KR102433234B1

KR102433234B1 - L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 l-시트룰린의 생산 방법

Info

Publication number: KR102433234B1
Application number: KR1020200127021A
Authority: KR
Inventors: 이동석; 최민진; 김문정; 박석현; 한재춘
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2022-08-18
Anticipated expiration: 2040-09-29
Also published as: CN116171327A; EP4223880A4; CN116171327B; JP7537014B2; JP2023540330A; US20230332192A1; WO2022071638A1; KR20220043522A; EP4223880A1

Abstract

본 발명은 L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 L-시트룰린의 생산 방법에 관한 것으로, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주는 NCgl2816 유전자에 의해 발현되는 수송 단백질의 활성이 약화 또는 불활성화됨으로써 L-시트룰린을 고수율 및 고농도로 생산할 수 있다.

Description

L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 L-시트룰린의 생산 방법{Mutant of Corynebacterium glutamicum with enhanced L-citrulline productivity and method for preparing L-citrulline using the same}

본 발명은 L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 및 이를 이용한 L-시트룰린의 생산 방법에 관한 것이다.

L-시트룰린(citrulline)은 비필수 아미노산 중의 하나로, 시트룰린에는 암모니아 대사 촉진이나 혈관 확장에 의한 혈류 개선, 혈압 저하, 신경 전달, 면역력 증진, 활성 산소 소거 등의 유용한 작용이 있다는 점이 알려져 있다. 이러한 시트룰린은 아르기닌의 생합성 과정에서 중간 생산물로 합성된다. 미생물에서 아르기닌의 생합성은 선형 단계와 고리형 단계의 서로 다른 두 경로를 통해, L-글루타메이트(L-glutamate)로부터 8번의 효소 단계를 거쳐서 이루어진다. 선형 단계에서, L-아르기닌은 L-글루타메이트에서 N-아세틸글루타메이트(N-acetylglutamate), N-아세틸오르니틴(N-acetylornithine), 오르니틴(ornithine), 시트룰린(citrulline), 그리고 아르기니노숙시네이트(argininosuccinate)를 거쳐서 합성된다.

L-시트룰린 생산은 일반적으로 세균이나 효모와 같은 미생물을 이용한 발효에 의해 생산되며, 자연상태에서 수득된 야생형 균주나 이의 L-시트룰린 생산능이 향상되도록 변형된 변이주를 이용할 수 있다. 최근에는 L-시트룰린의 생산 효율을 개선시키기 위하여 L-아미노산 및 기타 유용물질 생산에 많이 이용되는 대장균, 코리네박테리움 등의 미생물을 대상으로 유전자 재조합 기술을 적용하여 우수한 L-시트룰린 생산능을 갖는 다양한 재조합 균주 또는 변이주 및 이를 이용한 L-시트룰린 생산 방법이 개발되고 있다. 한국등록특허 제10-1102263호 및 제10-1053429호에 따르면, L-시트룰린 생산에 관련된 효소, 전사 인자 등 단백질의 활성 또는 발현을 강화하거나 약화함으로써 L-시트룰린 생산능이 향상됨을 확인하였다. 따라서 L-시트룰린의 생산 경로에 작용하는 다양한 단백질의 활성 또는 발현 조절을 통해 L-시트룰린의 생산량 또한 조절할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.

한국등록특허 제10-1102263호 한국등록특허 제10-1053429호

본 발명은 L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 변이주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 변이주를 이용한 L-시트룰린의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 이용하여 L-시트룰린 생산능이 향상된 새로운 변이주를 개발하기 위해 연구한 결과, L-시트룰린 생산 경로에 작용하는 수송 단백질(transporter 또는 transport protein)을 암호화하는 NCgl2816 유전자를 제거할 경우 L-시트룰린 생산량이 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 양상은 NCgl2816 유전자에 의해 발현되는 단백질의 활성이 약화 또는 불활성화된, L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 제공한다.

본 발명에서 사용된 “NCgl2816 유전자”는 세포막에서 물질이 이동할 때 세포의 밖과 안의 농도 차이를 이기고 영양을 선택적으로 흡수하거나 배출하는 능동수송(secondary transporter)에 관여하는 다양한 수송 단백질들 중 추정 내재성 막 수송 단백질(putative integral membrane transport protein)을 암호화하는 유전자를 의미한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 NCgl2816 유전자는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 균주에서 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 코리네박테리움속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 크루디락티스(Corynebacterium crudilactis), 코리네박테리움 데저티(Corynebacterium deserti), 코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae), 코리네박테리움 수라나래에(Corynebacterium suranareeae), 코리네박테리움 루브리칸티스(Corynebacterium lubricantis), 코리네박테리움 두사넨세(Corynebacterium doosanense), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 우테레키(Corynebacterium uterequi), 코리네박테리움 스테셔니스(Corynebacterium stationis), 코리네박테리움 파캔세(Corynebacterium pacaense), 코리네박테리움 싱굴라레(Corynebacterium singulare), 코리네박테리움 휴미레듀센스(Corynebacterium humireducens), 코리네박테리움 마리눔(Corynebacterium marinum), 코리네박테리움 할로톨레란스(Corynebacterium halotolerans), 코리네박테리움 스페니스코룸(Corynebacterium spheniscorum), 코리네박테리움 프레이부르겐세(Corynebacterium freiburgense), 코리네박테리움 스트리아툼(Corynebacterium striatum), 코리네박테리움 카니스(Corynebacterium canis), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 레날레(Corynebacterium renale), 코리네박테리움 폴루티솔리(Corynebacterium pollutisoli), 코리네박테리움 이미탄스(Corynebacterium imitans), 코리네박테리움 카스피움(Corynebacterium caspium), 코리네박테리움 테스투디노리스(Corynebacterium testudinoris), 코리네박테리움 슈도펠라지(Corynebacaterium pseudopelargi) 또는 코리네박테리움 플라베스센스(Corynebacterium flavescens)일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 NCgl2816 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 NCgl2816 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 암호화된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 NCgl2816 유전자에 의해 발현되는 단백질은 L-시트룰린 생산 경로에 관여하는 수송 단백질인 것으로, 이러한 수송 단백질이 L-시트룰린의 생산에 미치는 영향에 관해서는 알려지거나 연구된 바가 없었다. 그러나, 본 발명자들은 수송 단백질을 암호화하는 NCgl2816 유전자를 결실시킬 경우 막 안정성이 향상되고 L-시트룰린의 배출이 증가할 뿐만 아니라 L-시트룰린 과량 생산 시 부가적으로 검출되는 중간체 6-아세틸오르니틴(6-acetylornithine)의 배출을 억제하여 L-시트룰린을 고수율 및 고농도로 생산할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 사용된 “활성이 약화”는 객체인 유전자의 발현량이 본래의 발현량보다 감소되는 것을 의미한다. 이러한 활성의 약화는 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 통하여 단백질 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 발현 저해 또는 번역 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 효소 활성 정도가 천연형 균주, 야생형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함한다.

본 발명에서 사용된 "불활성화"는 효소, 전사 인자, 수송 단백질 등 단백질을 암호화하는 유전자의 발현이 천연형 균주, 야생형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않는 경우이거나 발현이 되더라도 그 활성이 없는 경우를 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 NCgl2816 유전자를 결실시켜 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 또는 시트룰린이 과량 생산되도록 기 개발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주에 비해 L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 획득하였다.

본 발명에서 사용된 “생산능이 향상된”은 모균주에 비해 L-시트룰린의 생산성이 증가된 것을 의미한다. 상기 모균주는 변이의 대상이 되는 야생형 또는 변이주를 의미하며, 직접 변이의 대상이 되거나 재조합된 벡터 등으로 형질전환되는 대상을 포함한다. 본 발명에 있어서, 모균주는 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 또는 야생형으로부터 변이된 균주일 수 있다. 예를 들면, 시트룰린이 과량 생산되도록 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제 및 카바모일 인산 합성효소의 활성이 강화된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 (한국특허출원 제10-2019-0151321호 참조)일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주는 모균주에 비해 증가된 L-시트룰린 생산능을 나타내며, 특히 모균주에 비해 L-시트룰린 농도가 0.5% 이상, 구체적으로는 0.5% 내지 5% 증가된 것일 수 있으며, 이때 부산물로 생산되는 6-아세틸 오르니틴이 20% 이상, 구체적으로는 20 내지 50% 감소된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주는 모균주에서 NCgl2816 유전자를 결실하는 재조합 벡터를 통해 구현될 수 있다.

본 발명에서 사용된 “벡터”는 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제 가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 발명에 있어서 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 상기 재조합 벡터의 제작에 사용된 벡터는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지일 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ 벡터, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 "형질전환"은 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것이며, 형질전환된 유전자는 숙주세포 내에서 발현될 수 있으면 숙주세포의 염색체 내 삽입 또는 염색체 외에 위치하고 있는 것이든 제한하지 않고 포함될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 형질전환 방법으로 전기 천공 방법 (van der Rest et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 541-545, 1999)을 사용할 수 있다.

상기 숙주세포는 생체내 또는 시험관내에서 본 발명의 재조합 벡터 또는 폴리뉴클레오티드로 형질감염, 형질전환, 또는 감염된 세포를 포함한다. 본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포는 재조합 숙주 세포, 재조합 세포 또는 재조합 미생물이다.

또한, 본 발명에 의한 재조합 벡터는 선택 마커(selection marker)를 포함할 수 있는데, 상기 선택 마커는 벡터로 형질전환된 형질전환체 (숙주세포)를 선별하기 위한 것으로서 상기 선택 마커가 처리된 배지에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존할 수 있기 때문에, 형질전환 된 세포의 선별이 가능하다. 상기 선택 마커는 대표적인 예로 카나마이신, 스트렙토마이신, 클로람페니콜 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 형질전환용 재조합 벡터 내에 삽입된 유전자들은 상동성 재조합 교차로 인하여 코리네박테리움 속 균주, 대장균 등의 미생물과 같은 숙주세포 내로 치환될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 양상은 a) 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 배지에서 배양하는 단계; 및 b) 상기 변이주 또는 변이주가 배양된 배지로부터 L-시트룰린을 회수하는 단계를 포함하는 L-시트룰린의 생산 방법을 제공한다.

상기 배양은 당업계에 알려진 적절한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있으며, 통상의 기술자라면 배지 및 배양 조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 액체 배지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(continuous culture), 유가식 배양(fed-batch culture) 또는 이들의 조합 배양을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 하며, 통상의 기술자에 의해 적절하게 변형될 수 있다. 코리네박테리움 속 균주에 대한 배양 배지는 공지된 문헌 (Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981)을 참조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 배지에 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코스, 수크로스, 락토스, 프락토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함될 수 있다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 사용될 수 있는 인의 공급원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외에, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 포함될 수 있다. 또한 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양과정에서 배양액에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 추가적으로, 배양액의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양액 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양액의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 예를 들면 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 유용물질이 원하는 생산량으로 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 예를 들면 10 내지 160 시간일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 배양된 변이주 및 변이주가 배양된 배지에서 L-시트룰린을 회수하는 단계는 배양 방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지로부터 생산된 L-시트룰린을 수집 또는 회수할 수 있다. 예를 들면 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해 (예를 들면, 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, L-시트룰린을 회수하는 단계는 배양 배지를 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 L-시틀룰린을 회수하는 단계는 L-시트룰린을 정제하는 공정을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주는 NCgl2816 유전자에 의해 발현되는 수송 단백질의 활성이 약화 또는 불활성화됨으로써 L-시트룰린을 고수율 및 고농도로 생산할 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 시트룰린 생산 균주의 전사체량 변화 분석

1-1. 균체 채집

시트룰린 생산 균주의 전사체량 변화를 분석하기 위하여, 균주 성장단계의 변화 시점에서 균체 채집을 수행하였다.

먼저, 시트룰린이 과량 생산되도록 오르니틴 카바모일트랜스퍼라제 및 카바모일 인산 합성효소의 활성이 강화된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 (한국특허출원 제10-2019-0151321호 참조, 이하 'CT4'라 함)와 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 (ATCC13032)를 각각 시트룰린 종배지에 접종하여 30℃에서 10시간 배양 후 배양액 250 mL을 5L 배양기 배지에 접종하였다. 초기 배지에 포함된 당이 모두 소진되면, 추가 배지를 투입하였다. 접종 후 배양 13, 28, 35, 68시간 시점에서 균체를 채집하여 전사체 분석 샘플의 제조에 사용하였다. 본 실험에서 사용된 배지의 조성은 하기 표 1과 같다.

	조성 (/L)
시트룰린 종배지	포도당 2.67%, YPA 3.14%, KH₂PO₄ 0.1%, K₂HPO₄ 0.1%, MNSO₄ 10 ppm, FeSO₄ 10 ppm, Biotin 100 ug/L, Thiamin-HCl 200 ug/L
5L 배양기 배지	포도당 8%, MgSO₄ 0.08%, FeSO₄ 16 ppm, MnSO₄ 8 ppm, CuSO₄ 1.6 ppm, ZnSO₄ 1.6 ppm, CaCl₂ 32 ppm, Biotin 160 ppb, Thiamine-HCl 8 ppm, HVP 0.4%, NaCl 0.08%, KH₂PO₄ 0.22%, (NH₄)₂SO₄ 2.4%
추가 배지	포도당 52%, MgSO₄ 0.1%, CaCl₂ 120 ppm, Biotin 160 ppb, Thiamine-HCl 16 ppm, NH₄H₂PO₄ 0.08%, (NH₄)₂SO₄ 4.4%

1-2. 전사체 분석 샘플 제조

상기 1-1에서 균체 채집 후 배양 종료액을 동일한 농도로 집적하여 Rneasy Mini Kit (QIAGEN, 독일)을 이용하여 사용 매뉴얼에 따라 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 액체질소에 보관한 상태로 ㈜마크로젠에 전달하여 전체 유전자 전사체 분석을 의뢰하였다.

1-3. 유효 유전자 후보 선별

상기 1-2에서 분석된 코리네박테리움 글루타미쿰의 전체 유전자 전사체 분석 결과를 바탕으로, 투과효소(permease) 및 수송단백질(transpoter) 중 RPKM 값이 1000을 넘고 발효 후반에 급격히 증가하거나 야생형 균주 대비 3배 이상 발현량이 높은 후보 유전자를 40개를 1차 선별하였다. 참고로, 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 (ATCC13032)는 시트룰린 생산능이 거의 없는 것으로 알려져 있다.

40개의 유전자를 각각 결손한 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 플라스크 역가배지 (하기 표 2 참조)에 접종하여 30℃, 200 rpm, 30시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 배양액을 증류수로 100배 희석하고 0.45 um 필터로 여과한 다음 컬럼 (DionexIonPac^TM CS12A)과 자외선 검출기 (195 mm)가 장착된 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 균주에서 생산된 배양액 내 L-시트룰린과 부산물인 6-아세틸오르니틴(6-acetylornithine)의 농도를 측정하였다. 후보 유전자 40개 중에서 6-아세틸오르니틴의 농도가 낮은 5개의 후보군을 2차 선별하였고, 야생형 균주 및 선별된 5개의 후보군의 L-시트룰린 및 6-아세틸오르니틴(6-acetylornithine)의 농도를 하기 표 3에 나타내었다.

	조성 (/L)
플라스크 역가배지	Glucose 105.3 g (95%), MgSO₄ 1 g, YPA 4 g, KH₂PO₄ 0.8 g, Na₂HPO₄ 1.2 g, (NH₄)₂SO₄ 30 g, Fe_SO₄ 20 mg, MnSO₄ 20 mg, ZnSO₄ 10 mg, Arginine 100 mg, Biotin 100 ug, Thiamine 200 ug

균주	L-시트룰린(%)	6-아세틸 오르니틴 (%)
CT4 균주	2.10	0.36
NCgl2816 결손 균주	2.12	0.10
NCgl205 결손 균주	1.98	0.32
NCgl0397 결손 균주	0.80	0.08
NCgl0258 결손 균주	2.11	0.36
NCgl1095 결손 균주	2.00	0.35

그 결과, NCgl2816 유전자를 결손한 균주에서 L-시트룰린의 생산량이 가장 높으면서 6-아세틸오르니틴의 생산량이 가장 낮은 것으로 나타나, 균주의 L-시트룰린 생산량을 향상시키기 위한 결실 유전자로서 NCgl2816 유전자를 선택하였다.

실시예 2. NCgl2816 유전자가 결실된 변이주의 제조

2-1. 벡터 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 제조하기 위해 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 (ATCC13032)를 사용하였다.

먼저, Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, 미국)을 이용하여 야생형 균주로부터 염색체 DNA를 추출한 후 이를 주형으로 하여 프라이머 1 및 2와 프라이머 3 및 4의 조합으로 각각 PCR을 수행하였다. 이를 통해 얻은 PCR 산물을 다시 프라이머 1 및 4의 조합을 이용하여 크로스오버(crossover) PCR로 증폭한 후 재조합 벡터 pK19mobSacB의 제한효소 HindIII, XbaI 위치에 삽입하였다. 이를 벡터 pK19ms/△NCgl2816로 명명하였다. 상기 벡터를 제작하는데 하기 표 4의 프라이머를 사용하였다.

프라이머	서열 (5’→3’)	서열번호
프라이머 1	tgatttacgccaagctccttatccg	3
프라이머 2	ggaggggttttacttagattggtgacctcttctctgaaac	4
프라이머 3	gtttcagagaagaggtcaccaatctaagtaaaacccctcc	5
프라이머 4	ccggggatcctctagcgac	6

이상의 프라이머를 이용하여 아래의 조건 하에 PCR을 수행하였다. Thermocycler (TP600, TAKARA BIO Inc., 일본)를 이용하여 각각의 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트 (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 100 μM가 첨가된 반응액에 올리고뉴클레오타이드 1 pM, 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) ATCC13032의 염색체 DNA 10 ng을 주형(template)으로 이용하여, PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara, 일본) 1 유닛의 존재 하에서 25 ~ 30 주기(cycle)를 수행하였다. PCR 수행 조건은 (i) 변성(denaturation) 단계: 94℃에서 30초, (ii) 결합(annealing) 단계: 58℃에서 30초, 및 (iii) 확장(extension) 단계: 72℃에서 1 ~ 2분 (1 kb 당 2분의 중합시간 부여)의 조건에서 실시하였다.

이와 같이 제조된 유전자 단편을 self-assembly cloning을 이용하여, pK19mobSacB 벡터에 클로닝하였다. 상기 벡터를 대장균(E. coli) DH5a에 형질전환시키고, 50 ㎍/㎖의 카나마이신(kanamycin)을 함유하는 LB-한천 플레이트 상에 도말하여, 37℃에서 24시간 배양하였다. 최종 형성되는 콜로니를 분리하여 삽입물(insert)이 정확히 벡터에 존재하는지 확인한 후, 이 벡터를 분리하여 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 재조합에 사용하였다.

상기 방법에서 공통적으로 진행된 과정으로서, 해당 유전자들의 증폭은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 genomic DNA로부터 PCR 방법으로 증폭하여 전략에 따라 self-assembled cloning 방법으로 pK19mobSacB 벡터에 삽입하여 E. coli DH5a에서 선별하였다. 이때 증폭된 유전자를 pK19mobSacB 벡터에 삽입하기 위해 DNA ligation kit (Takara, 일본) 및 제한효소 HindIII, XbaI (NEB, 영국)를 공급된 버퍼 및 프로토콜에 따라 사용하였다.

2-2. 변이주의 제조

모균주로서 변이주 CT4에 상기 2-1에서 제작된 pK19ms/ΔNCgl2816 벡터를 도입하여 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 제조하였다.

구체적으로, RG 배지 (Beef extract 10 g/L, BHI 40 g/L 및 소비톨 30 g/L 함유) 100 ㎖에서 모균주를 1차 배양하고, 동일 배지에 2.5 g/L glycine, 400 mg/L isoniazid 및 0.1 ㎖/L Tween80을 첨가한 배지를 제조하였다. 그 다음, OD₆₁₀ 값이 0.3이 되도록 종배양액을 접종한 후, 30℃, 180 rpm으로 3 내지 5시간 배양하여 OD₆₁₀ 값이 1.6 내지 1.8가 되도록 하였다. 얼음에서 30분간 방치한 후, 4℃, 3500 rpm으로 15분간 원심분리하였다. 그 후 상등액을 버리고 침전된 모균주를 10% 글리세롤 용액으로 4회 세척하고, 최종적으로 10% 글리세롤 용액 0.5 ㎖에 재현탁하였다. 전기충격요법(Electroporation)은 바이오-라드(Bio-Rad) 일렉트로포레이터(electroporator)를 사용하여 수행하였다. 일렉트로포레이션 큐벳 (0.2 mm)에 상기 방법으로 제조한 컴피턴트 셀(competent cell)을 넣고 pK19ms/ΔNCgl2816 벡터를 첨가한 후 2.5 kV, 200 Ω 및 12.5 ㎌의 조건으로 전기충격을 가하였다. 전기충격이 끝난 즉시 재생(Regeneration) 배지 (Brain Heart infusion 18.5 g/l 및 소비톨 0.5 M 함유) 1 ㎖을 첨가하고 46℃에서 6분간 열처리하였다. 그 후 실온에서 식힌 뒤 15㎖ 캡 튜브로 옮겨 30℃에서 2시간 배양하고 카나마이신(kanamycine) 30 ㎍/㎖이 포함된 고체배지 (Brainheart infusion 40 g/L, D-소비톨 30 g/L, Beef extract 10 g/L 및 Agar 20 g/L 함유)에 도말하였다. 30℃에서 2일간 배양하여 콜로니를 얻었다. 1차 상동재조합이 유도된 콜로니 중 상기 표 4의 프라이머 1 및 4를 사용하여 상기 2-1과 동일한 조건으로 PCR로 증폭이 확인된 콜로니를 1차 재조합주로 선별하고 2YT 액체배지 (Tryptone 16 g/L, Yeast extract 10 g/L 및 NaCl 5 g/L 함유)에서 12시간 배양 후 2YT-10% sucrose 고체배지 (Tryptone 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, NaCl 5 g/L 및 sucrose 100 g/L 함유)에 도말하여 2차 상동재조합을 유도하여 항생제 마커를 제거하였다. 2YT-10% sucrose 고체배지에서 배양된 콜로니를 2YT-Km 배지 (Tryptone 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, NaCl 5 g/L 및 카나마이신 30 ㎍/㎖ 함유)와 2YT-10% sucrose에 패칭(patching)하여 카나마이신에 저항성이 없으며, 10% sucrose 배지에서 생육이 가능한 균주를 최종적으로 선별하였다. 그리고 상기 표 4의 프라이머 1 및 4를 사용하여 상기 2-1과 동일한 조건으로 PCR을 수행하여 NCgl2816 유전자가 제거되었는지 최종 확인하였고, NCgl2816 유전자가 결실된 균주를 CT5로 명명하였다.

실시예 3. NCgl2816 유전자가 결실된 변이주의 L-시트룰린 생산성 확인

모균주로 사용된 시트룰린을 과량 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 (CT4) 및 실시예 2에서 제조된 NCgl2816 유전자가 결실된 균주 (CT5)의 L-시트룰린 생산성을 비교하였다.

각 균주를 시트룰린 종배지에 접종하여 30℃에서 10시간 배양 후 배양액 250 mL을 5L 배양기 배지에 접종하였다. 초기 배지에 포함된 당이 모두 소진되면, 추가 배지를 투입하였다. 본 실험에서 사용된 배지의 조성은 상기 표 1과 같다. 배양 종료 후 배양액을 증류수로 100배 희석하고 0.45 um 필터로 여과한 다음 컬럼 (DionexIonPac^TM CS12A)과 자외선 검출기 (195 mm)가 장착된 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 균주에서 생산된 배양액 내 L-시트룰린과 부산물인 6-아세틸오르니틴(6-acetylornithine)의 농도를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

균주	L-시트룰린(%)	6-아세틸 오르니틴 (%)
CT4	8.56	1.6
CT5	8.73	0.7

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, NCgl2816 유전자가 결실된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 CT5는 기 개발된 변이주 CT4에 비해 L-시트룰린의 생산성이 약 2% 증가한 반면, 부산물인 6-아세틸 오르니틴의 생산이 약 44% 감소한 것으로 확인되었다. 이러한 결과를 통해, NCgl2816 유전자에 의해 발현되는 단백질의 활성이 약화 또는 불활성화됨으로써 균주의 L-시트룰린 생산능이 향상될 뿐만 아니라 부산물의 생성이 감소하여 L-시트룰린을 고순도로 생산할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> DAESANG CORPORATION <120> Mutant of Corynebacterium glutamicum with enhanced L-citrulline productivity and method for preparing L-citrulline using the same <130> PN200281 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1302 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2816 <400> 1 atgacaaccg cagtagatca aaactcaccg cccaagcagc aactcaacaa gcgcgtcctg 60 ctgggcagct tgagtggcag cgttatcgaa tggttcgact tcctggttta cggaaccgtc 120 gccgcgctgg tcttcaacaa gatgtacttc cccagcggca acgagttcct ctccacaatc 180 ctggcgtacg catccttctc cctgaccttc ttcttccgcc ccattggtgg cgtcatcttc 240 gcccacatcg gcgaccgcat tgggcgtaag aagaccctgt tcatcacctt gatgctcatg 300 ggtggcggca ccgtcgccat tggtttgctg cccgactaca acgccatcgg catttgggca 360 ccaatccttc tgatgttcct ccgcattttg cagggcatcg gaattggcgg cgaatggggt 420 ggcgcactgc tcctggcata cgaatacgct ccaaagaagc agcgtgggct ctacggcgca 480 gttcctcaaa tgggcatttc cctgggcatg ctgcttgcag ctggcgtgat ctctctgctc 540 accctcatgc cggaagatca gttcctcacc tggggctggc gcatcccatt cgtcggatcc 600 atcctcctag tgttcatcgg cctgttcatc cgaaacggcc ttgatgaaac ccccgagttc 660 aagcgtatcc gcgattccgg ccagcaggta aagatgcctc tgaaggaagt tctgaccaag 720 tactggccag ccgttctggt ctccatcggc gcaaaagctg ccgagaccgg ccccttctac 780 atcttcggca cctacatcgt tgcttacgca accaacttcc tgaacatccg cgacaacatt 840 gtccttctgg cagttgcttg cgccgccctc gttgccacca tctggatgcc actgttcgga 900 tccttctccg accgcgtcaa ccgtgcagtg ctctacagga tctgtgcatc cgcaaccatc 960 gtgctgattg tcccttacta cttggtcctc aacaccggcg aaatttgggc actgtttatc 1020 actaccgtga ttggcttcgg catcctctgg ggtagcgtca acgcaatcct cggaaccgtc 1080 atcgcagaaa acttcgcacc tgaggtccgc tacaccggcg ctaccctggg ttaccaagtc 1140 ggagcagcac tcttcggcgg taccgcaccc attatcgcag catggctgtt cgaaatctcc 1200 ggcggacaat ggtggccaat cgccgtctac gtcgctgcat gttgccttct ctctgtgatc 1260 gcctcgttct tcatccaacg cgtcgcgcac caagagaact aa 1302 <210> 2 <211> 433 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NCgl2816 <400> 2 Met Thr Thr Ala Val Asp Gln Asn Ser Pro Pro Lys Gln Gln Leu Asn 1 5 10 15 Lys Arg Val Leu Leu Gly Ser Leu Ser Gly Ser Val Ile Glu Trp Phe 20 25 30 Asp Phe Leu Val Tyr Gly Thr Val Ala Ala Leu Val Phe Asn Lys Met 35 40 45 Tyr Phe Pro Ser Gly Asn Glu Phe Leu Ser Thr Ile Leu Ala Tyr Ala 50 55 60 Ser Phe Ser Leu Thr Phe Phe Phe Arg Pro Ile Gly Gly Val Ile Phe 65 70 75 80 Ala His Ile Gly Asp Arg Ile Gly Arg Lys Lys Thr Leu Phe Ile Thr 85 90 95 Leu Met Leu Met Gly Gly Gly Thr Val Ala Ile Gly Leu Leu Pro Asp 100 105 110 Tyr Asn Ala Ile Gly Ile Trp Ala Pro Ile Leu Leu Met Phe Leu Arg 115 120 125 Ile Leu Gln Gly Ile Gly Ile Gly Gly Glu Trp Gly Gly Ala Leu Leu 130 135 140 Leu Ala Tyr Glu Tyr Ala Pro Lys Lys Gln Arg Gly Leu Tyr Gly Ala 145 150 155 160 Val Pro Gln Met Gly Ile Ser Leu Gly Met Leu Leu Ala Ala Gly Val 165 170 175 Ile Ser Leu Leu Thr Leu Met Pro Glu Asp Gln Phe Leu Thr Trp Gly 180 185 190 Trp Arg Ile Pro Phe Val Gly Ser Ile Leu Leu Val Phe Ile Gly Leu 195 200 205 Phe Ile Arg Asn Gly Leu Asp Glu Thr Pro Glu Phe Lys Arg Ile Arg 210 215 220 Asp Ser Gly Gln Gln Val Lys Met Pro Leu Lys Glu Val Leu Thr Lys 225 230 235 240 Tyr Trp Pro Ala Val Leu Val Ser Ile Gly Ala Lys Ala Ala Glu Thr 245 250 255 Gly Pro Phe Tyr Ile Phe Gly Thr Tyr Ile Val Ala Tyr Ala Thr Asn 260 265 270 Phe Leu Asn Ile Arg Asp Asn Ile Val Leu Leu Ala Val Ala Cys Ala 275 280 285 Ala Leu Val Ala Thr Ile Trp Met Pro Leu Phe Gly Ser Phe Ser Asp 290 295 300 Arg Val Asn Arg Ala Val Leu Tyr Arg Ile Cys Ala Ser Ala Thr Ile 305 310 315 320 Val Leu Ile Val Pro Tyr Tyr Leu Val Leu Asn Thr Gly Glu Ile Trp 325 330 335 Ala Leu Phe Ile Thr Thr Val Ile Gly Phe Gly Ile Leu Trp Gly Ser 340 345 350 Val Asn Ala Ile Leu Gly Thr Val Ile Ala Glu Asn Phe Ala Pro Glu 355 360 365 Val Arg Tyr Thr Gly Ala Thr Leu Gly Tyr Gln Val Gly Ala Ala Leu 370 375 380 Phe Gly Gly Thr Ala Pro Ile Ile Ala Ala Trp Leu Phe Glu Ile Ser 385 390 395 400 Gly Gly Gln Trp Trp Pro Ile Ala Val Tyr Val Ala Ala Cys Cys Leu 405 410 415 Leu Ser Val Ile Ala Ser Phe Phe Ile Gln Arg Val Ala His Gln Glu 420 425 430 Asn <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 3 tgatttacgc caagctcctt atccg 25 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 4 ggaggggttt tacttagatt ggtgacctct tctctgaaac 40 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 5 gtttcagaga agaggtcacc aatctaagta aaacccctcc 40 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 6 ccggggatcc tctagcgac 19

Claims

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a) NCgl2816 유전자에 의해 발현되는 단백질의 활성이 약화 또는 불활성화된, L-시트룰린 생산능이 향상된 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 변이주를 배지에서 배양하는 단계; 및
b) 상기 변이주 또는 변이주가 배양된 배지로부터 L-시트룰린을 회수하는 단계를 포함하는 L-시트룰린의 생산 방법.