KR102460165B1 - Ospa의 돌연변이 단편 및 이와 관련된 방법 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 보렐리아 감염의 예방 및 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 외부 표면 단백질 A(OspA)의 하이브리드 C-말단 단편을 포함하는 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 핵산, 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 폴리펩타이드 및/또는 상기 핵산 및/또는 상기 항체 (특히, 약물로서 사용하기 위해 또는 보렐리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법에서)를 포함하는 약제학적 조성물, 보렐리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법 및 대상체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.

Description

OSPA의 돌연변이 단편 및 이와 관련된 방법 및 용도{MUTANT FRAGMENTS OF OSPA AND METHODS AND USES RELATING THERETO}

본 발명은 보렐리아 감염의 예방 및 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 외부 표면 단백질 A(OspA)의 하이브리드 C-말단 단편을 포함하는 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 핵산, 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 폴리펩타이드 및/또는 상기 핵산 및/또는 상기 항체 (특히, 약물로서 사용하기 위해 또는 보렐리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법에서)를 포함하는 약제학적 조성물, 보렐리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법 및 대상체를 면역화시키는 방법에 관한 것이다.

라임 보렐리아증, 또는 라임 질환은, 유럽 및 북아메리카에서 가장 일반적으로 보고된 진드기 매개 질환이다. 상기 질환은 절지동물 매개성 그람 음성형 스피로헤타(spirochete), 보렐리아 부르그도르페리 ( Borrelia burgdorferi ) 센수 라토(sensu lato) (B. 부르그도르페리 s.l.)의 감염에 의해 유발되고, 피부, 심장, 골격근 및 신경학적 장애를 유도하는 다중 기관 또는 조직과 관련될 수 있다. 대부분의 국가에서, 라임 보렐리아증(Lyme borreliosis)은 신고해야 하는 질환이 아니라서 연간 발병률에 관한 정확한 데이터는 가용하지 않다. 미국에서, 발병 인자는 B. 부르그도르페리 (B. burgdorferi ) 센수 스트릭토(sensu stricto), (B. 부르그도 르페리(B. burgdorferi ) s.s.)이고 라임 보렐리아증은 북동부, 아틀란틱 중부 및 상북부 중앙 주들에 국지적이다. 2010년에, 총 약 30,000건의 라임 보렐리아증이 미국의 질환 통제 및 예방 센터(CDC)에 보고되었다. 2013년에 CDC에 의한 최신 보고는 다른 출처의 진단학적 데이터를 고려하여 미국에서 연간 실제 새로운 사례 건수가 300,000건에 가까운 것으로 추산한다 (http://www.cdc.gov/media/releases/2013/p0819-lyme-disease.html). 유럽에서, B. 아프젤리 (B. afzelii ) 및 B. 가리니(B. garinii)는 라임 보렐리아증의 주요 발병 인자이고, 또한 B. 부르그도르페리 (B. burgdorferi ) s.s. 및 B. 바바리엔시스(B. bavariensis)는 지정학적 위치에 따라 덜한 정도로 기여한다. 라임 보렐리아증의 만연은 다른 유럽 국가에서 상당히 다양하고 전체 만연은 서부에서 동부쪽으로 증가한다. 유럽 대부분에서 라이병의 보고된 사례 건수는 1990년대 초반 이후 증가하였고(예를 들어, 체코(Czech Republic), 에스토니아, 리투아니아; 유럽에서 라임 보렐리아증에 대해 2006년의 WHO 보고서를 참조한다), 사례의 지정학적 분포는 또한 확대되었다.

보렐리아는 스피로헤타세아(Spirochaetaceae)의 과에 속하고 이는 의학적으로 중요한 트레포네마( Treponema ), 레프토스피라 ( Leptospira ) 및 보렐리아(Borrelia) 속으로 세분된다. B. 부르그도르페리 (B. burgdorferi ) s.l.은 나선형이고, 왕성한 이동성인 그람-음성 세균이고 길이는 약 10-20μm이고 너비는 0.2-0.5μm이고, 이는 미세호기성 조건하에서 성장한다. 스피로헤타성 세포벽은 펩티도글리캔 및 여러 플라겔라에 이어서 느슨하게 연합된 외막에 의해 둘러싸인 세포질막으로 이루어진다.

라임 보렐리아증은 일반적으로 차도 및 악화와 함께 상이한 임상적 증상을 특징으로 하는 단계로 일어난다. 단계 1, 조기 감염은 수일 또는 수주이내 단계 2인 파종성 감염, 및 수개월 내지 수년에 단계 3인 지속적 감염으로 이어지는 피부의 국소 감염으로 이루어진다. 그러나, 상기 감염은 가변적이고; 일부 환자들은 단지 피부의 국소화된 감염을 갖고 다른 환자들은 단지 관절염과 같은 병의 후반 증상을 나타낸다. 라임 보렐리아증의 상이한 임상적 증후군은 또한 다양한 B. 부르그도르페리 (B. burgdorferi ) s.l. 종과의 감염에 의해 유발된다. B. 부르그도르페리(B. burgdorferi ) s.s는 보다 흔히 관절 증상(관절염) 및 심장 문제를 유발하고, B. 아프젤리(B. afzelii)는 주요 피부 증상(이동홍반(erythema migrans); EM 및 만성위축성선단피부염; ACA)을 유발하고, 반면 B. 가리니(B. garinii)는 뇌보렐리아증의 대부분의 사례에 연루되어 있다.

국부 감염 - 감염의 단계 1의 가장 공통된 증상은 감염된 사람들 70 내지 80%에서 일어나는 이동홍반이다. 이러한 피부 병변은 흔히 근육통, 관절통, 두통 및 열과 같은 감기형 증상으로 이어진다. 이들 비-특이적 증상은 이동홍반을 갖는 환자의 50%에서 일어난다.

파종성 감염 - 단계 2 동안에, 세균은 감염 부위로부터 혈류를 통해 원거리 조직 및 기관으로 이동한다. 상기 단계에서 일어나는 신경학적, 심혈관 및 관절 증상은 뇌수막염, 두개골 신경병증 및 간헐적 염증성 관절염을 포함한다.

지속적인 감염 - 감염의 단계 3은 만성적이고 진드기에게 물린 후 수개월 내지 수년까지 일어난다. 북아메리카에서 가장 흔한 증상은 B. 부르그도르페리 (B. burgdorferi) s.s과의 감염에 의해 유발되는 류마티스 관절염이다. B. 가리니(B. garinii)에 의한 중추신경계의 지속적인 감염은 단계 3동안에 보다 중증의 신경학적 증상을 유발하고 B. 아프젤리(B. afzelii)에 의한 피부의 지속적인 감염은 만성위축성 선단 피부염을 유발한다.

농부, 임학 작업자, 도보여행자, 주자 또는 휴가자들과 같은 일부 위험 그룹에서, 혈청학적 유병률 및 질환 발병률은 증가하였고, 또한 성별 상관 없이 15세 미만의 어린이 및 39세와 59세 사이의 성인에서 증가하였다. 라임 보렐리아증의 이러한 증가된 발병은 숲 서식지 및 사회적 인자의 변화와 관련된다. 산림 세분화와 같은 환경적 변화는 여우 및 맹금과 같은 설치류 포식자를 상당히 감소시키고 이는 이어서 마우스 집단을 증가시키고 후속적으로 진드기 집단을 증가시킨다. 보다 최근에는, 산발적 조림산업은 사슴의 수와 이어서 진드기의 수를 증가시켰다. 캠핑 및 하이킹과 같은 교외 외곽 지역 및 삼림지대의 증가하는 사용은 인간이 대다수의 진드기 보렐리아 매개체와 보다 크게 접촉되게 하였다. 모든 이들 인자들은 함께 보렐리아의 광범위한 분포 및 라임 보렐리아증의 보다 큰 발병에 기여했다.

항미생물 제제는 원칙적인 보렐리아 감염의 치료 방법이다. 사용되는 항생제는 의약치료에 대한 질환, 증상 및 환자의 알레르기의 단계에 의존한다. 항생제 치료과정의 기간은 또한 질환 단계 및 증상의 중증도에 의존한다. 조기 라임 보렐리아증은 전형적으로 독시사이클린과 같은 경구 테트라사이클린, 및 아목실린 또는 페니실린 V와 같은 반합성 페니실린으로 치료된다. 관절 및 신경학적 장애는 고용량의 정맥내 페니실린 G 또는 세프트리악손으로 치료된다. 30% 이하의 라임 보렐리아증 환자는 보렐리아와의 감염의 조기 특징적인 증상을 나타내지 않아 진단 및 치료가 문제가 되게 한다. 상기 항생제 치료과정은 길 수 있고(수개월까지) 때로는 비효과적이고 따라서 특히 후기 단계 질환 동안에 보렐리아 분야에서 논란이 되고 있다. 보렐리아의 효과적인 치료 경우에서도, 환자들은 이후 수년동안 쇠약하게하는 피로도, 통증 또는 신경학적 증상이 남을 수 있고 이는 치료후 라임병 증후군으로 언급된다. 일반적으로, 항생제의 사용은 표적 미생물에 의한 내성 발달과 같은 바람직하지 못한 결과를 가질 수 있다. 최종적으로, 항생제 치료요법은 라임 보렐리아증을 효과적으로 치유할 수 있지만 후속적 감염에 대한 보호를 제공하지 못한다.

1가 혈청형 1-OspA-기반 백신 (LYMErix^TM)은 승인되었고 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi ) s.s에 의해 유발되는 라임병의 예방을 위해 미국에서 시판되고 있지만 상기 백신은 더 이상 가용하지 않다. 추가로, 유럽 및 그밖의 지역에서 상이한 혈청형 전반에 걸친 OspA 서열의 이종성은 단지 단일혈청형 기원의 OspA를 기반으로 하는 백신을 사용한 효율적인 보호를 불가능하게 한다.

또 다른 OspA 혈청형 기원의 원거리 부분과 함께 하나의 OspA 혈청형 기원의 인접한 부분을 포함하는 키메라 OspA 분자는 모 폴리펩타이드 둘 모두의 항원성 성질을 보유하지만 라임병 또는 보렐리아증의 예방 및 치료에 사용될 수 있다(WO2011/143617, WO2011/143623).

현재, 시장에는 라임 보렐리아증에 대한 예방적 의학치료는 없고 따라서 미국, 유럽 및 그밖에 지역에 존재하는 보렐리아에 대한 효과적인 보호를 제공할 수 있는 상기 의약치료의 개발, 특히, 수개의 보렐리아 혈청형에 대해 동시에 효과적인 보호를 제공할 수 있는 의약치료의 개발이 당업계에서 요구된다. 본 발명의 혈청형 3 OspA-함유 이종이량체인 Lip-S4D1-S3hybD1은 혈청형 3 보렐리아 스피로헤타에 결합하는 항체 표면에 의해 측정된 바와 같이 특이적 항체의 생산 및 자극의 둘 모두의 용이함과 관련하여 본 발명자의 이전에 기재된 이종이량체인 Lip-S4D1-S3D1(WO2014/006226 참조)을 개선시킨다. 추가로, 새로운 이종이량체에 대한 면역 반응의 보다 특이적 품질은 효능이 또한 이전에 기재된 이종이량체와 비교하여 우수함을 지적한다.

발명의 요약

본 발명은 보렐리아 외부 표면 단백질 A (OspA)의 하이브리드 단편을 포함하는 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 핵산, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 생산하는 방법 및 상기 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 더욱이, 본 발명은 상기 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포, 상기 항체를 생산하기 위한 방법, 상기 폴리펩타이드, 핵산 분자, 벡터 또는 항체를 포함하는 약제학적 조성물, 약물 또는 약제학적 조성물의 제조를 위한 상기 폴리펩타이드, 핵산 분자, 벡터 또는 항체의 용도(특히, 백신으로서 사용하기 위해 또는 보렐리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법에서), 감염을 진단하기 위한 방법 및 보렐리아 감염을 치료하거나 예방하기 위한 방법 및 대상체를 면역화시키는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 본 발명자의 이전의 출원 WO2014/006226에서 기재된 혈청형 3 OspA 함유 작제물과 비교하는 경우 보렐리아에 결합하는 표면에 의해 평가된 바와 같이 상기 폴리펩타이드가 정제를 위해 보다 바람직하고 보렐리아에 대한 보다 특이적 면역 반응을 유도한다는 점에서 혈청형 3 보렐리아에 대한 면역화를 위해 개선된 폴리펩타이드에 관한 것이다.

라임 보렐리아증의 예방을 위한 서브유니트 백신을 개발하기 위한 노력은 대부분 항원으로서 보렐리아 외부표면 단백질 A(OspA)의 용도에 집중되어 있다. 상기 OspA 단백질은 단지 이것이 진드기 매개체의 소화관에 있는 경우에만 보렐리아에 의해 발현된다. 따라서, 백신 접종에 의해 생산되는 OspA 항체는 신체에서 감염을 퇴치하지 못하지만 이것이 혈액 식사로 복용되는 경우 진드기의 소화관에 진입한다. 거기에서, 상기 항체는 스피로헤타를 중화시키고 중장으로부터, 보렐리아가 척추동물 숙주가 진입하는 경로인 진드기의 침샘으로의 세균 이동을 차단한다. 따라서, OspA-특이적 항체는 진드기 매개체로부터 인간 숙주에게 보렐리아의 전염을 차단한다.

수산화알루미늄과 함께, B. 부르그도르페리 (B. burgdorferi ) s.s., 균주 ZS7 기원의 OspA의 지질화된 형태는 제조원(SmithKline Beecham)에 의해 미국 시장에 대해 현재 GlaxoSmithKline(GSK)인, 보렐리아에 대한 백신(LYMErixTM)으로서 상업적으로 개발되었다. 1년 기간 동안 LYMErixTM의 3회 투여는 최적의 보호를 위해 요구되었다. 처음 2회 투여 후, 라임 보렐리아증에 대한 백신 효능은 49%였고, 3회 투여 후에는 76%였다. 그러나, LYMErixTM가 시판된 직후, 이것은 2002년에 시장으로부터 퇴출되었다. 그 이유는 백신의 현실적 적용 문제점, 예를 들어, 조기 감염의 항생제 치료와 비교하여 상기 예방적 방법의 비교적 높은 비용 뿐만 아니라 매년 또는 격년으로 부스터 주사에 대한 필요성 때문이다. 추가로, LYMErixTM이 인간 단백질과 서열 상동성으로 인해 집단의 서브그룹에서 자가면역 반응을 유발할 수 있다는 우려가 있었지만 이것은 결코 입증되지 않았다. 추가로, 다른 임상적으로 중요한 보렐리아 종에 대한 교차 보호는 상기 백신에 의해제공되지 않았다.

따라서, 하나의 양태에서, 본 발명의 목적은 예를 들어, 라임 보렐리아증의 예방을 위해 개선된 백신을 제공하는 것이다. 바람직하게, 기존의 치료요법 보다 더 보호적이고 안전하고 보다 효과적인 상기 백신이 용이하게제조되고/되거나 하나 이상의 보렐리아 종에 대한 보호를 제공한다. 추가로, 상이한 환자들이 상이한 백신 조성에 대해 상이하게 반응한다는 것은 당업계에 널리 공지되어 있다. 따라서, 임의의 경우에, 보렐리아에 대한 백신접종을 위한 추가의 옵션으로서 가용한 대안적 백신을 갖는 것이 두드러진 이점이 될 것이다.

본 발명의 바탕이 되는 문제점은 하이브리드 C-말단 OspA 단편을 포함하는 폴리펩타이드에 의해해결되고, 상기 하이브리드 단편은 B. 가리니(B. garinii ), 균주 PBr과는 상이한 보렐리아 균주의 OspA 단백질로부터 유래된 단편 및 B. 가리니(B. garinii ), 균주 PBr 기원의 OspA의 제2 단편으로 구성되고 적어도 하나의 디설파이드 결합의 도입에 의해 상응하는 야생형 서열과는 상이한 보렐리아의 OspA 단백질의 C-말단 도메인으로 이루어진다.

놀랍게도, 디설파이드 결합이 도입된 혈청형 3 OspA (B. 가리니(B. garinii), 균주 PBr) 기원의 서열과 융합된 비(B. 발라이시아나 ( valaisiana ), 균주 VS116 기원의 서열을 포함하는 상기 하이브리드 C-말단 OspA 단편의 도입은 정제하기가 보다 용이해지고 본 발명자의 이전의 발명 (WO2014/006226)의 이종이량체 Lip-S4D1-S3D1 보다 혈청형 3 OspA에 대한 보다 특이적 면역 반응을 자극했던 이종이량체 단백질(Lip-S4D1-S3hybD1)을 유도하였다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 혈청형 3 하이브리드 OspA C-말단 단편은 혈청형 3 OspA 단편 보다 다른 혈청형 기원의 다른 OspA 단편들과 보다 유사한 예측된 정전기 전위 수준을 갖는다. 추가로, 혈청형 3 하이브리드 OspA C-말단 단편-함유 이종이량체 (Lip-S4D1-S3hybD1)는 정제하기가 보다 용이하여 선행 기술의 Lip-S4D1-S3D1 이종이량체 보다 보다 높은 수율을 수득하기 위해 적은 단계를 요구한다. 추가로, 상기 관찰된 항체 역가는 유사하였지만, 개선된 이종이량체 조합 백신에 의해 자극된 항체가 선행 기술의 이종이량체 조합 백신과 비교하여, 혈청형 3 OspA를 발현하는 보렐리아에 보다 특이적으로 결합하였다. 최종적으로, 개선된 이종이량체 조합 백신의 생체내 보호 능력은 시험된 4개의 보렐리아 혈청형에 대해 높았다.

발명의 상세한 설명

따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 외부 표면 단백질 A(OspA)의 하이브리드 C-말단 단편을 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이고, 상기 하이브리드 C-말단 OspA 단편은 보렐리아 균주들의 2개의 상이한 OspA의 C-말단 도메인 융합으로 이루어지고 적어도 하나의 디설파이드 결합, 예를 들어, 시스틴의 도입으로 적어도 상응하는 야생형 단편과 상이하다. 특히, 상기 하이브리드 C-말단 OspA 단편은 B. 가리니, 균주 PBr과는 상이한 균주 기원의 OspA 단백질로부터의 아미노산의 융합으로 이루어지고, 예를 들어, 상기 상이한 균주는 비. 발라이시아나, 균주 VS116, 또는 B. 스피엘마니이고; 아미노산은 B. 가리니, 균주 PBr의 OspA 단백질로부터 기원하고, 적어도 하나의 디설파이드 결합(시스틴)이 도입되어 있다. 구체적으로, 폴리펩타이드는 하이브리드 C-말단 OspA(보렐리아의 외부 표면 단백질 A) 단편을 포함하고, 상기 하이브리드 C-말단 OspA 단편은 N-에서 C-말단 방향으로 i) 서열번호: 8을 갖는 B. 가리니(B. garinii ), 균주 PBr의 상응하는 단편이 아닌 보렐리아 균주 기원의 OspA의 아미노산 125번 내지 176번 또는 아미노산 126번 내지 175번으로 이루어진 제1 OspA 부분: 및 ii) B. 가리니, 균주 PBr 기원의 OspA (서열번호: 8)의 아미노산 177번 내지 274번 또는 아미노산 176번 내지 274번(그러나 가장 바람직하게는 아미노산 177번 내지 274번)으로 이루어진 제2 OspA 부분으로 이루어지고 상기 제2 OspA 부분은 돌연변이체이고 이것이 서열번호: 8의 위치 182번에서 야생형 아미노산의 시스테인에 의한 치환 및 시스테인에 의해 치환되고 서열번호: 8의 위치 269번에서 야생형 아미노산이 시스테인에 의해 치환되어 상응하는 야생형 서열과 상이하다는 점에서 시스틴 안정화되어 있고 상기 제2 OspA 단편의 182번 위치에서의 시스테인과 269번 위치에서의 시스테인 간의 디설파이드 결합이 존재하고; 아미노산 및 시스테인 치환의 넘버링은 B. 부르그도르페리 s.s., 균주 B31 (서열번호: 5)의 넘버링에 따르는 제2 C-말단 OspA 단편을 추가로 포함한다.

대안적으로, 폴리펩타이드는 하이브리드 C-말단 OspA 단편을 포함하고, 상기 하이브리드 C-말단 OspA 단편은 N-에서 C-말단 방향으로,

i) 서열번호: 8을 갖는 B. 가리니, 균주 PBr의 상응하는 단편이 아닌 보렐리아 균주 기원의 OspA의 아미노산 125번 내지 176번 또는 아미노산 126번 내지 175번으로 이루어진 제1 OspA 단편(또한 제1 OspA 부분으로 언급됨), 및

ii) B. 가리니, 균주 PBr 기원의 OspA (서열번호: 8)의 아미노산 177번 내지 274번으로 이루어진 제2 OspA 단편(또한 제2 OspA 부분으로서 언급됨), 상기 제2 OspA 단편은 서열번호: 8의 위치 182번에서 시스테인에 의한 야생형 아미노산의 치환 및 시스테인에 의해 치환되고 서열번호: 8의 위치 269번에서 야생형 아미노산이 시스테인에 의해 치환되어 상응하는 야생형 서열과 상이하다는 점에서 시스틴 안정화되어 있고 상기 제2 OspA 단편의 위치 182번에서 시스테인과 위치 269번에서 시스테인 간의 디설파이드 결합이 존재하고;

상기 시스테인 치환의 넘버링은 B. 부르그도르페리 s.s., 균주 B31 (서열번호: 5)의 넘버링에 따르는 제2 C-말단 OspA 단편을 추가로 포함한다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 용이하게 및 효과적으로 생산될 수 있는 것으로 밝혀졌다 (실시예 2 참조). 이의 생산은 공지된 생성물과 비교하여 증가된 수율을 유도하였다(실시예 2 참조). 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 사용한 면역화는 이의 천연 형태의 OspA 단백질에 특이적인 보다높은 수준의 항체를 생산하였고 따라서 개선된 백신이다(실시예 3 참조). 더욱이, 이것은 생체내 보렐리아 챌린지에 대한 보호를 제공하였다 (실시예 4 참조).

보렐리아는 스피로헤타 필럼(spirochete phylum)의 세균 속이다. 이것은 종에 따라 주로 진드기에 의해서 및 일부는 이에 의해 전염되는 동물 매개 감염 질환인 보렐리아증을 유발한다. 현재에, 36개의 공지된 보렐리아 종이 있다. 36개 공지된 보렐리아 종 중에서, 이들 종 중 13개는 라임병 또는 보렐리아증을 유도하는 것으로 공지되어 있고 진드기에 의해 전염된다. 라임병을 유발하는 주요 보렐리아 종은 보렐리아 부르그도르페리, 보렐리아 아프젤리, 및 보렐리아 가리니이다. 용어 B. 부르그도르페리 s.l.은 적어도 13개의 보렐리아 종을 포함한다(표 A-1). 이들 종은 상이한 지정학적 지역에 존재하고 이속데스 리시누스 ( Ixodes ricinus ) 복합체 (또한 이속데스 퍼술카투스 ( Ixodes persulcatus ) 복합체로 호칭된다)의 진드기 및 광범위한 동물 숙주를 포함하는 동물감염 매개 사이클에서 자연에서 생존한다. 4개의 보렐리아 종은 인간에서 주요 감염에 관여한다: B. 부르그도르페리 s.s., B. 아프젤리, B. 바바리엔시스 및 B. 가리니의 혈청형 지정 및 출현율. 3개의 다른 종, B. 루시타니애 (B lusitaniae ), B. 비세티 (B. bissettii ) 및 B. 스피엘마니(B. spielmanii)는 때로는 인간에서 검출되었지만 라임 보렐리아증에서의 이들의 역할은 현재 불확실하다. 보렐리아의 새로운 종은 여전히 동정되고 있다.

[표 A-1]

상기 상세하게 기재된 바와 같이, 보렐리아 외부 표면 단백질 A (OspA)는 백신 후보물로서 이의 잠재력 때문에 특정 관심 대상인 보렐리아의 풍부한 면역원성 지질단백질이다. B. 부르그도르페리 (B. burgdorferi ) s.l.의 OspA는 대략 30kDa의 분자량을 갖고 선형 플라스미드상에 암호화된 염기성 지질단백질이다. OspA 단백질의 중요한 측면은 이의 N-말단 지질화이고; 즉, 이중 결합의 존재 또는 부재하에 C₁₄ 내지 C₁₉의 쇄 길이를 갖는 지방산이 N-말단 시스테인 잔기에 부착되어 있고, 이는 OspA 단백질의 면역원성을 증진시키는 특징이다. 불량하게 면역원성인 합성 펩타이드가 지질화되는 경우, 예를 들어, 지질 부착을 특정하는 신호 서열과 함께 합성되는 많은 세균 지질단백질의 아미노 말단에서 발견되는 지방산 치환인 Pam₃Cys에 공유적으로 커플링되는 경우 보다 강한 항체 반응을 유도하는 것으로 나타났다(문헌참조: Bessler and Jung, Research Immunology (1992) 143:548-552). 추가로, Pam₃Cys 잔기는 부분적으로 TLR-2/1과의 상호작용을 통해 마우스에서 OspA에 대한 면역 반응을 증진시키는 것으로 나타났다 (문헌참조: Yoder, 등 (2003) Infection and Immunity 71:3894-3900). 따라서, OspA의 C-말단 단편의 지질화는 단편의 면역원성 및 보호 능력을 증진시킬 것으로 예상된다.

북아메리카와 유럽에서 수득된 B. 부르그도르페리 s.l.의 분리물의 분석은 OspA가 항원 가변성을 갖고 여러 특징적인 그룹들이 혈청학을 기준으로 한정될 수 있음을 밝혔다. 특이적 N- 및 C-말단 항원 결정인자에 결합하는 항-OspA mAb는 보고되었다. X-선 결정학 및 NMR 분석은 OspA에서 면역학적으로 중요한 초가변 도메인을 동정하기 위해 사용되어 왔고 C-말단 아미노산 203 내지 257에 대한 LA-2 에피토프를 맵핑하였다 (문헌참조: Ding 등, Mol. Biol. 302: 1153-64, 2000). 이전의 연구는 C-말단 에피토프 LA-2에 대한 항체의 생성이 OspA의 백신 접종 후 보호 면역과 상호관련이 있음을 보여주었다(문헌참조: Van Hoecke 등 Vaccine (1996) 14(17-18):1620-6 및 Steere 등, N Engl J Med (1998) 339:209-215). LA-2에 대한 항체는 진드기로부터 숙주로의 보렐리아의 전파를 차단하는 것으로 나타났다(문헌참조: Golde 등 Infect Immun (1997) 65(3):882-889). 이들 연구는 OspA 단백질의 C-말단 부분이 보호 면역을 유도하기 위해 충분할 수 있음을 시사했다. OspA의 C-말단 부분의 서열이 N-말단 부분 보다 보렐리아 혈청형간에 고도의 보존성이 적음을 주지해야 한다 (참조: 도 1)로부터 기원하는 시스틴 안정화된 아미노산 177 내지 274번으로 이루어진 폴리펩타이드.

다른 것들과 함께 상기 명시된 연구로부터의 정보를 기초로, C-말단 부분을 포함하는 절단된 형태의 OspA(또한 본원에서 "OspA 단편" 또는 "단량체"로서 언급됨)는 선행 발명 (WO2014/006226)에서 사용되었다. 절단된 형태의 OspA는 전장의 OspA 단백질 보다 덜 보호적인 것으로 입증되었다. 그러나 놀랍게도, 선행 발명의 연구 과정에서 절단된 형태로 디설파이드 결합의 도입(또한 본원에서 "돌연변이 OspA 단편", "시스틴-안정화된 OspA 단편" 또는 "돌연변이체 단편" 또는 "시스틴 안정화된 단편"으로서 언급됨)이 상기 단점을 해결하는 것으로 밝혀졌다. 특정 기작으로 제한되는 것 없이, 개선된 보호가 열 안정성을 측정하는 분석에서 보여지는 바와 같이 OspA 단편의 증가된 안정성 때문인 것으로 사료된다.

선행 발명에 따라, 돌연변이체 OspA 단편 (본 발명에서 또한 제2 OspA 단편으로서 언급됨)은 임의의 보렐리아 종으로부터 유래할 수 있고; 그러나, 의학 분야, 특히 인간에 대한 이들의 만연성으로 인해, B. 부르그도르페리 s.s., B.아프젤리, B. 바바리엔시스 및 B. 가리니가 바람직하다. 본 발명에 따르면, 제1 OspA 부분은 B. 가리니, 균주 PBr를 제외한 임의의 보렐리아 균주로부터 기원하고 제2 부분은 B. 가리니, 균주 PBr로부터 기원한다. 따라서, 하이브리드 OspA 단편은 B. 가리니, 균주 PBr의 OspA 기원의 아미노산의 융합으로부터 유래하고 아미노산은 B. 가리니, 균주 PBr을 제외한 임의의 보렐리아 종 기원의 OspA (따라서, 아미노산 서열은 B. 가리니, 균주 PBr 기원의 OspA로부터의 아미노산과는 상이하다), 특히, B. 부르그도르페리 s.s., B. 아프젤리, 및 B. 바바리엔시스, 특히 B. 발라이시아나, 균주 VS116 기원의 OspA로부터 유래한다. 제1 OspA 부분은 서열번호: 8을 갖는 B. 가리니, 균주 PBr의 상응하는 단편이 아닌, 보렐리아 기원의 OspA의 아미노산 125번 내지 176번 또는 아미노산 126번 내지 175번으로 이루어지고 제2 OspA 부분은 B. 가리니, 균주 PBr 기원의 OspA (서열번호: 8)의 아미노산 176번 내지 274번 또는 가장 바람직하게는 아미노산 177번 내지 274번으로 이루어지고, 상기 제2 OspA 부분은 돌연변이체이고 이것이 서열번호: 8의 위치 182번에서 야생형 아미노산의 시스테인에 의한 치환 및 시스테인에 의해 치환되고 서열번호: 8의 위치 269번에서 야생형 아미노산이 시스테인에 의해 치환되어 상응하는 야생형 서열과 상이하다는 점에서 시스틴 안정화되어 있고 상기 제2 OspA 단편의 182번 위치에서의 시스테인과 269번 위치에서의 시스테인 간의 디설파이드 결합이 존재하고; 아미노산 및 시스테인 치환의 넘버링은 B. 부르그도르페리 s.s., 균주 B31 (서열번호: 5)의 넘버링에 따르는 제2 C-말단 OspA 단편을 추가로 포함한다. 그러나, 야생형 부분에 상대적인 추가의 돌연변이는 본 발명에 따른 제1 및 제2 부분에 존재할 수 있다(또한 하기를 참조한다). 바람직한 양태에서, 182번 및 269번 위치에서 시스테인에 의한 상기 치환은 야생형에 비해 유일한 돌연변이이다. 대안적으로, 보렐리아 가리니, 균주 PBr 기원의 상기 시스테인-안정화된 아미노산 177번 내지 274번은 보렐리아 가리니, 균주 PBr의 야생형 OspA의 아미노산 233번에서 트레오닌 잔기가 유일하게 프롤린 잔기로 치환되어 있다는 점에서 상이하다.

폴리펩타이드의 바람직한 예는 하기를 포함한다:

- B. 발라이시아나, 균주 VS116 기원의 아미노산 125번 내지 176번 및 보렐리아 가리니, 균주 PBr (서열번호: 1) 기원의 시스틴 안정화된 아미노산 177번 내지 274번으로 이루어진 하이브리드 C-말단 OspA 단편, 또는

- B. 스피엘마니 기원의 아미노산 126번 내지 175번 및 보렐리아 가리니, 균주 PBr (서열번호: 51) 기원의 결정 안정화된 아미노산 177번 내지 274번으로 이루어진 하이브리드 C-말단 OspA 단편.

따라서, 본 발명의 바람직한 양태에서, 폴리펩타이드는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 대안적으로, 폴리펩타이드는 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.

본 발명의 하나의 양태에서, 제2 OspA 부분은 보렐리아 가리니, 균주 PBr 기원의 시스틴 안정화된 아미노산 177번 내지 274번과 동일하지만, 보렐리아 가리니, 균주 PBr의 야생형 OspA의 아미노산 223번에서 트레오닌 잔기가 프롤린 잔기(서열번호: 7)로 치환되어 있다는 점에서 상이하다.

4개의 보렐리아 종 B. 부르도르페리 s.s., B. 아프젤리, B. 바바리엔시스 및 B. 가리니는 각각의 OspA 단백질에 특이적인 모노클로날 항체를 사용한 분석에 의해 측정된 이들의 OspA 혈청형에 따라 추가로 분류될 수 있다. 인간 보렐리아 감염의 대부분을 차지하는 혈청형 1-7은 하기 표 A-2에 나타낸다.

표 A-2. B. 부르도르페리 s.s., B. 아프젤리, B. 바바리엔시스 및 B. 가리니의 혈청형 지정 및 출현율. 인간 뇌척수액 또는 피부 또는 진드기 매개체로부터 분리된 보렐리아는 각각 OspA의 특정 에피토프에 특이적인 마우스 모노클로날 항체를 사용하여 전세포 용해물을 탐침함에 의해 혈청 분류하였다 (문헌: Wilske 등, J. of Clin Microbiol (1993) 31(2):340-350 and presented by Baxter Bioscience at "Climate change effect on ticks and tick-borne diseases", Brussels, 06 Feb 2009)에 기재된 바와 같음.

B. 부르그도르페리 s.s. 균주 B31 기원의 OspA 단백질의 구조는 리(Li) 등 에 의해 결정되었다 (문헌참조: Proc Natl Acad Sci (1997) 94:3584-3589). 이는 N-말단 (α-쇄 1 내지 4) 및 중앙 β-쉬트 (α-쇄 5 내지 14n [N-말단부]), 배럴 쉬트 1 (α-쇄 14c [C-말단부] 내지 16), 배럴 쉬트 2 (α-쇄 17 내지 21) 및 C-말단 α-나선구조로 이루어진다. 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 바와 같은 OspA와 관련된 용어 "C-말단 OspA 단편" 또는 "OspA C-말단 도메인" 또는 "C-말단 도메인" 또는 "야생형 단편" 또는 "C-말단 부분"은 OspA, 즉 적어도 N-말단 β-쉬트 (α-쇄 1 내지 4를 포함하는)가 없는 OspA의 C-말단 아미노산 서열을 의미한다. B. 부르그도르페리 s.s. 균주 B31 기원의 OspA에서, N-말단 쉬트는 아미노산 17번 내지 70번(16개 아미노산 길이의 지질화 신호 펩타이드의 해독후 절단에 이어서)으로 이루어진다.

본 발명의 C-말단 OspA 단편은 또한 N-말단에서 지질화 신호 서열을 포함할 수 있고, 예를 들어, OspA(서열번호: 13) 또는 OspB (서열번호: 14)의 아미노산 1번 내지 16번의 지질화 신호 서열이고 이는 B. 부르그도르페리 s.s. 균주 B31로부터 기원하고, "lpp 지질화 신호"(서열번호: 15)로서 본원에서 언급되는 이. 콜리 기원의 지질화 신호 서열, 또는 예를 들어, 하기 정의된 바와 같은 임의의 다른 신호 서열이다.

순수 OspA 폴리펩타이드 상에 존재하는 것들과 같은 N-말단 지질화 신호 서열을 사용한 단백질의 지질화는 각각 효소 디아실글리세릴 트랜스퍼라제, 신호 펩티다제 II 및 트랜스아실라제의 단계적 작용에 의해 이. 콜라이 발현 벡터에 존재한다. 제1 단계는 디아실글리세라이드를 변형되지 않은 프로지질단백질의 시스테인 설프하이드릴 그룹으로의 전달에 이어서 신호 펩티다제 II에 의한 신호 펩타이드의 절단 및 최종적으로 아포지질단백질의 N-말단 시스테인의 아미노 그룹의 아실화이다. 상기 결과는 하나의 지질 및 글리세롤 그룹이 폴리펩타이드의 N-말단 시스테인 잔기상에 부착된 2개의 추가의 지질로 대체된 것이다. 지질화 신호 서열은 지질화 동안에 절단 제거되어 최종 폴리펩타이드 서열에는 존재하지 않는다.

폴리펩타이드는 펩타이드(아미드) 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체 쇄의 생물학적 분자이다. 공유 화학적 결합은 하나의 아미노산의 카복실 그룹이 또 다른 아미노 그룹과 반응하는 경우 형성된다. 본 발명의 폴리펩타이드는 연속적이고 비측쇄화된 아미노산 쇄이다. 본 발명의 폴리펩타이드는 시스틴 결합을 포함한다. 본 발명에 따라, 돌연변이체 OspA 단편은 지질화된 단백질, 또한 지질단백질일 수 있고, 여기서, 글리세롤 그룹과 함께 지질 잔기는 또한 "Lip"로서 언급된다. 본 발명에 따라, Lip는 본 발명의 폴리펩타이드의 N-말단 시스테인의 글리세롤 및 아미노 그룹에 부착된 C_14-20 알킬 및/또는 C_14-20 알케닐과 같은 1개 내지 3개의 지질을 포함하거나, 바람직하게, Lip는 하기 화학식 I의 잔기이다.

식 (I),

식 중, R₁, R₂ 또는 R₃ 중 하나는 C₁₄-C₂₀ 알킬 또는 알케닐이고, 다른 것들의 각각은 독립적으로 C₁₄-C₂₀ 알킬 또는 C₁₄-C₂₀ 알케닐이고, X는 화학식 I에 나타낸 시스테인 잔기에 부착된 아미노산 서열이다. 보다 바람직하게, Lip 및 폴리펩타이드의 N-말단 시스테인은 N-팔미토일-S-(2RS)-2,3-비스-(팔미토일옥시) 프로필 시스테인 (본원에서 "Pam₃Cys"로서 언급됨)이고 시스테인의 카보닐 C를 통해 본 발명의 상기 아미노산 서열에 연결되어 있다. 상기 화학식 I에서, R₁, R₂ 및 R₃은 팔미토일 잔기이고 X는 시스테인 잔기에 부착된 아미노산 서열이다.

본 발명에 따라 OspA의 C-말단 도메인은 적어도 B. 부르그도르페리 s.s., 균주 B31 기원의 OspA의 아미노산 17번 내지 70번에 상동성인 N-말단 도메인이 부재일 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 OspA C-말단 도메인은 또한 리 및 공동 연구자(Li 외, 앞에)에 의해 정의된 바와 같은 중앙 쉬트의 추가의 부분, 특히, 임의의 보렐리아, 특히 B. 부르그도르페리 s.s., 균주 B31의 아미노산 17번 내지 82번, 93번, 105번, 118번 또는 119번, 바람직하게는 17번 내지 129번, 보다 바람직하게는 1번 내지 124번, 1번 내지 125번, 1번 내지 129번 또는 1번 내지 130번 기원의 아미노산 부분과 같은 추가의 가닥 또는 B. 부르그도르페리 s.s., 균주 B31 이외의 보렐리아 종 기원의 OspA 단백질의 상동성 부분이 부재일 수 있다.

본 발명과 관련하여, OspA C-말단 도메인은 또한 "OspA 단편" 또는 "OspA의 단편"으로서 언급된다.

본 발명의 폴리펩타이드와 관련되고 본원 명세서 전반에 걸쳐 사용된 바와 같은 "돌연변이체 C-말단 OspA 단편" 또는 "돌연변이체 단편" 또는 "돌연변이체 OspA 단편"은 적어도 디설파이드 결합, 즉 시스틴을 형성할 수 있는 적어도 2개의 시스테인이 도입되어 야생형 단편과는 상이한 상기된 바와 같은 본원의 OspA C-말단 단편을 의미한다. 상기 이론에 국한되는 것 없이, 상기 디설파이드 결합은 항체 결합을 유도하는 형태로 상기 단편을 안정화시키는 것으로 추정된다. OspA의 야생형 C-말단 단편의 폴딩은 전장 단백질과 비교하여 감소된 온도 안정성을 보여준다 (문헌참조: Koide 등, Structure-based Design of a Second-generation Lyme Disease Vaccine Based on a C-terminal Fragment of Borrelia burgdorferi OspA, J. Mol. Biol. (2005) 350:290-299). 본 발명에 대해, B. 부르그도르페리 s.s., 균주 B31 OspA의 C-말단 도메인의 서열은 상기 C-말단 도메인의 폴딩의 안정성을 증진시킬 수 있는 도입된 디설파이드 브릿지에 대한 위치를 결정하기 위해 인실리코 분석하였다. 상기 분석 결과는 상기 폴딩이 종을 거쳐 보존된다는 추정과 함께 다른 보렐리아 종의 상동성 OspA 단편에 적용되었다.

본 발명의 폴리펩타이드와 관련하여 본원 전반에 걸쳐 사용된 바와 같은 "하이브리드 C-말단 OspA 단편" 또는 "하이브리드 단편" 또는 "하이브리드 OspA 단편"은 하기의 관점에서 야생형 단편과 상이한 상기 및 본원에 정의된 바와 같은 OspA C 말단 단편을 의미한다:

a) 하이브리드 C-말단 OspA 단편은 B. 가리니, 균주 PBr과 상이한 균주, 예를 들어, B. 발라이시아나, 균주 VS116, 또는 B. 스피엘마니 기원의 제1 OspA 단백질(제1 OspA 부분으로서 언급됨)로부터의 아미노산과 B. 가리니, 균주 PBr의 제2 OspA 단백질로부터의 아미노산의 융합으로 이루어지고, 적어도 하나의 디설파이드 결합(시스틴)(제2 OspA 부분으로서 언급됨) 및 임의의 하나 이상의 추가의 돌연변이가 도입되어 있고;

b) 하이브리드 C-말단 OspA 단편에서 적어도 2개의 도입된 시스테인은 디설파이드 결합, 즉 시스틴을 형성하고, 상기 도입된 시스테인은 본원에 기재된 바와 같고 WO2014/006226의 교시에 따라 도입되고;

상기 하이브리드 C-말단 OspA 단편은 예를 들어, 마우스에서 보렐리아 혈청형 3 항원에 대한상기 하이브리드 C-말단 OspA 단편에 의한 백신 접종으로부터 비롯된 항체의 결합 효능에 의한 측정시, 예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 유동 세포측정기에 의해 상기 항체(3회 면역화 후 수득된)의 혈청형 3 보렐리아 표면으로의 결합을 시험함에 의해 천연적으로 폴딩된 단편을 유도한다.

전형적으로 상기 디설파이드 결합은 하나 이상, 바람직하게 2개의 시스테인 잔기의 도입에 의해도입될 수 있고, 여기서, 디설파이드 결합(S-S 브릿지)은 아미노산 시스틴을 형성하는 2개의 시스테인 잔기의 티올 그룹 간에 형성된다. 단지 하나의 시스테인 잔기는 디설파이드 결합이 야생형 OspA 단편에 존재하는 시스테인 잔기와함께 형성되는 경우 도입될 필요가 있다. 2개의 시스테인은 아미노산 치환에 의해 도입된다. 치환은 a) 관련 야생형 OspA 아미노산 서열의 아미노산의 182번 위치에서 시스테인에 의한 치환 및 b) 관련 야생형 OspA 아미노산 서열의 아미노산의 위치 269번에서 시스테인에 의한 치환이고, 여기서, 위치 182번에서 시스테인과 상기 OspA 단편의 위치 269번 위치에서 시스테인 간의 디설파이드 결합이 존재하여 시스틴을 형성한다. 시스테인 치환의 넘버링은 B. 부르그도르페리 s.s., 균주 B31 (서열번호: 5)의 넘버링에 따르는 제2 C-말단 OspA 단편을 추가로 포함한다.

돌연변이체 또는 하이브리드 OspA 단편은 또한 야생형에 비해 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다. 상기 상세히 기재된 바와 같이, OspA의 구조 및 표면 도메인은 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 돌연변이체 단편은 추가의 돌연변이, 특히 단백질의 표면상에 있지 않고/않거나 면역 반응에서 관여하지 않고 따라서 항원 용량에 영향을 주지 않는 부위에서의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이들은 하나 이상의 아미노산 결실(들), 특히, 소형(예를 들어 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 아미노산) 결실, 하나 이상의 아미노산 결실(들)(특히 C- 또는 N-말단), 하나 이상의 아미노산 치환(들), 특히, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환들을 포함할 수 있다. 바람직하게, 각각의 야생형에 비해 제1 및 제2 부분에서의 추가의 돌연변이 수는 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4개, 보다 바람직하게는 3 또는 2개, 특히 1개이다. 보다 바람직하게, 추가의 돌연변이(들)은 단지 제2 OspA 부분에 있다. 바람직한 돌연변이는 치환들, 특히, 보존성 치환들이다. 보존성 아미노산 치환들의 예는 하기 열거된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:

바람직한 돌연변이는 단편의 선택된 부분에서의 변화를 포함하고, 예를 들어, 여기서, B. 부르그도르페리 s.s.에 존재하는 인간 백혈구 기능 연관된 항원(hLFA-1)과 서열 유사성을 갖는 서열은 변형되고, 예를 들어, 또 다른 보렐리아종 기원의 OspA 단백질로부터의 상동성 서열에 의해 대체된다. 상기 변형의 근본적인 이유는 인간 단백질과의 면역학적 교차 반응을 유도하기 위한 위험을 감소시키는 것이다. 또 다른 바람직한 돌연변이는 B. 가리니, 균주 PBr (서열번호: 8)로부터 OspA 폴리펩타이드 서열에서 위치 233에서 트레오닌에 대한 프롤린의 치환이다. 또한, 마커 단백질의 최종, 또는 중간체, 단편 또는 첨가에서 지질화를 위한 신호 서열의 첨가 (예를 들어, 동정 또는 정제를 위해)가 가능하다.

일부 양태에서, 돌연변이체 또는 하이브리드 OspA 단편은 야생형 단편에 대한 60%, 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 더 바람직하게 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 양태에서, 서열은 서열 첨가, 결실 또는 치환으로 인해 최대 10%, 최대 9%, 최대 8%, 최대 7%, 최대 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 가장 바람직하게는 최대 1%로 차이가 있다.

당업계에 공지되고 본원에 사용된 바와 같은 동일성은 서열을 비교함에 의한 측정시 2개 이상의폴리펩타이드 서열간의 관계이다. 당업계에서 동일성은 또한 상기 서열들의 스트링 간의 매치에 의한 측정시 있을 수 있는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 간의 서열 관련성 정도를 의미한다. 동일성은 용이하게 계산될 수 있다. 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 2개의 폴리펩타이드 서열 간의 동일성을 측정하기 위해 다수의 방법이 존재하지만 용어는 당업자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌참조: Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987). 동일성을 측정하기 위한 바람직한 방법은 시험된 서열 간의 최대 매치를 제공하도록 디자인한다. 동일성을 측정하기 위한 방법은 컴퓨터 프로그램으로 코드화되어 있다. 2개의 서열 간의 동일성을 측정하기 위해 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 팩키지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(문헌참조: Devereux, J. 등, 1984), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul, S. 등, 1990).

돌연변이체 또는 하이브리드 OspA 단편과는 대조적으로, 본 발명과 관련하여 "야생형 단편" 또는 "야생형 OspA 단편"은 보렐리아의 천연 OspA의 단편에 관한 것이다. 야생형 단편은 N-말단 결실에 의해 수득되지만 이것은 내부 결실(본원에서 상세히 기재된 신호서열로부터의 결실을 제외하고는) 또는 돌연변이를 포함하지 않는다. 하이브리드 및 돌연변이 OspA 단편과는 상대적으로, 야생형 단편은 OspA의 동일한 부분(OspA의동일한 길이 및 동일한 균주 등)으로 이루어지고 단지 상기 상세히 기재된 변형(들)에서만 차이가 있다.

본 발명의 폴리펩타이드

폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 연결되고, 또한 일부 경우에는 디설파이드 결합에 의해 연결된 아미노산의 단일 선형 중합체이다. 본 발명에 따라, 폴리펩타이드는 또한 하나 이상의 해독 후 변형; 즉 부착된 생화학적 기능성 그룹, 예를 들어, 부착된 아세테이트, 포스페이트, 지질 또는 탄수화물, 바람직하게 지질 또는 글리세롤, 보다 바람직하게는 1 내지 3개의 C₁₄-C₂₀ 알킬 또는 알케닐 잔기, 보다 더 바람직하게는 1 내지 3개의 팔미토일 그룹, 가장 바람직하게는 3개의 팔미토일 그룹 (Pam₃)과 함께 N-말단 시스테인에 부착된 지질을 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 상기 정의된 바와 같고 하이브리드 C-말단 OspA 단편을 포함하거나 이들로 이루어지고, 상기 하이브리드 C-말단 OspA 단편은 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음으로 이루어진다:

i) 서열번호: 8을 갖는 B. 가리니, 균주 PBr의 상응하는 단편이 아니고, 약 125번 또는 126번 위치에서 개시하여 175번 또는 176번에서 종결되는 보렐리아 균주 기원의 OspA의 제1 C-말단 부분의 아미노산으로 이루어진 제1 OspA 부분; 및

ii) 제1 C-말단 부분(예를 들어, 제1 C-말단 부분이 위치 175번에서 종료되는 경우, 제2 C-말단 부분은 위치 176번에서 연속하거나; 제1 C-말단 부분이 위치 176번에서 종료되는 경우, 제2 C-말단 부분이 위치 177번 등에서 연속하지만, 예를 들어, 또한 1개 또는 2개 이상의 10개 이하의 아미노산이 2개의 C-말단 부분의 융합 영역에서 결실될 수 있고 가장 바람직하게는 제1 C 말단 부분이 위치 175번에서 종료되는 경우, 제2 C-말단 부분은 위치 177번에서 연속한다)에 연속적으로 이어지는 OspA의 제2 C-말단 부분으로 이루어진 제2 OspA 부분 (여기서, 제2 OspA 단편은 시스테인에 의한 서열번호: 8의 위치 182번에서 야생형 아미노산의 치환 및 시스테인에 의한 서열번호: 8의 위치 269에서 야생형 아미노산의 치환에 의해 상응하는 야생형 서열과 상이하다는 점에서 시스틴 안정화되어 있고 상기 제2 OspA 단편의 위치 182번에서의 시스테인과 위치 269번에서의 시스테인 간의 디설파이드 결합이 시스테인(또한, "시스틴-안정화된 OspA 단편"으로서 언급됨)을 형성하고;

상기 아미노산 및 시스테인 치환의 넘버링은 B. 부르그도르페리 s.s., 균주 B31 (서열번호: 5)의 전장 OspA의 상응하는 아미노산의 넘버링을 따른다.

본 발명의 추가의 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 B. 발라이시아나 균주, VS116으로부터 아미노산 125번 내지 176번, 및 보렐리아 가리니, 균주 PBr (서열번호: 1)로부터 기원하는 시스틴 안정화된 아미노산 177 내지 274번으로 이루어진 하이브리드 C-말단 OspA 단편을 포함하거나, 그것으로 이루어진다.

본 발명의 추가의 양태에서, 폴리펩타이드는 B. 스피엘마니로부터의 아미노산 126번 내지 175번 및 보렐리아 가리니, 균주 PBr (서열번호: 51)의 시스틴-안정화된 아미노산으로 이루어진 하이브리드 C-말단 OspA 단편을 포함하거나, 그것으로 이루어진다.

본 발명의 추가의 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 본원에 정의된 바와 같고, 여기서, 제2 OspA 부분은 보렐리아 가리니, 균주 PBr로부터 시스틴-안정화된 아미노산 177번 내지 274번과 동일하지만, 보렐리아 가리니, 균주 PBr의 야생형 OspA의 아미노산 233번에서 트레오닌 잔기가 프롤린 잔기로 치환된 것만이 상이하다.

상기 정의된 바와 같고 본원에서 추가로 정의된 바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드는 면역화된 동물에서 항체 역가를 제공하고, 상기 항체는 관련 선행 기술의 폴리펩타이드(예를 들어, WO2014/006226에서 정의된 바와 같은)와 비교하는 경우 동일계에서 이들의 각각의 항원으로의 개선된 결합을 보여준다. 바람직하게, 본 발명의 하이브리드 C-말단 OspA 단편을 포함하는 폴리펩타이드는 적어도 하나의 시스테인 결합의 첨가에 의해 상응하는 야생형 OspA 서열과는 상이한 보렐리아의 OspA 단백질, 더 바람직하게는 서열번호: 31에 의해 정의된 바와 같은 Lip-S4D1-S3D1 이종이량체 단백질의 C-말단 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 대해 생성된 항체 의해 유발된 형광 강도와 비교하여, 형광 강도에서 적어도 1.5-배 증가, 바람직하게 적어도 2-배 증가, 보다 바람직하게 적어도 3-배 증가, 보다 더 바람직하게 적어도 4-배 증가, 보다 더 바람직하게 적어도 5-배 증가, 가장 바람직하게 적어도 10-배 증가를 유발하고, 이는 유동 세포측정에 의해 측정되고 혈청형 3 보렐리아의 표면으로 결합함에 의해 마우스에서 폴리펩타이드로 3회 면역화 후 생성된 항체에 의해 유발되고, 특히 상기 상승은 실시예 3에서 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.

추가로, 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 및 본원에 정의된 본 발명의 폴리펩타이드는 표준 공정과 함께 보다 높은 수율로 생산될 수 있고 관련 선행 기술의 폴리펩타이드(예를 들어, WO2014/006226에 정의된 바와 같은)와 비교하는 경우 덜 정제 단계를 필요로 한다. 바람직하게, 본 발명의 하이브리드 C-말단 OspA 단편을 포함하는 폴리펩타이드는, 적어도 하나의 시스테인 결합의 첨가에 의해 상응하는 야생형 OspA 서열과 상이한 보렐리아의 OspA 단백질의 C-말단 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 보다 바람직하게는 서열번호: 31에 의해 정의된 바와 같은 Lip-S4D1-S3D1 이종이량체 단백질과 비교하여 그람 바이오매스당 밀리그램으로 측정시 생산 수율에 있어서 적어도 1.5배 증가, 바람직하게 적어도 2배 증가, 보다 바람직하게 적어도 3배 증가, 보다 더 바람직하게 적어도 4배 증가, 보다 더 바람직하게 적어도 5배 증가, 가장 바람직하게 적어도 10배 증가를 보여주고, 특히, 상기 증가가 실시예 2에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 하이브리드 C-말단 OspA 단편을 포함하는 폴리펩타이드는 적어도 하나의 시스테인 결합의 첨가에 의해 상응하는 야생형 OspA 서열과 상이한 보렐리아의 OspA 단백질의 C-말단 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 보다 바람직하게는 서열번호: 31에 의해 정의된 바와 같은 Lip-S4D1-S3D1 이종이량체 단백질 보다 적은 정제 단계를 요구하고; 보다 구체적으로 적어도 하나 적은 크로마토그래피 단계를 요구한다.

본 발명의 추가의 양태에서, 상기 폴리펩타이드는 a) 상기 및 본원에 정의된 바와 같은 하이브리드 C-말단 OspA 단편 및 b) 돌연변이체 OspA 단편을 포함한다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 a) 본원에 정의된 바와 같은 하이브리드 C-말단 OspA 단편, 및 b) 제2 OspA 단편을 포함하고, 상기 OspA 단편은 보렐리아의 OspA 단백질의 C-말단 도메인으로 이루어져 있다는 점에서 C-말단이고 야생형 서열의 위치 182번에서 아미노산이 시스테인으로 치환되고, 야생형 서열의 위치 269번에서 아미노산이 시스테인으로 치환되어 상응하는 야생형 OspA 서열과는 상이하다는 점에서 돌연변이체이고 시스틴 안정화되어 있고 상기 OspA 단편의 위치 182번에서 시스테인과 위치 269번에서의 시스테인 간의 디설파이드 결합이 존재하고, 추가로, 여기서 상기 돌연변이체 OspA 단편은 위치 123번, 124번 또는 125번에서 개시하고 위치 273번 또는 274번에서 종료하고; 추가로 상기 아미노산 및 시스테인 치환의 넘버링은 B. 부르그도르페리 s.s., 균주 B31 (서열번호: 5)의 넘버링에 따르는 제2 C-말단 OspA 단편을 추가로 포함한다. 본 발명의 하나의 양태에서, 제2 OspA 단편은 예를 들어, 이전의 발명 (WO2014/006226)과 관련하여 상기 정의된 바와 같은 OspA의 임의의 돌연변이체 C-말단 단편일 수 있다.

본 발명에 따라, 본 발명의 상기 돌연변이체 OspA 단편 및 하이브리드 단편은 (i) 상기 정의된 바와 같은 N-말단 쉬트 및 (ii) 임의로 상기 정의된 바와 같은 중앙 쉬트의 하나 이상의 추가의 쇄를 포함하지 않는다. 그러나, 폴리펩타이드는 하나 이상의 기능성 서열, 예를 들어, 신호 서열, 예를 들어, 지질화 신호 서열 또는 지질화와 같은 해독후 변형을 포함할 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 (i) 하나 이상의 돌연변이체 OspA 단편(여기서, 적어도 하나는 예를 들어, 하기 정의된 바와 같은 링커에 의해 임의로 연결된 본 발명에 따른 하이브리드 C-말단 OspA 단편 또는 하나 이상의 돌연변이 OspA 단편 및 혈청형 3 하이브리드 OspA C-말단 단편이다) 및 (ii) 임의로 OspA에 대해 이종성인 하나 이상의 아미노산, 특히 신호 서열 및 (iii) 임의로 지질화와 같은 해독후 변형으로 이루어진다.

따라서, 본 발명의 추가의 양태에서, 상기 및 본원에 정의된 바와 같은 본 발명의 폴리펩타이드는 추가로

i) 지질화된 폴리펩타이드 또는 지질화 신호, 바람직하게 이. 콜라이-유래된 lpp 지질화 신호

(서열번호: 15);

ii) 지질화를 위한 부위로서 N-말단 시스테인 잔기에 의한 지질화 부위 펩타이드 리드, 바람직하게는 CSS를 포함하는 폴리펩타이드; 및/또는

iii) 하이브리드 C-말단 OspA 단편과 제2 시스테인-안정화된 OspA 단편 간의 링커를 포함하는 폴리펩타이드(특히, 상기 링커는 예를 들어

(서열번호: 16)을 포함할 수 있다.

본 발명의 하나의 양태에서, 제2 C-말단 OspA 단편은 본 발명에 따른 OspA의 하이브리드 C-말단 단편이다.

본 발명의 추가의 양태에서, 폴리펩타이드는 Lip-S4D1-S3hybD1 (서열번호: 27)의 이종이량체를 포함하거나 그것으로 이루어진다. 따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 서열번호: 27의 아미노산 서열(Lip-S4D1-S3hybD1의 이종이량체)을 포함하거나 이것으로 이루어진다.

본 발명의 폴리펩타이드는 보호 능력을 갖는다. 상기 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명의 OspA 단편의 하이브리드 성질 뿐만 아니라 하이브리드 및 하이브리드/돌연변이체 OspA 단편으로의 디설파이드 결합의 도입은 디설파이드 결합(들) 및 OspA 단편의 하이브리드 성질이 없는 각각의 단편을 포함하는 폴리펩타이드에 비해 폴리펩타이드의 보호 능력을 증가시킨다. 일부 양태에서, 보호 능력은 OspA 단편의 디설파이드 결합(들) 및 하이브리드 성질이 없는 각각의 단편을 포함하는 폴리펩타이드에 비해 적어도 10%, 보다 바람직하게 적어도 20%, 보다 바람직하게 적어도 30%, 보다 바람직하게 적어도 40%, 보다 바람직하게 적어도 50%, 보다 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%까지 증가된다.

용어 보호 능력은 보렐리아 감염에 대해 대상체를 보호하는 능력을 기재한다. 본 발명의 폴리펩타이드와 관련하여, 보호 능력은 보렐리아 감염에 대해 대상체를 보호하는 면역 반응을 유도하는 폴리펩타이드의 능력에 관한 것이다. 보호 능력은 대상체에게 폴리펩타이드에 대한 면역 반응을 유도하는 방식으로 폴리펩타이드를 투여함에 의해 시험될 수 있다. 이후, 상기 대상체에게 보렐리아를 챌린지할 수 있다. 감염에 대한 대상체의 반응은 모니터링한다. 특히, 대상체에서, 보렐리아의 존재를 결정할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 보렐리아가 대상체에서 검출될 수 없는 경우 보호성이다. 보렐리아의 존재는 보렐리아-특이적 핵산 (예를 들어, PCR에 의해) 또는 보렐리아-특이적 항체 (예를 들어, ELISA 또는 웨스턴 블롯에 의해)을 검출하거나 보렐리아 자체 (예를 들어, 성장 배지에서 기관 또는 조직을 배양하고 현미경에 의해 보렐리아의 존재를 입증하는)를 검출함에 의해 결정될 수 있다. 특히, 특정 용량에 대한 %로서 보고되는 보호 능력 ("pc")은 하기와 같이 정의된다:

pc (%) = [(총 시험된 대상체의 수 - 보렐리아-감염된 대상체의 수) / 총 시험된 대상체의 수] x 100

보호 능력에서의 차이 (Δpc)는 예를 들어, 디설파이드 결합(들)을 갖는 ([결합을 갖는] pc) 돌연변이체 OspA 단편의 보호 능력(pc)을 디설파이드 결합(들) (pc [w/o 결합])이 없는 OspA 단편의 보호 능력과 비교함에 의해 결정할 수 있다. 본 발명에 따라, 비교될 폴리펩타이드는 단지 적어도 하나의 디설파이드 결합의 도입에 차이가 있다. 디설파이드 결합(들)의 도입에 의한 보호 능력에서의 변화 (Δpc)는 하기와 같이 결정된다:

Δpc = (pc [샘플] - pc [대조군])

예를 들어, Δpc = ([결합을 갖는] pc - pc [w/o 결합])

Δpc가 0초과 (> 0)인 경우, 모든 다른 파라미터(예를 들어, 투여량 및 분석)가 동일하다고 가정했을 때, 샘플(예를 들어, 디설파이드 결합(들)을 갖는 돌연변이체 OspA 단편)의 보호 능력은 대조군(예를 들어, 디설파이드 결합(들)이 없는 OspA 단편)의 보호 능력 보다 우수하다. 역으로, Δpc가 0 미만 (< 0)이고 모든 다른 파라미터(예를 들어, 투여량 및 분석)가 동일하다고 가정한 경우, 샘플(예를 들어, 디설파이드 결합(들)을 갖는 돌연변이체 OspA 단편)의 보호 능력은 비교물(예를 들어, 디설파이드 결합(들)이 없는 OspA 단편)의 보호 능력 미만이다.

바람직하게, 본 발명의 폴리펩타이드는 생체내 챌린지 분석에 의해 이의 보호 능력에 대해 평가하고, 여기서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 위약 대조군으로 면역화된 마우스에는 피하 바늘 (바늘 챌린지 방법) 또는 진드기 매개체에 의한 도입(진드기 챌린지 방법)에 의해 면역화된 대상체로 도입된 보렐리아를 챌린지한다.

비늘 챌린지 방법은 목적하는 보렐리아 균주 (예를 들어, B. 부르그도르페리, 균주 ZS7)에 대해 보렐리아를 감염성 용량 (ID)50의 20배 내지 50배의 용량으로 제1 측면의 제1 폴리펩타이드 또는 적당한 위약(음성) 대조군, 예를 들어, 단독의 완충액 또는 보조제로 면역화된 마우스에 피하내 도입하고 챌린지된 마우스에서 감염률을 비교함에 의해 수행된다. ID50은 챌린지된 마우스의 50%가 감염되는 용량으로서 정의된다. 보렐리아의 용량은 세균의 수로 측정된다. 챌린지 용량은 광범위하게 다양할 수 있고 균주 의존성이며; 따라서, 처음에 균주의 독성이 ID50의 결정을 위한 챌린지 실험에 의해 평가되어야만 한다. 바늘 챌린지 한지 4주 후에, 혈액 및 조직은 감염 상태를 결정하기 위한 판독 방법을 위해 수거한다. 이들 판독 방법은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 혈청에 대한 VlsE ELISA 또는 보렐리아의 동정을 위해 수거된 조직에 대한 qPCR 또는 다른 방법일 수 있다.

진드기 챌린지 방법은 적어도 하나의 진드기 유충(예를 들어, 보렐리아 (예를 들어, B. 아프젤리, 균주 IS1)으로 감염된 아이. 리시누스 (I. ricinus ))를 제1 측면의 상기 제1 폴리펩타이드로 면역화된 마우스에 적용하고; b) 적어도 하나의 감염된 진드기 유충을 제1 측면의 상기 제2 폴리펩타이드로 면역화된 제2 마우스에 적용하고; c) 일반적으로 챌린지한지 6주후의 감염률을 비교함에 의해 수행된다. 바람직하게, 분석 또는 시험은 시험될 폴리펩타이드 당 마우스 그룹과 함께 수행된다. 적합한 시험은 또한 실시예에서 기재되고 설명된다. 감염 상태 평가는 혈청상의 VlsE ELISA 또는 수거된 조직으로부터 분리된 DNA에 대한 qPCR를 사용하거나 다른 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 예를 들어, 30 μg, 바람직하게 10 μg, 바람직하게 5.0 μg, 바람직하게 1.0 μg, 바람직하게 0.3 μg 이하의 용량으로 대상체에게 3회 투여되는 하이브리드 OspA 단편 및 바람직하게 돌연변이체 OspA C-말단 단편을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드와 같은 본 발명의 생성물은 50% 이상, 바람직하게 60% 이상, 보다 바람직하게 70% 이상, 보다 바람직하게 80% 이상, 보다 바람직하게 90% 이상, 보다 더 바람직하게 95% 이상, 가장 바람직하게 99% 이상의 보호 능력을 갖는다. 하나의 양태에서, 보호 능력은 예를 들어, 실시예에 기재된 바와 같은 생체내 챌린지방법, 바람직하게 진드기 챌린지 방법, 보다 바람직하게 바늘 챌린지 방법에서 평가된다.

바람직한 양태에서, 하이브리드 OspA C-말단 단편 및 위약(음성) 대조군을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드 간의 보호 능력 차이 (Δpc)는 30 μg, 바람직하게 10 μg, 바람직하게 5.0 μg, 바람직하게 1.0 μg, 바람직하게 0.3 μg 이하의 용량으로 대상체에게 3회 투여되는 경우, 적어도 50%, 특히 적어도 60%, 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 더 바람직하게 적어도 90%, 보다 더 바람직하게 적어도 95%, 가장 바람직하게 적어도 99%이다.

본 발명에 따라, 하이브리드 OspA의 제1 부분은 B. 가리니, 균주 PBr 이외의 다른 임의의 보렐리아 균주로부터 기원할 수 있고, 서열번호: 8을 갖고, 특히 본원에 특정된 것들로부터 기원하고, 예를 들어 B. 부르그도르페리 s.s., B. 가리니 (PBr 균주가 아님), B. 아프젤리 , B. 안데르소니 , B. 비세티 , B. 발라이시아나 , B. 루시타니애, B. 스피엘마니 , B. 자포니카, B. 타누키 , B. 투르디 또는 B. 시니카 , B. 바바리엔시스가 있고, 바람직하게는 B. 부르그도르페리 s.s., B. 아프젤리 , B. 바바리엔시스 또는 B. 가리니로부터 기원하고, 또는 이들 종들 중 2개 이상으로부터의 OspA 단백질 단편의 융합일 수 있다. 바람직하게, OspA는 B. 발라이시아나, 특히 균주 VS116 (서열번호: 4)로부터 기원하지만 B. 아프젤리, 특히 균주 K78, OspA 혈청형 2 (서열번호: 6); B. 부르그도르페리 s.s., 특히 균주 B31, OspA 혈청형 1 (서열번호: 5); B. 가리니, 특히 균주 PBr, OspA 혈청형 3 (서열번호: 8); B. 바바리엔시스, 특히 균주 PBi, OspA 혈청형 4(서열번호: 9); B.가리니, 특히 균주 PHei, OspA 혈청형 5 (서열번호: 10); B. 가리니, 특히 균주 DK29, OspA 혈청형 6 (서열번호: 11); 또는 B. 가리니, 특히 균주 T25, OspA 혈청형 7 (서열번호: 12)로부터 유도된 야생형 전장 OspA 단백질 중 적어도 하나와 비교하여 보렐리아 감염에 대한 상기 폴리펩타이드와 동일한 보호 능력을 필수적으로 확립한다. 이들 OspA 단백질(전장)의 아미노산 서열은 하기에 제공된다.

본 발명에 따라, 디설파이드 결합은 또한 단편의 적당한 폴딩을 가능하게 하거나 지지하는 OspA 단편의 임의의 위치에서 도입된 시스테인 간에 형성될 수 있다. 상기 위치는 OspA의 공지된 구조를 기준으로 상기 상세히 기재된 바와 같이 선택될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 B. 아프젤리, 특히 B. 아프젤리 K78 혈청형 2 OspA의 잔기들 182 +/- 3 중 하나 및 잔기들 269 +/- 3 중 하나 (디설파이드 결합 1형; "D1")에서 시스테인 잔기의 삽입, 또는 B. 아프젤리 이외의 다른 보렐리아, 예를 들어 B. 부르그도르페리 s.s., 특히 균주 B31, 혈청형 1; B. 가리니, 특히 균주 PBr, 혈청형 3; B. 바바리엔시스, 특히 균주 PBi, 혈청형 4; B. 가리니, 특히 균주 PHei, 혈청형 5; B. 가리니, 특히 균주 DK29, 혈청형 6; B. 가리니, 특히 균주 T25, 혈청형 7의 OspA의 상동성 아미노산의 삽입, 또는 B. 발라이시아나, 균주 VS116의 OspA의 아미노산 125-176의 융합, 또는 B. 스피엘마니의 OspA의 아미노산 125-175와 B. 가리니, 균주 PBr (서열번호: 8)의 아미노산 177-274의 융합에 의해 도입된 적어도 하나의 디설파이드 결합을 함유한다.

이것은 하기와 같이 나타낸다:

위치 182 +/- 3은 위치 179, 180, 181, 182, 183, 184 또는 185번, 바람직하게는 182번이라는 약어이다. 위치 269 +/- 3은 위치 266, 267, 268, 269, 270, 271 또는 272, 바람직하게는 269번이라는 약어이다.

바람직한 양태에서, 추가의 돌연변이체 단편은 B. 아프젤리 균주 K78, 혈청형 2의 OspA의 야생형 서열 (서열번호: 6) 의 야생형 서열의 위치 125, 126, 130 또는 131 내지 위치 273번 기원의 아미노산으로부터 유래하고 적어도 하나의 디설파이드 결합(특히, 여기서, 적어도 하나의 디설파이드 결합은 위치 182번 내지 269번 사이 (디설파이드 결합 1형)에 있다); 또는 B. 아프젤리 이외의 다른 보렐리아 종, 예를 들어, B. 부르그도르페리 s.s., 특히 균주 B31, 혈청형 1; B. 가리니, 특히 균주 PBr, 혈청형 3; B. 바바리엔시스, 특히 균주 PBi, 혈청형 4; B. 가리니, 특히 균주 PHei, 혈청형 5; B. 가리니, 특히 균주 DK29, 혈청형 6 또는 B. 가리니, 특히 균주 T25, 혈청형 7 기원의 OspA의 상동성 단편 및 위치가 도입되어 있다는 점에서 차이가 있다.

추가의 양태에서, 돌연변이체 단편은 서열번호: 43, 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 가장 바람직하게는 서열번호: 46으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열, 및 서열번호: 19 내지 25를 갖는 서열 중 적어도 하나와 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있고, 상기 시스테인은 대체되지 않는다. 돌연변이 및 서열 동일성에 대한 추가의 세부 사항은 상기되어 있다.

상기 상세히 기재된 바와 같이, 본 발명의 폴리펩타이드는 신호 서열을 포함할 수 있다. 지질화는 OspA에 대한 보조제 성질을 부여하는 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 지질화된 형태의 폴리펩타이드 또는 지질화 신호를 포함하는 폴리펩타이드가 바람직하다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 지질화 신호, 바람직하게는 보렐리아 외부 표면 단백질, OspA 또는 OspB (각각 서열번호: 13 및 14) 또는 보다 바람직하게 이. 콜라이 lpp 지질화 신호 서열 (서열번호: 15)를 포함한다. 지질화 신호를 포함하는 본 발명의 OspA 단편은 프로세싱 동안에 지질화되고 지질화 신호 펩타이드는 절단 제거되고; 따라서, 신호 펩타이드는 성숙한 지질화된 단백질에 더 이상 존재하지 않는다.

본 발명에 따른 지질화된 단백질은 3개의 지방산 그룹 및 글리세롤이 폴리펩타이드에 부착되어 있음을 지적하기 위해 N-말단에서 "Lip"로 표지화된다. 상기된 바와 같은 적합한 지질화 신호는

(서열번호: 13),

(서열번호: 14) 및

(서열번호: 15)를 포함한다. 지질 모이어티 및 글리세롤은 전장 야생형 OspA 단백질에 존재하는 N-말단 시스테인 잔기에 부착되기 때문에, 지질화를 위한 OspA C-말단 단편은 시스테인 잔기에 이어서 추가의 아미노산을 포함하는 펩타이드들을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 지질화 신호 서열에 대한 C-말단에 인접한 CSS 또는 CKQN (서열번호: 62)과 같은 서열은 지질화 신호 펩타이드의 절단시 지질화를 위해 N-말단 시스테인 잔기를 제공한다. 지질화된 시스테인-함유 펩타이드는 본 발명의 최종 지질화된 폴리펩타이드에 존재한다.

B. 부르그도르페리 s.s의 OspA 단백질은 또한 인간 백혈구 기능 관련된 항원 (hLFA-1) (본원에서 또한 "hLFA-1-형 서열"로 언급됨)에 결합하는 능력을 갖는 T 세포 수용체에 대한 결합 능력을 갖는 서열을 포함하는 것으로 고려되었다. hLFA-1에 대한 상기 OspA 영역의 유사성은 B. 부르그도르페리 s.s. OspA의 인간 대상체로의 투여시 교차 반응성을 갖는 면역 반응을 유도할 수 있고 민감한 개체에서 자가면역 질환, 특히 자가면역 관절염을 유도할 수 있다. 따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 인간 백혈구 기능 관련된 항원 (hLFA-1)에 대한 결합 능력을 갖는 T 세포 수용체에 대한 결합 능력을 갖는 서열을 포함하지 않고, 특히 아미노산 서열GYVLEGTLTAE (서열번호: 17)을 포함하지 않는다. 이러한 목적을 위해, hLFA-1-형 서열, 특히 아미노산 서열 GYVLEGTLTAE (서열번호: 17)은 또 다른 보렐리아 종의 OspA 단백질 기원의 상동성 서열, 특히 NFTLEGKVAND (서열번호: 18)로 대체될 수 있다.

바람직한 양태에서, 적어도 하나의 디설파이드 결합을 포함하는 본 발명의 폴리펩타이드는 적어도 하나의 보렐리아 균주, 특히 B. 아프젤리 K78, OspA 혈청형 2 (서열번호: 6); B. 부르그도르페리 s.s., 특히 균주 B31, 혈청형 1 (서열번호: 5); B. 가리니, 특히 균주 PBr, 혈청형 3 (서열번호: 7 및 8); B. 바바리엔시스, 특히 균주 PBi, 혈청형 4 (서열번호: 9); B. 가리니, 특히 균주 PHei, 혈청형 5 (서열번호: 10); B. 가리니, 특히 균주 DK29, 혈청형 6 (서열번호: 11) 또는 B. 가리니, 특히 균주 T25, 혈청형 7 (서열번호: 12)로부터 유도된 야생형 전장 OspA 단백질 중 적어도 하나와 비교하여 보렐리아 감염에 대한 상기 폴리펩타이드와 동일한 보호 능력을 필수적으로 확립한다.

돌연변이 및 서열 동일성에 대한 추가의 세부 사항은 상기에 나타냄을 주지한다.

표 A-3. 본 발명에 기재된 지질화된 돌연변이체 OspA 단편 이종이량체의 명명법 및 서열번호.

*S=혈청형 (1-6) (표 A-2를 참조한다);

S3hyb= B. 발라이시아나의 아미노산 125-176와 B. 가리니, 균주 PBr의 아미노산 177 내지 274의 융합

D1=디설파이드 결합 1형(위치 183 +/- 3 및 270 +/- 3에 삽입된 시스테인 잔기);

Lip=지질화: 글리세롤 및 지방산 잔기의 N-말단 첨가

또 다른 바람직한 양태에서, 제1 측면에 따른 폴리펩타이드는 하나 이상의 링커를 통해 연결된 적어도 2개 또는 3개의 돌연변이체 단편을 포함한다. 링커는 2개의 단편을 연결하기 위해 사용되는 보다 짧은 아미노산 서열이다. 치료되거나 백신접종될 대상체에서 단편들, 이들의 상호작용에 대해 또는 이들의 보호 능력에 대한 임의의 음성 영향을 피하도록 디자인해야만 한다. 최대 21개의 아미노산, 특히 최대 15개 아미노산, 특히 최대 12개 또는 8개 아미노산의 짧은 링커가 바람직하다. 보다 바람직하게, 하나 이상의 링커들은 단편과의 상호작용을 감소시키거나 최소화하기 위해 글라이신, 세린 및알라닌과 같은 소형 아미노산으로 구성된다. 바람직한 링커는 "LN1" 펩타이드 링커이고, 하기의 서열을 갖는 B. 부르그도르페리 s.s.,균주 B31 (D53S의 위치 53에서 아미노산이 교환된 aa 65-74 및 aa 42-53) 기원의 OspA의 N-말단 절반의 2개의 별도의 루프 영역을 융합한다:

(서열번호: 16). 상기 링커는 지질화 부위를 포함할 수 있다.

또 다른 바람직한 양태에서, 제1 측면에 따른 폴리펩타이드는 제1 측면의 바람직한 양태에 정의된 바와 같은 2개 또는 3개의 상이한 돌연변이체 단편을 포함하는, 최대 총 크기가 500개 아미노산을 갖는 폴리펩타이드; 또는 2개 또는 3개의 상이한 돌연변이체 단편, 1개 또는 2개의 링커 및 임의로 N-말단 시스테인으로 필수적으로 이루어진 폴리펩타이드; 및/또는 2개 또는 3개의 상이한 돌연변이체 단편, 최대 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 또는 11개 아미노산, 바람직하게 최대 10, 9, 8, 7 또는 6개 아미노산, 여전히 보다 바람직하게 최대 5, 4, 3, 2 또는 1개 아미노산(들)으로 이루어진 단편의 N-말단 연장부(여기서, N-말단 연장부는 각각의 보렐리아 OspA에서 N-말단적으로 단편으로부터 직접적으로 위치한다) 및, 임의로, N-말단 시스테인으로 필수적으로 이루어진 폴리펩타이드를 포함한다. N-말단 시스테인에 이어서 임의로 1 내지 10개의 아미노산 길이의 짧은 펩타이드 링커가 존재할수 있고 바람직하게 N-말단 CSS 펩타이드 형태를 취한다.

본 발명의 핵산 및 관련 측면

추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명과 관련하여 본원 및 상기 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 핵산은 벡터 및/또는 세포에 포함될 수 있다.

본 발명은 추가로 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "핵산(들)"은 일반적으로 단일 및 이중 가닥 영역/형태를 포함하는 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시보뉴클레오타이드를 언급한다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩타이드를 암호화하는 핵산"은 본 발명의 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포괄한다. 상기 용어는 또한 암호화 및/또는 비암호화 서열을 함유할 수 있는 추가의 영역과 함께 펩타이드또는 폴리펩타이드를 암호화하는 단일 연속 영역 또는 비연속 영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 통합된 파아지, 통합된 삽입 서열, 통합된 벡터 서열, 통합된 트랜스포존 서열에 의해 차단되거나 RNA 에디팅 또는 게놈 DNA 재구성으로 인해 차단된 폴리뉴클레오타이드)를 포괄한다.

유전자 코드의 축퇴성의 결과로서 본원에 기재된 폴리펩타이드를 암호화하는 많은 뉴클레오타이드 서열이 있다는 것은 당업자가 이해할 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드의 일부는 임의의 천연(즉, 천연적으로 존재하는) 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 최소 유사성을 함유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용법에서의 차이로 인해 다양한 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 인간 및/또는 영장류 및/또는 이. 콜라이 코돈 선택을 위해 최적화된 폴리뉴클레오타이드는 구체적으로 본 발명에 의해 고려된다.

목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 당업계에 널리 공지된 화학적 방법을 사용하여 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다(문헌참조: Caruthers, M. H. 등, Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 215-223 (1980), Horn 등, Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 225-232 (1980)). 대안적으로, 단백질 자체는 폴리펩타이드 또는 이의 일부의 아미노산 서열을 합성하기 위한 화학적 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드 합성은 다양한 고형상 기술 (문헌참조: Roberge 등, Science 269:202-204 (1995))을 사용하여 수행될 수 있고 자동화 합성은 예를 들어, ASI 431 A 펩타이드 합성기 (문헌참조: Perkin Elmer, Palo Alto, CA)를 사용하여 성취될 수 있다.

더욱이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 유전자 생성물의 클로닝, 프로세싱 및/또는 발현을변형시키는 변화를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 이유 때문에 폴리펩타이드 암호화 서열을 변화시키기 위해 당업계에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 가공될 수 있다. 예를 들어, 무작위 단편화 및 유전자 단편들의 PCR 재어셈블리 및 합성 올리고뉴클레오타이드에 의한 DNA 셔플링은 뉴클레오타이드 서열을 가공하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 부위-지시된 돌연변이 유발을 사용하여 새로운 제한 부위를 삽입하거나, 당화 패턴을 변화시키거나, 코돈 선호도를 변화시키거나, 스플라이스 변이체를 변화시키거나, 돌연변이를 도입하는 등을 할 수 있다.

본 발명의 추가의 측면에서, 본 발명은 예를 들어, 프로모터가 유도되는 경우 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드가 발현되도록 유도성 프로모터에 연결되는 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 벡터는 pET28b(+)이다(http://www.addgene.org/vector-database/2566/).

본 발명의 추가의 측면은 상기 벡터를 포함하고, 여기서, 유도성 프로모터는 충분한 양의 IPTG (이소프로필 β-D-l-티오갈락토피라노사이드)를 바람직하게 성장 배지로 첨가함에 의해 활성화된다. 임의로 이의 농도는 0.1 내지 10 mM, 0.1 내지 5 mM, 0.1 내지 2.5 mM, 0.2 내지 10 mM, 0.2 내지 5 mM, 0.2 내지 2.5 mM, 0.4 내지 10 mM, 1 내지 10 mM, 1 내지 5 mM, 2.5 내지 10 mM, 2.5 내지 5 mM, 5 내지 10 mM이다. 대안적으로, 상기 프로모터는 온도 또는 pH의 변화에 의해 유도될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 핵산 분자는 일반적으로 비변형된 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 리보핵산 분자 또는 데옥시리보핵산 분자를 언급한다. 따라서, 예를 들어, 본원에 사용된 바와 같은 핵산 분자는 적어도 단일 및 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 또는 보다 전형적으로 이중 가닥 또는 단일 및 이중 가닥 영역의 혼합일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 언급한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 핵산 분자는 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 상기된 바와 같은 DNA 또는 RNA 분자를 포함한다. 따라서, 안정성 또는 다른 이유 때문에 변형된 골격을 갖는 DNA 또는 RNA 분자는 상기 용어가본원에서 의도된 바와 같은 "핵산 분자"이다. 더욱이, 단지 2개의 예로서 거론된 이노신과 같은 특수 염기 또는 트리틸화된 염기와 같은 변형된 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 종이 또한 본원에 정의된 핵산 분자이다. 당업자에게 공지된 많은 유용한 목적을 제공하는 DNA 및 RNA 분자에 다양한 변형이 적용된 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 핵산 분자는 상기 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태의 핵산 분자, 및 특히 단순 세포 및 복합 세포를 포함하는 바이러스 및 세포에 특징인 화학적 형태의 DNA 및 RNA를 포괄한다. 용어 핵산 분자는 또한 흔히 올리고뉴클레오타이드(들)로서 언급되는 짧은 핵산 분자를 포괄한다. 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산" 또는 "핵산 분자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

본 발명에 따른 핵산은 화학적으로 합성될 수 있다. 대안적으로, 핵산은 보렐리아로부터 분리되거나 당업자에게 공지된 방법에 의해 변형될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 동일하게 적용된다.

추가로, 본 발명의 핵산은 클로닝과 같은 표준 기술을 사용하여 보렐리아 조절 서열 또는 이종성 조절 서열, 이종성 리더 서열, 이종성 마커 서열 또는 이종성 암호화 서열이든 상관없이 임의의 목적하는 서열(들)에 기능적으로 연결되어 융합 유전자를 생성할 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 mRNA 또는 cRNA와 같은 RNA 형태, 또는 예를 들어, 클로닝에 의해 수득되거나 화학적 합성 기술 또는 이의 조합에 의해 생산되는 cDNA 및 게놈 DNA를 포함하는 DNA 형태일 수 있다. 상기 DNA는 삼중 가닥, 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 단일 가닥 DNA는 또한 센스 가닥으로서 공지된 암호화 가닥일 수 있거나 이는 안티-센스 가닥으로서 언급된 비-암호화 가닥일 수 있다.

본 발명의 핵산은 벡터 또는 숙주 세포에 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는, 벡터 또는 숙주 세포, 바람직하게는 이. 콜라이에 관한 것이다. 벡터는 벡터가 복제가능하고 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 단백질을 발현할수 있도록 하는 방식으로 상기 언급된 핵산을 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드의 재조합 생산을 위해, 숙주 세포를 유전학적으로 가공하여 본 발명의 핵산의 발현 시스템 또는 이의 일부를 혼입할 수 있다. 핵산의 숙주 세포로의 도입은 많은 표준 실험 매뉴얼에 기재된 방법에 의해 수행될 수 있고, 예를 들어, 문헌[Davis, 등, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) and Sambrook, 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]을 참조하고, 예를 들어, 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 트랜스벡션(transvection), 미세주사, 양이온 지질 매개 형질감염, 전기천공, 접합, 형질도입, 스크레이프 로딩, 탄도 도입(ballistic introduction) 및 감염이 있다.

적당한 숙주의 대표적인 예는 그람 음성 세균 세포, 예를 들어, 이. 콜라이 , 악시네토박터(Acinetobacter), 액티노바실러스 ( Actinobacillus ), 보르데텔라 (Bordetella), 브루셀라( Brucella ), 캠필로박터 ( Campylobacter ), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 엔테로박터( Enterobacter ), 어위니아 ( Erwinia ), 프란시스셀라 (Franciscella), 헬리코박터( Helicobacter ), 헤모필러스( Hemophilus ), 클렙시엘라 (Klebsiella), 레지오넬라( Legionella ), 모락셀라( Moraxella ), 나이세리아 (Neisseria), 파스퇴렐라 ( Pasteurella ), 프로테우스( Proteus ), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 세라티아( Serratia ), 쉬겔라( Shigella ), 트레포네마(Treponema), 비브리오( Vibrio ), 예르시니아(Yersinia)의 세포를 포함한다. 하나의 양태에서, 숙주 세포는 에스케리치아 콜라이 세포이다. 바람직한 양태에서, 숙주 세포는 이. 콜라이 BL21(DE3) 세포 또는 이. 콜라이 BL21 Star™ (DE3) 세포이다.

대안적으로, 그람 양성 세균 세포가 또한 사용될 수 있다. 다양한 양의 발현 시스템을 사용하여 본 발명의 폴리펩타이드를 생산할 수 있다. 하나의 양태에서, 벡터는 세균 플라스미드로부터 유래한다. 일반적으로, 숙주 세포에서 폴리뉴클레오타이드를 유지하거나, 증식시키거나, 발현시키고/시키거나 폴리펩타이드를 발현시키기에 적합한 임의의 시스템 또는 벡터는 이와 관련된 발현을 위해 사용될 수 있다. 적당한 DNA 서열은 예를 들어, 문헌[참조: Sambrook 등, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (supra)]에 제시된 것들과 같은 임의의 다양한 널리 공지되고 통상의 기술에 의해 발현 시스템으로 삽입될 수 있다.

본 발명의 하나의 양태에서, 세포는 예를 들어, 항생제, 바람직하게는 가나마이신의 존재하에 선택 압 하에 성장시킨다. 또 다른 양태에서, 세포는 항생제의 부재하에 성장시킨다.

다양한 발현 벡터를 사용하여 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 발현할 수 있다. 일반적으로, 숙주에서 폴리펩타이드를 발현하기 위해 핵산을 유지하거나, 증식시키거나 발현하기 위해 적합한 임의의 벡터는 이와 관련된 발현을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 상기 측면에 따라, 벡터는 예를 들어, 플라스미드 벡터, 단일 또는 이중 가닥 파아지 벡터 또는 단일 또는 이중 가닥 RNA 또는 DNA 바이러스 벡터일 수 있다. 본원에 기재된 출발 플라스미드는 시판되거나 대중에게 가용하거나 널리 공지된 공개된 과정의 통상적인 적용에 의해 가용한 플라스미드로부터 작제될 수 있다. 특정 측면에서 벡터 중에 바람직한 것은 본 발명에 따른 핵산 분자 및 폴리펩타이드의 발현을 위한 벡터이다. 숙주 세포에서 핵산 작제물은 재조합 서열에 의해 암호화된 유전자 생성물을 생산하기 위한 통상적인 방식으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 통상의 펩타이드 합성기에 의해 합성적으로 생산될 수 있다. 추가로, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 적당한 숙주 세포의 대표적인 예는 세균, 예를 들어, 스트렙토코시 (streptococci), 스타필로코시 (staphylococci), 이. 콜라이 , 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 및 바실러스 서브틸러스 (Bacillus subtilis ); 진균류, 예를 들어, 효모 및 아스퍼질러스 ( Aspergillus ); 곤충 세포, 예를 들어, 드로소필라 (Drosophila) S2 및 스포도프테라 ( Spodoptera ) Sf9 세포; 포유동물 세포, 예를 들어, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293 또는 바우스 흑색종 세포; 및 식물 세포를 포함한다. 세포 부재 해독 시스템을 또한 사용하여 본 발명의 DNA 작제물로부터 유래된 RNA를 사용하여 상기 단백질을 생산할 수 있다.

본 발명에 따른 벡터를 숙주 세포로 도입함에 의해 실제로 목적하는 아미노산 서열을 발현하기 위해, 벡터는 본 발명에 따른 핵산 서열뿐만 아니라 발현을 조절하기 위한 다른 서열, (예를 들어, 프로모터 서열, 터미네이터 서열 및 인핸서 서열) 및 미생물, 곤충 세포, 동물 배양 세포 등을 선택하기 위한 유전자 마커 (예를 들어, 네오마이신 내성 유전자 및 가나마이신 내성 유전자)를 포함한다. 추가로, 벡터는 반복된 형태예를 들어, 탠덤)로 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 벡터는 유전학적 가공 분야에서 통상적으로 사용되는 과정을 기초로 작제될 수 있다.

숙주 세포는 적당한 배지에서 배양될 수 있고, 본 발명에 따른 단백질은 배양 생성물로부터 수득될 수 있다. 본 발명에 따른 단백질은 배양 배지로부터 회수될 수 있고 통상적인 방식으로 정제될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 벡터로 적합한 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시킴을 포함하는, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 생산하기 위한 방법, 또는 본 발명에 따른 핵산 분자를 발현함을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다,.

대안적으로, 상기 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 생산하기 위한 방법은 하기의 단계를 특징으로 할 수 있다:

a) 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계,

b) 상기 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 상기 숙주 세포를 성장시키는 단계,

c) 상기 숙주 세포를 파쇄시키는 단계, 및

d) 상기 숙주 세포 파쇄물을 정제 단계에 적용하는 단계.

본 발명은 추가로 하기의 단계를 특징으로 하는 상기 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다:

a) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 벡터로 도입하는 단계,

b) 상기 벡터를 숙주 세포로 도입하는 단계,

c) 상기 숙주 세포를 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 성장시키는 단계,

d) 상기 숙주 세포를 파쇄시키는 단계,

e) 상 분리에 의해 지질 상내 폴리펩타이드를 집적시키는 단계, 및

f) 겔 여과 칼럼 상에서 추가로 정제하는 단계.

본 발명은 추가로 하기의 단계를 특징으로 하는 상기 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다:

a) 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 벡터로 도입하는 단계,

b) 상기 벡터를 숙주 세포로 도입하는 단계,

c) 상기 숙주 세포를 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 성장시키는 단계,

d) 상기 숙주 세포를 파쇄시키는 단계,

e) 상 분리에 의해 지질 상내에 폴리펩타이드를 집적시키는 단계,

f) 겔 여과 칼럼 상에서 정제하는 단계, 및

h) 임의로, 완충제 교환 칼럼 상에서 추가로 프로세싱하는 단계.

본 발명의 항체 및 관련 측면

본 발명에서 해결하고자 하는 문제점은 추가의 측면에서 본 발명과 관련하여 정의된 바와 같은 하이브리드 C-말단 OspA 단편에 선택적으로 결합하지만 단독의 제1 OspA 부분 및 제2 OspA 부분(즉, 다른 부분에는 융합되지 않은)에는 결합하지 않는 항체 또는 이의 적어도 유효 부분에 의해 해결된다.

바람직한 양태에서, 상기 항체는 모노클로날 항체이다.

또 다른 바람직한 양태에서, 상기 유효 부분은 Fab 단편, F(ab) 단편, F(ab)N 단편, F(ab)2 단편 또는 Fv 단편 또는 단일 도메인 항체를 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 항체는 키메라 항체이다.

또 다른 양태에서, 상기 항체는 인간화된 항체이다.

바람직한 측면에서, 본 발명의 항체는 본 발명의 하이브리드 OspA 단편 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하지만 단독의 제1 OspA 부분 및 제2 OspA 부분에 결합하지 않고 상응하는 야생형 OspA 단편 폴리펩타이드에 결합하지 않는다.

보다 바람직한 측면에서, 항체는 본 발명의 돌연변이체 OspA 단편의 디설파이드 결합에 특이적으로 결합한다.

용어 "특이성"은 특정 항원-결합 분자 또는 항원-결합 단백질(예를 들어, 나노바디 또는 본 발명의 폴리펩타이드)이 결합할 수 있는 다수의 상이한 유형의 항원 또는 항원 결정인자를 언급한다. 항원-결합 단백질의 특이성은 친화성 및/또는 결합가를 기준으로 결정될 수 있다. 항원-결합 단백질과 항원의 해리에 대한 평형 상수에 의해 나타나는 친화성(KD)은, 항원-결합 단백질 상의 항원 결정인자와 항원-결합 부위간의 결합 강도에 대한 척도이고: KD의 값이 적을 수록, 항원 결정인자와 항원-결합 분자간의 결합 강도가 더 강하다(대안적으로 상기 친화성은 또한 1/KD인 친화성 상수 (KA)로서 표현될 수 있다).

당업자에게 자명한 바와 같이(예를 들어, 본원에서의 추가의 기재를 기준으로), 친화성은 목적하는 특정 항원에 의존하여 공지된 방식 자체로 결정될 수 있다. 결합가는 항원-결합 분자(예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이의 유효 부분)와 적절한 항원 간의 결합 강도의 척도이다. 결합가는 항원-결합 분자상의 항원 결정인자 및 이의 항원 결합가 간의 친화성 및 항원-결합 분자상에 존재하는 적절한 결합 부위의 수 둘 모두와 관련된다. 전형적으로, 항원-결합 단백질(예를 들어, 본 발명의 항체 또는 이의 유효 부분)은 10^-5 내지 10^-12 M 이하, 및 바람직하게는 10^-7 내지 10^-12 M 이하 및 보다 바람직하게는 10^-8 내지 10^-12 M(즉, 결합 상수(K_A)는 10⁵ 내지 10¹² M^-1 이상 및 바람직하게는 10⁷ 내지 10¹² 리터/몰 이상 및 보다 바람직하게는 10⁸ 내지 10¹² M^-1이다)의 해리 상수(K_D)로 이들의 항원과 결합한다. 10⁴ M 초과의 임의의 K_D 값(또는 10⁴ M^-1 미만의 임의의 K_A 값)은 일반적으로 비-특이적 결합을 지적하기 위해 고려된다. 바람직하게, 본 발명의 1가 면역글로불린 서열은 500nM 미만, 바람직하게는 200nM 미만, 보다 바람직하게는 10nM, 예를 들어, 500pM 미만의 친화성으로 목적하는 항원에 결합할 것이다. 항원-결합 단백질의 항원 또는 항원 결정인자로의 특이적 결합은 예를 들어, 스캐챠드 분석 및/또는 경쟁 결합 분석, 예를 들어, 방사선면역분석(RIA), 효소 면역분석(EIA) 및 샌드위치 경쟁 분석을 포함하는 임의의 적합한 공지된 방식 자체 및 당업계에 공지된 이의 상이한 변법 자체, 및 본원에 언급된 다른 기술로 결정될 수 있다.

상기 해리 상수는 당업자에게 자명한 바와 같이 실제 또는 겉보기 분해 상수일 수 있다. 해리 상수를 결정하기 위한 방법은 당업자에게 자명하고 예를 들어, 본원에 언급된 기술을 포함한다. 이와 관련하여 또한 10^-4 M 또는 10^-3 M 이상의 (예를 들어, 10^-2 M) 해리 상수를 측정할 수 없다는 것은 명백할 것이다. 임의로, 또한 당업자에게 자명한 바와 같이, (실제 또는 겉보기) 해리 상수는 관계식 [K_D = 1/K_A]에 의해 (실제 또는 겉보기) 결합 상수(K_A)를 기준으로 계산될 수 있다.

친화성은 분자 상호작용의 강도 또는 안정성을 나타낸다. 상기 친화성은 통상적으로 몰/리터(또는 M)의 유니트를 갖는 K_D, 또는 해리 상수에 의해 나타낸다. 친화성은 또한 1/K_D과 동일하고 (리터/몰)^-1 (또는 M^{- 1})의 유니트를 갖는 결합 상수 K_A로서 나타낼 수 있다. 본원에서, 2개의 분자(예를 들어, 아민노산 서열, 본 발명의 나노바디 또는 폴리펩타이드 및 이의의도된 표적) 간의 상호작용의 안정성은 주로 이의 상호작용의 KD 값으로 나타낼 수 있고; 관계식 K_A = 1/K_D의 관점에서, 이의 K_D 값으로 분자 상호작용의 강도의 특정은 상응하는 K_A 값을 계산하기 위해 사용될 수 있는 것은 당업자에게 자명할 것이다. K_D 값은 또한 널리 공지된 관계식 DG = RT.ln(K_D) (균등하게 DG = -RT.ln(K_A))에 의한 결합의 유리 에너지 (DG)와 관련됨에 따라 열동력학적 방식에서 분자 상호작용의 강도를 특정하고, 여기서, R은 가스 상수이고 T는 절대 온도이고 In은 천연 로그를 지정하는 것이다.

의미있는 것으로 고려되는(예를 들어, 특이적인) 생물학적 반응에 대한 KD는 전형적으로 10^-10 M (0.1 nM) 내지 10^-5 M (10000 nM)의 범위에 있다. 상호작용이 보다 강할수록, 이의 K_D는 보다 낮다.

바람직한 양태에서, 본 발명의 항체의 K_D는 10^-12 M 내지 10^-5 M, 바람직하게 10^-6 미만, 바람직하게, 10^-7 미만, 바람직하게, 10^-8 M 미만, 바람직하게 10^-9 M 미만, 보다 바람직하게 10^-10 M 미만, 보다 더 바람직하게 10^-11 M 미만, 가장 바람직하게 10^-12 M 미만이다.

K_D는 또한 이의 해리율에 대해 k_off로서 나타내고, k_on으로 나타내는 (K_D = k_off/k_on 및 K_A = k_on /k_off이도록) 복합체의 해리율 상수의 비율로서 나타낼 수 있다. 오프 속도 k_off는 유니트 s^-1 를 갖는다(여기서, s는 초에 대한 SI 유니트 명명이다). on-속도 k_on은 유니트 M^-1 s^{- 1}를 갖는다. on-속도는 102 M^{- 1} s^-1 내지 약 10⁷ M^-1s^-1로 다양할 수 있고, 이분자 상호작용에 대한 확산-제한된 결합율 상수에 근접한다. off-속도는 관계식 t_1/2 = ln(2)/k_off에 의한 소정의 분자 상호작용의 반감기와 관련된다. off-속도는 10^-6 s^-1 (다수 일자의 t_1/2과 거의 비가역적 복합체) 내지 1 s^-1 (t_1/2 = 0.69 s)로 다양할 수 있다.

2개 분자 간의 분자 상호작용의 친화성은 공지된 상이한 기술 자체, 예를 들어, 널리 공지된 표면 플라스몬 공명(SPR) 바이오센서 기술 (문헌참조: 예를 들어 Ober 등, Intern. Immunology, 13, 1551-1559, 2001)를 통해 측정될 수 있고, 여기서, 1개 분자는 바이오센서 칩상에 고정화되고 다른 분자는 k_on, k_off 측정 및 이어서 K_D (또는 K_A) 값을 산출하는 유동 조건하에서 고정화된 분자상을 통과한다. 이것은 예를 들어, 널리-공지된 BIACORE 기구를 사용하여 수행될 수 있다. 측정된 K_D가 측정 방법이 어떻게든 예를 들어 1개 분자의 바이오센서 상에 코팅과 관련된 인공물에 의해 함축된 분자의 고유 결합 친화성에 영향을 미치는 경우 겉보기 KD 에 상응할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 또한, 겉보기 K_D는 1개 분자가 다른 분자에 대한 1개 이상의 인지 부위를 함유하는 경우 측정될 수 있다. 상기 상황에서, 측정된 친화성은 2개 분자에 의한 상호작용의 결합가에 의해 영향받을 수 있다.

친화성을 평가하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 방법은 문헌(참조: Friguet 등 (J. Immunol. Methods, 77, 305-19, 1985)의 2단계 ELISA(효소-결합된 면역 흡착 분석) 과정이다. 상기 방법은 용액 상 결합 평형 측정을 확립하고 플라스틱과 같은 지지체 상에 분자 중 1개의 흡착에 관한 가능한 인공물을 회피한다.

그러나, K_D의 정확한 측정은 매우 노동 집약적일 수 있고; 따라서, 겉보기 K_D 값은 흔히 2개 분자의 결합 강도를 평가하기 위해 결정된다. 모든 측정이 일관된 방식(예를 들어, 분석 조건이 변화되지 않도록 유지하면서)으로 수행되는 한, 겉보기 K_D 측정은 진정한 K_D의 근사치 및 이어서 본원의 K_D의 근사치로서 사용될 수 있고 겉보기 K_D가 균등한 중요성 또는 관련성으로 처리되어야 함을 주지해야 한다.

최종적으로, 많은 상황에서 경험있는 과학자는 일부 참조 분자에 상대적인 결합 친화성을 결정하기 위해 간편하게 판단할 수 있음을 주지해야 한다. 예를 들어, 분자 A와 B 간의 결합 강도를 평가하기 위해, 예를 들어, B에 결합하는 것으로 공지되고 예를 들어, ELISA 또는 유동 세포측정 또는 다른 포맷에서 용이한 검출을 위한 비오틴과 같은 형광단 또는 발색단 그룹 또는 다른 화학적 잔기(형광 검출을 위한 형광단, 광 흡수 검출을 위한 발색단, 스트렙타비딘-매개된 ELISA 검출을 위한 비오틴)로 적합하게 표지되는 표준 분자 C를 사용할 수 있다. 전형적으로, 표준 분자 C는 고정된 농도로 유지되고 A의 농도는 B의 주어진 농도 또는 양에 따라 다양하다. 결과로서, A의 부재하에 C에 대해 측정된 신호가 절반인 A 농도에 상응하는 억제 농도 (IC)₅₀ 값이 수득된다. 표준 분자의 총 농도 c_ref 뿐만 아니라 제공된 K_{D ref}인 표준 분자의 K_D은 공지되어 있고, 상호작용 A-B에 대한 겉보기 KD 는 하기의 식으로부터 수득될 수 있다: K_D = IC₅₀/(1 + c_ref/K_Dref). c_ref << K_Dref인 경우, K_D

IC₅₀임을 주지한다. IC₅₀의 측정이 일관된 방식(예를 들어, c_ref를 고정된 상태로 유지하면서)으로 비교되는 결합제에 대해 수행되는 경우, 분자 상호작용의 강도 또는 안정성은 IC₅₀에 의해 평가될 수 있고 상기 측정은 본원 전반에 걸쳐 K_D 또는 겉보기 K_D 균등한 것으로 판단된다.

본 발명의 또 다른 측면은 상기 정의된 바와 같은 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주에 관한 것이다.

본 발명에서 해결하고자 하는 문제점은 하기의 단계를 특징으로 하는, 상기 정의된 바와 같은 항체를 생산하기 위한 방법에 의해 추가로 해결된다:

a) 상기 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 상기 동물에게 투여함에 의해 비-인간 동물에서 면역반응을 개시하는 단계,

b) 상기 동물로부터 체액을 함유하는 항체를 제거하는 단계, 및

c) 상기 항체 함유 체액을 추가의 정제 단계에 적용하여 항체를 제조하는 단계.

본 발명은 추가로 하기의 단계를 특징으로 하는, 상기 정의된 바와 같은 항체를 생산하기 위한 방법에 관한 것이다:

a) 상기 정의된 바와 같은 폴리펩타이드를 상기 동물에게 투여함에 의해 비-인간 동물에서 면역반응을 개시하는 단계,

b) 상기 동물로부터 비장 또는 비장 세포를 제거하는 단계,

c) 상기 비장 또는 비장 세포의 하이브리도마 세포를 생산하는 단계,

d) 상기 폴리펩타이드에 특이적인 하이브리도마 세포를 선택하고 클로닝하는 단계,

e) 상기 클로닝된 하이브리도마 세포의 배양에 의해 항체를 생산하는 단계, 및

f) 임의로 추가의 정제 단계를 수행하는 단계.

약제학적 조성물 및 관련 의학 측면

본 발명의 또 다른 측면은 다음을 포함하는 약제학적 조성물에 관련된다:

(i) 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 핵산, 및/또는 본 발명에 따른 항체; 및

(ii) 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제.

따라서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 항체 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물은,

- 의약, 특히 백신으로서 사용하기 위한 것이나

- 보렐리아 감염을 치료하거나 예방하기 위한 방법에 사용하기 위한 것일 수 있고, 특히, 상기 감염은 B. 부르그도르페리 s.s., B. 가리니, B. 아프젤리 , B. 안데르소니 , B. 바바리엔시스 , B. 비세티 , B. 발라이시아나 , B. 루시타니아 , B. 스피엘마니 , B. 자포니카, B. 타누키 , B. 투르디 또는 B. 시니카 감염, 바람직하게 B. 부르그도르페리 s.s., B. 아프젤리 또는 B. 가리니 감염이다.

바람직하게, 상기 조성물은 Lip-S1D1-S2D1 (서열번호: 29) 및 Lip-S5D1-S6D1 (서열번호: 33)을 추가로 포함하거나, 상기 조성물은 Lip-S1D1-S2D1 (서열번호: 29)를 추가로 포함하거나, 상기 조성물은 Lip-S5D1-S6D1 (서열번호: 33)을 추가로 포함하거나, 상기 조성물은 Lip-S1D1-S2D1 (서열번호: 29), Lip-S4D1-S3hybD1 (서열번호: 27) 및 Lip-S5D1-S6D1 (서열번호: 33)을 추가로 포함한다.

여전히 또 다른 측면은 보렐리아 종, 보다 바람직하게 본원에 기재된 바와 같은 병원성 보렐리아 종에 의한 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 약제학적 조성물에 관한 것이고, 보다 바람직하게 상기 종은 B. 부 르그도르페리 s.s., B. 아프젤리, B. 바바리엔시스 및 B. 가리니를 포함한다.

본 발명에서 해결하기 위한 문제점은 또 다른 측면에서 보렐리아 종, 보다 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 병원성 보렐리아 종과의 감염을 치료하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 핵산, 및/또는 본 발명에 따른 항체를 사용함에 의해 해결되고, 보다 바람직하게 상기 종은 B. 부르그도르페리 s.s., B. 아프젤리, B. 바바리엔시스 및B. 가리니를 포함한다.

약제학적 조성물은 임의로 임의의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제, 예를 들어, 완충 물질, 안정화제 또는 추가의 활성 성분, 특히 약제학적 조성물 및/또는 백신 생산과 관련하여 공지된 성분들을 함유할 수 있다. 바람직하게, 약제학적으로 허용되는 부형제는 L-메티오닌을 포함한다. 바람직하게, 약제학적 조성물은 보렐리아 종, 보다 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같은 병원성 보렐리아 종에 의해 유발되는 감염을 예방하거나 치료하기 위한, 약물, 특히 백신으로서 사용하기 위한 것이고, 보다 바람직하게, 상기 종은 B. 부르그도르페리 s.s., B. 아프젤리, B. 바바리엔시스 및 B. 가리니, 및/또는 항원이백신에 포함된 다른 병원체를 포함한다. 바람직하게, 약제학적 조성물은 보렐리아 감염을 치료하거나 에방하는 방법에 사용하기 위한 것이고, 특히, 상기 감염은 B. 부르그도르페리 s.s., B. 가리니, B. 아프젤리 , B. 안데르소니 , B. 바바리엔시스 , B. 비세티 , B. 발라이시아나 , B. 루시타니아, B. 스피엘마니 , B. 자포니카, B. 타누키 , B. 투르디 또는 B. 시니카 감염, 바람직하게 B. 부르그도르페리 s.s., B. 아프젤리 또는 B. 가리니 감염이다.

하나의 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 추가로 보조제를 포함한다. 본 발명의 방법을 사용하게 하는 세균 독소 또는 접합체와 혼합될 적합한 보조제의 선택은 당업자의 지식 범위내에 있다. 적합한 보조제는 알루미늄 염, 예를 들어, 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄을 포함하지만, 또한 다른 금속 염, 예를 들어, 칼슘, 마그네슘, 철 또는 아연의 염일 수 있거나 아크릴화된 티로신 또는 아실화된 당, 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도체화된 사카라이드 또는 폴리포스파젠의 불용성 현탁액일 수 있다. 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 보조제로서 수산화알루미늄을 사용한다.

추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 면역자극 물질을 추가로 포함하고, 상기 자극 물질은 바람직하게 다가양이온 중합체, 특히, 다가양이온 펩타이드, 면역자극 올리고데옥시뉴클레오타이드 (ODN), 특히 올리고 (dIdC)13 (서열번호: 63), 적어도 2개의 LysLeuLys 모티프를 함유하는 펩타이드, 특히 펩타이드 KLKLLLLLKLK (서열번호: 61), 신경활성 화합물, 특히, 인간 성장 호르몬, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 프룬트 완전 또는불완전 보조제, 또는 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게, 면역자극 물질은 다가양이온 중합체 및 면역자극 데옥시뉴클레오타이드의 배합물 또는 적어도 2개의 LysLeuLys 모티프 및 면역자극 데옥시뉴클레오타이드를 함유하는 펩타이드의 배합물, 바람직하게 KLKLLLLLKLK (서열번호: 61) 및 올리고(dIdC)13 (서열번호: 63)의 배합물이다. 보다 바람직하게, 상기 다가양이온 펩타이드는 폴리아르기닌이다.

추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 6.7 +/- 0.2의 pH에서 인산나트륨, 염화나트륨, L-메티오닌, 슈크로스 및 폴리소르베이트-20 (Tween-20)을 포함한다. 바람직하게, 약제학적 조성물은 또한 바람직하게 0.15%의 농도에서 수산화알루미늄을 포함한다.

하나의 양태에서, 상기 제형은 5 mM 내지 50 mM 인산나트륨, 100 내지 200 mM의 염화나트륨, 5 mM 내지 25 mM L-메티오닌, 2.5% 내지 10%의 슈크로스, 0.01% 내지 0.1%의 Tween 20 및 0.1% 내지 0.2% (w/v) 수산화알루미늄을 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 제형은 pH 6.7 ± 0.2에서 10mM의 인산나트륨, 150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 L-메티오닌, 5%의 슈크로스, 0.05%의 Tween 20 및 0.15% (w/v)의 수산화알루미늄을 포함한다. 보다 더 바람직하게, 상기 제형은 본 발명에 따른 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개의 돌연변이체 OspA 이종이량체를 포함한다.

하나의 양태에서, 상기 약제학적 조성물은 3개의 이종이량체, 바람직하게 Lip-S1D1-S2D1 (서열번호: 29), Lip-S4D1-S3hybD1 (서열번호: 27) 및 Lip-S5D1-S6D1 (서열번호: 33)을 추가로 포함한다. 바람직하게, 3개의 이종이량체는 1:2:1, 1:3:1, 1:1:2, 1:1:3, 1:2:2, 1:2:3, 1:3:2, 1:3:3, 2:1:1, 2:1:2, 2:1:3, 2:2:3, 2:2:1, 2:3:1, 2:3:2, 2:3:3, 3:1:1, 3:1:2, 3:1:3, 3:2:1, 3:2:2, 3:2:3, 3:3:1, 3:3:2, 가장 바람직하게 1:1:1의 몰비로 혼합한다.

추가의 양태에서, 약제학적 조성물은 2개의 이종이량체, 바람직하게 Lip-S1D1-S2D1 (서열번호: 29) 및 Lip-S5D1-S6D1 (서열번호: 33), Lip-S1D1-S2D1 (서열번호: 29) 및 Lip-S4D1-S3hybD1 (서열번호: 27) 또는 Lip-S4D1-S3hybD1 (서열번호: 27) 및 Lip-S5D1-S6D1 (서열번호: 33)를 1:2, 1:3, 2:1, 3:1, 2:3, 3:2, 바람직하게 1:1의 몰비로 포함한다.

하나의 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 백신(본원에서 유전학적으로 "배합 약제학적 조성물 또는 백신"으로서 언급됨)은 보렐리아 또는 보렐리아 이외의 다른 병원체로부터 적어도 하나의 추가의 항원을 추가로 포함한다. 바람직한 양태에서, 적어도 하나의 추가의 항원은 라임병을 유발하는 보렐리아 종으로부터 유래된다. 다양한 측면에서, 적어도 하나의 추가의 항원은 또 다른 병원체, 바람직하게 진드기 매개 병원체로부터 유래된다. 추가의 측면에서, 병원체는 록키 마운틴 반점 열, 인간 과립세포 엘리히증 (HGE), 세네츠 열, 인간 단핵구 엘리히증 (HME), 아나플라스마증, 부톤네즈열, 리케치아 파케리 리케챠병, 남부 진드기 관련 발진 병 (STARI), 헬베티카 반점 열, 364D 리케챠 병, 아프리카 반점 열, 재발성 열, 야토병, 콜로라도 진드기 열, 진드기 매개 뇌염 (TBE, 또한 FSME로서 공지된), 크림반도-콩고 출혈 열, Q 열, Omsk 출혈 열, 키아사누르 숲 병, 포와산 뇌염, 중심지 바이러스 질환 또는 바베시아증을 유발한다. 추가의 측면에서, 상기 질환은 일본 뇌염이다.

추가의 양태에서, 적어도 하나의 추가의 항원은 보렐리아 헤름시 ( Borrelia hermsii), 보렐리아 파케리 ( Borrelia parkeri ), 보렐리아 두토니 ( Borrelia duttoni), 보렐리아 미야모토이 ( Borrelia miyamotoi ), 보렐리아 투리카타 ( Borrelia turicatae), 리케치아 리케트시 (Rickettsia rickettsii ), 리케치아 오스트랄리스 (Rickettsia australis), 리케치아 코노리 (Rickettsia conori ), 리케치아 헬베티카 , 프란시셀라 툴라렌시스 ( Francisella tularensis ), 아나플라스마 파고사이토필럼 (Anaplasma phagocytophilum ), 에흐를리키아 세네츠 ( Ehrlichia sennetsu ), 에흐를리키아 카펜시스( Ehrlichia chaffeensis ), 네오에흐를리키아 미쿠렌시스 (Neoehrlichia mikurensis ), 콕시엘라 부르네티 ( Coxiella burnetii ) 및 보렐리아 로네스타리(Borrelia lonestari ), 진드기 매개 뇌염 바이러스 (TBEV aka FSME 바이러스), 콜로라도 진드기 열 바이러스 (CTFV), 크림반도-콩고 출혈 열 바이러스 (CCHFV), Omsk 출혈 열 바이러스 (OHFV), 일본 뇌염 바이러스 (JEV) 및 바베시아 종을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 벡터 매개, 바람직하게는 진드기 매개 병원체로부터 유래한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물 및 상기된 바와 같은 추가의 항원을 포함하는 키트에 관한 것이고, 여기서, 적어도 하나의 추가의 항원은 제2 조성물에 포함되고, 특히, 여기서, 제2 조성물은 백신, 바람직하게 진드기 매개 뇌염 백신, 일본 뇌염 백신 또는 록키 마운틴 반점 열 백신이다. 제1 조성물은 또한 백신일 수 있다. 본 발명의 배합 약제학적 조성물 또는 백신은 적어도 제2 (백신) 조성물과 함께 본원에서 논의된 임의의 조성물을 포함한다. 일부 측면에서, 제2 백신 조성물은 벡터 매개 질환, 바람직하게 진드기 매개 질환으로부터 보호한다. 다양한 측면에서, 제2 백신 조성물은 보렐리아 감염 또는 라임 보렐리아증에 대한 면역화에 양립할 수 있는 계절에 따른 면역화 스케줄을 갖는다. 다른 측면에서, 배합 백신은 이들 질환이 만연된 지정학적 장소에서 사용하기 위한 다수 질환의 예방에 유용하다.

하나의 측면에서, 제2 조성물은 진드기 매개 뇌염 백신, 일본 뇌염 백신 및 록키 마운틴 반점 열백신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 백신이다. 바람직한 측면에서, 백신 조성물은 FSME-IMMUN^® (Baxter), Encepur^® (Novartis Vaccines), EnceVir^® (Microgen NPO) 또는 TBE Moscow Vaccine^® (Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides of Russian Academy of Medical Sciences)이다. 또 다른 바람직한 측면에서, 백신 조성물은 IXIARO^®/JESPECT^® (Valneva SE), JEEV^® (Biological E, Ltd.) 또는 IMOJEV^® (Sanofi Pasteur)이다.

백신인 약제학적 조성물이 추가로 제공되고 상기 백신은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 양태에서, 부형제는 L-메티오닌이다.

본 발명은 또한 면역원성 조성물을 포함한다. 일부 측면에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 본원에 논의된 임의의 조성물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 다양한 측면에서, 면역원성 조성물은 외부 표면 단백질 A(OspA) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도하는 성질을 갖는다. 특정 측면에서, 면역원성 조성물은 보렐리아에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도하는 성질을 갖는다. 특정 측면에서, 면역원성 조성물은 보렐리아를 중화시키는 항체의 생산을 유도하는 성질을 갖는다. 일부 측면에서, 상기 항체는 동물에 의해 생산된다. 추가의 측면에서, 상기 동물은 포유동물이다. 보다 추가의 측면에서, 포유동물은 인간이다.

본 발명의 약제학적 조성물을 함유하는 백신 제제는 상기 백신을 전신 또는 점막 경로를 통해 투여함에 의해 보렐리아 감염에 민감한 포유동물을 보호하거나 보렐리아 감염을 갖는 포유동물을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이들 투여는 근육내, 복강내, 피내 또는 피하 경로를 통한 주사를 통해 또는 경구/소화관, 호흡기또는 비뇨생식관을 통한 주사를 포함할 수 있다. 본 발명의 백신이 단일 용량으로 투여될 수 있지만 이의 성분들은 또한 동시에 또는 상이한 시점에 함께 공동 투여될 수 있다.

본 발명의 하나의 측면에서 임의로 동결건조된 형태로 본 발명의 약제학적 조성물을 함유하는 바이알을 포함하고 본원에 기재된 바와 같은 보조제를 함유하는 바이알을 추가로 포함하는 백신 키트가 제공된다. 본 발명의 상기 측면에서 보조제는 동결건조된 면역원성 조성물을 재구성하기 위해 사용되는 것으로 고려된다. 추가의 측면에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 바이알, 바람직하게는 시린지에 예비 혼합될 수 있다.

본 발명의 추가의 측면은 대상체에게 치료학적 유효량의 본 발명의 의 폴리펩타이드, 본 발명의 핵산, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 보렐리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법이다.

본 발명의 추가의 측면은 대상체에게 치료학적 유효량의 본 발명의 폴리펩타이드, 본 발명의 핵산, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상체를 면역화시키는 방법이다.

여전히 추가의 측면은 동물 또는 인간에게 본 발명의 폴리펩타이드, 본 발명의 핵산, 본 발명의 항체 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 보렐리아 유기체로 동물 또는 인간을 면역화시키기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 유효량은 상기 동물 또는 인간에서 면역 반응을 유발하기에 적합하다.

여전히 또 다른 측면은 동물 또는 인간에게 유효량의 본 발명의 폴리펩타이드, 본 발명의 핵산, 본 발명의의 항체 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 보렐리아 유기체에 대하여 동물 또는 인간에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 유효량은 상기 동물 또는 인간에서 면역 반응을 자극하기에 적합하다.

바람직하게, 상기 보렐리아 유기체는 B. 부르그도르페리 , 특히 B. 부르그도르페리 s.s., B. 가리니, B. 아프젤리 , B. 안데르소니 , B. 바바리엔시스 , B. 비세티 , B. 발라이시아나 , B. 루시타니아 , B. 스피엘마니 , B. 자포니카, B. 타누키 , B. 투르디 또는 B. 시니카 , 바람직하게 B. 부르그도르페리 s.s. B. 아프젤리 또는 B. 가리니를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.

하나의 양태에서, 숙주에게 본 발명의 약제학적 조성물 또는 백신 또는 키트의 면역보호 능력을 투여함을 포함하는, 보렐리아 감염의 1차 및/또는 재발 에피소드를 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명의 추가의 측면은 보렐리아 병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물이다. 하나의 양태에서, 보렐리아 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 추가의 측면은 보렐리아 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약물의 제조에 있어서 본 발명의 약제학적 조성물 또는 백신 또는 키트의 용도이다. 하나의 양태에서, 보렐리아 감염의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물이 제공된다.

본 발명은 또한 대상체에서 면역학적 반응을 유도하기 위한 방법을 포함한다. 다양한 측면에서, 상기 방법은 면역학적 반응을 유도하기 위한 유효량으로 본원에 논의된 임의의 면역원성 조성물 또는 백신 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, 면역학적 반응은 항-OspA 항체의 생산을 포함한다.

본 발명은 대상체에서 보렐리아 감염 또는 라임 보렐리아증을 예방하거나 치료하기 위한 방법을 포함한다. 다양한 측면에서, 상기 방법은 보렐리아 감염 또는 라임 보렐리아증을 예방하거나 치료하기 위한 유효량으로 본원에 논의된 임의의 백신 조성물 또는 임의의 배합 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 약물을 제조하기 위한 본 발명의 폴리펩타이드, 핵산, 항체, 약제학적 조성물 또는 백신의 용도를 포함한다. 본 발명에서 다른 관련 측면이 또한 제공된다.

본원에서 용어 "포함하는", "포함한다(comprise)" 및 "포함한다(comprises)"는 발명자에 의해 임의로 각각 모든 경우에 용어 "로 이루어진(consisting of)", "로 이루어진다(consist of) 및 "로 이루어진다(consists of)"로 대체될 수 있는 것으로 의도된다. 용어 "포함한다(comprises)"는 "포함한다(includes)"를 의미한다. 따라서, 달리 문단에서 요구되지 않는 경우, 용어 "포함한다(comprises)", 및 변형어구, 예를 들어 "포함한다(comprise)" 및 "포함하는"은 진술된 화합물 또는 조성물(예를 들어, 핵산, 폴리펩타이드, 항체) 또는 단계, 또는 화합물들 또는 단계들 그룹의 내포를 의미하는 것이고 임의의 다른 화합물, 조성물, 단계들 또는 이의 그룹들을 배제하는 것이 아닌 것으로 이해된다. 약어 "예를 들어(e.g.)"는 라틴어(Latin exempli gratia)로부터 유래하고, 본원에서 비제한적인 예를지적하기 위해 사용된다. 따라서, 약어 "예를 들어(e.g.)"는 용어 "예를 들어(for example)"와 동의어이다.

본 발명의 "백신 조성물"에 관한 본원의 양태는 또한 본 발명의 "약제학적 조성물"에 관한 양태에 적용될 수 있고 그 반대일 수 있다.

달리 설명되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본원이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.

분자 생물에서 통상적인 용어의 정의는 문헌[참조: Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew 등 (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1 -56081 -569-8)]에서 찾을 수 있다.

단수 용어 "a", "an", 및 "the"는 달리 명백하게 지시되지 않는 경우 복수의 개념을 포함한다. 유사하게, 용어 "또는"은 달리 명백히 지시되지 않는 경우 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "복수"는 2개 이상을 언급한다. 추가로, 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 주어진 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 대략적이고 기재를 위해 제공된 것으로 이해되어야만 한다. 추가로, 항원과 같은 물질의 농도 또는 수준과 관련하여 주어진 수치 제한값은 대략적일 수 있다.

다양한 양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 본 발명에 따른 핵산 분자에 대한 바람직한 담체 또는 부형제는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 이의 암호화 핵산 분자에 대한 면역 반응을 추가로 자극하기 위한 보조제와 같은 면역자극 화합물이다.

보조제 또는 면역자극 화합물은 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 약제학적 조성물에서 면역자극 화합물은 다가양이온 물질, 특히 다가양이온 펩타이드, 면역자극 핵산 분자, 바람직하게 면역자극 데옥시뉴클레오타이드, 수중유 또는 유중수 에멀젼, MF59, 알루미늄 염, 프룬트 완전 보조제, 프룬트 불완전 보조제, 신경활성 화합물, 특히 인간 성장 호르몬 또는 이의 배합의 그룹으로부터 선택된다.

수산화알루미늄 및/또는 인산알루미늄 보조제의 사용이 특히 바람직하고 항원은 일반적으로 이들 염에 흡착된다. 바람직하게, 수산화알루미늄은 0.15%의 최종 농도로 존재한다. 유용한 인산알루미늄 보조제는 무정형 알루미늄 하이드록시포스페이트이고 PO₄/Al 몰비는 0.84 내지 0.92이다. 본 발명에 유용한 또 다른 보조제는 수성 조성물의 중량을 기준으로 350ppb 미만의 중금속을 갖는 수성 조성물을 제공할 수 있는 알루미늄 염이다. 추가의 유용한 알루미늄계 보조제는 수산화알루미늄과 모노포스포릴 지질 A(MPL)의 배합물인 AS04이다.

또한, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 적어도 임의의 하기의 화합물 또는 이의 배합물을 포함하는 약제학적 조성물이다: 본 발명에 따른 핵산 분자, 광범위한 양태에서 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 본 발명에 따른 벡터, 본발명에 따른 세포 및 본 발명에 따른 항체. 이와 관련하여, 임의의 이들 화합물은 세포, 조직 또는 유기체와 함께 사용하기 위한 대상체에게 투여하기 위해 적합한 약제학적 담체와 같은 비-멸균성 또는 멸균성 담체 또는 담체들과 함께 사용될 수 있다. 상기 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이의 배합물을 포함할 수있지만 이에 제한되지 않는다. 상기 제형은 투여 방식에 적합해야만 한다.

하나의 양태에서, 약제학적 조성물은 안정화제를 포함한다. 용어 "안정화제"는 가열 또는 동결 동안에 일어나고/나거나 안정하고 면역원성 병태 또는 상태에서 면역원성 조성물의 안정성 또는 저장 수명을 연장하는 것들과 같이 역 조건으로부터 백신의 면역원성 조성물을 보호하는 물질 또는 백신 부형제를 언급한다. 안정화제의 예는 당, 예를 들어, 슈크로스, 락토스 및 만노스; 당 알코올, 예를 들어, 만니톨; 아미노산, 예를 들어, 글라이신 또는 글루탐산; 및 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 겔라틴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물은 예를 들어, 무엇보다 국소 투여, 경구 투여, 항문, 질내, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비내, 기관내 또는 피내 경로에 의한 투여를 포함하는 임의의 효과적인 간편한 방식으로 투여될 수 있다. 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 피하 또는 근육내, 가장 바람직하게는 근육내 투여된다. 치료요법에서 또는 예방제로서, 본 발명의 약제학적 조성물의 활성제는 예를 들어, 멸균 수성 분산제, 바람직하게는 등장성 제제로서 주사가능한 조성물로서 개체에게 투여될 수 있다.

대안적으로, 상기 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물은 예를 들어, 연고, 크림, 로션, 안연고, 안 적가제, 귀 적가제, 구강세척제, 침윤된 드레싱 및 봉합 및 에어로졸 형태의 국소 적용을 위해 제형화될 수 있고, 예를 들어, 보존제, 약물 침투를 원조하기 위한 용매 및 연고 및 크림에서 연화제를 포함하는 적당한 통상적인 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 국소 제형은 또한 양립가능한 통상적인 담체, 예를 들어, 크림 또는 연고 기제 및 로션용 에탄올 또는 올레일 알코올을 함유할 수 있다. 상기 담체는 제형의 약 1중량%에서 약 98중량%를 구성할 수 있고, 보다 일반적으로 이들은 제형의 약 80중량%까지 구성할 것이다.

상기된 치료요법에 추가로, 본 발명의 조성물은 일반적으로 상처 조직에 노출된 매트릭스 단백질로의 세균의 접착을 차단하기 위한 상처 치료제로서 또는 항생제 예방에 대한 대안으로서 또는 이와 함께 치과 치료에 예방용으로 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 약제학적 조성물은 백신 조성물이다. 바람직하게, 상기 백신 조성물은 간편하게 주사가능한 형태이다. 통상적인 보조제는 면역 반응을 증진시키기 위해 사용될 수 있다. 단백질 항원과의 백신 접종을 위해 적합한 단위 용량은 성인에 대해 kg 체중 당 0.02 μg 내지 3 μg 항원이고 어린이에 대해서는 kg 체중 당 0.2 μg 내지 10 μg 항원이고 상기 용량은 바람직하게 2 내지 24주 간격으로 1 내지 3 회 투여된다.

지적된 용량 범위에서, 적합한 개체에게 이들의 투여를 불가능하게 할 어떠한 역 독성학적 효과도 본 발명의 화합물과 함께 예상되지 않는다.

추가의 측면으로서, 본 발명은 대상체에게 투여하기 위한 이의 용도를 용이하게 하는 방식으로 팩키지된, 대상체에게 투여하기 위한 하나 이상의 약제학적 제형을 포함하는 키트를 포함한다. 바람직한 양태에서, 상기 키트는 2mL의 최종 용적, 보다 바람직하게는 1mL의 최종 용적으로 제형을 포함한다.

특정 양태에서, 본 발명은 단일 용량 투여 단위를 생산하기 위한 키트를 포함한다. 다양한 측면에서 키트 각각은 건조된 단백질을 갖는 제1 컨테이너 및 수성 제형을 갖는 제2 컨테이너 둘 모두를 함유한다. 또한, 본 발명의 범위내에 단일 및 다중 챔버의 예비 충전된 시린지(예를 들어, 액체 시린지 및 동결 시린지)를 함유하는 키트가 포함된다.

또 다른 양태에서, 상기 키트는 컨테이너에 부착된 라벨과 함께 밀봉된 병 또는 용기와 같은 컨테이너에 팩키징되거나 상기 방법을 실행하는데 있어서 화합물 또는 조성물의 용도를 기재하는 팩키지에 함유되는 본원에 기재된 약제학적 제형(예를 들어, 치료학적 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 조성물)을 포함한다. 하나의 양태에서, 약제학적 제형은 컨테이너에 헤드공간의 양(예를 들어, 액체 제형과 컨테이너 상부간의 공기의 양)이 매우 작도록 컨테이너에 팩키징된다. 바람직하게, 헤드공간의 양은 무시할만하다(즉, 거의 없다).

하나의 측면에서, 키트는 치료학적 단백질 또는 펩타이드 조성물을 갖는 제1 컨테이너 및 조성물에 대한 생리학적으로 허용되는 재구성 용액을 갖는 제2 컨테이너를 포함한다. 하나의 측면에서, 약제학적 제형은 단위 투여 형태로 팩키징된다. 키트는 임의로 특정 투여 경로에 따른 약제학적 제형을 투여하기 위해 적합한 장치를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 상기 키트는 약제학적 제형의 용도를 기재하는 라벨을 포함한다.

약제학적 조성물은 특정 범위의 상이한 항원을 함유할 수 있다. 항원의 예는 완전 사멸되거나 약독화된 유기체, 이들 유기체의 준분획물, 단백질, 또는 이의 가장단순한 형태의 펩타이드이다. 항원은 또한 당화된 단백질 또는 펩타이드 형태의 면역 시스템에 의해 인지될 수 있고 또한 폴리사카라이드 또는 지질이거나 이를 함유할 수 있다. 세포독성 T 세포 (CTL)는 짧은 형태의 항원, 통상적으로 길이가 8 내지 11개인 아미노산이고 주요 조직적합성 복합체(MHC)와 연계된 펩타이드를 인지하기 때문에 짧은 펩타이드가 사용될 수 있다. B 세포는 3차원 구조(형태적 에피토프) 뿐만 아니라 4 내지 5개 아미노산의 짧은 선형 에피토프를 인지할 수 있다.

바람직한 양태에서, 또 다른 측면의 약제학적 조성물은 보렐리아 단백질 또는 활성 단편 또는 이의 변이체, 예를 들어 WO2008/031133에 기재된 바와 같은 항원, 단편 및 변이체에 대한 과면역 혈청 반응성 항원을 추가로 포함한다.

본 발명에 따라, 또 다른 측면에 따른 약제학적 조성물은 약물로서 특히, 보렐리아에 의해 유발되거나 이와 연계되어나 관련된 질환 또는 질환 병태와 관련하여 특히 백신으로서 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 특히 보렐리아, 보다 바람직하게는 임의의 병원성 보렐리아 종과 결합되어 또는 연관되어 유발되는 질환 또는 질환 병태와 관련하여 및 보다 바람직하게는 보렐리아 감염, 특히 B. 부르그도르페리 s.s., B. 가리니, B. 아프젤리 , B. 안데르소니 , B. 바바리엔시스 , B. 비세티 , B. 발라이시아나 , B. 루시타니아 , B. 스피엘마니 , B. 자포니카, B. 타누키 , B. 투르디 또는 B. 시니카 감염, 바람직하게 B. 부르그도르페리 s.s., B. 아프젤리 또는 B. 가리니 감염.

이와 관련하여, B. 부르그도르페리 s.l.,를 포함하는 다양한 보렐리아 종은 본원에 기재된 것들을 포함하는 여러 종 및 균주를 포함하는 것으로 주지해야 한다. 본 발명에 따라 예방되고/되거나 치료될 세균 감염과 관련되거나, 유발되거나 관련된 질환은 라임보렐리아증(라임병)을 포함한다. 추가의 측면에서, 또한 도입부에서 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 질환을 앓는 특정 그룹의 환자들 뿐만 아니라 라임 보렐리아증의 증상, 단계 및 서브그룹은 본원에서 참조로서 인용된다. 보다 구체적으로, 라임 보렐리아증은 일반적으로 각각의 단계에서 상이한 임상적 증상과 함께 차도 및 악화를 갖는 단계에서 일어난다. 조기 감염 단계 1은 피부의 국소 감염, 이어서 수일 또는 수주 이내에 단계 2의 파종성 감염 및수개월 내지 수년 후에 단계 3의 지속적 감염으로 이루어진다. 그러나, 상기 감염은 가변적이고; 일부 환자들은 단지 피부의 국소화된 감염을 갖고 다른 환자들은 단지 관절염과 같은 병의 후반 증상을 나타낸다.

제4 측면에서, 본 발명은 대상체에게 제3 측면에 따른 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 보렐리아 감염을 치료하거나 예방하기 위한 방법에 관한 것이다.

용어 "대상체"는 본원 명세서 전반에 걸쳐 본 발명에 따른 치료 또는 방법이 제공되는 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간을 기재하기 위해 사용된다. 예를 들어, 인간 환자와 같은 특이적인 동물에 대해 특이적인 감염, 병태 또는 질환상태의 치료를 위해, 용어 환자는 특정 동물을 언급한다. 바람직하게, 대상체는 인간이지만 상기 조성물의 의학적 용도는 또한 닭, 칠면조, 오리 또는 거위를 포함하는 가금류와 같은 동물, 말, 소 또는 양과 같은 가축 또는 개 또는 고양이와 같은 반려 동물을 포함할 수 있다.

용어 "유효량"은 본 발명의 방법에 사용되는 경우 의도된 결과를 유도하기 위해 사용될 수 있는 본 발명의 약제학적 조성물의 양을 기재하기 위해 본원 명세서 전반에 걸쳐 사용된다. 본 발명의 많은 측면에서, 용어 유효량은 치료 또는 예방과 관련하여 사용된다. 다른 측면에서, 용어 유효량은 단순히 본 발명에 따른 방법에서 보렐리아 감염의 치료 또는 예방이 요구되는 경우를 포함하는, 이롭거나 유용한 것으로서 보이는 결과를 생성하는 제제의 양을 언급한다.

본원에 기재된 화합물 및 조성물과 관련된 용어 유효량은 본원 명세서 전반에 걸쳐 특히 보렐리아-관련 질환을 앓는 인간 환자를 포함하는 포유동물 환자에게 보렐리아 감염을 감소시키거나 억제하기 위해 투여되는 본 발명에 따른 화합물의 양을 기재하기 위해 사용된다.

바람직한 양태에서, 상기 측면에 따른 대상체를 면역화시키는 방법은 본 발명의 제3 측면의 치료학적 유효량의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

상기 방법은 질환이 개체내에서 이미 확립되었는지의 여부에 상관없이 상기 개체를 질환으로부터보호하기 위해 항체 또는 세포-매개된 T 세포 반응, 사이토킨-생산 T 세포 또는 세포독성 T세포를 생산하도록 면역학적 반응을 자극하기 위해 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 핵산을 생체내 투여함에 의해 유전자 치료요법 또는 다른 방법을 통한 개체에서의 면역학적 반응을 유도함을 포함한다.

본 발명의 생성물, 특히 폴리펩타이드 및 핵산은 바람직하게 분리된 형태로 제공되고 균일하게 정제될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "분리된"은 이의 천연 상태로부터 "인간의 손"에 의해 분리된 것을 의미하고; 즉, 이것이 천연에 존재하는 경우, 이의 본래의 환경으로부터 변화되거나 제거되거나 이의 둘 모두를 의미한다. 예를 들어, 천연적으로 존재하는 핵산 분자 또는 이의 천연 상태로 생유기체에 천연적으로 존재하는 폴리펩타이드는 "분리된" 것이 아니지만 이의 천연 상태의 공존 물질로부터 분리된 동일한 핵산 분자 또는 폴리펩타이드는 용어가 본원에 사용된 바와 같이 "분리된" 것이다. 하기 분리의 일부로서, 상기 핵산 분자는 융합 유전자를 형성하는 돌연변이 유발을 위해 그리고예를 들어, 숙주에서 증식 또는 발현을 위한 DNA 분자와 같은 다른 핵산 분자에 연결될 수 있다. 단독의 또는 벡터와 같은 다른 핵산 분자에 연결된 분리된 핵산 분자는 배양물 또는 전체 유기체에서 숙주 세포에 도입될 수 있다. 배양물에서 숙주 세포 또는 전체 유기체 중에 도입된 상기 DNA 분자는 이들이 천연적으로 존재하는 형태 또는 환경에 있지 않기 때문에 상기 용어가 본원에 사용된 바와 같이 분리된다. 유사하게, 핵산 분자 및 폴리펩타이드는 예를 들어, 천연 조성물에 존재하지 않고 본원에서 이것이 본원에서 사용된 바와 같은 용어의 의미내에서 분리된 핵산 분자 또는 폴리펩타이드를 유지하는 화학적 또는 효소적 반응을 위해 예를 들어, 세포, 조성물 또는 용액으로 핵산 분자 또는 폴리펩타이드의 도입을 위한 용액인 배지 제형과 같은 조성물 중에 존재할 수 있다.

본 발명은 이들이 다양할 수 있기 때문에 본원에 기재된 바와 같은 특정 방법, 프로토콜 및 시약에 제한되지 않는다. 추가로, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 양태를 기술할 목적인 것이고 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 본원 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an", 및 "the"는 달리 명백하게 지시되지 않는 경우 복수 언급을 포함한다. 유사하게, 용어 "포함한다 ", "함유한다 " 및 "포괄한다"는 배타적이기 보다는 포괄적인 것으로 해석되어야만 한다.

달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어 및 임의의 동의어는 본 발명의 기술 분야에서 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 수행에서 사용될 수 있지만 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있다.

본 발명은 추가의 특징, 양태 및 잇점이 취해질 수 있는 하기의 도면, 표, 실시예 및 서열 목록에 의해 추가로 설명된다. 이와 같이, 논의된 특정 변형은 본 발명의 범위에 대한 제한으로서 해석되지 말아야 한다. 다양한 등가물, 변화 및 변형이 본 발명의 범위로부터 벗어나는 것 없이 가해질 수 있다는 것은 자명할 것이고 따라서 상기 등가 양태가 본원에 포함되어야 하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명과 관련하여
도 1은 B. 발라이시아나, 균주 VS116의 아미노산 125번 내지 176번, 및 B. 가리니, 균주 PBr의 아미노산 177번 내지 274번으로 이루어지고, 디설파이드 결합이 도입된 (S3hybD1) 본 발명의 돌연변이 융합 OspA 단편 뿐만 아니라 혈청형 1-혈청형 6 및 B. 발라이시아나 OspA (S1D1-S6D1 및 BvaD1)의 디설파이드 결합 안정화된 단편의 정전위 수준 세트를 보여준다.
도 2는 이종이량체 단백질 Lip-S4D1-S3D1과 본 발명의 돌연변이 혈청형 3 OspA 융합 단편-함유 이종이량체 단백질인 Lip-S4D1-S3hybD1의 아미노산 정렬을 보여준다.
도 3은 도식적으로 본 발명에 따른 돌연변이체 OspA 단편 이종이량체의 생산을 보여준다.
도 4는 도식적으로 Lip-S4D1-S3hybD1을 포함하는 3개의 상이한 돌연변이체 OspA 이종이량체를 포함하는 "개선된 배합 백신"인 본 발명의 약제학적 조성물의 폴리펩타이드 성분들을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 지질화된 폴리펩타이드의 N-말단에서 발견되는 바와 같이 지방산 치환된 시스테인의 예인 Pam₃Cys의 화학적 구조를 보여준다.
도 6은 본 발명의 개선된 이종이량체 배합 백신을 사용한 면역화에 응답하여 마우스에서 생성된 혈청형 1-6의 보렐리아 OspA 단백질에 대한 IgG 항체 역가를 보여준다.
도 7은 본 발명의 개선된 이종이량체 배합 백신으로 면역화된 마우스 기원의 항체의 OspA 혈청형 1-6의 보렐리아 스피로헤타의 세포 표면으로의 결합을 보여준다.
표 1은 Lip-S4D1-S3hybD1 이종이량체와 Lip-S4D1-S3D1 이종이량체의 정제 수율을 비교한다.
표 2는 OspA 혈청형 1, 2, 5 및 6 보렐리아를 사용한 생체내 챌린지에 대한 본 발명의 개선된 이종이량체 배합 백신의 보호 능력을 보여준다.

본원 명세서에 언급될 수 있는 도면 및 표는 보다 상세하게 하기에 기재한다.

도 1 디설파이드-결합-안정화된 융합 OspA 단편 (S3hybD1) 뿐만 아니라 혈청형 1-6 (S1D1-S6D1) 및 B. 발라이시아나 (BvaD1)로부터 디설파이드-결합-안정화된 OspA 단편의 정전위 시뮬레이션. 수준 세트 (+/- 1 kT/e)는 고체 표면으로서 음전하에 대해서는 밝은 색상이 양전하에 대해서는 어두운 색이다. 용매-접근가능한 표면은 와이어프레임으로서 나타낸다. 백색 화살표는 이소형 3 단편의 동일한 평판상에서 정전기 극성을 유발하는 2개의 확대된 클러스터의 위치를 지적한다. 하이브리드 OspA C-말단 단편의 표면이 S3D1 단량체로서 확대된 정전기 극성 클러스터를 소유하지 않는 것으로 보일 수 있다.

도 2 컨센서스 서열을 보여주는 Lip-S4D1-S3hybD1 및 Lip-S4D1-S3D1 이종이량체 폴리펩타이드의 아미노산 서열 정렬. Lip-S4D1-S3hybD1 이종이량체는 총 31개 아미노산 만이 Lip-S4D1-S3D1 이종이량체와 상이하다.

도 3 보렐리아 종 또는 하이브리드 돌연변이체 OspA C-말단 단편의 상이한 OspA 혈청형으로부터 선택되는 2개의 돌연변이 OspA C-말단 단편을 포함하는 본 발명의 돌연변이체 OspA 이종이량체의 생산 (A) 지질화된 돌연변이체 OspA 이종이량체를 암호화하는 핵산의 도식적 표시. 5'에서 3'로의 성분은 지질화 신호 서열(Lip 신호), N-말단 지질화에 대한 CSS 펩타이드, 2개의비-천연 시스테인을 갖는 OspA의 돌연변이체 C-말단 단편, 짧은 링커 펩타이드(LN1)에 이어서 2개의 비-천연 시스테인을 갖는 제2 돌연변이체 OspA C-말단 단편에 대한 암호화 서열을 포함한다. (B) 중간체 돌연변이체 OspA 이종이량체 폴리펩타이드는 핵산 작제물의 해독 직후 순수 생성물을 포함한다. N-에서 C-말단으로, 상기 폴리펩타이드는 지질화 신호 서열 (Lip 신호), 지질화를 위한 CSS 펩타이드, 비-천연 디설파이드 결합을 갖는 돌연변이체 OspA 단편, 짧은 링커 펩타이드 (LN1)에 이어서 비-천연 디설파이드 결합을 갖는 제2 돌연변이체 OspA 단편으로 이루어진다. (C) 해독후 변형후 최종 지질화된 돌연변이체 OspA 이종이량체 폴리펩타이드 N-말단에서 C-말단으로 이종이량체는 N-말단 시스테인이 지질화된 CSS 펩타이드, 디설파이드 결합에 의해 안정화된 돌연변이체 OspA 단편, 링커 펩타이드 (LN1), 및 디설파이드 결합에 의해 안정화된 제2 돌연변이체 OspA 단편으로 이루어진다. 지질화 신호 서열은 보여지는 바와 같이 폴리펩타이드의 해독후 변형 동안에 절단 제거된다.

도 4 본 발명에 따른 바람직한 약제학적 조성물의 예. 상이한 보렐리아 OspA 혈청형 또는 하이브리드 돌연변이체 OspA C-말단 단편 (S3hybD1)으로부터 선택되는 2개의 돌연변이된 OspA 단편을 각각 포함하는 3개의 돌연변이체 OspA 이종이량체는 6개의 상이한 보렐리아 OspA 혈청형 기원의 OspA 항원을 함께 제공하는 조성물에 존재한다. 상기 약제학적 조성물은 6개의 보렐리아 혈청형에 대한 동시 면역화를 가능하게 한다.

도 5 본 발명의 지질화된 돌연변이체 OspA 단편 이종이량체의 예 뿐만 아니라 전장 야생형 OspA 단백질의 N-말단 시스테인의 지방산 치환의 예인 Pam₃Cys의 화학적 구조의 도해. 본 발명의 전장 OspA 단백질 또는 폴리펩타이드의 해독후 변형 동안에, N-말단 지질화 신호서열은 절단 제거되고 지방산인 가장 통상적인 3개의 팔미토일 모이어티 ("Pam₃")는 N-말단 시스테인 잔기에 효소적으로 공유적으로 부착되어 있다(황 원자, "S"는 화살표로 나타낸다). Pam₃Cys 잔기로부터 C-말단에 위치한 폴리펩타이드 쇄의 잔여 잔기는 "Xn"으로 나타낸다.(문헌 참조: Modified from Bouchon, 등 (1997) Analytical Biochemistry 246: 52-61.)

도 6 전장 OspA 단백질의 모든 6개 혈청형에 대해 생성된 항체 역가. 마우스는 지적된 배합 백신의 각각 3 μg으로 3회 면역화시켰다: 2주 간격으로 함께 1:1:1 비율의 Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3D1 및 Lip-S5D1-S6D1 ("Het 콤보"); 함께 1:1:1 비율의 Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3hybD1 및 Lip-S5D1-S6D1 ("개선된 het 콤보") 또는 함께 1:1:1 비율의 Lip-Chimeric OspA ST1/ST2-His, Lip-키메라 OspA ST5/ST3-His 및 Lip-키메라 OspA ST6/ST4-His ("키메라 콤보") 및 혈청을 마지막 투여 후 1주째에 수거하였다. 전장 OspA 단백질의 6개의 상이한 혈청형에 대한 IgG 항체의 역가는 ELISA로 결정하였다.

도 7 면역화된 마우스 기원의 항체의 보렐리아 스피로헤타의 세포 표면으로의 결합. 마우스는 상기와 같이 면역화시키고 혈청은 마지막 투여 후 1주째에 수거하고 풀링하였다. 혈청의 연속 희석물은 세포 염색 및 유동 세포측정을 통한 보렐리아 스피로헤타의 세포 표면에 결합하는 것에 대해 시험하였다. 단독의 Al(OH)3 보조제 단독으로 면역화된 대조군 마우스로부터 수거된 혈청으로 염색하는 경우 관찰되는 형광 강도 값은 비-특이적 결합을 설명하기 위해 공제하였다. 결합 분석에 사용되는 (보렐리아는 다음과 같았다: B. 부르그도르페리, OspA 혈청형 1, 균주 N40; B. 아프젤리, OspA 혈청형 2, 균주 PKo; B. 가리니, OspA 혈청형 3, 균주 Fr; B. 바바리엔시스, OspA 혈청형 4, 균주 Fin; B. 가리니, OspA 혈청형 5, 균주 PHei; B. 가리니, OspA 혈청형 6, 균주 KL11.)

실시예

실시예 1. 하이브리드 혈청형 3 OspA C-말단 단편의 분자 모델링

하이브리드 OspA ST3-C 말단 단편을 작제하기 위한 동기

본원 이전의 출원 (WO2014/006226)에 기재된 바와 같은 라임 보렐리아증 배합 백신은 3개의 돌연변이체 OspA 이종이량체로 구성된다. C-말단 도메인으로부터 유래된 2개의 상이한 OspA 혈청형(ST) 기원의 짧은 안정화된 단편은 짧은 링커와 융합시켜 이종이량체를 형성한다. 3개의 이종이량체는 OspA ST1-ST2, ST4-ST3 및 ST5-ST6으로 구성된다. 이종이량체의 면역원성의 개선을 위해, 지질화를 위한 신호 서열은 지질단백질인 성숙한 전장 OspA와 유사하게 첨가한다.

상기 지질화된 이종이량체는 OspA ST4-ST3 (Lip-S4D1-S3D1; 서열번호: 31)으로 구성되고 2개의 다른 이종이량체 보다 가용성이 덜하여 정제 동안에 회수율이 낮은 것으로 입증되었다. 상기 문제점은 대부분 지질화된 단량체로서 상기 단백질이 발현되고 정제될 수 없기 때문에 짧은안정화된 OspA ST3 부분 때문일 수 있다.

분자 모델링

안정화된 단량체의 비교 구조 조사는 인 실리코로 착수하여 OspA 결정 구조와 비교되는 단량체 모델간의 폴딩의 적합성을 해명하고(PDB:1OSP; Li H, Dunn JJ, Luft BJ, Lawson CL (1997) Crystal structure of Lyme disease antigen outer surface protein A complexed with an Fab. Proc Natl Acad Sci 94: 3584-3589) 이들의 표면 성질을 ST3형 단량체와 비교하였다. 상기 결정 구조는 보렐리아 부르그도르페리 B31의 혈청형 1을 나타내고, 쥐 항체 Fab 184.1로 N-말단으로 결합된 OspA를 보여준다. 6개의 짧은 안정화된 OspA 단량체의 유사성 구조 모델은 ST1 OspA 결정 구조 및 가용한 유사성 모델로 시작하여 작제하였고(문헌참조: SwissModel; Kiefer F, Arnold K, Kunzli M, Bordoli L, Schwede T (2009) The SWISS-MODEL Repository and associated resources. Nucleic Acids Res 37: D387-392), 이어서 안정화 디설파이드 결합 및 적용되는 경우 서열 변화를 혼입하도록 변형시켰다(The PyMOL Molecular Graphics System, Version Open-Source, Schrodinger LLC).

모든 6개 짧은 안정화된 OspA 단량체의 정전위 수준 세트는 적응성 포외송 볼츠만 솔버로 자극하여(APBS; Baker NA, Sept D, Joseph S, Holst MJ, McCammon JA (2001) Electrostatics of nanosystems: application to microtubules and the ribosome. Proc Natl Acad Sci 98: 10037-10041, pdb2pqr; Dolinsky TJ, Czodrowski P, Li H, Nielsen JE, Jensen JH, 등 (2007) PDB2PQR: expanding and upgrading automated preparation of biomolecular structures for molecular simulations. Nucleic Acids Res 35: W522-525), 짧은 안정화된 OspA ST3 단백질이 짧은 안정화된 OspA ST3의 용해도 문제를 설명할 수 있는 다른 OspA ST로부터 이탈하는 표면 정전기에서 패턴을 갖는지를 결정한다 ("S3D1", 도 1). 전하 분포에서 중요한 극성은 S3D1의 한쪽 측면상에서 관찰되었고(화살표 참조) 이는 임의의 다른 짧은 안정화된 OspA ST에서 관찰되지 않았다.

정전위 자극은 또한 B. 발라이시아나 ("BvaD1", 도 1) 기원의 짧은 안정화된 OspA로 수행하였다. BvaD1 OspA 단편은 표면상의 정전위 수준 세트의 변이체 극성을 나타내고 이는 이것이 S3D1에서 발견된 바와 같이 연장된 정전기 극성의 임의의 상당한 연장된 클러스터를 보여주지 않는 전체 표면을 변형시킬 목적으로 부분적 절편 교환을 위한 잠재력 있는 후보 빌딩 블록이게 하였다. 하이브리드 단량체에서 혈청형 3 부분과 B. 발라이시아나로부터 교환된 부분간의 바람직한 연결은 전체 폴딩 유지하에 단량체의 N-말단 베타-쉬트를 대체하고 혈청형 3 부분의 적어도 2개의 베타 쉬트 및 C-말단 나선구조가 온전한 상태로 유지되도록 하기 위해 선택되었다. 후자 조건은 분자의 코어 내에서 긴밀하게 팩킹된 소수성 잔기들의 입체적 양립성에 크게 의존한다. 하이브리드 안정화된 단량체, S3hybD1의 모델을 위한 폴딩 양립성은 분자 기계 시뮬레이션으로 입증하였다 (문헌참조: Gromacs; Pronk S, Pall S, Schulz R, Larsson P, Bjelkmar P, 등 (2013) GROMACS 4.5: a high-throughput and highly parallel open source molecular simulation toolkit. Bioinformatics 29: 845-854).

하이브리드 OspA 단편을 함유하는 이종이량체 형태의 적용

정전위 시뮬레이션의 결과로서, B. 발라이시아나 및 B. 가리니 (S3hybD1, 도 1) 기원의 단편 OspA 단백질의 실험적 융합체 함유하는 새로운 이종이량체를 클로닝하였다: Lip-S4D1-S3hybD1. Lip S4D1-S3D1과 비교하여 이종이량체 S4D1-S3hybD1에서 혈청형 3 OspA 단편의 제1 3분의 1의 변화에 추가로, OspA ST3의 위치 233번에서 아미노산 치환 (P233T, 미성숙 전장 OspA에 따른 아미노산 명명; 서열번호: 8)을 도입하였다.

하기에 추가로 상세히 설명된 바와 같이, 상기 새로운 이종이량체는 마우스를 면역화시키기 위해정제되고 사용되는 경우 혈청형 3 OspA를 발현하는 보렐리아에 대한 면역원성 뿐만 아니라 실질적으로 개선된 용해도를 보여준다.

실시예 2. 지질화된 돌연변이체 OspA 단편 이종이성체의 정제 및 제형

지질화된 비-His-태그된 돌연변이체 OspA 단편 이종이량체의 클로닝 및 발현

융합 OspA 단량체 B. 발라이시아나/B. 가리니 균주 VS116/PBr은 GeneArt (Germany)에 의해 이. 콜라이 발현에 대해 코돈 최적화되었다. N-말단부에 부가된 지질화 신호 서열은 이. 콜라이 주요 외막 지질단백질, Lpp로부터 유래하고 바로 이어서 C-말단에 CSS 펩타이드가 있어 지질화를 위한 N-말단 시스테인을 제공하였다. 개선된 이종이량체 작제물은 링커 서열 "LN1"을 통해 돌연변이체 혈청형 4 OspA 단편과 하이브리드 혈청형 3 OspA 단편을 융합시킴에 의해 제조하였다. 유전자 단편은 pET28b(+) 벡터 (Novagen, USA)에 클로닝하였고, 안정화된 이종이량체는 BL21(DE3) 세포 (Invitrogen, USA)에서 발현하였다. 세포는 원심분리 4시간 후 수거하였고 펠렛은 추가의 프로세싱 전에 12개월까지 동안 -70℃에서 저장하였다.

지질화된 돌연변이체 OspA 단편 이종이량체의 정제

세포는 고압 분쇄에 의해 기계적으로 분쇄하고 지질화된 돌연변이체 OspA 단편 이종이량체인, Lip-S4D1-S3D1 및 Lip-S4D1-S3hybD1을 세제로서 트리톤 X-114를 사용한 상 분리에 의해 지질 상에 집적시켰다. 이어서, 희석된 세제 상은 비-결합 방식으로 작동되는 음이온 교환 크로마토그래피(Q-세파로스; GE Healthcare, United Kingdom)에 적용하였다. 수득한 통류물은 하이드록시애퍼타이트 칼럼 (Bio-Rad, USA)에 로딩하고 지질화된 단백질은 선형 염 농도구배에 의해 칼럼으로부터 용출시켰다. 상기 용출물은 비-결합 방식에서 DEAE-세파로스 칼럼 (GE Healthcare) 상에 이어서 완충제 교환을 위한 겔 여과 칼럼 (Superdex 200, GE Healthcare)에 적용하였다. 상기 지질화된 돌연변이체 OspA 이종이량체는 분석적 크기 배척 칼럼 및 SDS-PAGE를 기준으로 풀링하였다. 멸균 여과 후, 상기 정제된 이종이량체는 제형화때까지 20℃에서 저장하였다.

배합 백신의 제형화

본 발명의 배합 백신의 제형화에 관한 연구는 안정성을 최적화하기 위해 수행하였다. 상이한 유형의 완충제 및 안정화제는 본원의 이전의 출원 WO2014/006226에 기재된 바와 같이 수산화알루미늄 및 항원과 함께 다양한 농도에서 시험하였다. pH 6.7 ± 0.2에서 3개 각각 이종이량체 40 μg/mL (120 μg의 총 단백질), 10 mM의 인산나트륨, 150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 L-메티오닌, 5% 슈크로스, 0.05% Tween 20 (폴리소르베이트 20) 및 0.15% (w/v) 수산화알루미늄의 최적화 제형을 결정하였다.

결과

상기 개선된 이종이량체인 Lip-S4D1-S3hybD1은 mg/g의 바이오매스로 약 4배 높은 수율을 보여주었고 Lip-S4D1-S3D1 보다 상당히 개선되었다. 추가로, 개선된 이종이량체 제제의 비교할만한 순도는 1개 적은 크로마토그래피 단계로 성취가능하였다.

표 1. Lip-S4D1-S3D1와 비교하여 이종이량체 Lip S4D1-S3hybD1의 개선된 수율.

실시예 3. 상이한 혈청형의 지질화된 돌연변이체 OspA 단편 이종이량체의 면역원성.

마우스의 면역화

암컷 C3H/HeN 마우스는 모든 연구를 위해 사용하였다. 면역화 전에, 10마리의 마우스 그룹을 안면 정맥을 통해 육종하고 예비-면역 혈청을 제조하고 풀링하였다. 각각 100 μL의 3회 s.c. 면역화는 2주 간격으로 투여하였다. 각각의 용량은 각각의 이종이량체 단백질 1μg을 함유하였다. 개선된 이종이량체 배합 백신에 대해: Lip-S1D1-S2D1 (서열번호: 29), Lip-S4D1-S3hybD1 (서열번호: 27) 및 Lip-S5D1-S6D1 (서열번호: 33); 이전 발명의 이종이량체 배합 백신에 대해: Lip-S1D1-S2D1 (서열번호: 29), Lip-S4D1-S3D1 (서열번호: 31) 및 Lip-S5D1-S6D1 (서열번호: 33) 및 키메라 배합 백신에 대해: Lip-키메라 OspA ST1/ST2-His (서열번호: 40), Lip-키메라 OspA ST5/ST3-His (서열번호: 41) 및 Lip-키메라 OspA ST6/ST4-His (서열번호: 42). 모든 배합 백신은 0.15%의 최종 농도에서 수산화알루미늄(Al(OH)₃)으로 제형화하였다. 제3 면역화 1주 후에, 혈액을 안면 정맥으로부터 수거하고 면역 혈청을 제조하였다. 각각의 실험에서, Al(OH)3으로 제형화된 PBS로 면역화된 1개 그룹은 음성 대조군(위약 그룹)으로서 포함되었다. 모든 동물 실험은 오스트리아 법 (BGB1 Nr. 501/1989)에 따라 수행하였고 "Magistratsabteilung 58"에 의해 승인되었다.

OspA ELISA

ELISA 플레이트 (Maxisorp, Nunc, Denmark)는 웰당 코팅 완충액(PBS)에 희석된 50 ng (1 μg/mL) 단백질로 코팅하고 16 내지 72 시간 동안 4℃에서 항온처리하였다. 상기 코팅 항원은 C-말단적으로 His-태그된 전장 지질화된 OspA ST1-6이었다. 코팅 완충액을 버리고 100 μL 차단 완충액 (1% BSA, 0.5% Tween-20, PBS)을 첨가하고 1 내지 2시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 플레이트는 300 μL (과유동) PBST (0.1% Tween-20, PBS)로 3회 세척하였다. 혈청의 5배 희석은 차단 완충액에서 제조하였고 50 μL는 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트는 300 μL (과유동) PBST로 3회 세척하였다. 2차 항체 (서양고추냉이 퍼옥시다제 [HRP]-접합된 래빗 항-마우스 IgG, DAKO, Denmark)는 차단 완충액 중에서 1:2000으로 희석하고 50 μL는 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트는 300 μL (과유동) PBST로 3회 세척하였다. ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산), Sigma-Aldrich, USA)는 HRP에 대한 기질로서 사용하였고, 50 μL의 ABTS는 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 암실에서 15분 동안 항온처리하였다. 상기 반응은 50 μL 1% SDS의 첨가에 의해 종료하고 흡광도는 405 nm에서 판독하였다. 플레이트는 블랭크의 흡광도 0.1 미만인 경우 유효한 것으로 간주하였다. 샘플은 최저 희석물이 1.0 이상의 흡광도를 갖고 최고 희석물이 0.1 미만인 경우 유효하였다. 이들 기준이 충족되는 경우 절반 최대 역가를 결정하였다. 상기 절반 최대 역가는 희석의 역수이고 최고와 최저 희석물 간의 평균 흡광도에 상응한다.

유동 세포측정

스피로헤타 (1x10⁶)는 동일 용적의 4% 파라포름알데하이드와 혼합하고 96웰 플레이트 (Nunclon 96U, Nunc)에서 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 상기 플레이트는 2,000 g에서 5분 동안 원심분리하고 상등액은 버렸다. 세포는 2% BSA(HBSS-B)를 갖는 150 μL의 HBSS로 세척하고 상기된 바와 같이 원심분리하고 상등액을 버렸다. 마우스 혈청은 이들을 35분 동안 56℃에서 항온처리함에 의해 열 불활성화하였다. 열 불활성화된 혈청은 HBSS-B 중에서 희석하고 Costar 스핀-X 원심분리 튜브 필터 (0.22 μm, Corning, USA)를 사용하여 3분 동안 4,000 g에서 원심분리에 의해 멸균 여과하였다. 스피로헤타는 100 μL 혈청 중에 용해시키고 실온에서 45분 동안 항온처리하였다. 상기 플레이트는 2,000 g에서 15분 동안 원심분리하고 상등액은 버렸다. 상기 세포는 150 μL HBSS-B로 1회 세척하고 이어서 100 μL HBSS-B 중에 재현탁하였다. 1마이크로리터의 2차 항체 (PE 접합된 염소 항-마우스 IgG, Beckman Coulter, USA)를 세포에 첨가하고 암실에서 45분 동안 실온에서 항온처리하였다. 스피로헤타는 150 μL HBSS-B로 1회 세척하고 이어서 2.5 μM SYTO17 DNA 염료를 함유하는 200 μL HBSS 중에 재현탁하고 암실내 실온에서 10분 동안 항온처리하였다. 상기 염색된 스피로헤타는 2,000g에서 5분 동안 원심분리함에 의해 펠렛화하고 후속적으로 200 μL HBSS 중에 재현탁시켰다. 표지된 스피로헤타는 SYTO-17 양성 이벤트를 위해 게이팅된 FC500 (Beckman Coulter) 유동 세포측정기로 측정하였다.

결과

2개의 상이한 OspA 이종이량체 제형 ("het 콤보" 및 "개선된 het 콤보") 및 OspA 키메라 배합은마우스에서 면역원성에 대해 시험하였다. 과면역 혈청은 전장 OspA (코팅 항원)에 대한 반응성 및 상이한 OspA 혈청형(ST1 내지 ST6)을 발현하는 보렐리아 균주에 결합하는 표면에 대한 ELISA에 의해 분석하였다.

ELISA 결과는 모든 백신 배합이 모든 6개의 OspA 혈청형에 대한 항체 반응을 자극하였음을 지적했다(도 6 참조). 특히, 본 발명에 대하여 개선된 OspA 이종이량체 배합 백신은 본 발명의 OspA 이종이량체 배합백신과 비교하여 혈청형 3 OspA에 특이적인 보다 높은 수준의 항체를 생성시키는 반면 다른 OspA 혈청형에 대한 항체 수준은 2개 백신에 의해 상응하게 자극됨을 주지한다.

과면역 마우스 혈청으로부터 직접적인 항체의 보렐리아 스피로헤타로의 결합은 모든 6개 OspA 혈청형을 발현하는 보렐리아의 경우에서 관찰되었고 (도 7 참조), 이것은 모든 항원에 응답하여 생성된 항체는 기능적으로 활성이고 동일계에서 천연 OspA에 결합할 수 있음을 지적한다. 형광 강도는 혈청 희석물의 대형 범위에 걸쳐 비례하였다. 스피로헤타에 대한 개선된 이종이량체 배합 백신에 응답하여 관찰되는 형광 강도는 이종이량체배합 백신 및 키메라 배합 백신에 응답하여 관찰되는 것들에 상응하였다. 주지할만하게, 혈청형 3 OspA 보렐리아에 결합하는 것과 관련하여, 개선된 백신과 함께 면역화에 의해 생성되는 항체는 다른 배합 백신 둘 모두에 응답하는 항체 생성 보다 우수하였다.

실시예 4. 생체내 보렐리아 챌린지에 대해 개선된 이종이량체 배합 백신의 보호 능력

마우스의 면역화

암컷 C3H/HeN (H-2^k) 마우스는 모든 연구를 위해 사용하였다(Janvier, France). 각각의 챌린지 전에, 5마리의 8주령 마우스의 그룹은 꼬리 정맥을 통해 육종하고 예비 면역혈청을 제조하고 풀링하였다. 100 μL의 3회 피하 (s.c.) 면역화는 표 2에 지적된 용량으로 2주 간격으,로 투여하였다. 개선된 이종이량체 배합 백신 및 키메라 배합 백신 둘 모두는 실시예 3에 기재된 바와 같이 1:1:1의 비율로 3개의 단백질을 포함하였다. 모든 제형은 0.15%의 최종 농도에서 수산화알루미늄 (Al(OH)₃)을 포함했다. 제3 면역화 1주 후에, 혈액을 수거하고 과면역 혈청을 제조하였다. 각각의 실험에서, Al(OH)₃ (제형 완충액 또는 PBS 중에서) 단독으로 주사된 1개의 그룹은 음성 대조군으로서 포함했고 적당한 OspA 혈청형으로부터 야생형 전장 지질화된 OspA 단백질로 면역화된 마우스 1개 그룹은 양성 대조군 그룹 (B. 부르그도르페리 균주 B31 (OspA 혈청형 1, 서열번호: 34), B. 아프젤리 균주 K78 (OspA 혈청형 2, 서열번호: 35), B. 가리니 균주 PHei (OspA 혈청형 5, 서열번호: 38) 또는 B. 가리니 균주 DK29 (OspA 혈청형 6, 서열번호: 39))으로서 사용하였다. 모든 동물 실험은 오스트리아 법 (BGB1 Nr. 501/1989)에 따라 수행하였고 "Magistratsabteilung 58"에 의해 승인되었다.

시험관내 성장된 보렐리아 를 사용하여 면역화된 마우스의 바늘 챌린지

마지막 면역화한지 2주 후에, 마우스에 100 μL 성장 배지 (BSKII) 중에 희석된 스피로헤타를 s.c.로 챌린지하였다. OspA 혈청형 1 (실험 1 및 2)를 발현하는 B. 부르그도르페리 균주 ZS7, OspA 혈청형 5 (실험 10 내지 13)을 발현하는 B. 가리니 균주 PHei 또는 OspA 혈청형 6 (실험 14 내지 17)을 발현하는 B. 가리니 균주 Ma는 챌린지를 위해 사용하였다. 상기 챌린지 용량은 균주 의존적이고 개별 균주의 독성에 의존적이며 이는 ID₅₀의 결정값에 대한 챌린지 실험에 의해 평가하였다. 바늘 챌린지 실험에 대해 사용된 용량은 ID₅₀의 20 내지 50배 범위였다. 각각 챌린지 전에, OspA 발현은 유동 세포측정에 의해 입증하였다 (실시예 3 참조). 마우스의 챌린지는 단지 세포의 >80%가 OspA 발현에 대해 양성인 경우의 배양물로 수행하였다.

B. 부르그도르페리 또는 B. 아프젤리 ("진드기 챌린지 ")로 감염된 진드기를 사용한 면역화된 마우스의 챌린지

마지막 면역화한지 2주 후에, 마우스는 OspA 혈청형 1 (실험 3)을 발현하는 B. 부르그도르페리 균주 Pra4, OspA 혈청형 1 (실험 4 및 5)을 발현하는 B. 부르그도르페리 균주 Pra1 또는 OspA 혈청형 2 (실험 6 내지 9)를 발현하는 B. 아프젤리를 함유하는 진드기로 챌린지하였다. 면역화된 마우스의 진드기 감염을 촉진시키기 위해, 각각의 마우스의 등의 모발을 Veet^® Cream (Reckitt Benckiser, United Kingdom)으로 제거하고 작은 통기된 컨테이너를 우수한 접착제로 피부에 접착하였다(Pattex, Germany). 이후, B. 부르그도르페리 균주 Pra1 또는 Pra 4 또는 B. 아프젤리 균주 IS1로 감염된 2개 내지 3개의 아이. 리시누스 님프를 마우스당 적용하였고 이들이 완전히 울혈되어 떨어져 나갈때까지 부착시키고 먹이 공급하였다. 상기 먹이 공급 상태는 각각의 개별 진드기에 대해 매일 모니터링하였다. 적어도 하나의 완전히 또는 거의 완전히 먹이 공급 진드기가 수거된 상기 마우스만을 최종 판독에 포함시켰다.

마우스의 희생 및 물질의 수거

각각 바늘 또는 진드기 챌린지한지 4주 또는 6주 후에, 마우스는 경부 탈골로 희생시켰다. 혈액은 오비탈 채혈에 의해 수거하고 최종 혈청을 제조하고 VlsE ELISA 및/또는 웨스턴 블롯을 위해 사용하여 감염 상태를 결정하였다. 추가로, 각각의 마우스 기원의 뇨 방광을 수거하고 DNA를 추출하고 보렐리아의 동정을 위해 정량 PCR (qPCR)에 적용하였다.

VlsE의 불변 영역 6(IR6)을 사용한 ELISA

비오티닐화된 25-량체 펩타이드 (MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK, 서열번호: 59)는 B. 가리니 균주 IP90의 서열로부터 유래하고 분석(문헌참조: Liang FT, Alvarez AL, Gu Y, Nowling JM, Ramamoorthy R, Philipp MT. An immunodominant conserved region within the variable domain of VlsE, the variable surface antigen of Borreliaburgdorferi. J Immunol. 1999; 163:5566-73)을 위해 사용하였다. 스트렙타비딘 예비 코팅된 96-웰 ELISA 플레이트 (Nunc)는 0.1% Tween (PBS/0.1T)이 보충된 PBS에서 100 μL/웰 (1 μg/mL) 펩타이드로 코팅시켰다. 상기 플레이트는 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 펩타이드로 코팅시킨 후, 플레이트는 PBS/0.1T로 1회 세척하였다. 이어서 상기 플레이트는 실온(RT)에서 1시간 동안 PBS + 2% BSA의 100 μL/웰을 사용하여 차단한 후 다시 PBS/0.1T로 세척하였다. 펩타이드에 대한 챌린지 후 혈청(최종 혈청)의 반응성은 PBS + 1% BSA에서 1:200 및 1:400 희석으로 시험하였다. 플레이트는 PBS/0.1T로 3회 세척하기 전에 RT에서 90분 동안 항온처리하였다. 각각의 웰에는 이어서 PBS + 1% BSA 중에서 HRP(Dako)에 접합된 50 μL의 1.3 μg/mL 폴리클로날 래빗 항-마우스 IgG를 부가하였다. 상기 플레이트는 이어서 RT에서 1시간 동안 항온처리하였다. PBS/0.1T로 3회 세척 후, ABTS (50 μL/웰)을 기질 (Sigma-Aldrich)로서 첨가하고 색은 30분 동안 발색되도록 하였다. 흡광도는 405 nm에서 측정하였다. 모든 혈청은 2회 시험하였다. 음성 대조군은 펩타이드로 코팅되지 않은 플레이트 뿐만 아니라 혈청 대신 PBS를 포함했다. 보렐리아 감염에 대해 양성인 배양물인 것으로 보여진 마우스 기원의 혈청은 양성 대조군으로서 사용하였다.

DNA 추출 및 정제

각각의 마우스로부터 뇨 방광은 하기의 변형과 함께 제조업자의 지침에 따른 DNeasy 혈액 및 조직 키트(Qiagen)를 사용하여 DNA 추출 및 정제에 적용하였다. 각각의 뇨 방광은 100 μL 재조합 프로테이나제 K (PCR 등급 14-22 mg/mL, Roche)를 사용하여 60℃에서 밤새 분해하였다. DNA는 50 μL 멸균 탈이온수에서 용출시키고 -20℃에 저장하였다. 음성 대조군으로서, 각각의 DNA 추출 및 정제에서 매번 10번째 샘플에 이어서 하나의 빈 정제 칼럼을 위치시킨다.

qPCR 표적화 recA

올리고뉴클레오타이드 프라이머는 이들이 라임 보렐리아증을 유발하는 모든 관련 보렐리아 종의 동정을 위해 qPCR에 사용될 수 있는 방식으로 recA 유전자를 위해 디자인하였다 (정배향: CATGCTCTTGATCCTGTTTA, 서열번호: 57, 역배향: CCCATTTCTCCATCTATCTC, 서열번호: 58). recA 단편은 B. 부르그도르페리 s.s. 균주 N40으로부터, 각각의 반응에서 표준물로서 사용될 pET28b(+)에 클로닝하였다. 마우스 뇨 방광으로부터 추출된 염색체 DNA는 물에서 1:4로 희석하여 비희석된 DNA와 함께 관찰된 매트릭스 효과를 감소시켰다. 10 μL의 SSoAdvanced™ SYBR^® Green Supermix, 0.3 μL의 각각의 프라이머 (10 μM), 및 7.4 μL의 물로 이루어진 마스터 혼합물은 각각의 실험을 위해 제조하였다. 18 μL의 마스터 혼합물은 미세 역가 플레이트에서 뇨 방광으로부터 추출된 2 μL의 희석된 DNA와 혼합하고 DNA를 CFX96 실시간 PCR 검출 시스템 (Bio-Rad)을 사용하여 증폭시켰다. DNA는 95℃에서 3분 동안 변성시킴에 이어서 95℃에서 15초 및 55℃에서 30초의 50 사이클 변성을 수행했다. 증폭 후, DNA는 95℃에서 30초 동안에 이어서 55℃에서 2분 동안 변성시킴에 의한 용융 곡선 분석을 위해 제조하였다. 상기 용융 곡선 분석은 사이클 당 및 95℃에서 5초당 0.5℃ 증가시키면서 55℃에서 5초 항온처리함에 의해 수행하였다. 각각의 플레이트 상에서, 10 내지 10,000 범위의 주형 카피수와 함께 2회의 표준 곡선 뿐만 아니라 4개의 비-주형 대조군 (NTC)을 포함시켰다.

웨스턴 블롯

상응하는 OspA 혈청형에 속하는 보렐리아 기원의 전체 세포 용해몰로의 최종 혈청의 결합은 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 간략하게, 분석될 마우스 혈청 당 2.5 μg의 스피로헤타 용해물은 4 내지 12% 트리스-글라이신 ZOOM 겔(Invitrogen)을 사용한 환원 조건하에서 SDS-PAGE로 분리하였다. 분리된 단백질은 iBlot^® 건조 블롯팅 시스템 (Invitrogen)을 사용하여 니트로셀룰로스 막상으로 전달하였다. 1시간 동안 5% 밀크 중에서 차단시킨 후, 최종 혈청은 1:2000 희석으로 첨가하고 +4℃에서 밤새 항온처리하였다. 막은 이어서 PBS/0.1T로 3회 세척함에 이어서 1:10,000 희석된 HRP (Dako)에 접합된 폴리클로날 래빗 항 마우스 IgG에서 1시간 항온처리하였다. 면역블롯은 Amersham ECL Plus^TM 웨스턴 블롯팅 검출 시약 (GE Healthcare) 및 코닥 BioMax 필름 (Kodak)을 사용하여 가시화하였다.

감염 판독

최종 감염 판독은 2개의 별도의 방법을 기초로 하였다: 보렐리아-특이적 항체 (웨스턴 블롯 및 VlsE ELISA)의 존재 및 보렐리아 DNA (qPCR 표적화 recA)의 존재를 검출한다. B. 부르그도르페리 균주 ZS7이 챌린지를 위해 사용되는 실험(실험 1 및 2)에서 qPCR과 함께 웨스턴 블롯을 적용하였다. 모든 다른 실험에서, VlsE ELISA 및 qPCR을 사용하였다. 2개의 방법 간에는 높은 일관성 (>95%)이 있었고; 따라서, 마우스는 2개의 방법 중 적어도 1개가 양성인 경우 감염된 것으로 간주되었다. 통계학적 유의성은 피셔(Fisher)의 정확한 시험 (투-테일드)에 의해 결정하였다.

결과

개선된 이종이량체 배합 백신은 보렐리아 챌린지에 대한 보호 능력에 대해 시험하였다. 이들 실험 결과는 표 2에 요약한다. 면역화된 마우스는 B. 부르그도르페리 s.s.로 챌린지하였다 (각각 OspA 혈청형 1, 균주 ZS7, 바늘 챌린지, 실험 1 및 2 또는 균주 Pra1 또는 Pra 4, 진드기 챌린지, 실험 3 또는 4 및 5), B. 아프젤리 (OspA 혈청형 2, 균주 IS1, 진드기 챌린지, 실험 6-9), B. 가리니(OspA 혈청형 5, 균주 PHei, 바늘 챌린지 실험 10-13) 또는 B. 가리니 (OspA 혈청형 6, 균주 Ma, 바늘 챌린지, 실험 14-17). 일부 실험에서, 다른 OspA-기반 항원, 예를 들어, 키메라 배합 백신 또는 지질화된 전장 OspA 단백질이 포함되었다. Al(OH)₃과 배합된 PBS 또는 제형 완충액으로 면역화된 마우스 그룹은 각각의 실험에서 위약 (단독의 보조제) 대조군 그룹으로서 사용하였다.

17개 실험으로부터 보호 데이터는 표 2에 요약되어 있다. 모든 실험에서, 고수준의 감염은 모든 위약 그룹에서 나타났다. 추가로, 낮은 감염률은 상응하는 전장 OspA 단백질을 수용한 그룹에서 관찰되었고, 전장 OspA 혈청형 6은 제외되고 여기서, 단지 부분적 보호가 관찰되었다(실험 14 내지 17). 이들 결과는 실험적 셋업 및 판독 법을 유효하게 한다.

개선된 이종이량체 배합 백신은 마우스가 시험관내 성장한 B. 부르그도르페리 s.s. 또는 B. 가리니 (OspA 혈청형 5 또는 6), 또는 B. 부르그도르페리 또는 B. 아프젤리를 함유하는 진드기로 챌린지되는 경우 3 μg의 용량에서 상당한 보호 (p-값<0.05)를 부여하였다. 추가로, 상이한 면역화 용량이 백신 효능에 대해 평가되는 경우, 고도로 상당한 보호 (p-값 <0.01)는 0.03 μg의 개선된 이종이량체 배합 백신이 투여되고 마우스가 B. 아프젤리 또는 B. 가리니 (OspA 혈청형 5 또는 6) (실험 8, 9, 12, 13 및 16)로 챌린지되는 경우 나타날 수 있다. 요약하면, 개선된 이종이량체 배합 백신은 챌린지를 위해 시험관내 성장한 스피로헤타를 사용한 마우스 모델에서 나타낸 바와 같이 4개의 임상적 관련 OspA 혈청형 (1, 2, 5 및 6)을 포함하는 3개의 보렐리아 종 (B. 부르그도르페리, B. 아프젤리 및 B. 가리니)에 대한 보호 면역력을 유도하였다.

개선된 이종이량체 배합 백신에 의해 부여된 것과 상응하는 혈청형 5 및 6에 대한 보호는 또한 키메라 배합 백신(데이터는 나타내지 않음)으로 면역화된 마우스에서 관찰되었다.

표 2. OspA 혈청형 1, 혈청형 2, 혈청형 5 및 혈청형 6 보렐리아 챌린지에 대한 본 발명의 개선된 돌연변이체 OspA 이종이량체 배합 백신의 보호 능력.

마우스 그룹은 2주 간격으로 단독의 면역원 또는 Al(OH)₃ 보조제의 지정된 용량으로 3회 면역화시켰다. 사용되는 면역원은 돌연변이체 OspA 이종이량체 Lip-S1D1-S2D1, Lip-S4D1-S3hybD1 및 Lip-S5D1-S6D1의 1:1:1 배합 ("개선된 이종이량체 배합 백신"), Lip-키메라 OspA ST1/ST2-His, Lip-키메라 OspA ST5/ST3-His 및 Lip-키메라 OspA ST6/ST4-His의 1:1:1 배합 ("키메라 배합 백신") 및 Lip-OspA1-His (B. 부르그도르페리 균주 B31으로부터 기원하는 지질화된 전장 OspA 단백질) 또는 Lip-OspA2-His (B. 아프젤리 균주 K78 기원의 지질화된 전장 OspA 단백질), Lip-OspA5-His (B. 가리니 균주 PHei로부터 기원하는 지질화된 전장 OspA 단백질) 또는 Lip-OspA6-His (B. 가리니 균주 DK29로부터 기원하는 지질화된 전장 OspA 단백질)였다. 면역화된 마우스는 마지막 면역화한지 2주 후 s.c.로 시린지를 사용하여 지정된 보렐리아 종 (B. 부르그도르페리 균주 ZS7, B. 가리니 균주 PHei 또는 B. 가리니 균주 Ma)를 사용하거나 진드기 (B. 부르그도르페리 균주 Pra1 또는 Pra4 또는 B. 아프젤리 균주 IS1)를 사용하여 챌린지 하였다.

A 키메라 배합 백신 및 개선된 이종이량체 배합 백신에 의한 혈청형 1 OspA 보렐리아와의 바늘 챌린지에 대한 보호 (1개 용량: 3 μg)

B 키메라 배합 백신 및 개선된 이종이량체 배합 백신에 의한 혈청형 1 OspA 보렐리아를 사용한 진드기 챌린지에 대한 보호 (1개 용량: 3 μg)

C 개선된 이종이량체 배합 백신에 의한 혈청형 1 OspA 보렐리아를 사용한 진드기 챌린지에 대한 보호 (감소하는 용량: 3 μg 및 0.3 μg)

D 키메라 배합 백신 및 개선된 이종이량체 배합 백신에 의한 혈청형 2 OspA 보렐리아를 사용한 진드기 챌린지에 대한 보호 (1개의 용량: 3 μg)

E 개선된 이종이량체 배합 백신에 의한 혈청형 2 OspA 보렐리아를 사용한 진드기 챌린지에 대한 보호 (감소하는 용량: 0.03 μg 및 0.003 μg)

F 개선된 이종이량체 배합 백신에 의한 혈청형 5 OspA 보렐리아를 사용한 바늘 챌린지에 대한 보호 (하나의 용량: 3 μg)

G 개선된 이종이량체 배합 백신에 의한 혈청형 5 OspA 보렐리아를 사용한 바늘챌린지에 대한 보호 (감소하는 용량: 3 μg, 0.3 μg 및 0.03 μg)

H 개선된 이종이량체 배합 백신에 의한 혈청형 6 OspA 보렐리아를 사용한 바늘 챌린지에 대한 보호 (1개의 용량: 3 μg)

I 개선된 이종이량체 배합 백신에 의한 혈청형 6 OspA 보렐리아를 사용한 바늘챌린지에 대한 보호 (감소하는 용량: 3 μg, 0.3 μg 및 0.03 μg)

P-값; 투-테일드 피셔의 정확 시험은 단독의 보조제 그룹과 비교하여 괄호에 나타내고 유의적이지 않다 (n.s.).

서열

서열번호: 1

S3hybD1: 하이브리드 OspA C-말단 단편; 보렐리아 발라이시아나, 균주 VS116으로부터의 위치 125번 내지 176번의 아미노산, 및 보렐리아 가리니, 균주 PBr로부터의 아미노산 177번 내지 274번, 디설파이드 결합 1형을 갖고 위치 233번에서 T를 가짐

서열번호: 2

B. 발라이시아나 (균주 VS116), OspA aa 125-176

FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGK

서열번호: 3

B. 가리니 (균주 PBr, 혈청형 3), 전장 OspA (서열번호: 8)로부터 위치 233번에서 T를 갖는 OspA aa 177-274

TKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK

서열번호: 4

B. 발라이시아나 (균주 VS116), OspA

서열번호: 5

B. 부르그도르페리 s.s. (균주 B31, OspA 혈청형 1)

서열번호: 6

B. 아프젤리 (균주 K78; OspA 혈청형 2)

서열번호: 7

위치 233번에서 P를 갖는 B. 가리니 (균주 PBr, OspA 혈청형 3) (embl 승인 X80256.1)

서열번호: 8

위치 233번에서 T를 갖는 B. 가리니 (균주 PBr, OspA 혈청형 3) (embl 승인 ACL34827.1)

서열번호: 9

B. 바바리엔시스 (균주 PBi, OspA 혈청형 4)

서열번호: 10

B. 가리니 (균주 PHei, OspA 혈청형 5)

서열번호: 11

B. 가리니 (균주 DK29, OspA 혈청형 6)

서열번호: 12

B. 가리니 (균주 T25, OspA 혈청형 7)

MKKYLLGIGLILALIACKQNVSSLDEKNSVSVDLPGEMKVLVSKEKDKDGKYSLEATVDKLELKGTSDKNNGSGVLEGVKAAKSKAKLTIADDLSQTKFEIFKEDGKTLVSKKVTLKDKSSTEEKFNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIQNDGSGKAKEVLKSLTLEGTLTADGETKLTVEAGTVTLSKNISESGEITVELKDTETTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQKYNTAGTKLEGSPAEIKDLEALKAALK

서열번호: 13

보렐리아 OspA 지질화 신호

서열번호: 14

보렐리아 OspB 지질화 신호

MRLLIGFALALALIG

서열번호: 15

이. 콜라이 lpp 지질화 신호

MKATKLVLGAVILGSTLLAG

서열번호: 16

B. 부르그도르페리 s.s. 균주 B31 (aa 65-74 및 aa 42-53, 53번 위치에서 아미노산 교환: D53S)으로부터 기원하는 OspA의 N-말단 절반의 2개의 별도의 루프 영역으로부터 작제된 LN1 펩타이드 링커

서열번호: 17

B. 부르그도르페리 s.s.균주 B31 (OspA 혈청형 1)로부터 기원하는 hLFA-1형 서열

GYVLEGTLTAE

서열번호: 18

B. 아프젤리 균주 K78 (OspA 혈청형 2)로부터 비-hLFA-1형 서열

NFTLEGKVAND

서열번호: 19

B. 부르그도르페리 s.s.

(균주 B31, 혈청형 1), 혈청형 1 OspA로부터 대체된 hLFA형 서열을 갖는 OspA aa 126-273

서열번호: 20

B. 아프젤리 (균주 K78, 혈청형 2), OspA aa 126-273

서열번호: 21

B. 가리니 (균주 PBr, 혈청형 3), OspA aa 126-274

서열번호: 22

B.바바리엔시스 (균주 PBi, 혈청형 4), OspA aa 126-273

서열번호: 23

B. 가리니 (균주 PHei, 혈청형 5), OspA aa 126-273

서열번호: 24

B. 가리니 (균주 DK29, 혈청형 6), OspA aa 126-274

서열번호: 25

B. 가리니(균주 T25, 혈청형 7) OspA aa 126-274

서열번호: 26

디설파이드 결합 1형, 이. 콜라이 lpp 지질화 신호, LN1 링커 서열, B. 발라이시아나, 균주 VS116 (서열번호: 2)의 아미노산 서열 125 내지 176번 및 B. 가리니, 균주 PBr, 혈청형 3 (서열번호: 3)의 아미노산 177 내지 274번을 포함하는 혈청형 3 OspA 단편을 갖는 OspA 혈청형 4 및 OspA 혈청형 3의 중간체 및 최종 이종이량체 융합 단백질에 대한 Lip-S4D1-S3hybD1-nt 암호화 서열

ATAA

서열번호: 27

Lip-S4D1-S3hybD1-aa: B. 발라이시아나, 균주 VS116 (서열번호: 2)의 아미노산 서열 125 내지 176번 및 B. 가리니, 균주 PBr, 혈청형 3 (서열번호: 3)의 아미노산 177 내지 274번을 포함하는 OspA 혈청형 4 및 OspA 혈청형 3의 이종이량체 융합 단백질, 디설파이드 결합 1형, 지질 첨가를 위한 N-말단 CSS, LN1 링커 서열, N-말단 지질화를 가짐

LipCSSFNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALKGTSDKNNGSGSKEKNKDGKYSFNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK

서열번호: 28

Lip-S1D1-S2D1-nt: 디설파이드 결합 1형, 이. 콜라이 lpp 지질화 신호, LN1 링커 서열, 비-hLFA-1-형 서열 NFTLEGKVAND에 의해 대체된 OspA 혈청형 1의 aa 164-174를 갖는 OspA 혈청형 1 및 OspA 혈청형 2의 중간체 및 최종 이종이량체 융합 단백질에 대한 암호화 서열

서열번호: 29

Lip-S1D1-S2D1-aa: 디설파이드 결합 1형, 지질의 첨가를 위한 N-말단 CSS, LN1 링커 서열, 비-hLFA-1-형 서열 NFTLEGKVAND, N-말단 지질화에 의해 대체된 OspA 혈청형 1의 aa 164-174를 갖는 OspA 혈청형 1 및 OspA 혈청형 2의 이종이량체 융합 단백질

서열번호: 30

Lip-S4D1-S3D1-nt: 디설파이드 결합 1형, 이. 콜라이 lpp 지질화 신호, 지질의 첨가를 위한 N-말단 CSS, LN1 링커 서열을 갖는 OspA 혈청형 4 및 3 둘 모두의 중간체 및 최종 이종이량체 융합 단백질에 대한 암호화 서열

서열번호: 31

Lip-S4D1-S3D1-aa: 디설파이드 결합 1형, 지질의 첨가를 위한 N-말단 CSS, LN1 링커 서열, N-말단 지질화를 갖는 OspA 혈청형 4 및 3 둘 모두의 이종이량체 융합 단백질

서열번호: 32

Lip-S5D1-S6D1-nt: 디설파이드 결합 1형, 이. 콜라이 lpp 지질화 신호, 지질의 첨가를 위한 N-말단 CSS, LN1 링커 서열을 갖는 OspA 혈청형 6의 중간체 및 최종 이종이량체 융합 단백질 둘 모두에 대한 암호화 서열

서열번호: 33

Lip-S5D1-S6D1-aa: 디설파이드 결합 1형, 지질의 첨가를 위한 N-말단 CSS, LN1 링커 서열, N-말단 지질화를 갖는 OspA 혈청형 6 둘 모두의 헤테로이량체 융합 단백질

서열번호: 34

B. 부르그도르페리(균주 B31, OspA 혈청형 1) aa 18-273, lpp 지질화 신호 서열 제거됨 (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, 서열번호: 15), C-말단 His 태그 (lehhhhhh), 지질의 첨가를 위한 N-말단 CSSF

서열번호: 35

B. 아프젤리(균주 K78; OspA 혈청형 2) aa 18-273, lpp 지질화 신호 서열 제거됨 (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, 서열번호: 15), C-말단 His 태그 (lehhhhhh), 지질의 첨가를 위한 N-말단 CSSF

서열번호: 36

B. 가리니 (균주 PBr; OspA 혈청형 3) aa 18-274, lpp 지질화 신호 서열 제거됨 (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, 서열번호: 15), C-말단 His 태그 (lehhhhhh), 지질의 첨가를 위한 N-말단 CSSF

서열번호: 37

B. 바바리엔시스 (균주 PBi; OspA 혈청형 4) aa 18-273, lpp 지질화 신호 서열 제거됨 (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, 서열번호: 15), C-말단 His 태그 (lehhhhhh), 지질의 첨가를 위한 N-말단 CSSF

서열번호: 38

B. 가리니 (균주 PHei; OspA 혈청형 5) aa 18-273, lpp 지질화 신호 서열 제거됨 (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, 서열번호: 15), C-말단 His 태그 (lehhhhhh), 지질의 첨가를 위한 N-말단 CSSF

서열번호: 39

B. 가리니(균주 DK29; OspA 혈청형 6) aa 18-274, lpp 지질화 신호 서열 제거됨 (MKATKLVLGAVILGSTLLAG, 서열번호: 15), C-말단 His 태그 (lehhhhhh), 지질의 첨가를 위한 N-말단 CSSF

서열번호: 40

키메라 OspA 혈청형 1/혈청형 2, N-말단 지질화, His-태그됨, OspB 지질화 신호 서열을 포함함:

(서열번호: 14) 이는 프로세싱 동안에 절단됨

서열번호: 41

키메라 OspA 혈청형 5/혈청형 3, N-말단 지질화, His-태그됨, OspB 지질화 및 신호 서열을 포함함:

(서열번호: 14) 이는 프로세싱 동안에 절단됨

서열번호: 42

키메라 OspA 혈청형 6/혈청형 4, N-말단 지질화, His-태그됨, OspB 지질화 및 신호 서열을 포함함:

(서열번호: 14) 이는 프로세싱 동안에 절단됨

서열번호: 43

S1D1

FNEKGEVSEKIITRADGTRLEYTGIKSDGSGKAKEVLKNFTLEGKVANDKTTLVVKCGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKDLVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSAVEITKLDEICNALK

서열번호: 44

S2D1

FNEKGELSAKTMTRENGTKLEYTEMKSDGTGKAKEVLKNFTLEGKVANDKVTLEVKCGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQLVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTAVEIKTLDELCNALK

서열번호: 45

S3D1

FNDKGKLSEKVVTRANGTRLEYTEIKNDGSGKAKEVLKGFALEGTLTDGGETKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK

서열번호: 46

S4D1

FNAKGELSEKTILRANGTRLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFALEGTLAADKTTLKVTCGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNIVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNAVEIKTLDELCNALK

서열번호: 47

S5D1

FNEKGEISEKTIVRANGTRLEYTDIKSDKTGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLVFTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK

서열번호: 48

S6D1

FNGKGETSEKTIVRANGTRLEYTDIKSDGSGKAKEVLKDFTLEGTLAADGKTTLKVTCGTVVLSKNILKSGEITAALDDSDTTRATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKNLVFTKEDTITVQRYDSAGTNLEGKAVEITTLKELCNALK

서열번호: 49

S3HYBD1 (BVA)

FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK

서열번호: 50

BVAD1

FNEKGEVSEKILTRSNGTTLEYSQMTDAENATKAVETLKNGIKLPGNLVGGKTTLKITCGTVTLSKHIAKSGEVTVEINDTSSTPNTKKTGKWDARNSTLTIIVDSKNKTKLVFTKQDTITVQSYNPAGNKLEGTAVEIKTLQELCNALK

서열번호: 51

S3hybD1(Bsp): 하이브리드 OspA C-말단 단편; 보렐리아 스피엘마니 기원의 아미노산 126 내지175번 및 보렐리아 가리니 균주 PBr 기원의 아미노산 177 내지 274번, 디설파이드 결합 1형 및 위치 233번에서 T를 가짐

FNEKGELSEKTLVRANGTKLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFTLEGTLANEKTKLTVTCGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQNYNRAGNALEGSPAEIKDLAELCAALK

서열번호: 52

MSPD1

FNEKGELSEKTLVRANGTKLEYTEIKSDGTGKAKEVLKDFTLEGTLANEKATLTVKCGTVTLSKNIDKSGEVTVALNDTDSTAATKKTGAWDSKTSTLTITVNSKKTKDLVFTKQDTITVQKYDSAGTTLEGSAVEIKTLDELCNALK

서열번호: 53

16S-23S 유전자간 스페이서에 대한 정배향 프라이머

GTATGTTTAGTGAGGGGGGTG

서열번호: 54

16S-23S 유전자간 스페이서에 대한 역배향 프라이머

GGATCATAGCTCAGGTGGTTAG

서열번호: 55

16S-23S 유전자간 스페이서에 대한 정배향 프라이머

AGGGGGGTGAAGTCGTAACAAG

서열번호: 56

16S-23S 유전자간 스페이서에 대한 역배향 프라이머

GTCTGATAAACCTGAGGTCGGA

서열번호: 57

보렐리아의 RecA 유전자에 대한 정배향 프라이머

서열번호: 58

보렐리아의 RecA 유전자에 대한 역배향 프라이머

서열번호: 59

VIsE의 불변 영역 6(IR6) 기원의 25량체 펩타이드

MKKDDQIAAAMVLRGMAKDGQFALK

서열번호: 60

마우스 카텔린

RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPE

서열번호: 61

KLK 펩타이드

KLKLLLLLKLK

서열번호: 62

지질화를 위한 N-말단 펩타이드

CKQN

서열번호: 63

5'-(dIdC)13-3'

본원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참조문헌의 전체 내용(일반 문헌, 승인된 특허, 공개된 특허 출원 및 공계류 특허 출원을 포함함)은 명백히 본원에 참조로 인용된다.

SEQUENCE LISTING <110> Valneva Austria GmbH <120> MUTANT FRAGMENTS OF OspA AND METHODS <130> V69542PCREV <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S3hybD1 <400> 1 Phe Asn Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Leu Thr Arg Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Thr Leu Glu Tyr Ser Gln Met Thr Asp Ala Glu Asn Ala Thr 20 25 30 Lys Ala Val Glu Thr Leu Lys Asn Gly Ile Lys Leu Pro Gly Asn Leu 35 40 45 Val Gly Gly Lys Thr Lys Leu Thr Val Thr Cys Gly Thr Val Thr Leu 50 55 60 Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asn Asp 65 70 75 80 Thr Glu Thr Thr Pro Ala Asp Lys Lys Thr Gly Glu Trp Lys Ser Asp 85 90 95 Thr Ser Thr Leu Thr Ile Ser Lys Asn Ser Gln Lys Thr Lys Gln Leu 100 105 110 Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Asn Tyr Asn Arg Ala 115 120 125 Gly Asn Ala Leu Glu Gly Ser Pro Ala Glu Ile Lys Asp Leu Ala Glu 130 135 140 Leu Cys Ala Ala Leu Lys 145 150 <210> 2 <211> 52 <212> PRT <213> Borrelia valaisiana <400> 2 Phe Asn Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Leu Thr Arg Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Thr Leu Glu Tyr Ser Gln Met Thr Asp Ala Glu Asn Ala Thr 20 25 30 Lys Ala Val Glu Thr Leu Lys Asn Gly Ile Lys Leu Pro Gly Asn Leu 35 40 45 Val Gly Gly Lys 50 <210> 3 <211> 98 <212> PRT <213> Borrelia garinii <400> 3 Thr Lys Leu Thr Val Thr Cys Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile 1 5 10 15 Ser Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asn Asp Thr Glu Thr Thr 20 25 30 Pro Ala Asp Lys Lys Thr Gly Glu Trp Lys Ser Asp Thr Ser Thr Leu 35 40 45 Thr Ile Ser Lys Asn Ser Gln Lys Thr Lys Gln Leu Val Phe Thr Lys 50 55 60 Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Asn Tyr Asn Arg Ala Gly Asn Ala Leu 65 70 75 80 Glu Gly Ser Pro Ala Glu Ile Lys Asp Leu Ala Glu Leu Cys Ala Ala 85 90 95 Leu Lys <210> 4 <211> 274 <212> PRT <213> Borrelia valaisiana <400> 4 Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala 1 5 10 15 Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Ala Ser Val 20 25 30 Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys 35 40 45 Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Val Ala Thr Val Asp Lys Val Glu Leu Lys 50 55 60 Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu Gly Val Lys 65 70 75 80 Asp Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Glu 85 90 95 Thr Lys Leu Glu Thr Phe Lys Glu Asp Gly Thr Leu Val Ser Arg Lys 100 105 110 Val Asn Phe Lys Asp Lys Ser Phe Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys 115 120 125 Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Leu Thr Arg Ser Asn Gly Thr Thr Leu 130 135 140 Glu Tyr Ser Gln Met Thr Asp Ala Glu Asn Ala Thr Lys Ala Val Glu 145 150 155 160 Thr Leu Lys Asn Gly Ile Lys Leu Pro Gly Asn Leu Val Gly Gly Lys 165 170 175 Thr Thr Leu Lys Ile Thr Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys His Ile 180 185 190 Ala Lys Ser Gly Glu Val Thr Val Glu Ile Asn Asp Thr Ser Ser Thr 195 200 205 Pro Asn Thr Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ala Arg Asn Ser Thr Leu 210 215 220 Thr Ile Ile Val Asp Ser Lys Asn Lys Thr Lys Leu Val Phe Thr Lys 225 230 235 240 Gln Asp Thr Ile Thr Val Gln Ser Tyr Asn Pro Ala Gly Asn Lys Leu 245 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Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser 180 185 190 Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp Ser Ser Ala 195 200 205 Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe Thr Lys Glu 225 230 235 240 Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln Tyr Asp Ser Asn Gly Thr Lys Leu Glu 245 250 255 Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr Lys Leu Asp Glu Ile Lys Asn Ala Leu 260 265 270 Lys <210> 6 <211> 273 <212> PRT <213> Borrelia afzelii <400> 6 Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala 1 5 10 15 Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Ala Ser Val 20 25 30 Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys 35 40 45 Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Val Asp Lys Ile Glu Leu Lys 50 55 60 Gly Thr Ser Asp Lys Asp Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Thr Lys 65 70 75 80 Asp Asp Lys Ser Lys Ala Lys Leu Thr Ile Ala Asp Asp Leu Ser Lys 85 90 95 Thr Thr Phe Glu Leu Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Arg 100 105 110 Lys Val Ser Ser Lys Asp Lys Thr Ser Thr Asp Glu Met Phe Asn Glu 115 120 125 Lys Gly Glu Leu Ser Ala Lys Thr Met Thr Arg Glu Asn Gly Thr Lys 130 135 140 Leu Glu Tyr Thr Glu Met Lys Ser Asp Gly Thr Gly Lys Ala Lys Glu 145 150 155 160 Val Leu Lys Asn Phe Thr Leu Glu Gly Lys Val Ala Asn Asp Lys Val 165 170 175 Thr Leu Glu Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Glu Ile Ala 180 185 190 Lys Ser Gly Glu Val Thr Val Ala Leu Asn Asp Thr Asn Thr Thr Gln 195 200 205 Ala Thr Lys Lys Thr Gly Ala Trp Asp Ser Lys Thr Ser Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Ser Val Asn Ser Lys Lys Thr Thr Gln Leu Val Phe Thr Lys Gln 225 230 235 240 Asp Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu Glu 245 250 255 Gly Thr Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys Asn Ala Leu 260 265 270 Lys <210> 7 <211> 274 <212> PRT <213> Borrelia garinii <400> 7 Met Lys Lys Tyr Leu Leu Gly Ile Gly Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ala 1 5 10 15 Cys Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val 20 25 30 Asp Leu Pro Gly Gly Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys 35 40 45 Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Met Ala Thr Val Glu Lys Leu Glu Leu Lys 50 55 60 Gly Thr Ser Asp Lys Ser Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Glu Lys 65 70 75 80 Ala Asp Lys Ser Lys Ala Lys Leu Thr Ile Ser Gln Asp Leu Asn Gln 85 90 95 Thr Thr Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Arg 100 105 110 Lys Val Asn Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Asp 115 120 125 Lys Gly Lys Leu Ser Glu Lys Val Val Thr Arg Ala Asn Gly Thr Arg 130 135 140 Leu Glu Tyr Thr Glu Ile Lys Asn Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu 145 150 155 160 Val Leu Lys Gly Phe Ala Leu Glu Gly Thr Leu Thr Asp Gly Gly Glu 165 170 175 Thr Lys Leu Thr Val Thr Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile 180 185 190 Ser Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asn Asp Thr Glu Thr Thr 195 200 205 Pro Ala Asp Lys Lys Thr Gly Glu Trp Lys Ser Asp Thr Ser Thr Leu 210 215 220 Thr Ile Ser Lys Asn Ser Gln Lys Pro Lys Gln Leu Val Phe Thr Lys 225 230 235 240 Glu Asn Thr 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Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser Val Ser Val 20 25 30 Asp Leu Pro Gly Gly Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys 35 40 45 Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Met Ala Thr Val Glu Lys Leu Glu Leu Lys 50 55 60 Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu Gly Glu Lys 65 70 75 80 Thr Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ala Glu Asp Leu Ser Lys 85 90 95 Thr Thr Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys 100 105 110 Lys Val Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu 115 120 125 Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Thr Ile Val Arg Ala Asn Gly Thr Arg 130 135 140 Leu Glu Tyr Thr Asp Ile Lys Ser Asp Lys Thr Gly Lys Ala Lys Glu 145 150 155 160 Val Leu Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala Asp Gly Lys 165 170 175 Thr Thr Leu Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys Asn Ile 180 185 190 Ser Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asp Asp Thr Asp Ser Ser 195 200 205 Gly Asn Lys Lys Ser Gly Thr Trp Asp Ser Gly Thr Ser Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Ser Lys Asn Arg Thr Lys Thr 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<220> <223> Lip-S5D1-S6D1-nt <400> 32 atgaaagcta ctaaactggt actgggcgcg gtaatcctgg gttctactct gctggcaggt 60 tgctcaagct tcaacgaaaa gggcgaaatc tcagaaaaaa ccatcgtccg cgctaacggc 120 acccgcctgg aatacaccga catcaaatca gacaagaccg gtaaagcgaa ggaagttctg 180 aaagatttta cgctggaagg taccctggca gcagacggta aaaccacgct gaaggtgacc 240 tgcggtaccg ttacgctgtc caaaaacatt agtaagtccg gcgaaatcac ggtcgccctg 300 gatgacaccg atagctctgg caacaaaaag agcggtacct gggattcagg cacctcgacg 360 ctgaccattt ctaaaaatcg tacgaaaacc aagcagctgg tcttcacgaa agaagatacg 420 atcaccgtgc aaaactatga cagcgcaggt accaatctgg aaggcaaagc tgtggaaatt 480 accacgctga aagaactgtg taatgctctg aaaggtacta gtgacaaaaa caatggctct 540 ggtagcaaag agaaaaacaa agatggcaag tactcattca acggcaaagg tgaaacgagc 600 gaaaagacca tcgtgcgtgc gaacggtacc cgcctggaat atacggacat taaatcggac 660 ggcagcggca aagcaaagga agtcctgaaa gattttacgc tggaaggtac cctggcagca 720 gacggtaaaa ccacgctgaa ggtgacgtgc ggcaccgtgg ttctgtcaaa aaacattctg 780 aagtcgggtg aaatcaccgc agctctggat gacagcgata ccacgcgtgc tacgaaaaag 840 accggtaaat gggatagcaa gacctctacg ctgaccatta gtgtcaactc ccagaaaacg 900 aagaatctgg tgttcaccaa agaagatacg atcaccgttc aacgctatga cagtgcgggc 960 accaacctgg aaggcaaagc cgttgaaatt accacgctga aagaactgtg taatgctctg 1020 aaa 1023 <210> 33 <211> 321 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lip-S5D1-S6D1-aa <220> <221> LIPID <222> (1)..(1) <400> 33 Cys Ser Ser Phe Asn Glu Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Thr Ile Val 1 5 10 15 Arg Ala Asn Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Asp Ile Lys Ser Asp Lys 20 25 30 Thr Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr 35 40 45 Leu Ala Ala Asp Gly Lys Thr Thr Leu Lys Val Thr Cys Gly Thr Val 50 55 60 Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu 65 70 75 80 Asp Asp Thr Asp Ser Ser Gly Asn Lys Lys Ser Gly Thr Trp Asp Ser 85 90 95 Gly Thr Ser Thr Leu Thr Ile Ser Lys Asn Arg Thr Lys Thr Lys Gln 100 105 110 Leu Val Phe Thr Lys Glu Asp Thr Ile Thr Val Gln Asn Tyr Asp Ser 115 120 125 Ala Gly Thr Asn Leu Glu Gly Lys Ala Val Glu Ile Thr Thr Leu Lys 130 135 140 Glu Leu Cys Asn Ala Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser 145 150 155 160 Gly Ser Lys Glu Lys Asn Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Phe Asn Gly Lys 165 170 175 Gly Glu Thr Ser Glu Lys Thr Ile Val Arg Ala Asn Gly Thr Arg Leu 180 185 190 Glu Tyr Thr Asp Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys Ala Lys Glu Val 195 200 205 Leu Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala Asp Gly Lys Thr 210 215 220 Thr Leu Lys Val Thr Cys Gly Thr Val Val Leu Ser Lys Asn Ile Leu 225 230 235 240 Lys Ser Gly Glu Ile Thr Ala Ala Leu Asp Asp Ser Asp Thr Thr Arg 245 250 255 Ala Thr Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ser Lys Thr Ser Thr Leu Thr 260 265 270 Ile Ser Val Asn Ser Gln Lys Thr Lys Asn Leu Val Phe Thr Lys Glu 275 280 285 Asp Thr Ile Thr Val Gln Arg Tyr Asp Ser Ala Gly Thr Asn Leu Glu 290 295 300 Gly Lys Ala Val Glu Ile Thr Thr Leu Lys Glu Leu Cys Asn Ala Leu 305 310 315 320 Lys <210> 34 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B. burgdorferi (strain B31, OspA serotype 1) aa 18-273 <400> 34 Cys Ser Ser Phe Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser 1 5 10 15 Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu 20 25 30 Lys Asn Lys Asp Gly Lys Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu 35 40 45 Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu 50 55 60 Gly Val Lys Ala Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp 65 70 75 80 Leu Gly Gln Thr Thr Leu Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu 85 90 95 Val Ser Lys Lys Val Thr Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys 100 105 110 Phe Asn Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Ile Thr Arg Ala Asp 115 120 125 Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Gly Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys 130 135 140 Ala Lys Glu Val Leu Lys Gly Tyr Val Leu Glu Gly Thr Leu Thr Ala 145 150 155 160 Glu Lys Thr Thr Leu Val Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys 165 170 175 Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu Asn Asp Thr Asp 180 185 190 Ser Ser Ala Ala Thr Lys Lys Thr Ala Ala Trp Asn Ser Gly Thr Ser 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe 210 215 220 Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Gln Tyr Asp Ser Asn Gly Thr 225 230 235 240 Lys Leu Glu Gly Ser Ala Val Glu Ile Thr Lys Leu Asp Glu Ile Lys 245 250 255 Asn Ala Leu Lys Leu Glu His His His His His His 260 265 <210> 35 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B. afzelii (strain K78; OspA serotype 2) aa 18-273 <400> 35 Cys Ser Ser Phe Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser 1 5 10 15 Ala Ser Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu 20 25 30 Lys Asp Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Val Asp Lys Ile 35 40 45 Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asp Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu 50 55 60 Gly Thr Lys Asp Asp Lys Ser Lys Ala Lys Leu Thr Ile Ala Asp Asp 65 70 75 80 Leu Ser Lys Thr Thr Phe Glu Leu Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu 85 90 95 Val Ser Arg Lys Val Ser Ser Lys Asp Lys Thr Ser Thr Asp Glu Met 100 105 110 Phe Asn Glu Lys Gly Glu Leu Ser Ala Lys Thr Met Thr Arg Glu Asn 115 120 125 Gly Thr Lys Leu Glu Tyr Thr Glu Met Lys Ser Asp Gly Thr Gly Lys 130 135 140 Ala Lys Glu Val Leu Lys Asn Phe Thr Leu Glu Gly Lys Val Ala Asn 145 150 155 160 Asp Lys Val Thr Leu Glu Val Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys 165 170 175 Glu Ile Ala Lys Ser Gly Glu Val Thr Val Ala Leu Asn Asp Thr Asn 180 185 190 Thr Thr Gln Ala Thr Lys Lys Thr Gly Ala Trp Asp Ser Lys Thr Ser 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Val Asn Ser Lys Lys Thr Thr Gln Leu Val Phe 210 215 220 Thr Lys Gln Asp Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr 225 230 235 240 Asn Leu Glu Gly Thr Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys 245 250 255 Asn Ala Leu Lys Leu Glu His His His His His His 260 265 <210> 36 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B. garinii (strain PBr; OspA serotype 3) aa 18-274 <400> 36 Cys Ser Ser Phe Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser 1 5 10 15 Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Gly Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu 20 25 30 Lys Asp Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Met Ala Thr Val Glu Lys Leu 35 40 45 Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Ser Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu 50 55 60 Gly Glu Lys Ala Asp Lys Ser Lys Ala Lys Leu Thr Ile Ser Gln Asp 65 70 75 80 Leu Asn Gln Thr Thr Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu 85 90 95 Val Ser Arg Lys Val Asn Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys 100 105 110 Phe Asn Asp Lys Gly Lys Leu Ser Glu Lys Val Val Thr Arg Ala Asn 115 120 125 Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Glu Ile Lys Asn Asp Gly Ser Gly Lys 130 135 140 Ala Lys Glu Val Leu Lys Gly Phe Ala Leu Glu Gly Thr Leu Thr Asp 145 150 155 160 Gly Gly Glu Thr Lys Leu Thr Val Thr Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser 165 170 175 Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asn Asp Thr 180 185 190 Glu Thr Thr Pro Ala Asp Lys Lys Thr Gly Glu Trp Lys Ser Asp Thr 195 200 205 Ser Thr Leu Thr Ile Ser Lys Asn Ser Gln Lys Thr Lys Gln Leu Val 210 215 220 Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Asn Tyr Asn Arg Ala Gly 225 230 235 240 Asn Ala Leu Glu Gly Ser Pro Ala Glu Ile Lys Asp Leu Ala Glu Leu 245 250 255 Lys Ala Ala Leu Lys Leu Glu His His His His His His 260 265 <210> 37 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B. bavariensis (strain PBi; OspA serotype 4) aa 18-273 <400> 37 Cys Ser Ser Phe Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser 1 5 10 15 Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu 20 25 30 Lys Asp Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Met Ala Thr Val Asp Lys Leu 35 40 45 Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Ser Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu 50 55 60 Gly Glu Lys Ser Asp Lys Ser Lys Ala Lys Leu Thr Ile Ser Glu Asp 65 70 75 80 Leu Ser Lys Thr Thr Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu 85 90 95 Val Ser Lys Lys Val Asn Ser Lys Asp Lys Ser Ser Ile Glu Glu Lys 100 105 110 Phe Asn Ala Lys Gly Glu Leu Ser Glu Lys Thr Ile Leu Arg Ala Asn 115 120 125 Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Glu Ile Lys Ser Asp Gly Thr Gly Lys 130 135 140 Ala Lys Glu Val Leu Lys Asp Phe Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala 145 150 155 160 Asp Lys Thr Thr Leu Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Val Leu Ser Lys 165 170 175 His Ile Pro Asn Ser Gly Glu Ile Thr Val Glu Leu Asn Asp Ser Asn 180 185 190 Ser Thr Gln Ala Thr Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ser Asn Thr Ser 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asn Ile Val Phe 210 215 220 Thr Lys Glu Asp Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr 225 230 235 240 Asn Leu Glu Gly Asn Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Lys 245 250 255 Asn Ala Leu Lys Leu Glu His His His His His His 260 265 <210> 38 <211> 268 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B. garinii (strain PHei; OspA serotype 5) aa 18-273 <400> 38 Cys Ser Ser Phe Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser 1 5 10 15 Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Gly Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu 20 25 30 Lys Asp Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Met Ala Thr Val Glu Lys Leu 35 40 45 Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu 50 55 60 Gly Glu Lys Thr Asp Lys Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ala Glu Asp 65 70 75 80 Leu Ser Lys Thr Thr Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu 85 90 95 Val Ser Lys Lys Val Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys 100 105 110 Phe Asn Glu Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Thr Ile Val Arg Ala Asn 115 120 125 Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Asp Ile Lys Ser Asp Lys Thr Gly Lys 130 135 140 Ala Lys Glu Val Leu Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala 145 150 155 160 Asp Gly Lys Thr Thr Leu Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser 165 170 175 Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asp Asp Thr 180 185 190 Asp Ser Ser Gly Asn Lys Lys Ser Gly Thr Trp Asp Ser Gly Thr Ser 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Ser Lys Asn Arg Thr Lys Thr Lys Gln Leu Val Phe 210 215 220 Thr Lys Glu Asp Thr Ile Thr Val Gln Asn Tyr Asp Ser Ala Gly Thr 225 230 235 240 Asn Leu Glu Gly Lys Ala Val Glu Ile Thr Thr Leu Lys Glu Leu Lys 245 250 255 Asn Ala Leu Lys Leu Glu His His His His His His 260 265 <210> 39 <211> 269 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B. garinii (strain DK29; OspA serotype 6) aa 18-274 <400> 39 Cys Ser Ser Phe Lys Gln Asn Val Ser Ser Leu Asp Glu Lys Asn Ser 1 5 10 15 Val Ser Val Asp Leu Pro Gly Gly Met Thr Val Leu Val Ser Lys Glu 20 25 30 Lys Asp Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Glu Ala Thr Val Asp Lys Leu 35 40 45 Glu Leu Lys Gly Thr Ser Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu 50 55 60 Gly Glu Lys Thr Asp Lys Ser Lys Val Lys Ser Thr Ile Ala Asp Asp 65 70 75 80 Leu Ser Gln Thr Lys Phe Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu 85 90 95 Val Ser Lys Lys Val Thr Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys 100 105 110 Phe Asn Gly Lys Gly Glu Thr Ser Glu Lys Thr Ile Val Arg Ala Asn 115 120 125 Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Asp Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys 130 135 140 Ala Lys Glu Val Leu Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala 145 150 155 160 Asp Gly Lys Thr Thr Leu Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Val Leu Ser 165 170 175 Lys Asn Ile Leu Lys Ser Gly Glu Ile Thr Ala Ala Leu Asp Asp Ser 180 185 190 Asp Thr Thr Arg Ala Thr Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ser Lys Thr 195 200 205 Ser Thr Leu Thr Ile Ser Val Asn Ser Gln Lys Thr Lys Asn Leu Val 210 215 220 Phe Thr Lys Glu Asp Thr Ile Thr Val Gln Arg Tyr Asp Ser Ala Gly 225 230 235 240 Thr Asn Leu Glu Gly Lys Ala Val Glu Ile Thr Thr Leu Lys Glu Leu 245 250 255 Lys Asn Ala Leu Lys Leu Glu His His His His His His 260 265 <210> 40 <211> 278 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric OspA Serotype1/Serotype2, N-terminal lipidation <400> 40 Met Arg Leu Leu Ile Gly Phe Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ile Gly Cys 1 5 10 15 Ala Gln Lys Gly Ala Glu Ser Ile Gly Ser Val Ser Val Asp Leu Pro 20 25 30 Gly Glu Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys Asn Gly Lys 35 40 45 Tyr Asp Leu Ile Ala Thr Val Asp Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser 50 55 60 Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Val Leu Glu Gly Val Lys Thr Asn Lys 65 70 75 80 Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ser Asp Asp Leu Gly Gln Thr Thr Leu 85 90 95 Glu Val Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr 100 105 110 Ser Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu 115 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20 25 30 Gly Gly Met Lys Val Leu Val Ser Lys Glu Lys Asp Lys Asn Gly Lys 35 40 45 Tyr Ser Leu Met Ala Thr Val Glu Lys Leu Glu Leu Lys Gly Thr Ser 50 55 60 Asp Lys Asn Asn Gly Ser Gly Thr Leu Glu Gly Glu Lys Thr Asn Lys 65 70 75 80 Ser Lys Val Lys Leu Thr Ile Ala Glu Asp Leu Ser Lys Thr Thr Phe 85 90 95 Glu Ile Phe Lys Glu Asp Gly Lys Thr Leu Val Ser Lys Lys Val Thr 100 105 110 Leu Lys Asp Lys Ser Ser Thr Glu Glu Lys Phe Asn Glu Lys Gly Glu 115 120 125 Ile Ser Glu Lys Thr Ile Val Met Ala Asn Gly Thr Arg Leu Glu Tyr 130 135 140 Thr Asp Ile Lys Ser Asp Lys Thr Gly Lys Ala Lys Tyr Val Leu Lys 145 150 155 160 Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala Asp Gly Lys Thr Thr Leu 165 170 175 Lys Val Thr Glu Gly Thr Val Thr Leu Ser Met Asn Ile Ser Lys Ser 180 185 190 Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asp Asp Thr Asp Ser Ser Gly Asn Lys 195 200 205 Lys Ser Gly Thr Trp Asp Ser Asp Thr Ser Thr Leu Thr Ile Ser Lys 210 215 220 Asn Ser Gln Lys Thr Lys Gln Leu Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile 225 230 235 240 Thr 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Sequence <220> <223> S4D1 <400> 46 Phe Asn Ala Lys Gly Glu Leu Ser Glu Lys Thr Ile Leu Arg Ala Asn 1 5 10 15 Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Glu Ile Lys Ser Asp Gly Thr Gly Lys 20 25 30 Ala Lys Glu Val Leu Lys Asp Phe Ala Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala 35 40 45 Asp Lys Thr Thr Leu Lys Val Thr Cys Gly Thr Val Val Leu Ser Lys 50 55 60 His Ile Pro Asn Ser Gly Glu Ile Thr Val Glu Leu Asn Asp Ser Asn 65 70 75 80 Ser Thr Gln Ala Thr Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ser Asn Thr Ser 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ser Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asn Ile Val Phe 100 105 110 Thr Lys Glu Asp Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr 115 120 125 Asn Leu Glu Gly Asn Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Cys 130 135 140 Asn Ala Leu Lys 145 <210> 47 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S5D1 <400> 47 Phe Asn Glu Lys Gly Glu Ile Ser Glu Lys Thr Ile Val Arg Ala Asn 1 5 10 15 Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Asp Ile Lys Ser Asp Lys Thr Gly Lys 20 25 30 Ala Lys Glu Val Leu Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala 35 40 45 Asp Gly Lys Thr Thr Leu Lys Val Thr Cys Gly Thr Val Thr Leu Ser 50 55 60 Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asp Asp Thr 65 70 75 80 Asp Ser Ser Gly Asn Lys Lys Ser Gly Thr Trp Asp Ser Gly Thr Ser 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ser Lys Asn Arg Thr Lys Thr Lys Gln Leu Val Phe 100 105 110 Thr Lys Glu Asp Thr Ile Thr Val Gln Asn Tyr Asp Ser Ala Gly Thr 115 120 125 Asn Leu Glu Gly Lys Ala Val Glu Ile Thr Thr Leu Lys Glu Leu Cys 130 135 140 Asn Ala Leu Lys 145 <210> 48 <211> 149 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S6D1 <400> 48 Phe Asn Gly Lys Gly Glu Thr Ser Glu Lys Thr Ile Val Arg Ala Asn 1 5 10 15 Gly Thr Arg Leu Glu Tyr Thr Asp Ile Lys Ser Asp Gly Ser Gly Lys 20 25 30 Ala Lys Glu Val Leu Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Ala 35 40 45 Asp Gly Lys Thr Thr Leu Lys Val Thr Cys Gly Thr Val Val Leu Ser 50 55 60 Lys Asn Ile Leu Lys Ser Gly Glu Ile Thr Ala Ala Leu Asp Asp Ser 65 70 75 80 Asp Thr Thr Arg Ala Thr Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ser Lys Thr 85 90 95 Ser Thr Leu Thr Ile Ser Val Asn Ser Gln Lys Thr Lys Asn Leu Val 100 105 110 Phe Thr Lys Glu Asp Thr Ile Thr Val Gln Arg Tyr Asp Ser Ala Gly 115 120 125 Thr Asn Leu Glu Gly Lys Ala Val Glu Ile Thr Thr Leu Lys Glu Leu 130 135 140 Cys Asn Ala Leu Lys 145 <210> 49 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S3HYBD1 (BVA) <400> 49 Phe Asn Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Leu Thr Arg Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Thr Leu Glu Tyr Ser Gln Met Thr Asp Ala Glu Asn Ala Thr 20 25 30 Lys Ala Val Glu Thr Leu Lys Asn Gly Ile Lys Leu Pro Gly Asn Leu 35 40 45 Val Gly Gly Lys Thr Lys Leu Thr Val Thr Cys Gly Thr Val Thr Leu 50 55 60 Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asn Asp 65 70 75 80 Thr Glu Thr Thr Pro Ala Asp Lys Lys Thr Gly Glu Trp Lys Ser Asp 85 90 95 Thr Ser Thr Leu Thr Ile Ser Lys Asn Ser Gln Lys Thr Lys Gln Leu 100 105 110 Val Phe Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Asn Tyr Asn Arg Ala 115 120 125 Gly Asn Ala Leu Glu Gly Ser Pro Ala Glu Ile Lys Asp Leu Ala Glu 130 135 140 Leu Cys Ala Ala Leu Lys 145 150 <210> 50 <211> 150 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BVAD1 <400> 50 Phe Asn Glu Lys Gly Glu Val Ser Glu Lys Ile Leu Thr Arg Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Thr Leu Glu Tyr Ser Gln Met Thr Asp Ala Glu Asn Ala Thr 20 25 30 Lys Ala Val Glu Thr Leu Lys Asn Gly Ile Lys Leu Pro Gly Asn Leu 35 40 45 Val Gly Gly Lys Thr Thr Leu Lys Ile Thr Cys Gly Thr Val Thr Leu 50 55 60 Ser Lys His Ile Ala Lys Ser Gly Glu Val Thr Val Glu Ile Asn Asp 65 70 75 80 Thr Ser Ser Thr Pro Asn Thr Lys Lys Thr Gly Lys Trp Asp Ala Arg 85 90 95 Asn Ser Thr Leu Thr Ile Ile Val Asp Ser Lys Asn Lys Thr Lys Leu 100 105 110 Val Phe Thr Lys Gln Asp Thr Ile Thr Val Gln Ser Tyr Asn Pro Ala 115 120 125 Gly Asn Lys Leu Glu Gly Thr Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Gln Glu 130 135 140 Leu Cys Asn Ala Leu Lys 145 150 <210> 51 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> S3HYBD1 (BSP) <400> 51 Phe Asn Glu Lys Gly Glu Leu Ser Glu Lys Thr Leu Val Arg Ala Asn 1 5 10 15 Gly Thr Lys Leu Glu Tyr Thr Glu Ile Lys Ser Asp Gly Thr Gly Lys 20 25 30 Ala Lys Glu Val Leu Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Asn 35 40 45 Glu Lys Thr Lys Leu Thr Val Thr Cys Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys 50 55 60 Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Ile Thr Val Ala Leu Asn Asp Thr Glu 65 70 75 80 Thr Thr Pro Ala Asp Lys Lys Thr Gly Glu Trp Lys Ser Asp Thr Ser 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Ser Lys Asn Ser Gln Lys Thr Lys Gln Leu Val Phe 100 105 110 Thr Lys Glu Asn Thr Ile Thr Val Gln Asn Tyr Asn Arg Ala Gly Asn 115 120 125 Ala Leu Glu Gly Ser Pro Ala Glu Ile Lys Asp Leu Ala Glu Leu Cys 130 135 140 Ala Ala Leu Lys 145 <210> 52 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSPD1 <400> 52 Phe Asn Glu Lys Gly Glu Leu Ser Glu Lys Thr Leu Val Arg Ala Asn 1 5 10 15 Gly Thr Lys Leu Glu Tyr Thr Glu Ile Lys Ser Asp Gly Thr Gly Lys 20 25 30 Ala Lys Glu Val Leu Lys Asp Phe Thr Leu Glu Gly Thr Leu Ala Asn 35 40 45 Glu Lys Ala Thr Leu Thr Val Lys Cys Gly Thr Val Thr Leu Ser Lys 50 55 60 Asn Ile Asp Lys Ser Gly Glu Val Thr Val Ala Leu Asn Asp Thr Asp 65 70 75 80 Ser Thr Ala Ala Thr Lys Lys Thr Gly Ala Trp Asp Ser Lys Thr Ser 85 90 95 Thr Leu Thr Ile Thr Val Asn Ser Lys Lys Thr Lys Asp Leu Val Phe 100 105 110 Thr Lys Gln Asp Thr Ile Thr Val Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Gly Thr 115 120 125 Thr Leu Glu Gly Ser Ala Val Glu Ile Lys Thr Leu Asp Glu Leu Cys 130 135 140 Asn Ala Leu Lys 145 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for the 16S-23S intergenic spacer <400> 53 gtatgtttag tgaggggggt g 21 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for the 16S-23S intergenic spacer <400> 54 ggatcatagc tcaggtggtt ag 22 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward nested primer for the 16S-23S intergenic spacer <400> 55 aggggggtga agtcgtaaca ag 22 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse nested primer for the 16S-23S intergenic spacer <400> 56 gtctgataaa cctgaggtcg ga 22 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for the RecA gene of Borrelia <400> 57 catgctcttg atcctgttta 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for the RecA gene of Borrelia <400> 58 cccatttctc catctatctc 20 <210> 59 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 25-mer peptide from the Invariable Region 6 (IR6) of VlsE <400> 59 Met Lys Lys Asp Asp Gln Ile Ala Ala Ala Met Val Leu Arg Gly Met 1 5 10 15 Ala Lys Asp Gly Gln Phe Ala Leu Lys 20 25 <210> 60 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse cathelin <400> 60 Arg Leu Ala Gly Leu Leu Arg Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Glu Lys 1 5 10 15 Leu Lys Lys Ile Gly Gln Lys Ile Lys Asn Phe Phe Gln Lys Leu Val 20 25 30 Pro Gln Pro Glu 35 <210> 61 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KLK peptide <400> 61 Lys Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Lys 1 5 10 <210> 62 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal peptide for lipidation <400> 62 Cys Lys Gln Asn 1 <210> 63 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-(dIdC)13-3' <220> <221> misc_feature <222> (1)..(26) <223> n=inosine <400> 63 ncncncncnc ncncncncnc ncncnc 26 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal His tag <400> 64 Leu Glu His His His His His His 1 5 <210> 65 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal CSSF for addition of lipids <400> 65 Cys Ser Ser Phe 1

Claims (62)

1. 보렐리아의 외부 표면 단백질 A (OspA)의 하이브리드 C-말단 단편을 포함하는 폴리펩타이드로서,
   상기 하이브리드 C-말단 OspA 단편은, N- 내지 C-말단 방향으로,
   i) 서열번호: 8을 갖는 B. 가리니, 균주 PBr의 상응하는 단편이 아닌 보렐리아 균주 기원의 OspA의 아미노산 125 내지 176번 또는 아미노산 126 내지 175번으로 이루어진 제1 OspA 부분, 및
   ii) 서열번호: 8을 갖는 B. 가리니, 균주 PBr 기원의 OspA의 아미노산 176 내지 274번으로 이루어진 제2 OspA 부분으로서, 상기 제2 OspA 부분은 서열번호: 8의 위치 182번에서 야생형 아미노산이 시스테인에 의해 치환되고 서열번호: 8의 위치 269번에서 야생형 아미노산이 시스테인에 의해 치환되어 상응하는 야생형 서열과 상이하고, 도입된 시스테인 간의 디설파이드 결합이 존재하는, 제2 Ospa 부분으로 이루어지고,
   상기 아미노산 및 시스테인 치환의 넘버링은 서열번호: 5를 갖는 B. 부르그도르페리 s.s., 균주 B31의 전장 OspA의 상응하는 아미노산의 넘버링에 따르는, 폴리펩타이드.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 하이브리드 C-말단 OspA 단편은 서열번호: 1을 갖는 B. 발라이시아나, 균주 VS116로부터 기원하는 아미노산 125 내지 176번, 및 보렐리아 가리니, 균주 PBr로부터 기원하는 시스틴 안정화된 아미노산 177 내지 274번으로 이루어진 폴리펩타이드.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 하이브리드 C-말단 OspA 단편은 서열번호: 51을 갖는 B. 스피엘마니로부터 기원하는 아미노산 126 내지 175번 및 보렐리아 가리니, 균주 PBr로부터 기원하는 시스틴-안정화된 아미노산 177 내지 274번으로 이루어진, 폴리펩타이드.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 제2 OspA 부분은, 보렐리아 가리니, 균주 PBr로부터 기원하는 시스틴 안정화된 아미노산 177 내지 274번과 동일하지만, 보렐리아 가리니, 균주 PBr의 야생형 OspA의 아미노산 233번에서 트레오닌 잔기가 프롤린 잔기로 치환된 것에 차이가 있는, 폴리펩타이드.
5. 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 폴리펩타이드.
6. 서열번호: 51의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 폴리펩타이드.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩타이드는, 유동 세포측정기에 의해 측정되고, 혈청형 3 보렐리아의 표면에 결합함에 의해 마우스에서 상기 폴리펩타이드로 3회 면역화 후 생성된 항체에 의해 유발되는 형광 강도에 있어서 서열번호: 31을 갖는 Lip-S4D1-S3D1 이종이량체 단백질에 대해 생성된 항체에 의해 유발된 형광 강도와 비교하여 형광 강도에 있어서 적어도 1.5배 증가를 유발하는, 폴리펩타이드.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 작제물이 서열번호: 31을 갖는 Lip-S4D1-S3D1 이종이량체 단백질과 비교하여 그람 바이오매스당 밀리그램으로 측정시 생산 수율에 있어서 적어도 1.5배 증가를 보여주는, 폴리펩타이드.
9. 청구항 1에 있어서, 제2 C-말단 OspA 단편을 추가로 포함하고, 상기 제2 C-말단 OspA 단편은 보렐리아의 OspA 단백질의 C-말단 도메인으로 이루어지고, 상기 C-말단 도메인은 위치 123번, 124번, 또는 125번에서 개시하여 상응하는 야생형 OspA 서열의 위치 273번 또는 274번에서 종료하며, 상기 C-말단 도메인은 상기 야생형 OspA 서열의 위치 182번에서 아미노산의 시스테인에 의한 치환, 및 상기 야생형 OspA 서열의 위치 269번에서 아미노산의 시스테인에 의한 치환을 포함하고, 도입된 시스테인 간의 디설파이드 결합이 존재하고, 추가로 아미노산 및 시스테인 치환의 넘버링은 서열번호: 5를 갖는 B. 부르그도르페이 s.s., 균주 B31의 전장 OspA의 상응하는 아미노산의 넘버링에 따르는, 폴리펩타이드.
10. 청구항 9에 있어서,
    i) 상기 폴리펩타이드는 지질화되거나, 상기 폴리펩타이드의 N 단말은 지질화 신호를 포함하거나;
    ii) 상기 폴리펩타이드의 N 단말은 지질화를 위한 부위를 포함하고, 지질화를 위한 부위는 N-말단 시스테인 잔기가 이끄는 지질화 부위 펩타이드를 포함하고/하거나;
    iii) 상기 폴리펩타이드는 하이브리드 C-말단 OspA 단편 및 제2 C-말단 OspA 단편 사이에 링커를 포함하는, 폴리펩타이드.
11. 청구항 9에 있어서, 상기 제2 C-말단 OspA 단편은 청구항 1의 OspA의 하이브리드 C-말단 단편인, 폴리펩타이드.
12. 청구항 9에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호: 27을 갖는 Lip-S4D1-S3hybD1의 이종이량체로 이루어진, 폴리펩타이드.
13. 서열번호: 27의 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진, 폴리펩타이드.
14. 청구항 1의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
15. 청구항 14에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
16. 청구항 14의 핵산 또는 청구항 15의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
17. 적합한 숙주 세포를 청구항 15의 벡터로 형질전환시키거나 형질감염시킴을 포함하는, 청구항 1의 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 제조하기 위한 방법.
18. 청구항 14에 따른 핵산을 발현시킴을 포함하는, 청구항 1에 따른 폴리펩타이드를 제조하기 위한 방법.
19. 청구항 1에 따른 폴리펩타이드를 제조하기 위한 방법으로서,
    a) 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계,
    b) 상기 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 하는 조건하에서 상기 숙주 세포를 성장시키는 단계,
    c) 상기 숙주 세포를 파쇄시키는 단계, 및
    d) 상기 숙주 세포 파쇄물을 정제 단계에 적용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩타이드를 제조하기 위한 방법.
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 청구항 1의 하이브리드 C-말단 OspA 단편에는 선택적으로 결합하지만, 제1 OspA 부분 또는 제2 OspA 부분에만 결합하지 않는 항체를 제조하는 방법으로서,
    a) 청구항 1의 폴리펩타이드를 비-인간 동물에게 투여함에 의해 상기 비-인간 동물에서 면역 반응을 개시하는 단계,
    b) 상기 비-인간 동물로부터 체액을 함유하는 항체를 제거하는 단계, 및
    c) 상기 항체 함유 체액을 추가의 정제 단계에 적용하여 항체를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체를 제조하는 방법.
27. 청구항 1의 하이브리드 C-말단 OspA 단편에는 선택적으로 결합하지만, 제1 OspA 부분 또는 제2 OspA 부분에만 결합하지 않는 항체를 제조하는 방법으로서,
    a) 청구항 1의 폴리펩타이드를 비-인간 동물에게 투여함에 의해 상기 비-인간 동물에서 면역 반응을 개시하는 단계,
    b) 상기 비-인간 동물로부터 비장 또는 비장 세포를 제거하는 단계,
    c) 상기 비장 또는 비장 세포의 하이브리도마 세포를 생산하는 단계,
    d) 상기 폴리펩타이드에 특이적인 하이브리도마 세포를 선택하고 클로닝하는 단계, 및
    e) 상기 클로닝된 하이브리도마 세포의 배양에 의해 항체를 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체를 제조하는 방법.
28. 보렐리아 감염의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물로서,
    (i) 청구항 1에 따른 폴리펩타이드; 및
    (ii) 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
29. 청구항 28에 있어서, 상기 조성물은 서열번호: 29를 갖는 Lip-S1D1-S2D1 및 서열번호: 33을 갖는 Lip-S5D1-S6D1을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
30. 청구항 28에 있어서, 상기 조성물은 서열번호: 29를 갖는 Lip-S1D1-S2D1을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
31. 청구항 28에 있어서, 상기 조성물은 서열번호: 33을 갖는 Lip-S5D1-S6D1을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
32. 청구항 28에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호: 27을 갖는 Lip-S4D1-S3hybD1 이고, 상기 조성물은 서열번호: 29를 갖는 Lip-S1D1-S2D1 폴리펩타이드 및 서열번호: 33을 갖는 Lip-S5D1-S6D1 폴리펩타이드를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
33. 청구항 28에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 부형제가 L-메티오닌을 포함하는, 약제학적 조성물.
34. 청구항 28에 있어서, 보렐리아 또는 보렐리아 이외의 다른 병원체로부터 기원하는 적어도 하나의 추가의 항원을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
35. 청구항 34에 있어서, 상기 추가의 항원이 진드기 매개 병원체로부터 기원하는, 약제학적 조성물.
36. 청구항 35에 있어서, 상기 진드기 매개 병원체가 보렐리아 헤름시, 보렐리아 파케리, 보렐리아 두토니, 보렐리아 미야모토이, 보렐리아 투리카타, 리케치아 리케치, 리케치아 오스트랄리스, 리케치아코노리, 리케치아헬베티카, 리케치아파케리, 프란시셀라 툴라렌시스, 아나플라스마 파고사이토필럼, 에흐를리키아세네추, 에흐를리키아 카펜시스, 네오에흐를리키아 미쿠렌시스, 콕시엘라부르네티, 보렐리아로네스타리, 진드기 매개 뇌염 바이러스 (TBEV), 콜로라도 진드기 열 바이러스 (CTFV), 크림반도-콩고 출혈 열 바이러스 (CCHFV), 키아사누르 산림 질환 바이러스 (KFDV), 포와산 바이러스, 심장부 바이러스, Omsk 출혈 열 바이러스 (OHFV) 및 바베시아 종으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
37. 청구항 28의 약제학적 조성물을 포함하는 키트로서, 보렐리아 또는 보렐리아 이외의 다른 병원체로부터 기원하는 적어도 하나의 추가의 항원을 추가로 포함하고, 적어도 하나의 추가의 항원이 제2 조성물에 포함되어 있는 키트.
38. 청구항 37에 있어서, 상기 제2 조성물이 백신인, 키트.
39. 청구항 28에 있어서, 면역자극 물질을 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
40. 청구항 39에 있어서, 상기 면역자극 물질이 다가양이온 중합체 및 면역자극 데옥시뉴클레오타이드 또는 적어도 2개의 LysLeuLys 모티프를 함유하는 펩타이드 및 면역자극 데옥시뉴클레오타이드의 배합물인, 약제학적 조성물.
41. 청구항 40에 있어서, 상기 다가양이온 중합체가 폴리아르기닌인, 약제학적 조성물.
42. 청구항 28에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 백신인, 약제학적 조성물.
43. 약물로서 사용하기 위한 청구항 1에 따른 폴리펩타이드.
44. 보렐리아 감염을 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 청구항 1에 따른 폴리펩타이드.
45. 삭제
46. 삭제
47. 삭제
48. 삭제
49. 삭제
50. 청구항 10에 있어서, 상기 지질화 신호는 서열번호: 15를 갖는 이. 콜라이-유래된 주요 외막 지질단백질(lpp) 지질화 신호

    

    인, 폴리펩타이드.
51. 청구항 10에 있어서, 상기 지질화 부위 펩타이드는 시스테인-세린-세린(CSS)을 포함하는, 폴리펩타이드.
52. 청구항 10에 있어서, 상기 링커는 서열번호: 16을 갖는

    

    을 포함하는, 폴리펩타이드
53. 청구항 14에 있어서, 상기 핵산은 서열번호: 26의 핵산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진, 핵산.
54. 청구항 16에 있어서, 상기 숙주 세포는 이. 콜라이인, 숙주 세포.
55. 청구항 38에 있어서, 상기 백신은 진드기 매개 뇌염 백신, 일본 뇌염 백신 또는 록키 마운틴 열 백신인, 키트.
56. 청구항 39에 있어서, 상기 면역자극 물질은 다가양이온 중합체, 면역자극 올리고데옥시뉴클레오타이드 (ODNs), 적어도 2개의 LysLeuLys 모티프를 함유하는 펩타이드, 신경활성 화합물, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 프룬트 완전 또는 불완전 보조제, 및 이의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
57. 청구항 56에 있어서, i) 상기 다가양이온 중합체는 다가양이온 펩타이드이고,
    ii) 상기 면역자극 올리고데옥시뉴클레오타이드는 서열번호: 63을 갖는 올리고(dIdC)₁₃ 이고,
    iii) 적어도 2개의 LysLeuLys 모티프를 함유하는 펩타이드는 서열번호: 61을 갖는 KLKLLLLLKLK 이고/이거나,
    iv) 상기 신경활성 화합물은 인간 성장 호르몬인, 약제학적 조성물.
58. 청구항 44에 있어서, 상기 보렐리아는 B. 부르그도르페리 s.s., B. 가리니, B. 아프젤리, B. 안데르소니, B. 바바리엔시스, B. 비세티, B. 발라이시아나, B. 루시타니아, B. 스피엘마니, B. 자포니카, B. 타누키, B. 투르디 및 B. 시니카로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
59. 청구항 58에 있어서, 상기 보렐리아는 B. 부르그도르페리 s.s., B. 아프젤리 및 B. 가리니로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 폴리펩타이드.
60. 청구항 1에 있어서, 상기 제2 OspA 부분은 서열번호: 8을 갖는 B. 가리니, 균주 PBr 기원의 OspA의 아미노산 177 내지 274번으로 이루어진, 폴리펩타이드.
61. 보렐리아 감염을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 청구항 14에 따른 핵산.
62. 청구항 14에 따른 핵산을 포함하는 보렐리아 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.

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