KR102463782B1 - 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 천연물인 광나무의 유효성분을 미생물의 효소적 기능을 이용하여 B16F10 흑색종 세포의 활성화를 억제(사멸, 공격성 완화 포함)시키는 반응물을 생성함으로써 피부의 안정성을 높이고 부작용을 감소시키면서 피부 미백에 도움을 주는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 의한 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물은, 미생물인 바실러스 아미로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)와 광나무 추출물의 혼합 반응으로 이루어진다.
본 발명에 의한 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물의 제조 방법은, 광나무 추출물을 제조하는 제1단계와; 미생물로 바실러스 아미로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)를 선정하고 배양한 후 원심분리하여 미생물 펠렛을 수득하는 제2단계와; 상기 제2단계에서 수득한 미생물 펠렛과 상기 제1단계에서 제조한 광나무 추출물을 혼합 반응시키는 제3단계를 포함하고, 상기 제1단계는 광나무의 꽃과 잎을 에탄올로 주정추출한 후 감압 농축을 통해 광나무 추출물을 추출한다.

Description

광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물 및 이의 제조 방법{A whitening composition and its manufacturing method by bio-renovation of Ligustrum Janponicum Extract}

본 발명은 광나무를 이용한 미백 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 천연물인 광나무의 유효성분으로부터 피부 미백에 효과적이면서 피부의 안정성을 높이고 부작용을 감소시키는 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

이 부분은 본 출원 내용과 관련된 배경 정보를 제공할 뿐 반드시 선행기술이 되는 것은 아니다.

사람의 피부색은 노화, 자외선, 스트레스 등 다양한 요인에 의해 변하게 되며, 피부 내부의 멜라닌(melanin) 농도와 분포에 따라 결정되는데, 유전적인 요인 외에도, 태양 자외선이나 피로, 스트레스 등의 환경적 또는 생리적 조건에 의해서도 영향을 받는다.

멜라닌 세포(melanocyte)는 모발색과 피부색을 결정하는 페놀류의 생체고분자 물질로 검은 단백질의 복합체인 멜라닌(melanin)을 합성하고 분비하여, 자외선에 의한 피부손상을 막아줄 뿐 아니라 독성 약물의 흡수 등 여러 중요한 작용을 수행한다.

멜라닌은 다양한 형태 및 과정으로 피부에 흡수되어 피부 기저층에 존재하며, 자외선 및 외부 손상으로부터 피부를 보호하는 역할을 한다. 특히 자외선은 피부 면역계의 구성 요소를 활성화하여 염증 매개체를 방출하는 각질형성 세포 (keratinocyte) 및 기타 세포의 직접 활성화 등 많은 기전을 통해 염증 반응을 유발할 수 있다. 자외선으로 유도된 DNA 손상은 p53이 POMC (pro-opiomelanocortin) 유전자의 프로모터에 대한 결합을 활성화하여 α-MSH (melanocyte-stimulating hormones)를 생성하며, 생성된 α-MSH는 멜라닌 세포로 신호를 보내는 역할을 하는 MC1R(melanocortin 1 receptor)와 결합하여 cAMP(cyclic adenosine monophosphosphate) 생산을 자극하고, 증가된 cAMP는 PKA (protein kinase A)를 활성화하여 cAMP 반응 요소인 CREB(cAMP response element-binding protein) 단백질을 인산화한다. CREB는 MITF (microphthalmia-associated transcription factor)의 발현을 포함하여 다양한 유전자의 발현을 조절하는 전사 인자이다. MITF는 멜라닌 생성 효소인 TRP(tyrosinase-related protein)-1, 2, 및 티로시나제(tyrosinase)의 발현을 조절한다. 그 중 tyrosinase 효소로부터 시작되는 멜라닌 생성은 티로시나제(tyrosinase) 효소가 도파(DOPA)(3, 4-dihydroxy phenylalanine)를 거쳐 도파퀴논(DOPA-quinone)으로 변환되며, 이것이 효소반응과 자동 산화 반응으로 DOPA-chrome을 거쳐 멜라닌이 형성된다.

이와 같은 멜라닌의 합성이 피부 내에서 과도하게 일어나면, 피부 톤을 어둡게 하고, 기미, 주근깨 등을 발생시키기기도 한다. 따라서, 피부내의 멜라닌 색소의 합성을 저해시키면, 피부 톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라 자외선, 호르몬 및 유전적인 원인에 기인하여 발생하는 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증을 개선시킬 수 있다. 따라서, 종래에는 하이드로퀴논(hydroquinone)이나 아스콜빈산(ascorbic acid), 코지산(kojic acid), 글루타티온(glutathione)과 같은 티로시나제에 대해 저해 활성을 갖는 물질을 연고, 에센스 등의 화장료에 배합함으로써 피부 미백을 실현하거나, 기미, 주근깨 등의 피부 과색소 침착증을 개선하였다. 그러나, 하이드로퀴논은 소정의 미백효과를 발휘하지만, 피부 자극성이 심하여 배합량을 극소량으로 제한해야 하는 문제점이 있고, 아스콜빈산은 산화되기 쉬워 이를 배합한 화장료는 변색, 변취되는 등의 문제가 발생하는 단점이 있다. 또한, 글루타티온, 시스테인 등의 티올계 반응물은 특유의 불쾌한 냄새를 가질 뿐만 아니라 경피흡수에도 문제점이 있고, 이들의 배당체 및 유도체들도 극성이 높으므로 화장료의 배합 성분으로 사용하기는 어렵다.

피부 미백을 위한 특허문헌으로 등록특허 제10-1326690호는 진세노사이드 F1(20-O-β-D-글루코피라노실-20(S)-프로토파낙사트리올)을 유효 성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물이며, 등록특허 제10-2010235호는 흑난초 (Liparis nervosa (Thunb.) Lindl.), 섬꿩고사리 (Plagiogyria japonica Nakai), 버어먼초 (Burmanniacryptopetala Makino) 및 자주땅귀개 (Utricularia yakusimensis Masam.)의 혼합물로부터 추출된 혼합추출물을 함유하는 피부보습 및 피부미백 기능을 갖는 화장료 조성물이고, 등록특허 제10-0894714호는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물로 추출되며, 피부 미백 활성을 가지는 백모사(Humata tyermanni Moore) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 화장료 조성물이며, 지금까지 광나무를 미백을 위한 재료로 사용하지는 않았다.

등록특허 제10-1326690호 등록특허 제10-2010235호 등록특허 제10-0894714호

본 발명은 전술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 미생물의 반응을 통해 천연물인 광나무의 유효성분으로부터 B16F10 흑색종 세포의 활성화를 억제(사멸, 공격성 완화 포함)시키고 멜라닌 합성을 저해하는 화합물을 생성함으로써 피부의 안정성을 높이면서 부작용을 감소시키는 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하려는데 그 목적이 있다.

본 발명에 의한 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물은, 미생물인 바실러스 아미로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)와 광나무 추출물의 혼합 반응으로 이루어진 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물의 제조 방법은, 광나무 추출물을 제조하는 제1단계와; 미생물로 바실러스 아미로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)를 선정하고 배양한 후 원심분리하여 미생물 펠렛을 수득하는 제2단계와; 상기 제2단계에서 수득한 미생물 펠렛과 상기 제1단계에서 제조한 광나무 추출물의 반응으로 광나무 추출물의 유효성분을 통해 흑색종 세포의 활성화를 억제시킬 수 있도록 생물전환시키는 제3단계를 포함하고, 상기 제3단계는 상기 미생물 펠렛을 PG 버퍼로 세척하여 PG 버퍼 현탁액으로 현탁시킨 후 상기 광나무 추출물과 반응시킨다.

본 발명에 의한 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물 및 이의 제조 방법에 의하면, 미백을 위하여 사용하지 않던 광나무의 유효성분을 미생물과의 반응을 통해 B16F10 흑색종 세포의 활성화를 억제(사멸, 공격성 완화 포함)시키고 멜라닌 합성을 저해하는 화합물을 생성함으로써 피부 미백에 도움을 주는 한편 천연물로서 피부의 안정성을 높이고 부작용을 감소시키는 효과가 있다.

따라서, 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 폼 클렌징 등 화장품이나 외용 연고와 같은 약품 등의 피부미백용 조성물에 첨가되어 피부 트러블없이 사용할 수 있어 자외선에 노출되어도 피부 미백이 오랫동안 유지되는 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명에 의한 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물 제조 방법의 공정도.
도 2는 일반적인 광나무와 본 발명에 의한 광나무 추출물의 리노베이션 반응물 및 바실러스 아미로리쿼파시엔스의 HPLC 크로마토그램의 그래프.
도 3 내지 도 9는 본 발명의 실시예에 따른 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물의 테스트 결과를 보인 것으로,
도 3은 B16F10 세포 생존율을 보인 그래프이고,
도 4는 멜라닌(Melanin) 내용물의 양을 보인 그래프이며,
도 5는 티로시나아제(tyrosinase) 활성도 테스트 결과를 보인 그래프이고,
도 6 내지 도 9는 본 발명의 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석 결과를 보인 영상이다.

하기에서 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략할 것이다. 그리고 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

본 발명에 의한 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물은, 미생물인 바실러스 아미로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)에 의한 바이오리노베이션(Biorenovation) 생물전환기법을 통해 광나무의 유효성분으로부터 B16F10 흑색종 세포의 활성화를 억제시킬 수 있는 항산화 특성이 우수한 바이오리노베이션 반응물로 생성된 것이다.

1. 광나무 추출물.

광나무는 물푸레나무과 쥐똥나무에 속하는 식물로서, 전남, 경남의 해안, 제주, 섬지방, 일본과 대만 등지에서 분포하는 상록활엽교목으로, 정목 또는 여정목이라고도 부르며, 열매를 여정실이라고 한다. 또한, 잎에는 시린진(syringin), 과피와 과육에 우르솔산(ursolic acid), 올레오놀산(oleanolic acid), 아세틸 올레오놀산(acetyl-oleanolic acid) 등의 성분이 함유되어 있다고 알려져 있다. 광나무 잎은 성질이 평하고 독이 없으며, 시력을 좋게 하고 통증완화, 구내염, 치주염, 급성세균성 이질, 악성종양, 화상 등에 효과가 있다고 보고되어 있다. 지금까지는 광나무의 미백 효과에 대한 연구는 아직 알려지지 않았으며, 본 발명을 통해 광나무의 유효성분(syringin)으로부터 미백이 가능한 조성물을 얻고자 하는 것이다.

2. 바실러스 아미로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens).

미생물 리노베이션을 위한 미생물로는 바실러스 아미로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)를 선정하였다.

바실러스 아미로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)는 예를 들어 제주 전통 젓갈에 존재하는 미생물을 대상으로 탐색하였으며, 그 중 제주콩 재래간장에서 분리한 바실러스 아미로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)를 선정하였다.

즉, 본 발명은 제주도에서 많은 양이 재배되고 있는 광나무와 제주 전통 젓갈을 이용하는 점에서 지방자치단체의 특산품 활용으로 지자체의 홍보와 함께 경제 활성화에 도움을 줄 수 있다.

본 발명에 의한 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물의 제조 방법의 전체 공정은 광나무 추출물 제조 - 미생물 선정 및 배양 - 바이오리노베이션 - 원심분리/여과 - 동결건조를 포함하며 각 공정은 다음과 같다(도 1 참조).

1. 광나무 추출물 제조.

광나무 추출물은 주정추출을 통해 제조되며 그 공정은 주정 추출 - 여과 - 감압농축 - 동결건조이며 구체적인 공정은 다음과 같다.

가. 주정 추출.

광나무의 잎(작은 크기로 분쇄 가능) 300g에 대하여 에탄올(바람직하게 70% Ethanol) 0.9~1.1 L의 양을 이용하여 주정추출한다.

주정추출의 조건은 57~63℃, 2시간 40분~3시간 20분, 바람직하게 60℃, 3시간이다.

나. 여과.

주정추출된 추출물은 고형물을 포함하고 있으며, 고형물을 예를 들어, 여과지(paper filter)로 여과한다.

다. 농축(감압 농축).

여과 공정을 거친 추출물의 유효성분 농도를 높이기 위하여 추출물을 농축, 바람직하게 감압 농축(통상의 감압 농축 조건 안에서 자유롭게 실시 가능하므로 감압 농축의 조건을 구체적인 수치로 한정하지 아니한다)하고 이 과정에서 에탄올을 제거한다.

라. 동결 건조.

감압 농축을 거친 농축액을 예를 들어 영하 110℃로 동결 건조하여 보관할 수 있으며, 동결 건조 공정은 필요에 따라 선택되는 것이다.

이상의 주정 추출 공정은 광나무의 유효성분을 파괴하지 않고 추출하는데 최적의 공정이다.

2. 미생물 선정 및 배양.

미생물로 선정한 바실러스 아미로리쿼파시엔스를 Nutrient broth(Beef extract 3.0 g/L, Peptone 5.0 g/L)에서 최적 생육 조건에 맞추어 18시간~22시간, 바람직하게 20시간 배양하였다. 20시간 배양 후, 미생물을 4,800~5,200rpm의 속도, 3~5℃, 8분~12분간, 바람직하게 5,000 rpm, 4℃, 10분 동안 원심분리하여 미생물 펠렛(pellet)을 수득한다.

3. 바이오리노베이션(생물전환 반응).

가. 반응 합성.

수득한 미생물 펠렛을 PG 버퍼(50 mM phosphate pH 7.2 및 2% 글리세롤)로 세척하여, PG 버퍼(buffer) 5ml에 현탁시켰다(현탁하는 이유는 미생물을 배양하는 배지에 포함된 이물질을 제거하여 깨끗한 상태에서 반응을 유도하기 위한 것이며, 조성 중 글리세롤의 농도를 정확하게 하기 위한 것이다). 이후 현탁액과 광나무 추출물을 혼합{광나무 추출물 : 미생물 펠렛 : PG 버퍼 = 1 : 9~11 : 45~55의 중량비, 바람직하게 1 : 10 : 50의 중량비로 혼합}하여 27~33℃에서 120~180rpm의 속도로 70시간~74시간, 바람직하게 30℃에서 150rpm의 속도로 72시간 동안 배양하여 반응액을 합성한다. 상기 혼합비율은 광나무 추출물의 항산화 유효성분을 회수하기 위한 최적의 비율이다.

나. 바이오리노베이션 반응물의 생성여부 확인.

바이오리노베이션 반응물(반응물)의 반응여부를 확인하는 공정을 더 포함할 수 있으며, 반응이 끝난 후 원심분리하여 상등액을 바이오리노베이션 반응물로 수거하고, 감압 농축하여 DMSO(다이메틸설폭사이드, dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 후 HPLC(high performance liquid chromatography, 고성능 액체 크로마토그래피)로 생물전환 반응물의 생성여부를 확인한다.

다. 분리 동정.

HPLC 결과를 바탕으로 Prep-HPLC (preparative high performance liquid chromatography, 제조용 고성능 액체 크로마토그래피)를 이용하여 생성한 바이오리노베이션 반응물에 대한 피크(peak)를 분리하였다. 분리된 시료는 HPLC를 통해 purity를 확인한 후, LC-Mass (Liquid chromatography-mass spectrometry, 액체 크로마토그래피 질량 분석기) 및 NMR (Nuclear magnetic resonance, 핵자기 공명)을 통해 동정한다(분리 동정은 일반적인 방법과 동일하므로 구체적인 설명을 생략한다).

4. 원심분리 및 여과.

바이오리노베이션 반응물을 4,800~5,200rpm의 속도, 3~5℃, 8분~12분간, 바람직하게 5,000 rpm, 4℃, 10분 동안 원심분리하고, 여과지를 통해 여과한다.

5. 감압 농축.

여과 공정을 거친 바이오리노베이션 반응물의 유효성분 농도를 높이기 위하여 바이오리노베이션 반응물을 감압 농축(통상의 감압 농축 조건 안에서 자유롭게 실시 가능하므로 감압 농축의 조건을 구체적인 수치로 한정하지 아니한다)한다.

6. 동결 건조.

감압 농축을 거친 농축액을 동결 건조하여 보관할 수 있으며, 동결 건조 공정은 필요에 따라 선택되는 것이다.

본 발명에 의한 미백 조성물은 화장품, 외용 약품 등에 0.01~25중량%의 함량을 만족하도록 첨가되어 사용된다.

본 발명에 의한 미백 조성물의 바람직한 실시예는 다음과 같다.

<실시예>

1. 제조.

가. 광나무 추출물 : 광나무(제주특별자치도 제주시 한림읍에서 채취한 원물을 제주자원식물연구소에서 제공)의 잎 300g을 70% 에탄올(Ethanol) 1 L의 양으로 60ㅀC에서 3시간 동안 가열하여 주정추출함으로써 광나무 추출물을 제조하였다.

나. 미생물 : 미생물센터에서 분양받은 Bacillus amyloliquefaciens (KCTC 43033) 균주를 이용하여 바이오 리노베이션(Biorenovation) 반응에 사용하였으며, 균주의 증식에 필요한 Nutrient Broth (Beef extract 3.0 g/L, Peptone 5.0 g/L) 배지를 이용하여 30℃에서 150rpm의 속도로 72시간 동안 배양하였다. 이 균주를 20시간 배양 후, 5,000 rpm, 4℃, 10분 동안 원심분리하여 미생물 펠렛(pellet)을 수득하였다. 수득한 미생물 펠렛을 PG 버퍼 (50 mM phosphate pH 7.2 및 2% 글리세롤)로 세척하여, PG buffer 5ml에 현탁시켰다.

다. 바이오리노베이션.

광나무 추출물과 미생물을 혼합한 후 30℃에서 72시간 동안 150rpm의 속도로 반응시킨 후 분리동정을 통해 바이오리노베이션 반응물의 시료를 생성하고 원심분리를 통해 상등액을 감압 농축 후 -110℃에서 동결건조하여 사용하였다.

2. 테스트.

본 실시예의 테스트는 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 세포 생존율, melanin 합성 저해, tyrosinase 활성 저해, 멜라닌 합성에 관여하는 TRP-1, TRP-2, MITF, tyrosinase의 단백질 발현량을 확인하는 것이다.

가. 세포 배양.

본 테스트에서 사용된 α-멜라닌세포 자극 호르몬 (α-MSH, α-melanocyte-stimulating hormone)과 L-3,4-dihydroxyphenylalanin (L-DOPA)는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. B16F10 melanoma 세포는 ATCC사 (American Type Cell Culture, USA)에서 분양을 받았으며 10% Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA), 1% penicillin/streptomycin을 함유한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco BRL Co. Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하여 37ㅀC, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였으며 3일에 한 번씩 계대배양을 하였다.

나. 바이오리노베이션(Biorenovation) 생물전환의 HPLC 분석

Shimadzu SpectroMonitor 3200 digital UV/Vis detector (Phenomenex 4 μm Hydro-RP 80 Å, 250×4.6 mm)를 이용하여 시료의 HPLC 비교 분석을 진행하였으며, 정제수(0.1% TFA (Trifluoroacetic acid))와 Acetonitrile를 이동상으로 사용하였다. 이동상의 조성은 A: H₂O 99.9: TFA (Trifluoroacetic acid) 0.1, B: Acetonitrile이며 A: 90%, B: 10%로 시작하여 30 min에 A: 0%, B: 100%의 조건으로 분석하였다. 또한 최대 흡수 파장인 UV 254 nm, Ethanol에 녹인 시료 10 μl, 용매의 유속 1.0 mL/min, column 온도 40℃, Gradient 조건으로 분석하였다.

도 2는 광나무 추출물(LJ)과 생물 전환된 광나무 추출물(LJBR), 바이오리노베이션(Biorenovation)에 사용된 미생물인 B. amyloliquefaciens(KCTC 43033) 추출물(BA)의 HPLC 크로마토그램의 그래프이며, HPLC로 분석한 결과 LJBR 14-17.5min 에서 LJ에 존재하지 않는 신규 peak 생성이 확인되었다. 이는 LJ에 존재하는 미지의 반응물이 미생물과의 대사작용을 통해 새로운 반응물로 전환되었을 가능성을 시사한다.

다. 세포생존능(Cell viability).

B16F10 melanoma 세포에 대한 광나무 추출물 (LJ)과 생물 전환된 광나무 추출물 (LJBR), Biorenovation에 사용된 B. amyloliquefaciens 추출물 (BA)의 세포 독성은 MTT assay를 통해 측정하였다. B16F10 melanoma 세포를 24 well plate에 1.0 × 10⁴ cells/well로 분주하여 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 α-MSH (200 nM)와 각 시료를 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리하여 72시간 배양하였다.

이후 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromide, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액을 첨가하여 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 4시간 동안 반응시킨 후 상등액을 제거하고 형성된 pellet을 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 용해시킨 후 96 well plate에 담아 570 nm 파장에서 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finland)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

도 3에서 알 수 있듯이, BA 및 LJ와 LJBR을 25, 50, 100 μg/mL 농도로 처리한 결과 측정 농도에서 BA, LJ, LJBR 모두 약 98% 이상의 세포 생존율을 보였다. 따라서 세포 독성을 보이지 않는 25, 50, 100 μg/mL의 농도로 추후 실험을 진행하였다.

라. Melanin 생성 억제 활성 평가.

LJ와 LJBR의 멜라닌 합성 억제 효능을 확인하기 위해 B16F10 melanoma 세포를 6 well plate에 4.0 × 10⁴ cells/well로 분주하여 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였고, α-MSH (200 nM)와 LJ와 LJBR을 세포 독성이 없는 농도로 함께 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 이후 PBS (phosphate buffered saline, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로 세포를 세척하고 trypsin-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, USA)를 처리하여 세포를 회수하여 1%의 protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)가 함유된 RIPA buffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 넣어 세포를 lysis한 후 13,000 rpm에서 40분간 원심 분리하여 pellet과 상등액을 분리하였다. 분리한 pellet에 1 N NaOH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 넣어 90°C에 1시간 동안 가열 후 spectrophotometer를 이용하여 405 nm 파장으로 흡광도를 측정하였다.

LJ와 LJBR 처리 시 멜라닌 생성에 미치는 영향을 확인한 결과, 도 4에서 보이는 것처럼, α-MSH 단독 처리 군과 비교하여 LJ 처리군은 약 18%, 18%, 19%로 미미한 멜라닌 합성 저해를 보인 반면 LJBR 처리군은 21%, 25%, 29% 멜라닌 합성 저해를 나타내었다. 이 결과는 Biorenovation 기법으로 생물 전환된 LJBR이 기존의 LJ 보다 멜라닌 합성에 대한 우수한 저해 효과를 갖는다는 것을 나타낸다.

마. 티로시나아제(Tyrosinase) 생성 억제 활성 평가.

Tyrosinase는 멜라닌 생성의 관여하는 효소로 이 tyrosinase의 활성을 측정하기 위해 B16F10 melanoma 세포를 6 well plate에 4.0 × 10⁴ cells/well로 분주하여 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였고, α-MSH (200 nM)와 시료를 농도별 (25, 50, 100 μg/mL)로 함께 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 이후 trypsin-EDTA를 3분간 처리하여 세포를 회수하고 RIPA buffer (1% protease inhibitor)를 넣어 lysis한 후 13,000 rpm에서 40분간 원심 분리하여 pellet과 상등액을 분리하였다. 분리한 상등액은 BCA protein assay kit (Thermo Scientific, USA)를 이용하여 정량하였고, 0.1 M sodiumphosphate buffer (Samchum Chemical Co., Seoul, Korea)와 L-DOPA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 2 mg/mL로 만들어, 정량한 단백질과 함께 96 well plate에 첨가하여 2시간 동안 37°C에서 반응시켰다. 반응 후 spectrophotometer를 이용하여 490 nm에서 tyrosinase 활성도를 측정하였다.

LJ와 LJBR이 멜라닌 합성 초기단계에 작용하는 Tyrosinase에 미치는 영향을 확인한 결과, 도 5에서 보이는 것처럼, α-MSH(200 nM) 단독 처리군과 비교하여 LJ 처리군은 최고농도인 100 μg/mL에서 tyrosinase 활성이 22% 억제된 반면 LJBR 처리군에서는 25, 50, 100 μg/mL 농도에서 14%, 49%, 58% 활성 억제를 보였다. 이 결과는 생물 전환 후 tyrosinase 효소에 직간접적으로 관여하는 반응물이 생성되어 tyrosinase 효소를 억제했을 가능성을 보여준다.

바. 웨스턴 블롯(Western Blot).

멜라닌 합성의 중요한 단백질인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase의 발현량을 측정하기 위해 B16F10 melanoma 세포를 6 well plate에 4.0 × 10⁴ cells/well로 분주하여 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 48시간 배양한 후 α-MSH (200 nM)와 LJ와 LJBR을 농도별 (25, 50, 100 ㅅg/mL)로 함께 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 이후 배양된 세포를 PBS를 이용해 세척하고 RIPA buffer (1% protease inhibitor)를 첨가하여 lysis한 후, 13,000 rpm에서 40분간 원심 분리하여 pellet과 상등액을 분리하였다. 분리한 상등액은 BCA protein assay kit를 이용하여 정량하였고, 정량한 상등액을 10% SDS-PAGE에 전기영동한 후 poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, Burlington, MA, USA)으로 단백질을 전이시켰다. 그 후 0.05% Tween 20/Tris-buffered saline (0.05% T/ TBS)에 5% skim milk를 포함한 용액을 membrane에 넣어 상온에서 2시간 동안 blocking 한 후, 1차 antibody인 MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase (Santa cruz Biotechnology, USA)를 각각 처리하여 저온 (4°C)에서 18시간 반응시켰고, 0.05% T/TBS로 10분간 4회 세척 후 Horseradish peroxidase (HRP)가 결합된 2차 andtibody인 anti-mouse IgG (Cell signaling, USA)을 0.05% T/TBS와 1 : 10,000으로 희석하여 상온에서 2시간 동안 부착시킨 뒤 0.05% T/TBS로 4회 세척하였다. 단백질은 Enhanced chemiluminescence kit (Bio-rad, USA)를 사용하여 Imaging densitometer (model GS-700, Bio-rad, USA)를 통해 결과를 측정하였다. 또한, MITF, TRP-1, TRP-2, tyrosinase 단백질 발현량을 imageJ program (NIH, Bethesda, MD, USA)을 이용하여 면적을 수치화한 뒤 그래프로 나타내었다.

앞선 실험 결과에서 α-MSH가 처리된 세포에 대하여 LJ 처리 시 melanin 생성이 저해된 것에 비해 도 6 내지 도 9에서 보이는 것처럼, 멜라닌 합성 관련 인자인 TRP-1, TRP-2, MITF 및 tyrosinase의 발현은 농도 의존적인 저해 활성을 보이지 않았다. 반면에 LJBR 처리군은 기존 추출물(LJ) 보다 우수하고 농도 의존적인 미백활성을 나타내었으며 특히 TRP-1 과 tyrosinase 발현은 LJBR 100 μg/mL 농도에서 각각 89%, 90% 감소하여 무처리군 보다도 우수한 미백 활성을 나타내었다. 이는 LJ가 천연소재인 특성상 소재 내 여러 성분이 다발적으로 작용하여 관련 인자들의 발현이 일관되게 나타나지 않은 것으로 판단되며 LJBR은 Biorenovation 과정에서 특정 반응물의 구조가 변화되어 특이적으로 작용되었기에 우수한 미백활성을 나타낸 것으로 사료된다.

상기의 테스트 결과를 정리하면, α-MSH로 자극된 B16F10 melanoma 세포에 대하여 광나무 추출물(LJ)과 바이오리노베이션(Biorenovation) 기법을 이용해 생물전환시킨 반응물(LJBR)의 미백 활성을 조사한 결과, 세포 독성을 보이지 않는 농도 (25, 50, 100 ㅅg/mL) 내에서 melanin 생성량 및 melanin 합성에 관여하는 TRP-1, TRP-2, MITF 그리고 tyrosinase의 발현을 확인한 결과 LJ와 LJBR 모두 melanin합성을 저해하였지만 LJBR에서 더 우수한 활성을 나타내었다. 또한 LJ에서는 melanin 합성 관여인자의 발현이 농도 의존적으로 저해되지 않은 반면에 LJBR 에서는 농도의존적인 저해 활성이 확인되었으며 특히 100 μg/mL 농도에서 TRP-1과 tyrosinase 발현은 무처리군과 유사한 수준으로 감소하였다. 따라서 LJBR이 멜라닌 합성과 관련된 효소 및 단백질 발현에 직간접적인 영향을 미침으로써 멜라닌 합성에 대한 저해 활성을 갖는다는 것을 확인하였으며 이 결과는 바이오리노베이션(Biorenovation)기법을 이용한 생물전환이 천연물의 생리활성 증대를 유도할 수 있음을 시사한다.

Claims (6)

1. 미생물인 바실러스 아미로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)와 광나무 추출물의 혼합 반응으로 이루어진 것을 특징으로 하는 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물.
2. 삭제
3. 광나무 추출물을 제조하는 제1단계와;
   미생물로 바실러스 아미로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)를 선정하고 배양한 후 원심분리하여 미생물 펠렛을 수득하는 제2단계와;
   상기 제2단계에서 수득한 미생물 펠렛과 상기 제1단계에서 제조한 광나무 추출물을 혼합 반응시키는 제3단계를 포함하고,
   상기 제1단계는 광나무의 꽃과 잎을 에탄올로 주정추출한 후 감압 농축을 통해 광나무 추출물을 추출하는 것을 특징으로 하는 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물의 제조 방법.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 제3단계는 상기 미생물 펠렛을 PG 버퍼로 세척하여 PG 버퍼 현탁액으로 현탁시킨 후 상기 광나무 추출물과 반응시키는 것을 특징으로 하는 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물의 제조 방법.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 제3단계를 거쳐 생물전환된 리노베이션 반응물을 원심분리하는 제4단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 광나무 추출물의 바이오리노베이션에 의한 미백 조성물의 제조 방법.
   
   
   
   
   
   
   
   
   
6. 삭제

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