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KR102527160B1 - 예정 사멸 1(pd-1)에 대한 신규한 단일클론성 항체 - Google Patents

예정 사멸 1(pd-1)에 대한 신규한 단일클론성 항체 Download PDF

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KR102527160B1
KR102527160B1 KR1020217020495A KR20217020495A KR102527160B1 KR 102527160 B1 KR102527160 B1 KR 102527160B1 KR 1020217020495 A KR1020217020495 A KR 1020217020495A KR 20217020495 A KR20217020495 A KR 20217020495A KR 102527160 B1 KR102527160 B1 KR 102527160B1
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Abstract

본 발명은 PD-1 단일클론성 항체, 특히 PD-1의 인간 단일클론성 항체를 제공하며, 이는 PD-1에 높은 친화성으로 특이적으로 결합하고 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산 서열, 클로닝 또는 발현 벡터, 숙주 세포 및 항체의 발현 또는 분리 방법을 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 면역접합체, 치료적 조성물 또한 제공된다. 본 발명은 또한 항-PD-1 항체로 다양한 암을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

예정 사멸 1(PD-1)에 대한 신규한 단일클론성 항체{THE NOVEL MONOCLONAL ANTIBODIES TO PROGRAMMED DEATH 1(PD-1)}
본 발명은 일반적으로 PD-1의 항체 및 이의 조성물, 및 인간 질환의 치료에서의 항-PD-1 항체를 이용한 면역요법(immunotherapy)에 관한 것이다.
임상 전 및 임상 결과로부터의 증가하는 증거들이 면역 체크포인트를 표적하는 것이 암에 걸린 환자들을 치료하기 위한 가장 유망한 접근법이 되고 있다는 점을 나타내어 왔다. CD28에 대한 상동성을 가지며 면역글로불린 상-과(super-family)의 억제성 구성원인 단백질 예정 사멸 1(protein Programmed Death 1)(PD-1)은 활성화된 B 세포, T 세포 및 골수 세포 상에서 발현되고([문헌 Agata et al, supra; Okazaki et al (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82]; [Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8]) 면역 체계에서 자극 및 억제 신호를 조절하는 데에 중대한 역할을 갖는다(문헌 [Okazaki, Taku et al. 2007 International Immunology 19:813-824]). PD-1은 사멸성(apoptotic) 세포에서의 차별적인 발현을 스크리닝함으로써 발견되었다[문헌 (Ishida et al (1992) EMBO J 11:3887-95)].
PD-1은 Ig 유전자 상과의 일부(part)인 유형 I 막관통 단백질이고(문헌 [(Agata et al. (1996) bit Immunol 8:765-72]) PD-1의 구조는, 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)(ITIM) 및 면역수용체 티로신-기반 스위치 모티프(immunoreceptor tyrosine-based switch motif)(ITSM)을 함유하는, 하나의 면역글로불린 가변-유사 세포외 도메인 및 세포질 도메인으로 이루어진다. CTLA-4와 구조적으로 유사함에도 불구하고, PD-1은 B7-1 및 B7-2 결합에 중대한 MYPPPY 모티프가 결여되어 있다. PD-1은 공지된 두 개의 리간드, PD-L1(B7-H1, CD274) 및 PD-L2(B7-DC, CD273)를 가지며, 이는 B7 과(family)의 세포 표면 발현 구성원들이다([Freeman et al (2000) J Exp Med 192: 1027-34]; [Latchman et al (2001) Nat Immunol 2:261-8]; [Carter et al (2002) Eur J Immunol 32:634-43]). PD-L1 및 PD-L2는 둘 다 PD-1에 결합하는 B7 상동체이지만, 다른 CD28 과 구성원들에는 결합하지 않는다.
면역-체크포인트 단백질 중의 하나로서, PD-1은 활성화된 B 세포, T 세포, 및 골수 세포 상에서 발현되는 CD28 과의 억제성 구성원이며(문헌 [Agata et al, supra; Okazaki et al. (2002) Curr Opin Immunol 14: 391779-82]; [Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8]), 종양 세포가 면역 감시를 탈출했던 주요 면역 저항성 메커니즘을 제공하는 T 세포의 활성을 제한하는 데 있어서 주요 역할을 한다. PD-1은 T 세포에서 무력증(anergy) 또는 무반응(unresponsiveness)의 상태를 유도하여, 세포에서 효과기(effector) 시토카인의 최적 수준을 생산할 수 없게 하는 결과를 초래한다. PD-1은 또한 T 세포에서 이것의 생존 신호를 억제하는 능력을 통해 세포자멸(apoptosis)을 유도할 수도 있다. PD-1 결손 동물은 자가면역 심근병증 및 관절염과 신장염이 동반된 루푸스-유사 증후군을 포함하는, 다양한 자가면역 표현형이 생긴다(문헌 [Nishimura et al. (1999) Immunity 11:141-51]; [Nishimura et al. (2001) Science 291:319-22]). 게다가, PD-1은 자가면역 뇌척수염, 전신 홍반 루푸스, 이식편대숙주병(GVHD), 제1형 당뇨, 및 류마티스 관절염에서 역할을 하는 것으로 발견되었다(문헌 [Salama et al. (2003) J Exp Med 198:71-78]: [Prokunina and Alarcon-Riquelme (2004) Hum MoI Genet 13:R143]; [Nielsen et al. (2004) Lupus 11:510]). 뮤린 B 세포 종양 선(murine B cell tumor line)에서, PD-1의 ITSM은 BCR-매개 Ca2+-흐름(flux) 및 하류 효과기 분자의 티로신 인산화를 차단하는 데에 필수적인 것으로 나타났다(문헌 [Okazaki et al. (2001) PNAS 98: 13866-71]).
활성화된 T 세포 상에 발현된 PD-1, 및 종양 세포 상에 발현된 PD-L1의 상호작용은 면역 반응을 음성적으로 조절하고 항-종양 면역성을 약하게 한다. PD-L1은 다양한 인간 암들에서 풍부하다(문헌 [Dong et al (2002) Nat. Med 8:787-9]). 종양 상에서의 PD-L1의 발현은 식도암, 췌장암 및 다른 유형의 암들에서 감소된 생존과 상관관계가 있으며, 이는 종양 면역요법을 위한 신규하고 유망한 표적으로서의 이 경로를 강조한다. 여러 그룹들이 PD-1-PD-L 상호작용이 질환을 악화시키며, 종양 침윤성 림프구에서의 감소, T-세포 수용체 매개 증식의 감소, 및 암의 세포에 의한 면역 회피를 초래한다(문헌 [Dong et al. (2003) J. MoI. Med. 81:281-7]; [Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314]; [Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100]). 면역 억제는 PD-1의 PD-L1과의 국소적 상호작용을 억제함으로써 역전될 수 있고, PD-1의 PD-L2와의 상호작용이 또한 차단될 때 효과가 부가된다.
PD-1 경로를 표적하는 다수의 제제가 수 개의 제약회사, 예컨대 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb)(BMS), 머크(Merck), 로슈 및 글락소스미스클라인(Roche and GlaxoSmithKline)(GSK)에 의해 개발되어왔다. 임상 시험으로부터의 데이터는 다양한 종양 유형을 앓는 환자들에서 지속적인 임상적 활성의 초기의 증거 및 고무적인 안전성 프로파일을 입증했다. BMS가 개발한 항-PD-1 약물인 니볼루맙(Nivolumab)은 차세대 분야의 중심 단계에 놓여진다. 현재 6개의 후기 임상 연구에서, 폐암 환자의 18%(n=72), 흑색종 환자 수의 1/3 가까이(n=98) 및 신장암 환자의 27%(n=33)을 포함하여, 연구된 다섯 개의 암 그룹 중 세 개에서, 처리는 종양 수축을 자극하였다. 머크가 개발한, 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)은 PD-1에 대해 작용하는, 인간화 단일클론성 IgG4 항체이며, 피부암에 대한 인상적인 IB 데이터를 얻은 후로 FDA의 신규한 혁신 지정의 기회를 잡았다. IB 단계 연구로부터의 결과는, 51%의 암 환자에서(n=85) 객관적인 항-종양 반응을, 9%의 환자에서 완전한 반응을 나타내었다. 로슈의 실험적인 MPDL3280A(아테졸리주맙)(Atezolizumab)은 다양한 종양 크기를 갖는 후기 암 환자 140명 중 29명에서(21%) 종양을 수축시키는 능력을 입증하였다.
치료제로서 PD-1에 대한 항체를 개선하기 위한 어느 정도의 여지가 존재한다. 현재 임상 시험에서 시험되는 PD-1에 대한 대부분의 단일클론성 항체들은 오직 임상 전의 생체 내 분석을 제한하는 인간 PD-1에 대한 것이며, 마우스-유래의 단백질 서열의 면역원성으로 인해 효능이 감소된다. 마우스 PD-1에 대한 교차-반응성을 가진 인간화 항체는 이러한 결점을 극복하고 생체 내에서 보다 더 관용성(tolerability) 및 더 높은 효능을 나타냈다. 그러므로 여전히 신규한 항-PD-1 항체의 필요성이 존재한다.
발명의 개시
본 발명은 단리된 항체, 특히 단일클론성 항체 또는 인간 단일클론성 항체를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 서열번호 24의 128번, 129번, 130번, 131번 및 132번 위치에서의 아미노산, 및 35번, 64번, 82번, 83번 위치에서의 아미노산 중 적어도 하나를 포함하는 PD-1의 에피토프(epitope)에 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 인간 및 뮤린 PD-1의 에피토프에 결합하며, 여기서 에피토프가 서열번호 24의 128번, 129번, 130번, 131번 및 132번 위치에서의 아미노산을 포함하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기한 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 뮤린 PD-1은 마우스 또는 랫트 PD-1이다.
상기한 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 여기서 항체는
a) 2.15E-10 M 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하며;
b) 1.67E-08 M 이하의 KD로 마우스 PD-1에 결합한다.
상기한 항체로서, 여기서 항체는
a) 2.15E-10 M 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하며;
b) 1.67E-08 M 이하의 KD로 마우스 PD-1에 결합하고,
여기서 항체는 다음의 특징 중 적어도 하나를 나타낸다:
a) 4.32E-10 M과 2.15E-10 M 사이의 KD로 인간 PD-1에 결합하고 5.39E-08 M과 1.67E-08 M 사이의 KD로 마우스 PD-1에 결합하거나;
b) 인간 CD28, CTLA-4에 실질적으로 결합하지 않거나;
c) T-세포 증식을 증가시키거나;
d) 인터페론-감마 생산을 증가시키거나; 또는
e) 인터류킨-2 분비를 증가시킴.
본 발명은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 상동성인 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명은 a) 서열번호: 1 및 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역; 및
b) 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열과 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95% 상동성인 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역을 포함하며,
여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하는, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
본 발명은 a) 서열번호: 1 및 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역; 및
b) 서열번호: 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역을 포함하며,
여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
다양한 구현예에서, 항체는
a) 서열번호: 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역; 및
b) 서열번호: 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역을 포함하며,
여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하거나;
또는 항체는
a) 서열번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역; 및
b) 서열번호: 3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역을 포함하며,
여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하거나;
또는 항체는
a) 서열번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역; 및
b) 서열번호: 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역을 포함하며,
여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하거나;
또는 항체는
a) 서열번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역; 및
b) 서열번호: 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역을 포함하며,
여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하거나;
또는 항체는
a) 서열번호: 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역; 및
b) 서열번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역을 포함하며,
여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하거나;
또는 항체는
a) 서열번호: 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역; 및
b) 서열번호: 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역을 포함하며,
여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하거나;
또는 항체는
a) 서열번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역; 및
b) 서열번호: 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역을 포함하며,
여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하거나;
또는 항체는
a) 서열번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역; 및
b) 서열번호: 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역을 포함하며,
여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하거나;
또는 항체는
a) 서열번호: 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역; 및
b) 서열번호: 8로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역을 포함하며,
여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하거나;
또는 항체는
a) 서열번호: 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역; 및
b) 서열번호: 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역을 포함하며,
여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합한다.
상기 항체의 서열을 표 1 및 서열 목록에 나타낸다.
[표 1] 항체의 서열
Figure 112021075571923-pat00001
Figure 112021075571923-pat00002
또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호: 10 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 상보성-결정 영역(CDR)을 포함하며, 여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열번호: 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열, 및 이의 보존적 변형(conservative modification)을 포함하며, 여기서 항체가 PD-1에 특이적으로 결합하는, 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공한다.
바람직하게는, 여기서 상기한 항체의 경쇄 가변 영역 CDR3 서열은 서열번호: 20, 21, 22 및 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형을 포함한다.
바람직하게는, 여기서 상기한 항체의 중쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열번호: 11의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형을 포함한다.
바람직하게는, 여기서 상기한 항체의 경쇄 가변 영역 CDR2 서열은 서열번호: 19의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형을 포함한다.
바람직하게는, 여기서 상기한 항체의 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호: 10의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체로서, 여기서 상기한 항체의 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호: 14, 15, 16, 17 및 18의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형을 포함한다.
보다 바람직한 구현예에서, 본 발명은 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기서 항체는 PD-1에 특이적으로 결합하고: CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서:
a) 중쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호: 10을 포함하며, CDR2 서열은 서열번호: 11로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, CDR3 서열은 서열번호: 12 및 13의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고;
b) 경쇄 가변 영역 CDR1 서열은 서열번호: 14 내지 18의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, CDR2 서열은 서열번호: 19의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, CDR3 서열은 서열번호: 20 내지 23의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 항체는:
a) 서열번호: 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
b) 서열번호: 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
c) 서열번호: 12를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
d) 서열번호: 14를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
e) 서열번호: 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
f) 서열번호: 20을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;을 포함하며,
여기서 항체는 PD-1에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 항체는
a) 서열번호: 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
b) 서열번호: 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
c) 서열번호: 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
d) 서열번호: 14를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
e) 서열번호: 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
f) 서열번호: 21을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;을 포함하며,
여기서 항체는 PD-1에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 항체는
a) 서열번호: 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
b) 서열번호: 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
c) 서열번호: 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
d) 서열번호: 15를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
e) 서열번호: 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
f) 서열번호: 21을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;을 포함하며,
여기서 항체는 PD-1에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 항체는
a) 서열번호: 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
b) 서열번호: 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
c) 서열번호: 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
d) 서열번호: 16을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
e) 서열번호: 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
f) 서열번호: 21을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;을 포함하며,
여기서 항체는 PD-1에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 항체는
a) 서열번호: 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
b) 서열번호: 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
c) 서열번호: 12를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
d) 서열번호: 17을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
e) 서열번호: 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
f) 서열번호: 21을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;을 포함하며,
여기서 항체는 PD-1에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 항체는
a) 서열번호: 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
b) 서열번호: 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
c) 서열번호: 12를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
d) 서열번호: 16을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
e) 서열번호: 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
f) 서열번호: 21을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;을 포함하며,
여기서 항체는 PD-1에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 항체는
a) 서열번호: 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
b) 서열번호: 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
c) 서열번호: 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
d) 서열번호: 17을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
e) 서열번호: 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
f) 서열번호: 21을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;을 포함하며,
여기서 항체는 PD-1에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 항체는
a) 서열번호: 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
b) 서열번호: 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
c) 서열번호: 13을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
d) 서열번호: 17을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
e) 서열번호: 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
f) 서열번호: 22를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;을 포함하며,
여기서 항체는 PD-1에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 항체는
a) 서열번호: 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
b) 서열번호: 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
c) 서열번호: 12를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
d) 서열번호: 18을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
e) 서열번호: 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
f) 서열번호: 23을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;을 포함하며,
여기서 항체는 PD-1에 특이적으로 결합한다.
또 다른 바람직한 항체는
a) 서열번호: 10을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1;
b) 서열번호: 11을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2;
c) 서열번호: 12를 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3;
d) 서열번호: 18을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1;
e) 서열번호: 19를 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2;
f) 서열번호: 20을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3;을 포함하며,
여기서 항체는 PD-1에 특이적으로 결합한다.
상기 항체의 CDR 서열을 표 2 및 서열 목록에 나타낸다.
[표 2] 항체의 서열
Figure 112021075571923-pat00003
본 발명의 항체는 키메릭(chimeric) 또는 인간화(humanized) 또는 인간 항체일 수 있다.
본 발명의 항체는 다음의 특징 중 적어도 하나를 나타낼 수 있다:
a) 2.15E-10 M 이하의 KD로 인간 PD-1에 결합하고 1.67E-08 M 이하의 KD로 마우스 PD-1에 결합하거나;
b) 인간 CD28, CTLA-4에 실질적으로 결합하지 않거나;
c) T-세포 증식을 증가시키거나;
d) 인터페론-감마 생산을 증가시키거나; 또는
e) 인터류킨-2 분비를 증가시킴.
추가의 측면에서, 본 발명은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
여전히 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 항체를 분리하는 단계를 포함하는 공정을 제공하며, 여기서 항체는 인간 PD-1 세포외 도메인 및 마우스 PD-1 세포외 도메인을 사용한 SD 랫트에서의 면역화를 통해 제조된다.
본 발명은 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 전이유전자(transgene)를 포함하는 유전자삽입(transgenic) 마우스를 제공하며, 여기서 마우스는 본 발명의 항체를 발현한다.
본 발명은 본 발명의 마우스로부터 제조되는 하이브리도마를 제공하며, 여기서 하이브리도마는 상기 항체를 생산한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체, 또는 상기 항체의 항원 결합 단편, 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 치료제에 연결된, 본 발명에서의 상기 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 면역접합체(immunoconjugate)를 제공한다.
여기서, 본 발명은 상기 면역접합체 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제조하는 방법으로서:
(a) (i) 서열번호: 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 서열, 서열번호: 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 서열; 및 서열번호: 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 항체 서열; 및/또는 (ii) 서열번호: 14, 15, 16, 17 및 18로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR1 서열, 서열번호: 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR2 서열, 및 서열번호: 20, 21, 22 및 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 항체 서열을 제공하는 단계; 및
(b) 변경된 항체 서열을 단백질로서 발현시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에서의 항체, 또는 상기 항체 중 임의의 하나의 항원 결합 단편을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 면역 장애 또는 암의 치료 또는 예방을 위한 의약(medicament)의 제조에서의, 상기 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 치료적 유효량의 상기 항체, 또는 상기 항원-결합 단편을 대상체에 투여하여 종양 세포의 성장을 억제하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
여기서, 본 발명은 상기 방법을 제공하며, 여기서 종양 세포는 흑색종, 신장암, 전립선암, 유방암, 결장암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 및 직장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암의 것이다.
여기서, 본 발명은 상기 방법을 제공하며, 여기서 항체는 키메릭 항체 또는 인간화 항체이다.
상세한 설명
본 발명이 보다 용이하게 이해되도록 하기 위하여, 우선 특정 용어를 정의한다. 추가적인 정의들은 상세한 설명에 걸쳐 제시된다.
용어 "예정 사멸 1", "예정 세포 사멸 1", "단백질 PD-1", "PD-1", "PD1", "PDCD1", "hPD-1" 및 "hPD-F"는 상호교환적으로 사용되고, 변이체, 동형, 인간 PD-1의 종 상동체, 및 적어도 하나의 PD-1와의 공통적인 에피토프를 갖는 유사체를 포함한다.
본원에서 지칭되는 용어 "항체"는 전체 항체 및 임의의 항원-결합 단편(즉, "항원-결합 부분(portion)") 또는 이의 단일쇄를 포함한다. "항체"는 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 상호-연결된 적어도 두 개의 중(H)쇄 및 두 개의 경(L)쇄를 포함하는 단백질, 또는 이의 항원-결합 부분을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 간략화됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 간략화됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 추가로, 상보성 결정 영역(CDR)이라고 불리는 과변이성(hypervariability)의 영역으로 세분화될 수 있으며, 이는 보다 보존적인, 프레임워크 영역(framework regions)(FR)로 불리는 영역 사이에 배치되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 이루어지며, 아미노-말단에서 카복시-말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다.
본 개시내용에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 또는 이의 단편 또는 유도체를 지칭하고, 이것이 시험관 내에서 생산되든지 또는 생체 내에서 생산되든지와 상관 없이, 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 아우른다. 상기 용어는 다클론성, 단일클론성, 단일특이성, 다특이성, 비-특이성, 인간화, 단일-쇄, 키메릭, 합성의, 재조합, 잡종(hybrid), 돌연변이된, 및 그래프트(grafted) 항체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 용어 "항체"는 또한 항체 단편, 예컨대 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, 및 항원-결합 기능, 즉, PD-1에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 다른 항체 단편을 포함한다. 전형적으로, 이러한 단편은 항원-결합 단편을 포함할 것이다.
용어 "항원-결합 단편", "항원-결합 도메인", 및 "결합 단편"은 항체와 항원 사이의 특이적 결합의 원인인 아미노산을 포함하는 항체 분자의 일부를 지칭한다. 예를 들어, 항원이 큰 경우에, 항원-결합 단편은 단지 항원의 일부에만 결합할 수 있다. 항원 분자의 항원-결합 단편과의 특이적 상호작용의 원인이 되는 부분을 "에피토프" 또는 "항원 결정인자(antigenic determinant)"로 지칭한다.
항원-결합 단편은 전형적으로 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하지만, 필수적으로 둘 다 포함해야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 소위 Fd 항체 단편은 오직 VH 도메인으로만 구성되지만, 여전히 온전한 항체의 항원-결합 기능을 약간 유지한다.
상기와 같이, 용어 "에피토프"는 항원 결정인자를 정의하며, 이는 상기에 정의된 바와 같이 결합 단편에 의해 특이적으로 결합/동정된다. 결합 단편은, 표적 구조, 예를 들어, 인간 및 뮤린 PD-1에 대해 고유한 구조적인 에피토프 또는 연속적인 에피토프와 특이적으로 결합/상호작용할 수 있다. 구조적인 또는 비연속적인 에피토프는, 1차 서열에서 분리되지만 폴리펩티드가 생단백질(native protein)/항원으로 접힐 때 분자의 표면 상에 합쳐지는, 두 개 이상의 불연속의 아미노산 잔기의 존재에 의해 폴리펩티드 항원으로 특징지어진다. 에피토프에 기여하는 두 개 이상의 불연속의 아미노산 잔기는 하나 이상의 폴리펩티드 쇄(들)의 분리된 구획 상에 존재한다. 이 잔기들은 폴리펩티드 쇄(들)이 3-차원 구조로 접혀 에피토프를 구성할 때 분자의 표면 상에 합쳐진다. 대조적으로, 연속적인 또는 선형 에피토프는 폴리펩티드 쇄의 단일 선형 세그멘트(segment) 내에 존재하는, 두 개 이상의 불연속의 아미노산 잔기로 구성된다.
용어 "PD-1의 에피토프에 결합한다"는 항체가 PD-1의 특정한 에피토프에 대해 특이적 결합을 갖는다는 것을 지칭하며, 이 에피토프는 선형 아미노산 서열, 또는 PD-1 폴리펩티드의 일부 상의 3원, 즉, 3차원의 구조에 의해 정의될 수 있다. 결합은 PD-1의 부분에 대한 항체 친화성이 다른 관련된 폴리펩티드들에 대한 그들의 친화성보다 실질적으로 더 크다는 것을 의미한다. 용어 "실질적으로 큰 친화성"은 다른 관련된 폴리펩티드들에 대한 친화성과 비교하여, PD-1의 부분에 대한 친화성에 있어서 측정 가능한 증가가 있음을 의미한다. 바람직하게는, 상기 친화성은 다른 단백질에 대하여보다, PD-1의 특정한 부분에 대하여 적어도 1.5-배, 2-배, 5-배 10-배, 100-배, 103-배, 104-배, 105-배, 106-배 이상이다. 바람직하게는, 결합 친화성은 효소-결합 면역 흡착측정법(ELISA)에 의해, 또는 유세포 분석법(FACS) 또는 표면 플라즈마 공명(SPR)에 의해 결정될 수 있다. 보다 바람직하게는, 결합 특이성은 유세포 분석법에 의해 수득된다.
용어 "교차-반응성(cross-reactivity)"은 본원에 기재된 항원 단편의, 인간 및 뮤린(마우스 또는 랫트)에서의 동일한 표적 분자로의 결합을 지칭한다. 그러므로, "교차-반응성"은 상이한 종에서 발현되는 동일한 분자 X에 대한, 그러나 X 이외의 다른 분자에 대하여는 아닌, 종간 반응성(interspecies reactivity)으로서 이해되어야 한다. 예를 들어 인간 PD-1을 인식하는 단일클론성 항체의 뮤린(마우스 또는 랫트) PD-1으로의 교차-종 특이성은 예를 들어, FACS 분석에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체(subject)"는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어, 포유류 및 비-포유류, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 젖소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 언급될 때를 제외하고, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 상호교환적으로 사용된다.
용어 "치료" 및 "치료 방법(therapeutic method)"은 치료법과 예방 조치/예방책 둘 다를 지칭한다. 치료가 필요한 것은 이미 특정한 의학적 장애를 갖고 있는 개체(individual) 뿐만 아니라, 결국 장애를 얻게될 개체를 포함한다.
본 발명의 특징 및 이점들
본 발명의 발명자들은 소유하고 있는 하이브리도마 기술을 이용하여 PD-1에 대한 인간화 항체를 생성하였다. 본 발명에서 보고되는 항체는 높은 결합 친화성, 교차-과 반응(cross-family reaction) 없이 인간 및 마우스 PD-1 단백질 둘 다에 대한 특이적 결합; 및 T 세포 증식을 강화하고 시토카인 IFN-γ 및 인터류킨-2 생산을 증가시킴을 포함하여, 면역 반응의 강력한 조절을 갖는다.
마우스 PD-1에 결합하는 신규한 항-PD-1 항체는 면역화된 랫트로부터 유래하고, 이는 항-PD-1 항체는 임상 전 마우스 모델에서 사용될 수 없다는 단점을 극복하며; 서열 인간화 후의 인간화 수준이 100%에 가까워, 인체에 사용되는 약물의 부작용을 크게 감소시킨다.
도 1은 세포 표면 인간 및 마우스 PD-1에 결합하는 하이드리도마 항체의 그래프를 나타낸다. 도 1A는 인간 PD-1에 대한 결합을 나타낸다. 도 1B는 마우스 PD-1에 대한 결합을 나타낸다.
도 2는 1차 돌연변이유발 라이브러리 스크린(library screen)으로부터의 결과를 나타낸다. 높은 친화도 상에서 서열 및 분석 돌연변이가 2차 돌연변이를 위해 클론화된다.
도 3은 FACS로 시험된 교차-종(cross-species)의 결과를 나타낸다. 도 3A는 인간 PD-1 형질감염된 CHO-S 세포에 대한 결합을 나타낸다. 도 3B는 마우스 PD-1 형질감염된 293F 세포에 대한 결합을 나타낸다. 도 3C는 활성화된 사이노몰거스(cynomolgus) PBMC에 대한 결합을 나타낸다. 주석: 동형(isotype)은 인간 IgG4 카파(kappa)이었다. 하기에서도 동일하다.
도 4는 ELISA로 시험된 교차-종의 결과를 나타낸다. 도 4A는 인간 PD-1에 대한 결합을 나타낸다. 도 4B는 마우스 PD-1에 대한 결합을 나타낸다. 도 4C는 사이노몰거스 PD-1에 대한 결합을 나타낸다.
도 5는 교차-과 시험의 결과를 나타낸다. 항-PD-1 항체는 인간 PD-1에 특이적으로 결합하고, CD28 및 CTLA-4에는 결합하지 않는다.
도 6A는 PD-1 형질감염된 CHO-S 세포에 대한 인간 PD-L1 결합을 차단하는 항-PD-1 항체의 결과를 나타낸다. 도 6B는 PD-1 형질감염된 293F 세포에 대한 마우스 PD-L1 결합을 차단하는 항-PD-1 항체의 결과를 나타낸다.
도 7은 항-PD-1 항체가 PD-1에 대한 인간 PD-L2 결합을 차단할 수 있다는 사실을 나타낸다.
도 8A 및 도 8B는 항-PD-1 항체가 기준(benchmark) 항체와 동일하거나 유사한 에피토프 빈(bin)에 존재함을 시사하는 에피토프 비닝 분석(epitope binning assay)의 결과를 나타낸다. 도 8A는 WBP305BMK1(US9084776)에 대한 비닝을 나타낸다. 도 8B는 키트루다(Keytruda)(US8168757)에 대한 비닝을 나타낸다.
도 9는 항-PD-1 항체의 인간/마우스 PD-1과의 교차-반응성을 나타낸다. 각각의 항체 2 μg/mL 를 96-웰 플레이트(well-plate)에 밤새도록 코팅하고 hPD-1/mPD-1-His 단백질과 함께 인큐베이션하고, 이후에, 검출을 위해 HRP-항-His 항체를 첨가하였다.
도 10은 hPD-1 구조 상에 매핑된(mapped) 핫 스팟 잔기(Hot spot residue)를 나타낸다. (A). hPD-L1 결합 부위. 데이터는 문헌 [Zak et al. 2015]로부터 수득하였다. (B-C). 각각 항체 W3052_r16.88.9 및 키트루다의 결합 부위. 데이터는 표 8로부터 수득하였다. 도면 상의 색상들은 에피토프 간의 차이점을 구별하는 데에 도움을 주기 위한 것이다.
도 11은 인간과 뮤린 PD-1 사이의 비교를 나타낸다. 이들의 명백한 구조적 차이점(BC 고리 및 C'D 고리(또는 mPD-1 상의 C'' 가닥))을 주황색으로 표시하였다. (A). hPD-1의 구조(PDB 코드 4ZQK). 없어진 고리(missing loop)(Asp85-Asp92)를 이의 NMR 구조(PDB 코드 2M2D)에 기반하여 개조하였다. (B) mPD-1의 구조(PDB 코드 3BIK).
도 12A 내지 12C는 항-PD-1 항체가 인간 CD4+ T 세포의 기능을 강화할 수 있음을 입증하는 인간 동종 림프구 혼합 배양 반응(allo-MLR)의 결과를 나타낸다. 도 12A는 항-PD-1 항체가 IL-2 분비를 용량-의존적 방식으로 증가시킴을 나타낸다. 도 12B는 항-PD-1 항체가 IFN-γ 분비를 용량-의존적 방식으로 증가시킴을 나타낸다. 도 12C는 항-PD-1 항체가 CD4+ T 세포 증식을 용량-의존적 방식으로 증가시킴을 나타낸다.
도 13A 내지 13C는 항-PD-1 항체가 마우스 CD4+ T 세포의 기능을 강화할 수 있음을 입증하는 마우스 동종 림프구 혼합 배양 반응의 결과를 나타낸다. 도 13A는 항-PD-1 항체가 IL-2 분비를 용량-의존적 방식으로 증가시킴을 나타낸다. 도 13B는 항-PD-1 항체가 IFN-γ 분비를 용량-의존적 방식으로 증가시킴을 나타낸다. 도 13C는 항-PD-1 항체가 CD4+ T 세포 증식을 용량-의존적 방식으로 증가시킴을 나타낸다.
도 14A 및 14B는 항-PD-1 항체가 인간 CD4+ T 세포의 기능을 강화할 수 있음을 입증하는 인간 동종 림프구 혼합 배양 반응의 결과를 나타낸다. 도 14A는 항-PD-1 항체가 IFN-γ 분비를 용량-의존적 방식으로 증가시킴을 나타낸다. 도 14B는 항-PD-1 항체가 CD4+ T 세포 증식을 용량-의존적 방식으로 증가시킴을 나타낸다.
도 15는 항-PD-1 항체가 Treg의 억제적인 기능을 역전시킬 수 있음을 입증한다. 도 15A는 항-PD-1 항체가 IFN-γ 분비를 회복시킬 수 있음을 나타낸다. 도 15B는 항-PD-1 항체가 T-세포 증식을 회복시킬 수 있음을 나타낸다.
도 16은 항-PD-1 항체가 활성화된 CD4+ T 세포 상에서 ADCC 활성을 조정하지 않음을 입증하는 ADCC 시험의 결과를 나타낸다.
도 17은 항-PD-1 항체가 활성화된 CD4+ T 세포 상에서 CDC 활성을 조정하지 않음을 입증하는 CDC 시험의 결과를 나타낸다.
도 18은 2E5 처리 후 동계의(syngeneic) 종양 누드 마우스 모델에서의 체중 변화를 나타낸다. 데이터 지점은 평균 체중을 나타내고; 오차 바(bar)는 표준 오차(SEM)을 나타낸다.
도 19는 상대적 중량 변화를 나타낸다(%). 체중에서의 상대적 변화를 투여 시작 시의 체중에 기반하여 계산하였다. 데이터 지점은 평균 체중을 나타내고; 오차 바는 표준 오차(SEM)를 나타낸다.
도 20은 2E5 처리 후 클라우드만S91(CloudmanS91) 동계의 종양 누드 마우스 모델에서의 종양 성장 곡선을 나타낸다. 데이터 지점은 평균 체중을 나타내고; 오차 바는 표준 오차(SEM)를 나타낸다.
도 21은 2E5 처리 후 클라우드만S91(CloudmanS91) 동계의 종양 누드 마우스 모델에서의 생존 곡선을 나타낸다.
실시예
실시예 1 : 연구 자료 준비
1. 면역원 생성(Immunogen generation)
ECD 또는 전장(full length)의 PD-1 및 PD-L1을 암호화하는 DNA를 합성하고 발현 벡터 pcDNA3.3에 삽입하였다. 맥스-프렙(Max-prep) 플라스미드 DNA 및 삽입된 DNA 서열을 서열분석(sequencing)을 통해 확인하였다. 인간 Fc, 마우스 Fc 및 His 태그를 포함한 다양한 태그(tag)를 포함하는 융합 단백질 PD-1 ECD 및 PD-L1 ECD를, 인간 PD-1 ECD 유전자를 CHO-S 또는 HEK293 세포에 형질감염시킴으로써 수득하였다. 5일 후, 일시적인 형질감염된 세포의 배양물로부터 상층액을 수확하였다. 면역화 및 스크리닝에 사용하기 위해 융합 단백질을 정제하고 정량화하였다.
2. 안정한 세포주 확립
항체 스크리닝 및 생물학적 검증(validation)을 위한 도구를 수득하기 위해, 본 발명자들은 PD-1 및 PD-L1 형질감염된 세포주를 생성하였다. 요약하면, CHO-K1 또는 293F 세포를, 전-장의 PD-1 또는 PD-L1을 함유하는 pcDNA3.3 발현 벡터로 리포펙타민 2000 형질감염 키트(Lipofectamine 2000 Transfection kit)를 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 형질감염 후 48 내지 72시간; 형질감염된 세포를 블라스티시딘(Blasticidin) 또는 G418을 함유하는 배지 속에서 배양하여, 그들의 유전체 DNA(genomic DNA) 내로 안정하게 혼입된(incorporated) PD-1 또는 PD-L1 유전자를 가진 세포를 선택하였다. 그동안 세포를 관심있는 유전자 PD-1 및 PD-L1 발현에 대해 점검하였다. 일단 발현이 확인되면, 관심있는 단일 클론을 제한된 희석을 이용해 골라냈고 큰 부피로 늘렸다. 이후에, 확립된 단일클론성 세포주를 더 낮은 용량의 항생체 블라스티시딘 또는 G418을 함유하는 배지에서 유지하였다.
실시예 2 : 항체 하이브리도마 생성
1. 면역화
6-8주령의 암컷 SD 랫트를 최초로 티터맥스(TiterMax)에서 발바닥 주사에 의해 10 μg/동물의 인간 PD-1 ECD 단백질 및 10 μg/동물의 마우스 PD-1 ECD 단백질로 면역화하였고, 1주에 2회 알루미늄 중의 인간 PD-1 ECD 단백질 또는 마우스 PD-1 ECD 단백질로 번갈아서 추가접종(boost)하였다. 매 2주마다 혈청 항체 역가(titer)를 ELISA 또는 FACS로 측정하였다.
2. 세포 융합
혈청 항체 역가가 충분히 높아졌을 때, 아주반트(adjuvant) 없이 동일 부피의 D-PBS(둘베코 인산염 완충 식염수) 중의 인간 및 마우스 PD-1 ECD 단백질 둘 다로 랫트에 최종 추가접종을 제공하였다. 세포 융합은 다음과 같이 수행되었다: 골수종 세포 SP2/0을 준비하고, 골수종 세포를 융합 1주 전에 녹였으며, 융합 전 날까지 날마다 1:2로 분열시켜 대수 생장을 유지시켰다. 면역화된 SD 랫트의 림프절로부터 단리된 B 림프구를 흑색종 세포와 결합시켰다(1:1의 비율로). 세포를 트립신으로 처리하고 반응을 FBS로 중지시켰다. 이후에, 세포 혼합물을 세척하고 ECF 용액에 ECF에 대하여 2Х106 세포/ml로 재현탁시켰다. 전자 세포 융합(BTX2000) 후, 융합 챔버(chamber)로부터의 세포 현탁액을 더 많은 배지를 함유하는 살균된 튜브로 즉시 이동시켰고, 37℃의 인큐베이터에서 적어도 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이후에, 세포 현탁액을 혼합하고 96-웰 플레이트(1Х104 세포/웰)로 이동시켰다. 96-웰 플레이트를 37℃, 5% CO2 에서 배양하였고, 주기적으로 모니터링하였다. 클론이 충분히 커졌을 때(7 내지 14일 후), 항체 스크리닝을 위해 100 μL 의 상층액을 조직 배양 플레이트에서 96-웰 분석 플레이트로 이동시켰다.
3. 하이브리도마 상층액의 첫 번째, 두 번째 및 구조 스크린
하이브리도마 상층액의 인간 또는 마우스 PD-1 단백질에 대한 결합을 시험하기 위해 ELISA 분석을 첫 번째 스크린 방법으로 사용하였다. 요약하면, 플레이트(눈크)(Nunc)를 1 μg/ml의 인간 또는 마우스 PD-1 ECD로 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. 차단 및 세척 후, 하이브리도마 상층액을 코팅된 플레이트에 로딩하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이후에, 플레이트를 세척하고 그 뒤에 2차 항체 염소 항 랫트 IgG Fc HRP(베틸)(Bethyl)과 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하였고 반응을 2M HCl로 중지시켰다. 마이크로플레이트 리더기(몰레큘라 디바이스)(Molecular Device)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 확인하였다.
세포막 상에 발현되는 구조적 PD-1 분자 상에의 항-PD-1 항체의 본래의 결합을 확인하기 위해, 두 번째 스크리닝으로서 PD-1 형질감염된 세포주를 이용하여 FACS 분석을 수행하였다. 인간 PD-1을 발현하는 CHO-S 세포 또는 마우스 PD-1을 발현하는 293F 세포를 1Х105 세포/웰의 밀도로 96-웰 U-하부 플레이트(U-bottom plate)(Corning)로 이동시켰다. 이후에, 하이브리도마 상층액을 첨가하고 세포와 함께 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 1XPBS/1%BSA로 세척한 후, 2차 항체 염소 항 랫트 FITC(잭슨 이뮤노리서치 랩)(Jackson ImmunoResearch Lab)를 적용하였고 암 조건, 4℃에서 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 이후에, 세포를 세척하고 1XPBS/1%BSA 중에 재현탁시키거나 4% 파라포름알데히드로 고정시켰고, 유세포 분석(BD) 및 플로우조(FlowJo) 소프트웨어로 분석하였다. 모(parental) CHO-S 또는 293F 세포주에 결합한 항체를 각각 음성 대조군으로 사용하였다.
잠재적인 길항적 히트(hit)를 선택하기 위해, 선택된 항체를 FACS 분석을 이용해 PD-1 형질감염된 세포에 대한 리간드 PD-L1의 결합을 차단하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 인간 PD-1을 발현하는 CHO-S 세포 또는 마우스 PD-1을 발현하는 293F 세포를 1Х105 세포/웰의 밀도로 96-웰 U-하부 플레이트(BD)로 이동시켰다. 하이브리도마 상층액을 첨가하였고 1시간 동안 4℃에서 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 마우스 Fc 융합-인간 PD-L1 단백질 또는 마우스 Fc 융합-마우스 PD-L1 단백질을 첨가하였고 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 2차 항체 염소 항 마우스 IgG Fc FITC 항체(랫트 IgG Fc에 대한 교차-반응성 없음, 잭슨 이뮤노리서치 랩)는 암 조건, 4℃에서 1시간 동안 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 이후에, 세포를 세척하고 1XPBS/1%BSA 중에 재현탁시키거나 4% 파라포름알데히드로 고정시켰고, 유세포 분석(BD) 및 플로우조 소프트웨어로 분석하였다.
도 1은 세포 표면 인간 및 마우스 PD-1에 결합한 16개 하이브리도마 항체의 그래프를 나타낸다. 도 1A는 인간 PD-1에 대한 결합을 나타낸다. 도 1B는 마우스 PD-1에 대한 결합을 나타낸다.
4. 하이브리도마 하부-클로닝(subcloning)
첫 번째 스크리닝 및 확인 스크리닝을 통해 구체적인 결합 및 차단 활성을 증명하자마자, 양성 하이브리도마 세포주를 하부-클로닝을 위해 사용하였다. 요약하면, 각각의 하이브리도마 세포주에 대해, 세포의 수를 세고 200 μL의 클로닝 배지 당 5 세포, 1 세포 또는 0.5 세포를 제공하도록 희석하였다. 5 세포/웰의 1개 플레이트, 1 세포/웰의 1개 플레이트 및 0.5 세포/웰의 4개의 플레이트가 되도록 세포 현탁액을 200 μL/웰만큼 96-웰 플레이트로 플레이팅하였다. 플레이트를 이들이 상기에 기재된 결합 ELISA 또는 FACS로 스크리닝 될 준비가 될 때까지 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 선택된 단일 클론의 ESN을 수집하였고, 항체를 추가의 특성화를 위해 정제하였다.
5. 하부유형 시험(Subtypes Testing)
50 μL 의 염소 항-랫트 IgG, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG 또는 IgM 항체(1 μg/mL)를 웰 당 미량정량판(microtiter plate)(눈크) 중에 밤새도록 코팅하였다. 차단 후, 50 μL 의 하이브리도마 상층액 시료를 각각의 웰에 첨가하였고, 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 염소 항-랫트 IgG 카파 또는 HRP 표지된 람다 경쇄 2차 항체(베틸)이 검출 항체이다. 색을 내기 위해 TMB 기질을 사용하였으며, 이후에, 반응을 2M HCl로 퀀칭(quenching)시켰다. 450 nm에서 빛을 흡광하는 값을 마이크로플레이트 리더기(몰레큘라 디바이스)를 이용하여 확인한다.
표 3은 16개 하이브리도마 항체의 하부유형 결과를 나타낸다. 7개의 항체는 다클론성 항체이고, 9개의 항체는 IgG2 카파 하부유형이다. 생체 내에서 항-PD-1 항체의 ADCC 및 CDC의 역할을 피하기 위한 필요를 고려하여, 인간화 항체를 인간 IgG4 카파 하부유형으로서 확립하였다.
[표 3] 하이브리도마 항체의 하부 유형
Figure 112021075571923-pat00004
실시예 3 : 항체 하이브리도마 세포 서열 및 인간화 항체 분자 작제 및 친화성 성숙
1. 항체 하이브리도마 세포 서열
RNA를 트리졸 시약으로 단일클론성 하이브리도마 세포로부터 단리하였다. PD-1 키메릭 항체의 VH 및 VL을 다음과 같이 증폭하였다: RNA를 먼저 여기 기재된 바와 같은 역전사 효소를 이용하여 cDNA로 역전사시켰다,
반응 계 (20 μL)
10 X RT 버퍼(Buffer) 2.0 μL
25 X dNTP 믹스 (100 mM) 0.8 μL
10 X RT 무작위 프라이머/올리고dT/특이적 프라이머 2.0 μL
멀티스크라이브(MultiScribe)TM 역전사 효소 1.0 μL
RNase 억제제 1.0 μL
RNA 2 μg
뉴클라아제-비함유 H2O 20.0 μL 까지
반응 조건
Figure 112021075571923-pat00005
수득되는 cDNA를 흥미있는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용한 후속적인 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. PCR 반응은 다음과 같이 이루어졌다:
cDNA 1 μL
Ex PCR 버퍼 5 μL
dNTP 2 μL
ExTaq 0.5 μL
P1 (25 pM) 0.5 μL
P2 (25 pM) 0.5 μL
ddH2O 40.5 μL
반응 조건:
Figure 112021075571923-pat00006
수득되는 PCR 생산물(10 μL)을 pMD18-T 벡터로 결찰시켰다. 상위 10개의 적격 세포(competent cell)를 결찰 생산물 10μL로 형질전환시켰다. M13-48 및 M13-47 프라이머를 이용한 PCR에 뒤이어 서열분석으로 양성 클론을 점검하였다.
2. 인간화 항체 분자 작제
PD-1에 결합하는 항-PD-1 항체의 높은 친화성 및 특이성에 따라, 하이브리도마로부터의 랫트 항-PD-1 항체를 선택하고 인간화하여, 인간 항체 서열과의 상동성을 향상시켰다. 상기 인간화 용법은 CDR-그래프팅 기술(CDR-grafting technique)로 불린다. 항체의 가변 영역 유전자, 예컨대 FR 영역 및 CDR 영역을 카밧(KABAT) 시스템 및 IMGT 시스템으로 분할하였다. 항체 데이터베이스에서, 결합 서열 상동성 및 구조적 유사성의 정렬에 기반하여, 뮤린 영역 FR1-3의 유전자를 인간화 가변 영역 FR1-3으로 대체하였고, 뮤린 유전자의 영역 FR4를 가장 유사한 구조를 갖는 JH 및 JK 유전자로부터 유래된 인간화 FR4 영역으로 대체하였다. 주형 서열 및 코돈 최적화를 확인한 후, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 합성하고 발현 벡터 내로 클로닝하였으며, 이후에 인간화 항체를 발현시켰다.
세포 표면 인간 및 마우스 PD-1에 대한 결합 능력에 따라, W3052_r16.88.9 및 W3052_r16.81.3을 인간화를 위해 선택하였다. 표 2는 인간화 점수의 분석을 나타낸다. 이러한 모든 요소들, 예컨대 더 우수한 친화성 및 인간화 점수를 고려하여 클론 W3052-16.88-z9-IgG4(42720)를 친화성 성숙을 위해 선택하였다(표 4).
[표 4]
Figure 112021075571923-pat00007
Figure 112021075571923-pat00008
Figure 112021075571923-pat00009
3. 친화성 성숙
모 클론의 세 개의 상보성-결정 영역(VH CD3, VK CDR1, 및 VK CDR3)의 각각의 아미노산을 혼성화 돌연변이유발 방법(hybridization mutagenesis method)을 이용하여 개별적으로 다른 20개의 아미노산으로 돌연변이화하였다. 각각의 표적 CDR 위치에 돌연변이를 도입하기 위해 20개의 아미노산을 암호화하는 NNS 코돈을 함유하는 DNA 프라이머를 사용하였다. 개별적인 축퇴 프라이머(degenerate primer)를 혼성화 돌연변이유발 반응에 사용하였다. 요약하면, 각각의 축퇴 프라이머를 인산화하였고, 이후에, 우리디닐화(uridinylated) ssDNA와 함께 10:1의 비율로 사용하였다. 혼합물을 5분 동안 85℃까지로 가열하였고 이후에, 1시간에 걸쳐 55℃로 냉각하였다. 그 후에, T4 리가아제 및 T4 DNA 폴리머라아제를 첨가하였고 혼합물을 1.5 시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. VH 및 VL CDR을 위한 합성 생산물을 각각 혼주(pooled)시켰다. 전형적으로, BL21 세균 론(bacterial lawn) 상에 플라크(plaque)를 형성하기 위해, 또는 scFv 단편을 생산하기 위해, 혼주된 라이브러리 DNA 200 ng을 BL21 내로 전기천공시켰다.
1차 스크린은 96-웰 플레이트(깊은 웰)에서 성장한 세균의 세포질 추출물(PE)을 이용하여 수행된 단일 지점 ELISA(SPE) 분석으로 구성되었다. 요약하면, 이 캡쳐 ELISA(capture ELISA)는 96-웰 막시소르프 이뮤노플레이트(Maxisorp Immunoplate)의 개별적인 웰을 코팅 버퍼(200 mM Na2CO3/NaHCO3) 중, pH 9.2, 4℃에서 밤새도록 항-c-myc 항체로 코팅하는 것을 수반한다. 다음 날, 플레이트를 카제인으로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 이후에, scFV PE를 플레이트에 첨가하였고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, 바이오티닐화 항체 단백질을 웰에 첨가하였고 혼합물을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이에 이어서 스트렙타비딘-HRP 접합체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. HRP 활성을 TMB 기질로 검출하였고 반응을 2 M HCl로 퀀칭하였다. 플레이트를 450 nm에서 확인하였다. 모 클론보다 더 우수한, 450 nm에서의 광학 밀도(OD) 신호를 나타낸 클론을 선택하였고 양성 결과를 확인하기 위한 복제물 중에서 ELISA(상기에 기재된 바와 같음)를 이용하여 재-분석하였다. 모 항체의 것에 비해 우수한 신호를 반복적으로 나타내는 클론을 서열분석하였다. 이후에, CDR 변화를 가진 각각의 클론의 scFv 단백질 농도를 정량적 scFv ELISA로 결정하였는데, 여기서 공지된 농도의 scFv를 참조로서 사용하였다. scFv 단백질 농도는 ELISA의 신호를 참조 scFv에 의해 발생되는 신호와 비교함으로써 결정하였다. 돌연변이 scFv와 모 항체의 상대적 결합 친화성을 결정하기 위해, 정규화된 scFv 농도 하에서 모든 양성 변이체에 대하여 결합 분석을 한 번 더 반복하였다.
항원과 결합하는 데에 유익하다고 결정된 VH 및 VL 내의 점 돌연변이를 추가로 조합하여, 추가적인 결합 상승작용을 얻었다. 조합 돌연변이(combinatorial mutant)들을 scFv로서 발현시키고 캡처 ELISA를 이용하여 스크리닝하였다. 450 nm에서 모 클론보다 더 우수한 OD 신호를 나타내는 클론들을 서열분석하였고 추가로 상기에 기재된 바와 같이 결합 ELISA로 확인하였다.
친화성 성숙 후, 총 10개의 인간화 항체(2E5, 2G4, 1G10, 2C2, 2B1, 8C10, 1H6, 5C4, A6W 및 L1I)를 수득하였다. 도 2는 1차 돌연변이유발 라이브러리 스크린으로부터의 결과를 나타낸다. 인간, 사이노몰거스 원숭이(cynomolgus monkey) 및 마우스에서의 10개의 인간화 항체의 서열 및 친화성 데이터를 표 5에 나타내었다.
표 5는 2차 돌연변이유발 라이브러리 스크린으로부터의 결과를 나타냈다. 클론 1H6, 2E5, 2G4 및 2C2를 추가의 분석을 위해 선택하였다.
[표 5]
Figure 112021075571923-pat00010
4. 항체 정제
항체 생산 및 발현을 위해, 친화성 성숙된 인간화 항체를 함유하는 벡터를 293F 세포에 형질감염시켰다. 293F 세포의 상층액 중의 항체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다.
실시예 4 : 인간화 항체의 특성화
1. 인간, 사이노몰거스 및 마우스 PD-1에 대한 교차-반응성(교차-종)
1.1 FACS
교차-반응성을 FACS 및 ELISA로 측정하였다. FACS의 경우, 실시예 2.3에 기재된 바와 같이 항-PD-1 항체를 세포 표면 인간, 마우스 및 사이노몰거스 PD-1에 대한 결합으로 시험하였다.
도 3은 FACS에 의해 시험된 교차-종의 결과를 나타냈다. 도 3A는 인간 PD-1 형질감염된 CHO-S 세포에 대한 결합을 나타냈다. 항체는 2.20-2.78 nM의 EC50으로 인간 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있다. 도 3B는 마우스 PD-1 형질감염된 293F 세포에 대한 결합을 나타냈다. 항체는 11.8-15.1 nM의 EC50으로 마우스 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있다. 도 3C는 용량 의존적 방식으로 활성화된 사이노몰거스 PBMC에 대한 결합을 나타냈다. 동형은 인간 IgG 카파였다. 하기에서도 동일하다.
1.2 인간, 사이노몰거스 및 마우스 PD-1에 대한 교차-반응성(교차-종)
ELISA의 경우, 플레이트(눈크)를 인간, 사이노몰거스 또는 마우스 PD-1(시노 바이올로지칼) 1 μg/ml로 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. 차단 및 세척 후, 항체를 차단 버퍼 중에 연속적으로 희석하였고 플레이트에 첨가하였으며 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이후에, 플레이트를 세척하였고 그 후에 2차 항체 염소 항 인간 IgG HRP(베틸)과 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하였고 반응을 2M HCl로 중지시켰다. 마이크로플레이트 리더기(몰레큘라 디바이스)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 확인하였다.
도 4는 ELISA에 의해 시험된 교차-종의 결과를 나타냈다. 도 4A는 인간 PD-1에 대한 결합을 나타냈다. 도 4B는 마우스 PD-1에 대한 결합을 나타냈다. 도 4C는 사이노몰거스 PD-1에 대한 결합을 나타냈다.
2. 인간 PD-1 과 구성원 CD28, CTLA4에 대한 교차-반응성
각각 인간 PD-1, CD28, CTLA-4 또는 ICOS를 발현하는 작제된 세포주들을 2Х105 세포/웰의 밀도로 96-웰 U-하부 플레이트(BD)로 이동시켰다. 시험용 항체를 세척 버퍼(1XPBS/1%BSA) 중에 희석시켰고 1시간 동안 4℃에서 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 세척 후, 2차 항체 염소 항-인간 IgG Fc FITC(잭슨 이뮤노리서치 랩)을 첨가하였고 암(dark) 상태 하의 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이후에, 세포를 1회 세척하고 1XPBS/1%BSA 중에 재현탁시켰으며, 유세포 분석(BD) 및 플로우조 소프트웨어로 분석하였다.
도 5는 교차-과 시험의 결과를 나타냈다. 항-PD-1 항체는 인간 PD-1에 특이적으로 결합할 수 있고, CD28 및 CTLA-4에는 결합하지 않는다.
3. PD-1에 대한 리간드 결합의 차단
3.1 PD-1에 대한 PD-L1 결합을 차단하는 항-PD-1 항체의 능력을 실시예 2.3에 기재된 바와 같이 FACS로 시험하였다.
3.2 PD-1에 대한 PD-L2 결합을 차단하는 항-PD-1 항체의 능력을 ELISA로 시험하였다. 요약하면, 플레이트(눈크)를 1 μg/ml의 인간 PD-1으로 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. 항체를 차단 버퍼 중에 연속적으로 희석하였고 his 태그 접합된 PD-L2와 혼합하였다. 코팅된 플레이트의 차단 및 세척 후, 항체/PD-L2 혼합물을 플레이트에 첨가하였고, 이후에, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. 이후에, 플레이트를 세척하고 그 후에 2차 항체 염소 항-his HRP(젠스크립트)(GenScript)와 함께 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세척 후, TMB 기질을 첨가하였고 반응을 2M HCl로 중지시켰다. 450 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더기(몰레큘라 디바이스)를 이용하여 확인하였다.
도 6A는 PD-1 형질감염된 CHO-S 세포에 대한 인간 PD-L1 결합을 차단하는 항-PD-1 항체의 결과를 나타냈다. 도 6B는 PD-1 형질감염된 293F 세포에 대한 마우스 PD-L1 결합을 차단하는 항-PD-1 항체의 결과를 나타냈다. 도 7은 항-PD-1 항체가 PD-1에 대한 인간 PD-L2 결합을 용량-의존적 방식으로 차단할 수 있음을 나타냈다.
4. 표면 플라스몬 공명(SPR)으로 시험된 전체 동역학 결합 친화성
항체를 프로테온(ProteOn) XPR36(바이오-래드)(Bio-Rad)을 이용한 SPR 분석을 통해 PD-1에의 친화성 및 결합 동역학에 대해 특성화하였다. 단백질 A 단백질(시그마)(Sigma)를 GLM 센서 칩(바이오-래드)에 아민 연결(coupling)을 통해 고정시켰다. 정제된 항체를 센서 칩 위로 흘려보내어 단백질 A에 의해 포획시켰다. 칩을 90°로 회전시키고 기저선이 안정될 때까지 러닝 버퍼(running buffer)(1XPBS/0.01% 트윈20, 바이오-래드)로 세척하였다. 인간 PD-1 및 러닝 버퍼의 7개의 농도를 유속 30 μL/분으로 회합(association) 단계의 180s 동안 센서 칩으로 흘려 보냈고 300 s의 해리가 이어졌다. 재생 후, 마우스 PD-1 및 러닝 버퍼의 7개의 농도를 유속 30 μL/분으로 회합 단계의 180s 동안 센서 칩으로 흘려 보냈고 300 s의 해리가 이어졌다. 칩은 각각의 실험 후 pH 1.5의 H3PO4로 재생성되었다. 회합 및 해리 곡선은 프로테온 소프트웨어를 이용한 1:1 랭뮤어(Langmui) 결합 모델과 들어맞았다.
표 6A 및 6B는 SPR에 의한, 인간 및 마우스 PD-1에의 전체 동역학 결합 친화성의 결과를 나타냈다. BMS 특허 US9084776B2으로부터의 5C4의 클론에 따라 WBP305BMK1를 합성하였다. 키트루다는 머크로부터의 항-PD-1 약물이었다. 하기에서도 동일하다. 결과는 SPR 분석에 의한 인간 PD-1에의 친화성 능력은 1.43E-8 내지 5.64E-9 mol/L임을 나타냈다. WBP305BMK1을 키트루다와 비교했을 때, 항체 2E5, 2G4 또는 2C2의 KD 값은 더 작았는데, 이는 2E5, 2G4 또는 2C2가 인간 PD-1에 대한 더 우수한 결합 능력을 가짐을 나타낸다. 더욱이, 마우스-PD-1에의 친화성 능력은 9.37E-9 내지 3.89E-9 mol/L이었다.
[표 6A]
Figure 112021075571923-pat00011
[표 6B]
Figure 112021075571923-pat00012
5. 유세포 분석(FACS)으로 시험된 세포 표면 PD-1 분자에 대한 항-PD-1 항체의 결합 친화성
인간 PD-1을 발현하는 CHO-S 세포 또는 마우스 PD-1을 발현하는 293F 세포를 96-웰 U-하부 플레이트(BD)로 1X105 세포/웰의 밀도로 이동시켰다. 시험용 항체는 세척 버퍼(1XPBS/1%BSA) 중에 1:2로 연속적으로 희석시켰고 세포와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 2차 항체 염소 항-인간 IgG Fc FITC(몰 IgG 당 3.0 몰 FITC, (잭슨 이뮤노리서치 랩)을 첨가하고 암 상태 하의 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이후에, 세포를 한 번 세척하고, 1XPBS/1%BSA 중에 재현탁시켰고, 유세포 분석(BD)에 의해 분석하였다. 형광 광도를 결합된 분자/세포에 기반한-정량적 비즈(퀀텀(Quantum)TM MESF 키트, 뱅스 라보레이토리스, 인크.(Bangs Laboratories, Inc.))로 전환하였다. KD를 그래프패드 프리즘5를 이용하여 계산하였다.
표 7A 및 7B는 유세포 분석으로 시험된, 항-PD-1 항체의 세포 표면 인간 및 마우스 PD-1 분자에 대한 결합 친화성의 결과를 나타낸다. 결과는 FACS 분석에 의한 인간 PD-1의 친화성 능력이 3.80E-10 내지 2.15E-10 mol/L임을 나타냈다. 더욱이, 마우스 PD-1에 대한 친화성 능력은 5.39E-8 내지 1.74E-8 mol/L이었다.
[표 7A]
Figure 112021075571923-pat00013
[표 7B]
Figure 112021075571923-pat00014
6. 에피토프 비닝 시험
항-PD-1 항체의 결합 에피토프를 기준 항체 A 및 B와 FACS에 의해 비교하였다. 인간 PD-1을 세포 표면에 발현하는 CHO-S 세포를 비오티닐화 기준 항체 A 또는 B(1μg/ml) 및 시험용 항체(세척 버퍼에 연속적으로 희석된)의 혼합물과 함께 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고 2차 항체 스트렙타비딘-PE를 첨가하여 30분 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 이후에, 세포를 한 번 세척하고 1XPBS/1%BSA 중에 재현탁하였으며, 유세포 분석(BD)로 분석하였다.
도 8A 및 8B는 항-PD-1 항체가 기준 항체와 동일하거나 유사한 에피토프 빈(bin)에 존재함을 시사하는 에피토프 비닝 분석의 결과를 나타냈다. 도 8A는 WBP305BMK1(US9084776)에 대한 비닝을 나타냈다. 도 8B는 키트루다(US8168757)에 대한 비닝을 나타냈다.
더욱이, hPD-1 상의 알라닌 스캐닝 실험을 수행하였고 항체 결합에 대한 그들의 효과를 평가하였다. hPD-1 상의 알라닌 잔기들을 글라이신 코돈으로 돌연변이화하였고, 다른 모든 잔기들을 알라닌 코돈으로 돌연변이화하였다. hPD-1 세포외 도메인(ECD)의 각각의 잔기의 경우, 2회의 순차적인 PCR 단계를 이용하여 점 아미노산 치환을 제작하였다. 인간 PD-1의 ECD 및 C-말단 His-태그를 암호화하는 pcDNA3.3-hPD-1_ECD.His 플라스미드를 주형으로 사용하였으며, 돌연변이유발 프라이머 세트를 퀵체인지 라이트닝 다중부위-유도된 돌연변이유발 키트(QuikChange lightning multisite-directed mutagenesis kit)(아질렌트 테크놀로지스, 팔로 알토, CA)를 이용한 첫 번째 단계 PCR을 위해 사용하였다. 돌연변이 가닥 합성 반응 후, Dpn I 엔도뉴클레아제를 모 주형을 소화하기 위해 사용하였다. 두 번째-단계 PCR에서, CMV 프로모터, PD-1의 세포외 도메인(ECD), His-태그 및 헤르페스 단순 바이러스 티미딘 키나아제(TK) 폴리아데닐화로 구성된 선형 DNA 발현 카세트를 증폭하였고, HEK293F 세포(라이프 테크놀로지스, 게이더스버그, MD)에서 일시적으로 발현시켰다.
ELISA 결합 분석을 위해, 단일클론성 항체 W3052_r16.88.9 및 키트루다를 플레이트에 코팅하였다. 정량화된 PD-1 돌연변이 또는 인간/마우스 PD-1_ECD.His 단백질(시노 바이올로지컬, 중국)을 함유하는 상층액과 상호작용한 후, HRP 접합된 항-His 항체를 검출 항체로서 첨가하였다. 대조군 돌연변이의 평균에 따라 흡광도를 정규화하였다. 결합 배수 변화에 대한 추가적인 컷오프(cutoff)를 설정한 후(<0.55), 최종 결정된 에피토프 잔기를 동정하였다.
인간 및 뮤린 PD-1 둘 다에 대한 항체 W3052_r16.88.9 및 키트루다의 결합 활성을 수행하였다(도 9). W3052_r16.88.9는 hPD-1 및 mPD-1 둘 다와의 결합하는 것으로 발견된 반면 키트루다는 오직 인간의 것에만 결합했다(도 9). 이 W3052_r16.88.9의 독특한 기능적 교차-반응성은 약물 안전성을 평가할 때 임상 전 연구에서 보다 많은 동물 모델 선택을 제공하는 데에 도움이 될 수 있다. 관찰된 결합 거동의 기원을 분석하기 위해, 양 항체의 에피토프 매핑을 수행하였다.
항체 결합을 현저하게 감소시키는, 상위 30개의 점-치환된 hPD-1 돌연변이를 표 8에 나타내었다. hPD-1 결정 구조(PDB 코드 3RRQ 및 4ZQK) 상의 이 모든 잔기들의 위치를 점검한 것은 몇몇의 아미노산(예를 들면, Val144, Leu142, Val110, Met108, Cys123 등)이 단백질 내에 완전히 묻혀있고, 어떤 항체와도 직접적으로 접촉하지 않을 것 같다는 점을 나타냈다. 관찰된 결합 감소는 대부분 아마도 알라닌 치환 후의 hPD-1 구조의 불안정성 또는 심지어는 붕괴로 인한 것일 수 있다. 항원 구조 분석에 따르면, 몇 개의 잔기, 예를 들면 V144 및 L142는 결합 활성에 관여하지 않지만, hPD-1 구조의 안정성에 책임이 있는 것으로 기대된다. 양 항체에 영향을 미치는 돌연변이는 가짜 핫 스팟(false hot spot)으로서 처리하였고 목록에서 제거하였다. 결합 배수 변화에 대한 추가적인 컷오프(cutoff)를 설정한 후(<0.55), 최종 결정된 에피토프 잔기를 표 9에 나열하였다. 이들은 W3052_r16.88.9에 대하여 9개의 위치이고, 키트루다에 대하여 5개의 위치이다.
표 9의 W3052_r16.88.9 및 키트루다의 에피토프 잔기를 비교한 것은 단지 두 개의 겹쳐진 핫 스팟 잔기만을 나타냈다. 나머지는 다소 다양하게 보이는데, 이는 두 항체가 아마도 hPD-1 결합 및 hPD-L1 차단과 관련해서 매우 상이한 메커니즘을 선택해왔을 지도 모른다는 사실을 나타낸다. 메커니즘을 해석하기 위해 표 9의 잔기 ID를 읽는 것은 용이하지 않다. 그러므로 보다 나은 시각화 및 비교를 하기 위하여 표 9의 모든 데이터 뿐만 아니라 hPD-L1 결합 부위를 hPD-1의 결정 구조 상에 매핑하였다(도 10).
[표 8] 항체 결합에 대한 PD-1 점 돌연변이의 효과
Figure 112021075571923-pat00015
a 결합에 있어서 배수 변화는 여러 개의 침묵 알라닌 치환의 결합에 상대적이다.
[표 9] 잠재적인 에피토프의 동정
Figure 112021075571923-pat00016
컷오프 : 배수 변화 <0.55
*mPD-1 상에서 관찰된 C'' 가닥은 hPD-1 구조 상에서 존재하지 않는다. 이 β-시트는 hPD-1 상에서 구조가 없는 고리에 의해 대체되었다. 본 발명자들은 mPD-1과의 더 용이한 비교를 목적으로, 이 영역을 표지하기 위해 여전히 C''을 사용한다.
두 개의 조사된 항체 W3052_r16.88.9 및 키트루다는, 둘 다 hPD-1에 결합하고 hPD-L1을 차단하는 데에 있어서 기능적임에도 불구하고, 명백히 상이한 에피토프를 갖는다(도 10B, 10C). 키트루다의 에피토프에는 주로 C'D 고리(mPD-1 상의 C'' 가닥에 대응됨) 상의 잔기가 기여했는데, 이는 PD-L1 결합 부위와 전혀 교차하지 않았다. 이것은 키트루다의 hPD-L1 차단 기능이, 항체의 크기에 의해 제공되는 이의 입체 장해(steric hindrance) 효과에 더 의존한다는 사실을 시사하였다. 대조적으로, 에피토프 매핑 결과는 항체 W3052_r16.88.9의 에피토프가 다중의 위치를 가로질러 분포된 핫 스팟으로 구성되었고, hPD-L1 결합 부위와의 직접적인 겹침을 가진다는 사실을 나타낸다(도 10A, 10B). W3052_r16.88.9는 그들의 공통 결합 부위에 반응함에 있어서 hPD-L1과의 경쟁이라는 수단을 통해 hPD-L1을 차단한다. 더구나, W3052_r16.88.9는, 인간 및 뮤린 PD-1이 큰 구조적 편차를 나타내는 구조인(도 11), 잘 구부러지는 C'D 고리(또는 mPD-1 상의 C'' 가닥과 대응되는 곳)와 상호작용을 하지 않았다. 이의 결합 부위는 주로 FG 고리 상에 위치해있다(문헌 [(Lin et al. (2008) PNAS 105: 3011-3016]). 이 사실은 왜 W3052_r16.88.9가 양 PD-1 종들에 결합할 수 있는 반면 키트루다는 오직 인간의 것에만 결합할 수 있는지를 설명한다(도 9). 이 독특한 기능적 교차-반응성 때문에, W3052_r16.88.9의 임상 전 안전성 평가가 마우스 모델에서 수행될 수 있고, 이는 개발을 매우 단순화하고 가속화할 것이다. 종합적으로, 항체 W3052_r16.88.9는 키트루다보다 더 기능적이고 개발가능할 것으로 기대된다.
7. 세포-기반 분석에 의해 시험된 시험관내 항-PD-1 항체의 기능
7.1 림프구 혼합 배양 반응(MLR)이 T 림프구 기능에 대한 항-PD-1 항체의 효과를 시험하기 위해 사용됨
인간 DC, CD4+ T, CD8+ T 및 총 T 세포 분리: 피콜-파쿠 플러스(Ficoll-Paque PLUS)(GE) 기울기 원심분리를 이용하여 인간 PBMC를 건강한 공여체로부터 갓 분리하였다. 인간 단핵구 농축 키트(Human Monocyte Enrichment Kit)(스템쎌)를 이용하여 제조업자의 설명서에 따라 단핵구를 분리하였다. rhGM-CSF 및 rhIL-4를 함유하는 배지에 세포를 5 내지 7일 간 배양하여 수지상 세포를 생성하였다. MLR 전 18 내지 24시간에, 1 μg/mL LPS를 배양물에 첨가하여 DC의 성숙을 유도하였다. 인간 CD4+ T 세포 농축 키트(스템쎌)을 이용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 인간 CD4+ T 세포를 분리하였다. 마우스 CD4+ T 세포 농축 키트(스템쎌)을 이용하여 제조업자의 프로토콜을 따라 마우스 CD4+ T 세포를 Balb/c 마우스의 비장으로부터 수득하였다. rmGM-CSF 및 rmIL-4를 함유하는 배지에서 5 내지 7일 간 C57BL/6 마우스의 골수 세포로부터 마우스 DC를 유도하였다. MLR 전 18 내지 24시간에, 1 μg/mL LPS를 배양물에 첨가하여 DC의 성숙을 유도하였다.
요약하면, 최초의 수지상 세포(DC)-자극된 MLR을 10% FCS 및 1% 항생제를 함유하는 RPMI 1640 200 μL 중의 96-웰, U-하부 조직 배양 플레이트에서 수행하였다. 시험용 항체 또는 기준 항체의 존재 또는 부재하에서(166.75 nM에서 아래로 0.00667 nM까지, 일반적으로 총 6개의 농도를 형성함), DC를 1Х105 CD4+ T 세포와 1:10 및 1:200 사이의 DC:T 세포 비율로 혼합하였다. T 세포 기능 상의 항-PD-1 항체의 효과를 결정하기 위해 시토카인 생산 및 T 세포 증식을 결정하였다. 보여지는 결과는 수행된 5개의 실험의 최저치를 나타낸다.
시토카인 검출: 일치하는 항체 쌍(antibody pair)을 이용한 효소-결합 면역흡착체 분석(ELISA)으로 인간 IFN-γ 및 IL-2를 측정하였다. 플레이트를 IFN-γ(cat# Pierce-M700A) 및 IL-2(cat# R&D-MAB602)에 각각 특이적인 인간 포획 항체로 전-코팅(pre-coating)하였다. 비오틴-접합된 항-IFN-γ 항체(cat# Pierce-M701B) 또는 항-IL-2 항체(cat# R&D-BAF202)를 검출 항체로서 사용하였다.
도 12A는 항-PD-1 항체가 IL-2 분비를 용량-의존적 방식으로 증가시켰음을 나타냈다. 도 12B는 항-PD-1 항체가 IFN-γ 분비를 용량-의존적 방식으로 증가시켰음을 나타냈다.
증식 분석: 3H-티미딘(cat# PerkinElmer- NET027001MC)을 0.9% NaCl 용액 중에 1:20으로 희석시켰고, 0.5 uCi/웰로 세포 배양 플레이트에 첨가하였다. 증식하는 세포로의 3H-티미딘의 혼입(incorporaiton)이 결정되기 전에, 플레이트를 5% CO2 중의 37℃에서 16 내지 18시간 동안 배양하였다. 도 12C는 항-PD-1 항체가 CD4+ T 세포 증식을 용량-의존적 방식으로 증가시킴을 나타냈다.
항-PD-1 항체의 마우스 T 세포 기능에 대한 효과를 결정하기 위해, 시토카인 생산 및 마우스 T 세포 증식을 유사하게 결정하였다. 도 13A 내지 13C는 항-PD-1 항체가 마우스 CD4+ T 세포의 기능을 강화시킬 수 있음을 입증하는 마우스 동종-MLR의 결과를 나타냈다. 도 13A는 항-PD-1 항체가 IL-2 분비를 용량-의존적 방식으로 증가시켰음을 나타냈다. 도 13B는 항-PD-1 항체가 IFN-γ 분비를 용량-의존적 방식으로 증가시켰음을 나타냈다. 도 13C는 항-PD-1 항체가 CD4+ T 세포의 기능을 용량-의존적 방식으로 증가시킴을 나타냈다.
7.2 자가 항원 특이적 면역 반응에 의한 인간 항-PD-1 항체의 세포 증식 및 시토카인 생산에 대한 효과
본 분석에서는, CD4+ T 세포 및 DC를 동일한 공여체에게서 받았다. 요약하면, CD4+ T 세포를 PBMC로부터 정제하였고 CMV pp65 펩티드 및 저용량의 IL-2 (20 U/mL)의 존재 하에서 배양하였고, 동시에, 동일한 공여체의 PBMC로부터의 단핵구를 GM-CSF 및 IL-14 중에 배양함으로써 DC를 생성하였다. 5일 후, 인간 항-PD-1 항체 또는 기준 항체(대조군으로서)의 부재 또는 존재 하에서 CMV pp65 펩티드 처리된 CD4+ T 세포를 CMV pp65 펩티드로 펄스화된(pulsed) DC와 함께 공-배양하였다. 5일째에, 상기에 기재한 바와 같이 ELISA로 IFN-γ를 측정하기 위해 100 μL 의 상층액을 각각의 배양물로부터 취했다. CMV pp65-특이적 T 세포의 증식을 상기에 기재된 바와 같이 3H-티미딘 혼입으로 평가하였다.
도 14A 및 14B는 항-PD-1 항체가 인간 CD4+ T 세포의 기능을 강화시킬 수 있음을 입증하는 인간 자가-MLR의 결과를 나타냈다. 도 14A는 항-PD-1 항체가 IFN-γ 분비를 용량-의존적 방식으로 증가시켰음을 나타냈다. 도 14B는 항-PD-1 항체가 CD4+ T 세포 증식을 용량-의존적 방식으로 증가시킴을 나타냈다.
7.3 조절 T 세포(Treg) 억제적 기능에 대한 인간 항-PD-1 항체의 효과
T 세포의 부분모집단인 Treg는 중요한 면역 조절자이고 자가-관용을 유지하는 데에 있어서 중대한 역할을 한다. CD4+CD25+ Treg의 증가된 수는 다수의 암에 걸린 환자들 및 더 불량한 예후와 연관된 환자들에서 발견되었다. 항-PD-1 항체가 Treg의 면역 억제적 역할에 영향을 미치는지 여부를 결정하기 위해, 본 발명자들은 Treg의 존재하에서, 항-PD-1 항체 처리와 함께 또는 처리 없이 T 세포 기능을 비교하였다. CD4+CD25+ 및 CD4+CD25-T 세포들을 특이적 항-CD25 마이크로비즈(스템쎌)을 이용하여 제조업자의 설명서를 따라 분리하였다. 2천 개의 성숙 DC, 1X105 개의 CD4+CD25- T 세포, 1Х105 개 Treg 세포 및 PD-1 항체를 96-웰 플레이트에서 인큐베이션시켰다. 5일 동안 플레이트를 5% CO2 의 인큐베이터 속에서 37℃로 유지시켰다. IFN-γ 생산 및 CD4+CD25- 세포 증식을 상기에 기재된 바와 같이 시험하였다.
도 15는 항-PD-1 항체가 Treg의 억제적 기능을 역전시킬 수 있음을 입증한다. 도 15A는 항-PD-1 항체가 IFN-γ 분비를 회복시킬 수 있음을 나타냈다. 도 15B는 항-PD-1 항체가 T-세포 증식을 회복시킬 수 있음을 나타냈다.
8. ADCC 및 CDC 시험
PD-1은 다양한 세포 유형 상에서 발현된다. 건강한 PD-1 양성 세포에 대한 잠재적인 독성을 최소화하기 위해, 항-PD-1 항체를 그들의 항체-의존 세포매개 세포독성(ADCC) 및 보체-의존성 세포독성(CDC)를 조정하는 능력에 대해 평가하였다.
8.1 ADCC 시험
인간 활성화된 CD4+ T 세포 및 다양한 농도의 PD-1 항체를 96-웰 플레이트에서 30분 동안 전-인큐베이션시켰고, 이후에, PBMC를 50:1의 효과기/표적 비율로 첨가하였다. 6시간 동안 플레이트를 5% CO2 의 인큐베이터 속에서 37℃로 유지시켰다. 표적 세포 용해(cell lysis)를 LDH-기반 세포독성 검출 키트(cat# Roche-11644793001)로 결정하였다. 492 nm에서의 흡광도를 마이크로플레이트 리더기(몰레큘라 디바이스)를 이용하여 확인하였다. 허셉틴-유도된 SK-Br-3 세포 용해를 양성 대조군으로서 사용하였다.
도 16은 항-PD-1 항체가 CD4+ T 세포를 활성화시키는 데에 있어서 ADCC 활성을 조정하지 않았다는 것을 입증하는 ADCC 시험의 결과를 나타냈다.
8.2 CDC 시험
인간 활성화된 CD4+ T 세포 및 다양한 농도의 PD-1 항체를 96-웰 플레이트에 혼합하였다. 인간 보체(complement)(Quidel-A112)를 1:50의 희석 농도로 첨가하였다. 2시간 동안 플레이트를 5% CO2 의 인큐베이터 속에서 37℃로 유지시켰다. 표적 세포 용해를 쎌티터-글로(CellTiter-Glo)로 결정하였다. 리툭산®-유도된 라지(Raji) 세포 용해를 양성 대조군으로서 사용하였다. 발광을 마이크로플레이트 리더기(몰레큘라 디바이스)를 이용하여 확인하였다.
도 17은 항-PD-1 항체가 CD4+ T 세포를 활성화시키는 데에 있어서 CDC 활성을 조정하지 않았다는 것을 입증하는 CDC 시험의 결과를 나타냈다.
실시예 5 : PD-1에 대한 인간 단일클론성 항체를 이용한 생체 내 종양 모델의 치료
1. 실험 설계
[표 10] 항체 2E5의 생체 내 동물 효능 실험의 분류(grouping) 및 투여(dosing) 섭생
Figure 112021075571923-pat00017
주석:
1N : 각각의 그룹 내의 마우스 수
2용량-부피: 마우스 체중에 따라 10 μL/g. 체중 감소가 15%를 초과하는 경우, 투여 섭생은 그에 맞춰 조정되어야 한다.
2. 방법
2.1 세포 배양
뮤린 흑색종 세포 클라우드만S92 세포(ATCC-CCL-53.1)를 시험관 내에서 단일층으로서 배양하였고, 배양 조건은 F-12K 배지에 2.5% FBS 및 15% 말 혈청, 100 U/mL 페니실린, 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 더하였으며, 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션시켰다. 세포를 트립신-EDTA를 이용하여 소화하였고 주 당 2회 일정하게 계대배양하였다. 세포를 수확하여 계수하고, 이후에, 대략 80%-90% 융합성(confluent) 및 수가 요구된 바와 같을 때 접종하였다.
2.2 종양 세포의 주사
0.1 mL（5Х105 개 세포）클라우드만S91 세포를 각각의 동물의 오른쪽 엉덩이에 피하 접종하였다. 종양 부피의 평균이 대략 64 mm3에 도달했을 때, 각각의 그룹에서 투여를 시작하였다. 분류 및 투여 섭생을 표 10에 나타내었다.
2.3 종양 시험 및 색인(index)
실험 색인은 종양 성장이 억제되었는지, 지연되었는지, 또는 치료되었는지를 조사하기 위한 것이다. 종양 지름을 캘리퍼(caliper)로 한 주에 3회 측정하였다. 종양 부피를 V=0.5aХb 2를 이용하여 계산하였다(여기서 a 및 b는 각각 종양의 긴 지름 및 짧은 지름을 나타낸다).
항체의 항종양 효능을 종양 성장 억제 TGI(%) 또는 상대적 종양 증식 비율 T/C(%)로 평가하였다. TGI(%)는 종양 성장 억제의 비율을 반영했다. TGI(%)를 다음과 같이 계산하였다: TGI (%) = [(1- (치료 그룹에서 투여의 종료 시 평균 종양 부피 - 치료 그룹에서 투여의 시작 시 평균 종양 부피)) / (용매 대조군 그룹에서 투여의 종료 시 평균 종양 부피 - 용매 대조군 그룹에서 투여의 시작 시 평균 종양의 부피)] X 100%.
상대적 종양 증식 비율 T/C(%)를 다음과 같이 계산하였다: T/C% = TRTV / CRTV X 100%(TRTV: 치료 그룹 RTV; CRTV: 음성 대조군 그룹 RTV). 상대적 종양 부피(RTV)를 RTV=Vt/V0 를 이용하여 종양 측정의 결과에 따라 계산하였다(여기서, V0 은 분류 시점(즉, d0)에서의 평균 종양 부피이고, Vt는 어떤 측정의 평균 종양 부피였다; TRTV 및 CRTV의 데이터는 동일한 날에 취했다).
T-C(일(day))는 종양 성장 지연 색인을 반영했고, T는 치료 그룹에서 종양이 미리결정된 부피에 도달했을 때(예를 들면, 300 mm3)의, 지나간 평균 일을 나타냈다고, C는 대조군 그룹에서 종양이 동일한 부피에 도달했을 때의 평균 일을 나타냈다.
생존 곡선을 플로팅하였다: 동물 생존 곡선을 투여에서부터 동물이 사망하기까지의 시간 또는 종양 부피가 2000 mm3에 도달하기까지의 시간으로서 정의하였다. 생존 시간(일) 중앙값을 각각의 그룹에서 계산하였다. 증가된 수명(Increased life span)(ILS)를 처리 그룹과 모델 대조군 그룹 사이의 생존 시간 중앙값을 비교함으로써 계산하였으며 모델 대조군 그룹의 생애 전반에 걸쳐 백분율로 나타내었다.
2.4 통계학적 분석
각각의 그룹에서 각각의 시간 지점에서의 평균 종양 부피 및 표준 오차(SEM)를 포함하는 데이터를 통계학적으로 분석하였다(구체적인 데이터의 경우 표 11을 참조). 실험은 투여 후 37일 째에 완료되었다; 투여 후 13일 째에, 동물을 연속적으로 희생하기 시작하였고; 그러므로 통계학적 분석 및 그룹 사이의 차이점에 대한 평가는 투여 개시 후 13일 째의 종양 부피에 기반하였다. 두 그룹 사이의 비교를 위해, 데이터를 T-검정을 이용하여 분석하였다; 세 개 이상의 그룹 사이의 비교를 위해, 데이터를 일원분산분석(one-way ANOVA)을 이용하여 분석하였다. 통계학적으로 유의적인 차이가 F 값에 대해 발견된 경우, 데이터를 게임스-호웰 검정(Games-Howell test)를 이용하여 분석하였다. 통계학적으로 유의적인 차이가 F 값에 대해 발견되지 않은 경우, 이후에, 분석을 위해 듀넷(Dunnet)(양 측(2-sided)) 검정을 사용하였다. SPSS 17.0을 모든 데이터 분석에 사용하였다. p<0.05를 유의적인 차이로서 고려하였다. 생존 시간을 로그-순위 검정과 함께 카플란-메이어 방법을 이용하여 분석하였다.
3. 결과
3.1 사망률, 이환율(morbidity), 및 체중 변화
동물의 체중은 약물 독성의 측정을 위한 간접적인 참조가 된다. 클라우드만S91 피하 동계의 이종이식 암컷 DBA/2 마우스 모델의 체중에 대한 2E5의 효과를 도 18 및 도 19에 나타내었다. 이 모델에서, 모든 투여 그룹은 현저한 체중 감소를 나타내지 않았다(도 18). 그러므로, 2E5는 흑색종 클라우드만S91의 마우스 모델에서 명백한 독성을 가지지 않았다.
3.2 종양 부피
2E5 치료 후 클라우드만S91 피하 동계의 이종이식 암컷 DBA/2 마우스 모델에서의 종양 부피를 표 11에 나타내었다.
[표 11] 각각의 그룹에서 다른 시간에서의 종양 부피
Figure 112021075571923-pat00018
주석:
a. 평균 ± SEM;
b. 투여 후 일.
3.3 종양 성장 곡선
종양 성장 곡선을 도 20에 나타내었다.
3.4 항종양 효능 평가
[표 12] 클라우드만S91 동계의 종양 모델에서의 2E5의 항종양 효능 평가(투여 개시 후 13일 째의 종양 부피에 기반함)
Figure 112021075571923-pat00019
주석:
a. 평균 ± SEM;
b. 종양 성장 억제는 T/C 및 TGI로 계산되었음(TGI (%) = [1-(T13-T0)/ (V13-V0)]Х100);
c. p 값은 종양 부피로 계산하였음.
3.5 생존 곡선
각각의 그룹에서의 생존 곡선을 도 21에 나타내었다.
3.6 생존 시간
[표 13] 클라우드만S91 동계의 종양 모델의 생존에 대한 2E5의 효과
Figure 112021075571923-pat00020
주석:
a. p-값은 처리 그룹과 비히클 대조군 그룹 사이의 비교를 나타냄;
b. 실험의 종료 시, 3 mg/kg 그룹(2E5)에서, 생존 비율은 66.7%였음.
4. 토의
본 연구에서, 본 발명자들은 클라우드만S91 동계의 종양 모델에서 2E5의 생체 내 효능을 평가하였다. 각각의 그룹에서 상이한 시간 지점에서의 종양 부피를 표 11, 표 12 및 도 20에 나타내었고, 생존 곡선을 도 21 및 표 13에 나타내었다. 투여 후 13일 째에, 용매 대조군 그룹에서 종양을 지닌 마우스의 종양 부피는 1,626 mm3에 도달했다. 1 mg/kg 2E5 그룹에서는 대조군 그룹과 비교하여 약한 억제 효과가 관찰되었으며, 종양 부피는 1,089 mm3 이었고(T/C=68.1%, TGI=34.4%, p=0.367), 종양 성장 지연은 0일이었다. 유의한 항-종양 효과는 3 mg/kg 2E5 그룹에서 용매 대조군 그룹과 비교하여 관찰되었으며, 종양 부피는 361 mm3 (T/C=22.9%, TGI=81.0%, p=0.008)이었고, 종양 성장 지연은 5일이었다. 유의한 항-종양 효과는 또한 10 mg/kg 2E5 그룹에서 용매 대조군 그룹과 비교하여 관찰되었으며, 종양 부피는 614 mm3 (T/C=39.4%, TGI=64.7%, p=0.036)이었고, 종양 성장 지연은 5일이었다.
실험에서, 용매 대조군 그룹에서의 종양을 지닌 마우스의 생존 시간 중간값은 16일이었다. 비히클 대조군 그룹과 비교하여, 1 mg/kg 2E5 그룹에서의 종양을 지닌 마우스의 생존 시간 중간값은 20일이었고, 생존은 25%(p=0.077) 지속되었으며; 3 mg/kg 2E5 그룹에서의 종양을 지닌 마우스의 생존 비율은 66.7%(p=0.001)이었다. 10 mg/kg 2E5 그룹에서의 종양을 지닌 마우스의 생존 시간 중간값은 32일이었고, 생존은 100% 지속되었다(p=0.022).
누드 마우스의 체중의 변화를 도 19에 나타내었다. 약물 2E5의 양호한 관용성(tolerability)이 모든 종양을 지닌 마우스에서 발견되었고, 유의한 체중 감소는 모든 처리 그룹에서 관찰되지 않았다. 요약하면, 이 실험에서, 클라우드만S91 피하 동계의 종양 모델에 대하여 유의한 항-종양 효과가 3 mg/kg 그룹 및 10 mg/kg 그룹 둘 다에서 나타났으며, 이는 용량-의존적이지 않다. 3 mg/kg 그룹에서의 항-종양 효과는 10 mg/kg 그룹에서의 것보다 우수하다.
본 발명의 상세한 설명은 상기한 실시예들에 의해 작성되었다. 그러나, 당업자는 본 발명이 실시예에 한정되지 않는다는 사실을 이해한다. 본 발명은 이의 사상과 본질적인 특징에서 벗어나지 않고 다른 구체적인 형태로 구현될 수 있다. 본 발명의 범위는 그러므로 앞서의 상세한 설명에 의해서라기보다 첨부된 청구범위들에 의해 나타내지며, 청구범위들의 등가물의 의미와 범위 내에 있는 모든 변화들이 본원에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> CSTONE PHARMACEUTICALS CSTONE PHARMACEUTICALS (SUZHOU) CO., LTD. CSTONE PHARMACEUTICALS (SHANGHAI) CO., LTD. <120> THE NOVEL MONOCLONAL ANTIBODIES TO PROGRAMMED DEATH 1 (PD-1) <130> IPA190388-CN-D1 <160> 24 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Tyr Leu 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Met Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ile Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Tyr Ile Ser Trp Val Arg 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Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro 195 200 205 Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly 210 215 220 Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro 225 230 235 240 Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly 245 250 255 Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg 260 265 270 Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu 275 280 285

Claims (34)

  1. 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 숙주 세포로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 다음 특징 중 하나 이상을 포함하는, 단리된 숙주 세포:
    a. 서열번호 24의 35번, 64번, 82번, 83번, 128번, 129번, 130번, 131번 및 132번 아미노산을 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합함;
    b. 서열번호 1 및 2로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역 및 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역을 포함하고, PD-1에 특이적으로 결합함; 및
    c. CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역 CDR1 서열이 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열이 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열번호 12 및 13으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1 서열이 서열번호 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR2 서열이 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열번호 20, 21, 22 및 23으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, PD-1에 특이적으로 결합함.
  2. 제1항에 있어서, 숙주 세포가 포유동물 세포인, 단리된 숙주 세포.
  3. 제2항에 있어서, 포유동물 세포가 원숭이 신장 세포, 인간 배아 신장 세포, 햄스터 신장 세포, 개 신장 세포, 중국 햄스터 난소(CHO)　세포, 마우스 세포, 및 인간 폐 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 단리된 숙주 세포.
  4. 제3항에 있어서, 세포가 중국 햄스터 난소 (CHO)　세포인, 단리된 숙주 세포.
  5. 제3항에 있어서, 세포가 인간 배아 신장 293F 세포인, 단리된 숙주 세포.
  6. 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법으로서, 상기 방법이:
    a. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계;
    b. 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    c. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리하는 단계를 포함하고,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 다음 특징 중 하나 이상을 포함하는, 방법:
    i) 서열번호 24의 35번, 64번, 82번, 83번, 128번, 129번, 130번, 131번 및 132번 아미노산을 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합함;
    ⅱ) 서열번호 1 및 2로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역 및 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역을 포함하고, PD-1에 특이적으로 결합함; 및
    ⅲ) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역 CDR1 서열이 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열이 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열번호 12 및 13으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1 서열이 서열번호 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR2 서열이 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열번호 20, 21, 22 및 23으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, PD-1에 특이적으로 결합함.
  7. 제6항에 있어서, 도입 단계가 발현 벡터의 숙주 세포로의 형질감염을 포함하는, 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 단리 단계가 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 정제를 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 정제 단계가 크로마토그래피를 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 정제 단계가 친화성 크로마토그래피를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 친화성 크로마토그래피가 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 포함하는, 방법.
  12. 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 다음 특징 중 하나 이상을 포함하는, 발현 벡터:
    i) 서열번호 24의 35번, 64번, 82번, 83번, 128번, 129번, 130번, 131번 및 132번 아미노산을 포함하는 PD-1의 에피토프에 결합함;
    ⅱ) 서열번호 1 및 2로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역 및 서열번호 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역을 포함하고, PD-1에 특이적으로 결합함; 및
    ⅲ) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하되, 상기 중쇄 가변 영역 CDR1 서열이 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역 CDR2 서열이 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 중쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열번호 12 및 13으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR1 서열이 서열번호 14, 15, 16, 17 및 18로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR2 서열이 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열번호 20, 21, 22 및 23으로 구성된 군으로부터 선택된 서열을 포함하고, PD-1에 특이적으로 결합함.
  13. 제12항에 있어서, 핵산 분자가 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 발현 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 프로모터가 바이러스 프로모터를 포함하는, 발현 벡터.
  15. 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 CMV 프로모터를 포함하는, 발현 벡터.
  16. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 플라스미드, 및 동물 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는, 발현 벡터.
  17. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 세포로의 진입을 돕는 물질을 추가로 포함하는, 발현 벡터.
  18. 삭제
  19. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포.
  20. 제19항에 있어서, 세포가 일차 세포인, 단리된 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서, 일차 세포가 면역 세포인, 단리된 숙주 세포.
  22. 제21항에 있어서, 세포가 CHO 세포인, 단리된 숙주 세포.
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