[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

KR102499191B1 - Cd20 면역요법을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Cd20 면역요법을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102499191B1
KR102499191B1 KR1020227005550A KR20227005550A KR102499191B1 KR 102499191 B1 KR102499191 B1 KR 102499191B1 KR 1020227005550 A KR1020227005550 A KR 1020227005550A KR 20227005550 A KR20227005550 A KR 20227005550A KR 102499191 B1 KR102499191 B1 KR 102499191B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
lymphoma
seq
car
Prior art date
Application number
KR1020227005550A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220030307A (ko
Inventor
올리버 프레스
브라이언 틸
Original Assignee
프레드 허친슨 캔서 센터
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 프레드 허친슨 캔서 센터 filed Critical 프레드 허친슨 캔서 센터
Publication of KR20220030307A publication Critical patent/KR20220030307A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102499191B1 publication Critical patent/KR102499191B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001124—CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A61K39/4611—
    • A61K39/4631—
    • A61K39/464424—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 조성물 및 그의 용도를 제공한다. 본 개시의 치료는 임의로 CD20-특이적 결합 분자, 화학요법제, 면역억제 성분의 억제제 또는 이들의 조합물과 결합하여, 항-CD20 CAR과 같은 융합 단백질을 발현하는 숙주 세포를 사용하는 것을 포함한다.

Description

CD20 면역요법을 위한 조성물 및 방법 {COMPOSITIONS AND METHODS FOR CD20 IMMUNOTHERAPY}
정부의 이해관계 진술
본 발명은 국립 보건원 (National Institutes of Health)이 수여한 CA154874에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가지고 있다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록은 종이 복사본 대신 텍스트 형식으로 제공되며 본 명세서에서 참조로 포함되어 있다. 서열 목록이 포함된 텍스트 파일의 이름은 360056_441WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 210KB이며, 2017년 3월 16일에 작성되었고, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되었다.
유전적으로 변형된 T 세포의 입양 전달이 다양한 악성종양에 대한 강력한 치료법으로 떠올랐다. 가장 널리 사용되고 있는 전략은 종양 관련 항원을 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 환자 유래 T 세포의 주입이다. 이 접근법은 T 세포를 임의의 세포 표면 항원에 표적화하는 능력을 갖고, 종양 도피 기전으로서 주요 조직적합성 복합체의 손실을 도피하며, 인간 백혈구 항원 반수체형에 상관없이 임의의 환자를 치료하기 위해 단일 벡터 작제물을 이용하는 등의 많은 이론적 이점을 갖는다. 예를 들어, B 세포 비호지킨 림프종 (NHL)에 대한 CAR 임상 시험은 현재까지 악성 림프 세포뿐만 아니라 정상 B 세포에서 발현되는 CD19, CD20 또는 CD22 항원을 표적으로 하고 있다 (Brentjens et al., Sci Transl Med 2013;5(177):177ra38; Haso et al.,Blood 2013;121(7):1165-74; James et al., J Immunol 2008;180(10):7028-38; Kalos et al., Sci Transl Med 2011;3(95):95ra73; Kochenderfer et al., J Clin Oncol 2015;33(6):540-9; Lee et al., Lancet 2015;385(9967):517-28; Porter et al., Sci Transl Med 2015;7(303):303ra139; Savoldo et al., J Clin Invest 2011;121(5):1822-6; Till et al., Blood 2008;112(6):2261-71; Till et al., Blood 2012;119(17):3940-50; Coiffier et al., N Engl J Med 2002;346(4):235-42). 림프성 악성 종양에 대한 치료법을 연구하는 대부분의 연구자들은 이 분자가 CD20 또는 CD22보다 B 세포 분화의 초기 단계에서 발현되기 때문에 CD19를 표적화하도록 선택했다. 따라서 CD19를 표적으로 하는 CAR T 세포는 분화의 프로- 또는 예비-B 세포 단계에서 발생하는 급성 림프구성 백혈병을 포함하여 약간 더 넓은 범위의 B 세포 악성 종양을 치료하는데 사용될 수 있다.
그러나, CD20은 CD20을 표적으로 하는 단일클론 항체인 리툭시맙을 이용한 임상 시험에서 입증된 바와 같이, 성공적인 면역요법 표적이라는 광범위한 임상 기록이 있어 매력적인 항원으로 남아있다 (Coiffier et al., N Engl J Med 2002;346(4):235-42; Lenz et al., J Clin Oncol 2005;23(9):1984-92; Marcus R, et al., J Clin Oncol 2008;26(28):4579-86; Pfreundschuh et al., Lancet Oncol 2011;12(11):1013-22). 항체 결합시 쉽게 내재화되는 CD19와 달리 (Pulczynski et al., Blood 1993;81(6):1549-57), CD20은 항체 결합 후에 엔도사이토시스를 훨씬 더 천천히 겪는다 (Press et al., Blood 1994;83(5):1390-7; Pulczynski et al., Leuk Res 1994;18(7):541-52). 이러한 안정성은 이론적으로 면역 시냅스의 품질 및 후속 CAR 트리거링 및 T 세포 활성화에 영향을 줄 수 있다. 종양 세포에서 CD19 발현의 상실은 CD19-표적화 T 세포로 치료된 환자에서 도피 기전으로 기술되어 있다 (Grupp et al., N Engl J Med 2013;368(16):1509-18). 항-CD20 항체 요법 후 CD20의 상실이 또한 기술되었지만, CD20-특이적 CAR T 세포는 순차 요법을 허용할 수 있거나, 다중 항원을 동시에 표적화하도록 CD19 CAR T 세포와 연합 사용되어 항원 상실에 의한 면역 도피의 위험을 감소시킬 수 있는 대안적인 표적을 제공한다.
CAR에 대한 표적 항원으로서의 CD20의 한가지 잠재적인 제한은 CAR T 세포 치료 시험의 후보가 될 가능성이 있는 재발성 또는 불응성 림프종을 가진 환자가 최근에 리툭시맙 함유 처방으로 치료된 경우가 종종 있다는 것이다. 항체가 수개월 동안 혈청에서 지속될 수 있기 때문에, 잔류 리툭시맙은 이론적으로 CD20에 대한 CAR의 결합을 차단하고 T 세포 활성화를 예방하거나 약화시켜 잠재적으로 치료 효과를 떨어뜨릴 수 있다. 이전의 CD20 CAR T 세포 시험 (Till et al., Blood 112:2261-71, 2008; Till et al., Blood 119:3940-50, 2012)에서, 자격 기준은 최근 리툭시맙으로 치료받은 환자를 제외시켰다. 그러나 이 접근법은 발생률에 상당한 영향을 주며 궁극적으로 새로운 치료 옵션이 매우 필요한 환자에게 이 치료법의 유용성을 제한할 수 있다.
현재, 면역요법 분야에는 암 (예를 들어, 백혈병, 림프종)을 비롯한 다양한 질환에 대한 추가 또는 대안적인 면역요법을 위한 조성물 및 방법에 대한 요구가 여전히 남아있다. 이제 개시되는 구체예들은 이러한 요구를 다루고 다른 관련 이점들을 제공한다.
도 1A 및 1B는 상이한 항-CD20 항체 (Leu16, 1F5 및 1.5.3)로부터의 scFv를 함유하는 CD20-특이적 CAR 작제물의 개략도를 나타낸다. (A)는 CD20-특이적 CAR 작제물과 그의 각각의 성숙한 CAR 단백질을 보여준다. (B)는 추가적인 성숙 CD20-특이적 CAR 단백질을 보여준다.
도 2A 내지 2F는 CAR scFv를 생성하는데 사용된 항체의 리툭시맙 및 오파투무맙 차단 항원 결합을 나타낸다. Ramos 세포 (CD20+)를 지시된 리툭시맙 (A-C) 또는 오파투무맙 (D-F) 농도로 30분 동안 인큐베이션한 후 PE-표지 항-CD20 항체 (클론 Leu16) 또는 동형 대조군과 4 ℃ (A 및 D) 또는 37 ℃ (B 및 E)에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고 유세포 계측법으로 분석하여 PE 형광 강도로 측정된 가용 CD20 결합 부위를 결정하였다. 도 2C 및 도 2F에 도시된 그래프는 각각 리툭시맙 또는 오파투무맙 농도의 함수로서 4 ℃ 또는 37 ℃에서의 기하 평균 형광 강도 (MFI)를 요약한 것이다. 데이터는 세 번의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 3A 및 3B는 시험관 내에서 CAR T 세포 기능에 대한 리툭시맙의 효과를 나타낸다. 지시된 B-세포 NHL 세포주를 조사하고 다양한 리툭시맙 농도 (T 세포를 첨가한 후 지시된 최종 농도를 산출하기 위한 인큐베이션 중 농도의 2 배)로 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. Leu16-28-BB-z-tEGFR CD20-특이적 CAR을 발현하는 CFSE로 염색된 T 세포를 표적 세포에 1:1 부피 및 비율로 첨가하였다. (A) T 세포의 증식을 4일 후 CFSE 희석에 대해 유세포 계측법으로 분석하였다. 비자극 T 세포에 대한 분열된 CD3+ T 세포의 비율이 좌축 (채워진 막대)에 표시되어 있다. 전방 산란의 기하 평균 (배지 단독에서의 세포 크기를 제한 값)에 의해 결정된 CD3+ T 세포의 세포 크기는 우축 (빈 막대)에 표시되어 있다. (B) 이들 T 세포의 사이토카인 분비를 재자극 후 24시간으로부터의 상등액을 사용하여 Luminex 분석법으로 측정하였다. 인터류킨 (IL)-2 농도는 왼쪽 y-축에, 인터페론 (IFN)-γ 및 종양 괴사 인자 (TNF)-α는 오른쪽 y-축에 표시되어 있다. 표시된 데이터는 세 번의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 4는 CAR T 세포-매개 세포독성에 대한 리툭시맙의 효과를 나타낸다. 지시된 51Cr-표지 표적 세포를 30분 동안 리툭시맙 (T 세포를 첨가한 후 지시된 최종 농도를 산출하기 위한 인큐베이션 중 농도의 2 배)로 예비배양한 다음, Leu16-28-z CAR을 발현하는 CD8+ T 세포를 표준 5시간 51크로뮴 방출 분석에 나타낸 E:T 비율로 첨가하였다. 모의 형질도입된 T 세포와 리툭시맙 및 표적 세포만을 갖는 샘플 ("0:1")을 음성 대조군으로 사용하였다. 중복 웰의 평균값이 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 표시된다. 데이터는 네 번의 독립적인 실험 결과를 나타낸다.
도 5A 내지 5C는 리툭시맙 봉쇄에 대한 민감성이 표적 세포상의 CD20 항원 밀도에 의존적임을 보여준다. CD80 및 CD20으로 형질도입된 K562 세포 ("K80-20")를 CD20 발현의 고수준, 중수준 또는 저수준에 대해 선택된 제한 희석법으로 클로닝하고 (도 10), 도 3에 기술된 바와 같은 CFSE-표지된 Leu16-28-z CAR로 형질도입된 T 세포를 사용하여 증식 및 세포 크기 (게이팅 CD3+ 세포의 기하 평균 전방 산란 - 매질 단독에서의 세포 크기) (도 5A); Luminex 검사법 (Luminex assay)으로 측정된, 상기 (도 5A)로부터 24시간에서의 Leu16-28-z CAR로 형질도입된 T 세포의 사이토카인 분비 (도 5B); 및 도 4에 기재된 51Cr-방출 분석에 의한 Leu16-28-z CAR로 형질도입된 CD8+ T 세포를 사용한 세포독성 (도 5C)에 대한 분석의 표적 세포로 사용하였다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험을 나타낸다. 사이토카인 분비의 절대값을 도 11에 나타내었다.
도 6A 및 6B는 항-CD20 CAR을 발현하는 T 세포에 의한 증식 및 사이토카인 분비를 나타낸다. 건강한 공여 T 세포를 항-CD3/28 비드를 사용하여 분류·자극한 다음, 1F5-28-BB-z CAR 작제물을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시켰다. (A) 자극 후 9 일째에, CAR T 세포를 CFSE로 표지하고, 조사된 K562-CD80-CD20 ("K80-20") 또는 K562-CD80 ("K80") 표적 세포로 재자극시킨 다음, CFSE 희석을 4일 후 유세포 계측법으로 측정하여 T 세포 증식을 측정하였다. 비자극 T 세포에 대한 분열된 CD3+ T 세포의 백분율이 표시된다. 모의-형질도입된 T 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. (B) 재자극 후 24시간에 상기 배양물로부터 상등액 샘플을 수확하고 Luminex 검사법에 의해 지시된 사이토카인 농도를 분석하여 T 세포에 의한 사이토카인 분비를 결정하였다.
도 7A 내지 7E는 CD20 CAR T 세포 기능에 대한 리툭시맙의 생체 내 효과를 나타낸다. Nod-SCID-γ-/- (NSG) 마우스에 5 × 105개의 리툭시맙-불응성 Raji-ffLuc 림프종 세포를 정맥 주사 (i.v.)하고 다음 치료법 중 하나를 적용하였다: 비치료, 5일 후 복강 내 (i.p.)로 리툭시맙 단독 (25 μg 또는 200 μg), 종양 6일 후 107 1.5.3-NQ-28-BBz CAR T 세포 단독, 또는 5일에 i.p.로 리툭시맙 단독 (25 μg 또는 200 μg)에 이어 종양 후 6일에 107개의 CAR T 세포. 마우스를 생체발광을 위해 주 2회 이미징화하였다. (A) 마우스 실험 스키마. (B) 전신 생체발광에 의해 측정된 시간에 따른 그룹당 평균 종양 부담. 95% 신뢰 구간으로 기하 평균 발광값을 나타내었고, 종양 체적 그래프의 오도된 변동을 방지하기 위해, 각 마우스의 최종 생체발광 수준은 죽은 후 이 그룹에서 마우스가 남아 있지 않을 때까지 이월되었다. 개별 생체발광 추이를 도 13에 나타내었다. (C) 각 처리 그룹의 전체 생존을 보여주는 카플란-마이어 플롯. (D) T 세포 주입일 (6일) 및 T 세포 주입 1 주 후 (13일)의 혈청 리툭시맙 농도. 수평 막대는 중간값을 나타낸다. (E) 4 전월 내에 리툭시맙 함유 구제 화학요법을 받은 림프종 환자로부터의 혈청 리툭시맙 수치. 회색 수평 막대선은 중앙값을 나타내고 검은색 수평 막대선은 사분위 범위 (25-75%)를 나타낸다.
도 8A 내지 8C는 시험관 내에서 CD20 CAR T 세포 기능에 대한 오파투무맙의 효과를 나타낸다. 조사된 Rec-1 또는 Raji-ffLuc 세포 또는 비조사된 51Cr-표지된 Rec-1 세포를 2×지시된 농도의 오파투무맙과 함께 30분 동안 예비인큐베이션한 다음, 도 3 및 도 4의 범례에 기술된 방법론을 사용하여 1.5.3-NQ-28-BB-z CAR을 발현하는 T 세포의 기능을 결정하기 위한 실험을 행하였다. (A) 비자극 T 세포에 대한 분열된 CD3+ T 세포의 백분율이 좌축 (채워진 막대)에 표시되어 있다. 전방 산란의 기하 평균 (배지 단독에서의 세포 크기를 제한 값)에 의해 결정된 CD3+ T 세포의 세포 크기는 우축 (빈 막대)에 표시되어 있다. (B) 이들 T 세포의 사이토카인 분비를 재자극 후 24시간으로부터의 상등액을 사용하여 Luminex 분석법으로 측정하였다. IL-2 농도는 왼쪽 y-축에, IFN-γ는 오른쪽 y-축에 나타내었다. (C) Rec-1 표적 세포와 표준 4시간 51Cr-방출 분석을 사용하여 1.5.3-NQ-28-BB-z CAR T 세포의 세포독성을 결정하였다. 중복 웰의 평균값이 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 표시된다.
도 9는 유세포 계측법에 의해 측정된 K80-20low, K80-20med, K80-20high의 CD20 발현을 나타낸다. 빈 히스토그램은 FITC-접합 1F5 항체 (항-CD20)로 염색된 세포를 나타내고, 채워진 히스토그램은 동형 대조 항체 Ab로 염색된 세포를 나타낸다.
도 10은 도 5의 실험에서 T 세포 상등액으로부터의 절대 사이토카인 농도를 보여준다.
도 11A 내지 11E는 완전 인간 항-CD20 scFv를 갖는 CAR T 세포의 증식, 사이토카인 분비 및 세포독성을 나타낸다. 건강한 기증자 CD14-CD45RA-CD62L+ 중추 기억 T 세포를 항-CD3/28 비드를 사용하여 자극시킨 다음, 1.5.3-NQ-28-z 또는 1.5.3-NQ-28-BB-z CAR 중 어느 하나를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다. CAR T 세포를 CFSE로 표지하고 조사한 Raji ffLuc, 리툭시맙-불응성 Raji-ffLuc (RR-Raji) 또는 Rec-1 표적 세포로 재자극하였다. (A) CFSE 희석에 대한 유세포 계측법으로 4일 후 세포를 분석하여 1.5.3-NQ-28-zT 세포의 증식을 평가하였다. 비자극 T 세포에 대한 분열된 CD3+ T 세포의 백분율이 표시되어 있다. (B) 재자극 후 24시간에 상기 배양물로부터 상등액 샘플을 수확하고 Luminex 검사법에 의해 지시된 사이토카인 농도를 분석하여 1.5.3-NQ-28-zT 세포에 의한 사이토카인 분비를 결정하였다. IL-2 및 TNF-α 농도는 왼쪽 y- 축에 표시되고 IFN-γ 농도는 오른쪽 y-축에 표시되어 있다. (C) 상기 파트 B에서와 같이 결정된 1.5.3-NQ-28-BB-z T 세포에 의한 사이토카인 분비. (D) 지시된 표적 세포주와 표준 5 시간 크로뮴51-방출 분석을 사용하여 1.5.3-NQ-28-BB-CAR T 세포의 세포독성을 결정하였다. (E) 상기 파트 (A)에서와 같이 1.5.3-NQ-28-BB-z T 세포에 의한 사이토카인 분비 및 Granta, Rec-1, FL-18 또는 K80-20 세포로의 자극.
도 12는 리툭시맙 불응성 Raji-ffLuc가 모 Raji-ffLuc 세포와 동일한 CD20 발현을 가짐을 보여준다. Raji-ffLuc (실선 히스토그램) 또는 리툭시맙-불응성 Raji-ffLuc (점선 히스토그램) 세포를 항-CD20-PE 또는 항-CD20-APC 항체로 염색 한 다음 유세포 계측법으로 분석하였다. 동형 대조 항체 (채워진 히스토그램)에 대한 CD20 발현을 각 세포주에 대해 나타내었다.
도 13A 및 13B는 항-CD20 CAR T 세포로 처리한 도 7의 이종이식 종양 마우스 모델로부터의 생체발광 추이 및 이미지를 도시한다. (A) 시간에 따른 개별 마우스 생체발광 종양 부담 추이. 각 선은 개별 마우스를 나타낸다. 회색 선은 종양이 없는 마우스를 나타내며 기준 자가형광을 나타낸다. (B) 대표 마우스 생체발광 이미지.
도 14A 내지 14C는 마우스에서 순환하는 T 세포의 존재를 나타낸다. 종양 주입 후 28일째에 채취한 레트로오비탈 혈액 샘플에서 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)를 단리하고 인간 CD3, 마우스 CD45 및 인간 CD19 (형질도입된 T 세포의 표지자)에 대해 유세포 계측법으로 분석하였다. (A) 순환 인간 T 세포 (생존성 림프구에 게이팅된)의 대표적인 도트 플롯이 왼쪽 패널에 표시되고, 인간 CD3+ T 세포에 게이팅된 CAR+ 세포 (CD19 발현에 기초)가 오른쪽 패널에 표시되어 있다. (B) 28일째 T 세포 지속성의 요약. (C) 지속 T 세포에 대한 CAR의 요약. 도 14B 및 도 14C 모두에서, CAR 단독과 CAR+ 리툭시맙 그룹 간의 차이는 비대응 양측 (unpaired two-tailed) t 검정에 기초하여 통계적으로 유의하지 않았다.
도 15A 내지 15D는 시험관 내에서 다양한 CAR 작제물에 의한 사이토카인 분비를 보여준다. 중추 기억 (CD14-CD45RA-CD62L+) T 세포를 항-CD3/CD28 항체 코팅된 비드로 자극하고, 24시간 후에 지시된 CAR 작제물을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입한 뒤, 생체 내에서 확장시켰다. 14일째, 세포를 조사된 Raji-ffLuc 세포 (도 15A 및 도 15C), Granta-519 세포 (도 15B) 및 Jeko 세포 (도 15D)로 재자극하였다. "19-BB-z" 작제물은 임상 시험에 사용되는 임상 등급의 CD19 표적 CAR이며 양성 대조군으로 제공된다. 24시간 후 상등액을 수확하고 인터페론 (IFN)-γ, IL-2 및 종양 괴사 인자-α 수준을 Luminex 검사법으로 분석하였다.
도 16A 및 16B는 CD20 CAR T 세포에 의한 사이토카인 분비를 나타낸다. (A) 1.5.3-NQ-28-BB-z 렌티바이러스 벡터로 형질도입되고 생체외 확장시킨 CD4= 및 CD8+ T 세포를 조사한 Raji-ffLuc CD20+ 림프종 세포로 재자극하였다. 24시간 후 지시된 사이토카인의 분비를 세포 상등액에서 Luminex 검사법에 의해 측정하였다. (B) 냉동보존된 CD4+ 및 CD8+ CD20 CAR T 세포를 해동시키고 K562 세포 또는 CD20을 발현하는 K562 세포로 재자극한 후, 24시간에 유세포 계측법에 의해 IFN-γ에 대한 세포내 염색으로 분석하였다.
도 17A 및 17B는 다양한 CAR 작제물의 시험관 내 세포독성을 나타낸다. 중추 기억 (CD14-CD45RA-CD62L+) T 세포를 항-CD3/CD28 항체 코팅된 비드로 자극하고, 24 간 후에 지시된 CAR 작제물을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입한 뒤, 생체 내에서 확장시켰다. 14일째에, 세포를 표적으로서 (도 17A 및 17B) Raji-ffLuc 및 (도 17B) Jeko 세포를 사용하여 표준 4 시간 51Cr-방출 분석에 이펙터로서 사용하였다. "19-BB-z" 작제물은 임상 시험에 사용되는 임상 등급의 CD19 표적 CAR이며 양성 대조군으로 제공된다. 각 CAR T 세포 집단의 특이적 표적 세포 용해가 나타난다.
도 18A 및 18B는 CD20 CAR T 세포의 증식을 나타낸다. CD8+ T 세포를 1.5.3-NQ-28-BB-z 렌티바이러스 벡터로 형질도입 (또는 모의 형질도입)하고 생체외에서 확장한 뒤, 냉동보존하였다. 이어서, 세포를 해동시키고, 카복시플루오레세인 숙신아미딜 에스테르 (CFSE)로 염색한 다음, 조사된 CD20+ Raji-ffLuc 림프종 세포, K562 세포 또는 CD20을 발현하는 K562 세포로 재자극하였다. 세포를 4일 후 유세포 계측법으로 분석하였다. (A) CAR+ 세포 (CD3+/tCD19+에 게이팅)의 CFSE 희석이 표시된다. 파선 히스토그램은 배양 배지 단독에서 T 세포의 CFSE 형광을 나타내며, 실선 히스토그램은 표적 세포와 함께 인큐베이션된 T 세포이다. (B) 분열된 세포의 백분율이 각 그룹에 대해 표시된다.
도 19A 및 19B는 다양한 CAR 작제물의 생체 내 항종양 활성을 나타낸다. 중추 기억 (CD14-CD45RA-CD62L+) T 세포를 항-CD3/CD28 항체 코팅된 비드로 자극하고, 24시간 후에 지시된 CAR 작제물을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입한 후, 시험관 내에서 확장시켰다. "19-BB-z" 작제물은 임상 시험용 CD19 표적 CAR로서 우리 센터의 임상 시험에 사용되며 벤치 마크 대조로 제공된다. NSG 마우스에 Raji-ffLuc 종양 세포를 정맥내 주사하고, 2일 후 1.5.3-NQ-28-BB-z CAR, 1.5.3-NQ-28-z CAR, JCAR-014 (항-CD19-41BB-ζ) 또는 빈 벡터로 형질도입된 확장된 중추 기억 (CD14-CD45RA-CD62L+) T 세포를 정맥내 주사하였다. (A) 생체발광 이미징에 의해 평가된 시간 경과에 따른 종양 부담; 및 (B) 전체 생존의 카플란-마이어 플롯.
도 20은 맨틀 세포 림프종에 대한 CD20 CAR T 세포의 생체 내 활성을 나타낸다. CD4+ 및 CD8+ CD20 CAR T 세포를 1.5.3-NQ-28-BBz CAR로 형질도입시키고, 7일전에 Granta ffLuc 맨틀 세포 림프종 세포를 꼬리 정맥으로 접종한 NSG 마우스를 치료하는데 사용하였다. 전체 생존의 카플란-마이어 플롯.
도 21A 및 21B는 생체 내 CAR T 세포 지속성을 나타낸다. CD20 CAR T 세포 또는 빈 벡터 tCD19-발현 T 세포를 Raji-ffLuc 파종 종양이 있는 NSG 마우스에 주입한 후, 레트로오비탈 혈액 샘플을 일련의 시점에 수득하였다. tCD19 형질도입 마커를 발현하는 CD20 CAR T 세포를 인간 CD3+/마우스 CD45-음성/인간 CD19+ 세포로서 각각의 시점에 유세포 계측법으로 정량화하였다. (도 21A) 혈액 중 전체 유핵 세포의 백분율 (n= 9, 초기 CAR T 세포 그룹에서)로서 3 주입 후 시점에서의 tCD19+ T 세포를 나타내었다. 빈 벡터 마우스로부터의 절단 CD19+ 세포를 참조용으로 나타내었다. (도 21B) 별도의 실험에서, 각 그룹에서 2마리 마우스로부터의 tCD19+ 세포 (빈 벡터 대 CAR T 세포)를 매주 측정하여 종적으로 나타내었다.
도 22A 및 22B는 다양한 길이의 스페이서를 갖는 다양한 작제물에 대한 비교 데이터를 도시한다. 중추 기억 (CD14-CD45RA-CD62L+) T 세포를 항-CD3/CD28 항체 코팅된 비드로 자극하고, 24시간 후에 지시된 CAR 작제물을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입한 후 시험관 내에서 확장시켰다. 1F5-28-BB-z, IgG1mut에는 전장 스페이서가 있다. 링커가 없는 것은 거의 전장이지만 6개의 아미노산 링커 (연접 아미노산)가 결여된 것이며, CH3는 연접 아미노산 및 CH2 도메인이 결여된 절단된 스페이서를 갖는다. (A) 20일에, 세포를 Granta 또는 Rec-1 림프종 세포로 재자극하고, 24시간 후에 상등액을 수확한 다음 IL-2 (오른쪽) 및 IFN-γ (왼쪽) 농도에 대해 Luminex 분석법으로 분석하였다. (B) 중추 기억 T 세포 (CD14-CD45RA-CD62L+) 를 항-CD3/항-CD28 항체 코팅 비드로 자극하고, 24시간 후에 지시된 CAR 작제물을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입한 뒤, 시험관 내에서 확장시켰다. "IgG1mut NQ"는 전장 CH2CH3 스페이서를 가지며, CH3만이 상기 논의된 중간 길이이고 Leu16 단편은 CH2 및 CH3 도메인이 결여되어 있다. 20일에, Raji 세포를 표적으로 사용하는 표준 4시간 51Cr-방출 분석에 이펙터 세포로서 상기 세포를 사용하였다.
도 23A 내지 23F는 다양한 변형의 스페이서를 갖는 다양한 작제물에 대한 비교 데이터를 도시한다. IgG2 연접 아미노산 ("IgG1mut"로 표시됨) 및 N297Q ("NQ"로 표시됨) 돌연변이를 갖는 CAR의 개략도가 도시된다 (도 23A). 야생형 IgG1 스페이서, IgG1 돌연변이 스페이서 (IgG1 연접 아미노산이 IgG2 연접 아미노산으로 치환됨)를 갖거나, 연접 아미노산이 없는 (IgG1 연접 아미노산 결실) CAR을 발현하는 T 세포를 비오티닐화된 가용성 CD64 (FcγRI)로 염색하고, 스트렙타비딘-PE로 처리한 후, 유세포 계측법으로 분석하여 야생형이지만 변형되지 않은 스페이서에 대한 Fc 수용체 결합을 입증하였다 (도 23B). 지시된 CAR 작제물을 발현하는 T 세포를 CD64 (FcγRI)를 발현하는 K562 세포 또는 Fc 수용체가 결여된 모 K562와 함께 인큐베이션하였다. 공동 인큐베이션 후 24시간에, T 세포를 유세포 계측법에 의해 활성화의 지표로서 CD25 및 CD69 발현에 대해 평가하였다. 도트 플롯은 CD3+ CD19+ 세포 (CAR+ T 세포)를 나타낸다. Fc 수용체에 대한 야생형 스페이서의 결합은 T 세포 활성화를 유도하는 반면 변형된 스페이서는 그렇지 않았다 (도 23C). 중추 기억 (CD14-CD45RA-CD62L+) T 세포를 항-CD3/CD28 항체 코팅된 비드로 자극하고, 24시간 후에 지시된 CAR 작제물을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시킨 후, 시험관 내에서 확장시키고, Raji-ffLuc 세포를 정맥내 투여하고 2일 후, NSG 마우스에 주사하였다. (D 및 E) 두 상이한 실험에 대한 생체발광에 의한 종양 부담 데이터. (F) 카플란-마이어 생존 곡선은 상기 (E) 부분의 실험에서 나온 것이다.
도 24는 본 발명의 면역요법 방법 및 조성물을 포함한 임상 시험을 위한 치료 스키마의 다이어그램을 도시한다.
도 25A 및 25B는 임상 시험에서 항-CD20 CAR T 세포의 투여 모델 및 제형 방법의 다이어그램을 나타낸다.
상세한 설명
본 발명은 CD20 발현 세포의 수를 감소시키거나 CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 치료 (예를 들어, B 세포의 수를 감소시키거나 이상 B 세포 활성과 관련된 질환 또는 장애를 치료)하기 위한 조성물 및 방법을 제공하고, 이는 융합 단백질을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포의 치료적 유효량으로 대상을 처리하는 단계를 포함하며, 상기 융합 단백질은 세포 외 성분 및 소수성 부분에 의해 세포 외 성분에 연결된 세포 내 성분을 포함하며, 상기 세포 외 성분은 CD20과 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하고, 세포 내 성분은 이펙터 도메인을 포함한다. 임의로, 상기 방법은 CD20에 특이적인 융합 단백질을 발현하는 숙주 세포와 병용하여 치료적 유효량의 CD20-특이적 결합 분자를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 융합 단백질은 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 또 다른 구체예에서, CAR은 항-CD20 항체로부터의 scFv 또는 CD20 항원에 특이적인 TCR로부터의 scTCR을 포함한다.
배경으로, 잔류 항-CD20 항체 수준은 CD20 표적화된 CAR T 세포에 대한 주요 제약을 나타낼 수 있다고 일반적으로 믿어진다. 예를 들어, 다른 표적에 대한 이전의 연구들은 암배아 항원, 루이스-Y 항원 또는 CD30을 표적으로 하는 CAR T 세포의 사이토카인 분비 및 세포독성이 10 ㎍/ml 이하의 가용성 동족 항원의 존재하에서 크게 손상되지 않는다는 것을 입증하였으며 (Hombach et al., Gene Ther 2000;7(12):1067-75; Hombach et al., Gene Ther 1999;6(2):300-4; Nolan et al., Clin Cancer Res 1999;5(12):3928-41; Westwood et al., J Immunother 2009;32(3):292-301); 이보다 더 높은 수준이 잠재적으로 억제된다는 것이 관찰되었다 (Hombach et al., Gene Ther 2000;7(12):1067-75). 본원에서, 놀랍게도 임상적으로 관련된 농도의 다양한 항-CD20 항체 (예: 리툭시맙)가 시험관 내 또는 생체 내에서 항-CD20 CAR을 발현하는 T 세포의 활성에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 밝혀졌다 (또한 Gall et al., Exp. Hematol. 33:452, 2005 참조). 또한, 본원의 마우스 실험은 병용 요법을 받은 그룹이 CAR T 세포 단독으로 처리된 마우스와 동등 내지는 그 이상의 결과를 나타냄을 입증한다.
본 발명을 보다 상세히 기재하기에 앞서, 본원에서 사용될 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 본원을 이해하는데 도움이될 수 있다. 추가 정의는 본 명세서 전반에 걸쳐 기재되어 있다.
본 명세서에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 표시되지 않는 한 기재된 범위 내의 임의의 정수값과, 적절하다면 그의 분수(예컨대, 정수의 10분의 1과 100분의 1)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 물리적 특성, 예컨대 중합체 서브유닛, 크기 또는 두께와 관련하여 본원에 기재된 수치 범위는, 달리 표시되지 않는 한, 기재된 범위 내의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 "약"이란 용어는, 달리 표시되지 않는 한, 표시된 범위, 값 또는 구조의 ±20%를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "하나" ("a", "an")란 용어는 열거된 성분의 "하나 또는 그 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안(예를 들어, " 또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 그의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 용어 "포함한다", "갖는다" 및 "구성하다"는 동의적으로 사용되고, 그의 용어 및 변형체는 비제한적인 것으로 해석되도록 의도된다.
"임의적" 또는 "임의로"는 후속하여 기술된 요소, 성분, 사건 또는 상황이 발생할 수도 있고 발생하지 않을 수도 있음을 의미하며, 이 설명에는 요소, 성분, 사건 또는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우가 포함됨을 의미한다.
또한, 개별 작제물, 또는 작제물의 그룹은 본원에 기술된 구조 및 서브유닛의 다양한 조합으로부터 유도되며 본원에 의해 각각의 작제물 또는 작제물의 그룹이 개별적으로 열거된 것과 동일한 범위로 기술된 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 특정 구조 또는 특정 서브유닛의 선택은 본 발명의 범위 내에 있다.
용어 "기본적으로 이루어지는"이란 청구의 범위를 특정된 물질 또는 단계, 또는 청구된 발명의 기본 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 것들로 제한한다. 예를 들어, 단백질 도메인, 영역, 모듈 또는 단편 (예를 들어, 결합 도메인, 힌지 영역, 링커 모듈 또는 태그) 또는 (하나 이상의 도메인, 영역 또는 모듈을 가질 수 있는) 단백질은 도메인, 영역, 모듈, 단편 또는 단백질의 아미노산 서열이 조합해서 도메인, 영역, 모듈, 카세트 또는 단백질 길이의 최대 20% (예를 들어, 최대 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)에 기여하고 도메인(들), 영역(들), 모듈(들), 카세트(들) 또는 단백질의 활성 (예를 들어, 결합 단백질의 표적 결합 친화성)에 실질적으로 영향을 미치지 않는(즉, 50%를 초과하여 활성을 감소하지 않는, 예컨대 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하) 삽입, 결실, 돌연변이, 또는 그의 조합 (예를 들어, 아미노- 또는 카복시-말단에 또는 도메인 사이에 아미노산 첨가)을 포함할 경우 특정한 아미노산 서열로 "기본적으로 이루어진다".
본원에 사용된 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 아미노산뿐만 아니라 나중에 변형된 아미노산, 예를 들어 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 지연 발생 아미노산과 동일한 기본적 화학 구조, 즉 수소, 카복실기, 아미노기 및 R기와 결합한 α-탄소를 가지는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸설포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R기 (예: 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 가지지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 다른 구조를 가지지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 지칭한다.
"보존적 치환"은 특정 단백질의 결합 특성에 유의적으로 영향을 주지 않거나 변경시키지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 일반적으로, 보존적 치환은 치환된 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 보존적 치환은 다음 그룹 중 하나에서 발견되는 치환을 포함한다: 그룹 1: 알라닌 (Ala 또는 A), 글리신 (Gly 또는 G), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T); 그룹 2: 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 Z); 그룹 3: 아스파라긴 (Asn 또는 N), 글루타민 (Gln 또는 Q); 그룹 4: 아르기닌 (Arg 또는 R), 리신 (Lys 또는 K), 히스티딘 (His 또는 H); 그룹 5: 이소류신 (Ile 또는 I), 류신 (Leu 또는 L), 메티오닌 (Met 또는 M), 발린 (Val 또는 V); 및 그룹 6: 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 티로신 (Tyr 또는 Y), 트립토판 (Trp 또는 W). 부가적으로 또는 대안으로, 아미노산은 유사한 기능, 화학적 구조 또는 조성 (예를 들어, 산성, 염기성, 지방족, 방향족 또는 황 함유)에 의해 보존적 치환기 그룹들로 그룹화될 수 있다. 예를 들어, 지방족 그룹은 치환을 위해 Gly, Ala, Val, Leu 및 Ile을 포함할 수 있다. 다른 보존적 치환 그룹은 다음을 포함한다: 황 함유: Met 및 시스테인 (Cys 또는 C); 산성: Asp, Glu, Asn 및 Gln; 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성인 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; 음으로 하전된 극성 잔기 및 그들의 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; 양으로 하전된 극성 잔기: His, Arg 및 Lys; 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp. 추가 정보는 [Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company]에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용된 "단백질" 또는 "폴리펩티드는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 단백질은 자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산 및 비자연 발생 아미노산 중합체의 인공 화학 모방체인 아미노산 중합체에 적용된다.
"퍼센트 서열 동일성"은 서열을 비교함으로써 결정된 것으로 2 이상의 서열 간의 관계를 나타낸다. 서열 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 비교되는 서열 간에 최상의 일치를 제공하도록 설계된다. 예를 들어, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를 들어, 갭은 최적의 정렬을 위해 제 1 및 제 2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있다). 또한, 비상동 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다. 본원에서 언급된 퍼센트 서열 동일성은 달리 언급되지 않는 한, 기준 서열의 길이에 대해 계산된다. 서열 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에서 확인할 수 있다. 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 BLAST 프로그램 (예를 들어, BLAST 2.0, BLASTP, BLASTN 또는 BLASTX)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 프로그램에 사용된 수학적 알고리즘은 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997]에서 확인할 수 있다. 본 개시의 문맥에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석에 사용되는 경우, 분석 결과는 언급된 프로그램의 "디폴트 값"에 기초한다는 것을 이해할 것이다. "디폴트 값"은 최초 초기화시 소프트웨어에 처음 로드된 값 또는 매개 변수의 임의의 집합을 의미한다.
"핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 천연 서브유닛 (예: 퓨린 또는 피리미딘 염기) 또는 비천연 서브유닛 (예: 모르폴린 고리)로 구성될 수 있는 공유 결합된 뉴클레오티드를 포함하는 중합 화합물을 지칭한다. 퓨린 염기는 아데닌, 구아닌, 하이포크산틴 및 크산틴을 포함하고, 피리미딘 염기는 우라실, 티민 및 시토신을 포함한다. 핵산 분자는 폴리리보핵산 (RNA), cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하는 폴리데옥시리보핵산 (DNA)을 포함하며, 이 중 어느 하나는 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥일 경우, 핵산 분자는 코딩 가닥 또는 비-코딩 가닥 (안티-센스 가닥)일 수 있다. 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자는 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열의 일부 버전은 또한 인트론(들)이 동시 또는 사후 전사 메카니즘을 통해 제거될 정도로 인트론(들)을 포함할 수 있다. 다른 말로 하면, 상이한 뉴클레오티드 서열은 스플라이싱 (splicing)에 의해, 또는 유전 코드의 중복 또는 축퇴의 결과로 동일한 아미노산 서열을 코딩할 수 있다.
본원의 핵산 분자의 변이체가 또한 고려된다. 핵산 분자 변이체는 약 65-68 ℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산나트륨, 또는 약 42 ℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산나트륨 및 50% 포름아미드의 엄격한 혼성화 조건하에서 폴리뉴클레오티드로 혼성화되거나, 본원에 정의된 핵산 분자 또는 기준 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일하다. 핵산 분자 변이체는 표적 분자 (예: CD20)에 특이적으로 결합하는 것과 같이, 본원에 기술된 기능성을 갖는 융합 단백질 또는 그의 결합 도메인을 코딩하는 능력을 보유한다.
"기능성 변이체"는 본원의 모 또는 기준 화합물과 구조적으로 유사하거나, 실질적으로 구조적으로 유사하지만, 조성이 약간 상이해 (예를 들어, 하나의 염기, 원자 또는 작용기가 상이하거나, 첨가되거나, 제거된) 폴리펩티드 또는 코딩된 폴리펩티드가 적어도 50% 효율, 바람직하게는 모 폴리펩티드의 활성 수준의 적어도 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%로 코딩된 모 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능을 수행할 수 있는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 달리 말하면, 본원의 폴리펩티드 또는 코딩된 폴리펩티드의 기능성 변이체는 기능성 변이체가 선택된 분석, 예컨대 결합 친화도를 측정하기 위한 분석법 (예를 들어, 결합 (Ka) 또는 해리 (KD) 상수를 측정하는 Biacore® 또는 테트라머 염색)에서 모 또는 기준 폴리펩티드와 비교하여 성능의 50% 이하의 감소를 나타내는 경우 "유사한 결합", "유사한 친화도" 또는 "유사한 활성"을 갖는다.
본원에서 사용된 "기능성 부분" 또는 "기능성 단편"은 모 또는 기준 화합물의 도메인, 부분 또는 단편만을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 폴리펩티드 또는 코딩된 폴리펩티드는 모 또는 기준 화합물의 도메인, 부분 또는 단편과 관련된 활성을 적어도 50%, 바람직하게는 모 폴리펩티드 활성 수준의 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%를 보유하거나, 또는 생물학적 이익 (예: 이펙터 기능)을 제공한다. 본원의 폴리펩티드 또는 코딩된 폴리펩티드의 "기능성 부분" 또는 "기능성 단편"은 기능성 부분 또는 단편이 선택된 분석, 예컨대 이펙터 기능을 측정하기 위한 분석법 (예를 들어, 사이토카인 방출)에서 모 또는 기준 폴리펩티드와 비교하여 성능의 50% 이하 (바람직하게는 20% 이하 또는 10% 이하, 또는 친화도에 대해 모 또는 기준 폴리펩티드와 비교하여 로그 차이 이하)의 감소를 나타내는 경우 "유사한 결합" 또는 "유사한 활성"을 갖는다.
본원에 사용된 "이종성" 또는 "비-내인성" 또는 "외인성"은 숙주 세포 또는 대상에 고유하지 않은 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자 또는 활성, 또는 변경되지 않은 숙주 세포 또는 대상에 고유한 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자 또는 활성을 지칭한다. 이종, 비-내인성 또는 외인성은 구조, 활성 또는 둘 모두가 자연 및 변경된 유전자, 단백질, 화합물 또는 핵산 분자 간에 차이가 있도록 돌연변이되거나 또는 달리 변형된 유전자, 단백질, 화합물 또는 핵산 분자를 포함한다. 특정 구체예에서, 이종성, 비-내인성 또는 외인성 유전자, 단백질 또는 핵산 분자 (예를 들어, 수용체, 리간드 등)는 숙주 세포 또는 대상에 내인성이 아닐 수 있고, 대신에 그러한 유전자, 단백질, 화합물 또는 핵산 분자를 코딩하는 핵산이 접합, 형질전환, 형질감염, 일렉트로포레이션 등에 의해 숙주 세포에 첨가될 수 있으며, 이때 첨가된 핵산 분자는 숙주 세포 게놈에 통합되거나, 염색체 외의 유전 물질 (예를 들어 플라스미드 또는 다른 자가 복제 벡터)로서 존재할 수 있다. 용어 "동종" 또는 "동족체"는 숙주 세포, 종 또는 균주에서 발견되거나 유래된 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자 또는 활성을 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드를 코딩하는 이종 또는 외인성 폴리뉴클레오티드 또는 유전자는 천연 폴리뉴클레오티드 또는 유전자와 상동성일 수 있으며 동종성 폴리펩티드 또는 활성을 코딩할 수 있지만, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 변경된 구조, 서열, 발현 수준 또는 이들의 임의 조합을 가질 수 있다. 비-내인성 폴리뉴클레오티드 또는 유전자뿐만 아니라 코딩된 폴리펩티드 또는 활성은 동일한 종, 상이한 종 또는 이들의 조합으로부터 유래할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "내인성" 또는 "천연"은 숙주 세포 또는 대상에 정상적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드, 유전자, 단백질, 화합물, 분자 또는 활성을 지칭한다.
"발현"은 발현 조절 서열 (예: 프로모터)에 작동가능하게 연결된 핵산 분자의 전사 또는 번역을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "조작된", "재조합" 또는 "비-천연"은 적어도 하나의 유전자 변경을 포함하거나 외인성 핵산 분자의 도입에 의해 변형된 생물체, 미생물, 세포, 핵산 분자, 또는 벡터를 지칭하며, 여기서 변경 또는 변형은 유전 공학 (즉, 인간 개입)에 의해 도입된다. 유전적 변형은 예를 들어, 단백질, 융합 단백질 또는 효소를 코딩하는 발현가능한 핵산 분자, 또는 세포의 유전 물질의 다른 핵산 분자 첨가, 결실, 치환 또는 다른 기능성 파괴를 도입하는 변형을 포함한다. 추가의 변형은 예를 들어 변형이 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비-코딩 조절 영역을 포함한다.
본원에서 사용된 "융합 단백질"은 단쇄에 적어도 2개의 별개의 도메인을 가지며, 여기서 도메인은 단백질에서 함께 자연적으로 발견되지 않는 단백질을 지칭한다. 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 PCR, 재조합적으로 조작된 것 등을 사용하여 작제될 수 있거나 또는 이러한 융합 단백질은 합성될 수 있다. 융합 단백질은 태그, 링커 모듈 또는 형질도입 마커와 같은 다른 성분을 추가로 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포 (예를 들어, T 세포)에 의해 발현되거나 생성된 융합 단백질은 세포 표면에 위치하고, 이 경우 융합 단백질은 (예를 들어, 막관통 도메인을 통해) 세포막에 고정되고 세포 외 부분 (예: 결합 도메인 포함) 및 세포 내 부분 (예: 신호 도메인, 이펙터 도메인, 공동 자극 도메인 또는 이들의 조합 포함)을 포함한다.
항체 기술 분야의 업자가 이해하는 용어들은 각각 본원에서 다르게 정의되지 않는 한 당업계에서 습득한 의미를 갖는다. 용어 "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 온전한 항체뿐만 아니라, 표적 분자에 결합하는 능력을 가지거나 보유하는 온전한 항체의 항원-결합 부분을 지칭한다. 항체에는 폴리클로날 및 모노클로날 항체가 포함된다. 항체는 자연 발생적이거나, 재조합적으로 생성되거나, 유전자 조작되거나, 변형될 수 있고, 예를 들어 인트라바디, 펩티바디, 나노바디, 단일 도메인 항체, 다중특이성 항체 (예를 들어, 이중특이성 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv)와 같은 변형된 형태의 면역글로불린을 포함한다. 항체로부의 "항원 결합 부분", "항원 결합 단편" 또는 "항원 결합 도메인"은 온전한 항체의 일부를 포함하고 항체의 항원 결정 가변 영역 또는 상보성 결정 영역을 함유한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, 단쇄 항체, scFv (즉, 일반적으로 약 10 내지 약 25개 아미노산의 짧은 결합 펩티드로 연결된 Ig 분자의 가변 중 (VH) 및 가변 경 (VL) 영역의 융합 단백질), VHH, 단일 도메인 항체 (예: sdAb, sdFv, 나노바디) 및 항체 단편을 포함하는 다중특이성 항체를 포함한다. 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 비인간, 키메라, 인간화 또는 인간, 바람직하게는 인간화 또는 인간일 수 있다. 면역글로블린 구조 및 기능은 예를 들어, [Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988)]에 검토되어 있다. 항체는 IgG 및 그의 서브 클래스 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgE, IgA, 및 IgD를 포함하는 임의의 클래스 또는 서브 클래스일 수 있다.
용어 "VL" 및 "VH"는 각각 항체의 경쇄 및 중쇄로부터의 가변 결합 영역을 지칭한다. 가변 결합 영역은 "상보성 결정 영역" (CDR) 및 "프레임워크 영역" (FR)으로 알려진 이산되고 잘 정의된 하위 영역으로 구성된다.
용어 "상보성 결정 영역" (CDR) 또는 "초가변 영역" (HVR)은 항원 특이성 또는 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내 아미노산의 비인접 서열을 지칭하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에는 3개의 CDR (HCDR1, HCDR2 및 HCDR3)이 있고 각각의 경쇄 가변 영역에는 3개의 CDR (LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)이 있다.
본원에서 사용되는 "프레임 워크 영역" (FR)은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 비-CDR 부분을 나타낸다. 일반적으로 각 전장 중쇄 가변 영역에는 4개의 FR (FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4)이 있고 각 경쇄 가변 영역에는 4개의 FR (FR-L1, FR-L2, FR-L3, 및 FR-L4)이 있다.
용어 "CL"은 "면역글로불린 경쇄 불변 영역" 또는 "경쇄 불변 영역", 즉 항체 경쇄로부터의 불변 영역을 지칭한다. 용어 "CH"는 "면역글로불린 중쇄 불변 영역" 또는 "중쇄 불변 영역"을 지칭하는데, 항체 동형에 따라 CH1, CH2 및 CH3 (IgA, IgD, IgG) 또는 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인 (IgE, IgM)로 더 분류될 수 있다.
"단편 항원 결합" (Fab) 영역은 항원에 결합하는 항체의 일부이며, 사슬 간 디설파이드 결합을 통해 경쇄에 연결된 중쇄의 가변 영역 및 CH1을 포함한다. "결정화 가능한 단편" (Fc) 영역은 Fab 영역이 아닌 항체의 일부이며, CH1 이외의 CH 영역 (예: IgG, IgA 또는 IgD 항체의 CH2 및 CH3 또는 IgE 항체의 CH2, CH3, 및 CH4)을 포함한다. 배경으로, Fc 영역은 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC), 보체 의존성 세포독성 (CDC) 및 Fc 수용체 (예를 들어, CD16, CD32, FcRn)에 결합하고, Fc 영역이 결여된 폴리펩티드에 비해 생체 내에서의 반감기가 더 큰 보체 고정, 단백질 A 결합 및 아마도 심지어는 태반 전달과 같은 면역글로불린의 이펙터 기능에 관여한다 (Capon et al., Nature 337:525, 1989 참조).
본원에 사용된 "Fc 영역 부분"은 CH2, CH3, CH4 또는 이들의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 불변 도메인을 포함할 수 있는 항체 유래의 Fc 단편의 중쇄 불변 영역 세그먼트를 지칭한다. 특정 구체예에서, Fc 영역 부분은 IgG, IgA 또는 IgD 항체의 CH2 및 CH3 도메인 또는 그의 임의의 조합, 또는 IgM 또는 IgE 항체의 CH2, CH3 및 CH4 도메인 및 그의 임의의 조합을 포함한다. 다른 구체예에서, CH2CH3 또는 CH3CH4 구조는 동일한 항체 동형으로부터의 서브-영역 도메인을 가지며, 인간, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM (예를 들어, 인간 IgG1 또는 IgG4로부터의 CH2CH3)이다. 특정 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질에서 발견되는 Fc 영역 부분은 면역글로불린의 하나 이상의 이펙터 기능을 매개할 수 있거나, 하나 이상의 강화된 이펙터 기능을 매개할 수 있거나, 예를 들어, 당 업계에 공지된 하나 이상의 돌연변이에 의한 이러한 활성의 하나 이상 또는 모두가 결여될 수 있다.
또한, 항체는 전형적으로 Fab와 Fc 영역 사이에 위치하는 힌지 서열을 갖는다 (그러나 힌지의 하부 섹션은 Fc 영역의 아미노 말단 부분을 포함할 수 있다). 배경으로, 면역글로불린 힌지는 Fab 영역이 공간에서 자유롭게 움직일 수 있도록 유연한 스페이서로 작용한다. 불변 영역과 달리, 힌지는 구조적으로 다양하며 면역글로불린 클래스와 하위 클래스 사이에서 서열과 길이가 다양하다. 예를 들어, 인간 IgG1 힌지 영역은 자유로운 유연성을 가져 Fab 영역이 대칭축을 중심으로 회전하고 2개의 중쇄 간 디설파이드 브릿지 중 첫 번째를 중심으로 하여 구체 내에서 움직인다. 비교해 보면, 인간 IgG2 힌지는 상대적으로 짧고 4개의 중쇄 간 디설파이드 브릿지에 의해 안정화된 경질의 폴리-프롤린 이중 나선을 포함하고 있어 유연성이 제한된다. 인간 IgG3 힌지는 62개의 아미노산 (21개의 프롤린과 11개의 시스테인 포함)을 함유하고 비가요성 폴리-프롤린 이중 나선을 형성하고, Fab 영역이 Fc 영역으로부터 비교적 멀리 떨어져 있기 때문에 더 큰 가요성을 제공하는 특유의 연장된 힌지 영역 (IgG1 힌지의 약4 배 길이)에 의해 다른 서브 클래스와 상이하다. 인간 IgG4 힌지는 IgG1보다 짧지만 IgG2와 길이가 같으며 유연성은 IgG1과 IgG2의 중간 정도이다.
"T 세포"는 흉선에서 성숙하여 T 세포 수용체 (TCR)를 생산하는 면역 시스템 세포이다. T 세포는 나이브 (항원에 노출되지 않고; TCM에 비해 CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 및 CD45RA의 발현 증가 및 CD45RO의 발현 감소), 기억 T 세포 (TM) (항원 경험 및 장기 생존), 및 이펙터 세포 (항원-경험, 세포독성)일 수 있다. TM은 중추 기억 T 세포 (나이브 T 세포와 비교하여 CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO 및 CD95의 발현 증가 및 CD54RA의 발현 감소) 및 이펙터 기억 T 세포 (TEM, 나이브 T 세포 또는 TCM과 비교하여 CD62L, CCR7, CD28, CD45RA의 발현 감소, 및 CD127의 발현 증가)의 서브세트로 더 나누어질 수 있다. 이펙터 T 세포 (TE)는 TCM과 비교하여 CD62L, CCR7, CD28의 발현이 감소하고 그랜자임 및 퍼포린에 양성인 항원-경험 CD8+ 세포독성 T 림프구를 지칭한다. T 헬퍼 세포 (TH)는 항원 신호전달을 돕기 위해 사이토카인을 방출하고, 성숙되면 표면 단백질 CD4 (CD4+)를 발현한다. 본원에서 사용된 "T 세포" 또는 "T 림프구"는 영장류, 개 또는 말, 바람직하게는 인간을 포함한 임의의 포유동물 유래이다. 일부 구체예에서, T 세포는 자가, 동종 또는 동족이다.
"T 세포 수용체" (TCR)는 CD3과 관련하여 일반적으로 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합된 항원의 인식을 담당하는 T 세포 (또는 T 림프구)의 표면에서 발견되는 분자를 의미한다. TCR은 대부분의 T 세포에서 고가변성 α 및 β 사슬 (각각 TCRα 및 TCRβ로도 알려짐)의 디설파이드 연결된 헤테로다이머를 가지고 있다. T 세포의 소 서브세트에서, TCR은 가변 γ 및 δ 사슬 (각각 TCRγ 및 TCRδ로도 알려짐)의 헤테로다이머로 구성된다. TCR의 각 사슬은 면역글로불린 수퍼패밀리의 구성원이며 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역 및 C 말단에 짧은 세포질 꼬리를 갖는다 (Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997 참조). 본 발명에 사용된 TCR은 인간, 마우스, 래트, 고양이, 개, 염소, 말 또는 다른 포유동물을 비롯한 다양한 동물 종으로부터 유래될 수 있다. TCR은 세포-결합 (즉, 막관통 영역 또는 도메인을 가짐)되거나 가용성 형태일 수 있다. 본원에서 논의된 바와 같이, 본 발명에 따른 결합 도메인은 단쇄 TCR (scTCR)을 포함할 수 있으며, 이것은 면역글로불린으로부터 유래된 scFv와 유사하며, 예를 들어 펩티드 또는 비펩티드 링커를 사용하고 임의로는 디설파이드 결합을 통해 함께 연결된 TCRα 및 TCRβ 쇄로부터의 가변 도메인을 포함한다.
"주요 조직적합성 복합체 분자" (MHC 분자)는 펩티드 항원을 세포 표면에 전달하는 당단백질을 지칭한다. MHC 클래스 I 분자는 α 사슬 (3개의 α 도메인을 가짐) 및 비공유 결합된 β2 마이크로글로불린에 걸친 막으로 이루어진 헤테로다이머이다. MHC 클래스 II 분자는 막에 걸친 2개의 막 관통 당단백질인 α와 β로 구성된다. 각 사슬에는 두개의 도메인이 있다. MHC 클래스 I 분자는 세포질에서 기원하는 펩티드를 세포 표면에 전달하며, 여기서 펩티드:MHC 복합체는 CD8+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 클래스 II 분자는 소포 시스템에서 기원하는 펩티드를 세포 표면에 전달하며, 여기서 이들은 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 분자는 인간, 마우스, 쥐, 고양이, 개, 염소, 말 또는 다른 포유 동물을 비롯한 다양한 동물 종으로부터 유래될 수 있다.
"T 세포 계통의 세포"는 T 세포의 적어도 하나의 표현형 특성을 나타내는 세포, 또는 다른 림프 세포 및 및 적혈구 또는 골수 계통의 세포와 세포가 구별되는 그의 전구체 또는 선조체를 지칭한다. 이러한 표현형의 특징은 T 세포에 특이적인 하나 이상의 단백질 (예: CD3+, CD4+, CD8+), 또는 T 세포에 특이적인 생리학적, 형태학적, 기능적 또는 면역학적 특징의 발현을 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포 계통의 세포는 T 세포 계통에 할당된 선조체 또는 전구 세포; CD25+ 나이브 및 불활성화 T 세포; CD4 또는 CD8 계통 투입을 받은 세포; CD4+CD8+ 이중 양성인 흉선 전구 세포; 단일 양성 CD4+ 또는 CD8+; TCRαβ 또는 TCRγδ; 또는 성숙 및 기능성 또는 활성화된 T 세포일 수 있다.
본원에서 사용된, 혼합물 중 세포 유형의 양에 대한 "농축된" 또는 "고갈된"은 하나 이상의 농축 또는 고갈 과정 또는 단계로 인한 세포 혼합물에서 "농축된" 유형의 수의 증가, "고갈된" 세포 수의 감소, 또는 이 둘 다를 지칭한다. 따라서, 농축 과정을 거친 세포의 원래 집단의 기원에 따라, 혼합물 또는 조성물은 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 이상의 (수 또는 개수에서) "농축된" 세포를 함유할 수 있다. 고갈 과정을 거친 세포는 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 또는 그 이하의 (수 또는 개수에서) "고갈된" 세포를 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, 예컨대 CD4+ 세포는 농축되는 반면 CD8+ 세포는 고갈되거나, 또는 CD62L+ 세포는 농축되는 반면 CD62L- 세포는 고갈되거나, 또는 그 조합과 같이, 혼합물 중 특정 세포 유형의 양은 농축되고 상이한 세포 유형의 양은 고갈될 것이다.
"치료하다" 또는 "치료" 또는 "개선"은 대상 (예: 영장류, 말, 고양이, 개, 염소, 마우스 또는 래트 등의 인간 또는 비인간 포유류)의 질환, 장애 또는 상태의 의학적 관리를 지칭한다. 일반적으로, 융합 단백질을 발현하는 숙주 세포 및 임의로 애쥬번트를 포함하는 적절한 용량 또는 치료법이 치료적 또는 예방적 이점을 유도하기에 충분한 양으로 투여되며, 여기서 상기 융합 단백질은 소수성 부분에 의해 연결된 세포 내 성분 및 세포 외 성분을 포함하고, 세포 외 성분은 CD20에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하며, 세포 내 성분은 본원의 이펙터 도메인을 포함한다. 치료적 또는 예방적/방지적 이익에는 개선된 임상적 성과; 질환과 관련된 증상의 완화 또는 경감; 증상 발생의 감소; 삶의 질 향상; 질환이 없는 상태 연장; 질환 범위의 감소, 질환 상태의 안정화; 질환 진행의 지연; 차도; 생존; 장기 생존; 또는 이들의 임의 조합이 포함된다. 본원에 추가로 기술된 바와 같이, 치료법은 하나 이상의 CD20-특이적 결합 분자, 예를 들어 항-CD20 항체가 하나 이상의 제 2 치료제 또는 보조 치료제의 투여 전, 이와 동시 또는 이에 순착적으로 투여되는 병용 요법을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 치료 방법에 사용하기에 적합한 예시적인 항-CD20 항체는 1.5.3, 1F5, Leu16, 리툭시맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 우블리툭시맙 및 오크렐리주맙을 포함한다.
본 개시의 융합 단백질을 발현하는 CD20-특이적 결합 분자, 융합 단백질 또는 숙주 세포 (예: CD20 CAR)의 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 개선된 임상적 성과; 질환과 관련된 증상의 완화 또는 경감; 증상 발생의 감소; 삶의 질 향상; 질환이 없는 상태 연장; 질환 범위의 감소, 질환 상태의 안정화; 질환 진행의 지연; 차도; 생존; 장기 생존을 비롯한 치료 효과를 통계적으로 유의적인 방식으로 유도하기에 충분한 CD20-특이적 결합 분자, 융합 단백질 또는 숙주 세포의 양을 지칭한다. 단독 투여되는 개별 활성 성분 또는 단독 활성 성분을 발현하는 세포를 언급할 때, 치료적 유효량은 그 성분 또는 그 성분만을 발현하는 세포의 효과를 가리킨다. 조합을 지칭할 때, 치료적 유효량은 연속적으로 또는 동시에 투여되는지 여부에 상관없이, 치료적 효과로 이어지는 활성 성분의 조합된 양, 또는 조합된 보조 활성 성분과 활성 성분을 발현하는 세포의 조합된 양을 지칭한다. 조합은 또한 두 상이한 CD20 CAR, 또는 하나의 CD20 CAR 및 CD20 TCR, 또는 CD20 CAR 및 다른 관련 치료제와 같이, 복수의 활성 성분을 발현하는 세포일 수 있다.
용어 "약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체" 또는 "생리적으로 허용가능한 부형제 또는 담체"는 인간 또는 다른 비인간 포유동물 대상에 투여하기에 적합하고 일반적으로 안전하다고 인정되거나 중대한 이상 반응을 일으키지 않아야 하는 생물학적으로 상용성인 비히클, 예를 들어 생리 식염수를 지칭하며, 이들은 본원에서 보다 상세하게 설명된다.
본원에서 "통계적으로 유의하다"는 것은 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산했을 때 0.050 이하의 p 값을 나타내며 측정되는 특정 사건이나 결과가 우연히 발생하지 않았음을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "양자 면역치료" 또는 "입양 면역요법"은 자연 발생 또는 유전자 조작된 질환 항원 특이적 면역 세포 (예: T 세포)의 투여를 지칭한다. 양자 세포 면역요법은 자가 (면역 세포는 수용자에게서 유래), 동종 (면역 세포는 같은 종의 기증자로부터 유래) 또는 동족 (면역 세포는 수용자와 유전적으로 동일한 기증자로부터 유래됨)일 수 있다.
융합 단백질
특정 양태에서, 본원은 소수성 부분에 의해 연결된 세포 내 성분 및 세포 외 성분을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
"세포 외 성분"은 CD20에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 본원에 사용된 "결합 도메인" ("결합 영역" 또는 "결합 부분"이라고도 함)은 표적 분자 (예: CD20)와 특이적 및 비공유적으로 연합, 통합 또는 조합되는 능력을 갖는 분자, 예컨대 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 지칭한다. 결합 도메인은 생물학적 분자 또는 다른 관심 표적에 대한 임의의 자연 발생적, 합성적, 반-합성적 또는 재조합적으로 생성된 결합 파트너를 포함한다. 일부 구체예에서, 결합 도메인은 항체 또는 TCR과 같은 항원-결합 도메인, 또는 그의 기능성 결합 도메인 또는 그의 항원-결합 단편이다.
특정 구체예에서, 결합 도메인은 가변 영역 링커 (예를 들어, scFv)를 포함한다. "가변 영역 링커"는 중쇄 면역글로불린 가변 영역 (VH)을 경쇄 면역글로불린 가변 영역 (VL)에 연결하거나, TCR Vα/β 및 Cα/β 사슬 (예를 들어, Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ)을 연결하거나, 각 Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ 쌍을 힌지 또는 소수성 도메인에 연결시켜 두 서브 결합 도메인의 상호작용에 충분한 스페이서 기능과 유연성을 제공하여 생성된 단쇄 폴리펩티드가 항체 또는 TCR과 동일한 표적 분자에 대해 특이적인 결합 친화도를 보유하도록 하는 5 아미노산 내지 약 35 아미노산 서열을 지칭한다.
특정 구체예에서, 가변 영역 링커는 약 10개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산 또는 약 15개의 아미노산 내지 약 25개의 아미노산을 포함한다. 특정 구체예에서, 가변 영역 링커 펩티드는 1 내지 10개의 GlyxSery 반복체 (여기서 x 및 y는 독립적으로 0 내지 10의 정수이되, 단 x 및 y가 모두 0은 아님) (예: Gly4Ser), Gly3Ser, Gly2Ser, 또는 (Gly3Ser)n(Gly4Ser)1, (Gly3Ser)n(Gly2Ser)n, (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n, 또는 (Gly4Ser)n (여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 정수이고, 연결된 가변 영역은 기능성 면역글로불린 유사 결합 도메인 (예: scFv 또는 scTCR)을 형성한다)를 포함한다.
예시적인 결합 도메인은 단쇄 항체 가변 영역 (예를 들어, 도메인 항체, sFv, scFv 또는 Fab), 단쇄 TCR (scTCR)과 같은 TCR의 항원 결합 영역, 또는 생물학적 분자에 결합하기 위한 특이적 능력에 대해 선택된 합성 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된 "특이적으로 결합하는"은 샘플 내 임의의 다른 분자 또는 성분과 유의적으로 연합 또는 통합되지 않고 105 M-1과 같거나 이보다 큰 친화도 또는 Ka (즉, 1/M을 단위로 하는 특정 결합 상호작용의 평형 연합 상수)로 표적 분자에 결합 도메인 또는 그의 융합 단백질이 연합 또는 통합하는 것을 지칭한다. 결합 도메인 (또는 그의 융합 단백질)은 "고친화성" 결합 도메인 (또는 그의 융합 단백질) 또는 "저친화성" 결합 도메인 (또는 그의 융합 단백질)으로 분류될 수 있다. "고친화성" 결합 도메인 (또는 그의 융합 단백질)이란 적어도 107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 또는 적어도 1013 M-1의 Ka를 갖는 결합 도메인 (또는 그의 융합 단백질)을 지칭한다. "저친화성" 결합 도메인 (또는 그의 융합 단백질)이란 최대 107 M-1, 최대 106 M-1, 최대 105 M-1의 Ka를 갖는 결합 도메인 (또는 그의 융합 단백질)을 지칭한다.
대안적으로, 친화도는 M을 단위로 하는 특정 결합 상호작용의 평형 해리상수 (Kd)로 정의될 수 있다 (예를 들어, 10-5 M 내지 10-13 M). 특정 구체예에서, 결합 도메인은 "강화된 친화도"를 가질 수 있으며, 이는 야생형 (또는 모) 결합 도메인보다 표적 항원에 대해 더 강한 결합을 갖도록 선택 또는 조작된 결합 도메인을 지칭한다. 예를 들어, 강화된 친화도는 야생형 결합 도메인의 것보다 큰 표적 항원에 대한 Ka (평형 결합 상수), 야생형 결합 도메인의 것보다 작은 표적 항원에 대한 Kd (해리 상수), 또는 야생형 결합 도메인의 것보다 작은 표적 항원에 대한 오프-레이트 (off-rate, Koff)에 기인할 수 있다. 결합 도메인 또는 융합 단백질 친화도를 결정하는 것 뿐만 아니라 특정 표적에 특이적으로 결합하는 본 발명의 결합 도메인을 동정하기 위한 다양한 어세이, 예컨대 웨스턴 블롯, ELISA 및 Biacore® 분석이 알려져 있다 (예를 들어, Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; 및 미국 특허 제5,283,173호, 5,468,614호, 또는 등가물 참조).
단백질의 3차 구조를 분석하기 위한 결합 도메인의 1차 및 2차 아미노산 구조의 분석 또는 컴퓨터 모델링은 구조를 크게 변경시키지 않고 치환, 첨가 또는 결실일 수 있는 특정 아미노산 잔기를 확인하는데 도움을 줄 수 있으며 그 결과 잠재적으로 결합 도메인의 결합 특이성 및 친화도를 현저히 감소시킬 수 있다.
특정 구체예에서, 결합 도메인은 VH 영역을 포함한다. 예를 들어, 본원의 결합 도메인에서 VH 영역은 공지된 모노클로날 항체의 VH로부터 유래될 수 있거나 또는 이를 기반으로 할 수 있고, 공지된 모노클로날 항체의 VH와 비교할 때 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)의 삽입, 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)의 결실, 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)의 아미노산 치환 (예를 들면, 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환), 또는 상기한 변화의 조합을 포함할 수 있다. 삽입, 결실 또는 치환은 영역의 아미노-말단, 카복시-말단, 또는 양 말단을 포함하여 VH 영역의 임의의 위치에 있을 수 있되, 단 각 CDR은 공지된 모노클로날 항체의 VH 영역의 CDR에서 0개의 변화 또는 최대 1개, 2개, 3개 또는 4개의 변화를 포함하며, 변형된 VH 영역을 함유하는 결합 도메인은 야생형 결합 도메인과 유사한 친화도로 그의 표적에 특이적으로 결합한다.
특정 구체예에서, 결합 도메인은 VL 영역을 포함한다. 예를 들어, 본원의 결합 도메인에서 VL 영역은 공지된 모노클로날 항체의 VL로부터 유래될 수 있거나 또는 이를 기반으로 할 수 있고, 공지된 모노클로날 항체의 VL과 비교할 때 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)의 삽입, 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)의 결실, 하나 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)의 아미노산 치환 (예를 들면, 보존적 아미노산 치환 또는 비보존적 아미노산 치환), 또는 상기한 변화의 조합을 포함할 수 있다. 삽입, 결실 또는 치환은 영역의 아미노-말단, 카복시-말단, 또는 양 말단을 포함하여 VL 영역의 임의의 위치에 있을 수 있되, 단 각 CDR은 공지된 모노클로날 항체의 VL 영역의 CDR에서 0개의 변화 또는 최대 1개, 2개, 3개 또는 4개의 변화를 포함하며, 변형된 VL 영역을 함유하는 결합 도메인은 야생형 결합 도메인과 유사한 친화도로 그의 표적에 특이적으로 결합한다.
특정 구체예에서, 결합 도메인은 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열, 예를 들어 1.5.3 (서열 번호 1), 1F5 (서열 번호 3), Leu16 (서열 번호 2), 리툭시맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 우블리툭시맙 또는 오클레리주맙으로부터의 VL과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 구체예에서, 결합 도메인은 중쇄 가변 영역 (VH)의 아미노산 서열, 예를 들어 11.5.3 (서열 번호 4), 1F5 (서열 번호 6), Leu16 (서열 번호 5), 리툭시맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 우블리툭시맙 또는 오클레리주맙으로부터의 VH와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 결합 도메인은 (a) VL의 아미노산 서열, 예를 들어 1.5.3 (서열 번호 1), 1F5 (서열 번호 3), Leu16 (서열 번호 2), 리툭시맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 우블리툭시맙 또는 오클레리주맙으로부터의 VL과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 아미노산 서열; 및 (b) VH의 아미노산 서열, 예를 들어 11.5.3 (서열 번호 4), 1F5 (서열 번호 6), Leu16 (서열 번호 5), 리툭시맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 우블리툭시맙 또는 오클레리주맙으로부터의 VH와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 전술한 임의의 구체예에서, VL, VH 또는 양자의 각 CDR은 CD20에 특이적으로 결합하는 모 모노클로날 항체 또는 그의 단편 또는 유도체와 비교하여 0개 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 변화를 포함하되, 변형된 VL, VH 또는 양 영역을 함유하는 결합 도메인은 야생형 결합 도메인과 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다.
특정 구체예에서, 결합 도메인은 scFv의 아미노산 서열, 예를 들어 1.5.3 (서열 번호 64), 1F5 (서열 번호 66), Leu16 (서열 번호 65), 리툭시맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 우블리툭시맙 또는 오클레리주맙으로부터의 scFv과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 scFv의 각 CDR은 CD20에 특이적으로 결합하는 모 모노클로날 항체 또는 그의 단편 또는 유도체의 상응하는 CD20과 비교하여 0개 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 변화를 포함하되, 하나 이상의 변형된 CDR을 함유하는 scFv는 야생형 scFv 또는 상응하는 항체와 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다.
특정 구체예에서, 결합 도메인은 경쇄 가변 영역 (VL)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 1.5.3 (서열 번호 70), 1F5 (서열 번호 72), Leu16 (서열 번호 71), 리툭시맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 우블리툭시맙 또는 오클레리주맙으로부터의 VL-코딩 폴리뉴클레오티드와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
추가의 구체예에서, 결합 도메인은 중쇄 가변 영역 (VH)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 1.5.3 (서열 번호 73), 1F5 (서열 번호 75), Leu16 (서열 번호 74), 리툭시맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 우블리툭시맙 또는 오클레리주맙으로부터의 VH-코딩 폴리뉴클레오티드와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 결합 도메인은 (a) VL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 1.5.3 (서열 번호 70), 1F5 (서열 번호 72), Leu16 (서열 번호 71), 리툭시맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 우블리툭시맙 또는 오클레리주맙으로부터의 VL-코딩 폴리뉴클레오티드와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드; 및 (b) VH을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 1.5.3 (서열 번호 73), 1F5 (서열 번호 75), Leu16 (서열 번호 74), 리툭시맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 우블리툭시맙 또는 오클레리주맙으로부터의 VH-코딩 폴리뉴클레오티드와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 전술한 임의의 구체예에서, VL, VH 또는 양자의 각 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 CD20에 특이적으로 결합하는 모 모노클로날 항체 또는 그의 단편 또는 유도체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여 0개 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 변화를 포함하되, 변형된 VL, VH 또는 양 영역을 함유하는 결합 도메인은 야생형 결합 도메인과 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다.
특정 구체예에서, 결합 도메인은 scFv의 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어 1.5.3 (서열 번호 67), 1F5 (서열 번호 69), Leu16 (서열 번호 68), 리툭시맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 우블리툭시맙 또는 오클레리주맙으로부터의 scFv과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 scFv의 각 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 CD20에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체으로부터의 모 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여 0개 또는 최대 1 내지 6개의 변화를 포함하되, 하나 이상의 변형된 CDR을 함유하는 scFv는 야생형 scFv 또는 상응하는 항체와 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다.
본원에 기재된 임의의 구체예에서, 결합 도메인은 VH, VL, 또는 양자, 우블리툭시맙 (예를 들어, US 2015/0290317 참조), 리툭시맙 (예를 들어, US 2014/0004037 참조), 또는 벨투주맙 (예를 들어, US 8,679,767 참조), 오파투무맙 (예를 들어, US 2009/0169550 참조), 또는 벨투주맙 (예를 들어, US 2009/0169550 참조) 유래일 수 있거나, 이를 기반으로 할 수 있거나, 이를 포함할 수 있거나, 이로 구성될 수 있으며, 상기의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 또한, 본원에 기술된 임의의 방법에서, CD20 결합 분자는 리툭시맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 또는 오클렐리주맙, 우블리툭시맙, 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시의 융합 단백질은 이펙터 도메인을 포함하는 세포 내 성분을 포함한다. 본원에서 사용된 "이펙터 도메인"은 적절한 신호를 수용하는 경우 세포 내의 생물학적 또는 생리학적 반응을 직접 또는 간접적으로 촉진할 수 있는 수용체 또는 융합 단백질의 세포 내 부분 또는 도메인이다. 특정 구체예에서, 이펙터 도메인은 결합 시, 또는 단백질 또는 그의 일부 또는 단백질 복합체가 표적 분자에 직접 결합하는 경우 신호를 수용하는 단백질 또는 단백질 복합체의 일부 또는 그 유래이고, 이펙터 도메인으로부터 신호를 촉발한다. 이펙터 도메인이 공자극 분자에서 발견된 바와 같이 하나 이상의 신호전달 도메인 또는 모티프, 예컨대 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유하는 경우 이펙터 도메인은 세포반응을 직접 촉진할 수 있다. ITAM을 포함하는 공자극 분자 또는 그의 일부는 일반적으로 리간드 결합 후에 T 세포 활성화 신호전달을 개시할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 다른 구체예에서, 이펙터 도메인은 직접적으로 세포 반응을 촉진하는 하나 이상의 다른 단백질과 연합하여 세포 반응을 간접적으로 촉진할 것이다.
특정 구체예에서, 이펙터 도메인은 림프구 수용체 신호전달 도메인 (예: CD3ζ)을 포함하고, 공자극 분자 (예: CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134)) 또는 이들 조합으로부터의 하나 이상의 ITAM을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이펙터 도메인은 세포질 신호전달 단백질과 결합하는 세포질 부분을 포함하며, 세포질 신호전달 단백질은 림프구 수용체 또는 그의 신호전달 도메인, 복수의 ITAM을 포함하는 단백질, 공자극 인자 또는 이들의 임의의 조합이다.
예시적인 이펙터 도메인은 4-1BB (CD137), CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, Wnt, OX40 (CD134), ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 것이다.
특정 구체예에서, 이펙터 도메인은 임의로 나이브 CD28 단백질의 186-187 위치에서 LL→GG 돌연변이를 포함할 수 있는 공자극 분자 CD28로부터의 부분 또는 도메인을 포함한다 (서열 번호 15; 참조: Nguyen et al., Blood 102:4320, 2003). 추가의 구체예에서, 이펙터 도메인은 CD3ζ 또는 그의 기능성 부분 (서열 번호 17) 및 CD28 (서열 번호 15), 4-1BB (서열 번호 16), CD27 또는 OX40과 같은 공자극 분자로부터의 하나 이상의 부분 또는 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질의 이펙터 도메인은 CD3ζ (서열 번호 17) 및 CD28 (서열 번호 15); CD3ζ (서열 번호 17) 및 4-1BB (서열 번호 16); 또는 CD3ζ (서열 번호 17), CD28 (서열 번호 15) 및 4-1BB (서열 번호 16)로부터의 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분을 포함한다.
특정 구체예에서, 이펙터 도메인은 서열 번호 86과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%%, 적어도 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CD3ζ 또는 그의 기능성 부분을 포함한다. 추가의 구체예에서, 이펙터 도메인은 서열 번호 84와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%%, 적어도 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 공자극 분자 CD28로부터의 부분 또는 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이펙터 도메인은 서열 번호 85와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%%, 적어도 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 공자극 분자 4-1BB로부터의 부분 또는 도메인을 포함한다.
본 발명의 세포 외 도메인 및 세포 내 도메인은 소수성 부분에 의해 연결된다. 본원에서 사용되는 "소수성 부분"은 세포막 내에서 열역학적으로 안정한 3차원 구조를 갖는 임의의 아미노산 서열을 의미하며, 일반적으로 길이가 약 15 아미노산 내지 약 30 아미노산 범위이다. 소수성 부분의 구조는 알파 나선, 베타 배럴, 베타 시트, 베타 나선 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 소수성 부분은 세포막에 삽입되거나 세포막에 걸쳐 이어질 수 있는 막관통 단백질의 일부인 공지 막관통 단백질로부터의 "막관통 도메인 (transmembrane domain)"으로 구성된다. 일부 구체예에서, 소수성 부분은 CD4 막관통 도메인, CD8 막관통 도메인, CD28 (예: 서열 번호 14), CD27 막관통 도메인 및 4-1 BB 막관통 도메인과 같은 막관통 도메인이다. 특정 구체예에서, 소수성 부분은 CD28 막관통 도메인 (서열 번호 14)이다. 추가의 구체예에서, 소수성 부분은 서열 번호 83과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%%, 적어도 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CD28 막관통 도메인이다.
본 개시의 융합 단백질은 링커 모듈을 더 포함할 수 있다. "링커 모듈"은 링커에 의해 연결된 2개의 영역, 도메인, 모티프, 단편 또는 모듈 사이의 구조 이동을 위한 유연성 및 공간을 제공할 수 있는 약 2 아미노산 내지 약 500 아미노산을 갖는 아미노산 서열일 수 있다. 특정 구체예에서, 링커 모듈은 결합 도메인과 소수성 영역 사이에 위치할 수 있다. 이러한 구체예에서, 링커 모듈은 적절한 세포/세포 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 하기 위해 결합 표면을 세포 표면으로부터 멀리 위치시킬 수 있다 (Patel et al., Gene Therapy 6: 412-419, 1999). 링커 모듈 길이는 선택된 표적 분자, 선택된 결합 에피토프 또는 항원 결합 도메인 크기 및 친화력에 기초해 종양 인식을 최대화하도록 변경될 수 있다 (예를 들어, Guest et al., J. Immunother.28: 203-11, 2005; PCT 공개 번호 WO 2014/031687 참조). 예시적인 링커 모듈은 1 내지 10개의 GlyxSery 반복체 (여기서 x 및 y는 독립적으로 0 내지 10의 정수이되, 단 x 및 y가 모두 0은 아님) (예: Gly4Ser)2, (Gly3Ser)2, Gly2Ser, 또는 이들의 조합, 예컨대 (Gly3Ser)2Gly2Ser)를 가지는 글리신-세린 (Gly-Ser) 링커를 갖는 것들을 포함한다. 특정 구체예에서, 링커 모듈은 CH3 단독 또는 CH2CH3 구조, CH3CH4 구조, 면역글로불린 힌지 또는 이들의 임의의 조합 (예를 들어, 힌지와 함께 CH2CH3 구조)과 같은 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함한다. 추가의 구체예에서, 링커 모듈은 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 또는 이들의 조합으로부터 선택된 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다 (예를 들어, PCT 공개 공보 WO 2014/031687 참조).
예시적인 링커 모듈의 길이는 예를 들어, 약 5 아미노산 내지 약 500 아미노산, 약 10 아미노산 내지 약 350 아미노산, 약 15 아미노산 내지 약 100 아미노산, 약 20 아미노산 내지 약 75 아미노산, 또는 약 25 아미노산 내지 약 35 아미노산이다. 추가 구체예에서, 링커 모듈은 힌지 영역, 태그 또는 이 둘 다를 더 포함할 수 있다. 링커 모듈의 이러한 각 구성 요소는 상호 배타적이지 않다.
특정 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질의 링커 모듈은 N297Q 돌연변이 (서열 번호 10)를 갖는 IgG1 CH2 영역; IgG4 CH2 영역 (서열 번호 11); IgG1 CH3 영역 (서열 번호 12); 또는 IgG4 CH3 영역 (서열 번호 13)을 포함한다. 특정 구체예에서, 링커 모듈은 글리신-세린 링커 (서열 번호 89에 의해 코딩될 수 있는 서열 번호 20, 또는 서열 번호 90에 의해 코딩될 수 있는 서열 번호 21)를 포함할 수 있다.
추가의 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질의 링커 모듈은 서열 번호 79와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%%, 적어도 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 N297Q 돌연변이를 갖는 IgG1 CH2 영역을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질의 링커 모듈은 서열 번호 80과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%%, 적어도 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 IgG4 CH2 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질의 링커 모듈은 서열 번호 81과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%%, 적어도 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 IgG1 CH3 영역을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질의 링커 모듈은 서열 번호 82와 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%%, 적어도 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 IgG4 CH3 영역을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 링커 모듈은 힌지 영역을 추가로 포함한다. 본원에 사용된 "힌지 영역" 또는 "힌지"는 (a) 면역글로불린 힌지 서열 (예를 들어, 상부 및 코어 영역으로 이루어짐), 또는 그의 기능성 단편 또는 변이체, (b) 타입 II C-렉틴 도메인간 (스토크) 영역, 또는 그의 기능성 단편 또는 변이체, 또는 (c) 분화 (CD) 분자 스토킹 영역의 클러스터, 또는 그의 기능성 변이체를 지칭한다. 본원에 사용된 "야생형 면역글로불린 힌지 영역"은 항체의 중쇄에서 발견되는 CH1 및 CH2 도메인 사이에 삽입되어 이를 연결하는 자연 발생 상부 및 중간 힌지 아미노산 서열을 지칭한다. 특정 구체예에서, 힌지 영역은 인간이고, 특정 구체예에서 인간 IgG 힌지 영역을 포함한다. 추가의 구체예에서, 힌지 영역은 PCT 공개 번호 WO 2014/031687에 기재된 바와 같은 변경된 IgG4 힌지 영역이다. 특정 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질의 힌지 영역은 IgG1 힌지 (서열 번호 7)일 수 있다. 관련 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질의 힌지 영역은 서열 번호 76에 제시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 IgG1 힌지일 수 있다.
본 개시의 융합 단백질은 연접 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. "연접 아미노산" 또는 "연접 아미노산 잔기"는 단백질의 2개의 인접한 도메인, 모티프, 영역, 모듈 또는 단편 사이, 예컨대 결합 도메인과 인접한 링커 모듈 영역 사이, 소수성 도메인과 인접한 이펙터 도메인 사이, 또는 2개의 도메인, 모티프, 영역, 모듈 또는 단편을 연결하는 링커 모듈의 한쪽 또는 양 단부 사이 (예를 들어 링커 모듈과 인접한 결합 도메인 사이, 또는 링커 모듈과 인접한 힌지 사이)의 하나 이상의 (예를 들어, 약 2 내지 20개의) 아미노산 잔기를 지칭한다. 연접 아미노산은 융합 단백질의 구조 설계 (예를 들어, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 작제 중에 제한 효소 부위의 사용으로 인한 아미노산 잔기)로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질의 소수성 부분은 아미노 말단 단부, 카복시 말단 단부 또는 둘 모두에 하나 이상의 연접 아미노산을 가질 수 있다. 연접 아미노산의 예는 IgG2로부터의 연접 아미노산 (예를 들어, 서열 번호 78에 의해 코딩될 수 있는 서열 번호 9)을 포함한다. 힌지 영역이 IgG4로부터 유래된 일부 구체예에서, 힌지 영역은 연접 아미노산 (예를 들어, 서열 번호 77에 의해 코딩될 수 있는 서열 번호 8)을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 소수성 부분은 서열 번호 14의 아미노산을 갖는 CD28 막관통 도메인이며, 여기서 CD28 막관통 도메인은 예를 들어 메티오닌의 아미노 말단 연접 아미노산을 포함한다 (예를 들어, 서열 번호 30, 31, 39 및 40의 융합 단백질 참조). 따라서, 특정 구체예에서, 링커 모듈은 IgG4 힌지, IgG4 연접 아미노산 및 IgG4 CH2-CH3를 포함한다. 특정 다른 구체예에서, 링커 모듈은 IgG1 힌지, IgG2 연접 아미노산 및 IgG1 CH2-CH3를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질은 태그를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "태그"는 이종 또는 비-내인성 동족 결합 분자 (예를 들어, 수용체, 리간드, 항체 또는 항원이 결합된 단백질)가 부착되거나, 융합되거나 특이적으로 결합할 수 있는 당해 단백질의 일부인 특유의 펩티드 서열을 지칭하며, 이때 결합 성질은 특히 태그화된 단백질이 단백질 또는 다른 물질의 이종 집단의 일부인 경우, 또는 태그 단백질을 발현하는 세포가 이종 세포 집단 (예를 들면 말초 혈액과 같은 생물학적 샘플)의 일부인 경우에, 태그화된 단백질 또는 태그화된 단백질을 발현하는 세포를 검출, 식별, 분리 또는 정제, 추적, 농축 또는 표적화하는데 사용될 수 있다. (예를 들어 WO 2015/095895 참조). 제공된 융합 단백질에서, 동족 결합 분자(들)에 의해 특이적으로 결합되는 태그(들)의 능력은 표적 분자(들)에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 도메인(들)의 능력과 별개이거나, 또는 이에 추가된다. 일반적으로 태그는 항원-결합 분자가 아니며, 예를 들어 항체 또는 TCR 또는 그의 항원-결합 부분이 아니다. 태그의 예로는 Strep 태그, His 태그, Flag 태그, Xpress 태그, Avi 태그, 칼모듈린 태그, 폴리글루타메이트 태그, HA 태그, Myc 태그, Nus 태그, S 태그, X 태그, SBP 태그, Softag, V5 태그, CBP, GST, MBP, GFP, 티오레독신 태그를 들 수 있다. 특정 구체예에서, Strep 태그는 서열 번호 62 또는 서열 번호 63의 아미노산 서열을 갖는다.
본 개시의 융합 단백질은 신호 펩티드를 포함할 수 있다. "신호 펩티드"는 세포 표면 발현을 위한 융합 단백질을 표적화하는데 사용되는 짧은 (예를 들어, 5 내지 30개의 아미노산) 서열이다. 예시적인 신호 펩티드는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 신호전달 펩티드 (서열 번호 87에 의해 코딩될 수 있는 서열 번호 18) 및 뮤린 카파 신호 펩티드 (서열 번호 88에 의해 코딩될 수 있는 서열 번호 19)를 포함한다.
특정 구체예에서, 융합 단백질은 키메라 항원 수용체이다. "키메라 항원 수용체" (CAR)는 자연 발생하지 않거나 숙주 세포에서 자연 발생하지 않는 방식으로 함께 연결된 2개 이상의 자연 발생 아미노산 서열을 함유하도록 조작된 본 개시의 융합 단백질을 지칭하며, 여기서 융합 단백질은 세포 표면상에 존재하는 경우 수용체로서 기능할 수 있다.
일부 구체예에서, CAR은 완전 인간 또는 인간화된 것이다. 특정 구체예에서, CAR은 항-CD20 항체로부터의 scFv 또는 CD20 항원에 특이적인 TCR로부터의 scTCR을 갖는다. 특정 구체예에서, CAR은 1.5.3, 1F5, Leu16, 리툭시맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 오크렐리주맙, 우블리툭시맙 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 scFv를 포함한다. 특정 구체예에서, CAR은 IgG1 힌지, IgG4 힌지 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 링커 모듈을 포함한다. 추가의 구체예에서, CAR은 N297Q 돌연변이를 가지는 IgG1 CH2 영역, IgG4 CH2 영역, IgG1 CH3 영역, IgG4 CH3 영역 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 링커 모듈을 포함한다. 또 다른 구체예에서, CAR의 소수성 부분은 CD28 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 CD3ζ, 4-1BB, CD28 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 부분 또는 도메인을 포함하는 세포 내 도메인을 포함한다. 상기 임의의 구체예에서, CAR은 2개의 인접한 도메인, 모티프, 영역, 모듈 또는 단편 사이에 연접 아미노산을 포함한다.
특정 구체예에서, CAR은 1.5.3-NQ-28-BB-z (서열 번호 26); 1.5.3-NQ-28-z (서열 번호 27); 1.5.3-NQ-BB-z (서열 번호 28); 1.5.3-NQ-z (서열 번호 29); Leu16-28-BB-z (서열 번호 30); Leu16-28-z (서열 번호 31); 1F5-NQ-28-BB-z (서열 번호 32); 1F5-NQ-28-z (서열 번호 33); 또는 1F5-NQ-BB-z (서열 번호 34)와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일할 수 있다. 특정 구체예에서, CAR은 서열 번호 26 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구체예에서, CAR은 서열 번호 44 내지 52 중 어느 하나의 핵산 분자 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일할 수 있다. 특정 구체예에서, CAR은 서열 번호 44 내지 52 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드로 코딩된다.
CAR을 포함한 융합 단백질의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제 6,410,319호; 미국 특허 제 7,446,191호; 미국 특허 공개 공보 제 2010/065818호; 미국 특허 제 8,822,647호; PCT 공개 번호 WO 2014/031687호; 미국 특허 제 7,514,537호; 및 [Brentjens et al., 2007, Clin. Cancer Res. 13:5426]에 기술되어 있다.
숙주 세포, 핵산 및 벡터
특정 양태에서, 본 개시는 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 원하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 표준 기술을 사용하여 당업계에 공지된 재조합 방법에 의해, 예컨대 원하는 서열 또는 그의 일부를 발현하는 세포로부터의 라이브러리를 스크리닝을 사용하거나, 이를 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 서열을 유도하거나, 또는 서열 또는 그의 일부를이를 함유하는 세포 또는 조직으로부터 직접 분리시킴으로써 수득하거나 생성할 수 있다. 대안으로, 관심 서열은 합성적으로 생성될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 관심 숙주 세포 (예를 들어, T 세포와 같은 면역 세포) 내로 도입하기 위해 적절한 벡터 (예를 들면 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 플라스미드 벡터) 내로 삽입될 수 있다.
"벡터"는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자이다. 일부 구체예에서, 벡터는 전사 또는 번역 터미네이터, 개시 서열, 또는 원하는 핵산 서열의 발현 조절을 위한 프로모터를 함유한다. 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 파지, 또는 트랜스포존 시스템일 수 있다 (예: Sleeping Beauty, 예를 들어, Geurts et al., Mol. Ther. 8:108, 2003; Mates et al., Nat. Genet. 41:753, 2009 참조). "발현 벡터"는 적절한 환경에 존재하는 경우 벡터에 의해 운반되는 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 지시할 수 있는 벡터이다.
코어 바이러스를 코딩하는 벡터는 본원에서 "바이러스 벡터"라 칭한다. 인간 유전자 치료 용도 (Pfeifer and Verma, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177, 2001 참조)에 대해 확인된 것을 포함하여, 본 개시의 조성물과 함께 사용하기에 적합한 다수의 이용 가능한 바이러스 벡터가 있다. 적합한 바이러스 벡터는 레트로바이러스 유래 벡터와 같은 RNA 바이러스에 기초한 벡터를 포함한다.
"레트로바이러스"는 역전사 효소를 사용하여 DNA로 역전사된 뒤에 역전사된 DNA가 숙주 세포 게놈에 통합된 RNA 게놈을 갖는 바이러스이다. "감마레트로바이러스"는 레트로바이러스과 (retroviridae)의 속 (genus)을 지칭한다. 감마레트로바이러스의 예로는 마우스 줄기 세포 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 고양이과 백혈병 바이러스, 고양이과 육종 바이러스 및 조류 세망내피증 바이러스가 있다. "렌티바이러스"는 분할 및 비분할 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스의 다른 속을 지칭한다. 렌티바이러스의 몇 가지 예는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV; HIV 1형 및 HIV 2형 포함); 말 감염성 빈혈 바이러스; 고양이과 면역결핍 바이러스 (FIV); 소 면역 결핍 바이러스 (BIV); 및 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV)를 포함한다.
특정 구체예에서, 바이러스 벡터는 감마레트로바이러스, 예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 유래 벡터일 수 있다. 다른 구체예에서, 바이러스 벡터는 보다 복잡한 레트로바이러스 유래 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 유래 벡터일 수 있다. HIV-1 유래 벡터가 이 범주에 속한다. 다른 예는 HIV-2, FIV, 말 감염성 빈혈 바이러스, SIV 및 메디-비스나 (Maedi-Visna) 바이러스 (양 렌티바이러스)로부터 유래된 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 포유류 숙주 세포를 CAR 트랜스진을 함유하는 바이러스 입자로 형질도입시키기 위한 레트로바이러스 및 렌티바이러스 바이러스 벡터의 사용 방법 및 세포 패키징은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 이전에 미국 특허 제 8,119,772호; Walchli et al., PLoS One 6:327930, 2011; Zhao et al., J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003; Frecha et al., Mol. Ther. 18:1748, 2010; Verhoeyen et al., Methods Mol. Biol. 506:97, 2009에서 설명되었다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 작제물 및 발현 시스템은 또한 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어 아데노바이러스-기반 벡터 및 아데노-관련 바이러스 (AAV)-기반 벡터를 포함하는 DNA 바이러스 벡터; 앰플리콘 백터, 복제 결함 HSV 및 약독화된 HSV를 포함한 단순 포진 바이러스 (HSV)로부터 유래된 벡터를 비롯한 다른 바이러스 벡터가 또한 폴리뉴클레오티드 전달을 위해 사용될 수 있다 (Krisky et al., Gene Ther. 5: 1517, 1998).
유전자 치료 용도로 최근 개발된 다른 벡터도 본 개시의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 이러한 벡터로는 바큘로바이러스 및 α-바이러스로부터 유래된 것들 (Jolly, D J. 1999. Emerging Viral Vectors. pp 209-40 in Friedmann T. ed. The Development of Human Gene Therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab), 또는 플라스미드 벡터 (예: 슬리핑 뷰티 또는 다른 트랜스포존 벡터)가 포함된다.
특정 구체예에서, 바이러스 벡터는 CD20과 같은 표적에 특이적인 융합 단백질을 코딩하는 비-내인성 폴리뉴클레오티드를 도입하는데 사용된다. 이러한 구체예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 또한 형질도입을 위한 마커를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터에 대한 형질도입 마커는 당업계에 공지되어 있으며 약물 내성을 부여할 수 있는 선택 마커, 유동 세포계수법과 같은 방법으로 검출할 수 있는 형광 마커 또는 세포 표면 단백질과 같은 검출 가능한 마커를 포함한다.
특정 구체예에서, 바이러스 벡터는 형질도입 마커를 포함한다. 본원에서 사용된 "형질도입 마커"는 형질감염 효율을 모니터링하거나 관심있는 융합 단백질을 발현하는 세포를 검출하기 위한 방식으로서 임의의 작제물에 포함될 수 있다. 예시적인 형질도입 마커는 녹색 형광 단백질, 인간 CD2의 세포 외 도메인, 절단된 인간 EGFR (huEGFRt; 서열 번호 94에 의해 코딩될 수 있는 서열 번호 25; Wang et al., Blood 118: 1255, 2011 참조) 또는 절단된 CD19 (서열 번호 93에 의해 코딩될 수 있는 서열 번호 24)를 포함한다. 특정 구체예에서, 바이러스 벡터는 iCasp9와 같은 자살 유전자 (예를 들어, Gargett and Brown, Front. Pharmacol.5: 235, 2104 참조) 또는 HSV-TK (예를 들어, Fillat et al., Curr, Gene Ther 3:13, 2003)를 포함한다.
바이러스 벡터 게놈이 숙주 세포에서 별도의 전사물로서 발현되는 다수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 바이러스 벡터는 또한 바이시스트론 또는 멀티시스트론 발현을 허용하는 2개 (또는 초과)의 전사물 사이에 추가 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터에 사용되는 이러한 서열의 예로는 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 푸린 (furin) 절단 부위, 바이러스 2A 펩티드, 또는 이들의 임의 조합을 들 수 있다. 특정 구체예에서, 벡터 작제물은 성숙한 융합 단백질이 형질도입 마커 또는 자살 유전자를 함유하지 않도록 하기 위해 자가 절단 펩티드 (예를 들어, E2A (서열 번호 91에 의해 코딩될 수 있는 서열 번호 22), T2A (서열 번호 92에 의해 코딩될 수 있는 서열 번호 23), P2A (서열 번호 97에 의해 코딩될 수 있는 서열 번호 95), 또는 F2A (서열 번호 98에 의해 코딩될 수 있는 서열 번호 96)을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 핵산 벡터는 임의로 형질도입 마커 (tCD19 또는 tEGFR)를 함유하는 본 개시의 융합 펩티드를 코딩할 수 있다. 추가의 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 T 세포와 같은 특정 세포형에서 발현을 증진시키거나 최대화하기 위해 코돈 최적화될 수 있으며 (Scholten et al., Clin.Immunol.19: 135-145, 2006), 임의로 형질도입 마커 (예컨대 tCD19 또는 tEGFR)를 함유할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 또한 제거 또는 사멸에 대한 형질도입 마커를 발현하는 숙주 세포를 표적화하는데 사용될 수 있는 형질도입 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 기능성 항원-표적 CAR T 세포의 지속성은 내인성으로 항원을 발현하는 건강한 세포의 지속적인 고갈을 유발할 수 있음이 밝혀졌다 (예를 들어, Paskiewicz et al., J. Clin. Invest., 126(11):4262-4272 (2016 참조). 따라서, 바람직한 항종양 효과를 달성한 후에 전달된 T 세포의 조절 (예를 들면, 제거, 살상 또는 또 다른 세포독성 효과의 생성)을 허용하는 조절 기전이 바람직하다. 본원에서 사용된 용어 "세포독성 효과"는 세포의 성장, 분열 또는 생존 능력을 제거하거나, 살상시키거나, 또는 다르게는 손상시키거나, 감소시키는 것을 포함한다. 세포독성 효과의 비제한적인 예는 괴사, 용해, 세포자멸사, 팽윤, 막 완전성의 상실, 전사의 수준 또는 비율 감소, 번역 수준 또는 비율 감소, ATP 생산의 수준 또는 비율 감소, 활성 산소 종의 수준 또는 비율 증가, 미토콘드리아 기능 감소, 핵 응축, 세포 DNA의 분열 증가, 분열 또는 증식 속도 감소, 및 특정 세포 기능 (예를 들어, B 림프구가 면역글로불린을 생성하는 능력)의 감소 또는 손실을 포함한다. 하나의 예시적인 접근법은 마커에 결합시 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 반응을 촉진하거나, 세포독성 분자를 전달하거나, 전이된 T 세포에 세포독성 효과를 제거하거나, 빼앗거나, 또는 다르게 일으키는 항체 (예를 들어, 세툭시맙) 또는 항체-약물 접합체에 의해 인식가능한 마커 (예: tEGFR)를 사용하는 것이다. 따라서, 특정 구체예에서, 벡터는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 형질도입 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 세포독성 항체, 항체-약물 접합체 또는 다른 세포독성제에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 형질도입 마커는 본원에서 "자살 형질도입 마커"로 지칭된다. 특정 구체예에서, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법은 치료적 유효량의 형질전환된 숙주 세포를 본 개시에 따른 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 형질전환된 숙주 세포는 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 및 자살 형질도입 마커를 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 상기 방법은 임의로 상기 자살 형질도입 마커와 결합하거나 또는 상기 자살 형질도입 마커와 복합체를 형성하는 세포독성 항체, 항체-약물 접합체 또는 다른 세포독성제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 자살 형질도입 마커는 예를 들어 세툭시맙과 같은 항-EGFR 항체에 의해 특이적으로 결합되는 절단된 EGFR (예: 서열 번호 25)을 포함하거나 그로 구성된다. 추가의 구체예에서, 자살 전달 마커는 세포독성 항-CD19 항체 또는 항체-약물 접합체, 예를 들어, 블리나투모맙, 콜툭시맙라브탄신, MOR208, MEDI-551, 데닌투주맙마포도틴, Merck 모 항-CD19, 타플루투모맙팝톡스, XmAb 5871, MDX-1342, SAR3419, SGN-19A, 또는 AFM11에 의해 특이적으로 결합된 절단된 CD19 (예: 서열 번호 24)를 포함하거나 그로 구성된다 (예를 들어, Naddafi and Davami, Int. J. Mol. Cell. Med., 4(3):143-151 (2015) 참조).
본원에 기술된 임의의 구체예에서, 본 개시의 코딩된 융합 단백질은 CD20 특이적 CAR와 같은 CAR일 수 있다. 특정 구체예에서, 본 개시의 벡터에 함유된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 CAR 또는 그의 결합 도메인은 완전 인간 또는 인간화된 것이다. 추가의 구체예에서, 본원의 벡터에 의해 코딩되는 CAR은 항-CD20 항체로부터의 scFv 또는 CD20 항원에 특이적인 TCR로부터의 scTCR을 갖는다. 또 다른 구체예에서, 본 개시의 벡터에 의해 코딩된 CAR은 1.5.3, 1F5, Leu16, 리툭시맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 오클렐리주맙, 우블리툭시맙 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 scFv를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 개시의 벡터에 함유된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 CAR은 IgG1 힌지, IgG4 힌지 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 링커 모듈을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 개시의 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 CAR은 N297Q 돌연변이를 갖는 IgG1 CH2 영역, IgG4 CH2 영역, IgG1 CH3 영역, IgG4 CH3 영역, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 링커 모듈을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 개시의 벡터에 의해 코딩된 CAR의 링커 모듈 또는 가변 영역 링커는 글리신-세린 링커를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본원의 벡터에 함유된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 CAR의 소수성 부분은 CD28 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 개시의 벡터에 함유된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 CAR은 CD3ζ, 4-1BB, CD28 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 부분 또는 도메인을 포함하는 세포 내 도메인을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 구체예에서, 본 개시의 벡터에 함유된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 CAR은 인접한 도메인, 모티프, 영역, 모듈 또는 단편 간의 연접 아미노산을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 구체예에서, 벡터는 1.5.3-NQ-28-BB-z (서열 번호 26); 1.5.3-NQ-28-z (서열 번호 27); 1.5.3-NQ-BB-z (서열 번호 28); 1.5.3-NQ-z (서열 번호 29); Leu16-28-BB-z (서열 번호 30); Leu16-28-z (서열 번호 31); 1F5-NQ-28-BB-z (서열 번호 32); 1F5-NQ-28-z (서열 번호 33); 또는 1F5-NQ-BB-z (서열 번호 34)와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 구체예에서, 벡터는 서열 번호 26 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, CD20-특이적 CAR은 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 44 내지 52 중 어느 하나의 핵산 분자 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일하다. 관련 구체예에서, CD20-특이적 CAR은 서열 번호 44 내지 52 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
임의로, 본 개시의 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 본 개시의 임의의 벡터는 또한 형질도입 마커 및 CAR이 분리된 분자 - CAR 및 형질도입 마커로 분리되도록 자가 분해 펩티드를 또한 포함할 수 있는 형질도입 마커 (예: tCD19)를 코딩할 수 있다. 특정 구체예에서, 벡터는 CD20-특이적 CAR 및 tCD19 형질도입 마커 사이에 배치된 자가 절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 이 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 53 내지 61 중 어느 하나의 핵산 분자 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일하다. 추가의 구체예에서, 벡터는 서열 번호 53 내지 61 중 어느 하나의 핵산 분자 서열을 포함하거나 그로 구성되고 CD20-특이적 CAR 및 tCD19 형질도입 마커 사이에 배치된 자가 절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 구체예에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 융합 단백질을 코딩하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 (a) 서열 번호 53 내지 56 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 동일하거나; (b) 서열 번호 44 내지 47 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 동일하거나; (c) 서열 번호 53 내지 56 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되어 있거나; (d) 서열 번호 44 내지 47 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나; (e) 서열 번호 53 내지 56 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어져 있거나; 또는 (f) 서열 번호 44 내지 47 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
본원에 개시된 임의의 구체예에서, 융합 단백질은 본원에 개시된 바와 같은 단리된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 특정 구체예에서, 융합 단백질은 융합 단백질이 (a) 성숙한 융합 단백질과 적어도 90% 동일하고, 성숙한 융합 단백질은 tCD19 형질도입 마커가 제거된 서열 번호 26 내지 29 및 35 내지 38 및 32 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며; (b) 성숙한 융합 단백질로 구성되어 있으며, 여기서 성숙한 융합 단백질은 tCD19 형질도입 마커가 제거된 서열 번호 35 내지 38 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며; (c) 성숙한 융합 단백질로 이루어지며, 여기서 성숙한 융합 단백질은 tCD19 형질도입 마커가 제거된 서열 번호 35 내지 38 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며; (d) 서열 번호 26 내지 29 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고; (e) 서열 번호 26 내지 29 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되어 있고; (f) 서열 번호 26 내지 29 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구체예에서, 본원에 개시된 바와 같은 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고 이종 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 융합 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포가 제공된다.
본원에 개시된 임의의 구체예에서, 숙주 세포는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 융합 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 (a) 서열 번호 53 내지 56 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 동일하고; (b) 서열 번호 44 내지 47 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 동일하고; (c) 서열 번호 53 내지 56 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고; (d) 서열 번호 44 내지 47 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고; (e) 서열 번호 53 내지 56 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지고; 또는 (f) 서열 번호 44 내지 47 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
특정 구체예에서, 숙주 세포는 융합 단백질이 (a) 성숙한 융합 단백질과 적어도 90% 동일하고, 성숙한 융합 단백질은 tCD19 형질도입 마커가 제거된 서열 번호 26 내지 29 및 35 내지 38 및 32 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며; (b) 성숙한 융합 단백질로 구성되어 있으며, 여기서 성숙한 융합 단백질은 tCD19 형질도입 마커가 제거된 서열 번호 35 내지 38 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며; (c) 성숙한 융합 단백질로 이루어지며, 여기서 성숙한 융합 단백질은 tCD19 형질도입 마커가 제거된 서열 번호 35 내지 38 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며; (d) 서열 번호 26 내지 29 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고; (e) 서열 번호 26 및 29 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되어 있고; (f) 서열 번호 26 내지 29 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
특정 구체예에서, 숙주 세포는 본원에 개시된 바와 같은 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이종 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 융합 단백질을 발현할 수 있다.
특정 구체예에서, 숙주 세포는 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 결합 도메인은 (a) 서열 번호 64의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 1.5.3 scFv (여기서, scFv의 각 CDR은 CD20에 특이적으로 결합하는 모 모노클로날 항체 또는 그의 단편 또는 유도체의 상응하는 CDR과 비교하여 0 변화 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 변화를 포함하되, 하나 이상의 변형된 CDR을 함유하는 scFv는 야생형 scFv 또는 상응하는 항체와 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다); (b) 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 1.5.3 scFv; (c) 서열 번호 66의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 1F5 scFv (여기서, scFv의 각 CDR은 CD20에 특이적으로 결합하는 모 모노클로날 항체 또는 그의 단편 또는 유도체의 상응하는 CDR과 비교하여 0 변화 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 변화를 포함하되, 하나 이상의 변형된 CDR을 함유하는 scFv는 야생형 scFv 또는 상응하는 항체와 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다); (d) 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 1F5 scFv; (e) 서열 번호 65의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Leu16 scFv (여기서, scFv의 각 CDR은 CD20에 특이적으로 결합하는 모 모노클로날 항체 또는 그의 단편 또는 유도체의 상응하는 CDR과 비교하여 0 변화 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 변화를 포함하되, 하나 이상의 변형된 CDR을 함유하는 scFv는 야생형 scFv 또는 상응하는 항체와 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다); 또는 (f) 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 Leu16 scFv이다.
특정 구체예에서, 숙주 세포는 scFv를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 scFv는 (a) 서열 번호 67의 핵산 분자 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 (여기서, scFv의 각 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 CD20에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체로부터의 모 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여 0 변화 또는 최대 1 내지 6 폴리뉴클레오티드 변화를 포함하되, 하나 이상의 변형된 CDR을 함유하는 scFv는 야생형 scFv 또는 상응하는 항체와 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다); (b) 서열 번호 67의 핵산 분자 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드; (c) 서열 번호 69의 핵산 분자 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 (여기서, scFv의 각 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 CD20에 특이적으로 결합하는 모노클로날 랑체로부터의 모 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여 0 변화 또는 최대 1 내지 6 폴리뉴클레오티드 변화를 포함하되, 하나 이상의 변형된 CDR을 함유하는 scFv는 야생형 scFv 또는 상응하는 항체와 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다); (d) 서열 번호 69의 핵산 분자 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드; (e) 서열 번호 68의 핵산 분자 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 (여기서, scFv의 각 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 CD20에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체로부터의 모 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여 0 변화 또는 최대 1 내지 6 폴리뉴클레오티드 변화를 포함하되, 하나 이상의 변형된 CDR을 함유하는 scFv는 야생형 scFv 또는 상응하는 항체와 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다); 또는 (f) 서열 번호 68의 핵산 분자 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
특정 구체예에서, 숙주 세포는 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 융합 단백질은 키메라 항원 수용체이고, 서열 번호 26 내지 3443 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구체예에서, 숙주 세포는 소수성 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 소수성 부분은 막관통 도메인이다. 특정 구체예에서, 소수성 부분은 CD4, CD8, CD28 또는 CD27 막관통 도메인이다.
특정 구체예에서, 숙주 세포는 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분은 4-1BB (CD137), CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, OX40 (CD134), ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2, 또는 이들의 임의의 조합이다.
특정 구체예에서, 숙주 세포는 세포 내 성분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 세포 내 성분은 (a) CD3ζ 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분, CD28 공자극 도메인 또는 그의 기능성 부분 및 4- 1BB (CD137) 공자극 도메인 또는 그의 부분; (b) CD3ζ 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분, CD28 공자극 도메인 또는 그의 기능성 부분 및 OX40 (CD134) 공자극 도메인 또는 그의 부분; (c) CD3ζ 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분, CD27 공자극 도메인 또는 그의 기능성 부분 및 4-1BB (CD137) 공자극 도메인 또는 그의 부분; (d) CD3ζ 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분, CD27 공자극 도메인 또는 그의 기능성 부분 및 OX40 (CD134) 공자극 도메인 또는 그의 부분; (e) CD3ζ 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분, CD27 공자극 도메인 또는 그의 기능성 부분 및 CD28 공자극 도메인 또는 그의 부분; 또는 (f) CD3ζ 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분, 4-1BB (CD137) 공자극 도메인 또는 그의 기능성 부분 및 OX40 (CD134) 공자극 도메인 또는 그의 부분을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질을 함유하는 벡터는 숙주 세포 내로 형질도입된다. "형질도입"은 숙주 세포 내로 핵산 분자 (예를 들어, 본 개시의 융합 단백질을 코딩하는 벡터)의 도입을 의미한다. 형질도입 후, 숙주 세포는 염색체 외적으로 벡터를 운반하거나 염색체에 통합될 수 있다. 숙주 세포 게놈 또는 자기 복제 벡터에 통합되면 일반적으로 형질전환된 벡터의 유전적으로 안정한 유전으로 이어진다. 임의의 적합한 형질도입 방법을 이용할 수 있다. 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다. 형질전환된 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포는 "조작된", "재조합된" 또는 "비천연적인" 것으로 언급된다.
특정 구체예에서, 대상으로부터 수득된 T 세포와 같은 세포는 본원에 기술된 바와 같은 세포 표면에 위치하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 도입함으로써 조작된, 비천연 또는 재조합 세포 (예를 들어, 조작된, 비천연 또는 재조합 T 세포)로 전환될 수 있으며, 여기서 세포는 융합 단백질을 발현한다.
특정 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질을 발현하기 위해 형질감염된 숙주 세포는 바이러스 특이적 T 세포, 종양 항원 특이적 세포독성 T 세포, 나이브 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 중추 또는 이펙터 기억 T 세포, γδ T 세포 또는 CD4+ CD25+ 조절 T 세포와 같은 기능성 T 세포이다. 추가의 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 벌크 CD8+ T 세포, 나이브 CD8+ T 세포, CD8+ TCM 세포, CD8+ TEM 세포, 또는 이들의 임의의 조합으로 도입된다. 또 다른 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 벌크 CD4+ T 세포, 나이브 CD4+ T 세포, CD4+ TCM 세포, CD4+ TEM 세포, 또는 이들의 임의의 조합으로 도입된다. 다른 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 나이브 CD8+ T 세포 및 CD8+ TCM 세포가 풍부한 T 세포 집단에 도입된다. 또 다른 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 나이브 CD4+ T 세포 및 CD4+ TCM 세포가 풍부한 T 세포 집단에 도입된다. 전술한 임의의 구체예에서, T 세포는 조작된 CD20-특이적 TCR, 조작된 CD20-특이적 고친화성 TCR, CD20-특이적 CAR 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 핵산 분자를 추가로 함유한다.
특정 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질 작제물로 T 세포의 확장 및 유전적 변형에 앞서, T 세포원을 대상 (예를 들어 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수, 림프절 조직, 탯줄 혈액, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출액 또는 비장 조직)으로부터 수득하며, T 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 단리된다. 특정 T 세포 서브세트는 공지된 기술에 따라 수집되고, 항체에 대한 친화성 결합, 유세포 계측법 또는 면역자기 선택과 같은 공지된 기술에 의해 농축되거나 고갈될 수 있다. 농축 또는 고갈 단계 및 융합 단백질의 도입 후에, 목적하는 변형된 T 세포의 시험관 내 확장을 당업자에게 자명한 공지된 기술 (미국 특허 제 6,040,177호에 기술된 것을 포함함), 또는 그의 변형에 따라 수행할 수 있다.
예를 들어, 시험관 내에서 배양 배지에 초기 T 세포 집단을 첨가하고 비분할 PBMC와 같은 피더 세포를 배양 배지에 첨가하고 (예를 들어, 생성된 세포 집단은 확장되는 초기 개체군에서 각 T 세포에 대해 적어도 약 5, 10, 20, 또는 40 이상의 PBMC 피더 세포를 함유한다); 배양물을 인큐베이션 (예를 들어, T 세포의 수를 확장시키기에 충분한 시간동안) 함으로써 원하는 T 세포 집단 또는 아집단을 확장시킬 수 있다. 비-분할 피더 세포는 감마 조사 PBMC 피더 세포를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, PBMC는 약 3000 내지 3600 rad 범위의 감마선으로 조사된다. T 세포 및 피더 세포를 배양 배지에 첨가하는 순서는 필요하다면 역전될 수 있다. 배양물은 전형적으로 T 세포의 성장에 적합한 온도 등의 조건하에 인큐베이션될 수 있다. 예를 들어, 인간 T 림프구의 성장을 위해, 온도는 일반적으로 적어도 약 25 ℃, 바람직하게는 적어도 약 30 ℃, 보다 바람직하게는 약 37 ℃일 것이다.
임의로, 확장 방법은 비분할 엡스타인-바 바이러스 (EBV)-형질전환 림프모구성 세포 (LCL)를 피더 세포로서 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000 rad 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. LCL 피더 세포는 초기 T 림프구에 대한 LCL 피더 세포의 비율이 적어도 약 10:1과 같은 임의의 적합한 양으로 제공될 수 있다.
T 림프구를 단리한 후, CD8+ 세포독성 및 CD4+ 헬퍼 T 림프구 양자를 융합 단백질로 유전적으로 변형시키고 확장하기 전에 나이브, 기억 및 이펙터 T 세포 하위 집단으로 분류할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질을 발현하도록 변형된 T 세포는 벌크 T 세포 (예를 들어, 벌크 CD4+ T 세포 또는 벌크 CD8+ T 세포)이거나, 또는 T 세포의 하위 집단, 예를 들어, 중추 기억 T 세포 (예: CD8+ 중추 기억 T 세포) 또는 중추 기억 (TCM)과 나이브 (TN) T 세포의 조합 (예: CD4+ TCM + TN 세포)이다.
본원에 기술된 임의의 구체예에서, 숙주 세포 (예: T 세포)는 1.5.3-NQ-28-BB-z (서열 번호 26); 1.5.3-NQ-28-z (서열 번호 27); 1.5.3-NQ-BB-z (서열 번호 28); 1.5.3-NQ-z (서열 번호 29); Leu16-28-BB-z (서열 번호 30); Leu16-28-z (서열 번호 31); 1F5-NQ-28-BB-z (서열 번호 32); 1F5-NQ-28-z (서열 번호 33); 또는 1F5-NQ-BB-z (서열 번호 34)와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 포함한다. 추가의 구체예에서, 숙주 세포 (예컨대, T 세포)는 서열 번호 26 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 포함한다. 이들 임의의 구체예에서, 숙주 세포는 T 세포 벌크 CD4+ T 세포, 벌크 CD8+ T 세포, CD4+ 중추 기억 T 세포, CD8+ 중추 기억 T 세포 또는 CD4+ 중추 기억 (TCM) 및 CD4+ 나이브 (TN) T 세포의 조합인 T 세포이다. CAR 변형된 CD4+ T 세포 및 CAR 변형된 CD8+ T 세포는 대상에게 투여하기 전에 3:1 내지 1:1 내지 1:3의 비율로 혼합될 수 있거나, 동일하거나 유사한 비율로 대상에게 별도로 투여될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 숙주 세포 (예를 들어, T 세포)는 CD20-특이적 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 44 내지 52 중 어느 하나의 핵산 분자 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일성을 가진다. 관련 구체예에서, 숙주 세포 (예를 들어, T 세포)는 CD20-특이적 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 44 내지 52 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이들 임의 구체예에서, 숙주 세포는 T 세포 벌크 CD4+ T 세포, 벌크 CD8+ T 세포, CD4+ 중추 기억 T 세포, CD8+ 중추 기억 T 세포 또는 CD4+ 중추 기억 (TCM) 및 CD4+ 나이브 (TN) T 세포의 조합인 T 세포이다. CCAR 변형된 CD4+ T 세포 및 CAR 변형된 CD8+ T 세포는 대상에게 투여하기 전에 3:1 내지 1:1 내지 1:3의 비율로 혼합될 수 있거나, 동일하거나 유사한 비율로 대상에게 별도로 투여될 수 있다.
임의로, 본 개시의 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 본 개시의 임의의 벡터를 포함하는 숙주 세포는 또한 형질도입 마커 (예: tCD19)를 코딩할 수 있으며, 이는 형질도입 마커 및 CAR이 CAR과 형질도입 마커인 별도의 분자로 분리되도록 자가 절단 펩티드를 또한 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포 (예컨대, T 세포)는 CD20-특이적 CAR과 tCD19 형질도입 마커 사이에 배치된 자가 절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 포함하며, 이 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 53 내지 61 중 어느 하나의 핵산 분자 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일하다. 추가의 구체예에서, 숙주 세포 (예컨대, T 세포)는 CD20-특이적 CAR과 tCD19 형질도입 마커 사이에 배치된 자가 절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 포함하고, 서열 번호 53 내지 61 중 어느 하나의 핵산 분자 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
T 세포 또는 T 세포 집단이 특정 세포 표면 마커에 대해 양성인지의 여부는 표면 마커 및 동형 매치된 대조 항체에 대한 특이적 항체와 염색을 사용하여 유세포 계측법에 의해 결정될 수 있다. 마커에 대해 "음성"인 세포 집단은 동형 대조군 이상의 특이적 항체를 가지는 세포 집단의 유의적인 염색이 없는 것을 의미하며, "양성"은 동형 대조군에서 발견되는 수준 이상의 세포 집단의 균일한 염색을 의미한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 마커의 발현 감소는 기준 T 세포 집단과 비교하였을 때 세포의 적어도 20%, 세포의 25%, 세포의 30%, 세포의 35%, 세포의 40%, 세포의 45%, 세포의 50%, 세포의 55%, 세포의 60%, 세포의 65%, 세포의 75%, 세포의 80%, 세포의 85%, 세포의 90%, 세포의 95% 또는 세포의 100% 또는 20%와 100% 사이의 임의의 백분율의 마커를 나타내는 T 세포의 백분율 감소 또는 MFI에서 1 log10의 손실을 가리킨다. 일부 구체예에서, 마커에 대해 양성인 T 세포 집단은 기준 T 세포 집단과 비교하였을 때 세포의 적어도 50%, 세포의 55%, 세포의 60%, 세포의 65%, 세포의 70%, 세포의 75%, 세포의 80%, 세포의 85%, 세포의 90%, 세포의 95%, 또는 세포의 100% 또는 50%와 100% 사이의 임의의 백분율일 수 있는 마커를 나타내는 세포의 백분율을 가리킨다.
CliniMACS 장치 (예를 들어, Terakura et al., 2012, Blood 119: 72-82, Wang et al., 2012, J.Immunother. 35: 689-701 참조)를 사용하고 상업적으로 입수가능한 임상 등급의 항체 비드 접합체를 사용하여 T 세포 하위 집단을 정제하는데 면역자기 선택법을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 인간 CD8+ TCM 세포를 단리하기 위해, 항체 접합된 상자성 비드로의 고갈로 말초 혈액 단핵 세포로부터 CD4+, CD14+ 및 CD45RA+ 세포를 제거한 후, 잔류 세포로부터 CD62L+ 분획을 항-CD62L 표지된 비드로 양성적으로 선택하여 CD45RO+, CD62L+, CD8+ TCM 하위 집단을 풍부화시킨다. 풍부화된 CD8+ TCM 하위 집단을 항-CD3/CD28 비드 또는 항원으로 활성화시키고, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 종양-특이적 CAR로 변형시키고, 세포 면역요법에 사용하기 위해 확장시킬 수 있다 (예를 들어, Terakura et al., supra; Wang et al., 상기 참조).
대안으로, T 세포 서브세트는 Strep-tag II에 융합된 저 친화도 Fab 단편을 사용하여 선택될 수 있다. Fab 단량체는 세포 표면상의 표적 항원에 대한 안정한 결합을 위해 충분한 결합 친화도를 갖지 않는다. 그러나, StrepTactin 비드에서 다중화시키는 경우, 이들 시약은 표적 세포에 안정적으로 결합하고 세포 표면 표지 특이성에 기초한 선택을 가능하게 한다. Fab 멀티머 결합은 StrepTactin에 대한 높은 친화도을 갖고 Fab 단편상의 Strep-tag와 Strep-Tactin "백본" 사이의 결합을 파괴하는 과량의 D-비오틴을 첨가함으로써 빠르게 역전시킬 수 있다. Fab 단량체는 세포에 안정한 결합을 유지할 수 없다. 이 "Fab-Streptamers" 기술은 다중 세포 표면 마커에 기반한 T 세포의 연속적인 양성적 풍부화를 허용하며 임의의 원하는 T 세포 하위 집합을 선택하는데 사용할 수 있다 (예를 들어 Stemberger et al., PloS One 7: e35798, 2012 참조).
벌크 CD8+ T 세포는 표준 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 일부 구체예에서, 벌크 CD8+ T 세포는 이들 유형의 CD8+ T 세포 각각과 관련된 특정 세포 표면 마커를 동정함으로써 나이브, 중추 기억 및 이펙터 T 세포로 추가 분류된다. 특정 구체예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L + 및 CD62L- 서브세트 모두에 존재한다. 예를 들어 PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체로 염색한 후 CD62L-CD8+ 및 CD62L+ CD8+ 분획으로 분류될 수 있다. 일부 구체예에서, CD8+ 중추 기억 T 세포의 표현형 마커의 발현은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 또는 CD127을 포함하거나 그랜자임 B에 대해 음성이다. 일부 구체예에서, 중추 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, CD8+ T 세포이다. 일부 구체예에서, CD8+ 이펙터 T 세포는 CD8+ 중추 기억 T 세포에 비해 CD62L, CCR7, CD28 또는 CD127의 발현이 감소되었거나 이에 대해 음성이거나, 또는 그랜자임 B 또는 퍼포린의 발현이 증가되었거나 이에 대해 음성이다. 일부 구체예에서, 나이브 CD8+ T 세포는 CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 또는 CD45RA를 포함하는 나이브 T 세포의 표현형 마커의 발현이 특징이다.
벌크 CD4+ 림프구는 표준 방법으로 얻을 수 있다. 일부 구체예에서, 벌크 CD4+ T 세포는 특정 세포 표면 마커를 갖는 세포 집단을 동정함으로써 나이브, 중추 기억 및 이펙터 세포로 추가로 분류된다. 일부 구체예에서, 나이브 CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+, CD4+ T 세포이다. 일부 구체예에서, 중추 기억 CD4+ 세포는 CD62L 양성 및 CD45RO 양성이다. 일부 구체예에서, 이펙터 CD4+ 세포는 CD62L 또는 CD45RO 음성이거나 중추 기억 CD4+ 세포와 비교하여 CD62L 또는 CD45RO의 발현이 감소되어 있다.
항원 특이적인 TCR을 갖는 CD4+ 및 CD8+의 집단은 항원으로 나이브 또는 항원 특이적 T 림프구를 자극함으로써 수득할 수 있다. 예를 들어, 항원 특이적 TCR을 갖는 T 세포 클론은 감염된 대상으로부터 T 세포를 단리하고 시험관 내에서 동일한 항원으로 세포를 자극함으로써, 예를 들어 사이토메갈로바이러스 항원에 대해 생성될 수 있다. 나이브 T 세포는 또한 항원 제시 세포 또는 펩티드-MHC 복합체와 관련하여 제시된 펩티드 항원에 이들을 노출시킴으로써 사용될 수도 있다. 종양 세포, 암 세포 또는 병원성 물질로부터의 임의의 수의 항원이 사용될 수 있다. 이러한 항원의 예로는 HIV 항원, C 형 간염 바이러스 (HCV) 항원, B 형 간염 바이러스 (HBV) 항원, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 항원, EBV 항원, 기생 항원 및 종양 항원, 오판 티로신 키나제 수용체, 예컨대 ROR1, EGFR, EGFRvIII, GD2, GD3, HPV E6, HPV E7, Her2, L1-CAM, Lewis A, Lewis Y, MUC1, MUC16, PSMA, CD19, CD20, CD22, CD56, CD23, CD24, CD37, CD30, CD33, CD38, CD56, CD123, CA125, c-MET, FcRH5, WT1, 엽산 수용체 α, VEGF-α, VEGFR1, VEGFR2, IL-13Rα2, IL-11Rα, MAGE-A1, PSA, 에프린 A2, 에프린 B2, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, TAG-72, 메소텔린, CEA 등을 들 수 있다. 항원-특이적 TCR을 갖는 이러한 T 세포는 동일한 항원에 대해 특이적이거나, 동일한 항원상의 상이한 에피토프에 대해 특이적이거나, 또는 상이한 항원에 대해 특이적인, 본원에 기재된 융합 단백질을 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 이들 임의의 구체예에서, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 상이한 CAR를 함유할 것이며, 특히 CAR의 세포 내 신호전달 성분은 상이할 것이다.
본 개시의 융합 단백질을 발현하기 위한 T 세포의 제조 및 변형, 융합 단백질 변형된 T 세포 활성의 확인, 융합 단백질 변형된 T 세포 집단의 확장 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Hollyman et al., 2009, J. Immunother. 32:169-180]; PCT 공보 제WO 2012/079000호; 미국 특허 제8,802,374호; Brentjens et al., Blood 118:4817-4828, 2011; 미국 특허 공보 제2014/0271635호에 기술되어 있다.
용도
본 개시는 본원에 기재된 임의의 융합 단백질을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 질환, 상태 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 구체예들에서, 본 개시의 방법은 B-세포의 수를 감소시키는 방법 또는 대상에서 비정상적인 B-세포 활성과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 포함한다. 또 다른 구체예는 질환, 상태 또는 장애와 관련된 항원의 존재에 대해 환자의 생물학적 샘플을 분석하는 단계 및 항원에 특이적으로 결합하는 본원에 기술된 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 상태 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 질환, 상태 또는 장애와 관련된 항원은 종양 관련 항원이다.
본 개시에 기재된 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 질환, 상태 또는 장애는 암 및 면역 질환 (예: 자가면역)을 포함한다. 예를 들어, 특정 구체예에서, CD20-발현 세포는 B-세포를 포함한다. 추가의 구체예에서, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애는 B-세포 또는 이상 B 세포 활성, 예컨대 B-세포-관련 암이다. 입양 면역 및 유전자 치료는 다양한 유형의 암에 대해 유망한 치료법이다 (Morgan et al., Science 314:126, 2006; Schmitt et al., Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009; June, J. Clin. Invest. 117:1466, 2007).
고형 종양 및 백혈병을 비롯한 다양한 암이 본원에 개시된 조성물 및 방법으로 치료가능하다. 치료될 수 있는 예시적인 유형의 암은 유방, 전립선 및 결장의 선암; 폐의 기관지원성 암종의 모든 형태; 골수성 백혈병; 흑색종; 간잔암; 신경모세포종; 유두종; 아푸도마; 분리종; 새열종; 악성 카르시노이드 증후군; 카르시노이드 심장 질환; 및 암종 (예를 들면, 워커, 기저 세포, 기저편평성, 브라운-피어스, 도관, 에를리히 종양, 크렙스 2, 메르켈 세포, 점액소, 비-소세포 폐, 귀리 세포, 유두, 경섬유질, 세기관지, 기관지원성, 편평 세포 및 이행 세포)을 포함한다. 치료될 수 있는 추가 유형의 암은 조직구 장애; 악성 조직구증; 백혈병; 호지킨 질환; 면역증식성 소; 비-호지킨 림프종; 형질세포종, 세망내피종; 흑색종; 연골아세포종; 연골종; 연골육종; 섬유종; 섬유육종; 거대세포 종양; 조직구종; 지방종, 지방육종; 중피종; 점액종; 점액육종; 골종; 골육종; 척색종, 두개인두종; 미분화세포종; 과오종; 간엽종; 중신종; 근육종; 에나멜상피종; 백악질종; 치아종; 기형종; 흉선종; 영양막 종양을 포함한다. 추가로, 다음과 같은 종류의 암이 또한 치료 가능한 것으로 고려된다: 선종; 담관종; 진주종; 원주종; 낭종암; 낭선종; 과립막 세포 종양; 음양모세포종; 간암; 한선종; 섬 세포 종양; 라이디히(Leydig) 세포 종양; 유두종; 세르톨리 세포 종양; 난모막 세포 종양; 자궁근종; 자궁육종; 근아세포종; 근종; 근육종; 횡문근종; 횡문육종; 상의세포종; 신경절세포종; 신경교종; 수모세포종; 뇌수막종; 신경집종; 신경아세포종; 신경상피종; 신경섬유종; 신경종; 부신경절종; 부신경절종 비-크로마핀. 치료될 수 있는 암의 유형은 또한 피각혈관종; 호산구 증가증을 갖는 혈관림프양 증식; 혈관 경화증; 혈관종; 사구맥관종; 혈관내피종; 혈관종; 혈관주위세포종; 혈관육종; 림프관종; 림프관근종; 림프관육종; 송과체종; 암육종; 연골육종; 엽상 낭육종; 섬유육종; 혈관육종; 평활근육종; 백혈육종; 지방육종; 림프관육종; 근육종; 점액육종; 난소 암종; 횡문근육종; 육종; 신생물; 신경섬유종증 및 자궁경부 이형상피증을 포함한다.
본원에 기재된 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 다양한 과증식성 장애의 예는 B 세포 림프종을 포함하는 B-세포 암 [예컨대, 다양한 형태의 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종(NHL) 또는 중추신경계 림프종], 백혈병 [예컨대, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 털세포 백혈병 및 만성 골수성 백혈병의 B 세포 아구화 전환] 및 골수종 [예컨대, 다발성 골수종]을 포함하는 이상 B 세포 활성과 같은 CD20 발현과 관련된 장애 또는 질환이다. 추가적인 B 세포 암은 소 림프구성 백혈병 (SLL), 발덴스트룀스 거대글로불린혈증 (Waldenstroem's macroglobulinemia), CD37+ 수지상 세포 림프종, B-세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종, 비장 변연부 림프종, 형질 세포 골수종, 고형 골 형질세포종 종양, 골외 형질세포종, 점막-관련 (MALT) 림프 조직의 결절외 변연부 B-세포 림프종, 결절성 변연부 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 미만성 거대 B-세포 림프종, 종격(흉선) 거대 B-세포 림프종, 전구체 B-림프모구 림프종, 면역아세포 거대 세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출액 림프종, 버킷 림프종/백혈병, 미특정 악성 가능성의 B-세포 증식, 임파선 육아종증 및 이식후 림프증식성 장애를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 개시의 조성물 및 방법은 다발성 골수종, 흑색종, 줄기 세포의 다발성 골수종 및 줄기 세포의 흑색종을 포함하는 CD20 발현과 관련된 비-B-세포 장애 또는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 염증성 및 자가면역 질환으로는 관절염, 류마티스성 관절염, 유년기 류마티스성 관절염, 골관절염, 다발 연골염, 건선 관절염, 건선, 피부염, 특발성 염증성 근병증, 다발성 근염/피부 근염, 봉입체 근염, 염증성 근염, 독성 표피 괴사용해, 전신성 공피증 및 경화증, CREST 증후군, 염증성 장 질환, 크론병, 그레이브 병, 궤양성 대장염, 호흡 곤란 증후군, 성인 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 수막염, 뇌염, 포도막염, 대장염, 사구체신염, 알러지성 질환, 습진, 천식, T 세포 및 만성 염증 반응의 침윤을 포함하는 상태, 죽상동맥경화증, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 전신성 홍반성 루푸스 (SLE), 아급성 피부 낭창성 홍반성 루푸스, 반상 루프스, 루프스 척수염, 루프스 뇌염, 청소년 발병 당뇨병, 다발성 경화증, 알러지성 뇌척수염, 시신경 척수염, 류마티스 열, 시드남 (Sydenham's) 무도병, 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연성 과민성과 관련된 면역 반응, 결핵, 유육종증, 베게너 육아종증 및 척 슈트라우스 (Churg-Strauss) 병을 포함한 육아종증, 무과립구증, 혈관염 (과민성 혈관염/맥관염, ANCA 및 류마티스성 혈관염 포함), 재생 불량성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈 (AlHA)을 포함한 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 순수 적혈구 빈혈 (PRCA), VIII 인자 결핍증, A형 혈우병, 자가면역 호중구 감소증, 범혈구 감소증, 백혈구 감소증, 백혈구 누출을 포함하는 질환, 중추 신경계 (CNS) 염증성 장애, 다발성 장기 손상 증후군, 중증 근무력증, 항원-항체 복합체 매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알러지성 신경염, 베체트 질환, 캐슬만 증후군, 굿파스쳐 증후군, 램버트-이튼 근무력 증후군, 레이노이드 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 증후군, 고형 장기 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 수포성 천포창, 천포창, 자가면역성 다발성 내분비병증, 혈청 음성성 척추관절병증, 라이타병 (Reiter's disease), 강직 증후군, 거대 세포 동맥염, 면역 복합체 신염, IgA 신장병증, IgM 다발성 신장병증 또는 IgM 매개 신장병증, 특발성 혈소판 감소성 자반병 (ITP), 혈전성 혈소판 감소 자반병 (TTP), 헤노크-숀레인 자반병, 자가면역 혈소판 감소증, 자가 면역 고환염 및 난소염을 포함한 고환 및 난소의 자가 면역 질환, 원발성 갑상선 기능 저하증; 자가면역 갑상선염, 만성 갑상선염 (하시모토 갑상선염), 아급성 갑상선염, 특발성 갑상선 기능 저하증, 애디슨병, 그레이브병, 자가면역성 다선성 증후군 (또는 다선성 내분비 증후군), 제1형 당뇨병 (인슐린 의존성 진성 당뇨병 (IDDM) 이라고도 함) 및 시핸 증후군을 포함한 자가면역 내분비계 질환; 자가면역 간염, 림프성 간질성 폐렴 (HIV), 폐색성 세기관지염 (비이식), 비특이성 간질성 폐렴 (NSIP), 귈랑-바레 증후군 (Guayain-Barre Syndrome), 대형 혈관염 (류마티스성 다발근통 및 거대 세포 (다카야스) 동맥염 포함), 중형 혈관염 (가와사키병 및 다발성 결절 포함), 결절성 다발 동맥염 (PK) 강직성 척추염, 버거스 (Berger's) 병 (IgA 신장병증), 급속 진행성 사구체신염, 원발성 담즙성 경화증, 셀리악 스프루우 (Celiac sprue) (글루텐 장질환), 한랭 글로불린혈증, 간염과 관련된 한랭 글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 관상 동맥 질환, 가족성 지중해 열, 현미경적 다발성 혈관염, 코간 증후군, 비스코트-알드리히 (Whiskott-Aldrich) 증후군 및 폐색성 혈전혈관염을 들 수 있다.
본 발명에 의해 치료될 수 있는 대상은 일반적으로 인간 및 다른 영장류 대상, 예컨대 수의학 목적을 위한 원숭이 및 유인원이다. 대상은 남성이거나 여성일 수 있으며 유아, 소아, 청소년, 성인 및 노인을 포함한 임의의 적절한 연령일 수 있다.
본 개시의 융합 단백질은 당업자가 이해하는 바와 같이 임의의 적합한 방식으로 투여하도록 제형화될 수 있다. 본원의 CD20-특이적 융합 단백질 (예컨대, CAR) (또는 상이한 표적에 특이적인 융합 단백질)은 대상에 세포-결합 형태 (예를 들어, 표적 세포 집단의 생체 외 변형) (성숙 T 세포 (예: CD8+ 또는 CD4+ T 세포) 또는 T 세포 계통의 다른 세포))로 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 대상에게 투여되는 본원의 CD20-특이적 융합 단백질 (또는 상이한 표적에 대해 특이적인 융합 단백질)을 발현하는 T 세포 계통의 세포는 대상에 동계, 동종 또는 자가 세포이다. 일부 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질을 포함하는 세포는 (생물학적 샘플, 조직 또는 배양 배지로부터) 세포를 수확하고, 세척하고, 농축시키고, 투여에 적합한 매질 및 용기 시스템에서 제형화하여 제조한다.
본 개시는 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질을 발현하는 세포 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 적합한 부형제는 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤 등 및 이들의 조합물을 포함한다. 구체예들에서, 본원에 개시된 바와 같은 융합 단백질을 발현하는 세포를 포함하는 조성물은 적합한 주입 매질을 추가로 포함한다. 적합한 주입 매질로서는 임의의 등장성 매질 제제, 전형적으로 생리 식염수, Normosol R (Abbott) 또는 Plasma-Lyte A (Baxter), 물 중 5% 덱스트로스, 링거 락테이트가 사용될 수 있다. 주입 매질에는 인간 혈청 알부민 또는 기타 인간 혈청 성분이 보충될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 개시의 CD20-특이적 융합 단백질 (또는 상이한 표적에 특이적인 융합 단백질)은 가용성 형태로 대상에 투여될 수 있다. 예를 들어, 가용성 TCR은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Molloy et al., Curr. Opin. Pharmacol. 5:438, 2005; 미국 특허 제6,759,243호 참조).
본 개시의 융합 단백질 또는 이를 포함하는 세포는 의학 분야의 숙련자에 의해 결정될, 치료될 질환, 상태 또는 장애에 적합한 방식으로 투여될 수 있다. 상기 임의의 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같은 융합 단백질을 포함하는 세포는 정맥 내, 복강 내, 종양 내, 골수 내로, 림프절로 또는 뇌척수액으로 투여된다. 일부 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질을 포함하는 세포는 종양 부위로 전달된다.
조성물의 적절한 용량, 적합한 지속 시간 및 투여 빈도는 환자의 상태; 질환, 상태 또는 장애의 크기, 유형 및 중증성; 활성 성분의 특정 형태; 및 투여 방법과 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
상기 임의의 구체예에서, 본 개시의 방법은 본 개시의 융합 단백질을 발현하는 숙주 세포 또는 본 개시의 융합을 발현하는 숙주 세포의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 조성물 중 세포의 치료적 유효량은 적어도 하나의 세포 (예를 들어, 하나의 융합 단백질 변형된 CD8+ T 세포 아집단; 하나의 융합 단백질 변형된 CD4+ T 세포 아집단)이거나, 보다 전형적으로는 102 세포 초과, 예를 들어, 최대 106, 최대 107, 최대 108 세포, 최대 109 세포, 또는 1010 세포 초과이다. 특정 구체예에서, 세포는 약 106 내지 약 1010 세포/㎡, 바람직하게는 약 105 내지 약 109 세포/㎡의 범위로 투여된다. 세포의 수는 조성물의 의도하는 궁극적인 용도 및 그 안에 포함된 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 특정 항원에 특이적인 융합 단백질을 함유하도록 변형된 세포는 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 세포를 함유하는 세포 집단을 포함할 것이다. 본원에서 제공된 용도를 위해, 세포는 체적이 일반적으로 1 리터 이하, 500 ㎖ 이하, 250 ㎖ 이하 또는 100 ㎖ 이하이다. 구체예들에서, 원하는 세포의 밀도는 전형적으로 104 세포/ml 초과이며, 일반적으로 107 세포/ml 초과이며, 일반적으로 108 세포/ml 이상이다. 세포는 단일 주입 또는 일정 시간에 걸쳐 다회 주입으로 투여될 수 있다. 임상적으로 관련된 면역 세포의 수는 누적적으로 106, 107, 108, 109, 1010, 또는 1011 세포와 같거나 이를 초과하여 다회 주입으로 분배될 수 있다.
일부 구체예에 있어서, 본 개시의 방법은 완전 인간 또는 인간화된 본 개시의 CAR을 발현하는 숙주 세포를 투여하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 구체예에서, 본 개시의 방법은 항-CD20 항체로부터의 scFv 또는 CD20 항원에 특이적인 TCR로부터의 scTCR을 갖는 CAR을 발현하는 숙주 세포를 투여하는 것을 포함한다. 본원에 기술된 임의의 구체예에서, 본 개시의 방법은 1.5.3, 1F5, Leu16, 리툭시맙, 오파투무맙, 벨투주맙, 오클렐리주맙, 우블리툭시맙 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 scFv를 포함하는 CAR을 발현하는 숙주 세포를 투여하는 것을 포함한다. 상기 임의의 구체예에서, 본 개시의 방법은 IgG1 힌지, IgG4 힌지 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 링커 모듈을 포함하는 CAR을 발현하는 숙주 세포를 투여하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 구체예에서, 본 개시의 방법은 N297Q 돌연변이를 갖는 IgG1 CH2 영역, IgG4 CH2 영역, IgG1 CH3 영역, IgG4 CH3 영역 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 링커 모듈을 포함하는 CAR을 발현하는 숙주 세포를 투여하는 것을 포함한다. 본원의 임의의 구체예에서, 본 개시의 방법은 글리신-세린 링커 모듈 또는 글리신-세린 가변 영역 링커를 포함하는 CAR을 발현하는 숙주 세포를 투여하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 구체예에서, 본 개시의 방법은 CD28 막관통 도메인으로 구성된 소수성 부분을 포함하는 CAR을 발현하는 숙주 세포를 투여하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 구체예에서, 본 개시의 방법은 CD3ζ, 4-1BB, CD28 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 도메인을 포함하는 세포 내 도메인을 포함하는 CAR을 발현하는 숙주 세포를 투여하는 것을 포함한다. 상기 임의의 구체예에서, 본 개시의 방법은 인접한 도메인, 모티프, 영역, 모듈 또는 단편 사이에 연접 아미노산을 포함하는 CAR을 투여하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 구체예에서, 본 개시의 방법은 소수성 부분에 의해 연결된 세포 내 성분 및 세포 외 성분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 대상에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 세포 외 성분은 CD20에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하고, 세포 내 성분은 이펙터 도메인을 포함하며, 코딩된 융합 단백질 (예: CAR)은 1.5.3-NQ-28-BB-z (서열 번호 26); 1.5.3-NQ-28-z (서열 번호 27); 1.5.3-NQ-BB-z (서열 번호 28); 1.5.3-NQ-z (서열 번호 29); Leu16-28-BB-z (서열 번호 30); Leu16-28-z (서열 번호 31); 1F5-NQ-28-BB-z (서열 번호 32); 1F5-NQ-28-z (서열 번호 33); 또는 1F5-NQ-BB-z (서열 번호 34)와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일성이다. 추가의 구체예에서, 본 개시의 방법은 소수성 부분에 의해 연결된 세포 내 성분 및 세포 외 성분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 대상에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 세포 외 성분은 CD20에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하고, 세포 내 성분은 이펙터 도메인을 포함하며, 코딩된 융합 단백질 (예: CAR)은 서열 번호 26 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 이들 임의의 구체예에서, 숙주 세포는 T 세포 벌크 CD4+ T 세포, 벌크 CD8+ T 세포, CD4+ 중추 기억 T 세포, CD8+ 중추 기억 T 세포 또는 CD4+ 중추 기억 (TCM) 및 CD4+ 나이브 (TN) T 세포의 조합인 T 세포이다. CAR 변형된 CD4+ T 세포 및 CAR 변형된 CD8+ T 세포는 대상에게 투여하기 전에 3:1 내지 1:1 내지 1:3의 비율로 혼합될 수 있거나, 동일하거나 유사한 비율로 대상에게 별도로 투여될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 개시의 방법은 소수성 부분에 의해 연결된 세포 내 성분 및 세포 외 성분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 대상에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 세포 외 성분은 CD20에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하고, 세포 내 성분은 이펙터 도메인을 포함하며, 융합 단백질 (예: CAR)은 서열 번호 44 내지 52 중 어느 하나의 핵산 분자 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 관련 구체예에서, 방법은 소수성 부분에 의해 연결된 세포 내 성분 및 세포 외 성분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포를 대상에 투여하는 것을 포함하며, 여기서 세포 외 성분은 CD20에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하고, 세포 내 성분은 이펙터 도메인을 포함하며, 융합 단백질 (예: CAR)은 서열 번호 44 내지 52 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 이들 임의 구체예에서, 숙주 세포는 T 세포 벌크 CD4+ T 세포, 벌크 CD8+ T 세포, CD4+ 중추 기억 T 세포, CD8+ 중추 기억 T 세포 또는 CD4+ 중추 기억 (TCM) 및 CD4+ 나이브 (TN) T 세포의 조합인 T 세포이다. CCAR 변형된 CD4+ T 세포 및 CAR 변형된 CD8+ T 세포는 대상에게 투여하기 전에 3:1 내지 1:1 내지 1:3의 비율로 혼합될 수 있거나, 동일하거나 유사한 비율로 대상에게 별도로 투여될 수 있다.
임의로, 본원에 기술된 방법에 사용하기 위한, 본 개시의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 본 개시의 임의의 벡터를 포함하는 숙주 세포는 또한 형질도입 마커 (예: tCD19)를 코딩할 수 있으며, 이는 형질도입 마커 및 CAR이 CAR과 형질도입 마커인 별도의 분자로 분리되도록 자가 절단 펩티드를 또한 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포 (예컨대, T 세포)는 CD20-특이적 CAR과 tCD19 형질도입 마커 사이에 배치된 자가 절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 포함하며, 이 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 53 내지 61 중 어느 하나의 핵산 분자 서열과 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일하다. 추가의 구체예에서, 숙주 세포 (예컨대, T 세포)는 CD20-특이적 CAR과 tCD19 형질도입 마커 사이에 배치된 자가 절단 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터를 포함하고, 서열 번호 53 내지 61 중 어느 하나의 핵산 분자 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
따라서, 본원에 개시된 임의의 방법에서, 숙주 세포는 CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 융합 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 (a) 서열 번호 53 내지 56 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 동일하거나; (b) 서열 번호 44 내지 47 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80% 동일하거나; (c) 서열 번호 53 내지 56 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나; (d) 서열 번호 44 내지 47 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하거나; (e) 서열 번호 53 내지 56 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지거나; 또는 (f) 서열 번호 44 내지 47 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
특정 구체예에서, 본 방법에 사용된 숙주 세포는 융합 단백질이 (a) 성숙한 융합 단백질과 적어도 90% 동일하고, 성숙한 융합 단백질은 tCD19 형질도입 마커가 제거된 서열 번호 26 내지 29 및 35 내지 38 및 32 내지 34 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며; (b) 성숙한 융합 단백질로 구성되어 있으며, 여기서 성숙한 융합 단백질은 tCD19 형질도입 마커가 제거된 서열 번호 35 내지 38 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며; (c) 성숙한 융합 단백질로 이루어지며, 여기서 성숙한 융합 단백질은 tCD19 형질도입 마커가 제거된 서열 번호 35 내지 38 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며; (d) 서열 번호 26 내지 29 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고; (e) 서열 번호 26 및 29 중 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되어 있고; (f) 서열 번호 26 내지 29 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 융합 단백질을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 방법에 사용된 숙주 세포는 본원에 개시된 바와 같은 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하고 융합 단백질을 발현할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 방법에 사용된 숙주 세포는 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 결합 도메인은 (a) 서열 번호 64의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 1.5.3 scFv (여기서, scFv의 각 CDR은 CD20에 특이적으로 결합하는 모 모노클로날 항체 또는 그의 단편 또는 유도체의 상응하는 CDR과 비교하여 0 변화 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 변화를 포함하되, 하나 이상의 변형된 CDR을 함유하는 scFv는 야생형 scFv 또는 상응하는 항체와 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다); (b) 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 1.5.3 scFv; (c) 서열 번호 66의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 1F5 scFv (여기서, scFv의 각 CDR은 CD20에 특이적으로 결합하는 모 모노클로날 항체 또는 그의 단편 또는 유도체의 상응하는 CDR과 비교하여 0 변화 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 변화를 포함하되, 하나 이상의 변형된 CDR을 함유하는 scFv는 야생형 scFv 또는 상응하는 항체와 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다); (d) 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 1F5 scFv; (e) 서열 번호 65의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Leu16 scFv (여기서, scFv의 각 CDR은 CD20에 특이적으로 결합하는 모 모노클로날 항체 또는 그의 단편 또는 유도체의 상응하는 CDR과 비교하여 0 변화 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 변화를 포함하되, 하나 이상의 변형된 CDR을 함유하는 scFv는 야생형 scFv 또는 상응하는 항체와 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다); 또는 (f) 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 Leu16 scFv이다.
특정 구체예에서, 본 방법에 사용된 숙주 세포는 scFv를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 scFv는 (a) 서열 번호 67의 핵산 분자 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 (여기서, scFv의 각 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 CD20에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체로부터의 모 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여 0 변화 또는 최대 1 내지 6 폴리뉴클레오티드 변화를 포함하되, 하나 이상의 변형된 CDR을 함유하는 scFv는 야생형 scFv 또는 상응하는 항체와 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다); (b) 서열 번호 67의 핵산 분자 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드; (c) 서열 번호 69의 핵산 분자 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 (여기서, scFv의 각 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 CD20에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체로부터의 모 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여 0 변화 또는 최대 1 내지 6 폴리뉴클레오티드 변화를 포함하되, 하나 이상의 변형된 CDR을 함유하는 scFv는 야생형 scFv 또는 상응하는 항체와 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다); (d) 서열 번호 69의 핵산 분자 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드; (e) 서열 번호 68의 핵산 분자 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 (여기서, scFv의 각 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 CD20에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체로부터의 모 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 비교하여 0 변화 또는 최대 1 내지 6 폴리뉴클레오티드 변화를 포함하되, 하나 이상의 변형된 CDR을 함유하는 scFv는 야생형 scFv 또는 상응하는 항체와 유사한 친화도로 CD20에 특이적으로 결합한다); 또는 (f) 서열 번호 68의 핵산 분자 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
특정 구체예에서, 본 방법에 사용된 숙주 세포는 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 융합 단백질은 키메라 항원 수용체이고, 서열 번호 26 내지 43 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 그로 구성된다.
특정 구체예에서, 본 방법에 사용된 숙주 세포는 소수성 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 소수성 부분은 막관통 도메인이다. 특정 구체예에서, 소수성 부분은 CD4, CD8, CD28 또는 CD27 막관통 도메인이다.
특정 구체예에서, 본 방법에 사용된 숙주 세포는 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분은 4-1BB (CD137), CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, OX40 (CD134), ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 방법에 사용된 숙주 세포는 세포 내 성분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 세포 내 성분은 (a) CD3ζ 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분, CD28 공자극 도메인 또는 그의 기능성 부분 및 4-1BB (CD137) 공자극 도메인 또는 그의 부분; (b) CD3ζ 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분, CD28 공자극 도메인 또는 그의 기능성 부분 및 OX40 (CD134) 공자극 도메인 또는 그의 부분; (c) CD3ζ 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분, CD27 공자극 도메인 또는 그의 기능성 부분 및 4-1BB (CD137) 공자극 도메인 또는 그의 부분; (d) CD3ζ 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분, CD27 공자극 도메인 또는 그의 기능성 부분 및 OX40 (CD134) 공자극 도메인 또는 그의 부분; (e) CD3ζ 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분, CD27 공자극 도메인 또는 그의 기능성 부분 및 CD28 공자극 도메인 또는 그의 부분; 또는 (f) CD3ζ 이펙터 도메인 또는 그의 기능성 부분, 4-1BB (CD137) 공자극 도메인 또는 그의 기능성 부분 및 OX40 (CD134) 공자극 도메인 또는 그의 부분을 포함한다.
본 발명의 조성물은 또한 하나 이상의 다른 치료제의 투여와 동시에, 투여 전에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 이러한 병용 요법은 본 개시의 융합 단백질 및 하나 이상의 추가의 활성제를 함유하는 단일 투약 제형의 투여뿐만 아니라 본 개시의 융합 단백질 및 각각의 활성제를 그 자체의 분리된 투약 제형으로 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 개시의 융합 단백질과 다른 활성제는 단일 주입 투약 조성물로 대상에 함께 투여될 수 있거나, 또는 각각의 약제가 별도의 주입 투약 제형으로 투여될 수 있다. 별도의 투약 제형이 사용되는 경우, 본 개시의 융합 단백질과 하나 이상의 추가 활성제는 동일 시간에, 즉 동시에, 실질적으로 동일 시간에, 즉 병용하여, 또는 별도로 시차를 두고, 즉, 순차적으로 투여될 수 있으며; 병용 요법은 이들 모든 요법을 포함하는 것으로 이해된다.
본 개시는 CD20-특이적 결합 분자, 본원에 개시된 바와 같은 융합 단백질을 발현하는 세포 또는 이 둘 다와 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정 구체예에서, CD20-특이적 결합 분자는 항체이다. 이러한 구체예에서, CD20-특이적 항체는 리툭시맙, 오파투무맙, 오크렐리주맙, 오비누투주맙, 우블리툭시맙, 벨투주맙, 이브리투모맙, 토시투모맙 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
특정 구체예에서, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법은 CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 지니고 있거나 지닌 것으로 의심되는 대상에게 소수성 부분에 의해 연결된 세포 내 성분 및 세포 외 성분을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포의 치료적 유효량을 투여하고 (여기서 세포 외 성분은 CD20에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하고 세포 내 성분은 이펙터 도메인을 포함함), 임의로 치료적 유효량의 CD20-특이적 결합 분자, 화학요법제 또는 면역 억제 성분의 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 추가의 구체예에서, 상기 방법은 B-세포의 수를 감소시키거나, 이상 B-세포 활성과 관련된 질환 또는 장애를 치료한다.
따라서, 특정 구체예에서, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 지니고 있거나 지닌 것으로 의심되는 대상에게 서열 번호 26 내지 29 및 32 내지 38 및 41 내지 43 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열로 구성된 융합 단백질을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포의 치료적 유효량을 투여하고, 임의로 CD20-특이적 결합 분자, 화학요법제 또는 면역 억제 성분의 억제제 또는 이들의 조합을 투여하는 것을 포함하는, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 추가의 구체예에서, 상기 방법은 B-세포의 수를 감소시키거나, 이상 B-세포 활성과 관련된 질환 또는 장애를 치료한다.
일부 구체예에서, 본원에 기재된 조성물은 화학요법제 또는 면역 조절제 (예를 들어, 면역 억제제, 또는 면역 체크포인트 억제제와 같은 면역 억제 성분의 억제제)와 함께 투여된다. 면역 체크포인트 억제제는 CTLA-4, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, IDO, KIR, LAG-3, PD-1, PD-L1, PD-L2, Tim-3, VISTA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR 베타, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, CD244, 또는 이들의 임의의 조합의 억제제들을 포함한다. 면역 체크포인트 분자의 억제제는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 융합 단백질, 소분자, RNAi 분자 (예: siRNA, shRNA 또는 miRNA), 리보자임, 앱타머 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 화학요법제는 B-Raf 억제제, MEK 억제제, VEGF 억제제, VEGFR 억제제, 티로신 키나아제 억제제, 항-유사분열제 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
본원의 임의의 구체예에서, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법은 CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 지니고 있거나 지닌 것으로 의심되는 대상에게 본원에 개시된 바와 같은 융합 단백질을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포의 치료적 유효량, 및 면역 체크포인트 억제제와 같은 면역 억제 성분의 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 CTLA-4, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, IDO, KIR, LAG-3, PD-1, PD-L1, PD-L2, Tim-3, VISTA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR 베타, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, CD244, 또는 이들의 임의의 조합의 억제제이다.
이에 따라, 특정 구체예에서, 본 개시는 CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 지니고 있거나 지닌 것으로 의심되는 대상에게 서열 번호 26 내지 29 및 32 내지 38 및 41 내지 43 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 가지는 융합 단백질을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포의 치료적 유효량, 및 면역 체크포인트 억제제와 같은 면역 억제 성분의 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 CTLA-4, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, HVEM, GAL9, IDO, KIR, LAG-3, PD-1, PD-L1, PD-L2, Tim-3, VISTA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4, TGFR 베타, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, CD244, 또는 또는 이들의 임의의 조합의 억제제이다. 일부 구체예에서, 면역 체크포인트 억제제는 (a) PD-1에 특이적인 항체, 예컨대 피딜리주맙, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙; (b) PD-L1에 특이적인 항체, 예컨대 MDX-1105, BMS-936559, MEDI4736, MPDL3280A, 또는 MSB0010718C; 또는 (c) CTLA4에 특이적인 항체, 예를 들어 트레멜리무맙 또는 이필리무맙으로부터 선택된다.
추가의 구체예에서, 본 개시는 CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 가지는 대상 또는 이로 의심되는 대상에게 서열 번호 26 내지 29 및 32 내지 38 및 41 내지 43 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 융합 단백질을 코딩하는 이종 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포의 치료적 유효량, 및 면역 체크포인트 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 임의로 여기서 체크포인트 억제제는 (a) PD-1에 특이적인 항체, 예컨대 피딜리주맙, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙; (b) PD-L1에 특이적인 항체, 예컨대 MDX-1105, BMS-936559, MEDI4736, MPDL3280A, 또는 MSB0010718C; 또는 (c) CTLA4에 특이적인 항체, 예컨대 트레멜리무맙 또는 이필리무맙으로부터 선택된다.
예시적인 화학요법제로는 알킬화제 (예: 시스플라틴, 옥살리플라틴, 카보플 라틴, 부술판, 니트로소우레아, 질소 머스타드, 예컨대 벤다무스틴, 우라무스틴, 테모졸로미드), 항대사제 (예: 아미노프테린, 메토트렉세이트, 머캅토퓨린, 플루오로우라실, 시타라빈, 젬시타빈), 탁산 (예: 파클리탁셀, 납-파클리탁셀, 도세탁셀), 안트라사이클린 (예: 독소루비신, 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 발루비신), 블레오마이신, 미토마이신, 액티노마이신, 하이드록시우레아, 토포이소머라제 억제제 (예: 캄프토테신, 토포테칸, 이리노테캄, 에토포시드, 테니포시드), 모노클로날 항체 (예: 이필리무맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아벨루맙, 알렘투주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 젬투주맙, 파니투무맙, 리툭시맙, 토시투모맙, 트라스투주맙), 빈카 알칼로이드 (예: 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 비노렐빈), 사이클로포스파미드, 프레드니손, 류코보린, 옥살리플라틴, 히알루로디나제, 또는 이들의 임의의 조합을 들 수 있다. 특정 구체예에서, 화학요법제는 베무라페닙, 다브라페닙, 트라메티닙, 코비메티닙, 수니티닙, 에를로티닙, 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 이들의 임의의 조합이다. 일부 구체예에서, 환자는 먼저 다른 면역 세포를 억제하거나 파괴하는 화학요법제로 처리된 후에 본원에 기재된 약학 조성물로 처리된다. 일부 경우에는 화학요법을 완전히 피할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 구체예에서, 본 개시의 방법은 CD20-특이적 결합 분자로 사전 처리된 대상에게 적용되며, 임의로 CD20-특이적 결합 분자는 리툭시맙, 오파투무맙, 오클렐리주맙, 우블리툭시맙, 벨투주맙 또는 이들의 임의의 조합; 또는 화학요법제 (예: CHOP [사이클로포스파미드-하이드록시다우노루비신-온코빈-프레드니손]), CHOP-R [R은 리툭시맙], 또는 CHOEP 또는 CHOEP-R [E는 에토포시드] 요법); 또는 면역 억제 성분의 억제제 (예: PD-1, PD-L1, CTLA4 등에 대한 항체)이다.
순수한 형태 또는 적절한 약학 조성물로의 본 개시의 특정 화합물 (예를 들어, 항체, 화학요법제 또는 면역 조절제) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 투여는 유사한 용도를 제공하는 약제에 대한 임의의 투여 방식을 사용하여 행해질 수 있다. 본 개시의 약학 조성물은 본 개시의 화합물을 적절한 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 배합하여 제조될 수 있으며, 고체, 반고체, 액체 또는 가스 형태의 제제, 예를 들어 정제, 캡슐제, 산제, 과립, 연고, 용액, 좌약, 주사제, 흡입제, 겔, 미세구체 및 에어로졸로의 제제로 제형화될 수 있다. 이러한 약학 조성물을 투여하기 위한 예시적인 경로는 경구, 국소, 경피, 흡입, 비경구, 설하, 협측, 직장, 질 및 비강을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 피하 주사, 정맥 내, 근육 내, 흉골 내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 본 개시의 약학 조성물 (예를 들어, 화학요법제 또는 면역 조절제)은 조성물을 환자에게 투여하는 경우 그 안에 함유된 활성 성분이 생체이용 가능하도록 제형화된다. 대상 또는 환자에게 투여될 조성물은 예를 들어, 정제가 단일 투약 단위일 수 있고, 에어로졸 형태의 본 개시의 화합물의 용기가 복수의 투약 단위를 보유할 수 있는 하나 이상의 투약 단위의 형태를 취한다. 이러한 투약 형태를 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 자명할 것이다 (예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition (Pharmaceutical Press, 2012 참조). 임의의 경우에, 투여될 조성물은 본 개시의 교시에 따른 치료 방법을 위한 치료적 유효량의 본 개시의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 함유한다.
경구 투여를 위한 고체 조성물로서, 약학 조성물은 분말, 과립, 압축 정제, 환제, 캡슐, 츄잉검, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 예시적인 고체 조성물은 하나 이상의 불활성 희석제 또는 식용 담체를 함유할 수 있다. 또한, 카복시메틸셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 미세결정질 셀룰로오스, 트라가칸트 검 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분, 락토오스 또는 덱스트린과 같은 부형제, 알긴산, 알긴산나트륨, 프리모겔 (Primogel), 옥수수 전분 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로텍스와 같은 윤활제; 콜로이드성 이산화규소와 같은 활택제; 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향료와 같은 향미제; 또는 착색제를 포함하는 하나 이상의 첨가제가 존재할 수 있다. 약학 조성물이 캡슐, 예컨대 젤라틴 캡슐의 형태인 경우에는, 상기 유형의 물질 외에, 폴리에틸렌 글리콜 또는 오일 또는 이들의 조합물과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다.
약학 조성물은 엘릭시르, 시럽, 용액, 에멀젼 또는 현탁액과 같은 액체 형태일 수 있다. 특정 구체예에서, 액체 조성물은 두 가지 예로서 경구 투여용 또는 주사 전달용으로 제형화될 수 있다. 경구 투여용인 경우, 예시적인 조성물은 하나 이상의 본 개시의 화합물 외에, 감미제, 방부제, 염료/착색제, 향미 증강제 또는 이들의 임의 조합물을 추가로 함유할 수 있다. 주사에 의한 투여 목적의 예시적인 조성물은 계면활성제, 방부제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제, 등장화제 또는 이들의 임의 조합물을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 액체 약학 조성물은 용액, 현탁액 등등 형태 여부에 상관없이, 주사용수, 생리식염수, 바람직하게는 생리식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁 매질로서 제공될 수 있는 합성 모노 또는 디글리세라이드와 같은 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤과 같은 항균제; 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 장성 조절제를 비롯한 애쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰풀, 일회용 주사기 또는 다회 용량 바이알에 봉해질 수 있다. 생리 식염수가 바람직한 애주번트이다. 주사가능한 약학 조성물은 바람직하게는 무균이다.
본 개시의 약학 조성물은 국소 투여용으로 의도될 수 있으며, 이 경우 담체는 적합한 용액, 에멀젼, 연고, 겔 베이스 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 베이스는 바셀린, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 비즈 왁스, 광유, 물 및 알콜과 같은 희석제, 유화제, 안정제 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다. 증점제는 국소 투여용으로 본 개시의 약학 조성물에 존재할 수 있다. 경피 투여용으로 의도되는 경우, 조성물은 경피 패치 또는 이온영동 장치를 포함할 수 있다.
본 개시의 약학 조성물은 예를 들어 직장에서 용융되어 활성 화합물(들)을 방출하는, 예를 들어 좌약 형태의 직장 투여용으로 의도될 수 있다. 직장 투여용 조성물은 적합한 비자극성 부형제로서 유성 염기를 함유할 수 있다. 예시적인 베이스는 라놀린, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
본 개시의 약학 조성물은 고체 또는 액체 투약 단위의 물리적 형태를 변형시키는 다양한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 활성 성분(들) 주변에 코팅 쉘을 형성하는 물질을 포함할 수 있다. 코팅 외피를 형성하기 위한 예시적인 물질은 당, 쉘락 또는 다른 장용성 코팅제와 같이 불활성일 수 있다. 다르게는, 활성 성분(들)을 젤라틴 캡슐에 봉할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 개시의 화합물 및 조성물은 고체 또는 액체 형태일 수 있다. 예시적인 고체 또는 액체 제형은 반고체, 반액체, 현탁액 및 겔 형태를 포함한다. 고체 또는 액체 형태의 본 개시의 약학 조성물은 본 개시의 화합물에 결합하여 화합물의 전달을 돕는 제제를 추가로 포함할 수 있다. 이런 역할로 작용할 수 있는 적합한 제제는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 단백질 또는 리포좀을 포함한다.
본 개시의 약학 조성물은 에어로졸로서 투여될 수 있는 투약 단위로 이루어질 수 있다. 에어로졸이라는 용어는 콜로이드성의 것에서부터 가압 패키지로 구성된 시스템에 이르는 다양한 시스템을 나타내기 위해 사용된다. 전달은 액화 또는 압축 가스 또는 활성 성분을 분배하는 적절한 펌프 시스템에 의한 것일 수 있다. 본 개시의 화합물의 에어로졸은 활성 성분(들)을 전달하기 위해 단일상, 2 상 (bi phasic) 또는 3 상 시스템으로 전달될 수 있다. 에어로졸의 전달은 함께 키트를 형성할 수 있는 필요한 용기, 활성화제, 밸브, 서브용기 등을 포함한다.
본 개시의 약학 조성물은 제약 분야의 기술 분야에서 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사로 투여되도록 의도된 약학 조성물은 본 개시의 화합물을 멸균 증류수와 혼합하여 용액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 균질한 용액 또는 현탁액의 형성을 용이하게 하기 위해 계면활성제가 첨가될 수 있다. 계면활성제는 수성 전달 시스템에서 화합물의 용해 또는 균질 현탁을 용이하게 하기 위해 본 개시의 화합물과 비공유적으로 상호 작용하는 화합물이다.
본 개시의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 치료적 유효량으로 투여되며, 이는 사용된 특정 화합물의 활성; 화합물의 대사 안정성 및 작용 길이; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 방식 및 시간; 배설률; 약물 조합; 특정 장애 또는 상태의 중증도; 및 치료를 받는 대상를 비롯한 다양한 인자들에 따라 달라질 것이다. 본 개시의 제형 및 방법에 따른 치료제의 투여 후, 시험 대상은 위약 대조군 또는 다른 적합한 대조 대상과 비교하여 치료되는 질환 또는 장애와 관련된 하나 이상의 증상에서 약 10% 내지 최대 약 99%의 감소를 나타낼 것이다.
본 개시의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 유도체는 또한 하나 이상의 다른 치료제의 투여와 동시에, 투여 전에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 이러한 병용 요법은 본 개시의 화합물 및 하나 이상의 추가의 활성제를 함유하는 단일 약학적 투약 제형의 투여뿐만 아니라 본 개시의 화합물 및 각각의 활성제를 그 자체의 분리된 약학적 투약 제형으로 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 본 개시의 화합물과 다른 활성제는 정제 또는 캡슐과 같은 단일 경구 투약 조성물로 함께 환자에 투여될 수 있거나, 또는 각각의 약제가 개별적인 경구 투여 제형으로 투여될 수 있다. 별도의 투약 제형이 사용되는 경우, 본 개시의 화합물과 하나 이상의 추가 활성제는 실질적으로 동일 시간에, 즉 병용하여, 또는 별도로 시차를 두고, 즉, 순차적으로 투여될 수 있으며; 병용 요법은 이들 모든 요법을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에 기재된 방법에서 중간체 화합물의 작용기가 적합한 보호기에 의해 보호될 필요가 있음을 당업자는 이해할 것이다. 이러한 작용기는 하이드록시, 아미노, 머캅토 및 카복실산을 포함한다. 하이드록시에 적합한 보호기는 트리알킬실릴 또는 디아릴알킬실릴 (예를 들어, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴 또는 트리메틸실릴), 테트라하이드로피라닐, 벤질 등을 포함한다. 아미노, 아미디노 및 구아니디노에 대한 적합한 보호기는 t-부톡시카보닐, 벤질옥시카보닐 등을 포함한다. 머캅토에 대한 적합한 보호기는 C(O)R" (여기서 R"는 알킬, 아릴 또는 아릴알킬임), p-메톡시벤질, 트리틸 등을 포함한다. 카복실산에 대한 적합한 보호기는 알킬, 아릴 또는 아릴알킬 에스테르를 포함한다. 보호기는 당업자에게 공지되어 있고 본원에 기재된 표준 기술에 따라 첨가되거나 제거될 수 있다. 보호기의 사용에 대해서는 [Green, T.W. 및 P.G.M. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 3rd Ed., Wiley]에 자세히 기술되어 있다. 당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 보호기는 또한 Wang 수지, Rink 수지 또는 2-클로로트리틸 클로라이드 수지와 같은 중합체 수지일 수 있다.
당업자는 비록 본 개시의 화합물의 보호된 유도체가 그 자체로 약리학적 활성을 갖지 않을지라도 포유류에 투여된 후 체내에서 대사되어 약리학적으로 활성인 본 발명의 화합물을 형성할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서 이러한 유도체는 "전구약물"로 기술할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 개시의 화합물은 전구약물의 형태이다.
또한, 유리 염기 또는 산 형태로 존재하는 본 개시의 모든 화합물은 당업자에게 공지된 방법에 의해 적절한 무기 또는 유기 염기 또는 산으로 처리함으로써 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 전환될 수 있다. 본 개시의 화합물의 염은 표준 기술에 의해 그의 유리 염기 또는 산 형태로 전환될 수 있다.
본 개시에 따른 융합 단백질을 발현하는 형질전환된 숙주 세포의 경우, 투여는 세포의 개별 분취량을 사용하여 행할 수 있다. 특정 구체예에서, 형질전환된 숙주 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 이 둘 다를 포함할 수 있는 T 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, T 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 이종 핵산을 포함한다. 특정 구체예에서, T 세포는 환자에게 투여하기 위해 CD4+ 및 CD8+ CD20 CAR T 세포의 1:1 비를 제공하도록 분류된다. 세포는 각 대상에 대해 특정 세포 용량으로 약 20 내지 30분에 걸쳐 정맥 내로 투여될 수 있다. 명시된 세포 용량은 벡터에서 융합 단백질과 조화롭게 발현되는 형질도입 마커의 발현 수준에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, T 세포는 절단된 CD19 형질도입 마커 및 CAR을 조화롭게 발현하는 하나 이상의 벡터를 사용하여 형질전환된다. 본 개시의 다양한 구체예에서 사용하기 위한 예시적인 CD20 CAR T 세포 투여 수준을 하기 표 1에 나타낸다.
CD20 CAR T 세포 제형 및 주입
용량 수준 tCD19 + CD4 +/ tCD19 + CD8 + 비 총 tCD19 + T 세포 용량 *, **
0 1:1 1 x 105/kg
1 1:1 3.3 x 105/kg
2 1:1 1 x 106/kg
3 1:1 3.3 x 106/kg
4 1:1 1 x 107/kg
* 수용자 체중 kg 당; ** 투약 수준 당 상한±15%
특정 구체예에서, 세포는 대상으로부터 표준 비-동원 백혈구분리반출술에 의해 수득된 자가 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 산물로부터 제조된다. CD8+ 세포 또는 CD4+ T 세포를 풍부화하도록 면역자기성 선택을 수행할 수 있다. 특정 구체예에서, CD8+ 세포 및 CD4+ T 세포는 별도로 풍부화되고, 각각의 서브세트는 예를 들어, 항-CD3/CD28 상자성 비드로 별도로 자극된 후, 융합 단백질을 코딩하는 벡터 (예: 렌티바이러스 벡터) 및, 임의로, 예를 들어 tCD19 형질도입 마커와 같은 형질도입 마커로 형질도입된다. 형질도입된 T 세포를 확장시킨 후, 성장을 촉진시키기 위해 CD20-발현 표적 세포주로 재자극할 수 있고, 생체 외로 추가 확장시킬 수 있으며, 이어서 주입에 특정적인 세포 용량를 달성하도록 제형화할 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 본 개시에 따른 항-CD20 CAR T 세포 (예를 들어, 1.5.3-NQ-28-BB-z)는 다음을 포함하는 방법에 따라 제조될 수 있다:
1. 백혈구분리반출술 산물의 분획으로부터 CD4+ T 세포의 풍부화 또는 전혈로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 풍부화.
2. CD4+ T 세포 풍부화와 병행하여 남아있는 백혈구분리반출술 산물 또는 PBMC로부터 CD8+ T 세포의 풍부화.
3. 글루타민, β 머캅토에탄올 및 소태아혈청 (CTL 배지 + 10% FBS), 50 IU/mL IL-2가 보충된 RPMI 1640 배지에서 임상 등급의 항-CD3 및 항-CD28 코팅된 상자성 비드 (항-CD3/CD28 비드)로 별도의 배양물에서 풍부화된 CD4+ 및 CD8+ 세포의 자극.
4. 항-CD3/CD28 비드 자극 후 1일째에 1.5.3-NQ-28-BB-C CAR 렌티바이러스 벡터로 CD4+ 및 CD8+ 세포의 형질도입.
5. CTL 배지 + 10% FBS 및 50 IU/mL IL-2에서 형질도입된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 확장.
6. CD3/CD28 자극 후 4일째에 자성 고갈에 의한 항-CD3/CD28 비드의 2× 제거.
7. 항-CD3/CD28 자극 후 7일째에 조사되고 임상적으로 적격인 형질전환된 CD20+ B 세포주 (TM-LCL)로 자극. 7일째에 진행 중의 세포 계수가 TM-LCL 자극없이 충분한 세포 확장을 예측하면 이 단계는 생략될 수 있다.
8. CTL 배지 + 10% FBS 및 50 IU/mL IL-2를 갖는 G-Rex 플라스크에서 CD4+ 및 CD8+ 세포의 확장.
9. 항-CD3/CD28 자극 후 15일째 (13-17 범위)에 각 서브세트의 세포 수확 및 동결보존 또는 주입을 위해 결합된 CD4+/CD8+ T 세포 산물의 제형화.
10. 진행 및 최종 방출 시험을 위해 제조 과정 중 적절한 시점에 CD8+ 및 CD4+ T 세포 각각으로부터 샘플 수집.
11. tCD19+ CD4+ 및 tCD19+ CD8+ T 세포를 1:1 비율로 표시된 용량으로 정맥 내 주입에 의해 환자에 투여. 대상은 림프구 제거 화학요법으로 사전 처리되고 화학요법 완료 후 적어도 36시간에 T 세포 주입을 받는다.
특정 구체예에서, 대상에 대해 생성된 세포는 제조 직후 신선한 세포로 주어질 수 있거나, 또는 먼저 액체 질소 냉동고에서 동결보존되고 저장된 다음, 해동된 세포를 세척하여 잔류하는 항동결제를 제거하고 이어 주입을 위해 제형화할 수 있다. 총 세포 수는 해동으로부터의 회복 중에 세포 손실을 처리하고 임상 프로토콜에 명시된 세포 투여 수준을 달성하기에 충분할 것이다. CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 특정 구체예에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 총 비율은 개별 대상에서 개별 서브세트의 형질도입에 차이가 있기 때문에 1:1과 다를 수 있다. 이러한 이유로, 서브세트는 형질도입된 T 세포의 바람직한 제형을 달성하기 위해 별도로 형질도입될 수 있다. CD4 및 CD8 CAR T 세포는 동물 모델에서 시너지 효과를 나타내는 것으로 입증되었다 (Sommermeyer et al., Leukemia 2015).
형질전환된 세포는 제어된 속도의 냉동고에서 냉동보존을 위해 적절한 냉동보존 배지 (예컨대, CryoStor CS10®)에 현탁될 수 있다. 냉동보존된 세포는 액체 질소 냉동고의 기상에 저장할 수 있다. 그런 다음, 신선 또는 해동된 세포를 Normosol + 1% HSA에 재현탁하고 임상 프로토콜에 명시된 총 세포 용량 수준으로 전달 팩으로 옮길 수 있다. 제형화된 제품을 2 내지 8 ℃에 보관하고, 이어 적절한 조건 하에서 투여를 위한 임상 현장으로 옮길 수 있다.
백혈구분리반출에 이어, 대상은 형질전환된 세포의 생성 동안 질환 제어를 위해 세포감퇴 화학요법을 받을 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 대상은 백혈구분리반출 후에 저강도 화학요법 (예를 들어, 레날리도마이드, 이브루티닙)을 받을 수 있다. 본 개시에 따라 형질전환된 세포를 투여하기 전에, 전달된 T 세포의 생존 촉진을 위해 림프구 제거를 제공하고, 세포 주입 전에 종양 부담을 감소시키기 위해 화학요법 또는 면역 조절 치료가 적절할 수 있다. 예를 들어, 대상은 세포의 주입 전 (예를 들어, 36-96 시간)에 예정된 시간동안 림프구 제거 화학요법을 받을 수 있다. 특정 구체예에서, 대상은 먼저 사이클로포스파미드 (CY) i.v.와 같은 화학요법제의 단일 용량으로 초기에 치료될 수 있다 (예를 들어, 1 g/㎡로). 그러나, 대상 반응률이 부적절하다고 결정되면, 차후 환자가 제2의 추가 화학요법 또는 면역조절제 (예: CY + 플루다라빈)를 투여받을 수 있도록 림프구 제거 요법을 변경할 수 있다. 또한, 대상은 세포를 투여하기 전에 예비투약을 받을 수 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다.
본원에 기재된 세포의 1회 이상의 정맥 내 주입은 림프구 제거 화학요법의 완료 후 (예를 들어, 36-96 시간 후) 대상에 투여될 수 있다. 대상에 투여된 세포의 용량은 표 1에 표시된 용량 수준에 따라 결정될 수 있으며, 투여된 세포의 양, 조성, 비율 또는 속도를 증가, 감소 또는 달리 변화시키도록 조정될 수 있다. 특정 구체예에서, 단일 주입이 대상에게 투여된다. 추가의 구체예에서, 제1 주입이 완전한 반응 (CR)을 생성하지 않거나 질환이 CR 후에 재발한다면 제2 주입이 주어질 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제3, 제4, 제5, 제6, 제7, 제8, 제9, 제10 또는 그 이상의 주입이 주어질 수 있다. 특정 구체예에서, 세포 주입은 선택된 시간 (예를 들어, 약 20 내지 30분) 동안 정맥 내로 투여될 수 있으며, 이는 비경구 약물에 대한 내독소 한계 (￡ 5 EU/kg/시간)에 대한 지침을 준수하기 위해 필요에 따라 조정된다. 대상이 경미한 주입 관련 부작용 (2급 이하)을 경험할 경우 주입 비율은 또한 조정될 수 있다.
실시예
실시예 1
재료 및 방법
세포주
Raji, Daudi 및 Ramos (버킷 림프종), Rec-1 (맨틀 세포 림프종) 및 K562 (CD20-음성 적혈구 백혈병) 종양 세포주는 ATCC로부터 입수하였다. Granta-519 (맨틀 세포 림프종)는 DSMZ에서 입수하였고, FL-18 (형질전환된 소포성 림프종)은 데이비드 말로니 (David Maloney) 박사 (Fred Hutchinson Cancer Research Center)로부터 입수하였다. CD20 발현은 실험 전 모든 세포주에서 유세포 계측법에 의해 입증되었다. 세포주를 25 mM HEPES, 10% 소태아혈청 (FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% L-글루타민이 함유된 RPMI 1640에서 배양하고 37 ℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. K562 세포에 레트로바이러스 벡터를 형질도입하여 CD20을 발현시키고, 일부 세포에 다시 렌티바이러스 벡터를 형질도입하여 인간 CD80을 발현시켰다. 제한 희석 클로닝 후 선별에 의해 저, 중 및 고 CD20-발현 K562-CD80 세포주를 수득하였다. Raji-ffLuc 세포는 반딧불이 루시퍼라제-Thy1.1-Neo를 코딩하는 레트로바이러스로 Raji 세포를 형질도입하여 생성하였으며 이전에 기술된 바와 같이 G418로 선별하였다 (James et al., Blood 2009;114(27):5454-63). 리툭시맙 내성 Raji-ffLuc 세포는 이전에 기술된 바와 같이 리툭시맙 농도를 단계적으로 증가시키는 반복적 간헐 사이클로 생성하였다 (Czuczman et al., Clin Cancer Res 2008;14(5):1561-70).
유세포 계측법
Ramos 세포주를 0 내지 200 ㎍/ml 범위의 리툭시맙 농도로 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. CD20 차단 후, 항-CD20-PE 항체 (클론 L27 [Leu16], BD Biosciences)를 첨가하고, 세포를 4 ℃ 또는 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 냉 FACS 완충액 (PBS 중 0.5% 소태아혈청 및 2.5 mM EDTA)으로 세척하고, BD Canto 2 유세포 계측기에서 분석하였다. FlowJo 버전 7.6.1 (TreeStar)을 사용하여 데이터를 분석하였다. 별도의 실험에서, FL-18 세포를 다양한 농도의 리툭시맙으로 차단하고, FACS 완충액으로 1회 세척한 다음, 항-CD20-FITC 항체 (클론 1F5, 하이브리도마로부터 사내에서 생산; Press et al., Blood 1987;69(2):584-91)를 첨가하고, 차단된 세포와 함께 4 ℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 세포를 상기와 같이 세척하고 분석하였다. 리툭시맙 대신 오파투무맙을 사용하여 유사 실험을 수행하였다.
벡터 작제물
CD20-특이적 Leu16-28-BB-z-tEGFR 작제물 (서열 번호 57)은 Leu16 scFv (Wang et al., Hum Gene Ther 2007;18(8):712-25; Wang et al., Mol Ther 2004;9(4):577-86)를 PCR로 증폭시키고, IgG4-Fc, CD28 및 41BB 도메인 및 CD3ζ 도메인을 코딩하는 epHIV7 렌티바이러스 벡터의 NheI 및 RsrII 부위 내로 클로닝하여 생성하였다 (Hudecek et al., Clin Cancer Res 2013; 19(12):3153-64). Leu1628-z 작제물 (서열 번호 49 또는 58)은 Leu16-28-BB-z-tEGFR 벡터의 스플라이스 오버랩 PCR에 의해 41BB 도메인 및 절단된 EGFR을 제거하여 생성하였다. CD20-특이적 1F5-28-BB-z CAR을 코딩하는 렌티바이러스 벡터는 이전에 기술된 것이지만 (Budde et al., PLoS One 2013;8(12):e82742), HIV-1-기반 RRL.sin.cPPT.PGK.GFP.wpre 자가-불활성화 3세대 렌티바이러스 벡터 백본으로 이입되었다 (Becker et al., Gene Ther 2010;17(10):1244-52; Dr. Hans-Peter Kiem, FHCRC으로부터). 이 작제물의 Fc 스페이서 영역은 IgG1 연접 아미노산을 IgG2 연접 아미노산 (서열 번호 9)으로 치환하고 N297Q 돌연변이 (서열 번호 10)를 이전에 기술된 바와 같이 (Hudecek et al., Cancer immunology research 2014; 3(2):125-35; Hombach et al., Gene Ther 2010;17(10):1206-13) 첨가함으로써 Fcγ 수용체에 대한 결합을 배제하고 1F5-NQ-28-BB-z 작제물 (서열 번호 50 또는 59)을 생성하도록 변형시켰다. 1.5.3-NQ-28-BB-z CAR 작제물 (서열 번호 44 또는 53)을 생성하기 위해, 코돈 최적화 알고리즘 (GenScript)을 사용하여 1.5.3 완전 인간 항-CD20 항체 (예를 들어, Bornstein et al., Invest New Drugs 2010;28(5):561-74; PCT Publication No. WO　2006/130458 참조)로부터 VL 및 VH 서열을 합성함으로써 GM-CSF 신호 펩티드 (서열 번호 18)가 앞에 놓인 15 아미노산 글리신-세린 (서열 번호 20)에 의해 분리된 신규한 scFv 서열을 제조하였다. 스플라이스 오버랩 PCR에 의해 생성된 중첩 단편을 사용하여 1F5-NQ-28-BB-z 작제물의 scFv 도메인을 대체하고 이를 AgeI/SacII 제한 부위에 클로닝하였다. 유도성 카스파제 9 자살 유전자 및 하류 2A 서열 (서열 번호 22 또는 23)을 스플라이스 오버랩 PCR에 의해 이 작제물로부터 제거하였다. 1.5.3-NQ-28-z 작제물 (서열 번호 27)은 스플라이스 오버랩 PCR에 의해 1.5.3-NQ-28-BB-z로부터 41BB 도메인을 제거함으로써 생성되었다. 모든 작제물은 생거 (Sanger) 시퀀싱으로 확인하였다. 렌티바이러스는 기술된 백본 벡터 및 패키징 벡터 pCGHP-2, pCMV-Rev2 및 pCMV-G로 일시적으로 형질감염시킨 293T 세포를 사용하여 제조하였고, 패키지 렌티바이러스를 함유하는 상등액을 원심분리에 의해 100배 농축시켰다.
T 세포 단리 및 형질도입
말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)는 Puget Sound Blood Center에서 구입한 익숙한 Pall 백혈구 필터로부터 또는 FHCRC의 임상연구 심의위원회 (IRB)에서 승인한 연구 프로토콜 하에 동의서를 제출한 건강한 기증자로부터 분리반출법에 의해 얻었다. 암모늄-클로라이드-칼륨 (ACK) 완충액으로 적혈구 용해시킨 Ficoll-Paque 밀도 구배 배지로 원심분리에 의해 PBMC를 단리한 뒤, 10% DMSO 및 90% FBS에서 동결보존하였다. 시험관 내 실험을 위해, Pan T 세포 단리 키트 II (Miltenyi Biotec)를 사용하여 MACS에 의해 해동된 PMBC로부터 T 세포를 음성으로 선택하였다. 세포독성 실험을 위해, 동결보존 전에 항-CD8 항체가 코팅된 비드 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 MACS에 의해 건강한 기증자의 분리반출 PBMC로부터 CD8+ T 세포를 양성으로 선택하였다. 일부 실험의 경우, CliniMACS 항-CD14 및 항-CD45RA 비드 (Miltenyi Biotec)와 함께 인큐베이션한 후, AutoMACS 장치를 사용하여 음성적 선택에 의해 동결보존하기 전에 건강한 기증자의 분리반출 PBMC로부터 중추 기억 T 세포 (TCM)를 단리하고, CliniMACS CD62L 비드로 양성적 선택을 하였다. 다른 실험에서, 항-CD4 또는 항-CD8 비드 (Miltenyi Biotec)를 사용하여 양성 면역자기성 선택에 의해 CD4 및 CD8 세포를 풍부화시켰다. 선택된 T 세포를 3:1 비드:T-세포 비율로 αCD3/αCD28 Ab 코팅된 인간 T-확장기 비드 (Invitrogen)로 자극하였다. 다음날, 활성화된 T 세포를 CD20 CAR 작제물 (2-6의 감염 다중도) + 4-8 μg/ml 폴리브렌 중 하나를 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 스핀-형질도입시켰다 (32 ℃에서 60분간 2100 rpm). 형질도입된 T 세포를 10 ng/ml rhIL-15 (Miltenyi Biotec)의 존재 또는 부재하에 재조합 인간 인터류킨 2 (rhIL-2) 50 IU/ml를 포함하는 배지에서 배양하고, αCD3/αCD28 비드의 자기성 제거 전 자극 후에 4-5 일간 인큐베이션한 뒤고, 유세포 계측법으로 분석하여 CAR 발현을 확인하였다. CAR+ T 세포를 기능 분석에 사용하였다.
생체 내 마우스 실험을 위해, TCM 또는 CD4 및 CD8-풍부화된 T 세포를 해동시켜 활성화시키고, 다음날 각 실험에서 지시된 작제물을 코딩하는 농축된 렌티바이러스 상등액으로 형질도입시켰다. 5일째에 CD3/CD28 비드를 제거하고, 세포를 50 IU/mL rhIL-2에서 확장시킨 후, 7-10 일에 1:1 반응인자:자극인자 비율로 조사된 CD20+ LCL로 재자극시키고, LCL로 재자극 후 8-11일에 마우스에 주사하였다.
증식 및 사이토카인 분비 분석
5 μM 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)로 염색된 T 세포 (2 × 105 총 세포)를 8000-10000 cGy로 조사시킨 종양 표적 주와 1:1 비율로 공배양하였다. 리툭시맙 차단 실험에서, 조사된 표적 세포를 T 세포와 공-인큐베이션하기 전에 다양한 리툭시맙 농도로 실온에서 30분 동안 큐베이션하였다. 플레이팅 24시간 후 상등액을 수집하고, 인터페론-감마 (IFN-γ), 인터류킨-2 (IL-2) 및 TNF-α를 정량하기 위해 이전에 기술된 바와 같이 (Till et al., Blood 2012;119(17):3940-50) Luminex 분석에 의해 후속 사이토카인 분석때까지 -20 ℃에서 보관하였다. 4-5일 후, 세포를 항-CD3-APC (BioLegend)로 염색하고, 증식 척도로서 CD3-게이팅 림프구의 CFSE 희석을 유세포 계측법으로 측정하였다. 활성화의 또 다른 척도로서 세포 크기를 전방 산란 (FSC-A) 파라미터의 기하 평균을 사용하고 휴지 T 세포의 세포 크기를 뺀 값을 사용하여 유세포 계측법으로 측정하였다. 유세포 계측법 데이터를 FlowJo 소프트웨어 (v7.6.1; Treestar, Ashland, OR)를 사용하여 분석하였다. 일부 실험에서는, 리툭시맙 대신 오파투무맙이 사용되었다.
사이토카인 분비의 평가를 또한 IFN-γ의 세포 내 염색으로 결정하였다. CD20 CAR+ CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 조사된 K562 또는 K562-CD20 세포와 함께 24시간 동안 공배양하였다. 세포 내 염색을 위해, 세포를 고정시키고, 얼음 위에서 15분 동안 BD Cytofix/Cytoperm 키트 (BD Biosciences)로 투과처리하였다. 이어 세포를 고정 및 투과 후 얼음에서 1시간 동안 항-IFN-γ (Biolegend)로 염색하였다. 데이터를 BD FACSCanto (BD Biosciences)로 분석하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
세포독성 분석
이전에 기술된 바와 같이 (Wang, et al. Hum Gene Ther. 2007;18:712-725 참조), CD20 CAR CD8+ T 세포를 51Cr-표지된 표적 세포주와 4-5시간 동안 공인큐베이션하여 표준 51Cr-방출 분석을 수행하였다. 5% IGEPAL CA-630으로 용해시킨 표지된 세포 상등액의 51Cr 함량을 직접 측정하여 최대 51Cr 방출을 결정하였다. 상등액을 96-웰 Lumaplate에서 수거하고, 밤새 공기 건조시킨 후, 카운트를 TopCount (PerkinElmer)로 분석하였다. [샘플 - Minavg]/[Maxavg - Minavg] * 100의 식에 의해 세포독성 백분율을 계산하였다.
리툭시맙 차단 실험을 위해, 51Cr-표지된 표적 세포주를 다양한 리툭시맙 농도 (0 내지 200 ㎍/mL 범위)에서 30분 동안 인큐베이션하고 (10, 25, 50, 100 및 200 ㎍/ml의 최종 농도를 산출하도록 최초 배양 중 최종 농도는 2배로), 다양한 이펙터에서 표적 (E:T) 비율로 CAR+ CD8+ T 세포를 첨가하였다. 세포를 U-바닥 96-웰 플레이트에서 51Cr로 표지된 리툭시맙-차단 표적 세포와 함께 열-불활성화된 FBS를 함유하는 배지에서 37 ℃에서 5시간 동안 중복 배양하였다. 표적 세포를 함유하는 대조 웰은 리툭시맙으로 유도되는 CDC의 가능성을 배제하기 위해 T 세포가 없는 리툭시맙 함유 배지 ("0:1 "E:T 비율로서 도면에 나타냄)에서 인큐베이션하였다. 일부 실험에서는 리툭시맙 대신 오파투무맙이 사용되었다.
CAR T 세포 효능에 대한 리툭시맙 효과의 생체 내 평가
6-10 주령의 5-10 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NOD/SCID/γ-/- [NSG]) (Jackson Laboratory) 마우스 군에 5×105 리툭시맙-내성 Raji-ffLuc 또는 Granta-519 림프종 세포를 꼬리 정맥에 2-7일 동안 접종하였다. 2 내지 7일 후 (각 실험에서 지시된 바와 같이), 107개의 CD20 CAR T 세포 (tCD19+) 또는 빈 벡터 T 세포를 꼬리 정맥으로 주사하였다. 리툭시맙 차단 실험에서, 종양 접종 5일 후 및 CAR T 세포 투여 1일 전에 25 또는 200 ㎍의 리툭시맙을 복강 내로 (i.p.) 투여하였다. 종양 성장을 결정하기 위한 생체발광 이미징 (bioluminescence imaging)을 공지된 방법을 사용하여 수행하였다 (James et al., Blood 2009;114(27):5454-63; Rufener et al., Cancer Immunol Res. 2016;4:509-519 참조). 이미지 포화에 이르지 않고 최대 감도를 얻도록 비닝 (Binning) 및 노출을 조정하였다. GraphPad Prism 6 소프트웨어와 함께 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 생존 곡선을 생성하였다.
입양적으로 전달된 T 세포의 지속성을 시험하기 위해, 레트로오비탈 출혈에 의해 다양한 시점에서 수집한 전혈을 ACK 용해 완충액 (Quality Biological)으로 용해시켰다. 종양 접종 후 6일 및 13일에 레트로오비탈 총 (retro-orbital plexus)으로부터의 응괴된 혈액 표본을 원심분리하여 마우스 혈청을 얻고, ELISA 분석을 사용하여 혈청 리툭시맙 수준을 측정하여 이전에 기술된 것처럼 리툭시맙 농도를 결정하였다 (Gopal AK, et al., Blood 2008;112(3):830-5; Maloney DG, et al., Blood 1997;90(6):2188-95 참조). 단리된 세포의 Fc 수용체를 정맥 내 면역글로불린 (IVIG)으로 차단하고, 세포를 mCD45 (30-F11, Biolegend), hCD3 (HTT3a, Biolegend) 및 hCD19 (HIB19, BD Bioscience)에 대한 모노클로날 항체 (mAbs)로 염색하였다. BD Canto 2로 데이터를 수집하고 FlowJo Software (Treestar)에서 분석했다. 마우스 연구는 FHCRC 실험동물 운영위원회에 의해 승인되었다.
환자 혈청 샘플
인간 혈청 샘플은 IRB 승인 및 헬싱키 선언에 따라 사전 동의를 받은 후 B 세포 림프종 환자에 의해 제공받았다. 혈청 샘플은 리툭시맙 함유 샐비지 화학요법 후 4개월 이내에 수집하였다. 혈청 리툭시맙 농도는 이전에 공개된 바와 같이 측정되었다 (Maloney et al., Blood 1997;90(6):2188-95).
실시예 2
항-CD20 scFV를 포함하는 CAR에 의한 CD20 결합에 미치는 리툭시맙 효과
각각 CD20 분자의 대세포 외 루프 상의 에피토프에 결합하는 Leu16 (L27; Till et al., Blood 2008;112(6):2261-71; Till et al., Blood 2012;119(17):3940-50 참조) 또는 1F5 항체 (Wang J, et al., Hum Gene Ther 2007;18(8):712-25; Budde et al., PLoS One 2013;8(12):e82742 참조)인, 2개의 다른 뮤린 모노클로날 항체 유래 scFv를 사용한 CD20-지향 CAR이 이전에 시험되었다 (Polyak et al., Blood 2002;99(9):3256-62 참조). 이들 CD20 에피토프는 리툭시맙 에피토프와 중복되고 (Polyak et al., Blood 2002;99(9):3256-62 참조), 따라서 리툭시맙은 이들 CAR의 결합을 차단할 것으로 기대된다. Leu16 Ab와 인큐베이션하기 전에 Ramus 림프종 세포를 리툭시맙과 예비 인큐베이션함으로써, 유세포 계측법을 사용하여 다양한 농도의 리툭시맙이 Ramus 림프종 세포 상에서 발현된 CD20에 대한 Leu16 항-CD20 항체의 결합을 차단하는 능력에 대해 평가하였다. 용량 의존적인 CD20의 차단이 관찰되었으며, 4 ℃에서 50 μg/ml의 리툭시맙에서 거의 완전한 차단을 보였다. 그러나 항-CD20-PE (Leu16)를 37 ℃의 생리학적으로 관련된 온도에서 인큐베이션하면, 200 μg/ml의 리툭시맙에서도 저 수준의 CD20 결합이 일어났다 (도 2A-2F). FL-18 세포에서 1F5 항-CD20 항체를 사용한 실험에서도 유사한 발견이 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음). 따라서, 리툭시맙은 본 개시의 항-CD20 CAR과 중복되는 에피토프에 결합하고, CD20+ 표적 세포에 대한 CAR T 세포 활성을 간섭할 가능성이 있다.
실시예 3
리툭시맙이 CAR T 세포의 시험관 내 기능에 미치는 영향
다양한 CD20+ B 세포 NHL 세포주와 함께 인큐베이션한 후 5개의 상이한 CD20 CAR 렌티바이러스 작제물을 사용하여 증식, 사이토카인 분비 및 세포독성을 측정함으로써 리툭시맙에 의한 CD20 차단이 CD20 CAR T 세포의 기능에 미치는 영향을 평가하였다. CAR 작제물 (도 1A 및 1B)은 3 세대 Leu16-28-BB-z-tEGFR 및 1F5-28-BBz 작제물 (Budde et al., PLoS One 2013;8(12):e82742 참조), 2 세대 Leu16-28-z 작제물, 및 완전 인간 1.5.3 항-CD20으로부터 유래된 두 CD20 CAR (1.5.3-NQ-28-BB-z 및 1.5.3-NQ-28-z) (이는 리툭시맙과 중복되는 에피토프에 또한 결합한다 (Bornstein et al., Invest New Drugs 2010;28(5):561-74 참조))이었다. CAR 발현은 전형적으로 T 세포의 40-80%에서 달성되었다 (데이터는 나타내지 않음).
리툭시맙의 존재하에 다양한 NHL 표적 세포주 (Raji, Daudi, Rec-1 및 FL-18)와 함께 배양한 경우 CFSE-표지된 CAR T 세포의 증식은 크게 감소되지 않았다. 200 μg/ml까지 농도의 리툭시맙 존재하에 표적 세포로 자극된 CAR T 세포는 리툭시맙 부재하에 자극 후 관찰된 증식의 96% 초과를 나타내었다 (도 3A). 세포 크기는 T 세포 활성화의 또 다른 척도이다 (Grumont et al., Immunity 2004;21(1):19-30 참조). CAR+ T 세포를 세포 크기의 추정치로서 전방 산란에 대한 유세포 계측법으로 분석한 결과, 리툭시맙과 예비 인큐베이션된 Raji, Daudi 또는 Rec-1 종양 세포에 의한 자극 후 CAR T 세포의 중간 크기는 리툭시맙에 노출되지 않은 대조군 세포 크기의 85% 초과로 나타났다 (도 3A). FL-18 세포와 함께 인큐베이션된 T 세포는 리툭시맙과 인큐베이션 후 세포 크기가 약간 더 확연하지만 여전히 완만한 감소를 보였다 (200 μg/ml에서 대조군 세포 크기의 73%).
증식과 대조적으로, CAR T 세포에 의한 사이토카인 분비는 증가하는 리툭시맙 수준의 존재하에서 감소하는 것으로 밝혀졌다 (도 3B). 그러나 100 μg/ml의 리툭시맙에서도 사이토카인 IFN-γ, IL-2 및 TNF-α는 각각 기저 수준의 34-51%, 70-92% 및 79-108%으로 생성되었다. CD20 CAR T 세포 활성의 항원 특이성을 입증하기 위해 대조군으로서 CD20-음성 K562-CD80 세포와 함께, 표적으로서 CD80 및 CD20을 발현하도록 유전자 변형된 K562 세포를 사용하여 유사한 결과가 관찰되었다 (도 6A 및 6B).
리툭시맙이 다양한 CD20+ NHL 표적 세포주에 대한 CAR+ T 세포의 세포 용해 활성에 미치는 영향을 또한 조사하였다. CAR+/CD8+ T 세포를 이펙터로, Raji, FL-18, Granta 또는 Rec-1을 표적으로 한 표준 51Cr-방출 분석을 사용하여, 세포독성은 50 μg/ml까지의 리툭시맙 농도에서 최소로 감소된 것으로 나타났으며 (도 4), 기준 세포 용해 활성의 65% 초과가 시험된 모든 표적 세포주에 대해 100 ㎍/ml의 리툭시맙 농도에서 유지되었다.
완전 인간 1.5.3-NQ-28-z 및 1.5.3-NQ-28-BB-z CAR T 세포의 시험관 내 기능을 리툭시맙 존재하에 시험하였다. Leu16 및 1F5 CAR의 경우와 마찬가지로, 리툭시맙으로 예비 처리된 표적 세포에 대한 사이토카인 분비 및 세포독성의 온건한 용량 의존적 감소가 관찰되었지만, 증식은 관찰되지 않았다.
실시예 4
CD20의 발현 수준이 항-CD20에 대한 CAR T 세포 감수성에 미치는 영향
종양 세포에서의 CD20 발현 수준이 리툭시맙 차단에 대한 감수성에 영향을 미칠 수 있는지를 조사하기 위해, 제한 희석 클로닝 후 저, 중 및 고 수준의 CD20 발현을 갖는 K562-CD80 세포주를 시험용으로 선택하였다 (도 10). 시험관 내 CAR T 세포 기능을 다양한 농도의 리툭시맙 존재하에서 다시 평가하였다. NHL 세포주와 마찬가지로, CAR T 세포의 증식은 표적 세포상의 CD20의 발현 수준에 관계없이 완전히 온전하였다 (도 5A). CD20high 세포를 표적으로 사용한 경우 세포 크기는 줄어들지 않았지만 세포 크기의 완만한 감소가 CD20을 낮은 수준으로 발현하는 세포에서 관찰되었다. 증식 및 세포 크기와 대조적으로, IFN-γ, IL-2, TNF-α 수준은 100-200 μg/ml의 리툭시맙 농도에서 각각 기준치의 5%, 17%, 22%로 낮아, CD20low 표적 세포로 자극시 사이토카인 분비가 현저히 저하 (도 5B, 도 11A-11E)된 반면, CD20high 표적으로 자극된 T 세포는 100 μg/ml의 리툭시맙 농도에서 기준 활성의 75% 초과를 유지하였다.
CD20 항원 밀도가 CAR T 세포의 세포 용해 활성의 리툭시맙-매개 억제에 미치는 영향을 도 5C에 나타내었다. 높은 수준의 CD20을 발현하는 표적 세포의 T 세포 살상은 낮은 E:T 비율에서도 리툭시맙에 의해 최소로 영향을 받았다. 그러나, CD20low 및 CD20medium K562-CD80 표적에 대한 T 세포 세포독성의 용량 의존적인 감소가 있었으며, 이펙터 대 표적 (E:T) 비율이 낮을 때 가장 두드러졌다. CD20low 표적에 대한 세포 용해 활성은 200 μg/ml 리툭시맙에서 50:1 E:T 비에서 기준선의 47%에서 유지되었지만 2:1 E:T 비에서는 기준선의 16%에 불과하였다.
실시예 5
잔류 리툭시맙의 존재하에서 CD20 CAR T 세포의 생체 내 항종양 활성
상기 시험관 내 실험은 중등 수준의 리툭시맙이 존재함에도 불구하고 CD20 CAR T 세포가 CD20+ 종양에 대하여 유의한 기능을 보유함을 나타내었다. 이러한 관찰이 생체 내 환경에서 어떻게를 변환되는지를 평가하기 위해, 마우스 림프종 모델에서 잔류 리툭시맙이 CAR T 세포 활성에 미치는 영향을 조사하였다.
배경으로, 단일 약제로서의 리툭시맙은 면역이 손상된 마우스 이종이식 모델에서 Raji 세포에 대하여 유의적인 항종양 활성을 갖는다 (Hernandez-Ilizaliturri FJ, et al., Clin Cancer Res 2003;9(16 Pt 1):5866-73 참조). 병용 요법 실험에서 리툭시맙으로 인한 잠재적 교란 치료 효과를 극복하기 위해, 이전에 기술된 방법 (Czuczman MS, et al., Clin Cancer Res 2008;14(5):1561-70 참조)을 사용하여 리툭시맙 내성 Raji 세포주 (RR-Raji)를 생성시켰으며, CD20 발현은 이 세포주에서 유지되는 것으로 확인되었다 (도 12).
NSG 마우스에 RR-Raji 세포를 i.v.로 접종하고, 접종 5일 후에 종양이 확립되면, 일부 군을 고 또는 저용량 리툭시맙으로 처리한 후, 다음날 CD20 CAR+ T 세포를 i.v.로 투여하였다 (도 7A). 리툭시맙 단독 투여 마우스는 완만하고 일시적인 항종양 효과를 보였지만, 모두 24일까지 종양 진행으로 사망한 반면, CAR T 세포 단독 처리 마우스에서는 마우스의 40%에서 종양 근절과 2배의 중간 생존을 보여 (52일) 유의적인 종양 퇴화를 나타내었다. T 세포 주입 전날 리툭시맙을 투여한 마우스는 CAR T 세포만을 투여한 마우스와 비교하여 생체 내 CAR T 세포 활성이 저하되지 않았다; 25 μg/ml 리툭시맙 군에서 한 마리의 마우스와 200 μg/ml 리툭시맙 군의 모든 마우스에서 종양 근절이 입증되었다 (도 7B 및 7C;도 13A 및 13B).
이러한 종양 축소가 생리학적으로 관련된 리툭시맙 혈청 농도의 존재에서 일어났음을 확인하기 위해, 리툭시맙으로 처리된 마우스의 혈청을 T 세포 주입 당일과 1주일 후에 수집하고, 혈청 리툭시맙 농도를 측정하였다. 200 μg/ml 리툭시맙을 투여받은 마우스는 1주 후 138.5 μg/ml (54.5-173.6 범위) 및 39.7 μg/ml (1.6-51.9 범위)의 초기 중앙 혈청 리툭시맙 농도를 보였고, 25 μg/ml 리툭시맙을 투여받은 마우스는 기준선에서 11.7 μg/ml (2.8-17.8 범위) 및 T 세포 주입 후 1주에 0 μg/ml의 중앙 농도를 보였다 (도 7D).
또한, 순환 CAR T 세포 수준을 종양 주입 28일 후 유세포 계측법으로 정량화하였다. CAR T 세포 단독 또는 리툭시맙과 CAR T 세포를 투여받은 마우스 사이에 CAR T 세포 수준의 유의한 차이는 없었으며, 이는 리툭시맙의 존재가 CAR T 세포의 생체 내 지속성을 손상시키지 않음을 나타낸다 (도 14A-14C).
실시예 6
샐비지 리툭시맙 함유 요법으로 처리된 환자의 혈청 리툭시맙 농도
위의 결과를 임상적 맥락으로 평가하기 위해, 연구 프로토콜에 따라 자가 줄기 세포 이식을 받았고 이식 전 혈청 리툭시맙 측정이 이용가능한 B 세포 NHL 환자의 데이터베이스에서 대상으로 한 환자 집단에서 잔류 혈청 리툭시맙 수치의 임상적 관련 범위를 질의하였다 (Gopal et al., Blood 2008;112(3):830-5 참조). 혈청 채취 4개월 내 (0.5-3.8개월, 중앙값 1.8)에 리툭시맙-함유 화학치료 요법을 받은 총 103명의 환자를 확인하고, 이들 환자에서 리툭시맙 농도의 중앙값은 38.3 μg/ml 였으며, 사분위수 범위는 19.1-71.7 μg/ml이었다 (도 7E). 리툭시맙의 농도는 환자의 86%에서 100 ㎍/㎖ 이하였다.
실시예 7
오파투무맙이 CD20 CAR T 세포 기능에 미치는 영향
CAR 기능에 미치는 항-CD20 항체의 효과에 대한 에피토프 위치의 중요성을 결정하기 위해, 리툭시맙으로부터 상이한 에피토프에 결합하는 항-CD20 항체로서, 커다란 루프의 상이한 영역뿐만 아니라 더 작은 CD20 세포 외 루프를 포함하는 오파투무맙으로 시험관 내 분석을 반복하였다 (Du et al., Mol Immunol 2009;46(11-12):2419-23; Teeling et al., J Immunol 2006;177(1):362-71 참조). Leu16 항-CD20 항체의 결합을 차단하는 오파투무맙의 능력을 먼저 유세포 계측법에 의해 평가하였는데, 이는 상이한 에피토프에도 불구하고 제2 항체의 결합이 오파투무맙에 의해 크게 차단되었음을 보여주었다. 더욱이, 결합의 차단은 리툭시맙보다 더 낮은 농도에서 이루어졌다 (도 2D-F). 이어, 다양한 농도의 오파투무맙으로 예비 인큐베이션된 Rec-1 및 Raji-ffLuc 림프종 세포에서 시험관 내 기능 분석을 수행하였다 (도 8A-8C). 결과는 증식과 세포 크기가 최소한으로 영향을 받았다는 점에서 리툭시맙의 것과 유사하였지만 사이토카인 생산은 용량 의존적인 방식으로 더 영향을 받았다. 리툭시맙과 비교하여, 세포독성은 오파투무맙의 존재하에서 보다 크게 감소되었다. 이러한 결과는 항-CD20 항체의 억제 효과가 입체적 억제에 기인하고 CAR 결합 에피토프의 차단을 지시하지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, 오파투무맙의 보다 강력한 억제 효과는 리툭시맙과 비교하여 느린 오프율 (off-rate)에 기인한다. 이것은 4 ℃ 또는 37 ℃에서 경쟁적인 세포 결합 유세포 계측법 연구 (도 2D-F)로 뒷받침되었으며, 이전에 보고된 데이터와 일치하는 것으로, 오파투무맙의 해리가 훨씬 낮았음이 확인되었다 (T, Teeling et al., Blood 2004;104(6):1793-800 참조).
실시예 8
시험관 내에서 다양한 CAR 작제물에 의한 사이토카인 분비
중추 기억 (CD14-CD45RA-CD62L+) T 세포를 항-CD3/CD28 항체 코팅된 비드로 자극하고, 24시간 후에 지시된 CAR 작제물을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입한 후, 생체 내에서 확장시켰다. 14일에, 세포를 조사된 Raji-ffLuc 세포 (도 15A 및 도 15C), Granta-519 세포 (도 15B) 및 Jeko 세포 (도 15D)로 재자극하였다. "19-BB-z" 작제물은 임상 시험에 사용되는 임상 등급의 CD19 표적 CAR이며, 양성 대조군으로 제공된다. 24시간 후 상등액을 수확하고, Luminex 분석법으로 인터페론 (IFN)-γ, IL-2 및 종양 괴사 인자-α 수준에 대해 분석하였다.
실시예 9
CD20 세포 T 세포에 의한 사이토카인 분비
1.5.3-NQ-28-BB-z 렌티바이러스 벡터로 형질도입되고 생체 외에서 확장된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 조사한 Raji-ffLuc CD20+ 림프종 세포로 재자극하였다. 24시간 후 Luminex 분석에 의해 세포 상등액에서 지시된 사이토카인의 분비를 측정하였다. (도 16A). 냉동보존된 CD4+ 및 CD8+ CD20 CAR T 세포를 해동시키고, K562 세포 또는 CD20을 발현하는 K562 세포로 재자극시킨 뒤, 24시간에 유세포 계측법에 의래 IFN-γ에 대한 세포 내 염색으로 분석하였다 (도 16B).
실시예 10
다양한 CAR 작제물의 시험관 내 세포독성
중추 기억 (CD14-CD45RA-CD62L+) T 세포를 항-CD3/CD28 항체 코팅된 비드로 자극하고, 24시간 후 지시된 CAR 작제물을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입한 뒤, 생체 내에서 확장시켰다. 14일에, 세포를 표준 4-시간 51Cr-방출 분석에 이펙터로서 사용하였고, 표적으로는 (도 17A 및 17B) Raji-ffLuc 및 (도 17B) Jeko 세포를 사용하였다. "19-BB-z" 작제물은 임상 시험에 사용되는 임상 등급의 CD19 표적 CAR이며 양성 대조군으로 제공된다. 각 CAR T 세포 집단의 특이적인 표적 세포 용해가 나타난다.
실시예 11
CD20 CAR T 세포의 증식
CD8+ T 세포를 1.5.3-NQ-28-BB-z 렌티바이러스 벡터로 형질도입 (또는 모의 형질도입)하고, 생체 내에서 확장시킨 후, 냉동보존하였다. 이어서, 세포를 해동시키고, 카복시플루오레세인 숙신아미딜 에스테르 (CFSE)로 염색한 다음, 조사된 CD20+ Raji-ffLuc 림프종 세포, K562 세포 또는 CD20을 발현하는 K562 세포로 재자극하였다. 세포를 4일 후 유세포 계측법으로 분석하였다. (도 18A) CAR+ 세포 (CD3+/tCD19+에 게이팅)의 CFSE 희석이 도시된다. 파선 히스토그램은 배양 배지 단독에서 T 세포의 CFSE 형광을 나타내며, 실선 히스토그램은 표적 세포와 함께 배양된 T 세포이다. (도 18B) 분할된 세포의 백분율을 각 군별로 나타낸다.
실시예 12
다양한 CAR 작제물의 생체 내 항종양 활성
중추 기억 (CD14-CD45RA-CD62L+) T 세포를 항-CD3/CD28 항체 코팅된 비드로 자극하고, 24시간 후 지시된 CAR 작제물을 코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하고, 생체 내에서 확장시켰다. "19-BB-z" 작제물은 우리 센터에서 임상 시험에 사용된 임상 등급의 CD19 표적 CAR이며 벤치마크 대조군으로 제공된다. NSG 마우스에 Raji-ffLuc 종양 세포를 i.v.로 주사하고, 2일 후 빈 벡터 또는 1.5.3-NQ-28-BB-z CAR, 1.5.3-NQ-28-z CAR, JCAR-014 (항-CD19-41BB-ζ)로 형질도입된 확장된 중추 기억 (CD14-CD45RA-CD62L+) T 세포를 i.v.로 주사하였다. (도 19A) 생체발광 이미징에 의해 평가된 시간 경과에 따른 종양 부담; 및 (도 19B) 전체 생존의 카플란-메이어 (Kaplan-Meier) 플롯.
실시예 13
맨틀 세포 림프종에 대한 CD20 CAR T 세포의 생체 내 활성
CD4+ 및 CD8+ CD20 CAR T 세포를 1.5.3-NQ-28-BBz CAR로 형질도입하고, 7일전에 Granta-ffLuc 맨틀 세포 림프종 세포를 꼬리 정맥으로 접종한 NSG 마우스를 처리하는데 사용하였다. 전체 생존의 카플란-메이어 (Kaplan-Meier) 플롯이 도 20에 도시되었다.
실시예 14
생체 내 CAR T 세포 지속성 및 관련 생리학적 효과
CD20 CAR T 세포 또는 빈 벡터 tCD19-발현 T 세포를 Raji-ffLuc 파종성 종양을 가진 NSG 마우스에 주입한 후 레트로오비탈 혈액 샘플을 일련의 시점에 수득하였다. tCD19 형질도입 마커를 발현하는 CD20 CAR T 세포를 인간 CD3+/마우스 CD45-음성/인간 CD19+ 세포로서 각각의 시점에 유세포 계측법으로 정량화하였다. (도 21A) 세 주입 후 시점에서의 tCD19+ T 세포가 혈액 중 전체 유핵 세포의 백분율 (최초 CAR T 세포군에서 n = 9)로서 도시되었다. 빈 벡터 마우스로부의 절단 CD19+ 세포가 참조 용으로 도시되었다. (도 21B) 별도의 실험에서, 각 군의 두 마리 마우스로부터의 tCD19+ 세포 (빈 벡터 대 CAR T 세포)를 매주 측정하여 세로로 나타내었다.
또한, CD20 CAR T 세포로 처리한 마우스를 체중, 일반적인 행동 및 외관, 신체 활동, 자세, 몸의 습관, 피부색, 설사의 존재, 눈, 입 또는 피부 염증의 징후, 혼수 상태, 또는 심한 빈혈의 징후 (창백한 귓바퀴 또는 발 또는 점막)에 기초해 독성 징후에 대해 모니터링하였다. CD20 CAR T 세포를 사용한 11 가지 실험에서 어떤 마우스에서도 T 세포 관련 독성의 징후는 관찰되지 않았으나, 나중 시점에서 일부 마우스에서 이종 이식편 대 숙주 질환의 소견이 발견되었다. 이러한 소견은 CD20 CAR T 세포를 투여받은 마우스 및 빈 벡터 세포를 투여받은 마우스 모두에서 발생했기 때문에 CAR 벡터와는 관련이 없고 오히려 이종 T 세포 이입의 알려진 결과이다. 각 실험에서, 각 마우스의 체중을 주당 적어도 3회 기록하였는데, 말기 종양 진행을 겪은 마우스의 경우를 제외하고는 일반적으로 안정적이었다 (체중 감량은 생의 마지막 며칠에 걸쳐 일어났으며, 데이터는 나타내지 않았다).
마지막으로, 동물의 생리적 기능을 결정하기 위해 두 실험에서 마우스의 서브세트로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 첫 번째 실험에서, Granta 맨틀 세포 림프종 종양이 있는 마우스를 형질도입하지 않은 T 세포, CD20+ TM-LCL 세포로 재자극되지 않은 CD20 CAR T 세포 또는 TM-LCL 세포로 재자극된 CD20 CAR T 세포로 처리하였다 (생으로 주입되거나 일차 냉동보존 후 해동시켜 주입됨). 혈중 요소 질소 (BUN) 및 크레아티닌을 이용하여 신장 기능을 측정하고, 알라닌 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제 (ALT와 AST)를 이용하여 간 기능을 측정하였으며, 처리된 마우스의 레트로오비탈 혈액 샘플 중 백혈구 세포수 (WBC), 헤모글로빈 및 혈소판 수로 골수 기능을 측정하였다 (데이터는 나타내지 않음). 처리되지 않은 마우스와 비교하여, BUN 또는 크레아티닌의 증가 또는 간 기능의 현저한 변화는 CAR T 세포로 처리된 마우스에서 관찰되지 않았다. TM-LCL 세포로 재자극되지 않은 CAR T 세포로 처리된 마우스는 처리되지 않은 마우스와 비교하여 WBC가 떨어졌지만, TM-LCL로 재자극된 T 세포로 처리된 마우스에서는 관찰되지 않았다. TM-LCL-재자극된 CAR T 세포로 처리된 마우스에서 헤마토크릿의 소폭 감소 (그러나 헤모글로빈은 아님)가 관찰되었지만, 이는 재자극되지 않은 CAR T 세포를 투여받은 마우스에서는 보이지 않았다. 혈소판 수는 재자극되지 않은 CAR T 세포를 투여받은 마우스에서 증가했지만, 재자극된 CAR T 세포를 투여받은 마우스에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다.
두 번째 실험에서는, Raji-ffLuc 종양이 있는 마우스를 저용량 (1 × 106 CAR+ 세포/마우스) 또는 고용량 (5 × 106 CAR+ 세포/마우스)으로 처리하고, 신장 및 간 기능을 평가하였다. T 세포를 투여받은 마우스에서 BUN이 증가하는 추세를 보였으나 혈청 크레아티닌에는 변화가 없었다 (데이터는 나타내지 않음). 간 전이 효소의 상승은 관찰되지 않았다.
실시예 15
항-CD20 CAR 치료의 임상 연구
1.5.3-NQ-28-BB-z인 CD20-특이적 CAR을 발현하기 위해 형질도입된 자가 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 1:1 혼합물로 입양 T 세포 요법의 안전성과 최대 내약 용량 (MTD)을 평가하기 위한 I/II 상 연구가 설계되었다. 이 연구에서 T 세포를 형질도입하는데 사용된 상기 작제물을 가진 자기 불활성 (SIN) 렌티바이러스 벡터는 3세대 HIV-1 유래 렌티바이러스로서, 인간 CD20의 대세포 외 루프에서 에피토프를 인식하고, 변형된 인간 IgG1 힌지/스페이서 영역, 인간 CD28 막관통 및 세포 내 도메인, 및 인간 4-1BB 및 CD3ζ 신호전달 도메인에 연결된 1.5.3 완전 항 인간 모노클로날 항체로부터의 scFv를 코딩한다 (도 1A). 벡터는 또한 자가 절단가능한 E2A 요소에 의해 CAR 카세트로부터 분리된 비기능성 절단 세포 표면 인간 CD19 (tCD19)를 코딩하여 생체 내에서 CAR T 세포의 추적을 용이하게 한다. CD19의 절단은 인산화 부위로서 작용하는 모든 티로신 잔기를 제거하면서 19개의 아미노산으로 세포 내 도메인을 단축시키지만, 항-CD19 항체에 의해 인식되는 세포 외 에피토프는 보유한다. tCD19는 또한 예를 들어, 연장된 B 세포 무형성의 경우 CAR T 세포를 제거하기 위한 CD19-표적화 항체 또는 항체-약물 접합체의 표적으로서 사용될 수 있다.
항-CD20 CAR T 치료법을 연구한 이전의 노력은 어느 정도 성공을 이루었지만, 낮은 형질감염 효율 (<0.1%)은 항생제 선택 및 장시간의 생체 외 성장을 필요로하여 낮은 CAR 발현 및 T 세포 고갈을 초래했다 (예를 들어, Till et al., Blood 119(17):3940-3950, 2012; 또한 Till et al., Blood 112(6):2261-2271, 2008; Wang et al., J. Clin. Immunol. 155(2):160-75, 2014; da Silva et al., Blood ASH Annual Meeting Abstracts:Abstract #1851, 2016 참조).
이번 임상 시험에는 적어도 하나의 이전 치료 요법에 반응 후 재발되었거나 또는 이전 요법에 난치성인 미만성 거대 B 세포 림프종, 또는 맨틀 세포, 여포성, 림프구형질세포, 변연부, 변이형 무통성 B 세포 림프종 (형질전환된 CLL 포함)을 포함한 B 세포 비호지킨 림프종을 가진 30명의 대상이 등록할 예정이다. 중요한 자격 기준에는 다음이 포함된다: 18세 이상 (어떠한 성별, 인종 또는 민족도 가능); CD20 발현의 증거를 가진 측정가능한 질환; 여성 참가자는 임신 또는 모유 수유를 할 수 없음; 임상 프로토콜에 정의된 바와 같은 적절한 간, 신장, 폐, 심장 및 혈액학적 기능; 활동성 중추신경계 전이 또는 과거/현재의 임상 관련 중추 신경계 병리 없음; HIV, 활동성의 제어되지 않는 감염, 또는 전신 면역 억제 요법을 요하는 활동성 자가 면역 질환 없음.
데노보 DLBCL 환자는 다음 기준 중 하나를 충족해야 한다:
· 안트라사이클린과 리툭시맙 둘 다 또는 다른 항-CD20 항체를 모두를 포함하는 최첨단 요법 후 생검 입증된 난치성 (즉, "원발성 불응성") 질환 - 이 요법의 완료 3개월 내에 재발되는 모든 질환은 난치성인 것으로 간주된다.
· 다음 중 적어도 하나 후 재발되거나 난치성인 질환:
o 적어도 2 라인의 치료 (안트라사이클린 및 항-CD20 항체로 적어도 한 번 포함) 자가 줄기 세포 이식
o 동종이계 줄기 세포 이식
일반적인 치료 개요 도표가 도 24에 제공되고, CAR T 세포의 투여 제형 및 모델의 도식적 표현이 도 25A 및 25B에 제공된다.
백혈구분리반출술이 말초 혈액 단핵 세포를 얻기 위해 각 환자에게 수행될 것이다. 정맥 대 정맥 분리반출술을 받기에 적합하지 않은 환자는 이 수집을 허용하기 위해 경피 중심 정맥 카테터를 배치하도록 엄선될 수 있다. 적혈구 용적률이 적어도 38%이고 총 비악성 (정상) 림프구 수가 >2000/mcl인 분리반출법을 받을 수 없는 환자는 CAR T 세포의 생성에 필요한 PBMC를 얻기 위해 400 ml의 혈액이 채취될 수 있다. 이 접근법은 용량 수준 0 (1 × 105 tCD19 + 세포/kg), 1 (3.3 × 105 tCD19 + 세포/kg) 및 2 (1 × 106 tCD19+ 세포/kg)로 등록될 환자에게만 적용된다. 참가자들은 백혈구분리반출술 전에 종양 생검을 받게 될 것이다. 림프절의 접근성에 따라, PET CT가 종양 생검 및 백혈구분리반출술 전 또는 후 수행될 수 있다.
CAR T 세포는 각 환자에 대해 표준 비동원 백혈구분리반출술로 얻은 자가 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 산물로부터 제조된다. PBMC에 대해 면역자기성 선택을 행하여 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 별도로 풍부화시키고, 각 서브세트를 항-CD3/CD28 상자성 비드로 별도로 자극시킨 후, 완전 인간 3세대 CD20-특이적 CAR 및 tCD19 형질도입 마커을 코딩하는 1.5.3-NQ-28-BB-ζ 렌티바이러스 벡터로 형질도입한다. 형질도입된 T 세포를 확장시킨 다음, CD20-발현 표적 세포주로 재자극하여 성장을 촉진시키고, 생체 외에서 추가로 확장시킨 다음, 1:1 CD4/CD8 비율로 제형화하여 주입을 위한 특정 세포 용량을 달성한다. 세포 산물은 생으로 주입되거나, 또는 냉동보존 후 해동되고, 세척되어 주입될 수 있다.
CD20 CAR T 세포 산물은 1:1 비율의 tCD19+ CD4+ 및 tCD19+ CD8+ T 세포로 이루어질 것이며, 여기서 tCD19는 CAR과 공발현되고 CAR+ 세포를 동정하는 형질도입 마커이다. 각 환자에 대해 생성된 CD20 CAR T 세포 산물은 제조 직후 신선한 세포로 주어질 수 있거나, 또는 먼저 액체 질소 냉동고에서 동결보존되고 저장된 다음, 해동된 세포를 세척하여 잔류하는 항동결제를 제거하고 이어 주입을 위해 제형화할 수 있다. 총 세포 수는 해동으로부터의 회복 중에 세포 손실을 처리하고 임상 프로토콜에 명시된 세포 투여 수준을 달성하기에 충분할 것이다. CD4+ 및 CD8+ T 세포의 총 비율은 개별 서브세트의 형질도입이 개별 환자에서 유사하지만 동일하지 않기 때문에 1:1과 다를 수 있다. 이러한 이유로, 서브세트는 형질도입된 T 세포의 정확한 제형을 가능하게 하기 위해 별도로 형질도입된다. 이 비율의 근거는 동물 모델 (Sommermeyer et al., Leukemia 2015)에서 CD4와 CD8 CAR T 세포 사이의 시너지 효과를 입증한 공개된 연구와, 모든 환자가 상이한 조성을 받는다면 어려운 독성 및 효능 평가에 도움을 주기 위해 모든 환자에게 균일한 세포 산물을 제공하려는 우리의 목표에 기초한다.
CD20 CAR T 세포는 CryoStor CS10® 또는 제어된 속도의 냉동고에서 냉동보존을 위한 다른 적절한 냉동보존 매질에 현탁될 것이다. 냉동보존된 세포는 액체 질소 냉동고의 가스에 저장될 것이다. 신선 또는 해동된 CD20 CAR T 세포는 Normosol + 1% HSA에 재현탁되고 임상 프로토콜에 명시된 총 세포 용량 수준으로 전달 팩으로 옮겨질 것이다. 제형화된 제품은 2 내지 8 ℃에서 보관된 다음, 투여를 위해 냉장 젤 팩을 사용하여 와싱턴 대학 (Washington University) 또는 시애틀 암치료연합 (Seattle Cancer Care Alliance)의 임상 현장으로 전달될 것이다. 이 산물은 FHCRC 세포 처리 시설에 의해 배포될 것이다. 세포 산물은 제형화 6시간 이내에 연구 참여자에게 주입되어야 한다. FHCRC 세포 처리 시설은 조사 산물의 배포 및 반환 (해당되는 경우)에 대한 문서화에 책임을 질 것이다.
환자는 CD20 CAR T 세포의 주입 36 내지 96시간 전에 림프구고갈 화학요법을 받을 것이다. 화학요법의 마지막 용량과 T 세포 주입 사이에 최소 36시간의 간격이 있어야 한다. 화학요법을 투여하는 목적은 이이된 T 세포의 생존을 촉진하고 CD20 CAR T 세포를 주입하기 전에 종양 부담을 줄이기 위해 림프구고갈을 제공하려는 것이다. 프로토콜의 통계적 고찰에 요약되어 있듯이, 환자는 우선 초기에 사이클로포스파미드 (CY) i.v. 1 g/m2의 단일 용량으로 처리될 것이다. 그러나 반응률이 불충분하면 림프구고갈 요법은 차후 환자에게 CY + 플루다라빈을 받도록 변경될 것이다.
CD20 CAR T 세포를 투여받기 전에, 참가자는 프로토콜에 의해 금지된 어떤 폐, 심혈관계, 간, 신장 또는 신경계 독성도 발생되지 않았고; 통제되지 않고 활동적이며 심각한 감염이 발생되지 않았으며; T 세포 주입 후 30일 이내에 다른 연구 약제로 치료받지 않았는지의 확인을 위해 평가받게 될 것이다.
CD20 CAR T 세포 산물을 투여하기 전에 예비투약은 요구되지 않는다. 연구자의 재량에 따라 표준 예비투약이 사용될 수 있다.
각 환자는 림프구고갈 화학요법의 완료 36 내지 96시간 후에 CD20 CAR T 세포의 단일 정맥 주입을 받게 될 것이다. 각 환자에게 투여되는 CD20 CAR T 세포의 용량은 임상 프로토콜에 기술된 통계적 설계에 따라 결정될 것이다. 용량 수준을 하기 표 2에 나타내었다. 첫 번째 주입 용량이 CR을 생성하지 않거나, 질환이 CR 후 재발한다면 CD20 CAR T 세포의 두 번째 주입이 주어질 수 있다. 이를 위해 환자는 아래 임상 프로토콜에 명시된 기준을 충족해야 한다.
세포 투여: 1:1 비율로 CD4+ 및 CD8+ CD20 CAR T 세포의 개별 분취량으로부터 조합된 단일 세포 산물이 각 대상에 대해 특정된 세포 용량으로 약 20 내지 30분에 걸쳐 정맥 내 투여될 것이다. 특정된 T 세포 용량은 벡터에서 CAR과 조화롭게 발현되는, 절단된 CD19 형질도입 마커의 발현에 의해 결정된 CAR+ T 세포를 지칭한다. 제안된 프로토콜하에서의 투여를 위해 설계된 용량 수준은 다음과 같다:
CD20 CAR T 세포 제형 및 주입
용량 수준 tCD19 + CD4 +/ tCD19 + CD8 + 비 총 tCD19 + T 세포 용량 *, **
0 1:1 1 x 105/kg
1 1:1 3.3 x 105/kg
2 1:1 1 x 106/kg
3 1:1 3.3 x 106/kg
4 1:1 1 x 107/kg
* 수용자 체중 kg 당
** 투약 수준 당 상한, ±15%; 용량 수준 1은 출발 용량 수준이다.
모든 환자는 각 T 세포 주입 동안 모니터링될 것이다. 바이탈 사인 (산소 포화도 포함)은 주입 전과 주입 동안, 그리고 주입 후 약 2시간 동안 기록되어야 한다. 산소 포화도는 T 세포 주입 동안 및 T 세포 주입 후 2시간 동안 연속 맥박 산소 측정법으로 모니터링되어야 한다. 대상은 주입 후 최소 2시간 동안, 또는 외래 환자로서 조사 대상에게 유의한 위험을 초래한다고 간주되는 주입 관련 독성이 해소될 때까지 세포 주입실에서 체류할 것이다.
주입 속도: 각 세포 주입은 약 20 내지 30분에 걸쳐 정맥 내로 투여되어야 하며, 비경구 약물에 대한 내독소 한계 (￡ 5 EU/kg/시간) 지침을 준수하기 위해 필요에 따라 조정되어야 한다. 대상이 경미한 주입 관련 부작용 (2급 이하)을 경험할 경우 주입 비율은 또한 조정될 수 있다.
이 연구의 주된 목적은 CAR T 세포의 최대 내약 용량 (MTD)을 추정하는 것이다. 이러한 목적을 위한 MTD는 진정한 용량 제한 독성 비율 25%로서 정의될 것이며, 여기서 DLT는 주입 28일 이내에 발생하고 적어도 4일 지속되고, 토실루지맙, 덱사메타손 또는 기타 항염증 약물에 반응하지 않는 CAR T 세포 주입에 기인한 3 급 이상의 비혈액학적 독성으로 정의된다. MTD 산정을 위해 수정된 CRM (연속 재평가 방법 (continuous reassessment method))이 이용될 것이다. 수정에는 두 (하나가 아닌) 군으로 환자를 치료하고 군 간 1회 용량 수준을 최대로 증가시키는 것이 포함된다. 환자에게 2명의 환자로 이루어진 제1 군에 대해 용량 수준 1을 시작으로 4 단계의 단계적으로 증가하는 용량 수준 중 하나로 CD20 CAR T 세포가 단일 정맥 내로 주입된다. 단계적 용량 증가 또는 단계적 용량 감소는 각 용량 수준에서 심각한 독성을 겪는 환자의 수를 고려하여 CRM 알고리즘에 의해 결정된다 (위 참조).
단계적 용량 증가/감소 군의 환자 치료는 다음 용량 수준으로 단계적으로 증가시키기 전에 2명의 환자 각 세트 간에 주입 후 최소 28일 간격이 필요하도록 시차가 주어질 것이다. CY만으로 충분한 활성이 있는지 또는 플루다라빈이 추가될 것인지 (CY/flu)를 결정하기 위해 이 용량 수준을 처음에 CY 단독 요법과 함께 평가하여 CR 비율을 평가하게 될 것이다. CY/flu로 전환하기 위한 기준이 충족되면, CY/flu와 함께 중간 권장 용량 (CY 단독과 함께) 아래의 한 용량 수준에서 시작하여 CRM이 다시 개시될 것이다. 중간 권장 용량은 1차, 2차 및 3차 중간 분석을 위해 8번째, 16번째 또는 20번째 환자 후에 mCRM에 기초해 선정되는, 그때까지 평가된 최대 용량 또는 그 다음 용량 중 더 낮은 용량으로 정의될 것이다. 이 평가는 총 30명의 환자에 대해 계속될 것이다. 이 기준들 중 어느 것도 충족시키지 못하면, CRM 접근법은 추가적인 10명의 환자에서 CY 단독으로 계속될 것이다 (총 30명의 환자에 도달할 때까지). 두 번째 주입을 받은 환자에 대한 DLT 및 효능 결과는 그의 일차 주입 용량을 기준으로 평가될 것이다.
CD20 CAR T 세포를 투여받은 환자에서는 종양 항원을 접한 후 T 세포 활성화, 증식 및 사이토카인 분비로 인해 심각한 독성이 발생할 수 있다. 사이토카인 방출 증후군, 대식세포 활성화 및 신경독성이 발생할 수 있고 집중 치료 지원이 필요할 수 있으며, 코르티코스테로이드 및/또는 토실리주맙으로 4일 연속 치료한 후에도 이러한 독성이 회복되지 않으면, 종양의 T 세포 인식으로 고려된 경우 DLT로 간주되지 않을 것이다.
100일까지의 치료 관련 사망 확률이 20% (용량에 관계없이)를 초과할 것으로 예상되는 충분한 증거가 있다면, 환자 등록은 PI, 연구 모니터, 통계학자 및 DSMB의 상세한 검토가 있을 때까지 중단될 것이다. 이를 위한 충분한 증거는 하한 80% 신뢰한계가 20%를 초과하는 임의의 관찰된 결과로 정의될 것이다.
효능에 대한 예비 평가를 제공하기 위한 평가도 수행될 것이다. 이 연구의 부차적인 목적은 효능에 대한 검사 (차도 속도, 무-진행 생존 및 T 세포의 생체 내 지속성 측면에서)를 포함한다. 이 분석은 최종 임파구고갈 요법 (CY 단독 또는 CY/플루다라빈)과 병용된 모든 용량으로 처리된 환자를 대상으로 용량의 함수로 결과를 모델링하여 수행될 것이다. 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 이원 결과 (CR 및 CR/PR)를 평가할 것이다. 시간 대 이벤트 결과 (PFS, OS)를 평가하는데 Cox 비례 위험 모델을 사용할 것이다. 이들 종말점에 관해 공식적인 통계 가설은 테스트되지 않을 것이다; 오히려 추정치와 관련 신뢰 구간이 서술적으로 제공될 것이다.
추가의 부차적인 목적은 입양 전달된 CD20 CAR T 세포의 지속 기간과 입양 전달된 CD20 CAR T 세포의 이동을 평가하기 위한 것이다. CAR T 세포의 지속성을 평가하기 위해, 곡선 아래 환자 수준의 면적 (AUC)이 추정되고 AUC의 요약 통계가 평가될 것이다. 이동 (CAR T 세포가 치료 후 존재하는 경우)은 10 내지 16일에 종양에서 CAR T 세포의 존재, 및 해당되는 경우 28일에서의 BM으로 정의된다. 임상 결과와 함께 AUC와 이동 사이의 연관성은 대체로 사실상 그래프 표현을 포함해서 묘사될 것이다.
치료 저항성의 생물학적 원인을 평가하는 것과 관련된 부차적인 목적을 평가하기 위해, 다음 분석이 수행될 것이다. 기준 종양과 필요에 따라 적절히 변형된 치료 후 종양 사이의 바이오마커 프로파일을 비교하는데 대응 t-검정 (paired t-test)을 사용할 것이다. 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 기준 바이오마커 값과 반응 간의 연관성을 평가할 것이다. 1개월에 CR 또는 PR을 달성한 환자들에서의 랜드마크 분석, 랜드마크 시간으로부터 생존 시간 (PFS 및 OS)의 측정, Cox 비례 위험 회귀 모델을 사용하여 환자에 대해 CR/PR 시에 (이때에 생검이 이루어진다) 측정된 상관관계 연관성을 평가한다. 모델은 모든 환자/용량 수준에 대한 값들을 포함하며 용량 수준에 대한 변수를 포함할 것이다.
내인성 항종양 반응의 발생 및 에피토프 확산이 또한 크게 탐색적인 방식으로 평가될 것이다. 각 시점의 데이터를 요약하고, 충분한 데이터를 가지고 혼합 효과 모델을 사용하여 시간에 따른 결과를 모델링할 것이다. 면역 반응과 관련된 바이오마커를 확인하기 위해 입증된 에피토프 확산이 있거나 없는 환자 간에 차등 유전자 발현 분석을 실시할 것이다.
CD20 CAR T 세포의 두 번째 주입을 받고자 하는, CR을 달성하지 못했거나 또는 완전한 반응 (CR)을 얻었지만 나중에 재발된 연구에 참여한 환자는 자격이 있지만, 단 충분한 수의 CD20 CAR T 세포를 생산할 수 있으며 아래 나열된 기준을 충족시켜야 한다:
a. 첫 번째 T 세포 주입 후 지속적인 질환의 증거가 있거나 CR 후 종양이 재발됨.
b. 용량 제한적이거나, 용량의 단계적인 감소가 요구되는 독성 없음.
c. 환자는 첫 번째 T 세포 주입 후 30일 이상임.
d. 임상적 및/또는 실험실 제외 기준이 없다 (CR을 달성하고 나중에 재발된 환자는 종양 세포에서 진행중인 CD20 발현을 입증하는 재발 후 생검을 가져야 한다).
참가자들은 림프구고갈 화학요법 전, T 세포 주입 중 및 각 T 세포 주입 후 간격을 두고 선별 평가를 받을 것이다. 임상 프로토콜에 따라 안전성 및 독성 평가를 위해 다음과 같은 데이터가 수집될 것이다.
· T 세포 주입 전 및 주입 후 간격을 두고 이력 및 신체 검사.
· 주입 전과 주입 중 맥박 산소 측정
· T 세포 주입 전 및 주입 후 간격을 두고 혈액, 간, 신장 및 전해질 혈액 검사
· T 세포 주입 전 및 주입 후 간격을 두고 종양 용해 증후군, 응고병증 및 사이토카인 방출 증후군을 평가하기 위항 실험실 시험.
· NCI CTCAE 버전 4.0에 따른 독성 등급
· 혈청 사이토카인 수준
· B 세포 재구성
· 혈청 면역글로불린 농도
· 복제 적격 렌티바이러스 시험
· 유전자 변형 T 세포의 지속성
· 부작용 보고
상술된 다양한 구체예들을 조합하여 추가적인 구체예를 제공할 수 있다. 본원 명세서에서 언급되고/거나 출원 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허출원 공개, 미국 특허출원, 외국 특허, 외국 특허출원 및 비-특허 공개물은 모두 그의 전문이 참고로 본원에서 인용되었다. 구체예의 측면은, 필요에 따라 각종 특허, 출원 및 공개의 개념을 사용하도록 변형되어 또 다른 구체예를 제공할 수 있다.
상기한 상세한 설명에 비추어 구체예에 대해 이러한 변형 및 다른 변형이 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서 사용된 용어들은 청구범위를 명세서 및 청구범위에 기재된 특정 구체예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 이러한 청구범위의 등가물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 구체예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 상기 개시에 의해 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Fred Hutchinson Cancer Research Center Till, Brian Press, Oliver <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR CD20 IMMUNOTHERAPY <130> 360056.441WO <140> PCT <141> 2017-03-17 <150> US 62/310,541 <151> 2016-03-18 <150> US 62/320,327 <151> 2016-04-08 <160> 98 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala 85 90 95 Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 2 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 3 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 4 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 5 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Asp Glu Ser Lys Tyr 115 120 125 <210> 6 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 6 Gln Val Gln Leu Arg Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Asp Pro Lys Ser Ser 115 120 125 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 1 5 10 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Pro Val Ala Gly Pro Ser 1 5 <210> 10 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 10 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 1 5 10 15 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 20 25 30 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 35 40 45 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val 50 55 60 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 65 70 75 80 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 85 90 95 Ile Ser Lys Ala Lys 100 <210> 11 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 12 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 100 105 <210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 14 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 15 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 15 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg 35 40 <210> 16 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 17 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 18 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro 20 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly 20 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 21 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 21 Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ser <210> 22 <211> 20 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> E2A self-cleaving peptide <400> 22 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 23 <211> 24 <212> PRT <213> unknown <220> <223> T2A self-cleaving peptide <400> 23 Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg 20 <210> 24 <211> 323 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 24 Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met 1 5 10 15 Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp 20 25 30 Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln 35 40 45 Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu 50 55 60 Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile 65 70 75 80 Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu 85 90 95 Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr 100 105 110 Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp 115 120 125 Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro 130 135 140 Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala 145 150 155 160 Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro 165 170 175 Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro 180 185 190 Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser 195 200 205 Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser 210 215 220 Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp 225 230 235 240 Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala 245 250 255 Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu 260 265 270 Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly 275 280 285 Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu 290 295 300 Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg 305 310 315 320 Arg Lys Arg <210> 25 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 25 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly 20 25 30 Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe 35 40 45 Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala 50 55 60 Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu 65 70 75 80 Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile 85 90 95 Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu 100 105 110 Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala 115 120 125 Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu 130 135 140 Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr 145 150 155 160 Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys 165 170 175 Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly 180 185 190 Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu 195 200 205 Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys 210 215 220 Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu 225 230 235 240 Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met 245 250 255 Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala 260 265 270 His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val 275 280 285 Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His 290 295 300 Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro 305 310 315 320 Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala 325 330 335 Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly 340 345 350 Ile Gly Leu Phe Met 355 <210> 26 <211> 695 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 26 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala 85 90 95 Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser 130 135 140 Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 180 185 190 Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe Asp Tyr Trp Gly 225 230 235 240 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 245 250 255 Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260 265 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275 280 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325 330 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340 345 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355 360 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 370 375 380 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385 390 395 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405 410 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420 425 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435 440 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450 455 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val 465 470 475 480 Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile 485 490 495 Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr 500 505 510 Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln 515 520 525 Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly 530 535 540 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 545 550 555 560 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 565 570 575 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 580 585 590 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 595 600 605 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 610 615 620 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 625 630 635 640 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 645 650 655 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 660 665 670 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 675 680 685 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 690 695 <210> 27 <211> 653 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 27 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala 85 90 95 Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser 130 135 140 Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 180 185 190 Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe Asp Tyr Trp Gly 225 230 235 240 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 245 250 255 Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260 265 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275 280 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325 330 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340 345 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355 360 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 370 375 380 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385 390 395 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405 410 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420 425 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435 440 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450 455 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val 465 470 475 480 Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile 485 490 495 Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr 500 505 510 Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln 515 520 525 Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys 530 535 540 Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln 545 550 555 560 Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu 565 570 575 Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg 580 585 590 Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met 595 600 605 Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 610 615 620 Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 625 630 635 640 Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 645 650 <210> 28 <211> 654 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 28 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala 85 90 95 Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser 130 135 140 Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 180 185 190 Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe Asp Tyr Trp Gly 225 230 235 240 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 245 250 255 Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260 265 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275 280 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325 330 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340 345 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355 360 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 370 375 380 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385 390 395 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405 410 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420 425 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435 440 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450 455 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val 465 470 475 480 Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile 485 490 495 Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys 500 505 510 Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys 515 520 525 Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val 530 535 540 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 545 550 555 560 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 565 570 575 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 580 585 590 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 595 600 605 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 610 615 620 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 625 630 635 640 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 645 650 <210> 29 <211> 612 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 29 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala 85 90 95 Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser 130 135 140 Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 180 185 190 Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe Asp Tyr Trp Gly 225 230 235 240 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 245 250 255 Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 260 265 270 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 275 280 285 Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 290 295 300 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320 Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 325 330 335 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 340 345 350 Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 355 360 365 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 370 375 380 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 385 390 395 400 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 405 410 415 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 420 425 430 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 435 440 445 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 450 455 460 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val 465 470 475 480 Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile 485 490 495 Ile Phe Trp Val Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 500 505 510 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 515 520 525 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 530 535 540 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 545 550 555 560 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 565 570 575 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 580 585 590 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 595 600 605 Leu Pro Pro Arg 610 <210> 30 <211> 700 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 30 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met 130 135 140 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp 145 150 155 160 Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr 165 170 175 Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala 180 185 190 Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser 195 200 205 Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn 210 215 220 Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 225 230 235 240 Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Asp Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp 465 470 475 480 Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val 485 490 495 Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly 500 505 510 Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr 515 520 525 Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr 530 535 540 Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro 545 550 555 560 Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys 565 570 575 Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe 580 585 590 Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu 595 600 605 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 610 615 620 Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys 625 630 635 640 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 645 650 655 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 660 665 670 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 675 680 685 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 690 695 700 <210> 31 <211> 658 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 31 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met 130 135 140 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp 145 150 155 160 Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr 165 170 175 Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala 180 185 190 Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser 195 200 205 Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn 210 215 220 Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 225 230 235 240 Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Asp Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp 465 470 475 480 Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val 485 490 495 Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly 500 505 510 Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr 515 520 525 Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr 530 535 540 Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln 545 550 555 560 Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu 565 570 575 Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly 580 585 590 Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu 595 600 605 Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly 610 615 620 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 625 630 635 640 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro 645 650 655 Pro Arg <210> 32 <211> 698 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 32 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu 115 120 125 Arg Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met 130 135 140 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp 145 150 155 160 Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr 165 170 175 Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala 180 185 190 Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser 195 200 205 Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His 210 215 220 Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Asp Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 245 250 255 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 260 265 270 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 275 280 285 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 290 295 300 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 305 310 315 320 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 325 330 335 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 340 345 350 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 355 360 365 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 370 375 380 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 385 390 395 400 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 405 410 415 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 420 425 430 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 435 440 445 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 450 455 460 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Phe Trp Val Leu 465 470 475 480 Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val 485 490 495 Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His 500 505 510 Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys 515 520 525 His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 530 535 540 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 545 550 555 560 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 565 570 575 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 580 585 590 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 595 600 605 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 610 615 620 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 625 630 635 640 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 645 650 655 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 660 665 670 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 675 680 685 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 690 695 <210> 33 <211> 656 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 33 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu 115 120 125 Arg Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met 130 135 140 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp 145 150 155 160 Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr 165 170 175 Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala 180 185 190 Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser 195 200 205 Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His 210 215 220 Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Asp Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 245 250 255 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 260 265 270 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 275 280 285 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 290 295 300 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 305 310 315 320 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 325 330 335 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 340 345 350 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 355 360 365 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 370 375 380 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 385 390 395 400 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 405 410 415 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 420 425 430 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 435 440 445 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 450 455 460 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Phe Trp Val Leu 465 470 475 480 Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val 485 490 495 Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His 500 505 510 Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys 515 520 525 His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 530 535 540 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 545 550 555 560 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 565 570 575 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 580 585 590 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 595 600 605 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 610 615 620 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 625 630 635 640 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 645 650 655 <210> 34 <211> 657 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 34 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu 115 120 125 Arg Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met 130 135 140 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp 145 150 155 160 Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr 165 170 175 Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala 180 185 190 Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser 195 200 205 Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His 210 215 220 Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Asp Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His 245 250 255 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 260 265 270 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 275 280 285 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 290 295 300 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 305 310 315 320 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 325 330 335 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 340 345 350 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 355 360 365 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 370 375 380 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 385 390 395 400 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 405 410 415 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 420 425 430 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 435 440 445 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 450 455 460 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Phe Trp Val Leu 465 470 475 480 Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val 485 490 495 Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr 500 505 510 Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu 515 520 525 Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu 530 535 540 Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln 545 550 555 560 Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu 565 570 575 Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly 580 585 590 Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 595 600 605 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 610 615 620 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 625 630 635 640 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 645 650 655 Arg <210> 35 <211> 1060 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 35 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser 20 25 30 Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 35 40 45 Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln 50 55 60 Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr 85 90 95 Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val Gln Ala Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly 115 120 125 Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 145 150 155 160 Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr 165 170 175 Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys 180 185 190 Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg 195 200 205 Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser 210 215 220 Ile Thr Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr 225 230 235 240 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro 245 250 255 Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp 260 265 270 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 275 280 285 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 290 295 300 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 305 310 315 320 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 325 330 335 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val 340 345 350 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 355 360 365 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 370 375 380 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 385 390 395 400 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 405 410 415 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 420 425 430 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 435 440 445 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 450 455 460 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 465 470 475 480 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Phe 485 490 495 Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu 500 505 510 Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg 515 520 525 Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro 530 535 540 Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala 545 550 555 560 Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln 565 570 575 Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser 580 585 590 Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys 595 600 605 Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln 610 615 620 Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu 625 630 635 640 Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg 645 650 655 Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met 660 665 670 Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly 675 680 685 Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp 690 695 700 Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Cys Thr 705 710 715 720 Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly 725 730 735 Pro Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro 740 745 750 Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly 755 760 765 Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr 770 775 780 Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys 785 790 795 800 Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala 805 810 815 Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr 820 825 830 Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp 835 840 845 Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser 850 855 860 Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly 865 870 875 880 Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp 885 890 895 Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro 900 905 910 Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala 915 920 925 Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val 930 935 940 Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys 945 950 955 960 Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met 965 970 975 Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp 980 985 990 Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His 995 1000 1005 Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr 1010 1015 1020 Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys 1025 1030 1035 1040 Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu 1045 1050 1055 Arg Arg Lys Arg 1060 <210> 36 <211> 1018 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 36 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser 20 25 30 Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 35 40 45 Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln 50 55 60 Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr 85 90 95 Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val Gln Ala Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly 115 120 125 Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 145 150 155 160 Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr 165 170 175 Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys 180 185 190 Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg 195 200 205 Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser 210 215 220 Ile Thr Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr 225 230 235 240 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro 245 250 255 Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp 260 265 270 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 275 280 285 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 290 295 300 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 305 310 315 320 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 325 330 335 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val 340 345 350 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 355 360 365 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 370 375 380 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 385 390 395 400 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 405 410 415 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 420 425 430 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 435 440 445 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 450 455 460 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 465 470 475 480 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Phe 485 490 495 Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu 500 505 510 Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg 515 520 525 Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro 530 535 540 Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala 545 550 555 560 Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 565 570 575 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 580 585 590 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 595 600 605 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 610 615 620 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 625 630 635 640 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 645 650 655 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 660 665 670 Pro Pro Arg Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp 675 680 685 Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe 690 695 700 Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val 705 710 715 720 Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly 725 730 735 Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro 740 745 750 Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile 755 760 765 His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln 770 775 780 Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys 785 790 795 800 Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu 805 810 815 Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys 820 825 830 Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser 835 840 845 Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly 850 855 860 Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser 865 870 875 880 Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly 885 890 895 Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val 900 905 910 His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp 915 920 925 Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro 930 935 940 Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn 945 950 955 960 Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp 965 970 975 His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu 980 985 990 Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu 995 1000 1005 Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg 1010 1015 <210> 37 <211> 1019 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 37 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser 20 25 30 Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 35 40 45 Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln 50 55 60 Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr 85 90 95 Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val Gln Ala Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly 115 120 125 Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 145 150 155 160 Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr 165 170 175 Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys 180 185 190 Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg 195 200 205 Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser 210 215 220 Ile Thr Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr 225 230 235 240 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro 245 250 255 Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp 260 265 270 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 275 280 285 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 290 295 300 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 305 310 315 320 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 325 330 335 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val 340 345 350 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 355 360 365 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 370 375 380 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 385 390 395 400 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 405 410 415 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 420 425 430 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 435 440 445 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 450 455 460 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 465 470 475 480 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Phe 485 490 495 Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu 500 505 510 Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys 515 520 525 Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr 530 535 540 Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly 545 550 555 560 Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 565 570 575 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 580 585 590 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 595 600 605 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 610 615 620 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 625 630 635 640 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 645 650 655 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 660 665 670 Leu Pro Pro Arg Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly 675 680 685 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe 690 695 700 Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu 705 710 715 720 Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys 725 730 735 Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser 740 745 750 Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly 755 760 765 Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser 770 775 780 Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu 785 790 795 800 Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu 805 810 815 Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu 820 825 830 Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met 835 840 845 Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu 850 855 860 Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu 865 870 875 880 Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys 885 890 895 Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His 900 905 910 Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp 915 920 925 Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu 930 935 940 Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly 945 950 955 960 Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu 965 970 975 Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr 980 985 990 Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His 995 1000 1005 Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg 1010 1015 <210> 38 <211> 977 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 38 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser 20 25 30 Ser Pro Val Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 35 40 45 Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln 50 55 60 Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr 85 90 95 Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Val Gln Ala Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly 115 120 125 Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 145 150 155 160 Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr 165 170 175 Ser Phe Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys 180 185 190 Gly Leu Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg 195 200 205 Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser 210 215 220 Ile Thr Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr 225 230 235 240 Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro 245 250 255 Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp 260 265 270 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro 275 280 285 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 290 295 300 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 305 310 315 320 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 325 330 335 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val 340 345 350 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 355 360 365 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 370 375 380 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 385 390 395 400 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 405 410 415 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 420 425 430 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 435 440 445 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 450 455 460 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 465 470 475 480 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Phe 485 490 495 Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu 500 505 510 Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Val Lys Phe Ser Arg 515 520 525 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 530 535 540 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 545 550 555 560 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 565 570 575 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 580 585 590 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 595 600 605 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 610 615 620 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Cys Thr Asn Tyr Ala 625 630 635 640 Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Pro 645 650 655 Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val 660 665 670 Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala 675 680 685 Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu 690 695 700 Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu 705 710 715 720 Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu 725 730 735 Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln 740 745 750 Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn 755 760 765 Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly 770 775 780 Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser 785 790 795 800 Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp 805 810 815 Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp 820 825 830 Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser 835 840 845 Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly 850 855 860 Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu 865 870 875 880 Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met 885 890 895 Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys 900 905 910 Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile 915 920 925 Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp 930 935 940 Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser 945 950 955 960 Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys 965 970 975 Arg <210> 39 <211> 1101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 39 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser 35 40 45 Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys 50 55 60 Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg 85 90 95 Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe 100 105 110 Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser 115 120 125 Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 145 150 155 160 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 165 170 175 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 180 185 190 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 195 200 205 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp 245 250 255 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Asp Glu Ser Lys Tyr 260 265 270 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 275 280 285 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 290 295 300 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 305 310 315 320 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 325 330 335 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 340 345 350 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 355 360 365 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 370 375 380 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 385 390 395 400 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 405 410 415 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 420 425 430 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 435 440 445 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 450 455 460 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 465 470 475 480 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 485 490 495 Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr 500 505 510 Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys 515 520 525 Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg 530 535 540 Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp 545 550 555 560 Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 565 570 575 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 580 585 590 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 595 600 605 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 610 615 620 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 625 630 635 640 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 645 650 655 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 660 665 670 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 675 680 685 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 690 695 700 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 705 710 715 720 Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp 725 730 735 Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu 740 745 750 Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys 755 760 765 Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile 770 775 780 Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly 785 790 795 800 Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His 805 810 815 Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys 820 825 830 Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr 835 840 845 Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys 850 855 860 Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser 865 870 875 880 Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile 885 890 895 Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys 900 905 910 Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly 915 920 925 Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser 930 935 940 Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg 945 950 955 960 Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu 965 970 975 Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His 980 985 990 Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly 995 1000 1005 Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys 1010 1015 1020 Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val 1025 1030 1035 1040 Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn 1045 1050 1055 Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn 1060 1065 1070 Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu 1075 1080 1085 Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met 1090 1095 1100 <210> 40 <211> 678 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 40 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser 35 40 45 Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys 50 55 60 Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg 85 90 95 Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe 100 105 110 Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser 115 120 125 Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 145 150 155 160 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 165 170 175 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 180 185 190 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 195 200 205 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp 245 250 255 Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Asp Glu Ser Lys Tyr 260 265 270 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 275 280 285 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 290 295 300 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 305 310 315 320 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 325 330 335 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 340 345 350 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 355 360 365 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 370 375 380 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 385 390 395 400 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 405 410 415 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 420 425 430 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 435 440 445 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 450 455 460 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 465 470 475 480 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 485 490 495 Lys Met Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr 500 505 510 Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys 515 520 525 Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg 530 535 540 Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp 545 550 555 560 Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 565 570 575 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 580 585 590 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 595 600 605 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 610 615 620 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 625 630 635 640 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 645 650 655 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 660 665 670 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 675 <210> 41 <211> 1061 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 41 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser 35 40 45 Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys 50 55 60 Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg 85 90 95 Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser 100 105 110 Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ser 115 120 125 Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Gln Val Gln Leu Arg Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 145 150 155 160 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 165 170 175 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 180 185 190 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 195 200 205 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp 245 250 255 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Asp Pro Lys Ser Ser 260 265 270 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 275 280 285 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 290 295 300 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 305 310 315 320 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 325 330 335 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg 340 345 350 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 355 360 365 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 370 375 380 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 385 390 395 400 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 405 410 415 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 420 425 430 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 435 440 445 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 450 455 460 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 465 470 475 480 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 485 490 495 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 500 505 510 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser 515 520 525 Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly 530 535 540 Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala 545 550 555 560 Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys 565 570 575 Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys 580 585 590 Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val 595 600 605 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 610 615 620 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 625 630 635 640 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 645 650 655 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 660 665 670 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 675 680 685 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 690 695 700 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Cys 705 710 715 720 Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro 725 730 735 Gly Pro Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr 740 745 750 Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu 755 760 765 Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro 770 775 780 Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu 785 790 795 800 Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu 805 810 815 Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe 820 825 830 Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly 835 840 845 Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val 850 855 860 Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu 865 870 875 880 Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val 885 890 895 Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val 900 905 910 Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met 915 920 925 Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser 930 935 940 Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro 945 950 955 960 Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp 965 970 975 Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln 980 985 990 Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe 995 1000 1005 His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg 1010 1015 1020 Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe 1025 1030 1035 1040 Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val 1045 1050 1055 Leu Arg Arg Lys Arg 1060 <210> 42 <211> 1019 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 42 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser 35 40 45 Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys 50 55 60 Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg 85 90 95 Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser 100 105 110 Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ser 115 120 125 Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Gln Val Gln Leu Arg Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 145 150 155 160 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 165 170 175 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 180 185 190 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 195 200 205 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp 245 250 255 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Asp Pro Lys Ser Ser 260 265 270 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 275 280 285 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 290 295 300 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 305 310 315 320 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 325 330 335 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg 340 345 350 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 355 360 365 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 370 375 380 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 385 390 395 400 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 405 410 415 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 420 425 430 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 435 440 445 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 450 455 460 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 465 470 475 480 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 485 490 495 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 500 505 510 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser 515 520 525 Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly 530 535 540 Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala 545 550 555 560 Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 565 570 575 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 580 585 590 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 595 600 605 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 610 615 620 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 625 630 635 640 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 645 650 655 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 660 665 670 Leu Pro Pro Arg Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly 675 680 685 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe 690 695 700 Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu 705 710 715 720 Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys 725 730 735 Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser 740 745 750 Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly 755 760 765 Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser 770 775 780 Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu 785 790 795 800 Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu 805 810 815 Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu 820 825 830 Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met 835 840 845 Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu 850 855 860 Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu 865 870 875 880 Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys 885 890 895 Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His 900 905 910 Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp 915 920 925 Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu 930 935 940 Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly 945 950 955 960 Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu 965 970 975 Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr 980 985 990 Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His 995 1000 1005 Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg 1010 1015 <210> 43 <211> 1020 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 43 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser 35 40 45 Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys 50 55 60 Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg 85 90 95 Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser 100 105 110 Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ser 115 120 125 Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser 130 135 140 Gln Val Gln Leu Arg Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 145 150 155 160 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 165 170 175 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 180 185 190 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 195 200 205 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 210 215 220 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp 245 250 255 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Asp Pro Lys Ser Ser 260 265 270 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 275 280 285 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 290 295 300 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 305 310 315 320 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 325 330 335 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg 340 345 350 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 355 360 365 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 370 375 380 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 385 390 395 400 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 405 410 415 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 420 425 430 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 435 440 445 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 450 455 460 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 465 470 475 480 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 485 490 495 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 500 505 510 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys 515 520 525 Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr 530 535 540 Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu 545 550 555 560 Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro 565 570 575 Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly 580 585 590 Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro 595 600 605 Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr 610 615 620 Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly 625 630 635 640 Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln 645 650 655 Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln 660 665 670 Ala Leu Pro Pro Arg Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala 675 680 685 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu 690 695 700 Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro 705 710 715 720 Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu 725 730 735 Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu 740 745 750 Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu 755 760 765 Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val 770 775 780 Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser 785 790 795 800 Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly 805 810 815 Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly 820 825 830 Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu 835 840 845 Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp 850 855 860 Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser 865 870 875 880 Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser 885 890 895 Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr 900 905 910 His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys 915 920 925 Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu 930 935 940 Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg 945 950 955 960 Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val 965 970 975 Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val 980 985 990 Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu 995 1000 1005 His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg 1010 1015 1020 <210> 44 <211> 2085 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 44 gacattgtga tgactcagac accactgagc tccccagtga ctctgggaca gccagccagt 60 atctcatgca gatctagtca gtcactggtc tacagcgacg gcaacaccta tctgagctgg 120 ctgcagcagc gaccaggaca gccacctaga ctgctgatct acaagatttc caataggttc 180 tctggagtgc ccgaccgctt tagcggatcc ggagctggaa ctgatttcac cctgaaaatc 240 tcccgcgtgg aggctgaaga tgtgggcgtc tactattgcg tccaggcaac ccagttccct 300 ctgacatttg gcgggggaac taaggtggag atcaagggag gaggaggatc tggaggagga 360 ggaagtggag gaggaggatc cgaagtgcag ctggtccagt ctggggccga ggtgaagaaa 420 cctggagaaa gtctgaagat ctcatgtaaa ggctccgggt actctttcac aagttattgg 480 attggctggg tccgacagat gccaggaaag ggcctggagt ggatgggaat catctacccc 540 ggcgacagcg atacccggta ttctcctagt tttcagggcc aggtgacaat cagcgcagac 600 aagtccatta ccacagccta tctgcagtgg tcaagcctga aagcctctga taccgctatg 660 tactattgtg ccaggcaccc tagctacggg tcaggaagcc caaactttga ctattggggc 720 caggggacac tggtgactgt ctcctctgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 780 cctcctgtgg caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960 gaggagcagt accagagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020 tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgcca 1140 ccatcacgag atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1320 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccct tttgggtgct ggtggtggtt 1440 ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg 1500 aggagtaaga ggagcagggg aggtcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 1560 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 1620 tccaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 1680 caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 1740 tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1800 aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1860 agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1920 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1980 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 2040 aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 2085 <210> 45 <211> 1959 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 45 gacattgtga tgactcagac accactgagc tccccagtga ctctgggaca gccagccagt 60 atctcatgca gatctagtca gtcactggtc tacagcgacg gcaacaccta tctgagctgg 120 ctgcagcagc gaccaggaca gccacctaga ctgctgatct acaagatttc caataggttc 180 tctggagtgc ccgaccgctt tagcggatcc ggagctggaa ctgatttcac cctgaaaatc 240 tcccgcgtgg aggctgaaga tgtgggcgtc tactattgcg tccaggcaac ccagttccct 300 ctgacatttg gcgggggaac taaggtggag atcaagggag gaggaggatc tggaggagga 360 ggaagtggag gaggaggatc cgaagtgcag ctggtccagt ctggggccga ggtgaagaaa 420 cctggagaaa gtctgaagat ctcatgtaaa ggctccgggt actctttcac aagttattgg 480 attggctggg tccgacagat gccaggaaag ggcctggagt ggatgggaat catctacccc 540 ggcgacagcg atacccggta ttctcctagt tttcagggcc aggtgacaat cagcgcagac 600 aagtccatta ccacagccta tctgcagtgg tcaagcctga aagcctctga taccgctatg 660 tactattgtg ccaggcaccc tagctacggg tcaggaagcc caaactttga ctattggggc 720 caggggacac tggtgactgt ctcctctgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 780 cctcctgtgg caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960 gaggagcagt accagagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020 tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgcca 1140 ccatcacgag atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1320 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccct tttgggtgct ggtggtggtt 1440 ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg 1500 aggagtaaga ggagcagggg aggtcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 1560 gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 1620 tccagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1680 ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1740 ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1800 aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1860 cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1920 acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1959 <210> 46 <211> 1962 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 46 gacattgtga tgactcagac accactgagc tccccagtga ctctgggaca gccagccagt 60 atctcatgca gatctagtca gtcactggtc tacagcgacg gcaacaccta tctgagctgg 120 ctgcagcagc gaccaggaca gccacctaga ctgctgatct acaagatttc caataggttc 180 tctggagtgc ccgaccgctt tagcggatcc ggagctggaa ctgatttcac cctgaaaatc 240 tcccgcgtgg aggctgaaga tgtgggcgtc tactattgcg tccaggcaac ccagttccct 300 ctgacatttg gcgggggaac taaggtggag atcaagggag gaggaggatc tggaggagga 360 ggaagtggag gaggaggatc cgaagtgcag ctggtccagt ctggggccga ggtgaagaaa 420 cctggagaaa gtctgaagat ctcatgtaaa ggctccgggt actctttcac aagttattgg 480 attggctggg tccgacagat gccaggaaag ggcctggagt ggatgggaat catctacccc 540 ggcgacagcg atacccggta ttctcctagt tttcagggcc aggtgacaat cagcgcagac 600 aagtccatta ccacagccta tctgcagtgg tcaagcctga aagcctctga taccgctatg 660 tactattgtg ccaggcaccc tagctacggg tcaggaagcc caaactttga ctattggggc 720 caggggacac tggtgactgt ctcctctgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 780 cctcctgtgg caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960 gaggagcagt accagagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020 tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgcca 1140 ccatcacgag atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1320 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccct tttgggtgct ggtggtggtt 1440 ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg 1500 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1560 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1620 gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1680 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1740 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1800 tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1860 gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1920 gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 1962 <210> 47 <211> 1836 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 47 gacattgtga tgactcagac accactgagc tccccagtga ctctgggaca gccagccagt 60 atctcatgca gatctagtca gtcactggtc tacagcgacg gcaacaccta tctgagctgg 120 ctgcagcagc gaccaggaca gccacctaga ctgctgatct acaagatttc caataggttc 180 tctggagtgc ccgaccgctt tagcggatcc ggagctggaa ctgatttcac cctgaaaatc 240 tcccgcgtgg aggctgaaga tgtgggcgtc tactattgcg tccaggcaac ccagttccct 300 ctgacatttg gcgggggaac taaggtggag atcaagggag gaggaggatc tggaggagga 360 ggaagtggag gaggaggatc cgaagtgcag ctggtccagt ctggggccga ggtgaagaaa 420 cctggagaaa gtctgaagat ctcatgtaaa ggctccgggt actctttcac aagttattgg 480 attggctggg tccgacagat gccaggaaag ggcctggagt ggatgggaat catctacccc 540 ggcgacagcg atacccggta ttctcctagt tttcagggcc aggtgacaat cagcgcagac 600 aagtccatta ccacagccta tctgcagtgg tcaagcctga aagcctctga taccgctatg 660 tactattgtg ccaggcaccc tagctacggg tcaggaagcc caaactttga ctattggggc 720 caggggacac tggtgactgt ctcctctgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 780 cctcctgtgg caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960 gaggagcagt accagagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020 tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080 gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgcca 1140 ccatcacgag atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260 accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1320 gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccct tttgggtgct ggtggtggtt 1440 ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg 1500 agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 1560 tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1620 cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1680 gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1740 cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1800 tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 1836 <210> 48 <211> 2100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 48 gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 120 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaagg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 360 ggcggcagca gcgaggtgca gctgcagcag tctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 420 tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 480 gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 540 gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600 agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcgga ctattactgt 660 gcaagatcta attattacgg tagtagctac tggttcttcg atgtctgggg cgcagggacc 720 acggtcaccg tctcctcact cgacgaatct aagtacggac cgccctgccc cccttgccct 780 gcccccgagt tcctgggcgg acccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc 840 ctgatgatca gccggacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat 900 cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 960 cccagagagg aacagttcaa cagcacctac cgggtggtgt ctgtgctgac cgtgctgcac 1020 caggactggc tgaacggcaa agaatacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc 1080 agcatcgaaa agaccatcag caaggccaag ggccagcctc gcgagcccca ggtgtacacc 1140 ctgcctccct cccaggaaga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag 1200 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca acggccagcc tgagaacaac 1260 tacaagacca cccctcccgt gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagccggctg 1320 accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag 1380 gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgagcctgt ccctgggcaa gatgttctgg 1440 gtgctggtgg tggtgggcgg ggtgctggcc tgctacagcc tgctggtgac agtggccttc 1500 atcatctttt gggtgcggag caagcggagc agaggcggcc acagcgacta catgaacatg 1560 acccccagac ggcctggccc cacccggaag cactaccagc cctacgcccc acccagggac 1620 tttgccgcct acagaagcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 1680 tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 1740 gaagaagaag gaggatgtga actgcgggtg aagttcagca gaagcgccga cgcccctgcc 1800 taccagcagg gccagaatca gctgtacaac gagctgaacc tgggcagaag ggaagagtac 1860 gacgtcctgg ataagcggag aggccgggac cctgagatgg gcggcaagcc tcggcggaag 1920 aacccccagg aaggcctgta taacgaactg cagaaagaca agatggccga ggcctacagc 1980 gagatcggca tgaagggcga gcggaggcgg ggcaagggcc acgacggcct gtatcagggc 2040 ctgtccaccg ccaccaagga tacctacgac gccctgcaca tgcaggccct gcccccaagg 2100 <210> 49 <211> 1974 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 49 gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 120 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaagg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 360 ggcggcagca gcgaggtgca gctgcagcag tctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 420 tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 480 gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 540 gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600 agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcgga ctattactgt 660 gcaagatcta attattacgg tagtagctac tggttcttcg atgtctgggg cgcagggacc 720 acggtcaccg tctcctcact cgacgaatct aagtacggac cgccctgccc cccttgccct 780 gcccccgagt tcctgggcgg acccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc 840 ctgatgatca gccggacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat 900 cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 960 cccagagagg aacagttcaa cagcacctac cgggtggtgt ctgtgctgac cgtgctgcac 1020 caggactggc tgaacggcaa agaatacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc 1080 agcatcgaaa agaccatcag caaggccaag ggccagcctc gcgagcccca ggtgtacacc 1140 ctgcctccct cccaggaaga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag 1200 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca acggccagcc tgagaacaac 1260 tacaagacca cccctcccgt gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagccggctg 1320 accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag 1380 gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgagcctgt ccctgggcaa gatgttctgg 1440 gtgctggtgg tggtgggcgg ggtgctggcc tgctacagcc tgctggtgac agtggccttc 1500 atcatctttt gggtgcggag caagcggagc agaggcggcc acagcgacta catgaacatg 1560 acccccagac ggcctggccc cacccggaag cactaccagc cctacgcccc acccagggac 1620 tttgccgcct acagaagccg ggtgaagttc agcagaagcg ccgacgcccc tgcctaccag 1680 cagggccaga atcagctgta caacgagctg aacctgggca gaagggaaga gtacgacgtc 1740 ctggataagc ggagaggccg ggaccctgag atgggcggca agcctcggcg gaagaacccc 1800 caggaaggcc tgtataacga actgcagaaa gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc 1860 ggcatgaagg gcgagcggag gcggggcaag ggccacgacg gcctgtatca gggcctgtcc 1920 accgccacca aggataccta cgacgccctg cacatgcagg ccctgccccc aagg 1974 <210> 50 <211> 2094 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 50 gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300 accaagctgg agctgaaggg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 360 ggcggcagca gccaggtgca actgcggcag cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 420 tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 480 gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 540 gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600 agcacagcct acatgcagct cagcagtctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 660 gcaagatcgc actacggtag taactacgta gactactttg actactgggg ccaaggcacc 720 actctcacag tctcctcact cgaccccaaa tcttctgaca aaactcacac atgcccaccg 780 tgcccagcac ctcctgtggc aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 840 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 900 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 960 aagccgcggg aggagcagta ccagagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1020 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1080 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1140 accctgccac catcacgaga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1200 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1260 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1320 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1380 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccctt ttgggtgctg 1440 gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 1500 ttctgggtga ggagtaagag gagcagggga ggtcacagtg actacatgaa catgactccc 1560 cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 1620 gcctatcgct ccaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 1680 agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 1740 gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1800 cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1860 ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1920 caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1980 gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 2040 acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgc 2094 <210> 51 <211> 1968 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 51 gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300 accaagctgg agctgaaggg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 360 ggcggcagca gccaggtgca actgcggcag cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 420 tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 480 gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 540 gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600 agcacagcct acatgcagct cagcagtctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 660 gcaagatcgc actacggtag taactacgta gactactttg actactgggg ccaaggcacc 720 actctcacag tctcctcact cgaccccaaa tcttctgaca aaactcacac atgcccaccg 780 tgcccagcac ctcctgtggc aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 840 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 900 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 960 aagccgcggg aggagcagta ccagagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1020 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1080 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1140 accctgccac catcacgaga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1200 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1260 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1320 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1380 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccctt ttgggtgctg 1440 gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 1500 ttctgggtga ggagtaagag gagcagggga ggtcacagtg actacatgaa catgactccc 1560 cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 1620 gcctatcgct ccagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1680 cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1740 aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1800 ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1860 aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1920 accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgc 1968 <210> 52 <211> 1971 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 52 gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300 accaagctgg agctgaaggg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 360 ggcggcagca gccaggtgca actgcggcag cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 420 tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 480 gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 540 gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600 agcacagcct acatgcagct cagcagtctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 660 gcaagatcgc actacggtag taactacgta gactactttg actactgggg ccaaggcacc 720 actctcacag tctcctcact cgaccccaaa tcttctgaca aaactcacac atgcccaccg 780 tgcccagcac ctcctgtggc aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 840 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 900 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 960 aagccgcggg aggagcagta ccagagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1020 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1080 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1140 accctgccac catcacgaga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1200 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1260 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1320 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1380 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccctt ttgggtgctg 1440 gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 1500 ttctgggtga aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1560 ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1620 ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1680 ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1740 gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1800 gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1860 atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1920 gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg c 1971 <210> 53 <211> 3180 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 53 atgctgctgc tggtcacctc actgctgctg tgcgaactgc cccaccccgc cttcctgctg 60 attcccgaca ttgtgatgac tcagacacca ctgagctccc cagtgactct gggacagcca 120 gccagtatct catgcagatc tagtcagtca ctggtctaca gcgacggcaa cacctatctg 180 agctggctgc agcagcgacc aggacagcca cctagactgc tgatctacaa gatttccaat 240 aggttctctg gagtgcccga ccgctttagc ggatccggag ctggaactga tttcaccctg 300 aaaatctccc gcgtggaggc tgaagatgtg ggcgtctact attgcgtcca ggcaacccag 360 ttccctctga catttggcgg gggaactaag gtggagatca agggaggagg aggatctgga 420 ggaggaggaa gtggaggagg aggatccgaa gtgcagctgg tccagtctgg ggccgaggtg 480 aagaaacctg gagaaagtct gaagatctca tgtaaaggct ccgggtactc tttcacaagt 540 tattggattg gctgggtccg acagatgcca ggaaagggcc tggagtggat gggaatcatc 600 taccccggcg acagcgatac ccggtattct cctagttttc agggccaggt gacaatcagc 660 gcagacaagt ccattaccac agcctatctg cagtggtcaa gcctgaaagc ctctgatacc 720 gctatgtact attgtgccag gcaccctagc tacgggtcag gaagcccaaa ctttgactat 780 tggggccagg ggacactggt gactgtctcc tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 840 ccagcacctc ctgtggcagg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 900 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 960 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1020 ccgcgggagg agcagtacca gagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1080 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1140 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1200 ctgccaccat cacgagatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1260 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1320 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1380 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1440 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctcccttttg ggtgctggtg 1500 gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc 1560 tgggtgagga gtaagaggag caggggaggt cacagtgact acatgaacat gactccccgc 1620 cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc 1680 tatcgctcca aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1740 ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1800 ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1860 ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1920 gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1980 gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 2040 atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 2100 gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ccagtgtact 2160 aattatgctc tcttgaaatt ggctggagat gttgagagca accccgggcc gatgccacct 2220 cctcgcctcc tcttcttcct cctcttcctc acccccatgg aagtcaggcc cgaggaacct 2280 ctagtggtga aggtggaaga gggagataac gctgtgctgc agtgcctcaa ggggacctca 2340 gatggcccca ctcagcagct gacctggtct cgggagtccc cgcttaaacc cttcttaaaa 2400 ctcagcctgg ggctgccagg cctgggaatc cacatgaggc ccctggccat ctggcttttc 2460 atcttcaacg tctctcaaca gatggggggc ttctacctgt gccagccggg gcccccctct 2520 gagaaggcct ggcagcctgg ctggacagtc aatgtggagg gcagcgggga gctgttccgg 2580 tggaatgttt cggacctagg tggcctgggc tgtggcctga agaacaggtc ctcagagggc 2640 cccagctccc cttccgggaa gctcatgagc cccaagctgt atgtgtgggc caaagaccgc 2700 cctgagatct gggagggaga gcctccgtgt gtcccaccga gggacagcct gaaccagagc 2760 ctcagccagg acctcaccat ggcccctggc tccacactct ggctgtcctg tggggtaccc 2820 cctgactctg tgtccagggg ccccctctcc tggacccatg tgcaccccaa ggggcctaag 2880 tcattgctga gcctagagct gaaggacgat cgccctgcca gagatatgtg ggtaatggag 2940 acgggtctgt tgttgccccg ggccacagct caagacgctg gaaagtatta ttgtcaccgt 3000 ggcaacctga ccatgtcatt ccacctggag atcactgctc ggccagtact atggcactgg 3060 ctgctgagga ctggtggctg gaaggtctca gctgtgactt tggcttatct gatcttctgc 3120 ctgtgttccc ttgtgggcat tcttcatctt caaagagccc tggtcctgag gaggaaaaga 3180 <210> 54 <211> 3054 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 54 atgctgctgc tggtcacctc actgctgctg tgcgaactgc cccaccccgc cttcctgctg 60 attcccgaca ttgtgatgac tcagacacca ctgagctccc cagtgactct gggacagcca 120 gccagtatct catgcagatc tagtcagtca ctggtctaca gcgacggcaa cacctatctg 180 agctggctgc agcagcgacc aggacagcca cctagactgc tgatctacaa gatttccaat 240 aggttctctg gagtgcccga ccgctttagc ggatccggag ctggaactga tttcaccctg 300 aaaatctccc gcgtggaggc tgaagatgtg ggcgtctact attgcgtcca ggcaacccag 360 ttccctctga catttggcgg gggaactaag gtggagatca agggaggagg aggatctgga 420 ggaggaggaa gtggaggagg aggatccgaa gtgcagctgg tccagtctgg ggccgaggtg 480 aagaaacctg gagaaagtct gaagatctca tgtaaaggct ccgggtactc tttcacaagt 540 tattggattg gctgggtccg acagatgcca ggaaagggcc tggagtggat gggaatcatc 600 taccccggcg acagcgatac ccggtattct cctagttttc agggccaggt gacaatcagc 660 gcagacaagt ccattaccac agcctatctg cagtggtcaa gcctgaaagc ctctgatacc 720 gctatgtact attgtgccag gcaccctagc tacgggtcag gaagcccaaa ctttgactat 780 tggggccagg ggacactggt gactgtctcc tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 840 ccagcacctc ctgtggcagg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 900 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 960 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1020 ccgcgggagg agcagtacca gagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1080 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1140 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1200 ctgccaccat cacgagatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1260 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1320 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1380 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1440 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctcccttttg ggtgctggtg 1500 gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc 1560 tgggtgagga gtaagaggag caggggaggt cacagtgact acatgaacat gactccccgc 1620 cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc 1680 tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1740 aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1800 agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 1860 ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1920 ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc 1980 aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgccagtg tactaattat 2040 gctctcttga aattggctgg agatgttgag agcaaccccg ggccgatgcc acctcctcgc 2100 ctcctcttct tcctcctctt cctcaccccc atggaagtca ggcccgagga acctctagtg 2160 gtgaaggtgg aagagggaga taacgctgtg ctgcagtgcc tcaaggggac ctcagatggc 2220 cccactcagc agctgacctg gtctcgggag tccccgctta aacccttctt aaaactcagc 2280 ctggggctgc caggcctggg aatccacatg aggcccctgg ccatctggct tttcatcttc 2340 aacgtctctc aacagatggg gggcttctac ctgtgccagc cggggccccc ctctgagaag 2400 gcctggcagc ctggctggac agtcaatgtg gagggcagcg gggagctgtt ccggtggaat 2460 gtttcggacc taggtggcct gggctgtggc ctgaagaaca ggtcctcaga gggccccagc 2520 tccccttccg ggaagctcat gagccccaag ctgtatgtgt gggccaaaga ccgccctgag 2580 atctgggagg gagagcctcc gtgtgtccca ccgagggaca gcctgaacca gagcctcagc 2640 caggacctca ccatggcccc tggctccaca ctctggctgt cctgtggggt accccctgac 2700 tctgtgtcca ggggccccct ctcctggacc catgtgcacc ccaaggggcc taagtcattg 2760 ctgagcctag agctgaagga cgatcgcccg gccagagata tgtgggtaat ggagacgggt 2820 ctgttgttgc cccgggccac agctcaagac gctggaaagt attattgtca ccgtggcaac 2880 ctgaccatgt cattccacct ggagatcact gctcggccag tactatggca ctggctgctg 2940 aggactggtg gctggaaggt ctcagctgtg actttggctt atctgatctt ctgcctgtgt 3000 tcccttgtgg gcattcttca tcttcaaaga gccctggtcc tgaggaggaa aaga 3054 <210> 55 <211> 3057 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 55 atgctgctgc tggtcacctc actgctgctg tgcgaactgc cccaccccgc cttcctgctg 60 attcccgaca ttgtgatgac tcagacacca ctgagctccc cagtgactct gggacagcca 120 gccagtatct catgcagatc tagtcagtca ctggtctaca gcgacggcaa cacctatctg 180 agctggctgc agcagcgacc aggacagcca cctagactgc tgatctacaa gatttccaat 240 aggttctctg gagtgcccga ccgctttagc ggatccggag ctggaactga tttcaccctg 300 aaaatctccc gcgtggaggc tgaagatgtg ggcgtctact attgcgtcca ggcaacccag 360 ttccctctga catttggcgg gggaactaag gtggagatca agggaggagg aggatctgga 420 ggaggaggaa gtggaggagg aggatccgaa gtgcagctgg tccagtctgg ggccgaggtg 480 aagaaacctg gagaaagtct gaagatctca tgtaaaggct ccgggtactc tttcacaagt 540 tattggattg gctgggtccg acagatgcca ggaaagggcc tggagtggat gggaatcatc 600 taccccggcg acagcgatac ccggtattct cctagttttc agggccaggt gacaatcagc 660 gcagacaagt ccattaccac agcctatctg cagtggtcaa gcctgaaagc ctctgatacc 720 gctatgtact attgtgccag gcaccctagc tacgggtcag gaagcccaaa ctttgactat 780 tggggccagg ggacactggt gactgtctcc tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 840 ccagcacctc ctgtggcagg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 900 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 960 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1020 ccgcgggagg agcagtacca gagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1080 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1140 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1200 ctgccaccat cacgagatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1260 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1320 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1380 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1440 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctcccttttg ggtgctggtg 1500 gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc 1560 tgggtgaaac ggggcagaaa gaaactcctg tatatattca aacaaccatt tatgagacca 1620 gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt agctgccgat ttccagaaga agaagaagga 1680 ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1740 cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1800 aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1860 ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1920 aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1980 accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcca gtgtactaat 2040 tatgctctct tgaaattggc tggagatgtt gagagcaacc ccgggccgat gccacctcct 2100 cgcctcctct tcttcctcct cttcctcacc cccatggaag tcaggcccga ggaacctcta 2160 gtggtgaagg tggaagaggg agataacgct gtgctgcagt gcctcaaggg gacctcagat 2220 ggccccactc agcagctgac ctggtctcgg gagtccccgc ttaaaccctt cttaaaactc 2280 agcctggggc tgccaggcct gggaatccac atgaggcccc tggccatctg gcttttcatc 2340 ttcaacgtct ctcaacagat ggggggcttc tacctgtgcc agccggggcc cccctctgag 2400 aaggcctggc agcctggctg gacagtcaat gtggagggca gcggggagct gttccggtgg 2460 aatgtttcgg acctaggtgg cctgggctgt ggcctgaaga acaggtcctc agagggcccc 2520 agctcccctt ccgggaagct catgagcccc aagctgtatg tgtgggccaa agaccgccct 2580 gagatctggg agggagagcc tccgtgtgtc ccaccgaggg acagcctgaa ccagagcctc 2640 agccaggacc tcaccatggc ccctggctcc acactctggc tgtcctgtgg ggtaccccct 2700 gactctgtgt ccaggggccc cctctcctgg acccatgtgc accccaaggg gcctaagtca 2760 ttgctgagcc tagagctgaa ggacgatcgc cctgccagag atatgtgggt aatggagacg 2820 ggtctgttgt tgccccgggc cacagctcaa gacgctggaa agtattattg tcaccgtggc 2880 aacctgacca tgtcattcca cctggagatc actgctcggc cagtactatg gcactggctg 2940 ctgaggactg gtggctggaa ggtctcagct gtgactttgg cttatctgat cttctgcctg 3000 tgttcccttg tgggcattct tcatcttcaa agagccctgg tcctgaggag gaaaaga 3057 <210> 56 <211> 2931 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 56 atgctgctgc tggtcacctc actgctgctg tgcgaactgc cccaccccgc cttcctgctg 60 attcccgaca ttgtgatgac tcagacacca ctgagctccc cagtgactct gggacagcca 120 gccagtatct catgcagatc tagtcagtca ctggtctaca gcgacggcaa cacctatctg 180 agctggctgc agcagcgacc aggacagcca cctagactgc tgatctacaa gatttccaat 240 aggttctctg gagtgcccga ccgctttagc ggatccggag ctggaactga tttcaccctg 300 aaaatctccc gcgtggaggc tgaagatgtg ggcgtctact attgcgtcca ggcaacccag 360 ttccctctga catttggcgg gggaactaag gtggagatca agggaggagg aggatctgga 420 ggaggaggaa gtggaggagg aggatccgaa gtgcagctgg tccagtctgg ggccgaggtg 480 aagaaacctg gagaaagtct gaagatctca tgtaaaggct ccgggtactc tttcacaagt 540 tattggattg gctgggtccg acagatgcca ggaaagggcc tggagtggat gggaatcatc 600 taccccggcg acagcgatac ccggtattct cctagttttc agggccaggt gacaatcagc 660 gcagacaagt ccattaccac agcctatctg cagtggtcaa gcctgaaagc ctctgatacc 720 gctatgtact attgtgccag gcaccctagc tacgggtcag gaagcccaaa ctttgactat 780 tggggccagg ggacactggt gactgtctcc tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 840 ccagcacctc ctgtggcagg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 900 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 960 cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1020 ccgcgggagg agcagtacca gagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1080 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1140 cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1200 ctgccaccat cacgagatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1260 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1320 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1380 accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1440 gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctcccttttg ggtgctggtg 1500 gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc 1560 tgggtgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1620 cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1680 cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1740 tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1800 gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1860 gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gccagtgtac taattatgct 1920 ctcttgaaat tggctggaga tgttgagagc aaccccgggc cgatgccacc tcctcgcctc 1980 ctcttcttcc tcctcttcct cacccccatg gaagtcaggc ccgaggaacc tctagtggtg 2040 aaggtggaag agggagataa cgctgtgctg cagtgcctca aggggacctc agatggcccc 2100 actcagcagc tgacctggtc tcgggagtcc ccgcttaaac ccttcttaaa actcagcctg 2160 gggctgccag gcctgggaat ccacatgagg cccctggcca tctggctttt catcttcaac 2220 gtctctcaac agatgggggg cttctacctg tgccagccgg ggcccccctc tgagaaggcc 2280 tggcagcctg gctggacagt caatgtggag ggcagcgggg agctgttccg gtggaatgtt 2340 tcggacctag gtggcctggg ctgtggcctg aagaacaggt cctcagaggg ccccagctcc 2400 ccttccggga agctcatgag ccccaagctg tatgtgtggg ccaaagaccg ccctgagatc 2460 tgggagggag agcctccgtg tgtcccaccg agggacagcc tgaaccagag cctcagccag 2520 gacctcacca tggcccctgg ctccacactc tggctgtcct gtggggtacc ccctgactct 2580 gtgtccaggg gccccctctc ctggacccat gtgcacccca aggggcctaa gtcattgctg 2640 agcctagagc tgaaggacga tcgccctgcc agagatatgt gggtaatgga gacgggtctg 2700 ttgttgcccc gggccacagc tcaagacgct ggaaagtatt attgtcaccg tggcaacctg 2760 accatgtcat tccacctgga gatcactgct cggccagtac tatggcactg gctgctgagg 2820 actggtggct ggaaggtctc agctgtgact ttggcttatc tgatcttctg cctgtgttcc 2880 cttgtgggca ttcttcatct tcaaagagcc ctggtcctga ggaggaaaag a 2931 <210> 57 <211> 3306 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 57 atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60 gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 120 atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 180 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 240 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 300 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 360 accaagctgg aaataaaagg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 420 ggcggcagca gcgaggtgca gctgcagcag tctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 480 tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540 gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 600 gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 660 agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcgga ctattactgt 720 gcaagatcta attattacgg tagtagctac tggttcttcg atgtctgggg cgcagggacc 780 acggtcaccg tctcctcact cgacgaatct aagtacggac cgccctgccc cccttgccct 840 gcccccgagt tcctgggcgg acccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc 900 ctgatgatca gccggacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat 960 cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 1020 cccagagagg aacagttcaa cagcacctac cgggtggtgt ctgtgctgac cgtgctgcac 1080 caggactggc tgaacggcaa agaatacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc 1140 agcatcgaaa agaccatcag caaggccaag ggccagcctc gcgagcccca ggtgtacacc 1200 ctgcctccct cccaggaaga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag 1260 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca acggccagcc tgagaacaac 1320 tacaagacca cccctcccgt gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagccggctg 1380 accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag 1440 gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgagcctgt ccctgggcaa gatgttctgg 1500 gtgctggtgg tggtgggcgg ggtgctggcc tgctacagcc tgctggtgac agtggccttc 1560 atcatctttt gggtgcggag caagcggagc agaggcggcc acagcgacta catgaacatg 1620 acccccagac ggcctggccc cacccggaag cactaccagc cctacgcccc acccagggac 1680 tttgccgcct acagaagcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 1740 tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 1800 gaagaagaag gaggatgtga actgcgggtg aagttcagca gaagcgccga cgcccctgcc 1860 taccagcagg gccagaatca gctgtacaac gagctgaacc tgggcagaag ggaagagtac 1920 gacgtcctgg ataagcggag aggccgggac cctgagatgg gcggcaagcc tcggcggaag 1980 aacccccagg aaggcctgta taacgaactg cagaaagaca agatggccga ggcctacagc 2040 gagatcggca tgaagggcga gcggaggcgg ggcaagggcc acgacggcct gtatcagggc 2100 ctgtccaccg ccaccaagga tacctacgac gccctgcaca tgcaggccct gcccccaagg 2160 ctcgagggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 2220 cccggcccta ggatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2280 gcattcctcc tgatcccacg caaagtgtgt aacggaatag gtattggtga atttaaagac 2340 tcactctcca taaatgctac gaatattaaa cacttcaaaa actgcacctc catcagtggc 2400 gatctccaca tcctgccggt ggcatttagg ggtgactcct tcacacatac tcctcctctg 2460 gatccacagg aactggatat tctgaaaacc gtaaaggaaa tcacagggtt tttgctgatt 2520 caggcttggc ctgaaaacag gacggacctc catgcctttg agaacctaga aatcatacgc 2580 ggcaggacca agcaacatgg tcagttttct cttgcagtcg tcagcctgaa cataacatcc 2640 ttgggattac gctccctcaa ggagataagt gatggagatg tgataatttc aggaaacaaa 2700 aatttgtgct atgcaaatac aataaactgg aaaaaactgt ttgggacctc cggtcagaaa 2760 accaaaatta taagcaacag aggtgaaaac agctgcaagg ccacaggcca ggtctgccat 2820 gccttgtgct cccccgaggg ctgctggggc ccggagccca gggactgcgt ctcttgccgg 2880 aatgtcagcc gaggcaggga atgcgtggac aagtgcaacc ttctggaggg tgagccaagg 2940 gagtttgtgg agaactctga gtgcatacag tgccacccag agtgcctgcc tcaggccatg 3000 aacatcacct gcacaggacg gggaccagac aactgtatcc agtgtgccca ctacattgac 3060 ggcccccact gcgtcaagac ctgcccggca ggagtcatgg gagaaaacaa caccctggtc 3120 tggaagtacg cagacgccgg ccatgtgtgc cacctgtgcc atccaaactg cacctacgga 3180 tgcactgggc caggtcttga aggctgtcca acgaatgggc ctaagatccc gtccatcgcc 3240 actgggatgg tgggggccct cctcttgctg ctggtggtgg ccctggggat cggcctcttc 3300 atgtga 3306 <210> 58 <211> 2034 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 58 atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60 gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 120 atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 180 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 240 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 300 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 360 accaagctgg aaataaaagg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 420 ggcggcagca gcgaggtgca gctgcagcag tctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 480 tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540 gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 600 gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 660 agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcgga ctattactgt 720 gcaagatcta attattacgg tagtagctac tggttcttcg atgtctgggg cgcagggacc 780 acggtcaccg tctcctcact cgacgaatct aagtacggac cgccctgccc cccttgccct 840 gcccccgagt tcctgggcgg acccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc 900 ctgatgatca gccggacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat 960 cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 1020 cccagagagg aacagttcaa cagcacctac cgggtggtgt ctgtgctgac cgtgctgcac 1080 caggactggc tgaacggcaa agaatacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc 1140 agcatcgaaa agaccatcag caaggccaag ggccagcctc gcgagcccca ggtgtacacc 1200 ctgcctccct cccaggaaga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag 1260 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca acggccagcc tgagaacaac 1320 tacaagacca cccctcccgt gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagccggctg 1380 accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag 1440 gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgagcctgt ccctgggcaa gatgttctgg 1500 gtgctggtgg tggtgggcgg ggtgctggcc tgctacagcc tgctggtgac agtggccttc 1560 atcatctttt gggtgcggag caagcggagc agaggcggcc acagcgacta catgaacatg 1620 acccccagac ggcctggccc cacccggaag cactaccagc cctacgcccc acccagggac 1680 tttgccgcct acagaagccg ggtgaagttc agcagaagcg ccgacgcccc tgcctaccag 1740 cagggccaga atcagctgta caacgagctg aacctgggca gaagggaaga gtacgacgtc 1800 ctggataagc ggagaggccg ggaccctgag atgggcggca agcctcggcg gaagaacccc 1860 caggaaggcc tgtataacga actgcagaaa gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc 1920 ggcatgaagg gcgagcggag gcggggcaag ggccacgacg gcctgtatca gggcctgtcc 1980 accgccacca aggataccta cgacgccctg cacatgcagg ccctgccccc aagg 2034 <210> 59 <211> 3183 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 59 atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60 gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 120 atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 180 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 240 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 300 gatgctgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 360 accaagctgg agctgaaggg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 420 ggcggcagca gccaggtgca actgcggcag cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 480 tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540 gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 600 gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 660 agcacagcct acatgcagct cagcagtctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 720 gcaagatcgc actacggtag taactacgta gactactttg actactgggg ccaaggcacc 780 actctcacag tctcctcact cgaccccaaa tcttctgaca aaactcacac atgcccaccg 840 tgcccagcac ctcctgtggc aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 900 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 960 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1020 aagccgcggg aggagcagta ccagagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1080 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1140 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1200 accctgccac catcacgaga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1260 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1320 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1380 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1440 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccctt ttgggtgctg 1500 gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 1560 ttctgggtga ggagtaagag gagcagggga ggtcacagtg actacatgaa catgactccc 1620 cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 1680 gcctatcgct ccaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 1740 agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 1800 gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1860 cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1920 ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1980 caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 2040 gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 2100 acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgccagtgt 2160 actaattatg ctctcttgaa attggctgga gatgttgaga gcaaccccgg gccgatgcca 2220 cctcctcgcc tcctcttctt cctcctcttc ctcaccccca tggaagtcag gcccgaggaa 2280 cctctagtgg tgaaggtgga agagggagat aacgctgtgc tgcagtgcct caaggggacc 2340 tcagatggcc ccactcagca gctgacctgg tctcgggagt ccccgcttaa acccttctta 2400 aaactcagcc tggggctgcc aggcctggga atccacatga ggcccctggc catctggctt 2460 ttcatcttca acgtctctca acagatgggg ggcttctacc tgtgccagcc ggggcccccc 2520 tctgagaagg cctggcagcc tggctggaca gtcaatgtgg agggcagcgg ggagctgttc 2580 cggtggaatg tttcggacct aggtggcctg ggctgtggcc tgaagaacag gtcctcagag 2640 ggccccagct ccccttccgg gaagctcatg agccccaagc tgtatgtgtg ggccaaagac 2700 cgccctgaga tctgggaggg agagcctccg tgtgtcccac cgagggacag cctgaaccag 2760 agcctcagcc aggacctcac catggcccct ggctccacac tctggctgtc ctgtggggta 2820 ccccctgact ctgtgtccag gggccccctc tcctggaccc atgtgcaccc caaggggcct 2880 aagtcattgc tgagcctaga gctgaaggac gatcgcccgg ccagagatat gtgggtaatg 2940 gagacgggtc tgttgttgcc ccgggccaca gctcaagacg ctggaaagta ttattgtcac 3000 cgtggcaacc tgaccatgtc attccacctg gagatcactg ctcggccagt actatggcac 3060 tggctgctga ggactggtgg ctggaaggtc tcagctgtga ctttggctta tctgatcttc 3120 tgcctgtgtt cccttgtggg cattcttcat cttcaaagag ccctggtcct gaggaggaaa 3180 aga 3183 <210> 60 <211> 3057 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 60 atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60 gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 120 atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 180 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 240 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 300 gatgctgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 360 accaagctgg agctgaaggg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 420 ggcggcagca gccaggtgca actgcggcag cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 480 tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540 gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 600 gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 660 agcacagcct acatgcagct cagcagtctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 720 gcaagatcgc actacggtag taactacgta gactactttg actactgggg ccaaggcacc 780 actctcacag tctcctcact cgaccccaaa tcttctgaca aaactcacac atgcccaccg 840 tgcccagcac ctcctgtggc aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 900 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 960 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1020 aagccgcggg aggagcagta ccagagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1080 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1140 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1200 accctgccac catcacgaga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1260 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1320 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1380 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1440 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccctt ttgggtgctg 1500 gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 1560 ttctgggtga ggagtaagag gagcagggga ggtcacagtg actacatgaa catgactccc 1620 cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 1680 gcctatcgct ccagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1740 cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1800 aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1860 ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1920 aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1980 accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcca gtgtactaat 2040 tatgctctct tgaaattggc tggagatgtt gagagcaacc ccgggccgat gccacctcct 2100 cgcctcctct tcttcctcct cttcctcacc cccatggaag tcaggcccga ggaacctcta 2160 gtggtgaagg tggaagaggg agataacgct gtgctgcagt gcctcaaggg gacctcagat 2220 ggccccactc agcagctgac ctggtctcgg gagtccccgc ttaaaccctt cttaaaactc 2280 agcctggggc tgccaggcct gggaatccac atgaggcccc tggccatctg gcttttcatc 2340 ttcaacgtct ctcaacagat ggggggcttc tacctgtgcc agccggggcc cccctctgag 2400 aaggcctggc agcctggctg gacagtcaat gtggagggca gcggggagct gttccggtgg 2460 aatgtttcgg acctaggtgg cctgggctgt ggcctgaaga acaggtcctc agagggcccc 2520 agctcccctt ccgggaagct catgagcccc aagctgtatg tgtgggccaa agaccgccct 2580 gagatctggg agggagagcc tccgtgtgtc ccaccgaggg acagcctgaa ccagagcctc 2640 agccaggacc tcaccatggc ccctggctcc acactctggc tgtcctgtgg ggtaccccct 2700 gactctgtgt ccaggggccc cctctcctgg acccatgtgc accccaaggg gcctaagtca 2760 ttgctgagcc tagagctgaa ggacgatcgc ccggccagag atatgtgggt aatggagacg 2820 ggtctgttgt tgccccgggc cacagctcaa gacgctggaa agtattattg tcaccgtggc 2880 aacctgacca tgtcattcca cctggagatc actgctcggc cagtactatg gcactggctg 2940 ctgaggactg gtggctggaa ggtctcagct gtgactttgg cttatctgat cttctgcctg 3000 tgttcccttg tgggcattct tcatcttcaa agagccctgg tcctgaggag gaaaaga 3057 <210> 61 <211> 3060 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 61 atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60 gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 120 atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 180 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 240 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 300 gatgctgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 360 accaagctgg agctgaaggg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 420 ggcggcagca gccaggtgca actgcggcag cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 480 tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540 gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 600 gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 660 agcacagcct acatgcagct cagcagtctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 720 gcaagatcgc actacggtag taactacgta gactactttg actactgggg ccaaggcacc 780 actctcacag tctcctcact cgaccccaaa tcttctgaca aaactcacac atgcccaccg 840 tgcccagcac ctcctgtggc aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 900 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 960 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1020 aagccgcggg aggagcagta ccagagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1080 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1140 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1200 accctgccac catcacgaga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1260 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1320 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1380 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1440 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccctt ttgggtgctg 1500 gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 1560 ttctgggtga aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1620 ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1680 ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1740 ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1800 gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1860 gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1920 atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1980 gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ccagtgtact 2040 aattatgctc tcttgaaatt ggctggagat gttgagagca accccgggcc gatgccacct 2100 cctcgcctcc tcttcttcct cctcttcctc acccccatgg aagtcaggcc cgaggaacct 2160 ctagtggtga aggtggaaga gggagataac gctgtgctgc agtgcctcaa ggggacctca 2220 gatggcccca ctcagcagct gacctggtct cgggagtccc cgcttaaacc cttcttaaaa 2280 ctcagcctgg ggctgccagg cctgggaatc cacatgaggc ccctggccat ctggcttttc 2340 atcttcaacg tctctcaaca gatggggggc ttctacctgt gccagccggg gcccccctct 2400 gagaaggcct ggcagcctgg ctggacagtc aatgtggagg gcagcgggga gctgttccgg 2460 tggaatgttt cggacctagg tggcctgggc tgtggcctga agaacaggtc ctcagagggc 2520 cccagctccc cttccgggaa gctcatgagc cccaagctgt atgtgtgggc caaagaccgc 2580 cctgagatct gggagggaga gcctccgtgt gtcccaccga gggacagcct gaaccagagc 2640 ctcagccagg acctcaccat ggcccctggc tccacactct ggctgtcctg tggggtaccc 2700 cctgactctg tgtccagggg ccccctctcc tggacccatg tgcaccccaa ggggcctaag 2760 tcattgctga gcctagagct gaaggacgat cgcccggcca gagatatgtg ggtaatggag 2820 acgggtctgt tgttgccccg ggccacagct caagacgctg gaaagtatta ttgtcaccgt 2880 ggcaacctga ccatgtcatt ccacctggag atcactgctc ggccagtact atggcactgg 2940 ctgctgagga ctggtggctg gaaggtctca gctgtgactt tggcttatct gatcttctgc 3000 ctgtgttccc ttgtgggcat tcttcatctt caaagagccc tggtcctgag gaggaaaaga 3060 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 62 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 63 Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly 1 5 <210> 64 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 64 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala 85 90 95 Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 115 120 125 Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser 130 135 140 Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly 165 170 175 Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 180 185 190 Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr Leu 195 200 205 Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe Asp Tyr Trp Gly 225 230 235 240 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 65 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 65 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met 130 135 140 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp 145 150 155 160 Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr 165 170 175 Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala 180 185 190 Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser 195 200 205 Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn 210 215 220 Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr 225 230 235 240 Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Asp Glu Ser Lys Tyr 245 250 <210> 66 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 66 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu 115 120 125 Arg Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met 130 135 140 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp 145 150 155 160 Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr 165 170 175 Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala 180 185 190 Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser 195 200 205 Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His 210 215 220 Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Asp Pro Lys Ser Ser 245 250 <210> 67 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 67 gacattgtga tgactcagac accactgagc tccccagtga ctctgggaca gccagccagt 60 atctcatgca gatctagtca gtcactggtc tacagcgacg gcaacaccta tctgagctgg 120 ctgcagcagc gaccaggaca gccacctaga ctgctgatct acaagatttc caataggttc 180 tctggagtgc ccgaccgctt tagcggatcc ggagctggaa ctgatttcac cctgaaaatc 240 tcccgcgtgg aggctgaaga tgtgggcgtc tactattgcg tccaggcaac ccagttccct 300 ctgacatttg gcgggggaac taaggtggag atcaagggag gaggaggatc tggaggagga 360 ggaagtggag gaggaggatc cgaagtgcag ctggtccagt ctggggccga ggtgaagaaa 420 cctggagaaa gtctgaagat ctcatgtaaa ggctccgggt actctttcac aagttattgg 480 attggctggg tccgacagat gccaggaaag ggcctggagt ggatgggaat catctacccc 540 ggcgacagcg atacccggta ttctcctagt tttcagggcc aggtgacaat cagcgcagac 600 aagtccatta ccacagccta tctgcagtgg tcaagcctga aagcctctga taccgctatg 660 tactattgtg ccaggcaccc tagctacggg tcaggaagcc caaactttga ctattggggc 720 caggggacac tggtgactgt ctcctct 747 <210> 68 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 68 gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 120 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaagg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 360 ggcggcagca gcgaggtgca gctgcagcag tctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 420 tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 480 gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 540 gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600 agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcgga ctattactgt 660 gcaagatcta attattacgg tagtagctac tggttcttcg atgtctgggg cgcagggacc 720 acggtcaccg tctcctcact cgacgaatct aagtac 756 <210> 69 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 69 gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300 accaagctgg agctgaaggg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 360 ggcggcagca gccaggtgca actgcggcag cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 420 tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 480 gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 540 gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600 agcacagcct acatgcagct cagcagtctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 660 gcaagatcgc actacggtag taactacgta gactactttg actactgggg ccaaggcacc 720 actctcacag tctcctca 738 <210> 70 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 70 gacattgtga tgactcagac accactgagc tccccagtga ctctgggaca gccagccagt 60 atctcatgca gatctagtca gtcactggtc tacagcgacg gcaacaccta tctgagctgg 120 ctgcagcagc gaccaggaca gccacctaga ctgctgatct acaagatttc caataggttc 180 tctggagtgc ccgaccgctt tagcggatcc ggagctggaa ctgatttcac cctgaaaatc 240 tcccgcgtgg aggctgaaga tgtgggcgtc tactattgcg tccaggcaac ccagttccct 300 ctgacatttg gcgggggaac taaggtggag atcaag 336 <210> 71 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 71 gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 120 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaa 318 <210> 72 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 72 gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60 atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 120 tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300 accaagctgg agctgaag 318 <210> 73 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 73 gaagtgcagc tggtccagtc tggggccgag gtgaagaaac ctggagaaag tctgaagatc 60 tcatgtaaag gctccgggta ctctttcaca agttattgga ttggctgggt ccgacagatg 120 ccaggaaagg gcctggagtg gatgggaatc atctaccccg gcgacagcga tacccggtat 180 tctcctagtt ttcagggcca ggtgacaatc agcgcagaca agtccattac cacagcctat 240 ctgcagtggt caagcctgaa agcctctgat accgctatgt actattgtgc caggcaccct 300 agctacgggt caggaagccc aaactttgac tattggggcc aggggacact ggtgactgtc 360 tcctct 366 <210> 74 <211> 384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 74 gaggtgcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaagcagaca 120 cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tacttcctac 180 aatcagaagt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggact attactgtgc aagatctaat 300 tattacggta gtagctactg gttcttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctcactcg acgaatctaa gtac 384 <210> 75 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 75 caggtgcaac tgcggcagcc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaagcagaca 120 cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tacttcctac 180 aatcagaagt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagtctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatcgcac 300 tacggtagta actacgtaga ctactttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 360 tcctca 366 <210> 76 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacct 36 <210> 77 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 ggaccgccct gccccccttg ccct 24 <210> 78 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 cctgtggcag gaccgtca 18 <210> 79 <211> 303 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 79 gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 60 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 120 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta ccagagcacg 180 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 240 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 300 aaa 303 <210> 80 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 gcccccgagt tcctgggcgg acccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc 60 ctgatgatca gccggacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat 120 cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 180 cccagagagg aacagttcaa cagcacctac cgggtggtgt ctgtgctgac cgtgctgcac 240 caggactggc tgaacggcaa agaatacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc 300 agcatcgaaa agaccatcag caaggccaag 330 <210> 81 <211> 315 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgccaccat cacgagatga gctgaccaag 60 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 180 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 300 ctctccctgt ctccc 315 <210> 82 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 82 ggccagcctc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcctccct cccaggaaga gatgaccaag 60 aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 120 tgggagagca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggacagc 180 gacggcagct tcttcctgta cagccggctg accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc 240 aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 300 ctgagcctgt ccctgggcaa g 321 <210> 83 <211> 84 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 atgttctggg tgctggtggt ggtgggcggg gtgctggcct gctacagcct gctggtgaca 60 gtggccttca tcatcttttg ggtg 84 <210> 84 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 84 cggagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc cagacggcct 60 ggccccaccc ggaagcacta ccagccctac gccccaccca gggactttgc cgcctacaga 120 agc 123 <210> 85 <211> 126 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 85 aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60 actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120 gaactg 126 <210> 86 <211> 336 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 86 cgggtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaatcagctg 60 tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctggataa gcggagaggc 120 cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180 gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240 aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac caaggatacc 300 tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaagg 336 <210> 87 <211> 66 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 87 atgctgctgc tggtcacctc actgctgctg tgcgaactgc cccaccccgc cttcctgctg 60 attccc 66 <210> 88 <211> 60 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 88 atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60 <210> 89 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 89 ggaggaggag gatctggagg aggaggaagt ggaggaggag gatcc 45 <210> 90 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 90 ggcagtacta gcggtggtgg ctccgggggc ggttccggtg ggggcggcag cagc 54 <210> 91 <211> 60 <212> DNA <213> unknown <220> <223> E2A self-cleaving peptide <400> 91 cagtgtacta attatgctct cttgaaattg gctggagatg ttgagagcaa ccccgggccg 60 <210> 92 <211> 71 <212> DNA <213> unknown <220> <223> T2A self-cleaving peptide <400> 92 tcgagggcgg cggagagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc 60 ccggccctag g 71 <210> 93 <211> 969 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 93 atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60 gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120 gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180 ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240 tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300 cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360 ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420 tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480 aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtg tcccaccgag ggacagcctg 540 aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600 ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660 gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720 gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780 tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccagtacta 840 tggcactggc tgctgaggac tggtggctgg aaggtctcag ctgtgacttt ggcttatctg 900 atcttctgcc tgtgttccct tgtgggcatt cttcatcttc aaagagccct ggtcctgagg 960 aggaaaaga 969 <210> 94 <211> 1074 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 94 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60 atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120 aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180 ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240 ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300 gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360 caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420 tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480 gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540 agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 600 cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 660 ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 720 aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc aggccatgaa catcacctgc 780 acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact acattgacgg cccccactgc 840 gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca ccctggtctg gaagtacgca 900 gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca cctacggatg cactgggcca 960 ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt ccatcgccac tgggatggtg 1020 ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg gcctcttcat gtga 1074 <210> 95 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 95 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 96 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 96 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 97 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 97 ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60 ggacct 66 <210> 98 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence <400> 98 ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60 tccaaccctg gacct 75

Claims (68)

  1. CD20에 특이적으로 결합할 수 있는 융합 단백질을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 융합 단백질은 서열 번호 26의 아미노산 서열을 포함하며,
    상기 폴리뉴클레오티드는,
    (a) 서열 번호 53의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 60% 및 80% 미만으로 동일하거나;
    (b) 서열 번호 44의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 60% 및 80% 미만으로 동일한,
    단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 융합 단백질이 서열 번호 26의 아미노산 서열로 이루어지는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 44 또는 서열 번호 53의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 70% 및 80% 미만으로 동일한, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열 번호 44 또는 서열 번호 53의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 75% 및 80% 미만으로 동일한, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 또는 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 그 코딩된 융합 단백질을 발현할 수 있는, 단리된 숙주 세포.
  6. 제5항에 있어서, 숙주 세포가 T 세포 또는 대상 자기유래 T 세포인, 단리된 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 이 둘 다의 것인, 단리된 숙주 세포.
  8. 제7항에 있어서, T 세포가 T 세포의 벌크 집단 또는 아집단(subpopulation)인, 단리된 숙주 세포.
  9. 제7항에 있어서, T 세포가 인간 CD4+ T 세포 및 인간 CD8+ T 세포를 포함하는, 단리된 숙주 세포.
  10. 제8항에 있어서, T 세포가 중추 기억 세포 또는 중추 기억 및 나이브 세포의 아집단인, 단리된 숙주 세포.
  11. 복수의 제7항의 CD4+ T 세포 및/또는 복수의 제7항의 CD8+ T 세포를 포함하는, 세포 집단.
  12. CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 지니고 있거나 지닌 것으로 의심되는 인간 대상에서 CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 조성물로서,
    (1) 제5항에 따른 숙주 세포; 및
    (2) CD20-특이적 결합 분자;를 포함하며,
    상기 CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애가, 암, B 세포-관련 암, B 세포 림프종 또는 백혈병, B 세포 비-호지킨 림프종(NHL), 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소 림프구성 백혈병(SLL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 면역모세포성 대세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 털세포 백혈병, 발덴스트룀 거대글로불린혈증, B-세포 전림프구성 백혈병, CD37+ 수지상 세포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 비장 변연부 림프종, 점막-관련 림프 조직(MALT)의 결절외 변연부 B-세포 림프종, 결절성 변연부 B 세포 림프종, 종격 (흉선) 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출액 림프종, 특발성 염증성 근병증, 류마티스 관절염, 유년기 류마티스 관절염, 중증 근무력증, 그레이브 병, 1형 진성 당뇨병, 항-사구체 기저막 질환, 급속 진행성 사구체신염, 버거병(IgA 신장병증), 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 크론병, 궤양성 대장염, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 항-인지질 항체 증후군, 시신경 척수염, 다발성 경화증, 자가면역 질환, 피부근염, 다발성 근염, 다발성 골수종, 또는 흑색종인,
    조성물.
  13. 제12항에 있어서, CD20-특이적 결합 분자가 항체인, 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 항체가 1.5.3, 1F5, Leu16, 리툭시맙, 오파투무맙, 오클렐리주맙, 벨투주맙, 우블리툭시맙, 또는 이들 중 둘 이상의 조합인, 조성물.
  15. CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 지니고 있거나 지닌 것으로 의심되는 인간 대상에서 CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제로서,
    제5항에 따른 숙주 세포의 치료적 유효량을 포함하며,
    상기 CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애가, 암, B 세포-관련 암, B 세포 림프종 또는 백혈병, B 세포 비-호지킨 림프종(NHL), 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소 림프구성 백혈병(SLL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 면역모세포성 대세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 털세포 백혈병, 발덴스트룀 거대글로불린혈증, B-세포 전림프구성 백혈병, CD37+ 수지상 세포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 비장 변연부 림프종, 점막-관련 림프 조직(MALT)의 결절외 변연부 B-세포 림프종, 결절성 변연부 B 세포 림프종, 종격 (흉선) 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출액 림프종, 특발성 염증성 근병증, 류마티스 관절염, 유년기 류마티스 관절염, 중증 근무력증, 그레이브 병, 1형 진성 당뇨병, 항-사구체 기저막 질환, 급속 진행성 사구체신염, 버거병(IgA 신장병증), 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 크론병, 궤양성 대장염, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 항-인지질 항체 증후군, 시신경 척수염, 다발성 경화증, 자가면역 질환, 피부근염, 다발성 근염, 다발성 골수종, 또는 흑색종인,
    약제.
  16. 제15항에 있어서, 숙주 세포가 T 세포 또는 대상 자기유래 T 세포인, 약제.
  17. 제16항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 이 둘 다의 것인, 약제.
  18. 제16항에 있어서, T 세포가 T 세포의 벌크 집단 또는 아집단인, 약제.
  19. 제15항에 있어서, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애의 치료가 대상에서 B-세포의 수를 감소시키는 것을 포함하는, 약제.
  20. 제15항에 있어서, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애가 암, B 세포-관련 암, 비-호지킨 림프종(NHL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 백혈병, B 세포 림프종, B 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종(FL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 발덴스트룀스 거대글로불린혈증, 또는 이들 중 둘 이상의 조합인, 약제.
  21. 제15항에 있어서, 대상이 CD20-특이적 결합 분자로 전처리된, 약제.
  22. 제21항에 있어서, CD20-특이적 결합 분자가 1.5.3, 1F5, Leu16, 리툭시맙, 오파투무맙, 오클렐리주맙, 벨투주맙, 우블리툭시맙, 또는 이들 중 둘 이상의 조합인, 약제.
  23. 제20항에 있어서, 숙주 세포가 T 세포인, 약제.
  24. 제23항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 이 둘 다의 것인, 약제.
  25. 제21항에 있어서, 숙주 세포가 T 세포인, 약제.
  26. 제25항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 이 둘 다의 것인, 약제.
  27. 제22항에 있어서, 숙주 세포가 T 세포인, 약제.
  28. 제27항에 있어서, T 세포가 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 이 둘 다의 것인, 약제.
  29. 아미노산 서열 번호 35를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  30. 제29항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 인간 CD4+ T 세포.
  31. (1) 제30항의 인간 CD4+ T 세포; 및 (2) 제29항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 인간 CD8+ T 세포;의 조합.
  32. CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 지니고 있거나 지닌 것으로 의심되는 인간 대상에서 CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애를 치료하기 위한 조성물로서,
    (1) 제30항의 인간 CD4+ T 세포 및 (2) 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함하며,
    상기 CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애가, 암, B 세포-관련 암, B 세포 림프종 또는 백혈병, B 세포 비-호지킨 림프종(NHL), 버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소 림프구성 백혈병(SLL), 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종, 면역모세포성 대세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, 맨틀 세포 림프종, 털세포 백혈병, 발덴스트룀 거대글로불린혈증, B-세포 전림프구성 백혈병, CD37+ 수지상 세포 림프종, 림프형질세포성 림프종, 비장 변연부 림프종, 점막-관련 림프 조직(MALT)의 결절외 변연부 B-세포 림프종, 결절성 변연부 B 세포 림프종, 종격 (흉선) 거대 B-세포 림프종, 혈관내 거대 B-세포 림프종, 원발성 삼출액 림프종, 특발성 염증성 근병증, 류마티스 관절염, 유년기 류마티스 관절염, 중증 근무력증, 그레이브 병, 1형 진성 당뇨병, 항-사구체 기저막 질환, 급속 진행성 사구체신염, 버거병(IgA 신장병증), 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 크론병, 궤양성 대장염, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), 항-인지질 항체 증후군, 시신경 척수염, 다발성 경화증, 자가면역 질환, 피부근염, 다발성 근염, 다발성 골수종, 또는 흑색종인,
    조성물.
  33. 제32항에 있어서, 서열 번호 35를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 복수의 인간 CD8+ T 세포를 추가로 포함하는, 조성물.
  34. 제33항에 있어서, CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포가 3:1 내지 1:1의 비율로 존재하거나, 또는 1:1 내지 3:1의 비율로 존재하는, 조성물.
  35. 제34항에 있어서, CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포가 1:1의 비율로 존재하는, 조성물.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 최대 106, 최대 107, 최대 108, 최대 109, 또는 1010을 초과하는 수의 변형된 T 세포를 포함하는, 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 최대 106, 최대 107, 또는 최대 108개의 변형된 T 세포를 포함하는, 조성물.
  38. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 CD4+ T 세포, 복수의 CD8+ T 세포, 또는 이 둘 다가 CD20-특이적 융합 단백질을 코딩하도록 바이러스 벡터를 사용하여 생체 외 변형된 것인, 조성물.
  39. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 벌크 CD4+ T 세포, 벌크 CD8+ T 세포, CD4+ 중추 기억 T 세포, CD8+ 중추 기억 T 세포, 또는 CD4+ 중추 기억 T 세포(TCM)와 CD4+ 나이브 T 세포(TN)의 조합을 포함하는, 조성물.
  40. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포를 1:1의 비율로 포함하며, 대상의 체중 kg당 1×105(±20%)개의 T 세포를 포함하거나 이로 이루어진, 조성물.
  41. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포를 1:1의 비율로 포함하며, 대상의 체중 kg당 3.3×105(±20%)개의 T 세포를 포함하거나 이로 이루어진 조성물.
  42. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포를 1:1의 비율로 포함하며, 대상의 체중 kg당 1×106개의 T 세포를 포함하는, 조성물.
  43. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포를 1:1의 비율로 포함하며, 대상의 체중 kg당 3.3×106개의 T 세포를 포함하는, 조성물.
  44. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포를 1:1의 비율로 포함하며, 대상의 체중 kg당 1×107개의 T 세포를 포함하는, 조성물.
  45. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 (a) CD20-특이적 항체; 또는 (b) 화학요법제;로 전처리된, 조성물.
  46. 제45항에 있어서, CD20-특이적 항체가 리툭시맙, 오파투무맙, 오클렐리주맙, 우블리툭시맙, 벨투주맙, 또는 이들 중 둘 이상의 조합을 포함하는, 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 화학요법제가 사이클로포스파미드, 플루다라빈, 사이클로포스파미드와 플루다라빈, CHOP, CHOP-R, CHOEP, 또는 CHOEP-R(여기서, CHOP는 사이클로포스파미드-하이드록시다우노루비신-온코빈-프레드니손, R은 리툭시맙, E는 에토포시드를 나타냄)을 포함하는, 조성물.
  48. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포가 융합 단백질과 코디네이트하여 절단된 CD19를 발현하는, 조성물.
  49. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애가 암, B 세포-관련 암, 비-호지킨 림프종(NHL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 백혈병, B 세포 림프종, B 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종(FL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 발덴스트룀스 거대글로불린혈증, 또는 이들 중 둘 이상의 조합인, 조성물.
  50. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애가 암인, 조성물.
  51. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애가 B 세포-관련 암인, 조성물.
  52. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애가 비-호지킨 림프종(NHL)인, 조성물.
  53. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애가 만성 림프구성 백혈병(CLL)인, 조성물.
  54. 제49항에 있어서, 최대 106, 최대 107, 최대 108, 최대 109, 또는 1010을 초과하는 수의 변형된 T 세포를 포함하는, 조성물.
  55. 제49항에 있어서, 최대 106, 최대 107, 또는 최대 108개의 변형된 T 세포를 포함하는, 조성물.
  56. 제1항 또는 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  57. 제56항에 있어서, 렌티바이러스 벡터를 포함하는 벡터.
  58. 제10항에 있어서, T 세포가 중추 기억 세포와 나이브 세포의 아집단인, 단리된 숙주 세포.
  59. 제18항에 있어서, T 세포가 중추 기억 세포 또는 중추 기억 세포와 나이브 세포의 아집단인, 약제.
  60. 제12항에 있어서, 숙주 세포가 제1항 또는 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하고 그 코딩된 융합 단백질을 발현할 수 있으며, 숙주 세포가 CD8+ T 세포, CD4+ T 세포, 또는 이 둘 다의 것인, 조성물.
  61. 제12항에 있어서, CD20 발현과 관련된 질환 또는 장애가 암, B 세포-관련 암, 비-호지킨 림프종(NHL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 백혈병, B 세포 림프종, B 세포 백혈병, 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종(FL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 발덴스트룀스 거대글로불린혈증, 또는 이들 중 둘 이상의 조합인, 조성물.
  62. 제1항, 제2항 및 제29항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 관심 숙주 세포 내로 삽입하는 것을 포함하는, 시험관 내 또는 생체 외 방법.
  63. 제62항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 벡터 내에 포함되는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터를 포함하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터를 포함하는, 방법.
  66. 제62항에 있어서, 숙주 세포가 면역 세포를 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 면역 세포가 T 세포를 포함하는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, T 세포가 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 나이브 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 중추 기억 또는 이펙터 T 세포, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
KR1020227005550A 2016-03-18 2017-03-17 Cd20 면역요법을 위한 조성물 및 방법 KR102499191B1 (ko)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662310541P 2016-03-18 2016-03-18
US62/310,541 2016-03-18
US201662320327P 2016-04-08 2016-04-08
US62/320,327 2016-04-08
PCT/US2017/023098 WO2017161353A1 (en) 2016-03-18 2017-03-17 Compositions and methods for cd20 immunotherapy
KR1020187026926A KR102366611B1 (ko) 2016-03-18 2017-03-17 Cd20 면역요법을 위한 조성물 및 방법

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187026926A Division KR102366611B1 (ko) 2016-03-18 2017-03-17 Cd20 면역요법을 위한 조성물 및 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220030307A KR20220030307A (ko) 2022-03-10
KR102499191B1 true KR102499191B1 (ko) 2023-02-13

Family

ID=58448653

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187026926A KR102366611B1 (ko) 2016-03-18 2017-03-17 Cd20 면역요법을 위한 조성물 및 방법
KR1020227005550A KR102499191B1 (ko) 2016-03-18 2017-03-17 Cd20 면역요법을 위한 조성물 및 방법

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187026926A KR102366611B1 (ko) 2016-03-18 2017-03-17 Cd20 면역요법을 위한 조성물 및 방법

Country Status (13)

Country Link
US (2) US10875927B2 (ko)
EP (2) EP3939994A3 (ko)
JP (2) JP7065782B2 (ko)
KR (2) KR102366611B1 (ko)
CN (1) CN108884144B (ko)
AU (1) AU2017235657B2 (ko)
BR (1) BR112018067977A8 (ko)
CA (1) CA3015369A1 (ko)
DK (1) DK3430038T3 (ko)
ES (1) ES2893840T3 (ko)
IL (1) IL261316B2 (ko)
MX (1) MX2018010415A (ko)
WO (1) WO2017161353A1 (ko)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105985444B (zh) * 2015-02-05 2024-02-13 博生吉安科细胞技术有限公司 一种嵌合抗原受体、以及快速构建嵌合抗原受体的方法及应用
CN108395482B (zh) * 2017-02-08 2021-02-05 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种靶向cd20抗原嵌合抗原受体的构建及其工程化t细胞的活性鉴定
EP3704230B1 (en) * 2017-11-01 2024-10-23 Juno Therapeutics, Inc. Process for generating therapeutic compositions of engineered cells
WO2019149743A1 (en) * 2018-01-30 2019-08-08 Cellectis Combination comprising allogeneic immune cells deficient for an antigen present on both t-cells and pathological cells and therapeutic antibody against said antigen
EP3806903B1 (en) 2018-06-14 2024-02-14 2seventy bio, Inc. Cd79a chimeric antigen receptors
CN109293781A (zh) * 2018-09-12 2019-02-01 中国人民解放军总医院 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、cd19-cd20双靶向性的t细胞及其应用
US11312963B2 (en) * 2018-10-18 2022-04-26 Synerk Inc. Compositions and methods for inhibiting TIGIT gene expression
WO2020123691A2 (en) 2018-12-12 2020-06-18 Kite Pharma, Inc Chimeric antigen and t cell receptors and methods of use
GB201906685D0 (en) * 2019-05-13 2019-06-26 Ultrahuman Six Ltd Activatable protein constructs and uses thereof
CN114206936A (zh) * 2019-06-14 2022-03-18 2赛文缇生物公司 用于治疗癌症的组合物和方法
US20220411479A1 (en) * 2019-10-30 2022-12-29 Precision Biosciences, Inc. Cd20 chimeric antigen receptors and methods of use for immunotherapy
CN111944062B (zh) * 2019-12-09 2023-11-07 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种识别Fc片段的嵌合抗原受体及其应用
CA3174575A1 (en) * 2020-03-02 2021-09-10 The Regents Of The University Of California Chimeric antigen receptors and related methods and compositions for the treatment of cancer
WO2021231954A1 (en) * 2020-05-15 2021-11-18 Precision Biosciences, Inc. Methods for immunotherapy
US20230192807A1 (en) * 2020-05-15 2023-06-22 Precision Biosciences, Inc. Methods for immunotherapy
CN114774364B (zh) * 2022-04-26 2024-04-26 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
WO2024097313A1 (en) * 2022-11-02 2024-05-10 Sana Biotechnology, Inc. Methods for producing t cell therapy products

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000023573A2 (en) * 1998-10-20 2000-04-27 City Of Hope Cd20-specific redirected t cells and their use in cellular immunotherapy of cd20+ malignancies

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US7514537B2 (en) 2001-04-30 2009-04-07 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human gliomas
ZA200710496B (en) * 2005-06-02 2009-04-29 Astrazeneca Ab Antibodies directed to CD20 and used thereof
US8119772B2 (en) 2006-09-29 2012-02-21 California Institute Of Technology MART-1 T cell receptors
JP2011507897A (ja) 2007-12-21 2011-03-10 ジェネンテック， インコーポレイテッド リツキシマブ抵抗性関節リウマチ患者の治療
KR101319499B1 (ko) 2008-02-22 2013-10-17 엘지디스플레이 주식회사 화학적 자기조립 방법을 이용한 나노선 혹은탄소나노튜브의 적층 및 패턴형성 방법과, 이를 적용한액정표시장치의 제조방법
EP4032552B1 (en) 2008-08-26 2023-10-04 City of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
EP3527585B1 (en) 2009-11-03 2022-02-16 City of Hope Truncated epiderimal growth factor receptor (egfrt) for transduced t cell selection
PL3214091T3 (pl) 2010-12-09 2019-03-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Zastosowanie komórek T modyfikowanych chimerycznymi receptorami antygenowymi do leczenia nowotworów
KR101976882B1 (ko) * 2011-03-23 2019-05-09 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 세포 면역요법용 방법 및 조성물
RU2638806C2 (ru) 2011-05-12 2017-12-15 Дженентек, Инк. Lc-ms/ms способ мониторинга множественных реакций для выявления терапевтических антител в образцах животных с помощью каркасных сигнатурных пептидов
US20140004037A1 (en) 2012-01-19 2014-01-02 Therapeutic Proteins, Inc. Stabilization of the anti-cd20 antibody rituximab
IL293944A (en) 2012-08-20 2022-08-01 Hutchinson Fred Cancer Res Method and preparations for cellular immunotherapy
PL3150256T3 (pl) 2012-11-02 2021-02-08 Tg Therapeutics Inc. Kombinacja przeciwciała anty-cd20 i selektywnego inhibitora kinazy pi3
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
CN105143269B (zh) * 2013-09-25 2020-05-22 北京安保康生物医药科技有限公司 抗cd20的全人源单克隆抗体及其应用
CN105980402B (zh) 2013-12-20 2021-06-15 弗雷德哈钦森癌症研究中心 带标签的嵌合效应分子及其受体
JP6831777B2 (ja) * 2014-07-21 2021-02-17 ノバルティス アーゲー Ｃｄ３３キメラ抗原受容体を使用する癌の処置
CN105330750B (zh) * 2015-11-20 2019-02-01 上海细胞治疗研究院 一种快速中止car-t细胞杀伤作用的分子刹车及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000023573A2 (en) * 1998-10-20 2000-04-27 City Of Hope Cd20-specific redirected t cells and their use in cellular immunotherapy of cd20+ malignancies

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cancer Immunology research, Vol. 4, No. 6, pp. 509-519 (2016.04.21.)
PLOS ONE, Vol. 8, No. 12, p. e82742 (2013.12.17.)

Also Published As

Publication number Publication date
US10875927B2 (en) 2020-12-29
KR20220030307A (ko) 2022-03-10
IL261316B1 (en) 2024-01-01
MX2018010415A (es) 2018-11-29
US11834511B2 (en) 2023-12-05
RU2018134300A3 (ko) 2020-07-15
US20210147569A1 (en) 2021-05-20
KR102366611B1 (ko) 2022-02-23
IL261316A (en) 2018-10-31
IL261316B2 (en) 2024-05-01
KR20180127348A (ko) 2018-11-28
CA3015369A1 (en) 2017-09-21
ES2893840T3 (es) 2022-02-10
EP3430038A1 (en) 2019-01-23
BR112018067977A2 (pt) 2019-02-05
EP3939994A2 (en) 2022-01-19
JP2022002550A (ja) 2022-01-11
DK3430038T3 (da) 2021-09-13
CN108884144A (zh) 2018-11-23
AU2017235657A1 (en) 2018-09-06
JP2019515652A (ja) 2019-06-13
JP7397840B2 (ja) 2023-12-13
US20190106501A1 (en) 2019-04-11
BR112018067977A8 (pt) 2023-04-11
CN108884144B (zh) 2023-03-14
EP3939994A3 (en) 2022-04-27
AU2017235657B2 (en) 2022-07-21
EP3430038B1 (en) 2021-06-16
JP7065782B2 (ja) 2022-05-12
RU2018134300A (ru) 2020-04-20
WO2017161353A1 (en) 2017-09-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102499191B1 (ko) Cd20 면역요법을 위한 조성물 및 방법
US12060394B2 (en) Nucleic acid constructs for co-expression of chimeric antigen receptor and transcription factor, cells containing and therapeutic use thereof
AU2017233658B2 (en) Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
KR102357004B1 (ko) 입양 세포 면역요법의 효능을 강화하기 위한 조성물 및 방법
RU2711975C2 (ru) Лечение рака с помощью гуманизированного анти-cd19 химерного антигенного рецептора
US20190161542A1 (en) Treatment of cancer using a chimeric antigen receptor in combination with an inhibitor of a pro-m2 macrophage molecule
JP2019536437A (ja) Ｈｐｖ特異的結合分子
KR20180134385A (ko) 선택적 단백질 발현을 위한 조성물 및 방법
US20210388110A1 (en) Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
CA2955386A1 (en) Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
CA3103337A1 (en) Nef-containing t cells and methods of producing thereof
KR20240099161A (ko) Bcma를 표적화하는 조성물 및 이의 사용 방법
IL297916A (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using CD70-specific fusion proteins
RU2782699C2 (ru) Композиции и способы иммунотерапии против cd20
WO2022012681A1 (en) Multispecific chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2024140641A1 (zh) 靶向ror1的抗原结合蛋白
KR102723896B1 (ko) 항클라우딘 18a2의 항체 및 이의 응용

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
N231 Notification of change of applicant
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant