGCACAGAAGC-3' (서열번호 5)일 수 있고, FZD6를 위한 프라이머는 센스 프라이머: 5'- GCGGAGTGAAGGAAGGATTAGTC-3' (서열번호 6); 및 안티센스 프라이머: 5'-TGAACAAGCAGAGATGTGGAACC -3' (서열번호 7) 일 수 있다. 증폭 프로토콜은 95℃에서의 1분 배양, 40 사이클(15초 동안 95℃, 15초 동안 60℃, 및 30초 동안 72℃)일 수 있다. PCR 산물 내로의 SYBR 그린 염료의 도입은 바이오-라드 검출 시스템을 이용하여 실시간으로 관찰될 수 있고, 이어서 바이오-라드 CFX 매니저 2.1 소프트웨어를 사용하여 분석될 수 있다. 샘플을 각각의 조건에 대해 모으고, 이중으로 구동시킬 수 있다. 인터페론-처리된 샘플은 2-△△Ct 방법을 사용하여 모의 비처리 샘플과 비교하고, 배수 변화(fold change)로서 플롯팅할 수 있다. GAPDH를 정규화 대조군으로서 사용할 수 있다. 이러한 2-△△Ct 방법은 실시간 정량적 PCR 실험으로부터 유전자 발현에서의 상대적 변화를 분석하는데 통상적으로 사용된다.
다른 양상에서, 본 발명은 세포에서 Wnt-신호전달 경로의 적어도 하나의 표적 유전자를 포함하는 특정 유전자의 발현을 하향조절하는 방법, 예컨대 표적 유전자가 돌연변이되거나 과활성화되는 질병 또는 상태의 치료를 위한 상기 방법을 제공한다. 이러한 하향조절된 유전자는 예를 들어, Axin2, CD24, 서바이빈 및/또는 ID2 중 하나 이상을 포함한다. 상기 방법은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 표적 유전자의 발현이 억제된다. 하향조절의 정도는 표준 기술에 의해, 예컨대 앞서 언급한 바와 같은 qPCR에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 이러한 qPCR을 위해, Axin2의 경우에 센스 프라이머: 5'- CGTGGATACCTTAGACTT-3' (서열번호 8) 및 안티센스 프라이머: 5'-GCTGTTGTTCTCAATGTA-3' (서열번호 9)를 사용할 수 있고; CD24의 경우에 센스 프라이머: 5'- TGAAGAACATGTGAGAGGTTTGAC-3' (서열번호 10) 및 안티센스 프라이머: 5'-GAAAACTGAATCTCCATTCCACAA-3' (서열번호 11)를 사용할 수 있고; 서바이빈의 경우에 센스 프라이머: 5'-ACCGCATCTCTACATTCAAG-3' (서열번호 12) 및 안티센스 프라이머: 5'CAAGTCTGGCTCGTTCTC-3'(서열번호 13)를 사용할 수 있고; ID2의 경우에 센스 프라이머: 5'-CACAACAACAACAACAAC-3' (서열번호 14) 및 안티센스 프라이머: 5'-CACAGTCCAAGTAAGAGA-3' (서열번호 15)를 사용할 수 있다.
본 발명의 일부 실시예에서, rSIFN-co에의 세포의 노출에 대해 명시된 기간은 적어도 약 12시간; 선택적으로 적어도 약 24시간; 추가로 선택적으로 적어도 약 36시간; 여전히 선택적으로 적어도 약 48시간; 또한 여전히 선택적으로 적어도 약 72시간이다. 일부 실시예에서, rSIFN-co에 의해 처리될 세포는 암 세포이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 세포를 명시된 기간 동안 유효량의 rSIFN-co에 노출시키는 것을 포함하며, 이에 의해 적어도 하나의 종양 억제 유전자 발현이 상향조절이 일어나는 것인, 세포에서 적어도 하나의 종양 억제 유전자를 포함하는 특정 유전자의 발현을 상향조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 상향조절된 유전자는 DKK3, KLF4 및 BATF2 중 적어도 하나를 포함한다. 이러한 유전자의 상향조절의 정도는 표준 기술에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, 상향조절된 유전자의 발현은 mRNA 레벨을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, cDNA가 이러한 mRNA로부터 합성되고, 선택적으로 이와 같은 측정 목적을 위해 증폭된다. 일례로서, 증폭 목적을 위해, 하기 프라이머를 사용할 수 있다: BATF2의 경우에, 센스 프라이머: 5'-CAGAGCAGGGAGCACAAACC -3' (서열번호 16) 및 안티센스 프라이머: 5'-TGAGCAGAGGAGAGCAGAGG -3' (서열번호 17); DKK3의 경우에, 센스 프라이머: 5'-GGAGCCTGACTGAAGAGATGG-3'(서열번호 18) 및 안티센스 프라이머: 5'-ACGCCTAAAGCACACACCTG-3' (서열번호 19); KLF4의 경우에, 센스 프라이머: 5'- CCTTCAACCTGGCGGACATCAAC-3' (서열번호 20) 및 안티센스 프라이머: 5'-GGCTGCTGCGGCGGAATG -3' (서열번호 21).
다른 양상에서, 본 발명은 (a) 어느 하나 이상의 종양-보유 동물 모델에서의 생체 내 암 세포 성장의 억제; (b) 암 세포 생존율의 감소; (c) 암 세포 이동의 억제; (d) 암 세포에서의 베타-카테닌/TCF 전사 활성의 억제; (e) 암 세포에서의 LRP6 및/또는 FZD6 발현의 하향조절; (f) 암 세포에서의 Axin2, CD4, 서바이빈 및 ID2 중 어느 하나 이상의 발현의 억제; (g) 암 세포에서의 위족 형성의 억제; (h) 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제; (i) A549 세포 또는 SW620 세포와 같은 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 하나 이상의 발현의 상향조절; (j) IFNα-2b와 비교하여, IFNAR1에 대한 높은 결합 친화성 및/또는 IFNAR2에 대한 낮은 결합 친화성; 및 (k) 암 세포에서의 p-STAT 발현의 상향조절에서 IFNα-2b보다 B18R에 의한 억제에 대해 낮은 감수성 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11개의 활성을 비교하고 실질적으로 동일한 반응을 제시하는 것을 포함하는, 상기 활성에서의 시험 화합물과 및 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 사이의 실질적 동등성을 확립하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 본 발명은 앞서 언급한 활성 중 적어도 2개, 예컨대 (a) 및 (b); (a) 및 (c); (a) 및 (d); (a) 및 (e); (a) 및 (f); (a) 및 (g); (a) 및 (h); (a) 및 (i); (a) 및 (j); (a) 및 (k); (b) 및 (c); (b) 및 (d); (b) 및 (e); (b) 및 (f); (b) 및 (g); (b) 및 (h); (b) 및 (i); (b) 및 (j); (b) 및 (k); (c) 및 (d); (c) 및 (e); (c) 및 (f); (c) 및 (g); (c) 및 (h); (c) 및 (i); (c) 및 (j); (c) 및 (k); (d) 및 (e); (d) 및 (f); (d) 및 (g); 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(a), (b), (c), 및 (e); (a), (b), (c) 및 (f); (a), (b), (c) 및 (g); (a), (b), (c) 및 (h); (a), (b), (c) 및 (i); (a), (b), (c) 및 (j); (a), (b), (c) 및 (k); (a), (c), (d) 및 (e); (a), (c), (d) 및 (f); (a), (c), (d) 및 (g); (a), (c), (d) 및 (h); (a), (c), (d) 및 (i); (a), (c), (d) 및 (j); (a), (c), (d) 및 (k); (a), (d), (e) 및 (f); (a), (d), (e) 및 (g); (a), (d), (e) 및 (h); (a), (d), (e) 및 (i); (a), (d), (e) 및 (j); (a), (d), (e) 및 (k); (a), (e), (f) 및 (g); (a), (e), (f) 및 (h); (a), (e), (f) 및 (i); (a), (e), (f) 및 (j); (a), (e), (f) 및 (k); (a), (f), (g) 및 (h); (a), (f), (g) 및 (i); (a), (f), (g) 및 (j); (a), (f), (g) 및 (k); (a), (g), (h) 및 (i); (a), (g), (h) 및 (j); (a), (g), (h) 및 (k); (a), (h), (i) 및 (j); (a), (h), (i) 및 (k); (a), (i), (j) 및 (k); (b), (c), (d) 및 (e); (b), (c), (d) 및 (f); (b), (c), (d) 및 (g); (b), (c), (d) 및 (h); (b), (c), (d) 및 (i); (b), (c), (d) 및 (j); (b), (c), (d) 및 (k); (b), (d), (e) 및 (f); (b), (d), (e) 및 (g); (b), (d), (e) 및 (h); (b), (d), (e) 및 (i); (b), (d), (e) 및 (j); (b), (d), (e) 및 (k); 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(a), (c), (d), (e) 및 (f); (a), (c), (d), (e) 및 (g); (a), (c), (d), (e) 및 (h); (a), (c), (d), (e) 및 (i); (a), (c), (d), (e) 및 (j); (a), (c), (d), (e) 및 (k); (a), (d), (e), (f) 및 (g); (a), (d), (e), (f) 및 (h); (a), (d), (e), (f) 및 (i); (a), (d), (e), (f) 및 (j); (a), (d), (e), (f) 및 (k); (a), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (e), (f), (g) 및 (j); (a), (e), (f), (g) 및 (k); (a), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (f), (g), (h) 및 (j); (a), (f), (g), (h) 및 (k); (b), (c), (d), (e) 및 (f); (b), (c), (d), (e) 및 (g); (b), (c), (d), (e) 및 (h); (b), (c), (d), (e) 및 (i); (b), (c), (d), (e) 및 (j); (b), (c), (d), (e) 및 (k); (b), (d), (e), (f) 및 (g); (b), (d), (e), (f) 및 (h); (b), (d), (e), (f) 및 (i); (b), (d), (e), (f) 및 (j); (b), (d), (e), (f) 및 (k); (b), (e), (f), (g) 및 (h); (b), (e), (f), (g) 및 (i); (b), (e), (f), (g) 및 (j); (b), (e), (f), (g) 및 (k); (b), (f), (g), (h) 및 (i); (b), (f), (g), (h) 및 (j); (b), (f), (g), (h) 및 (k); (c), (d), (e), (f) 및 (g); (c), (d), (e), (f) 및 (h); (c), (d), (e), (f) 및 (i); (c), (d), (e), (f) 및 (j); (c), (d), (e), (f) 및 (k); (c), (e), (f), (g) 및 (h); (c), (e), (f), (g) 및 (i); (c), (e), (f), (g) 및 (j); (c), (e), (f), (g) 및 (k); (c), (f), (g), (h) 및 (i); (c), (f), (g), (h) 및 (j); (c), (f), (g), (h) 및 (k); (d), (e), (f), (g), 및 (h); (d), (e), (f), (g), 및 (i); (d), (e), (f), (g), 및 (j); (d), (e), (f), (g), 및 (k); (d), (f), (g), (h) 및 (i); (d), (f), (g), (h) 및 (j); (d), (f), (g), (h) 및 (k); (f), (g), (h), (i) 및 (j); (f), (g), (h), (i) 및 (k); (g), (h), (i), (j) 및 (k)에 있어서; 추가로 선택적으로, 앞서 언급한 활성 중 적어도 6개, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), 및 (f); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (g); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (h); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (j); (a), (b), (c), (d), (e), 및 (k); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (g); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (h); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (i); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (j); (a), (c), (d), (e), (f), 및 (k); (a), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (d), (e), (f), (g) 및 (j); (a), (d), (e), (f), (g) 및 (k); (a), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (a), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (g); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (h); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (i); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (j); (b), (c), (d), (e), (f), 및 (k); (b), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (b), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (b), (d), (e), (f), (g) 및 (j); (b), (d), (e), (f), (g) 및 (k); (b), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (b), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (b), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (h); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (j); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (k); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (i); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (j); (c), (d), (e), (f), (g), 및 (k); (c), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (c), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (c), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (d), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (d), (e), (f), (g), (h) 및 (k)에 있어서; 여전히 추가로 선택적으로, 앞서 언급한 활성 중 적어도 7개, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (g); (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (h); (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (j); (a), (b), (c), (d), (e), (f), 및 (k); (a), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (j); (a), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (k); (a), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (a), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (j); (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (k); (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (k)에 있어서서; 또한 여전히 추가로 선택적으로, 앞서 언급한 활성 중 적어도 8개, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (h); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (j); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (k); (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (a), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (a), (c), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (a), (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (a), (b), (d), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (a), (b), (c), (e), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (e), (f), (g), (h) 및 (j); (a), (b), (c), (e), (f), (g), (h) 및 (k); (a), (b), (c), (d), (f), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (f), (g), (h) 및 (j); (a), (b), (c), (d), (f), (g), (h) 및 (k); (a), (b), (c), (d), (e), (g), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (g), (h) 및 (j); (a), (b), (c), (d), (e), (g), (h) 및 (k); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (h) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (h) 및 (j); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (h) 및 (k); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (i); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (j); (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) 및 (k)에 있어서; 또는 선택적으로, 앞서 언급한 활성 중 적어도 9, 10, 또는 11개 모두, 예컨대 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), (j) 및 (k)에 있어서 실질적 동등성을 확립하는 것을 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 (a) rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물 및 (b) 본원에 기술된 방법들 중 하나 이상을 수행하기 위한 설명서 및 이러한 방법을 수행하기 위한 시약 중 적어도 하나를 포함하는 검정 키트를 제공한다. 시약은 인산완충용액(PBS) 또는 완충액을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 검정 키트에서의 rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물은 명시된 특정 활성을 포함한다.
일부 실시예에서, 시험 인터페론은 또한 암 세포에서 JAK/STAT 신호전달 경로를 통해 신호전달하고/하거나 rSIFN-co와 공통 IFNAR1/2 수용체를 공유하므로, rSIFN-co와 실질적 동등성을 가지거나 rSIFN-co와 실질적으로 동일한 효능을 가진다. 일부 실시예에서, JAK/STAT 경로를 통한 신호전달은 STAT 패밀리, 예컨대 STAT1, STAT2 및/또는 STAT3으로부터 인산화된 단백질의 존재를 검출하는 수단에 의해 검출된다. 일부 실시예에서, 이러한 검출을 위해 웨스턴 블롯이 사용된다. 일부 실시예에서, 이러한 검출을 위해 암 세포 A549 및/또는 Hela 세포가 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 암 세포는 약 10 mcg/ml의 시험 인터페론 또는 rSIFN-co로 처리된다. 일부 실시예에서, 암 세포는 약 5, 15, 30, 60, 120 및/또는 240분 동안 시험 인터페론 또는 rSIFN-co로 처리된다. 일부 실시예에서, 인터페론으로 처리한 후, 웨스턴 블롯 분석을 위해 세포 단백질을 수집한다. 일부 실시예에서, GAPDH가 대조군으로서 사용된다.
일부 실시예에서, rSIFN-co 또는 rSIFN-co 대체물에 대한 동등성 또는 효능을 확립하기 위해 수행되는 시험 또는 활성은 임의의 통상적인의 방식으로 실시될 수 있으며, 본원에 기술된 방식으로 제한되지 않는다.
도 1은 MMC(5 mg/kg) 또는 0.15 mg/마우스, 0.10 mg/마우스 또는 0.05 mg/마우스의 rSIFN-co로 처리하였거나 비히클, 생리식염수(NS)(0.15 ml/마우스)를 주사한 각각의 군에 대해, 처리 시작 후 21일의 기간에 걸쳐 평균 상대 종양 부피(relative tumor volume, RTV)로 나타낸, 실시예 1에 기재된 바와 같은 누드 마우스에서의 인간의 간세포암(hepatoma) 종양 SMMC-7721의 성장 곡선을 나타낸 것이다.
도 2는 MMC(5 mg/kg) 또는 0.15 mg/마우스, 0.10 mg/마우스 또는 0.05 mg/마우스의 rSIFN-co로 처리하였거나 비히클, 생리식염수(마우스당 0.15 ml)를 주사한 각각의 그룹에 대해, 28일의 처리 기간에 걸쳐 RTV로 나타낸, 실시예 2에 기재된 바와 같은 누드 마우스에서의 인간 자궁경부 종양의 성장 곡선을 나타낸 것이다.
도 3은 MMC(5 mg/kg), 또는 0.15 mg/마우스, 0.10 mg/마우스 또는 0.05 mg/마우스의 rSIFN-co, 또는 0.15 mg/마우스의 IFN 알파-2b로 처리하였거나 비히클, 생리식염수(마우스 당 0.15 ml)를 주사한 각각의 그룹에 대해, 28일의 처리 기간에 걸쳐 RTV로 나타낸, 실시예 3에 기재된 바와 같은 누드 마우스에서의 인간 결장 종양 HT-29의 성장 곡선을 나타낸 것이다.
도 4는 MMC(5 mg/kg), 또는 0.15 mg/마우스, 0.10 mg/마우스 또는 0.05 mg/마우스의 rSIFN-co, 또는 0.15 mg/마우스의 IFN 알파-2b로 처리하였거나 비히클, 생리식염수(마우스 당 0.15 ml)를 주사한 각각의 그룹에 대해 21일의 처리 기간에 걸쳐 RTV로 나타낸, 실시예 4에 기재된 바와 같은 누드 마우스에서의 인간 폐 종양 SPC-A4의 성장 곡선을 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5i는 0, 0.2, 0.39, 0.78, 1.56, 3.13, 6.25, 12.50, 25, 50 및 100 mcg/ml(μg/ml)로 나타낸 농도의 rSIFN-co 또는 IFN 알파-2b(IFNα-2b)로 48시간 동안 처리한 후의 상이한 종양 세포의 생존율에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸 것이다. 시험된 세포는 다음과 같다: A549 폐 종양 세포(도 5a); Hela 자궁경부 종양 세포(도 5b); CL-1 간 종양 세포(도 5c); Huh-7 간 종양 세포(도 5d); SW480 결장 종양 세포(도 5e); MDA-MB-231 유방 종양 세포(도 5f); Calu-1 폐 종양 세포(도 5g); SMMC-7721 간 종양 세포(도 5h); 및 PANC-1 췌장 종양 세포(도 5i). 결과는 대조군 세포 대비 세포 생존율의 백분율(percentage)로서 나타내었고, 적어도 2개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
도 6은 1, 2, 3, 4, 5 및 6일로 나타낸 일수 동안 처리한 후의 A549 세포(도 6A) 및 SW620 세포(도 6B)의 생존율에 대한, 각각 10 mcg/ml의 IFN 알파-2b 처리 및 rSIFN-co 처리의 효과를 보여주는 생존율 곡선이다. 세포 생존율은 MTT 검정에 의해 평가하였다. 결과는 대조군 세포 대비 세포 생존율의 백분율로서 나타내었고, 적어도 2개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다(**p<0.01).
도 7은 3D 배양 중, 폐암 세포 A549 상에서, 4일 후 콜로니 형성(1행)(배율 100×) 및 8일 후 침습성 발(invasive feet)(위족) 형성(2행 및 3행)(배율 400×)에 대한, 각각 rSIFN-co 처리(도 7, 컬럼 C) 및 IFN 알파-2b 처리(도 7, 컬럼 B)의 효과를 모의 대조군(도 7, 컬럼 A)과 비교하여 보여주는 현미경 사진이다. 컬럼 A 및 B에서 검은색 화살표는 암 세포로부터 돌출된 위족을 가리킨다. 컬럼 C에서 별표가 있는 화살표는 위족이 없는 세포를 가리킨다.
도 8은 상이한 폐암 세포: A549(도 8의 A); H1299(도 8의 B); 및 H460(도 8의 c), 및 상이한 결장암 세포: HT-29(도 8의 D); 및 SW620(도 8의 E)에서의 베타-카테닌/TCF-매개성 전사 활성에 대한, 각각 rSIFN-co 처리 및 IFN 알파-2b 처리의 효과를 모의 대조군과 비교하여 보여주는 막대형 다이어그램이다. 값은 3개 실험의 평균이었다. (*p<0.05, **p<0.01).
도 9는 상이한 암 세포: A549, H460, SW620 및 HT-29에서 GAPDH의 발현 대비 mRNA 레벨로 측정된 것과 같은 Wnt-관련 수용체 또는 공동수용체 LRP-LRP6(도 9의 A) 및 FZD6(도 9의 B)의 발현에 대한, 각각 rSIFN-co 처리 및 IFN 알파-2b의 처리의 효과를 모의 대조군과 비교하여 보여주는 막대형 다이어그램이다. 실험은 3중으로 수행하였고, 결과는 모의 대조군을 사용하여 정규화하였다.
도 10은 웨스턴 블롯이고, 각각 24시간, 48시간 및 72시간의 처리 후의 암 세포: A549(도 10의 A) 및 SW480(도 10의 B)에서 베타-카테닌 단백질 레벨에 대한, 각각 rSIFN-co 처리 및 IFN 알파-2b 처리의 효과를 모의 대조군과 비교하여 보여주는 것이다.
도 11은 A549 폐암 세포를 rSIFN-co 또는 IFN 알파-2b로 24시간 동안 처리한 후에 Wnt-신호전달 경로의 하류에 있는 4개의 유전자: Axin2(도 11의 A); CD24(도 11의 B); 서바이빈(도 11의 C); 및 ID2(도 11의 D)의 상대적 mRNA 발현 레벨을 모의 대조군과 비교하여 보여주는 막대형 다이어그램이다. 실험은 3중으로 수행하였고, 모의 대조군을 사용하여 정규화하였다.
도 12는 rSIFN-co 또는 IFN 알파-2b로 처리한 상이한 종양 세포: A549, H460, SW620 및 HT-29에서의 3개의 종양 억제 유전자: DKK-3(도 12의 A); BATF2(도 12의 B); 및 KLF4(도 12의 C)의 상대적 mRNA 발현 레벨을 모의 대조군과 비교하여 보여주는 막대형 다이어그램이다. 실험은 3중으로 수행하였고, 모의 대조군을 사용하여 정규화하였다.
도 13은 A549 세포(도 13의 A) 및 SW620 세포(도 13의 B)에 대해, IFN 알파-2b 또는 rSIFN-co로 처리한 후의 종양 세포 이동을 모의 대조군과 비교하여 보여주는 막대형 다이어그램이다. 결과는 이러한 처리 후의 필드(field)당 이동 세포 수의 평균 ± SD 로서 나타내었다. (**p<0.01).
도 14는 각각 모의 대조군 및 5FU 처리된 세포와 비교하여, 24시간 또는 48시간 동안 IFN 알파-2b 또는 rSIFN-co로 처리한 후의 A549 세포(도 14의 A) 및 SW620 세포(도 14의 B)로부터, 프로카스파아제-3, 절단된(cleaved) 카스파아제-3, 프로카스파아제-8, 절단된 카스파아제-8, PARP 및 베타-튜불린(β-tubulin)에 대해 특이적인 항체로 염색한 웨스턴 블롯이다.
도 15는 A549 세포를 10 mcg/ml의 IFN 알파-2b(도 15의 A) 또는 10 mcg/ml의 rSIFN-co(도 15의 B)로 처리한 후에, 또는 Hela 세포를 10 mcg/ml의 IFN 알파-2b(도 15의 C) 또는 10 mcg/ml의 rSIFN-co(도 15의 D)로 처리한 후에, P-STAT1, STAT1, P-STAT2, STAT2, P-STAT3, STAT3 및 GAPDH에 대해 특이적인 항체로 염색한 웨스턴 블롯이다.
도 16은 처리 개시 후 27일의 기간에 걸쳐, IFN 알파-2b 또는 rSIFN-co에 의한 처리 후의 종양 성장의 억제를 PBS 처리된 대조군과 비교하여 보여주는 종양 성장 곡선이다. 데이터는 평균 종양 부피(mm3) ± SD로 나타내었다(n=8).
도 17은, 정적-분석(steady-analysis) 모델에 의해 분석된 것으로서, IFNAR1 인터페론 수용체의 친화 상수(affinity constant)를 나타낸 것이다: KD(IFNAR1-EC/IFNα-2b): 2.835 × 10- 6 mol/L(블랙 다이아몬드) 및 KD(IFNAR1-EC/rSIFN-co): 6.003 × 10- 7 mol/L(블랙 서클)(도 17의 A), 동적-분석(dynamic-analysis) 모델에 의해 분석된 것으로서, IFNAR2 인터페론 수용체의 친화 상수를 나타낸 것이다: KD(IFNAR2-EC/IFNα-2b): 1.843 × 10- 9 mol/L 및 KD(IFNAR2-EC/rSIFN-co): 2.192 × 10-8 mol/L(도 17의 B)와, rSIFN-co/IFNAR1이 IFNα-2b/IFNAR1의 결합 친화성보다 약 4.72배 강한 결합 친화성을 나타내고, rSIFN-co/IFNAR2가 IFNα-2b/IFNAR2의 결합 친화성보다 약 11.9배 약한 결합 친화성을 나타냄을 보여주는, IFNAR1-EC 또는 IFNAR2-EC 각각에 대한 IFNα-2b 및 rSIFN-co의 수용체 결합 친화성의 비교를 보여주는 막대형 다이어그램(도 17 C)이다.
도 18은 미리 각각 1, 10 또는 10 ng/ml의 B18R 재조합 단백질과 함께 배양한 각 1 ng/ml(최종 검정 농도)의 rSIFN-co 또는 IFNα-2b로 암 세포를 처리한 후, P-STAT1, STAT1, P-STAT2, STAT2, P-STAT3, STAT3, 액틴 및 GAPDH에 대해 특이적인 항체로 염색한 웨스턴 블롯이며, 여기에서 상기 암 세포는 A549 세포(도 18의 A) 또는 Hela 세포(도 18의 B)이다.
본 발명은 본원에서 하기 실시예에 의해 추가로 설명되나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 발명은 구체적으로 언급되지는 않지만 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 유용한 것으로 인식되는, 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 존재 또는 부재하에서 실시될 수 있다. 또한, 본 발명의 설명은 본원에서 제한하고자 하는 것이 아니라, 달리 명시되지 않는 한, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 기재된 특징, 요소 또는 제한, 또는 그것의 등가물 또는 변경을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 다양한 다른 실시예는 본원에 제공된 일반적인 설명에 기초하여 실시될 수 있을 것으로 이해된다. 본 발명의 다른 대상, 특징 및 이점은 상기, 및 상세한 설명 및 실시예 및 첨부된 청구범위, 또한 함께 첨부된 도면으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자들에게 명백해질 것이다.
모든 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 나타낸다. T-검정(및 비모수적 검정)을 사용하여 상이한 변수 사이의 관계를 분석하였다. p<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1: 인간 간세포암에 대한 rSIFN -co의 활성
본 연구는 인간 간세포암에 대한 rSIFN-co의 활성 및 효능을 입증하기 위해, 생체 내(in vivo) 시스템에서 모델로서 인간 간세포암 SMMC-7721을 사용하여 수행하였다. 시험 제품인 rSIFN-co의 활성을 미토마이신 C(Mitomycin C, "MMC")의 활성과 비교하였다. 1 mg/ml 농도의 무색 액체인 rSIFN-co는 후이양 라이프 사이언스 앤 테크놀로지 코포레이션(Huiyang Life Science and Technology Corp.)(Chengdu, P.R. China)으로부터 제공받았다. 시험 제품은 희석하지 않고 사용하였다. 이는 주사하기 위해 해동될 때까지 4℃에 보관하였다. 2 mg/바이알의 농도의 미토마이신 C("MMC"), lot# 505 AGB는 쿄와 핫코 코교 컴퍼니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. (Japan))로부터 제공받았다. MMC는 주사시에 생리 식염수로 희석하였다.
동물 실험은 실험실 동물의 관리와 사용에 관한 국립 보건원의 가이드(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행하였다.
사용된 동물은 체중 약 23±2 g의 4-6주령 수컷 BALB/cA nu/nu 마우스로, 상하이 약물학 연구소(Shanghai Institute of Materia Medica)(Shanghai, P.R. China)로부터 입수하였다. 연구 프로토콜은 상하이 약물학 연구소의 동물의 사용 및 관리 위원회가 규정을 준수하여 검토하였으며, 연구 개시 전에 위원회의 승인을 받았다. 가능한 모든 경우에, 본 연구에 사용된 절차는 동물에 대한 불편함, 고통 및 통증을 방지하거나 최소화하도록 설계되었다. 완화될 수 없는 중증의 또는 만성의 통증 또는 고통을 경험한 동물은 규정에 따라 고통 없이 안락사시켰다. 동물을 케이지에 6마리 하우징시켰다. 동물들의 귀를 이어 홀 펀치(ear hole punch) 식별표시로 표시하였다. 온도는 25℃±1℃로 유지하였다. 조명은 12시간 켜고 12시간 끄도록 설정하였다. 음식은 임의로 제공하였다. 5 마이크로미터(μm) 필터로 여과된 수돗물을 동물에게 물병을 통해 임의로 제공하였다. 연구 감독관 또는 후이양 라이프 사이언스 앤 테크놀로지 코포레이션 어느 누구도 음식 또는 물에서 본 연구의 의도 및 목적을 방해하거나 또는 이에 영향을 미칠 수 있는 어떠한 오염물질도 알아차리지 못하였다.
시험 제품(rSIFN-co) 및 비히클 대조군을 각각 종양 내(intratumorally, i.t.)로 투여하였다. 시험 제품을 동물이 배정된 군에 따라, 처리마다 마우스 당 0.05 ml - 0.15 ml의 용량으로 투여하였다. MMC를 10 마이크로리터(μl)/g으로 정맥 내(i.v.)로 투여하였다. 생리식염수를 마우스 당 0.15 ml의 용량으로 주사하였으며, 이를 비히클 대조군으로서 사용하였다.
동물을 처리군에 무작위로 배정하였다. 처음에, 모든 동물을 하나의 큰 동물 케이지에 넣었다. 연구를 위한 배정을 위해, 동물을 나중에 처리군마다 케이지 당 6마리씩 따로 하우징하였다. 각각의 군에 대한 용량 및 투여 요법은 표 1에 제시한 바와 같다. 그룹 1 및 2는 대조군으로, 이들 군의 동물에게는 비히클을 각각 제1 처리 후에 격일로 투여하였다. 그룹 3의 동물에게는 MMC를 5 mg/kg의 용량으로 처리 시작 후 1일 및 6일째에 투여하였다. 그룹 4, 5 및 6의 동물에게는 rSIFN-co를 각각 0.15 mg/마우스(그룹 4) 또는 0.10 mg/마우스(그룹 5) 또는 0.05 mg/마우스(그룹 6)로 제1 처리 후에 격일로 투여하였다. 각각의 종양의 길이 및 폭을 연구 과정 동안 1주에 2회 측정함으로써 종양의 성장을 관찰하였다. 또한, 각각의 동물의 체중을 연구 과정 동안 1주에 2회 측정하였다.
종양인 인간 간세포암 SMMC-7721 이종이식편(human hepatoma SMMC-7721 xenografts)을 5 × 106개 세포를 각각의 마우스에 피하로(s.c.) 접종함으로써, 각 동물에서 확립시켰다. 본 연구의 개시 전에, 이종이식편을 누드 마우스에 2회 계대 접종(passaged twice)하였다. 멸균 조건하에서, 잘-성장한 종양을 1.5 mm3의 단편으로 자르고, 이러한 하나의 단편을 각각의 연구 동물의 우측 측복부에 투관침 주사바늘로 주사하였다. 종양이 100 mm3 - 200 mm3 범위의 부피에 도달하였을 때, 마우스를 대조군 또는 처리군으로 무작위로 분류하고, 각각의 군에 비히클(그룹 1 및 2), rSIFN-co(그룹 4, 5 및 6) 또는 MMC(그룹 3)를 3주의 기간 동안 표 1에 제시된 스케줄 하에 표 1에 제시된 용량으로 제공하였다. 개별 종양 크기(길이 및 폭)를 마이크로캘리퍼로 1주에 2회 측정하였다. 하기 식을 사용하여 종양 부피(V)를 계산하였다: V = (길이 × 폭2)/2. 하기 식을 사용하여 개별 상대 종양 부피(RTV)를 계산하였다: RTV = Vt/V0, 여기에서 Vt는 측정일에서의 종양의 부피이고, V0는 제1 처리일에서의 종양의 부피이다. 시험 제품 또는 대조군 제품의 치료 효과는 하기 식을 사용하여 T/C(%)로 나타내고: T/C(%) = (처리군의 평균 RTV/대조군의 평균 RTV)×100%; 하기 식을 사용하여 % 억제로 나타내었다: % 억제 = 100% - T/C%.
실시예 1에 대한 용량 레벨 및 그룹 식별
그룹 n 처리 용량 투여 스케줄
1 6 비히클 NA 격일
2 6 비히클 NA 격일
3 6 MMC 5 mg/kg 1일 및 6일째
4 6 rSIFN-co 0.15 mg/마우스 격일
5 6 rSIFN-co 0.10 mg/마우스 격일
6 6 rSIFN-co 0.05 mg/마우스 격일
결과는 표 2 및 도 1에 나타내었다. 표 2는 각각의 처리군에 대한, 0일에서의 최초 종양 크기, 21일에서의 최종 종양 크기뿐만 아니라 계산된 평균 RTV, T/C% 및 % 억제를 보여준다.
인간 간세포암 SMMC-7721에 대한 rSIFN-co의 활성
처리 TV
(mm3, 평균±SD)
(D0)		 TV
(mm3, 평균±SD)
(D21)		 RTV
(평균±SD)		 T/C(%) % 억제 P 값
생리식염수
(12 마우스)		 129±26 1172±302 9.36±3.9
MMC 125±35 621±247 5.05±2.1* 52.82 47.18 p<0.05
0.15 mg
rSIFN-co		 123±20 505±226 4.13±1.9** 43.20 56.80 p<0.01
0.10 mg
rSIFN-co		 124±15 573±287 4.57±2.3* 47.80 52.20 p<0.05
0.05 mg
rSIFN-co		 124±26 592±139 4.97±1.7* 51.99 48.01 p<0.05
표 2는 rSIFN-co가 시험된 모든 3가지의 용량에서 인간 간세포암 세포의 성장을 억제하는데 있어서 활성을 가지며 효과적이었음을 보여준다. 21일에서의 평균 RTV는 비히클 대조군의 경우 9.36 ± 3.9, MMC 처리군의 경우 5.05 ± 2.1, 0.15 mg rSIFN-co 처리군의 경우 4.13 ± 1.9, 0.10 mg rSIFN-co 처리군의 경우 4.57 ± 2.3, 및 0.05 mg rSIFN-co 처리군의 경우 4.97 ± 1.7이었다. 21일에서의 % 억제는 MMC 처리군의 경우 47.18%, 0.15 mg rSIFN-co 처리군의 경우 56.80%, 0.10 mg rSIFN-co 처리군의 경우 52.20%, 및 0.05 mg rSIFN-co 처리군의 경우 48.01%였다. 각각의 처리군 및 비히클 대조군 사이의 RTV의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 결정되었다.
도 1은 처리 시작 후 3일, 7일, 10일, 14일, 17일 및 21일에 이루어진 종양 측정을 반영하여, 21일의 연구 기간에 걸쳐 각각의 처리군에 대해 RTV로 나타낸, 누드 마우스에서의 인간 간세포암 SMMC-7721의 성장의 진행을 보여준다. 결과는 7일에서의 각각의 MMC 처리군 및 rSIFN-co 처리군에서 종양의 성장이 지연되었으며, 이는 21일까지 유지되었음을 보여준다. 결과는 또한 rSIFN-co의 용량이 높을수록 억제가 더 커지는 경향을 보여준다.
시험 제품으로 처리된 모든 동물에서 시험된 투여량은 독성의 징후 또는 체중의 감소없이 잘 받아들여졌다. 비히클군, MMC 치료군, 0.15 mg rSIFN-co 치료군, 0.10 mg rSIFN-co 치료군, 및 0.05 mg rSIFN-co 치료군에 대한 동물의 평균 체중(그램 단위)은 각각 0일(및 제21일)에: 22.7 (24.8); 23.9 (25.4); 23.7 (25.3); 24.3 (26.2); 및 22.6 (24.4) 이었다.
실시예 2. 인간 자궁경부암에 대한 rSIFN -co의 활성
본 연구는 모델로서 Hela 세포를 사용하여, 인간 자궁경부 종양의 치료에 대한 rSIFN-co의 활성 및 효능을 입증한다. 결과는 rSIFN-co가 인간 자궁 경부암 세포의 성장을 억제하는데 있어서 활성을 가지며 효과적이었음을 보여준다. 연구는 달리 특별히 나타낸 것을 제외하고는 실시예 1에서와 같이 수행하였다. 우선 인간 자궁경부암 이종이식편은 5 × 106의 Hela 세포를 누드 마우스에 피하로 접종하고, 잘-성장한 이종이식편을 누드 마우스에 2회 계대접종함으로써 실시예 1에서와 유사한 방식으로 확립하고 준비하였다. 그 후, 동물에 피하로 이식하기 위해 1.5 mm3의 단편을 준비하였다. 동물의 체중은 투여 시작시에 평균 19 ± 2 g이었다. 실시예 1과는 대조적으로, 사용된 동물은 모두 암컷이었다. 각각의 처리군에 대한 용량 및 투여 용법은 MMC를 0일째에 처리를 시작한 후 1일 및 13일째에 주사하고 연구를 처리 시작 후 28일의 기간에 걸쳐 지속한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 유사하였다.
결과는 표 3 및 도 2에 나타내었다. 표 3은 0일 및 28일째에 계산된 평균 TV뿐만 아니라, 계산된 평균 RTV, T/C(%) 및 % 억제 또한 보여준다. 28일(D28)에서의 RTV는 비히클 대조군의 경우 12.45 ± 4.46, MMC 처리군의 경우 4.97 ± 1.85, 0.15 mg rSIFN-co 처리군의 경우 7.42 ± 1.91, 0.10 mg rSIFN-co 처리군의 경우 6.64 ± 2.04, 및 0.05 mg rSIFN-co 처리군의 경우 6.64 ± 1.60이었다. 28일에서의 % 억제는 MMC 처리군의 경우 60.08%, 0.15 mg rSIFN-co 처리군의 경우 40.40%, 0.10 mg rSIFN-co 처리군의 경우 46.67%, 및 0.05 mg rSIFN-co 처리군의 경우 46.67%였다. MMC 처리군, 0.15 mg rSIFN-co 처리군, 0.10 mg rSIFN-co 처리군 및 0.05 mg rSIFN-co 처리군에 해당하는 T/C(%)는 각각 39.92%, 59.60%, 53.33% 및 53.33%였다. 각각의 처리군과 비히클 대조군 사이의 RTV의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 결정되었다. 결과는 rSIFN-co가 시험 동물에서 인간 자궁경부암의 성장을 억제하는데 효과적이었음을 보여주었다.
인간 자궁경부암 Hela 이종이식편에 대한 rSIFN-co의 활성
처리 TV
(mm3, 평균±SD)
(D0)		 TV
(mm3, 평균±SD)
(D28)		 RTV
(평균±SD)		 T/C(%) % 억제 P 값
생리식염수
(12 마우스)		 138±25 1720±756 12.45±4.46
MMC 130±28 676±358 4.97±1.85** 39.92 60.08 p<0.01
0.15 mg
rSIFN-co		 136±25 1025±440 7.42±1.91* 59.60 40.40 p<0.05
0.10 mg
rSIFN-co		 135±28 865±186 6.64±2.04** 53.33 46.67 p<0.01
0.05 mg
rSIFN-co		 135±26 886±232 6.64±1.60** 53.33 46.67 p<0.01
도 2는 처리 시작 후 4일, 7일, 11일, 14일, 18일, 21일, 25일 및 28일에 이루어진 종양 측정을 반영하여, 28일의 연구 기간에 걸친 각각의 처리군에 대한 RTV의 진행을 보여준다. 결과는 7일에서 각각의 MMC 처리군 및 rSIFN-co 처리군에서의 인간 자궁경부 종양의 성장이 지연되었으며, 이는 28일까지 유지되었음을 보여주었다.
연구된 모든 동물에서 rSIFN-co 처리는 독성의 징후 없이 받아들여졌다. 28일의 연구 기간에 걸쳐 매우 적은 평균 체중의 변화가 관찰되었다.
실시예 3. 인간 결장암에 대한 rSIFN -co의 활성
본 연구는 모델로서 HT-29를 사용하여 인간 결장암의 치료에 대한 rSIFN-co의 활성 및 효능을 입증하기 위해 수행하였다. 결과는 rSIFN-co가 인간 결장암 세포의 성장을 억제하는데 활성을 가지며 효과적이었음을 보여주었다. 본 연구는 달리 특별히 지시한 것을 제외하고는 실시예 1에서와 같이 수행하였다. 우선 인간 결장암 이종이식편은 5 × 106의 HT-29 세포를 누드 마우스에 피하로 접종하고, 잘-성장한 이종이식편을 누드 마우스에 2회 계대접종함으로써, 실시예 1에서와 유사한 방식으로 확립시켜 준비하였다. 그 후, 시험 동물에 피하(s.c.) 이식하기 위해 1.5 mm3의 단편을 준비하였다. 동물의 체중은 투여 시작시에 평균 20 ± 2 g이었다. 실시예 1과는 대조적으로, 본 연구에 사용된 동물은 모두 암컷이었다. 각각의 처리군에 대한 용량 및 투여 요법은 MMC를 1일 및 10일째에 그룹 3에 투여하고, 그룹 내의 각각의 마우스를 0.15 ml의 부피 및 0.15 mg/마우스의 용량의 IFN 알파-2b로 rSIFN-co 처리군에서와 같이 격일로 처리하고, 그러한 처리를 총 4주 동안 수행하는 추가적인 그룹인 그룹 7을 추가하는 것을 제외하고는, 실시예 1에 제시된 바와 같다. 1.41 mg/ml의 농도의 이러한 IFN-알파-2b는 후이양 라이프 사이언스 앤 테크놀로지 코포레이션으로부터 제공받았다. 결과는 표 4 및 도 3에 나타내었다.
처리 TV
(mm3, 평균±SD)
(D0)		 TV
(mm3, 평균±SD)
(D28)		 RTV
(평균±SD)		 T/C(%) % 억제 P 값
생리식염수
(12 마우스)		 131±23 1107±424 8.41±2.82
MMC
(5 mg/kg)		 132±22 395±95 3.12±1.19*** 37.10 62.9 p<0.001
rSIFN-co
0.15 mg 		131±36 570±144 4.51±1.25** 53.63 46.37 p<0.01
rSIFN-co
0.10 mg		 128±39 541±196 4.22±0.87** 50.18 49.82 p<0.01
rSIFN-co
0.05 mg		 130±26 416±166 3.28±1.25*** 39 61 p<0.001
IFN알파-2b
0.15 mg		 128±44 831±420 6.26±1.43 74.44 25.56 p>0.05
표 4는 0일에서 계산된 최초 평균 TV 및 28일에서의 최종 평균 TV뿐만 아니라 계산된 평균 RTV, T/C(%) 및 % 억제 또한 보여준다. 28일(D28)에서의 RTV는 비히클 대조군의 경우 8.41 ± 2.82, MMC 처리군의 경우 3.12 ± 1.19, 0.15 mg rSIFN-co 처리군의 경우 4.51 ± 1.25, 0.10 mg rSIFN-co 처리군의 경우 4.22 ± 0.87, 0.05 mg rSIFN-co 처리군의 경우 3.28 ± 1.25, 및 IFN 알파-2b 처리군의 경우 6.26 ± 1.43이었다. 28일에서의 % 억제는 MMC 처리군의 경우 62.9%, 0.15 mg rSIFN-co 처리군의 경우 46.37%, 0.10 mg rSIFN-co 처리군의 경우 49.82%, 0.05 mg rSIFN-co 처리군의 경우 61%, 및 0.15 mg IFN 알파-2b 처리군의 경우 25.56%였다. MMC 처리군, 0.15 mg rSIFN-co 처리군, 0.10 mg rSIFN-co 처리군, 0.05 mg rSIFN-co 처리군 및 IFN 알파-2b 처리군에 해당하는 T/C(%)는 각각 37.10%, 53.63%, 50.18%, 39.00% 및 74.44%였다. 결과는 rSIFN-co가 인간 결장암 세포의 성장을 억제하는데 있어서 IFN 알파-2b보다 더 효과적이었음을 보여주었다. 각각의 처리군 및 비히클 대조군 사이의 RTV의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 결정되었다.
도 3은 처리 시작 후 3일, 7일, 10일, 14일, 17일, 21일, 24일 및 28일에 이루어진 종양 측정을 반영하여, 각각의 치료군에 대하여 28일의 연구 기간에 걸쳐 RTV로 나타낸, 인간 대장 종양의 성장의 억제를 보여준다. 결과는 7일에 각각의 MMC 처리군 및 rSIFN-co 처리군에서 인간 대장 종양 성장이 지연되었으며, 이는 28일까지 유지되었음을 보여주었다. 3가지 용량의 rSIFN-co는 각각 종양 성장을 IFN 알파-2b보다 더 억제하였다.
실시예 1 및 2에서와 같이, 모든 rSIFN-co 처리된 동물에서 시험된 투여량이 받아들여졌고, 약물 독성의 징후는 나타나지 않았으며 최소의 체중 변화가 나타났다.
실시예 4. 인간 폐암에 대한 rSIFN -co의 활성
본 연구는 모델로서 SPC-A4를 사용하여, 인간 폐암의 치료에 대한 rSIFN-co의 활성 및 효능을 입증하기 위해 수행하였다. 결과는 rSIFN-co에 의한 인간 폐 종양 성장의 유의한 억제, 및 rSIFN-co가 IFN 알파-2b보다 훨씬 더 효과적이었음을 보여주었다. 본 연구는 달리 특별히 지시한 것을 제외하고는, 실시예 3에서와 같이 수행하였다. 우선 시험 동물에 주사하기 위한 인간 이종이식편은 2.5 × 106의 SPC-A4 세포를 누드 마우스에 피하로 접종하고, 잘-성장한 종양을 누드 마우스에 2회 계대접종함으로써, 실시예 1에서와 유사한 방식으로 확립하여 준비하였다. 시험 동물에 피하로 이식하기 위하여 1.5 mm3의 단편을 사용하였다. 동물의 체중은 투여 시작시에 22 ± 2 g이었다. 실시예 3과는 대조적으로, 본 연구에 사용된 동물은 모두 수컷이었고, 연구는 21일의 처리 기간에 걸쳐 수행하였다. 각각의 처리군에 대한 용량 및 투여 요법은, MMC를 1일 및 6일째에 그룹 3에 투여하는 것을 제외하고는 실시예 3에 제시한 바와 같다. 결과는 표 5 및 도 4에 나타내었다.
누드 마우스에서의 인간 폐암 SPC-A4 이종이식편의 성장에 대한 rSIFN-co의 효능
처리 TV
(mm3, 평균±SD)
(D0)		 TV
(mm3, 평균±SD)
(D21)		 RTV
(평균±SD)		 T/C(%) % 억제 P 값
생리식염수
(12 마우스)		 168±42 7133±2708 42.54±2.82
MMC
(5 mg/kg)		 166±42 1831±540 11.54±4.37*** 27.13 72.87 p<0.001
rSIFN-co
0.15 mg 		169±40 2284±653 13.72±3.96** 32.25 67.75 p<0.01
rSIFN-co
0.10 mg		 168±49 2388±1544 14.91±11.19** 35.05 64.95 p<0.01
rSIFN-co
0.05 mg		 170±41 2244±1043 15.45±9.07** 36.32 63.68 p<0.01
IFN알파-2b
0.15 mg		 191±44 4908±2433 27.84±15.51 65.47 34.53 p>0.05
도 4는 처리 시작 후 4일, 7일, 11일, 14일, 18일 및 21일에 이루어진 종양 측정을 반영하여, 각각의 처리군에 대해 21일의 연구 기간에 걸쳐 RTV로 나타낸, 누드 마우스에서의 인간 폐 종양의 성장의 억제를 보여준다. 결과는 7일에 각각의 MMC 처리군 및 rSIFN-co 처리군에서 종양 성장이 지연되었으며, 연구가 종료되는 23일까지 유지되었음을 보여주었다. IFN 알파-2b 처리군에서는 종양 억제가 11일까지 보이지 않았다. IFN 알파-2b에 의한 종양 성장의 억제는 어떠한 rSIFN-co 처리군에 의한 것보다도 적었으며, 통계적으로 유의하지 않았다(p>0.05). 그러므로, rSIFN-co는 인간 폐암 세포의 성장을 억제하는데 있어서 IFN 알파-2b보다 더욱 효과적이었다.
실시예 1-3에서와 같이, 모든 동물에서 시험 제품의 시험된 투여량이 받아들여졌으며, 독성의 징후 또는 체중 감소도 관찰되지 않았으나, 예외적으로 0.05 mg rSIFN-co 처리군에서의 1마리의 마우스가 알려지지 않은 이유로 17일째에 사망하였다.
실시예 5. rSIFN -co는 다양한 인간 고형 암 세포의 생존율을 감소시켰다.
세포 배양 및 시약. 인간 폐암 세포주(A549, H1299, H460, Calu-1), 인간 간암 세포주(SMMC-7721, Huh-7, CL-1), 인간 자궁경부 암종 세포주(Hela), 인간 유방암 세포주(MDA-MB-231), 인간 췌장암 세포주(PANC-1) 및 인간 결장암 세포주(SW620, HT29, SW480)를 상하이 셀 컬렉션(Shanghai, China)으로부터 구입하였다. 상기 세포주를 4 mM 글루타민, 50 U/ml 페니실린 및 50 mg/ml 스트렙토마이신이 보충되고, 10% 열-불활성화 소 태아 혈청(heat-inactivated fetal bovine serum)(Biochrom, Germany)이 포함된, 상하이 셀 콜렉션에서 제조된 상응하는 완전 성장 배지 중에서 5% CO2 하, 37℃에서 배양하였다. 완전 성장 배지는 A549의 경우 F-12K(lot # GNM21127; Hangzhou Gino Bio-Medical Technology Ltd.); SW620 및 MDA-MB-231의 경우 L-15(lot # 41300-039, GIBCO); 및 SMMC-7721, Hela, Huh-7, CL-1 및 PANC-1의 경우 DMEM(lot # C11995, GIBCO); H460, H1299 및 SW480의 경우 RMPI-1640(lot # C11875, GIBCO); HT-29의 경우 Macro5a(lot # M4892, Sigma); 및 Calu-1의 경우 DMEM + 10% FBS였다.
웰당 100 μl 완전 배지에 약 5 × 103개의 세포를 96-웰 플레이트에 넣고, 밤새 배양한 후, 각각 100 μg/ml, 50 μg/ml, 25 μg/ml, 12.5 μg/ml, 6.25 μg/ml, 3.13 μg/ml, 1.56 μg/ml, 0.78 μg/ml, 0.39 μg/ml 및 0.20 μg/ml의 농도의 IFN α-2b 또는 rSIFN-co로 약 48시간 동안 처리하고, 그 시점에서 분석을 위해 세포를 수집하였다. 세포 생존율을 선바이오 에이엠-블루(SunBio Am-Blue) 검정 키트(Cat#: SBAB8025, Shanghai SBO Medical Biotechnology Co., Ltd, Shanghai, China)로 평가하였다. 그것의 프로토콜에 따라, 10 μl 에이엠-블루를 각각의 웰에 첨가하였다. 그 후, 세포를 5% CO2하에 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 플레이트를 30초 동안 진탕시킨 후, 각 웰에 대한 흡광도를 써모 사이언티픽 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher Scientific, Inc., Lowell, MA)로 570 nm 및 595 nm 모두에서 판독하였다. 상대 세포 생존율을 다음과 같이 계산하였다: 세포 생존율 = (처리군(OD570-OD595) - 블랭크(OD570-OD595) / (대조군(OD570-OD595) - 블랭크(OD570-OD595)) × 100%, 여기에서 대조군은 해당 비처리 세포이다. 결과는 도 5a 내지 도 5i에 나타내었으며, 여기에서 종양 세포의 생존율은 비처리 대조군 세포에 대한 백분율로 나타내었다. 각각의 데이터 포인트는 적어도 2회의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5i는 암 세포의 생존율을 감소시킴에 있어서, rSIFN-co 또는 IFNα-2b 중 하나로 처리된 각각의 암 세포주인 (a) 내지 (d)에 대한 용량 반응 곡선을 나타낸다. (a) A549 세포; (b) Hela 세포; (c) CL-1 세포; (d) Huh-7 세포; (e) SW480 세포; (f) MDA-MB-231 세포; (g) Calu-1 세포; (h) SMMC-7721 세포; (i) PANC-1 세포.
결과는 IFNα-2b가 심지어 시험된 최고 농도(100 μg/ml)에서도 A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, SW480 세포 및 SMMC-7721 세포의 생존율을 감소시키는데 있어서 효과가 전혀 없거나 또는 매우 적음을 보여주었다. 100 mcg/ml(μg/ml)의 IFNα-2b를 사용하여 Huh-7 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포 및 PANC-1 세포를 처리한 경우, 생존율에 50% 미만의 감소가 보였다. 대조적으로, rSIFN-co는 종양 세포 생존율을 훨씬 더 낮은 용량에서 용량 의존적 방식으로 감소시킬 수 있었고, SW480 세포, MDA-MB-231 세포 및 PANC-1 세포의 경우 6.25 μg/ml 및 12.5 μg/ml 사이의 농도에서, A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, Calu-1 세포 및 SMMC-7721 세포의 경우 12.5 μg/ml 및 25 μg/ml 사이의 농도에서 세포 생존율이 거의 50% 감소하였다. 일반적으로, 세포 생존율을 감소시키는데 있어서 rSIFN-co에 대한 IC50은 상이한 암 세포에 대해 약 10 mcg/ml 내지 18 mcg/ml의 범위였다. 100 mcg/ml의 rSIFN-co에서, 세포 생존율은 어떠한 암 세포주에서도 검출할 수 없었다. 따라서, rSIFN-co는 종양 세포 생존율을 감소시키는데 있어서 각각의 시험된 농도에서 IFN 알파-2b보다 더욱 효과적이었다.
실시예 6A. rSIFN -co는 세포 생존율을 감소시키는데 있어서 IFN 알파-2b보다 더욱 효과적이었다.
rSIFN-co가 세포 생존율을 감소시키는 능력을 입증하기 위하여, A549 및 SW620 종양 세포를 각각 웰당 100 μl의 완전 배지에 2 × 103개로 96-웰 플레이트에 넣고, 1-6일 동안 각각 10 μg/ml의 rSIFN-co 또는 IFN 알파-2b로 처리하였다. 세포 생존율을 표준 MTT 검정[3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 검정, Sigma, St. Louis, MO)로 평가하였다. 검정를 위해, 약 20 μl의 MTT(4 mg/ml)를 각 웰에 첨가하였다. 세포를 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. 그 후, 각각의 웰의 상층액을 조심스럽게 따라내고, 이어서 동등한 부피(150 마이크로리터)의 디메틸 술폭시드(DMSO)를 각각의 웰에 첨가하고, 15분 동안 진탕기에서 철저하게 혼합하였다. 플레이트로부터의 흡광도를 써모 사이언티픽 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher Scientific Inc., Lowll, MA)로 595 nm에서 판독하였다. 상대 세포 생존율을 다음과 같이 계산하였다: 세포 생존율 = (처리군(OD595) - 블랭크(OD595) / (대조군(OD595) - 블랭크(OD595)) × 100%.
결과는 비처리 대조군 세포에 대한 백분율로 나타내었다. 각각의 데이터 포인트는 적어도 두 번(2회)의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 도 6에 나타난 바와 같이, rSIFN-co는, 만약 존재한다 하더라도 매우 적은 시간-의존적 효과를 나타내는 IFN 알파-2b와는 대조적으로, SW620 세포의 세포 생존율을 시간-의존적 방식으로 강하게 감소시켰다. rSIFN-co의 시간 의존적 효과는 또한 A549 세포의 경우 처리 시 단지 처음 약 3일 동안에만 뚜렷하였다. 각각의 세포주에 대한 각각의 시점에서의 rSIFN-co 및 IFN 알파-2b 사이의 효과의 차이는 통계적으로 유의하였다(p<0.01). 이들 데이터는 시간-의존적 방식으로 rSIFN-co의 강한 항-종양 효과를 보여주었다.
실시예 6B. rSIFN -co는 생체 내에서 종양 성장을 억제하였다.
본 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드에 따라 수행하였다. 4-5 주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스를 상하이 실험 동물 센터(Shanghai Experimental Animal Center)(Shanghai, China)로부터 입수하였다. 이종이식 종양을 확립시키기 위해 약 5 × 106개의 A549 세포를 각각의 마우스에 피하로 주사하였다. 동물을 무작위로 3개의 군으로 분류하고(군당 8마리의 마우스), PBS(1 × PBS, pH 7.2-7.4), 마우스당 100 μg/100 μl의 rSIFN-co, 또한 마우스당 100 μg/100 μl의 IFNα-2b를 격일로 12회 종양 내로 처리하였다. 종양을 3일마다 측정하고, 종양 부피를 다음과 같이 계산하였다: 종양 부피 (mm3) = (길이 × 폭2)/2. 결과는 도 16에 나타내었다. 데이터는 평균 ± SD로 나타내었다(n=8). 결과는 rSIFN-co가 PBS 처리군과 비교하여 확립된 종양의 성장의 거의 완전하게 억제할 수 있음을 입증한다(p<0.0001). 그러나, IFNα-2b는 종양 성장의 주목할 만한 억제를 나타내지 못하였다. 결과는 rSIFN-co가 생체 내에서 종양 성장을 억제하는데 있어서 IFNα-2b보다 더욱 효과적이었음을 나타내었다.
실시예 6C. rSIFN -co는 3차원 배양 시스템에서 종양 세포에 의한 콜로니 형성 및 침습성 발 형성( 위족 형성)을 억제하였다.
매트리겔(BD Corporation, Cat#: 356234)을 4℃ 냉장고에서 밤새 얼음 상에서 해동시키고, 24-웰 플레이트를 -20℃에서 밤새 동결시켰다. 그 후, 동결된 24-웰 플레이트의 각각의 웰을 1.0 mg/ml로 150 μl의 매트리겔을 사용하여 코팅하였다. 매트리겔로 코팅된 플레이트를 20-30분 동안 37℃에서 배양하였다. 폐암 세포인 A549를 트립신처리하고, 계수하였다. 2% 매트리겔 및 10 mcg/ml의 IFN 알파-2b 또는 rSIFN-co를 함유하는, 또는 대조군으로서 인터페론을 함유하지 않는 조건화 배지 중 약 5 × 103개의 세포를 매트리겔이 코팅된 웰상에 시딩하였다. 세포를 적어도 약 8일 동안 37℃에서 배양하였다. 약 200 μl의 상기 조건화 배지를 3일마다 첨가하여 배지가 마르지 않도록 하였다. 콜로니의 크기 및 침습성 발(위족) 형성을 관찰하기 위해 4일 또는 8일째에 사진을 촬영하였다. 실험을 3중으로 수행하였다.
결과는 도 7에 나타내었다. 4일 후, rSIFN-co 처리군(도 7C)는 비처리군(도 7A)보다 더 작은 콜로니를 갖는 것으로 밝혀졌다. 8일 후, rSIFN-co 처리군은 3개의 군 중에서 가장 작은 콜로니를 가질 뿐만 아니라 세포 주변에 돌출된 위족이 거의 없는 것으로 밝혀진 반면(도 7C, 2행 및 3행), 비처리군(도 7A, 2행 및 3행) 및 IFN 알파-2b 처리군(도 7B, 2행 및 3행)의 세포에서는 위족 형성이 분명하였다. 본 실험은 rSIFN-co가 암 세포 콜로니의 성장을 억제할 수 있을뿐만 아니라, 전이에 필수적인 특징인 암 세포에서의 침습성 발 형성을 억제할 수 있음을 보여준다.
실시예 7. rSIFN -co에 의한 베타- 카테닌 / TCT 전사 활성의 억제
베타- 카테닌 / TCF 전사 리포터 검정. Wnt/베타-카테닌 신호전달에 대한 rSIFN-co의 효과를 시험관 내에서 결정하였다. 암 세포를 96-웰 플레이트에 넣고(웰당 1 × 104개의 세포), 12시간 배양하고, 그 후 그것들을 100 ng TOPFlash(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염 효율을 정규화하기 위해, 세포를 SV40 프로모터인 pRL-SV40(Promega, Madison, WI, USA)하에 구동되는 내부 대조군 리포터 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) 루시페라아제 1 ng과 공동-형질감염시킨 후, 6시간 동안 형질감염 후에 10 mcg/ml 인터페론, rSIFN-co 또는 IFN 알파-2b로 처리하거나 대조군(모의)으로서 처리하지 않고 두었다. 24시간 동안 인터페론 처리 후, 제조업체의 프로토콜(Cat#: E1960, Promega)에 따라 2중 루시페라아제 검정 시스템 키트(Dual Luciferase Assay System kit)를 사용하여 루시페라아제 검정을 수행하였다. 상대적 루시페라아제 활성을 반딧불이/레닐라 루시페라아제 활성의 비로 보고하였다. 실험을 3중으로 수행하였다.
도 8에 나타낸 결과는 rSIFN-co가 인간 고형 암 세포에서 베타-카테닌/TCF 매개성 전사 활성을 감소시켰음을 나타내었다. 24시간 동안 처리 후, 베타-카테닌/TCF-매개성 전사 활성은 3가지 폐암 세포(A549, H1299, H460) 및 2가지 결장암 세포(HT-29, SW620)에서 rSIFN-co에 의해 유의하게 억제되었다(*, p<0.05, **, P<0.01). 그러나, A549 세포, H1299 세포, H460 세포 및 HT-29 세포에서 IFN 알파-2b의 억제 효과는 나타나지 않았고, 억제 대신 증가(enhancement)를 초래하였다.
간단하게는, 대조군, IFN 알파-2b 처리군 및 rSIFN-co 처리군에 대한 반딧불이/레닐라 비는 각각 (A) A549 세포의 경우: 약 310, 약 350, 및 약 100; (B) H1299 세포의 경우: 약 800, 약 1000, 및 약 500; (C) H460 세포의 경우: 약 450, 약 500, 및 약 280; (D) HT-29 세포의 경우: 약 300, 약 600, 및 약 200; (E) SW620 세포의 경우: 약 1500, 약 1200, 및 약 100 미만이었다. 본 연구는 rSIFN-co가 Wnt/TCF 신호전달의 억제 및 그에 따른 그것의 항종양 효과에 있어서 IFNα-2b보다 우수하였음을 보여준다.
실시예 8. rSIFN -co는 암 세포에서 베타- 카테닌 단백질 레벨을 감소시켰다.
암 세포인 A549 및 SW480을 약 85%의 전면생장률(confluency)까지 배양하고, 6웰 플레이트에 넣었다. 세포를 각각 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 10 mcg/ml IFNα-2b 또는 rSIFN-co로 처리하거나, 대조군(모의)으로서 처리하지 않고 두었다. 처리 후, 내인성 로딩 대조군으로서 GAPDH와 함께 그것의 특이적 항체를 사용하여 베타-카테닌 단백질 레벨을 검출하기 위한 웨스턴 블롯을 위해 세포를 수집하였다. 실험을 3중으로 수행하였다.
웨스턴 블롯 분석. 다양한 단백질의 발현을 결정하기 위해, 세포를 플레이트로부터 수집하고, 제조업체의 프로토콜(Beyotime, China)에 따라 추출 시약(Cat#: P0013)을 사용하여 총 세포 단백질을 추출하였다. 총 단백질 농도를 로우리 단백질 검정 키트(Bio-Rad, USA)로 결정하였다. 총 단백질을 소디움-도데실술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium-dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)에 의해 10% - 12% 겔 상에서 분리하고, 0.22 또는 0.45 μm PVDF 멤브레인(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)에 전사시켰다. 멤브레인을 5% 탈지유, 소 혈청 알부민, 10 mmol/L 트리스-HCl(pH 8.0), 150 mmol/L NaCl, 및 0.05% 트윈-20으로 밤새 4℃에서 차단시켰다. 차단된 멤브레인을 1차 항체(1:1000 희석)와 배양한 후에 2차 HRP-접합 항체와 배양하였다. 블롯을 수퍼 시그널 웨스트 피코 화학발광 기질 키트(Super signal west pico chemiluminescent substrate kit)(Thermo scientific, USA)와 발광/형광 이미징 LAS4000 시스템(GE Healthcare Life Science, USA)을 사용하여 시각화하였다.
이러한 결정을 위해 사용된 1차 항체는 마우스 모노클로날 항-베타-카테닌 항체(1:1000; Santa Cruz Technology, Santa Cruz, CA) 및 마우스 모노클로날 항-GAPDH 항체(1:2000)(Kangwei Biotechnology, China)였다. 항-마우스 HRP-접합 2차 항체(Santa Cruz Technology, Santa Cruze, CA)는 1:2000의 농도로 사용하였다. 도 10에 나타낸 결과는 A549 세포와 관련하여, rSIFN-co가 2일 (48시간) 동안 처리 후에 베타-카테닌 단백질 레벨을 현저하게 감소시켰음을 입증한다. 이들 세포에서, 3일 (72시간) 동안 처리 후에 추가 감소가 관찰되었다. SW480 세포에서의 베타-카테닌 단백질 레벨의 감소는 rSIFN-co를 이용한 처리 72시간 후에 명백해졌다. 베타-카테닌의 하향조절은 폐암 A549 세포 및 결장암 SW480 세포 모두에서 뚜렷하게 시간 의존적이었다. 대조적으로, IFN 알파-2b는 베타-카테닌 레벨의 어떠한 뚜렷한 감소도 유발하지 않았으며, 이는 이것이 베타-카테닌의 하향조절에 영향을 미치지 않았음을 시사한다.
실시예 9. rSIFN -co는 Wnt 경로 매개성 표적 유전자의 전사적 하향조절을 유도하였다.
폐암 A549 세포를 6웰 플레이트에 시딩하고, 각각 10 μg/ml의 IFN 알파-2b 또는 rSIFN-co로 처리하거나 대조군(모의)으로서 처리하지 않고 두었다. 24시간 처리 후, 트리졸 시약을 사용하여 세포 총 mRNA를 단리하고, cDNA를 합성하고, 4가지 Wnt 신호전달 하류 유전자인 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2의 특이적 프라이머를 사용하여 qPCR에 추가로 적용하였다. 실험을 3중으로 수행하고, 모의 군을 사용하여 정규화하였다.
정량적 PCR ( qPCR ) 분석. 제조업체의 지침에 따라 트리졸 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 총 mRNA를 단리하였다. 제조업체의 지침에 따라 RT-PCR 키트(Cat#: FSQ-101, TOYOBO, Japan)를 사용하여 상보적 DNA(cDNA)를 합성한 후, SYBR 그린 PCR 키트(Cat#: QPK-201, TOYOBO, Japan)를 사용하여 qPCR에 적용하였다. 4가지 Wnt 경로 표적 유전자의 프라이머는 다음과 같다: Axin2 센스 프라이머: 5'- CGTGGATACCTTAGACTT-3' (서열번호 8) 및 안티센스 프라이머: 5'-GCTGTTGTTCTCAATGTA-3'(서열번호 9); CD24 센스 프라이머: 5'- TGAAGAACATGTGAGAGGTTTGAC-3' (서열번호 10) 및 안티센스 프라이머: 5'-GAAAACTGAATCTCCATTCCACAA-3'(서열번호 11); 서바이빈 센스 프라이머: 5'-ACCGCATCTCTACATTCAAG-3' (서열번호 12) 및 안티센스 프라이머: 5'-CAAGTCTGGCTCGTTCTC-3' (서열번호 13); 및 ID2 센스 프라이머: 5'-CACAACAACAACAACAAC-3' (서열번호 14) 및 안티센스 프라이머: 5'-CACAGTCCAAGTAAGAGA-3'(서열번호 15).
증폭 프로토콜은 1분 동안 95℃, 40 사이클(15초 동안 95℃, 15초 동안 60℃, 30초 동안 72℃) 배양으로 이루어졌다. PCR 산물 내로의 SYBR 그린 염료의 혼입은 바이오-라드 검출 시스템을 사용하여 실시간으로 관찰하였고, 이후에 바이오-라드 CFX 매니저 2.1 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 샘플을 각각 조건에 대해 수집하고, 2중으로 실행하였다. 처리된 샘플을 2-△△Ct 방법을 사용하여 모의 군과 비교하고, 배수 변화로서 플롯팅하였다. GAPDH를 정규화 대조군으로서 사용하였다.
도 11에 나타낸 결과는 rSIFN-co가 Wnt 경로 매개성 표적 유전자인 Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2의 하향조절을 유도하였음을 입증한다. 이들 유전자의 mRNA 레벨은 rSIFN-co 처리 후에 유의하게 감소하였으나, 인터페론 IFN 알파-2b 처리 후에는 그렇지 않았다.
간략하게는, 모의 대조군에 대한 상대적 발현 레벨을 1로 설정하였을 때, Axin2 유전자의 경우(도 11A) IFN 알파-2b 처리는 1을 약간 넘어선 레벨을 생성한 반면, rSIFN-co 처리는 약 0.4의 레벨을 생성하였다(p<0.0001, rSIFN-co 처리를 비처리와 비교함). 각각 모의 비처리 세포, IFN 알파-2b 처리 세포 및 rSIFN-co 처리 세포에 해당하는 레벨은 CD4 유전자의 경우(도 11B) 각각 1, 약 0.9 및 약 0.4였고(p<0.0001); 서바이빈 유전자의 경우(도 11C) 1, 약 0.9 및 약 0.4(p<0.0005)였고; ID2 유전자의 경우(도 11D) 1, 약 1 및 약 0.4(p<0.0001)였다.
실시예 10. rSIFN -co는 상이한 세포에서 Wnt -관련 수용체 또는 공동수용체 LRP6/FZD6 mRNA 레벨을 하향조절할 수 있었다.
rSIFN-co에 의한 LRP6/FZD6의 조절을 연구하였다. 이는 실시예 9에서 수행된 바와 같은 qPCR에 의해 수행되었다. 암 세포인 A549, H460, SW620 및 HT-29를 6-웰 플레이트에 시딩하고, 10 μg/ml IFN 알파-2b 또는 rSIFN-co로 처리하거나 대조군(모의)로서 처리하지 않고 두었다. 24시간 처리 후, 트리아졸 시약을 사용하여 세포 mRNA를 단리하고, cDNA를 LRP6 및 FZD6의 특이적 프라이머를 사용하여 qPCR에 적용하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같았다: LRP6 센스 프라이머: 5'-TGAAGAACCAGCACCACAGG-3' (서열번호 4) 및 안티센스 프라이머: 5'-CATAACCAAGAGGCACAGAAGC-3' (서열번호 5), 및 FZD6 센스 프라이머: 5'- GCGGAGTGAAGGAAGGATTAGTC-3' (서열번호 6) 및 안티센스 프라이머: 5'-TGAACAAGCAGAGATGTGGAACC -3' (서열번호 7). 실험을 3중으로 수행하고, 모의 군을 사용하여 정규화하였다. 결과는 GAPDH에 대한 LRP6 또는 FZD6의 상대적 mRNA 레벨로 기록하였다.
도 9에 나타낸 결과는 LRP6 및 FZD6 둘 다 4가지 암 세포주에서 rSIFN-co에 의해 다양한 정도로 하향조절되었다는 것을 나타내었다. 도 9A는 rSIFN-co 처리 후 A549 세포(p<0.005), SW620 세포(p<0.005) 및 HT-29 세포(p<0.005)에서의 LRP6 mRNA의 상대적 발현의 유의한 감소를 보여주지만, IFN 알파-2b 처리시에는 유의한 감소가 보이지 않았다. 도 9B는 rSIFN-co 처리 후 모든 4가지 세포주, A549(p<0.001), H460(p<0.0005), SW620(p<0.001) 및 HT-29(p<0.0005)에서의 FZD6 mRNA의 상대적 발현의 유의한 감소를 보여준다. 다른 인터페론인 IFN 알파-2b는 HT-29 세포에서 FZD6 mRNA 발현의 증대를 유발하였으나, A549 세포, H460 세포 및 SW620 세포에서는 rSIFN-co와 동일한 정도는 아니더라도 FZD6 mRNA 발현의 약간의 감소를 유도하였다. 결과는 rSIFN-co에 의한 Wnt 신호전달 경로의 억제가 Wnt 관련 세포 표면 수용체 LRP6 및 FZD6의 발현의 억제로부터 발생하였을 수 있음을 나타낸다. rSIFN-co는 베타-카테닌/TCF-매개성 전사 활성 및 베타-카테닌 단백질 레벨뿐만 아니라 Wnt 신호전달 경로 관련 수용체, 공동 수용체 및 표적 유전자의 하향조절을 포함하는, 시험된 인간 암 세포, 예컨대 인간 폐암 세포 및 인간 결정암 세포에서의 Wnt 경로를 억제하는데 있어서, 인터페론 IFNα-2b보다 우수한 것으로 밝혀졌다.
실시예 11. rSIFN -co는 종양 억제 유전자의 발현을 상향조절하였다.
종양 억제 유전자의 상향조절에 대한 rSIFN-co의 효과를 본 연구에서 입증하였다. 암 세포인 A549, H460, SW620 및 HT-29를 6-웰 플레이트에 시딩하고, 10 mcg/ml의 IFN 알파-2b 또는 rSIFN-co로 처리하거나 모의 대조군으로서 처리하지 않고 두었다. 24시간 처리 후, 트리아졸 시약을 이용하여 총 세포 mRNA를 단리하고, cDNA를 합성하고, DKK3, KLF4 및 BATF2에 대한 특이적 프라이머를 사용하여 qPCR을 추가로 수행하였다. 하기 프라이머를 사용하였다: BATF2의 경우, 센스 프라이머: 5'-CAGAGCAGGGAGCACAAACC -3' (서열번호 16) 및 안티센스 프라이머: 5'-TGAGCAGAGGAGAGCAGAGG -3' (서열번호 17); DKK3의 경우, 센스 프라이머: 5'-GGAGCCTGACTGAAGAGATGG-3'(서열번호 18) 및 안티센스 프라이머: 5'-ACGCCTAAAGCACACACCTG-3' (서열번호 19); KLF4의 경우, 센스 프라이머: 5'- CCTTCAACCTGGCGGACATCAAC-3' (서열번호 20) 및 안티센스 프라이머: 5'-GGCTGCTGCGGCGGAATG -3' (서열번호 21).
실험을 3중으로 수행하고, 모의 대조군을 사용하여 정규화하였다. 도 12에 나타낸 결과는 GAPDH의 mRNA 발현 레벨에 대한 상대적 mRNA 발현 레벨로 나타내었다. A549 세포의 경우, rSIFN-co를 이용한 처리는 모든 3가지 종양 억제 유전자인 DKK-3(도 12A), BATF2(도 12B) 및 KLF4(도 12C)의 발현을 현저하게 증가시켰으며, IFN 알파-2b보다 훨씬 더 효과적이었다. SW620 세포에서, rSIFN-co 처리 후 KLF4 발현의 상향 조절 또한 대조군 및 IFN 알파-2b 처리와 비교하여 현저하게 증가하였다. IFN 알파-2b 처리는 H460 세포에서 DKK-3 발현을 현저하게 증가시켰다.
실시예 12. rSIFN -co는 암 세포 이동을 억제하였다.
rSIFN-co가 종양 세포 이동을 억제하는 능력은 비처리 대조군(모의)과 비교하여, 폐암 A549 세포 및 결장암 SW620 세포가 IFN 알파-2b 또는 rSIFN-co로 24시간 동안 처리한 후 미세다공성 멤브레인을 가로질러 이동하는 능력을 결정함으로써 입증하였다. 세포 이동 검정는 24-웰 플레이트(Becton-Dickinson Biosciences, NJ, USA)에서 8 μm 세포 배양 삽입물(insert)을 사용하여 수행하였다. FBS를 포함하지 않는 따뜻한(37℃) 중탄산염 기반 배양 배지를 삽입물의 내부 또는 웰의 바닥에 첨가하고, 5% CO2 하의 37℃, 습윤화된 조직 배양 배양기에서 2시간 동안 재수화시켰다. 재수화 후, 배양 배지를 조심스럽게 제거하였다. 그 후, FBS-무함유 배지 중에 현탁된 (10 μg/ml의 IFN 알파-2b 또는 10 μg/ml의 rSIFN-co로 처리한 후, 또는 전혀 처리된 적 없는) 500 μl의 준비된 세포를 삽입물 필터의 상부에 0.5 × 104개 세포/삽입물의 밀도로 시딩하였다. 24-웰 플레이트의 하부 구획에 10% FBS를 함유하는 완전 배지 500 μl를 넣었다. 정규 배양 조건하에 37℃에서 24시간 후, 챔버 멤브레인의 상부에 있는 이동하지 않은 세포를 면봉으로 제거하였다. 배양 삽입물의 하부를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 2% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 세포가 놓인곳으로부터 챔버 멤브레인의 반대편 상에서 이동된 세포의 수를 3중으로 웰 각각에서 계수하였다. 각각의 실험을 적어도 2회 반복하였고, 매회마다 3중으로 웰에서 수행하였다.
도 13에 나타낸 결과는 각각의 모의, IFN 알파-2b 처리 세포, 및 rSIFN-co 처리 세포에 대하여 필드당 이동 세포의 평균 수를 보여주었다. 멤브레인을 가로질러 이동한 A549 세포의 경우, 필드당 약 30개의 세포가 비처리된 모의 군에서 관찰되었고, 약 110개의 세포가 IFN 알파-2b 군에서 보였으며, 약 10개의 세포가 rSIFN-co 처리군에서 보였다. IFN 알파-2b 처리에 의해 유발된 이동의 증가 및 rSIFN-co 처리에 의해 유발된 이동의 억제는 통계적으로 유의하였다(p<0.01). rSIFN-co에 의한 유의한 억제는 또한 SW620 세포에서도 관찰되었다. 대조적으로, IFN 알파-2b 처리는 SW620 세포에서 종양 세포 이동을 증가시켰다. 그러므로, rSIFN-co는 종양 세포 이동을 억제하는데 효과적이었으며, IFN 알파-2b보다 훨씬 더 효과적이었다.
실시예 13. rSIFN -co는 아폽토시스 경로를 통해 그것의 효과를 발휘하지 않았다.
본 연구는 rSIFN-co가 아폽토시스 이외의 경로에 의해 종양 세포의 생존율을 감소시키는데 그것의 효과를 발휘한다는 것을 보여주기 위해 수행되었다. 종양 세포인 A549 및 SW620을 6-웰 플레이트에 넣고, 밤새 배양한 후, 24시간 또는 48시간 동안 10 mcg/ml의 IFN 알파-2b, 또는 10 mcg/ml의 rSIFN-co로 처리하거나, 5FU로 처리하거나, (모의 대조군으로서) 처리하지 않고 두었다. 그 후에, 아폽토시스-관련 분자 마커를 웨스턴 블롯으로 관찰하였다. 사용된 1차 항체는 마우스 모노클로날 항-베타-튜불린(1:2000, Cat#: CW0098A) 및 마우스 모노클로날 항-GAPDH(1:2000, Cat#: CW0100A)(Kangwei Biotechnology, China); 마우스 모노클로날 항-PARP(1:1000, Cat#: sc-2007, Santa Cruz Biotechnology, Inc.); 토끼 모노클로날 항-프로카스파아제 3(1:1000, Cat#: 9665), 및 토끼 폴리클로날 항-절단된 카스파아제 3(1:1000, Cat#: 9661)(Cell Signaling Technology, USA); 염소 폴리클로날 항-프로카스파아제 8(1:1000, Cat#: sc-6136, Santa Cruz Biotechnology, Inc); 토끼 모노클로날 항-절단된 카스파아제 8(1:1000, Cat#: 9496)(Cell Signaling Technology, USA)이었다.
결과는 A549 세포의 경우 도 14A에, SW620 세포의 경우 도 14B에 나타내었다. 웨스턴 블롯은 아폽토시스를 유발하는 것으로 알려져 있는 약물인 5FU를 이용한 처리 후, 세포가 프로카스파아제-3, 프로카스파아제-8 및 PARP의 레벨의 유의한 감소를 나타내었으나, 절단된 카스파아제-3 및 절단된 카스파아제-8의 레벨의 증가를 나타내었음을 보여주었다. 대조적으로, 인터페론인 IFN 알파-2b 또는 rSIFN-co 중 어떠한 것도 프로카스파아제-3 또는 프로카스파아제-8 또는 PARP의 레벨의 어떠한 감소도 유발하지 않거나, 절단된 카스파아제-3 또는 절단된 카스파아제-8의 레벨의 어떠한 증가도 유도하지 않았다. 따라서, 결과는 2가지 인터페론, 특히 rSIFN-co가 아폽토시스를 통한 것과는 상이한 메커니즘에 의해 종양 세포 생존율의 감소를 유발하였을 수 있음을 나타내었다.
실시예 14. rSIFN -co는 STAT 인산화를 유도하였다.
본 실험은 rSIFN-co가 꼭 IFN 알파-2b와 같이 JAK/STAT 신호전달 경로를 사용한다는 것을 밝히기 위해 수행하였다. 본 연구에서, A549 세포 및 Hela 세포를 3.3 cm 접시에 각각 넣고, 37℃에서 밤새 배양한 후, 10 μg/ml의 IFN 알파-2b 또는 rSIFN-co로 각각 0, 5, 15, 30, 60, 120 및 240분 동안 처리하였다. 처리 후, 세포를 수집하고, 세포 단백질을 추출하고, 웨스턴 블롯 분석을 위해 SDS-PAGE 아가로스 상에 로딩하여, STAT1 (Tyr 701), STAT2 (Tyr690) 및 STAT3 (Tyr705)의 인산화를 관찰하였다. GAPDH를 로딩 대조군으로서 사용하였다.
사용된 1차 항체는 다음과 같다: STAT1 (1:1000, Cat#: 9175S), Tyr701 인산화-STAT1 (1:1000, Cat#: 9167S), STAT2 (1:500, Cat#4594), Tyr690 인산화-STAT2 (1:1000, Cat#: 441S), STAT3 (1:1000, Cat#: 9132), Tyr705 인산화-STAT3 (1:1000, Cat#: 9145S). 항-마우스(Cat#: sc-2005) 또는 토끼(Cat#: sc-2004) 또는 염소(Cat#: sc-2020) HRP-접합 2차 항체(Santa Cruz Technology, Santa Cruz, CA)를 1:2000의 농도로 사용하였다. 블롯을 슈퍼 시그널 웨스트 피코 화학발광 기질 키트(Thermo Scientific, USA)와 발광/형광 이미징 LAS4000 시스템(GE Healthcare Life Sciences, USA)을 사용하여 시각화하였다.
도 15에 나타낸 결과는 2가지 인터페론인 IFN 알파-2b 및 rSIFN-co가 A549 세포 및 Hela 세포 모두에서 STAT1, STAT2 및 STAT3에 대한 그것의 인산화 패턴에 있어서 유사하게 거동하였음을 입증한다. 그러므로, rSIFN-co 매개성 JAK/STAT 신호전달 레벨은 IFN 알파-2b에 의해 매개된 것과 다르지 않았으며, 이는 rSIFN-co 및 IFN 알파-2b가 공통의 IFNAR1/2 수용체를 공유할 수 있음을 시사한다.
실시예 15. IFNAR1 및 IFNAR2에 대한 rSIFN -co의 결합 친화성
표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 기술에 기초한, 비아코어 T100 단백질 상호작용 어레이 시스템(Biacore T100 Protein Interaction Array system)(General Electric HealthCare Co.)을 사용하여, IFNAR1-EC(Cata: 13222-H08H, Sino Biological Inc) 또는 IFNAR2-EC(Cata: 10359-H08H, Sino Biological Inc)에 대한 IFNα-2b 및 rSIFN-co 모두의 결합 친화성을 측정하였다. 수용체 서브유닛의 고정을 위해, CM5 센서 칩을 각각 20 μg/ml 및 50 μg/ml의 IFNAR1-EC 서브유닛 및 IFNAR2-EC 서브유닛과 함께 배양하여, 단백질에 있는 아미노기를 통해 칩의 카르복실화된 덱스트란 표면을 결합시켰다. 그 후, 2개의 시험 인터페론을 IFNα-2b/IFNAR1 결합에 대해 100 - 3,000 nM 범위 내에서 그리고 rSIFN-co/IFNAR1 결합에 대해 50 - 1,000 nM 범위 내에서뿐만 아니라, IFNAR2 결합에 대한 그것들 모두에 대해 3.125 - 80 nM의 다른 범위 내에서의 상이한 농도로 리간드에 수직으로 주사하고, IFNs/IFNAR2 결합 동안 5초의 재활성화 과정을 위해 재생성된 2M NaCl 완충액을 첨가하였다. 데이터를 제조업체의 지침에 따라 분석하였다. 해리상수 KD를 하기 식에 따라 속도상수(rate constant)로부터 결정하였다: KD = Kd/Ka (d: 해리(dissociation); a: 결합(associaton)).
도 17은 rSIFN-co 및 IFNα-2b의 상이한 수용체 결합 친화성을 나타낸다. 본 실험의 조건하에서, IFNAR1 인터페론 수용체의 친화 상수(affinity constant)는 정적-분석 모델에 의해 분석할 수 있고: KD (IFNAR1-EC/rSIFN-co): 6.003 × 10-7 mol/L; KD (IFNAR1-EC/IFNα-2b): 2.835 × 10- 6 mol/L (도 17A); IFNAR2 인터페론 수용체의 친화 상수는 동적-분석 모델에 의해 분석할 수 있고: KD (IFNAR2-EC/rSIFN-co): 2.192 × 10- 8 mol/L; KD (IFNAR2-EC/IFNα-2b) 1.843 × 10- 9 mol/L (도 17B); 그것들의 친화 상수에 대한 비교에 대하여, rSIFN-co/IFNAR1은 인터페론 IFNα-2b(도 17C)와 비교할 때 더 강한 결합 친화성(4.72배)을 발휘한다. 그러나, rSIFN-co/IFNAR2의 결합 친화성은 IFNα-2b의 결합 친화성(도 17C)보다 11.9배 더 약하다는 것이 입증되었다.
실시예 16. rSIFN -co는 암 세포에서 B18R 전-처리 후 IFNα -2b보다 높은 p-STATs를 유도하였다.
본 연구에서, A549 및 Hela 세포를 밤새 배양하였다. B18R 재조합 단백질(우두 바이러스-암호화 중성화 타입 I 인터페론 수용체(Vaccinia virus-Encoded Neutralizing Type I Interferon Receptor), 타입 I IFN 억제제(type I IFN inhibitor)로도 불림, 카탈로그 번호: 14-8185, eBioscience, Inc)의 10배 연속 희석액(serial dilution)을 배양액 중에 제조하고, 상온에서 1시간 동안 일정한 양(1 ng/ml, 최종 검정 농도)의 각각의 IFN 단백질(IFNα-2b 및 rSIFN-co)과 결합시켰다. 상기 2개의 세포를 처리하기 위해 B18R/IFN 복합체를 사용하고, 30분간 배양하였다. 그 후, 세포 용해물을 수집하고, 웨스턴 블롯 검정로 STAT1 (Tyr701), STAT2 (Tyr690) 및 STAT3 (Tyr705)의 인산화를 검출하였다. GAPDH 및 액틴을 로딩 대조군으로서 사용하였다.
사용된 1차 항체는 다음과 같다: STAT1 (1:1000, Cat#: 9175S) (Cell Signaling Technology, USA), Tyr701 인산화-STAT1 (1:1000, Cat#: 9167S) (Cell Signaling Technology, USA), STAT2 (1:500-1:1000, Cat#4594) (Cell Signaling Technology, USA), Tyr690 인산화-STAT2 (1:500-1:1000, Cat#: 441S) (Cell Signaling Technology, USA), STAT3 (1:1000, Cat#: 9132) (Cell Signaling Technology, USA), Tyr705 인산화-STAT3 (1:1000, Cat#: 9145S) (Cell Signaling Technology, USA), GAPDH (Cat#: CW0100A, Kangwei biotech, Inc), b-액틴 (Cat#: CW0096, Kangwei biotech, Inc).
도 18은 rSIFN-co가 IFNα-2b 군과 비교하여, A549 세포(도 18A) 및 Hela 세포(도 18B)에 있어서 10 ng/ml의 억제제 B18R에서 STAT1/2/3에 대한 인산화를 크게 유도하였음을 보여주었다.
본원에 기재된 방법 및 검정 키트는 시험 화합물, 예컨대 인터페론의 효능을 결정하는데, 그리고 베타-카테닌, 또는 LRP6, FZD6, Axin2, CD24, 서바이빈 및 ID2 중 어느 하나 이상의 과활성화 또는 과발현, 또는 DKK3, BATF2 또는 KLF4의 하향조절에 의해 부정적인 영향을 받는 질병 또는 상태의 치료에 유용하다.

Claims (72)

  1. 재조합 슈퍼-화합물 인터페론(rSIFN-co)과 대비하여 시험 인터페론의 효능을 결정하거나 비교, 혹은 시험 인터페론과 rSIFN-co 사이의 동등성을 확립하는 방법에 있어서,
    (1) 상기 시험 인터페론 및 rSIFN-co를 제공하는 단계;
    (2) 동일하게 명시된 조건하에서, 시험관 내(in vitro), 상기 시험 인터페론 및 rSIFN-co에 의해 각각 하기 활성을 결정하는 단계; 및
    (i) HT-29 세포에서의 LRP6 및 FZD6의 발현의 하향조절; 및
    (ii) IFNα-2b와 비교하여, IFNAR1에 대한 더 높은 결합 친화성(affinity binding) 및 IFNAR2에 대한 더 낮은 결합 친화성,
    (3) 상기 시험 인터페론에 의한 활성을 상기 rSIFN-co에 의한 활성과 비교하는 단계;를 포함하며,
    이에 의해 rSIFN-co에 의한 활성과 대비하여, 통계적으로 유의한 방식으로 (i)에 명시된 활성이 상기 시험 인터페론에 존재하는 것, 및 (ii)에 명시된 활성이 상기 시험 인터페론에 존재하는 것은, 상기 시험 인터페론 및 rSIFN-co가 동일한 효능을 갖거나, 상기 시험 인터페론 및 rSIFN-co가 동등한 것을 의미하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (2)에서, 하기 활성 중 하나 이상이 더 결정되고,
    (iii) 어느 하나 이상의 종양-보유 마우스 모델에서의 생체 내(in vivo) 암 세포 성장의 억제;
    (iv) 암 세포 생존율(viability)의 감소;
    (v) 암 세포 이동(migration)의 억제;
    (vi) 암 세포에서의 베타-카테닌(beta-catenin)/TCF 전사 활성의 억제;
    (vii) 암 세포에서의 Axin2, CD24, 서바이빈(Survivin) 및 ID2 중 어느 하나 이상의 발현의 억제;
    (viii) 암 세포에서의 위족(pseudopod) 형성의 억제;
    (ix) 암 세포에서의 베타-카테닌 발현의 억제;
    (x) 암 세포에서의 DKK-3, KLF-4 및 BATF2 중 어느 하나 이상의 발현의 상향조절;
    (xi) 암세포에서의 p-STAT의 발현의 상향조절에서 IFNα-2b보다 B18R에 의한 억제에 대한 더 낮은 감수성,
    이에 의해 활성 (iv) 내지 (xi)은 시험관 내 상태에서 결정되고,
    rSIFN-co에 의한 활성과 대비하여, 통계적으로 유의한 방식으로 (i)에 명시된 활성이 상기 시험 인터페론에 존재하는 것, 및 (ii)에 명시된 활성이 상기 시험 인터페론에 존재하는 것과 함께, 통계적으로 유의한 방식으로 (iii), (iv), (v), (vi) 및 (vii)에 명시된 활성 중 어느 1, 또는 2, 또는 3, 또는 4, 또는 5개가 상기 시험 인터페론에 존재하는 것, 및/또는 (viii), (ix), (x) 및 (xi)에 명시된 활성 중 어느 하나 이상이 상기 시험 인터페론에 존재하는 것은, 상기 시험 인터페론 및 rSIFN-co가 동일한 효능을 갖거나, 상기 시험 인터페론 및 rSIFN-co가 동등한 것을 더 의미하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    하나 이상의 활성을 결정하는데 사용된 상기 암 세포는 폐암 세포, 결장암 세포, 자궁경부암 세포, 간암 세포, 유방암 세포 및 췌장암 세포 중 어느 하나 이상을 포함하는, 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    하나 이상의 활성을 결정하는데 사용된 상기 암 세포는 A549 세포, Hela 세포, CL-1 세포, Huh-7 세포, SW480 세포, MDA-MB-231 세포, Calu-1 세포, SMMC-7721 세포, PANC-1 세포, SW620 세포, SPC-A4 세포, H1299 세포, H460 세포 및 HT-29 세포 중 어느 하나 이상을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    활성 (ii)를 결정하는데 있어서, 상기 시험 인터페론이 IFNα-2b와 비교하여 IFNAR1에 대해 적어도 2배; 적어도 3배; 적어도 4배; 또는 적어도 4.5배 높은 결합 친화성을 가지는 경우, 상기 시험 인터페론 및 rSIFN-co는 동일한 효능을 갖거나 동등한 것으로 간주되는, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    활성 (ii)를 결정하는데 있어서, 상기 시험 인터페론이 IFNα-2b와 비교하여 IFNAR2에 대해 적어도 5배; 적어도 7배; 적어도 9배; 또는 적어도 11배 낮은 결합 친화성을 가지는 경우; 상기 시험 인터페론 및 rSIFN-co는 동일한 효능을 가지거나 동등한 것으로 간주되는, 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    활성 (ii)를 결정하는데 있어서, IFNAR1 및/또는 IFNAR2에 대한 IFNα-2b, 상기 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co의 결합 친화성은 그것의 해리 상수(KD)를 결정함으로써 결정되는, 방법.
  8. 제2항에 있어서,
    활성 (xi)를 결정하는데 사용된 상기 암 세포는 A549 세포 및 Hela 세포 중 어느 하나 이상을 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    활성 (xi)를 결정하는데 있어서, 상기 IFNα-2b, 상기 시험 인터페론 및/또는 rSIFN-co는 상기 암 세포와 접촉시키기 전, 5 ng/ml 내지 20 ng/ml의 범위, 또는 10 ng/ml의 B18R과 함께 배양되는, 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    활성 (xi)를 결정하는데 있어서, 상기 시험 인터페론이 암 세포에서의 p-STAT 발현의 상향조절에서 IFNα-2b보다 B18R에 의한 억제에 대해 낮은 감수성을 가지는 경우, 상기 시험 인터페론 및 rSIFN-co는 동일한 효능을 갖거나 동등한 것으로 간주되는, 방법.
  11. 제2항에 있어서,
    활성 (xi)를 결정하는데 있어서, 상기 p-STAT 발현의 상향조절은 웨스턴 블롯에 의해 결정되는, 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    통계학적 유의성은 대조군과 비교할 때, 0.05 이하, 또는 0.01 이하, 또는 0.005 이하, 또는 0.001 이하, 또는 0.0005 이하, 또는 0.0001 이하의 p 값을 의미하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 대조군은 상기 시험 인터페론 또는 rSIFN-co로 처리되지 않거나, 생리식염수 또는 PBS로 처리되거나, IFNα-2b로 처리되고, 또는 상기 대조군은 비처리 대조군(모의(Mock))인, 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 시험 인터페론과 rSIFN-co는 동일한 아미노산 서열(서열번호 1)을 가지고, 동일한 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)에 의해 암호화되는, 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 시험 인터페론과 rSIFN-co는 동일한 특정 활성을 가지는, 방법.
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