KR102413200B1

KR102413200B1 - 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102413200B1
Application number: KR1020210173265A
Authority: KR
Inventors: 윤은정; 박시준; 김정수; 김현민; 조진성
Original assignee: 주식회사 에이바이오머티리얼즈
Priority date: 2021-12-06
Filing date: 2021-12-06
Publication date: 2022-06-24

Abstract

본 발명은 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 열풍건조 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 안정성이 우수하며, 세포재생 효과, 피부장벽강화 효과, 보습 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition containing Rosemary exosome, Lotus leaf exosome}

본 발명은 로즈마리, 연꽃잎 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 열풍건조 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 우수한 세포재생, 피부장벽강화, 보습 효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

화장품의 기능은 청결과 단순한 메이크업을 지나 수분, 공해 물질, 스트레스, 자외선, 활성산소, 과산화물 등의 피부 노화 원인을 제거하거나 억제하는 것으로 확장되어 왔다. 피부는 각종 환경오염과 스트레스에 노출되어 거칠어지고 건조해지며, 칙칙하게 보이는 등 피부 노화가 가속되고 있으며 이러한 현상은 피부의 수분공급 및 유지와 밀접한 관련이 있다. 피부 건조는 수분 손실에 따른 각질세포의 응집력 저하, 즉 피부장벽의 기능 이상에서 비롯된다.

최근 안전한 천연물을 소재로 하여 피부 장벽을 강화하고 보습 효과가 우수한 화장료의 개발이 활발하게 이루어지고 있다.

본 발명에서 "엑소좀(Exosome)"이란 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 의미하며, 세포밖 소포체(Extracellular Vesicles, EVs)의 한 종류로 정의된다. 모든 세포들은 다른 세포들 또는 외부 환경과 정보 교환을 하며 이를 위해 세포밖 소포체를 분비한다. 엑소좀은 50~200 nm 정도의 크기를 가지며 단백질, 지질, 핵산 등 생리활성 물질을 포함한다. 엑소좀은 포유류, 박테리아, 식물 등 다양한 세포에 존재하며 기원하는 세포들의 상태를 반영하고 있어 진단 및 치료에 활용할 수 있다. 엑소좀은 이중인지질막 구조체로 세포내 침투가 용이하고, 면역 반응, 신호전달과 같은 다양한 생리적, 병리적 기능을 수행한다.

최근에 식물에서 유래한 엑소좀의 다양한 효능에 관한 연구가 이루어지고 있으며 이의 세포재생, 보습 등의 피부 효능에 대해서도 연구가 되고 있다. 식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질이 들어있어 세포간의 이동과 흡수에 도움을 주는 천연 나노입자이며, 식물에서 정제한 엑소좀은 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다.

이러한 엑소좀은 다양한 장점 및 활성으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나 인지질이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있다. 또한 고온에서 불안정하고, 화장품 제형을 제조하는 과정에서 쉽게 깨질 수 있으며, 이러한 성질은 제형 내 엑소좀의 안정성을 저하시키고 침전을 일으킬 수 있다. 따라서 지속적인 활성 유지를 위해 수용액 내의 엑소좀의 용해도 및 분산성을 높여 제형 내 안정성을 높일 필요가 있다.

본 발명자들은 다양한 방법을 적용하여 우수한 피부 개선 활성을 나타내는 식물 유래 엑소좀을 제조하고 이를 화장료로 이용하기 위해 노력하였으며, 그 결과 특정한 조건에서의 열풍건조 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 로즈마리 엑소좀 및/또는 연꽃잎 엑소좀이 우수한 세포재생, 피부장벽강화, 보습 효과를 나타낸다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

(0001) 대한민국 등록특허 제10-2125567호 (2020.06.16) (0002) 대한민국 등록특허 제10-2265811호 (2021.06.16.) (0003) 대한민국 등록특허 제10-2236253호 (2021.03.30)

본 발명은 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀을 유효성분으로 함유하여 안정성이 우수하며 세포재생, 피부장벽강화, 보습 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

유효성분으로서의 상기 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀은,

(A) 로즈마리 또는 연꽃잎을 열풍건조 처리하는 단계; (B) 열풍건조 처리한 로즈마리 또는 연꽃잎을 30~40℃의 물에 침지하는 단계; (C) 침지시킨 로즈마리 또는 연꽃잎을 착즙하는 단계; (D)상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (E)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (F)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (G)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된 것이다.

바람직하게는 상기 열풍건조 처리는 열풍건조기를 이용하여 로즈마리 또는 연꽃잎 생물을 40~60℃의 온도에서 20~24시간 동안 열풍건조하는 것이며, 더욱 바람직하게는 50℃의 온도에서 24시간 열풍건조하는 것임을 특징으로 한다.

바람직하게는 상기 혼합 엑소좀은 로즈마리 엑소좀과 연꽃잎 엑소좀이 각각 1~3:1~3의 중량비로 혼합되어 이루어지는 것임을 특징으로 한다.

유효성분으로서의 상기 로즈마리, 연꽃잎 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀은 조성물 전체중량에 대하여 0.0001 ~ 30.0%(w/w) 함유된다.

상기 화장료 조성물은 세포재생용, 피부장벽강화용 또는 보습용임을 특징으로 한다.

상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨토너, 팩, 영양크림, 수분 크림, 에센스, 바디크림, 바디로션, 바디오일, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 클렌징폼, 클렌징로션, 비누, 패치, 파운데이션, 립스틱, 메이크업 베이스 등의 제형을 가지는 것임을 특징으로 한다.

특정한 조건에서의 열풍건조 전처리와 수성 2상 시스템을 이용하여 정제된 본 발명의 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀과 그 혼합 엑소좀은 안정성이 우수하며, 우수한 세포재생 효과, 피부장벽강화 효과, 보습 효능을 나타내므로 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 로즈마리 유래 엑소좀의 TEM 이미지이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 연꽃잎 유래 엑소좀의 TEM 이미지이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 로즈마리 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 정제된 연꽃잎 유래 엑소좀 입자의 크기 분포와 입자수를 확인하기 위한 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 의해 정제된 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 세포 독성을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 의해 정제된 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 세포재생 효능을 wound healing assay로 평가한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 7은 본 발명에 의해 정제된 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 피부장벽강화 효능을 filaggrin 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 의해 정제된 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 피부장벽강화 효능을 transglutaminase-1 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명에 의해 정제된 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 보습 효능을 AQP3 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

식물 유래 엑소좀은 식물 세포 자체가 분비하는 생리활성 및 신호전달물질을 함유하고 있으며, 포유류 유래 엑소좀에 비해 독성이 없다고 알려져 있다. 이러한 장점으로 인해 의약품, 화장품, 식품 등의 분야에서 활용이 가능한 소재이나 인지질 이중막으로 구성되어 있는 구조적인 특징으로 인해 분산력이 낮고 응집하려는 성질이 있어, 제형 내에서 그 활성을 지속적으로 유지하기 어렵다는 문제점을 가진다. 본 발명은 로즈마리, 연꽃잎으로부터 엑소좀을 고순도로 분리 정제하여, 이를 화장료로 이용하는 것을 기술적 특징으로 한다.

로즈마리(Rosemary, Rosemarimus Officinalis)는 민트와 같은 과에 속하는 여러해살이 식물로 지중해 연안이 원산지인 허브이며 푸른 잎과 특유의 향을 지녔다. 로즈마리는 각종 비타민의 보고로, 생 잎 100g에는 비타민 A가 하루 권장 섭취량의 58% 들어 있고 비타민 C는 36% 들어 있다. 또한 엽산, 비타민 B6, 리보플라빈 등 비타민 B군도 다량 들어있다. 또한 칼슘, 철분, 망간, 마그네슘, 칼륨 등 미네랄도 다양하게 함유되어 있으며 그중 망간은 신체의 항산화 기능에서 중요한 역할을 담당하며 특히 과산화수소 불균등화 보조 효소의 지원을 통해 암 발병 위험을 낮추기도 한다. 로즈마리에는 로즈마리산과 카르노산 등 항산화 성분이 풍부하여 통증 완화와 소염 작용이 있으며 면역력을 높여주는 역할을 한다. 노화로 인한 세포 손상에 대응하는 등 노화 방지 효능도 좋고 몸의 독성을 제거하는 등 다양한 효능이 있다.

연꽃(Lotus, Nelumbo nucifera)은 어느 한 부위만 식용이나 약용으로 쓰이지 않는다. 꽃, 잎, 열매, 줄기, 마디까지 모든 부분을 이용할 수 있지만 특히 연꽃의 잎인 연꽃잎에는 많은 효능 성분이 함유되어 있으며 효능 또한 우수한다. 연꽃잎에는 특히 천연 항산화제인 비타민 E와 필수 아미노산인 히스티딘과 아르기닌이 많이 함유되어 있어 항산화 작용을 하며 그로 인해 노화를 억제하는 효과가 있다. 연꽃잎은 표면에 마이크로미터 크기의 돌기들이 형성돼 있으며 돌기들의 표면에 나노미터 크기의 섬모들이 돋아나 있다. 이 같은 표면구조로 인해 물방울이 붙지 않고 오염물질이 자동으로 씻겨 내려가는 자기정화 능력을 지녔다. 연꽃잎이 피부 미용에 좋기 때문에 붙여진 이름으로 연꽃잎 삶은 물은 피부를 곱게하고 피부병에도 도움이 된다.

본 발명에 따르면 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

유효성분으로서의 상기 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀은 다음과 같은 방법으로 정제된다.

(A) 로즈마리 또는 연꽃잎을 열풍건조 처리하는 단계;

(B) 열풍건조 처리한 로즈마리 또는 연꽃잎을 30~40℃의 물에 침지하는 단계;

(C) 침지시킨 로즈마리 또는 연꽃잎을 착즙하는 단계;

(D)상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;

(E)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계;

(F)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및

(G)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된다.

바람직하게는 상기 (A) 단계에서 열풍건조 처리는 열풍건조기를 이용하여 로즈마리 또는 연꽃잎 생물을 40~60℃의 온도에서 20~24시간 동안 열풍건조하는 것이며, 더욱 바람직하게는 50℃의 온도에서 24시간 열풍건조하는 것이다.

식물의 경우 여러 환경적인 요인에 의해 엑소좀의 분비량이 달라질 수 있다. 본 발명에서는 로즈마리 또는 연꽃잎 생물에 특정조건에서 열풍 건조하는 전처리 공정을 수행하는 경우에 엑소좀의 분비량이 증가하는 것을 이용하였다.

상기 열풍건조된 로즈마리 또는 연꽃잎을 착즙하기 위하여, 전처리된 로즈마리 또는 연꽃잎을 30~40℃의 물에 3~6시간 동안 침지시킨다.

상기 (C) 단계의 착즙 공정에 사용되는 스크류는 교반 속도가 20~50 rpm인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 (D) 단계에서 사용되는 원심분리법은 크기, 모양, 밀도, 점성, 로터 속도에 따른 원심력을 이용하여 용액의 입자를 분리해내는 방법을 의미한다. 순차적으로 rpm을 조절하여 큰 오염 물질 제거가 필요하며 수성 2상계를 형성하기 위한 최종 용액을 얻기 위해서는 10,000xg에서 수행하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 (E) 단계에서 사용되는 동결건조는 용기의 온도를 급격하게 낮추어 건조시키고자 하는 물질을 얼린 다음 용기 내부의 압력을 진공에 가깝게 하여 재료에 포함된 고체화된 용매를 바로 수증기로 승화시켜 건조하는 방법이다. -50 ~ -80℃에서 15~24시간동안 동결하고, 동결건조기에서 진공상태로 72~120시간동안 건조한다. 이때 진공상태는 통상 동결건조기의 압력 상태를 의미한다.

엑소좀을 효율적으로 분리 정제하기 위하여 본 발명에서는 상호간에 잘 용해되지 않은 2종류의 수용액으로 2층을 만들어 각층으로의 친화성 차이를 이용한 분리법의 하나인 수성 2상분배법(aqueous two phase partition method)을 사용하였다.

수성 2상계를 형성하는 방법에는 일반적으로 PEG/염(염으로는 sulfate, phosphate, citrate 등)도 사용할 수 있으나, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서는 PEG/Dextran을 사용하는 것이 바람직하다. Dextran은 박테리아 작용에 의해 얻은 천연 고분자로 화장품 제형에서 점증제, 결합제, 벌킹제로 사용한다.

상기 (F) 단계에서 수성 2상계의 형성에 있어서 PEG는 분자량이 10,000~35,000인 것을 1~15중량%, 바람직하게는 2~5중량% 사용하고 Dextran은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1~8 중량%, 바람직하게는 1~3중량% 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 PEG와 Dextran이 3.3중량%: 1.7중량%의 농도비율로 사용되는 경우에 엑소좀의 수율이 가장 높고, 안정성이 가장 우수하므로 더욱 바람직하다.

엑소좀의 순도를 높이기 위해, 상기 (G)단계에 이어서 동일한 농도의 수성 2상계 용액을 사용하여 수성 2상계를 형성하고 하층액을 수득하는 과정을 2~3회 수행하는 공정을 추가적으로 수행할 수 있다.

이와 같이 정제되는 상기 유효성분으로서의 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀 또는 그 혼합 엑소좀은 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.0001 내지 30.0%(w/w) 함유될 수 있다.

상기 혼합 엑소좀은 로즈마리 엑소좀과 연꽃잎 엑소좀이 각각 1~3:1~3의 중량비로 혼합되어 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 동일 중량비로 혼합되어 이루어진다. 상기 혼합 엑소좀은 정제된 로즈마리 엑소좀과 연꽃잎 엑소좀을 혼합하여 제조될 수 있고, 로즈마리 및 연꽃잎 혼합물을 상기 정제방법에 의하여 정제함으로써 제조될 수도 있다.

상기 정제 방법에 의하여 제조된 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀 및 그 혼합 엑소좀은 종래의 로즈마리 추출물과 연꽃잎 추출물과 비교하여 우수한 세포재생 효과(시험예 7), 피부장벽강화 효과(시험예 8, 시험예 10), 보습 효과(시험예 9)를 나타내었다.

그러므로 상기 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀 및 그 혼합 엑소좀은 세포재생용, 피부장벽강화용, 보습용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

상기의 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 가능하며 예를 들면, 스킨로션, 스킨토너, 팩, 영양크림, 수분 크림, 에센스, 바디크림, 바디로션, 바디오일, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 클렌징폼, 클렌징로션, 비누, 패치, 파운데이션, 립스틱, 메이크업 베이스 등으로 제조될 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 시험예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.

실시예 1: 로즈마리 엑소좀의 제조

로즈마리 열풍건조 처리

로즈마리(전초) 생물 200g을 열풍건조기를 이용하여 50℃의 온도에서 24시간 동안 열풍건조 처리를 실행하였다.

로즈마리 침지

열풍건조 처리한 로즈마리를 약 30~40℃의 물에 6시간동안 침지시켰다.

로즈마리 착즙

열풍건조 처리한 로즈마리를 일반 착즙기를 사용하여 30 rpm의 저속 스크류로 로즈마리 착즙을 수행하였으며 수득한 로즈마리 착즙액은 메쉬망에 걸러 부유물을 제거하였다. 회수한 로즈마리 착즙액은 정제를 진행하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

엑소좀 정제를 위한 상층액 회수

로즈마리 착즙액은 엑소좀 정제를 위해 큰 오염 물질 제거가 필요하기 때문에 10,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리를 수행 후 수성 2상계를 형성하기 위해 상층액을 회수하였다.

상층액 동결건조

엑소좀의 대량생산을 위해 상층액의 부피를 줄이는 목적으로 동결건조를 수행하였다. -80℃에서 20시간동안 동결하고, 동결건조기에서 진공상태로 100시간동안 건조하였다. 이때 진공상태는 통상 동결건조기의 압력 상태를 의미하며 동결 및 건조 시간은 용액의 부피에 따라 달라질 수 있다.

수성 2상계 형성

동결건조한 상층액에 정제수를 추가하고 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하였다. PEG (Sigma Aldrich에서 구매)는 분자량이 10,000~35,000인 것을 3.3 중량% 사용하고 Dextran (Sigma Aldrich에서 구매)은 분자량이 300,000~650,000인 것을 1.7 중량% 사용하여 수성 2상 시스템을 형성하였다.

로즈마리 엑소좀의 회수

상층액과 PEG/Dextran 용액을 혼합한 후 1,000xg에서 10분동안 4℃에서 원심분리를 수행하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하여 엑소좀을 회수하였다.

추가 세척 공정

순도를 높이기 위해 회수된 하층액에 동일한 농도의 상기 수성 2상계 용액을 넣어 추가 세척 공정을 수행하였다. 3회 반복 처리 후 최종 엑소좀이 농축된 하층액을 회수하였다.

실시예 2: 연꽃잎 엑소좀의 제조

상기 실시예와 동일하게 하여 연꽃잎 엑소좀을 정제하였다.

실시예 3: 로즈마리, 연꽃잎 혼합 엑소좀의 제조

상기 실시예 1, 2에서 제조한 로즈마리 엑소좀과 연꽃잎 엑소좀을 1:1 중량비율로 혼합하여 제조하였다.

비교예 1: 로즈마리 추출물 제조

로즈마리 건조물 10g을 정제수 100g에 넣고 80℃에서 3시간동안 추출하였다. 추출 후 감압여과를 수행하여 로즈마리 추출물을 얻은 후 회전증발농축기를 사용하여 증류하여 파우더 형태로 샘플을 수득하였다.

비교예 2: 연꽃잎 추출물 제조

연꽃잎 건조물 10g을 정제수 100g에 넣고 80℃에서 3시간동안 추출하였다. 추출 후 감압여과를 수행하여 연꽃잎 추출물을 얻은 후 회전증발농축기를 사용하여 증류하여 파우더 형태로 샘플을 수득하였다.

시험예 1: 로즈마리 유래 엑소좀의 특성 분석: TEM 분석

정제한 로즈마리 엑소좀의 모양을 확인하기 위해 투과 전자현미경(TEM)으로 분석하였다. 도 1은 상기 실시예 1에 따라서 정제된 로즈마리 유래 엑소좀의 TEM 분석 이미지이다. 분석 결과, 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 150nm의 입자의 존재를 확인하였다.

시험예 2: 연꽃잎 유래 엑소좀의 특성 분석: TEM 분석

정제한 연꽃잎 엑소좀의 모양을 확인하기 위해 투과 전자현미경(TEM)으로 분석하였다. 도 2는 상기 실시예 2에 따라서 정제된 연꽃잎 유래 엑소좀의 TEM 분석 이미지이다. 분석 결과, 구형의 인지질 이중층 구조로 된 약 150nm의 입자의 존재를 확인하였다.

시험예 3: 로즈마리 유래 엑소좀의 특성 분석: NTA 분석

정제한 로즈마리 유래 엑소좀의 입자 크기 분포와 단위 부피당 입자 수를 확인하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)으로 분석하였다. 도 3은 상기 실시예 1에 따라서 정제된 로즈마리 유래 엑소좀의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이며 분석 결과, 입자들의 평균 크기 150.3nm와 1 mL의 단위 부피당 7.70 × 10¹⁰ 개의 농도를 확인하였다.

시험예 4: 연꽃잎 유래 엑소좀의 특성 분석: NTA 분석

정제한 연꽃잎 유래 엑소좀의 입자 크기 분포와 단위 부피당 입자 수를 확인하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle Tracking Analysis, NTA)으로 분석하였다. 도 4는 상기 실시예 2에 따라서 정제된 연꽃잎 유래 엑소좀의 NTA 분석 결과를 나타낸 그래프이며 분석 결과, 입자들의 평균 크기 157.5nm와 1 mL의 단위 부피당 7.20 × 10¹⁰ 개의 농도를 확인하였다.

시험예 5: 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 온도별 안정성 분석

본 발명 실시예 1, 2에 따라 정제한 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 온도별 안정성을 확인하였다. 하기 표 1은 상기 실시예 1, 2에 따라서 정제된 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀을 12주 간 4℃, 25℃, 45℃에서 보관 후 나노입자추적분석(NTA)을 통해 입자의 크기와 농도를 나타낸 표이다.

	로즈마리 엑소좀 (4℃보관)		로즈마리 엑소좀 (25℃보관)		로즈마리 엑소좀 (45℃보관)
	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)
초기	7.70 x 10¹⁰	150.3	7.70 x 10¹⁰	150.3	7.70 x 10¹⁰	150.3
2주차	7.65 x 10¹⁰	151.4	7.67 x 10¹⁰	150.4	7.66 x 10¹⁰	151.1
4주차	7.64 x 10¹⁰	151.3	7.65 x 10¹⁰	152.7	7.68 x 10¹⁰	150.8
8주차	7.71 x 10¹⁰	150.5	7.70 x 10¹⁰	153.1	7.66 x 10¹⁰	151.4
12주차	7.70 x 10¹⁰	150.7	7.72 x 10¹⁰	151.9	7.72 x 10¹⁰	151.7
	연꽃잎 엑소좀 (4℃보관)		연꽃잎 엑소좀 (25℃보관)		연꽃잎 엑소좀 (45℃보관)
	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)	Particle Number (Particles/ml)	Particle Size (nm)
초기	7.20 x 10¹⁰	157.5	7.20 x 10¹⁰	157.5	7.20 x 10¹⁰	157.5
2주차	7.15 x 10¹⁰	155.7	7.15 x 10¹⁰	156.2	7.22 x 10¹⁰	156.9
4주차	7.11 x 10¹⁰	155.1	7.18 x 10¹⁰	155.7	7.20 x 10¹⁰	156.9
8주차	7.10 x 10¹⁰	156.0	7.11 x 10¹⁰	157.7	7.21 x 10¹⁰	157.1
12주차	7.12 x 10¹⁰	156.8	7.10 x 10¹⁰	157.0	7.19 x 10¹⁰	158.0

온도별 12주 안정성을 분석한 결과, 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 크기 및 농도 변화가 4℃, 25℃, 45℃ 조건에서 모두 안정적임을 확인하였다.

시험예 6: 로즈마리, 연꽃잎 엑소좀의 세포독성 평가

로즈마리 엑소좀(실시예 1), 연꽃잎 엑소좀(실시예 2), 혼합 엑소좀(실시예 3) 및 로즈마리 추출물(비교예 1), 연꽃잎 추출물(비교예 2)의 세포독성을 확인하기 위해 MTT assay 평가를 진행하였다. 96well 플레이트에 사람의 섬유아세포 세포주(human dermal fibroblast, HDFa)를 1×10⁵ cells/mL의 농도로 접종 후 37℃로 18시간동안 5% CO₂ 하에 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고 PBS buffer로 세척한 후 새로운 배지와 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀, 혼합 엑소좀 및 로즈마리 추출물, 연꽃잎 추출물을 농도별로 투여하고 다시 24시간동안 배양하였다. 세포의 생존율을 측정하기 위해 MTT solution (5mg/mL)을 첨가한 후 4시간 동안 형성된 formazan을 Dimethyl sulfoxide(DMSO)로 용해하고 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 5는 상기 실시예 1, 2에 따라서 정제된 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀과 그 혼합 엑소좀의 세포독성을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀, 로즈마리와 연꽃잎 혼합 엑소좀 및 로즈마리 추출물, 연꽃잎 추출물을 처리하였을 때 모든 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다.

시험예 7: 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 세포재생 효능 평가(Wound healing assay)

로즈마리, 연꽃잎 엑소좀의 세포재생 효능을 확인하기 위해 wound healing assay 평가를 진행하였다. 세포는 화학적 및 물리적 자극에 의해 손상을 받게 되면 다양한 케모카인(chemokine)과 사이토카인(cytokine)을 분비함과 동시에 피부 손상 부위로 이동해 세포의 증식을 유도한다. 따라서 피부 세포의 성장 및 이동을 시험하는 wound healing assay를 통해 시료에 의한 세포 재생 유도 효과를 확인하였다. 각질형성세포(HaCaT)를 12well 플레이트에 2×10⁵ cells/mL의 농도로 접종 후 37℃로 24시간동안 5% CO₂ 하에 배양하였다. 배양 후, 200 ㎕ 파이펫 팁을 이용하여 세포를 긁어 내었다. 긁어낸 후 떨어져나간 세포들은 PBS buffer로 반복해서 세척하고 1.5% 소혈청이 포함된 DMEM 배지로 교체한 후 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀 및 로즈마리 추출물, 연꽃잎 추출물을 처리하고 양성대조군으로는 Madecassoside를 0.1% 처리하였다. 그 후 18시간 동안 배양하였으며 상처가 생긴 후 0시간과 8시간에 같은 위치를 현미경으로 촬영하여 8시간 동안 줄어든 면적을 ImageJ (National Institutes of Health, USA)로 측정하여 평균값을 계산하였다.

도 6은 상기 실시예에 따라서 정제된 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 피부재생 효능을 wound healing assay로 평가한 결과를 나타낸 이미지이며, 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀, 그 혼합 엑소좀과 로즈마리, 연꽃잎 추출물을 1% 처리하였을 때의 결과를 나타내었다.

도 7은 wound gap 면적율에 대한 그래프 결과이며, 농도 별 시료를 처리한 결과를 나타내었다. 시험 결과, 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀을 처리하였을 때 wound gap 면적이 감소하였으며 로즈마리, 연꽃잎 혼합 엑소좀을 처리하였을 때 더 높은 면적 감소율을 보였다. 이로 인해 세포의 성장 및 이동이 증가하여 세포재생에 효과가 있음을 확인하였다. 이 때 양성 대조군인 Madecassosid 0.1%를 처리하였을 때는 43.29% 면적율을 보였다.

시험예 8: 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 피부장벽강화 효능 평가(filaggrin 발현)

피부 장벽 단백질은 피부 구조를 이루고 있는 중요한 요소로 외부 항원이 체내 안으로 유입되는 것을 차단하는 중요한 역할을 한다. 피부 장벽 단백질의 종류로는 filaggrin, involucrin, loricrin이 있으며 이중 filaggrin은 각질형성세포 내에서 케라틴 필라멘트를 응집하여 피부 장벽에 중요한 역할을 담당한다. 따라서 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 피부장벽강화 효능을 확인하기 위해 일반 용매 추출물과 비교하여 filaggrin 유전자 발현 시험을 진행하였다. 사람의 표피 각질 세포주(human keratinocyte, HEKa)를 접종 후 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM) 배양 배지에서 37℃로 24시간동안 5% CO₂ 하에 배양하였다. 배양 후 배지를 버리고 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀, 그 혼합 엑소좀 및 로즈마리 추출물, 연꽃잎 추출물을 처리하고 48시간 배양하였다. 그 후 배양된 세포들을 TransZol reagent를 이용하여 RNA를 추출한 뒤 RT-PCR(실시간 유전자 중합효소 연쇄반응)을 진행하였고 PCR에 의하여 생성된 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 Gel Documentation system으로 확인하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 CaCl₂ 20mM을 처리하였다.

도 8은 상기 실시예 1, 2에 따라서 정제된 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀과 그 혼합 엑소좀의 피부장벽강화 효능을 filaggrin 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 로즈마리 유래 엑소좀과 연꽃잎 유래 엑소좀을 처리하였을 때 농도 의존적으로 filaggrin 발현이 증가하였으며 로즈마리 추출물과 연꽃잎 추출물을 처리하였을 때보다 훨씬 더 높은 증가율을 확인하였다. 또한 로즈마리와 연꽃잎 혼합 엑소좀을 처리하였을 때도 높은 증가율을 나타냄을 확인하였다. 이 때 양성 대조군인 CaCl₂ 20mM 처리하였을 때는 134.68% 발현율을 보였다.

시험예 9: 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 보습 효능 평가(AQP3 발현)

로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 보습 효능을 확인하기 위해 용매 추출물과 비교하여 AQP3 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 사람의 표피 각질 세포주(human keratinocyte, HEKa)를 접종 후, 100 IU/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin을 첨가한 Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 배양 배지에서 37℃로 24시간동안 5% CO₂ 하에 배양하였다. 배양 후 배지를 버리고 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀, 그 혼합 엑소좀 및 로즈마리 추출물, 연꽃잎 추출물을 처리하고 48시간 배양하였다. 배양 후에 TransZol reagent를 이용하여 RNA를 추출한 뒤 RT-PCR(실시간 유전자 중합효소 연쇄반응)을 진행하여 세포의 수분 이동에 관여하는 보습 인자이며 피부보습에 중요한 역할을 하는 단백질인 AQP3(Aquaporin 3)의 mRNA 변화량을 측정하였다. PCR에 의하여 생성된 산물은 1% agarose gel에서 전기영동하여 Gel Documentation system으로 확인하였다. 이때 음성 대조군으로는 PBS를 처리하였으며 양성 대조군으로는 Hyaluronic acid 0.005%를 처리하였다.

도 9는 상기 실시예 1, 2에 따라서 정제된 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 보습 효능을 AQP3 발현으로 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 시험 결과, 로즈마리 엑소좀과 연꽃잎 엑소좀을 처리하였을 때 농도 의존적으로 AQP3의 발현이 증가하였으며 로즈마리 추출물과 연꽃잎 추출물을 처리하였을 때보다 더 높은 보습 효과가 있음을 확인하였다. 로즈마리와 연꽃잎 혼합 엑소좀을 처리하였을 때 더 높은 보습 효과를 확인할 수 있었으며, 양성 대조군인 Hyaluronic acid 0.005%를 처리하였을 때는 149.26% 발현율을 보였다.

제형예 1~3: 크림의 제조

하기 표 2의 조성으로 상기 실시예에 따라서 정제된 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀, 혼합 엑소좀을 포함하는 크림을 통상의 방법으로 제조하였다. 비교예 1의 로즈마리 추출물을 함유하는 크림을 비교 제형예 1로 하고 비교예 2의 연꽃잎 추출물을 함유하는 크림을 비교 제형예 2로 하였다.

성분	제형예 1	제형예 2	제형예 3	비교 제형예 1	비교 제형예 2
성분	함량(중량 %)
로즈마리 엑소좀(실시예 1)	6	-	-	-	-
연꽃잎 엑소좀(실시예 2)	-	6	-	-	-
로즈마리+연꽃잎 엑소좀(실시예 3)	-	-	6	-	-
로즈마리 추출물(비교예 1)	-	-	-	6	-
연꽃잎 추출물(비교예 2)	-	-	-	-	6
글리세린	10	10	10	10	10
부틸렌글라이콜	5	5	5	5	5
글리세릴올리에이트	1.8	1.8	1.8	1.8	1.8
세테아릴올리베이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
솔비탄올리베이트	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	5.0	5.0	5.0	5.0	5.0
세틸에틸헥사노에이트	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
비즈왁스	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
스쿠알란	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
1,2-헥산다이올	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
콜레스테릴/베헤닐/옥틸도데실라우로일글루타메이트	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
디메치콘	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
사이클로펜타실론삭/사이클로헥사실록산	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
세티아릴알코올	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
미네랄 오일	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
디소듐이디티에이	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
비에이치티	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
토코페릴아세테이트	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
판테놀	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
에칠헥실메톡시신나메이트	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
향	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량

시험예 10: 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 경피 수분 증발 억제 효과

로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 경피 수분 증발 억제 효과를 확인하기 위해 투와미터(Tewameter, Courage & Khazaka)를 사용하였다. 피부가 건조한 30세~40세의 남녀 성인 20명을 대상으로 왼쪽 팔 하부 안쪽에 구획을 나누고 경피 수분 손실량을 각 구획 당 3회씩 측정 한 후 제형예 1~3 및 비교제형예 1, 2를 1일 2회씩 5일간 도포하고, 경피수분증발량(Transepidermal Water Loss;TEWL)을 측정하였다. 측정은 실내온도 24±2℃, 상대 습도 40±2℃의 항온 항습실에서 실시하였고 각 조건당 3회씩 측정하여 얻어진 평균값을 사용하였다. 결과값은 시료를 도포하기 전 경피 수분 손실량을 100% 기준으로 하여 도포 3일 후, 5일 후에 따른 수분 증발량을 나타내었다. 표 3은 상기 실시예에 따라서 정제된 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 경피 수분 증발 억제 효과를 평가한 결과를 나타낸 표이다.

	수분 증발량 (%)
	초기	도포 3일 후	도포 5일 후
제형예 1	100	54	48
제형예 2	100	57	46
제형예 3	100	52	41
비교제형예1	100	69	56
비교제형예2	100	71	59

상기 표 3의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 로즈마리 엑소좀, 연꽃잎 엑소좀, 로즈마리, 연꽃잎 혼합 엑소좀이 포함된 크림에서 우수한 경피 수분 억제 효과를 확인하였다.

시험예 11: 로즈마리, 연꽃잎 유래 엑소좀의 제형 성상 안정성 분석

상기 제형예 1~3에 따라 제조된 크림의 성상 안정성 시험을 진행하였다. 제조된 크림을 12주 간 Cycling Chamber에서 24시간 간격으로 4℃ ↔ 45℃ 의 온도 변화를 주면서 그 성상의 변화를 관찰하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

주차	제형예 1	제형예 2	제형예 3
초기	-	-	-
2주차	-	-	-
4주차	-	-	-
8주차	-	-	-
12주차	+	-	+

(-; 변화없음, +; 약간 색의 변화, ++; 색변화 또는 약간의 침전, +++; 색변화와 침전 발생)

로즈마리 유래 엑소좀, 연꽃잎 유래 엑소좀과 로즈마리, 연꽃잎 혼합 엑소좀을 함유한 크림 제형의 안정성을 관찰한 결과, 12주 동안 성상이 안정함을 확인하였다.

Claims

로즈마리 엑소좀과 연꽃잎 엑소좀이 각각 1~3:1~3의 중량비로 혼합되어 이루어지는 로즈마리 엑소좀과 연꽃잎 엑소좀의 혼합엑소좀을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 유효성분으로서의 상기 로즈마리 엑소좀 또는 연꽃잎 엑소좀은, (A) 로즈마리 또는 연꽃잎을 열풍건조 처리하는 단계; (B) 열풍건조 처리한 로즈마리 또는 연꽃잎을 30~40℃의 물에 침지하는 단계; (C) 침지시킨 로즈마리 또는 연꽃잎을 착즙하는 단계; (D)상기 착즙액을 1,000xg~10,000xg에서 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; (E)엑소좀이 존재하는 상기 상층액을 동결건조하는 단계; (F)상기 동결건조물에 PEG(Polyethylene glycol)/Dextran을 사용하여 수성 2상계를 형성하는 단계; 및 (G)상기 수성 2상계 중 엑소좀이 농축된 하층액을 수득하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 정제된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제2항에 있어서, 상기 (A) 단계에서 열풍건조 처리는 열풍건조기를 이용하여 로즈마리 또는 연꽃잎 생물을 40~60℃의 온도에서 20~24시간 동안 열풍건조하는 것으로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 로즈마리 엑소좀과 연꽃잎 엑소좀의 혼합엑소좀은 화장료 조성물 전체중량에 대하여 0.0001~30.0%(w/w) 함유되는 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 세포재생용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부장벽강화용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 보습용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.