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KR102458490B1 - 핵산 정제 카트리지 - Google Patents

핵산 정제 카트리지 Download PDF

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KR102458490B1
KR102458490B1 KR1020177008858A KR20177008858A KR102458490B1 KR 102458490 B1 KR102458490 B1 KR 102458490B1 KR 1020177008858 A KR1020177008858 A KR 1020177008858A KR 20177008858 A KR20177008858 A KR 20177008858A KR 102458490 B1 KR102458490 B1 KR 102458490B1
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포라스 프란세스크 베니테즈
고메즈 조셉 파레자
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스타트-다이아그노스티카 앤드 이노베이션, 에스.엘.
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Publication date
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Abstract

하기와 같이, 복잡한 생물학적 샘플로부터 생물학적 또는 화학적 분석물을 정제하기 위한 필터를 함유하는 둘러싸인 챔버를 가지며, 상기 챔버는 상기 필터 이외에도 복수 개의 포트를 수용하는 것인 마이크로유체 장치가 개시되어 있다: 제1 유로를 통한, 챔버의 진공 발생기와의 기체 연통을 가능하게 하는 제1 포트; 제2 유로를 통한, 챔버의 하나 이상의 저장소와의 액체 연통을 가능하게 하는 제2 포트; 제3 유로를 통한, 챔버의 하나 이상의 수용 용기 및 진공 발생기 양자 모두와의 기체 및 액체 연통을 가능하게 하는 제3 포트; 및 제1 및/또는 제2 포트를 통해 챔버에 들어가고 제3 포트를 통해 챔버에서 나오는 유체가 필터를 통과해 흐르도록, 제3 포트와 제1 및 제2 포트 양자 모두의 사이에 위치하는 필터. 본 발명은 또한 마이크로유체 장치를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

핵산 정제 카트리지 {NUCLEIC ACID PURIFICATION CARTRIDGE}
실리카 표면에 대한 DNA 및 RNA의 친화도에 기반한 기본적인 핵산 정제 방법 (고체상 흡착)이 붐(Boom) 등에 의해 개시되었다. 실리카 표면에 대한 핵산의 끌어당김은 고 농도의 카오트로픽 염(chaotropic salt) (전형적으로는 구아니딘 이소티오시아네이트 또는 구아니딘 히드로클로라이드)에 의해 촉진된다. 붐 방법은 생물학적 샘플을 변성시키기 위해 카오트로픽 염 용액을 사용하고 실리카 표면 상에의 DNA 및 RNA의 흡착을 촉진시키기 위해 원심력을 이용하여 샘플이 필터를 통과하도록 한다. 핵산이 필터에 결합하면, 핵산이 결합된 상태를 유지하면서 카오트로픽 염과 다른 생물학적 불순물을 제거하기 위해 (카오트로픽 염은 하류 응용에서 대부분의 핵산에 대하여 파괴적임) 에탄올계 완충액을 이용한 한번 이상의 세척을 수행한다. 최종 단계로서, 에탄올의 제거 후에 (고속 회전에 의해), 핵산은 용리 완충액 (물 또는 저염 완충액)을 사용하여 재수화될 필요가 있다. 재수화는 실리카 표면으로부터의 DNA 및 RNA의 분리를 촉진시키고, 정제된 핵산이 재현탁되어 있는 용액이 최종 회전에 의해 제공된다.
액체 흐름의 구동력으로서 원심력 또는 진공을 사용하는, 상기 프로토콜의 변형예가 다른 곳에서 개시되었다. 그러나, 이들 방법은 모두 여러 번의 피펫팅 단계와 액체의 흐름을 제어하기 위한 상이한 구동력의 순차적인 적용을 포함하여, 다소 복잡하고 시간이 오래 걸리며, 이는 보통 반복된 정제 프로세싱 사이에 수율이 크게 변화하도록 한다.
예를 들어, NA가 하류 응용 (예컨대, qPCR 증폭 및 검출)을 위해 추가로 이용가능하도록 하기 위해, 진공에 의한 정제 프로토콜을 수동으로 실시할 때, 정제 프로세싱은 5종의 상이한 액체, 즉 핵산을 함유하는 샘플 혼합물, 필터를 세정하고 임의의 양의 오염물질을 제거하기 위한 세척 완충액 1 및 세척 완충액 2, 필터를 건조시키고 임의의 미량의 휘발성 오염물질을 제거하기 위한 공기, 및 필터로부터 핵산을 방출시키는 용리 완충액을 실리카 필터를 통해 흘리는 것에 상응하는 5개의 주요 단계로 이루어진다. 각각의 단계가 종료될 때, 다음 액체를 피펫팅하기 전에 필터 간극 내에 액체가 거의 남아있지 않도록 보장하기 위해, 일정 부피의 액체가 필터를 통과해 흐른 후에도 1분 또는 2분간 진공 흡인이 유지된다.
핵산 수율의 재현성은 샘플 및 완충액과 필터의 접촉 시간 및 액체 흐름의 규모와 분배를 재현하는 가능성에 좌우되며, 이는 조작원의 기술에 좌우된다.
따라서, 본 발명의 목적은 개별 조작원과 무관하게 재현가능한 정제 결과를 제공하는 정제 장치를 제공하는 것이다.
이는 복잡한 생물학적 샘플로부터 생물학적 또는 화학적 분석물을 정제하기 위한 마이크로유체 장치 및 방법에 의해 달성된다. 마이크로유체 장치는 필터가 삽입된 챔버, 여러 개의 저장소 및 밸브를 포함한다. 장치는 자동화 기기에 의해 작동되는 외부 펌프와 접속될 수 있다. 그에 따라 본원의 장치 및 방법은 전통적인 핵산 정제 방법의 종단간(end-to-end) 자동화 구현을 제공한다.
EP 1 300 680 A2 (2003.04.09.) US 8,747,669 B1 (2014.6.10.)
본 발명은 하기와 같이, 복잡한 생물학적 샘플로부터 생물학적 또는 화학적 분석물을 정제하기 위한 필터를 함유하는 둘러싸인 챔버를 가지며, 상기 챔버는 상기 필터 이외에도 복수 개의 포트를 수용하는 것인 마이크로유체 장치에 관한 것이다: 제1 유로를 통한, 챔버의 진공 발생기와의 기체 연통을 가능하게 하는 제1 포트; 제2 유로를 통한, 챔버의 하나 이상의 저장소와의 액체 연통을 가능하게 하는 제2 포트; 제3 유로를 통한, 챔버의 하나 이상의 수용 용기 및 진공 발생기 양자 모두와의 기체 및 액체 연통을 가능하게 하는 제3 포트; 및 제1 및/또는 제2 포트를 통해 챔버에 들어가고 제3 포트를 통해 챔버에서 나오는 유체가 필터를 통과해 흐르도록, 제3 포트와 제1 및 제2 포트 양자 모두의 사이에 위치하는 필터.
본원에 개시된 발명은 또한 (a) 유로 내의 밸브가 제1 및 제2 포트에 대해서 개방되어 있고 제3 포트에 대해서 폐쇄되어 있는 동안에, 챔버와 제1 저장소 사이에 음압차를 적용함으로써 액체 샘플이 제2 포트를 통해 챔버에 들어가도록 하는 단계; (b) 유로 내의 밸브가 제1 포트에 대해서 폐쇄되어 있고, 제2 포트에 대해서 대기압으로 통기되며, 제3 포트에 대해서 개방되어 있는 동안에, 제1 수용 용기와 챔버 사이에 음압차를 적용함으로써 샘플이 필터를 통과해 상기 제1 수용 용기로 흘러 들어가도록 하는 단계; (c) 유로 내의 밸브가 제1 및 제2 포트에 대해서 개방되어 있고 제3 포트에 대해서 폐쇄되어 있는 동안에, 챔버와 수용 용기 중 어느 하나 사이에 음압차를 적용함으로써 분석물을 필터로부터 용리시키는 단계를 포함하는, 본원에 개시된 마이크로유체 장치를 사용하여 복잡한 생물학적 샘플로부터 생물학적 또는 화학적 분석물을 정제하는 방법에 관한 것이다.
정제는 원칙적으로 크로마토그래피 (예를 들어, 치환, 친화도, 양이온 교환, 음이온 교환, 크기 배제, 역상 및 순상)에서 널리 공지되어 있는 임의의 효과에 기반하는 것일 수 있으며 그의 선택은 주로 정제될 분석물에 좌우된다. 그러나, 크기 배제는 다른 기술보다 덜 바람직한데, 그 이유는 이 기술의 경우에는 영구적인 결합이 달성될 수 없기 때문이다. 나머지 다른 기술의 경우에는 정제될 분석물이 매체와 선택적으로 결합하고, 반면에 이상적으로 샘플의 다른 구성성분이 결합 없이 매체를 지나가는 조건이 확인될 수 있다.
본 발명의 마이크로유체 장치는 필터를 함유하는 둘러싸인 챔버를 포함한다. 본원에서 필터는 샘플의 상이한 구성성분과 차등 상호작용하는 매체를 나타낸다. 통상의 크로마토그래피에서 이러한 매체는 보통 고정상이라 불릴 것이다. 샘플이 적합한 완충액 (크로마토그래피에서 보통 이동상이라 함) 중에 상기 매체를 통해 이동한다면, 차등 상호작용 (분배라고도 함)이 차등이 있는 체류 시간 및 그에 따라 정제 효과를 초래할 것이다.
본원에 개시된 장치에 사용되는 필터는 복잡한 생물학적 샘플로부터 생물학적 또는 화학적 분석물을 정제하는데 적합한 것이다. 분석물은 정제될 물질이다. 복잡한 생물학적 샘플은 정제될 분석물 이외에도, 다양한 크기 및 화학의 수많은 상이한 구성성분, 예컨대 단백질, 핵산, 호르몬, 지질, 염을 포함하는 샘플이다. 바람직한 샘플은 세포 용해물이다.
바람직한 실시양태에서, 필터는 실리카로 제조되거나 또는 실리카를 적어도 포함한다. 예를 들어, 필터는 실리카 막, 또는 실리카 비드 또는 실리카 코팅된 비드를 함유하는 수지의 형태일 수 있다. 실리카 표면은 핵산, 특히 DNA를 분리 또는 정제하는데 있어서 유용하다. 실리카는 특정 염 및 pH 조건 하에서 DNA 분자를 흡착시키는 것으로 공지되어 있으며, 실리카 흡착은 DNA 정제에 있어서 중요한 기술이 되었다.
본 발명의 한 실시양태에서, 필터 요소는 정제 공동에 통합되어 고정 고리에 의해 고정된다. 바람직한 실시양태에서, 정제 막 필터는 마이크로유체 장치 본체의 부분인 공동에 삽입되고, 막 필터는 그것을 압축시키는 고정 고리에 의해 제 위치에서 유지된다 (도 2a 및 2b).
별법의 실시양태에서, 정제 공동은 마이크로유체 장치로 조립되는 별개의 부분이며, 이는 막 필터를 제 위치에서 유지하기 위한 고정 고리에 대한 필요성을 제거한다. 정제 공동 자체가 막의 올바른 압축으로, 공동 및 막 필터를 제 위치에서 고정하는 클립핑(clipping) 특징부를 제공한다 (도 2c 및 2d).
바람직하게는 클립핑 특징부에 의해 제 위치에서 유지되는 별개의 공동은 고정 고리를 포함하는 공동과 비교하여 다수의 장점을 갖는다.
막 필터의 재현가능한 압축이 클립핑 특징부에 의해 달성된다. 이는 재현가능한 압축을 보장하여, 막 필터를 통한 액체의 재현가능한 흐름, 및 그에 따라 정제된 핵산 또는 다른 정제된 분석물의 재현가능한 수율을 발생시킨다.
정제 공동의 마이크로유체 장치 내에서의 정확한 배치가 디자인에 의해 제공되는 압축량의 제어를 필요로 하지 않으면서, 바람직하게는 그의 클립핑 특징부에 의해 보장된다. 이는 제조를 용이하게 한다.
정제 공동은 고정 고리에 대한 필요성을 제거하여, 샘플의 오염 감소를 초래한다. 고정 고리는 유체 경로를 방해하고 나머지 액체를 모아서, 완충액 사이에 오염을 발생시키고 최종 정제된 용리물 중에 특정 양의 오염물질을 초래하는데, 이는 PCR과 같은 하류 분석을 못하게 할 수 있다. 분리가능한 정제 공동은 그의 벽 상에서 매끄러운 이행을 초래하여, 벽에 갇힐 수 있는 오염물질의 양을, 전형적으로 5 내지 10배 감소시킨다.
분석물이 핵산인 것이 바람직하다. 핵산이라는 용어는 프로세싱 및 비-프로세싱 형태의 mRNA (전령 RNA), tRNA (운반 RNA), hn-RNA (이형핵 RNA), rRNA (리보솜 RNA), LNA (잠금 핵산), mtRNA (미토콘드리아 RNA), nRNA (핵 RNA), siRNA (짧은 간섭 RNA), snRNA (소형 핵 RNA), snoRNA (소형 핵소체 RNA), scaRNA (소형 카할 바디(Cajal Body) 특이적 RNA), 마이크로RNA, dsRNA (이중 가닥 RNA), 리보자임, 리보스위치, 바이러스 RNA, dsDNA (이중 가닥 DNA), ssDNA (단일 가닥 DNA), 플라스미드 DNA, 코스미드 DNA, 염색체 DNA, 바이러스 DNA, mtDNA (미토콘드리아 DNA), nDNA (핵 DNA), snDNA (소형 핵 DNA) 등 뿐만 아니라, 모든 다른 가능한 핵산을 포함한다.
챔버는 하기와 같이, 상기 필터 이외에도 복수 개의 포트를 수용한다: 제1 유로를 통한, 챔버의 진공 발생기와의 기체 연통을 가능하게 하는 제1 포트; 제2 유로를 통한, 챔버의 하나 이상의 저장소와의 액체 연통을 가능하게 하는 제2 포트; 제3 유로를 통한, 챔버의 하나 이상의 수용 용기 및 진공 발생기 양자 모두와의 기체 및 액체 연통을 가능하게 하는 제3 포트.
진공 발생기는 챔버의 상류에 위치한다. 하나 이상의 저장소 역시 챔버의 상류에 위치하나, 진공 발생기와는 다른 유로에 위치한다. 하나 이상의 수용 용기는 챔버의 하류에 위치한다. 또한 수용 용기(들)의 하류에 제3 유로의 진공 발생기가 위치한다.
저장소(들)는 보통 적어도 정제될 샘플을 함유하는 저장소 및 임의로, 1종 이상의 세척 완충액 및/또는 용리 완충액 및/또는 재생 완충액을 포함하는 하나 이상의 저장소를 포함한다. 하나 이상의 용기는 보통 분석물을 수용하기 위한 적어도 하나의 용기 및 임의로, 다른 액체, 예를 들어 통과액, 세척 완충액(들) 및/또는 재생 완충액(들)을 수용하기 위한 하나 이상의 용기를 포함한다.
필터는 제1 및/또는 제2 포트를 통해 챔버에 들어가고 제3 포트를 통해 챔버에서 나오는 유체가 필터를 통과해 흐르도록, 제3 포트와 제1 및 제2 포트 양자 모두의 사이에 위치한다. 가장 편리하게는, 필터가 챔버의 전체 횡단면에 걸쳐서 확장된다. 그러나, 매체가 챔버의 전체 높이까지 완전히 충전될 필요는 없다. 바람직하게는, 필터는 제3 포트의 바로 위에 위치한다.
장치가 마이크로유체 카트리지인 것이 바람직하다. 카트리지란 적합한 인터페이스를 통해 보다 큰 유닛에 의해 작동가능한 소모성 부품을 의미한다. 보통, 유닛은 고가이고/거나 내구적인 요소 또는 청정화가 용이한 요소, 및 프로세싱의 제어를 자동화하는 소프트웨어 코드부를 함유한다. 유닛은 별법으로 정제 유닛의 상류 또는 하류에서 다른 프로세싱을 수행하기 위한 추가 요소를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 장치는 일회용인데, 이는 장치가 단회 사용을 위해 디자인되었고 그 후에 폐기됨을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 장치는 재사용가능하나, 보통 각각의 사용 후에 장치의 재생을 필요로 한다.
장치는 밸브를 추가로 포함할 수 있고, 이상적으로는 진공 발생기가 분리된다. 진공 발생기는 챔버의 압력을 배기시킴으로써, 상대적 음압을 발생시킨다. 포트 구성 (즉, 개방 또는 폐쇄)에 따라, 유체가 저장소 중 어느 하나로부터 챔버로, 또한/또는 챔버로부터 수용 용기 중 어느 하나로 흡인된다. 바람직한 실시양태에서, 진공 발생기는 시린지 펌프 또는 다이어프램 펌프이다. 추가로 바람직한 실시양태에서, 진공은 동일한 진공 발생기로 제1 포트 및/또는 제3 포트에 적용될 수 있다.
공지된 마이크로유체 장치는 시스템에서의 압력을 추적하기 위한 수단을 포함하지 않는다. 본 발명은 바람직하게는 하나 이상의 압력 센서를 포함한다. 압력 센서는 바람직하게는 수용 용기의 상류에서 제3 유로 내에 위치한다. 또 다른 압력 센서는 바람직하게는 진공 발생기의 하류에서 제1 유로 내에 위치한다. 상기 압력 센서는 필터의 유체 상태를 나타내는, 필터에 의해 유발된 압력 강하를 결정하는데 사용될 수 있다. 그에 따라, (i) 시간 및 완충액을 최소화하는, 방법의 단계가 완료되는 시점 (예를 들어, 건조 단계 동안에 필터가 완전히 건조되는 시점; 유리하게는 각각의 액체를 흘린 후에, 그 다음 액체를 흘리기 전에 실시되는 퍼징 단계 동안에 필터의 액체 잔류물이 충분히 퍼징되는 시점); (ii) 샘플의 밀도 및 점도 때문에 액체 흐름에 대한 저항성의 증가가 일어난다면, 시스템이 흡인 압력의 '적시(just-in-time)' 증가를 적용하도록 하는, 액체가 필터를 완전히 통과하여 흘렀는지의 여부; (iii) 필터의 폐색 여부; 및 (iv) 정제 방법에 대한 제어로서 미리 결정된 한계값과 비교할 수 있는, 각각의 액체가 필터를 통과하는데 요구되는 시간이 결정될 수 있다.
상기에 기재된 바와 같이, 본원에 개시된 장치는 챔버와 연통되는 3개의 포트를 갖는다: 제1 포트 (기체 배출 포트), 제2 포트 (액체 주입 포트) 및 제3 포트 (액체/기체 배출 포트). 각각의 포트는 각각의 유로 내에 위치하는 밸브에 의해 개별적으로 개방, 폐쇄, 또는 대기로 통기될 수 있다. 편리하게는, 멀티포트 밸브가 사용되고, 필요에 따라 2개 또는 3개의 포트가 동일한 멀티포트 밸브로 작동된다. 그의 상응하는 밸브와 필터 사이에서 제3 유로에 의해 둘러싸인 불감 부피(dead volume)는 1 uL 내지 10 mL인 것이 바람직하다. 액체의 제어 흐름 (필터의 완전한 습윤화 동안 흐름이 부재하는 상황 포함)이, 진공을 적절한 포트에 적용하고 각각의 단계에서 적절한 밸브를 개방하고 폐쇄시킴으로써 달성된다. 이는 생물학적 샘플의 유형과 상관없이, 공지된 장치보다 높은 재현성을 장치에 부여한다.
예를 들어, 하류 응용 (예컨대, qPCR 증폭 및 검출)을 위해 추가로 이용가능하도록 하기 위해, 진공에 의한 정제 프로토콜을 수동으로 실시하는 통상의 정제 키트에서, 정제 프로세싱은 5종의 상이한 액체를 필터를 통해 흘리는 것에 상응하는 5개의 주요 단계, 즉 핵산을 함유하는 샘플 혼합물의 로딩, 필터를 세정하고 임의의 양의 오염물질을 제거하기 위한 세척 완충액 1 및 세척 완충액 2를 이용한 세척, 필터의 공기 건조 및 임의의 미량의 휘발성 오염물질의 제거, 및 필터로부터 핵산을 방출시키는 용리로 이루어진다. 각각의 단계가 종료될 때, 다음 액체를 피펫팅하기 전에 필터 간극 내에 액체가 거의 남아있지 않도록 보장하기 위해, 일정 부피의 액체가 필터를 통과해 흐른 후에도 1분 또는 2분간 진공 흡인이 유지되고, 이 작업을 '퍼징'이라 한다.
동일한 효과를 달성하기 위해, 자동화 프로토콜은 기본적으로 동일한 단계를 포함하나, 이들 단계가 각각의 포트를 적절한 저장소에 연결하고, 모든 단계를 자동화하는 소프트웨어를 사용하여 압력원 (예를 들어, 시린지 또는 회전 펌프), 밸브 세트, 마이크로유체 채널 세트 및 마이크로컨트롤러에 의해 항상 적절한 압력차를 적용함으로써 달성된다.
본원에 개시된 마이크로유체 장치는 1종 이상의 분석물이 다른 구성성분으로부터 분리되어야 하는 방법, 즉 정제 방법에 사용하기에 특히 적합하다. 따라서, 본 발명의 또 다른 목적은 (a) 유로 내의 밸브가 제1 및 제2 포트에 대해서 개방되어 있고 제3 포트에 대해서 폐쇄되어 있는 동안에, 챔버와 제1 저장소 사이에 음압차를 적용함으로써 액체 샘플이 제2 포트를 통해 챔버에 들어가도록 하는 단계; (b) 유로 내의 밸브가 제1 포트에 대해서 폐쇄되어 있고, 제2 포트에 대해서 대기압으로 통기되며, 제3 포트에 대해서 개방되어 있는 동안에, 제1 수용 용기와 챔버 사이에 음압차를 적용함으로써 샘플이 필터를 통과해 상기 제1 수용 용기로 흘러 들어가도록 하는 단계; (c) 유로 내의 밸브가 제1 및 제2 포트에 대해서 개방되어 있고 제3 포트에 대해서 폐쇄되어 있는 동안에, 챔버와 수용 용기 중 어느 하나 사이에 음압차를 적용함으로써 분석물을 필터로부터 용리시키는 단계를 상기 순서로 포함하는, 본원에 기재된 마이크로유체 장치를 사용하여 복잡한 생물학적 샘플로부터 생물학적 또는 화학적 분석물을 정제하는 방법이다.
단계 a에서의 압력은 제1 유로에 위치하는 진공 발생기에 의해 발생할 수 있다. 단계 b에서의 압력은 제3 유로에 위치하는 진공 발생기에 의해 발생할 수 있다.
단계 c에서의 용리는 하기에 상세히 설명된 바와 같이 수행될 수 있다.
i) 유로 내의 밸브가 제1 및 제2 포트에 대해서 개방되어 있고 제3 포트에 대해서 폐쇄되어 있는 동안에, 챔버와 제3 저장소 사이에 음압차를 적용함으로써 제3 저장소에 함유된 용리 완충액이 제2 포트를 통해 챔버에 들어가도록 한다. 압력은 제1 유로에 위치하는 진공 발생기에 의해 발생할 수 있다;
ii) 유로 내의 밸브가 제1 및 제2 포트에 대해서 개방되어 있고 제3 포트에 대해서 폐쇄되어 있는 동안에, 용리 완충액이 미리 결정된 시간 동안 필터와 접촉하도록 한다. 이 단계는 목적하는 분석물의 방출을 위한 필터의 충분한 습윤화를 가능하게 한다;
iii) 유로 내의 밸브가 제1 포트에 대해서 폐쇄되어 있고, 제2 포트에 대해서 대기압으로 통기되며, 제3 포트에 대해서 개방되어 있는 동안에, 제2 수용 용기와 챔버 사이에 음압차를 적용함으로써 용리 완충액 (방출된 분석물 함유)이 필터를 통과해 상기 제2 수용 용기로 흘러 들어가도록 한다. 압력은 제3 유로의 진공 발생기에 의해 발생할 수 있다.
바람직하게는, 방법은 유로 내의 밸브가 제1 및 제2 포트에 대해서 개방되어 있고 제3 포트에 대해서 폐쇄되어 있는 동안에, 샘플이 미리 결정된 시간 동안 필터와 접촉하도록 하는 단계를 단계 a와 단계 b 사이에 추가로 포함한다.
방법은 하기 단계 중 하나 이상을 단계 b와 단계 c 사이에 임의로 포함할 수 있다.
(i) 유로 내의 밸브가 제1 포트에 대해서 폐쇄되어 있고, 제2 포트에 대해서 대기압으로 통기되며, 제3 포트에 대해서 개방되어 있는 동안에, 제3 유로와 챔버 사이에 음압차를 적용함으로써 미리 결정된 시간 동안 필터를 청정화 및 건조하며, 상기 음압차가 제3 유로에 위치하는 진공 발생기에 의해 발생하는 것인 단계; 및/또는
(ii) 유체 경로 내의 밸브가 제2 및 제3 포트에 대해서 개방되어 있고 제1 포트에 대해서 폐쇄되어 있는 동안에, 수용 저장소와 제2 저장소 사이에 음압차를 적용함으로써 상기 제2 저장소에 위치하는 세척 완충액이 제2 포트를 통해 챔버에 들어가고 필터를 통과해 상기 수용 용기로 흘러 들어가도록 하며, 압력이 제3 유로에 위치하는 진공 발생기에 의해 발새할 수 있는 것인 단계; 및/또는
(iii) 유로 내의 밸브가 제1 포트에 대해서 폐쇄되어 있고, 제2 포트에 대해서 대기압으로 통기되며, 제3 포트에 대해서 개방되어 있는 동안에, 제3 유로와 챔버 사이에 음압을 적용함으로써 미리 결정된 시간 동안 기체가 필터를 통과해 흐르도록 하며, 기체가 액체를 치환하여 필터를 건조시키고, 압력이 제3 유로에 위치하는 진공 발생기에 의해 발생할 수 있는 것인 단계.
바람직하게는, 압력차는 하나 이상의 밸브가 개폐되어야 하고, 그에 따라 방법의 다음 단계가 수행되어야 하는 시점을 결정하기 위해 결정된다. 필터에서의 압력 강하는 밸브(들)가 방법의 다음 단계를 수행하도록 작동될 수 있음을 나타낸다.
또한, 필터를 건조시키기 위한 기체 흐름이 제1 및 제2 압력 센서 사이의 압력차의 1차 미분 값이 미리 한정된 한계값 미만인 경우에만 적용되는 것이 바람직하다.
표 1은 자동화 수단에 의한 정제 프로세싱을 위해 수행되어야 하는 예시 방법 단계를 상세히 설명한다. 도면에 도시된 흐름도는 상기 단계 각각에 대한 포트/밸브 구성을 도시한다.
<표 1> 예시 정제 프로세싱의 상세한 프로토콜
Figure 112017031655248-pct00001
본 발명은 완전 자동화가 달성될 수 있고 정제 프로세싱의 완료를 위해 수동 조작이 필요하지 않으므로, 재현가능한 결과가 달성된다는 장점을 갖는다. 또한, 정제 장치/프로세싱이 다른 상류 또는 하류 장치/프로세싱 (예를 들어, 용해, 증폭 및 검출)에 연결될 수 있다. 선행기술과 달리, 액체는 제3 포트가 폐쇄되어 있는 동안에, 제1 포트에 적용되는 진공에 의해 챔버 내로, 그리고 필터 상으로 이동한다. 이는 미리 결정된 인큐베이션 시간 동안 필터의 예비-습윤화를 허용하면서, 필터를 통한 흐름을 방지한다. 액체는 제3 포트에 적용되는 진공에 의해, 상기 포트의 밸브 개방 후에 필터를 통과해 이동한다. 종합하면, 공지된 방법과 비교하여 대등하거나 또는 그보다 높은 핵산 수율이 수득된다.
<도면의 간단한 설명>
도 1은 플라스틱 본체(2), 및 고정 고리(10)에 의해 압축되어 제 위치에서 유지되는 막 필터(3)로 이루어진 수동 정제용 시판 키트로부터의 정제 컬럼(1)을 도시한다. 플라스틱 본체는 액체 주입구(4) 및 액체 배출구(5)를 포함한다.
도 2a는 통합된 정제 공동(101), 및 고정 고리(10)에 의해 제 위치에서 유지되는 막 필터(3)를 갖는 마이크로유체 장치(100)의 부분을 도시한다.
도 2b는 통합된 정제 공동(101), 및 고정 고리(10)에 의해 제 위치에서 유지되는 막 필터(3)를 갖는 마이크로유체 장치(100)의 회전 단면도를 도시한다. 정제 공동(101)에 연결된 기체 포트(102), 액체 주입 포트(103) 및 배출 포트(104)가 또한 도시되어 있다.
도 2c는 별개의 정제 공동(200)을 도시한다.
도 2d는 마이크로유체 장치(100)에 조립되고 테이퍼링 형상(tapered shape) 및 중공형 내부를 갖는 둘러싸인 컬럼을 형성하는 정제 공동(200)을 도시한다. 클립핑 특징부(201)가 정제 공동(200)을 제 위치에서 유지하고 막 필터(3)에 올바른 압축을 적용한다. 기체 포트(203), 액체 주입 포트(204) 및 배출 포트(205)가 또한 도시되어 있다.
도 2e는 액체의 로딩 (단계 1) 및 세척/용리 (단계 2) 동안의 포트 구성 및 흐름 방향을 도해한다. 실선 화살표는 액체 흐름을 나타내고; 점선 화살표는 기체 흐름을 나타내며; X는 밸브에 의해 폐쇄된 포트를 나타낸다.
도 3 내지 11: 표 1에 상세히 설명된 단계 각각에 대한 포트/밸브 구성을 도시하는 상세한 흐름도. 본 발명의 장치가 도면에 도시된 요소 각각을 포함할 수 있지만, 반드시 포함해야 하는 것은 아님을 이해하여야 한다. 상세한 설명 및/또는 청구범위는 필수 요소를 나타낸다. 상기 요소 이외에도, 하나 이상의 추가의 임의적인 요소가 서로 독립적으로 선택될 수 있다. 임의적인 요소는 하기에 나타나 있다. 1: 진공 발생기(1) (예를 들어, 시린지 펌프); 2: 진공 발생기(2) (임의적, 예를 들어 다이어프램 펌프); 3 - 7: 밸브 (예를 들어, 멀티포트 밸브); 8 및 9: 압력 센서 (임의적); 10: 챔버; 11: 고정 고리 (임의적); 12: 필터; 13: 폐기물 수용 용기 (임의적); 14: 용리물 수용 용기; 15: 샘플 저장소; 16 - 17: 저장소 (임의적); 18: 용리 완충액 저장소.

Claims (17)

  1. (a) 정제 공동의 상류의 하나 이상의 저장소;
    (b) 정제 공동의 하류의 하나 이상의 폐기물 수용 용기;
    (c) 마이크로유체 장치로부터 분리가능하도록 구성되고 테이퍼링 형상(tapered shape) 및 중공형 내부를 갖는 둘러싸인 컬럼을 형성하며, 저장소 또는 폐기물 수용 용기 중 임의의 것으로부터 분리되고 저장소 또는 폐기물 수용 용기 중 임의의 것과 인접하지 않는 정제 공동이며:
    (i) 제1 유로를 통한, 정제 공동과 진공 발생기 사이의 기체 연통을 제공하도록 구성된 제1 포트;
    (ii) 제2 유로를 통한, 정제 공동과 하나 이상의 저장소 사이의 액체 연통을 제공하도록 구성된 제2 포트; 및
    (iii) 제3 유로를 통한, 정제 공동과 하나 이상의 폐기물 수용 용기 및 진공 발생기 양자 모두 사이의 기체 및 액체 연통을 제공하도록 구성된 제3 포트
    를 포함하고, 제1, 제2, 및 제3 포트가 정제 공동의 외부 주변 표면 상에 위치되는 정제 공동; 및
    (d) 액체 흐름의 방향에 직교하는 정제 공동의 단면에 걸친 필터이며, 제1 및 제2 포트 중 하나 또는 둘 다를 통해 정제 공동에 들어가고 제3 포트를 통해 정제 공동에서 나오는 유체가 필터를 통과해 흐르도록 제3 포트 위에 위치하며, 복잡한 생물학적 샘플로부터 생물학적 또는 화학적 분석물을 정제하도록 구성된 필터
    를 포함하는 마이크로유체 장치.
  2. 제1항에 있어서, 마이크로유체 카트리지이며, 일회용이거나 또는 재사용가능한 마이크로유체 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 정제될 분석물이 핵산을 포함하는 마이크로유체 장치.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 필터가 실리카를 포함하는 것인 마이크로유체 장치.
  5. 제4항에 있어서, 필터가 실리카 막, 또는 실리카 비드 또는 실리카 코팅된 비드를 함유하는 수지를 포함하는 것인 마이크로유체 장치.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 정제 공동이 마이크로유체 장치에서의 정제 공동의 위치를 고정하도록 구성된 클립핑 특징부를 포함하는 것인 마이크로유체 장치.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 진공 발생기가 시린지 펌프, 다이어프램 펌프 또는 둘의 조합인 마이크로유체 장치.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 진공이 동일한 진공 발생기로 제1 포트 및 제3 포트 중 하나 또는 둘 다에 적용될 수 있는 것인 마이크로유체 장치.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 정제 공동과 하나 이상의 폐기물 수용 용기 사이의 제3 유로 내에 위치하는 제1 압력 센서를 추가로 포함하는 마이크로유체 장치.
  10. 제9항에 있어서, 정제 공동과 진공 발생기의 사이의 제1 유로 내에 위치하는 제2 압력 센서를 추가로 포함하는 마이크로유체 장치.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포트가 그의 유로 내에 있는 하나 이상의 멀티포트 밸브에 의해 개별적으로 개방, 폐쇄, 또는 대기로 통기될 수 있는 것인 마이크로유체 장치.
  12. 제11항에 있어서, 제3 유로의 상응하는 밸브와 필터 사이에서 제3 유로에 의해 둘러싸인 불감 부피가 1 μL 내지 10 mL인 마이크로유체 장치.
  13. (a) 정제 공동과 제1 저장소 사이에 음압차를 적용하여 액체 샘플이 제2 포트를 통해 정제 공동 내로 흐르도록 하는 단계;
    (b) 제1 폐기물 수용 용기와 정제 공동 사이에 음압차를 적용하여 액체 샘플이 필터를 통과해 제3 포트 밖으로 흐르도록 하는 단계; 및
    (c) 정제 공동과 제2 폐기물 수용 용기 사이에 음압차를 적용함으로써 분석물을 필터로부터 용리시켜 용리 완충액이 필터를 통과해 제3 포트 밖으로 흐르도록 하는 단계
    를 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따른 마이크로유체 장치를 사용하여 복잡한 생물학적 샘플로부터 생물학적 또는 화학적 분석물을 정제하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 단계 c에서의 용리가:
    (i) 정제 공동과 제2 저장소 사이에 음압차를 적용하여 용리 완충액이 제2 포트를 통과해 정제 공동 내로 흐르도록 하는 단계; 및
    (ii) 용리 완충액이 미리 결정된 인큐베이션 시간 동안 필터로 인큐베이팅되는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 미리 결정된 인큐베이션 시간 동안 필터로 액체 샘플을 인큐베이팅 하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 하기 단계 중 하나 이상을 단계 b와 단계 c 사이에 추가로 포함하는 방법:
    (i) 제3 유로와 정제 공동 사이에 음압을 적용하여 미리 결정된 시간 동안 필터를 청정화 및 건조시키는 단계; 또는
    (ii) 폐기물 수용 용기와 제2 저장소 사이에 음압차를 적용하여, 세척 완충액이 제2 포트를 통해 제2 저장소로부터 정제 공동으로 흐르도록 하고, 폐기물 수용 용기와 제2 저장소 사이에 음압차를 적용함으로써 정제 공동의 필터를 통과해 폐기물 수용 용기 내로 흐르도록 하는 단계; 또는
    (iii) 제3 포트를 통해 진공 발생기와 정제 공동 사이에 음압을 적용하여 기체가 미리 결정된 시간 동안 필터를 통과해 흐르도록 하는 단계.
  17. 제13항에 있어서, 제1 유로, 제2 유로, 및 제3 유로 내의 하나 이상의 멀티포트 밸브가 압력차에 의해 작동되는 것을 추가로 포함하는 방법.
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