KR102419224B1 - Htr2b 유전자 넉아웃 마우스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Tph1 또는 Htr2b 넉아웃 마우스 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 Tph1 또는 Htr2b 넉아웃 마우스는 타겟 유전자의 넉아웃 효율이 높고, 췌장의 β 세포의 증식능이 감소되어 있으므로 제2형 당뇨 및 대사증후군을 비롯한 다양한 대사 질환 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 대한민국 과학기술정보통신부의 지원 하에서 과제번호 2018018200에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리 전문기관은 "한국연구재단", 연구사업명은 "원천기술개발사업", 연구과제명은 "(EZBARO)줄기세포 유래 생체모방 베타세포 클러스터 제작 및 임상응용", 주관기관은 "한국과학기술원", 연구기간은 2018.04.01-2019.01.31 이다.
본 발명은 또한 대한민국 과학기술정보통신부의 지원 하에서 과제번호 2018074646에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리 전문기관은 "한국연구재단", 연구사업명은 "이공분야기초연구사업", 연구과제명은 "(EZBARO)임신, 수유에 따른 여성 당뇨병의 특징 및 췌장 베타세포 기능 개선 연구", 주관기관은 "한국과학기술원", 연구기간은 2018.09.01-2019.02.28 이다.
본 특허출원은 2019년 4월 25일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2019-0048126호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 출원의 개시사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 넉아웃 마우스 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
세로토닌 (5-hydroxytryptamine [5-HT])은 필수 아미노산인 트립토판에서 합성된 모노 아민 신경전달물질이다. 5-HT의 생합성은 트립토판 가수분해효소(tryptophan hydroxylase, TPH)에 의해 조절되고, 이는 5-HT 효소의 생산을 위한 속도-조절 효소이다. 서로 구별되는 조직 발현 패턴을 나타내는 TPH의 두 가지 이형체 (TPH1 및 TPH2)가 발견된 이후로, 중추 및 말초의 5-HT 시스템들이 기능적으로 구별되어 있다는 점은 잘 알려져 있다. 이 공간적 분리는 5-HT가 혈액 뇌 장벽을 통과하지 못한다는 점에 기인한다; 따라서 5-HT는 TPH2에 의해 중추에서 생합성되고 TPH1에 의해 말초에서 생합성된다. 한편, 5-HT는 신경 조직과 말초 조직 모두에서 다양한 기능을 가진다. 신경 5-HT는 중추 신경계의 통제 하에 있는 수면, 기분 및 식욕을 조절하는 것으로 알려져 있을 뿐만 아니라 장 신경계(enteric neuvous system)에 의해 조절되는 위장관 운동성을 조절하는 것으로 알려져 있다. 신경 5-HT의 잘 알려진 기능과는 대조적으로, 말초 조직에서의 5-HT의 역할은 아직 명확하게 밝혀지지 않았다. 말초 5-HT는 간 재생, 뼈 형성, 면역 반응 및 에너지 대사를 조절하는 것으로 나타났다. 인체 내 5-HT의 90 % 이상이 말초 5-HT이며, 대다수는 장의 점막의 엔테로크로마핀 세포에 의해 생산되고 혈소판에 저장된다. 최근 연구에 따르면 췌장 베타 세포와 지방 세포는 TPH1에 의해 촉매되어 5-HT를 생성하는 것으로 나타났다.
말초 조직에서 5-HT의 기능을 연구하기 위해 몇몇 Tph1 녹아웃 (KO) 대립 유전자가 마우스에서 생성되었다. 최초의 Tph1 KO 마우스는 신경 및 말초 구획으로 공간적으로 분리된 5-HT 시스템의 이중성을 입증하였다. 이 마우스는 간 재생 능력이 부족했고 인슐린 분비 기능이 손상되었다. 다른 전신 Tph1 KO 마우스에 대한 연구는 심장 기능 및 태아 발달에 있어서 말초 5-HT의 중요한 역할을 밝혀 냈다. Yadav와 동료들은 최초의 컨디셔널 Tph1 KO 대립 유전자를 생성하여 이전에는 잘 알려져 있지 않던 뼈 조절과 에너지 대사에서 5-HT의 기능을 발견하게 되었다. 초기 Tph1 floxed 대립 유전자가 다른 조직에서 말초 5-HT의 기능을 연구하는데 유용함이 입증되었지만, 생성된 Tph1 KO 마우스는 장의 점막에 5-HT 양성 세포를 여전히 포함하고 있어 잔류 5-HT 합성을 나타내었고, 따라서 장내의 TPH1 활성이 불완전하게 파괴되었다.
현재까지 이용 가능한 모든 KO 마우스는 엑손 5 및 6 대신에 엑손 2 및/또는 엑손 3을 타겟팅 함으로써 생성되었으며, 엑손 5 및 6는 TPH1의 촉매 도메인을 코딩한다. 따라서 이전에 생성 된 모든 Tph1 KO 대립 유전자는 잠재적으로, 엑손 5와 6을 포함하는 비정상적으로 스플라이싱 된 Tph1 전사체를 발현 할 수 있었으며 Tph1의 엑손 2 및/또는 3의 결실에도 불구하고 TPH1 촉매 활성을 갖는 단백질을 생산하였다. 따라서 5-HT의 생산이 완전히 제거된 새로운 Tph1 넉아웃 마우스의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명자들은 말초 조직에서 5-HT의 기능을 연구하던 중, 종래 Tph1 넉아웃 마우스에서 5-HT 생산이 완전히 제거되지 않았음을 확인하고, 5-HT 생산이 완전히 중단된 새로운 Tph1 넉아웃 마우스를 개발하고자 노력하였다. 그 결과 Tph1 유전자의 엑손 5 및 엑손 6을 타겟팅하는 넉아웃 마우스에서 5-HT 생산이 완전히 제거되었음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
또한, 본 발명자들은 마우스의 β 세포 증식에 필수적인 기전 및 세로토닌 수용체(HTR)의 종류를 확인하기 위하여, Tph1 또는 Htr 유전자가 췌장 특이적으로 넉아웃 된 마우스를 개발하고 출생 전후 및 성체 마우스의 β세포 증식성을 관찰하였다. 그 결과, Tph1 유전자 또는 Htr2b 유전자가 췌장 특이적으로 넉아웃 된 마우스에서 β 세포 증식이 감소된다는 점 및 이들의 표현형이 유사하게 나타남을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 신규한 Tph1 넉아웃 마우스 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Htr2b 유전자가 넉아웃 된 마우스 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Tph1 유전자의 엑손 5 및 엑손 6이 넉아웃(knock-out)된 형질전환 동물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 Tph1 유전자(mRNA)는 NCBI Reference sequence NM_009414.3 에서 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 Tph1 유전자의 엑손 5 및 엑손 6은각각 서열번호 11의 845-912번째 서열과, 913-1109번째 염기서열로 이루어진 것이다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 형질전환 동물은 조직 특이적으로 Tph1 유전자가 넉아웃 된 것이고, 상기 조직은 췌장 β 세포이다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 형질전환 동물은 마우스이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 형질전환 동물은 Tph1 fl/fl x Insulin2-Cre +/- 마우스(Tph1 beta cell specific knockout mouse, Tph1 βKO mouse) 또는 Tph1 fl/fl x Pdx1-CreER +/- 마우스(Tph1 beta cell specific inducible knockout mouse, Tph1 βiKO mouse)일 수 있다.
상기 Tph1 fl/fl x Insulin2-Cre +/- 마우스(Tph1 beta cell specific knockout mouse, Tph1 βKO mouse) 마우스는 출생시부터 Tph1 유전자가 제거된 형질전환 마우스이고, 상기 Tph1 fl/fl x Pdx1-CreER +/- 마우스(Tph1 beta cell specific inducible knockout mouse, Tph1 βiKO mouse)는 출생 이후 타목시펜을 투여하는 경우 타겟 유전자의 넉아웃이 유도되는 형질전환 마우스이다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환 동물은 제2형 당뇨병, 비알코올성 지방간질환 및 간염 또는 대사증후군과 같은 대사질환의 모델로 사용될 수 있으나, 반드시 이에 용도가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 조직-특이적으로 Tph1 유전자가 넉아웃 된 마우스의 제조방법을 제공한다:
(a) Tph1의 엑손 5 및 엑손 6 양 옆에 loxp site를 삽입한 Tph1 floxed 마우스 및 조직-특이적으로 Cre-recombinase를 발현하는 마우스를 교배하는 단계; 및
(b) 상기 교배 결과 얻어진 다음 세대 마우스를 얻는 단계.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조직-특이적으로 Cre-recombinase를 발현하는 마우스는 췌장 특이적으로 Cre-recombinase를 발현하는 Insulin2-Cre 마우스이다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조직-특이적인 넉아웃이 이루어지는 조직은 췌장의 β 세포이다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 본 발명자들은 도 2a의 Tph1 tm1a 와 같은 유전체 구조를 가진 배아줄기세포(Embryonic stemm cell)을 구입하였고, 대리모에 착상하여 마우스를 생산하였다. 상기 생산된 Tph1 tm1a 의 유전체를 가진 마우스는 플리페이스(Flippase)를 발현하는 마우스와 교배하여 FRT 사이의 유전자를 제거한 후, β 세포 특이적으로 Cre-recombinase를 발현하는 Insulin2-Cre 마우스와 교배를 시킨다. 상기 교배로 얻어진 자손은 상기 유전체 중 loxp 의 양측으로 타겟팅 된 Tph1의 엑손 5 및 엑손 6가 제거된다. 따라서, β 세포 특이적인 Tph1 KO 마우스를 얻을 수 있다.
본 발명의 Tph1 βKO 마우스는 출생 당일(Postnatal day 0, P0) 췌장에서 Tph1의 mRNA 발현이 감소하여 Tph1이 넉아웃 되었음이 확인되었다. 또한, 면역형광염색 (IF, immunofluorescent) 결과에서도 5-HT (세로토닌)이 제거됨을 확인하여, Tph1 βKO 마우스의 췌장 베타세포에서 세로토닌 생성이 억제됨을 확인되었다.
본 발명의 Tph1 βKO 마우스과 야생형 마우스 사이에는 체중의 차이는 나타나지 않으며, 당내성 테스트(Glucose tolerance test, GTT) 상 Tph1 βKO 마우스에서 혈당감소가 지연되어 제2형 당뇨의 표현형을 나타낸다. 한편, Tph1 βKO 마우스에는 인슐린 내성 테스트(Insulin tolerance test, ITT) 상으로는 차이가 없다는 점이 특징적이다.
또한, 본 발명의 Tph1 βKO 마우스는 췌장 베타세포양이 절반 미만으로 감소되어 있어, 제2형 당뇨와 유사한 표현형을 나타낸다.
또한, 본 발명의 Tph1 βKO 마우스는 췌장 베타세포의 인슐린 분비능력을 평가하는 GSIS(Glucose stimulated insulin secretion) 검사에서 Tph1 βKO의 인슐린 분비능이 저하되어 있는 것으로 나타났다. 즉, 췌장 베타 세포에서 세로토닌이 없으면 인슐린 분비에 문제가 생기고, 이러한 점에서 본 발명의 Tph1 βKO 마우스는 제2형 당뇨와 유사한 표현형을 나타낸다.
또한, 본 발명의 Tph1 βKO 마우스는 출생 당일(P0) β 세포 양이 줄어들었음을 H&E염색 및 면역형광염색을 통해 확인되었고, β 세포의 증식(proliferation) 능력을 phosphohistone H3 (pHH3) 및 Ki-67을 통해 확인한 결과, Tph1 βKO에서 베타세포 증식능이 줄어있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 Tph1 βKO는 출생 전후 베타세포의 양과 증식능의 감퇴로 인한 성인기 2형 당뇨 발병 모델로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 Tph1 βKO 마우스의 β 세포의 증식(proliferation) 능력을 평가하는 다른 지표인 cyclin의 mRNA 수준을 측정한 결과, Tph1 βKO 마우스에서 감소되어 있어 β 세포 증식능이 감소되어 있음을 나타낸다.
또한, 본 발명의 변형된 STAM 마우스 모델에서 확인한 바와 같이, 췌장 베타 세포의 감소는 비알코올성 지방간, 간염, 간섬유화 및/또는 간경변을 유발하는 바, 본 발명의 Tph1 βKO 마우스는 췌장 베타 세포의 증식능이 감소하는 결과, 베타세포의 양이 감소되므로 비알코올성 지방간질환 및 간염의 모델 동물로서도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 Htr2b 유전자가 넉아웃(knock-out)된 형질전환 동물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 Htr2b 유전자는 엑손 2가 넉아웃 된 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 Htr2b 유전자(mRNA)는 NCBI Reference sequence NM_008311.3 에서 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 Htr2b 유전자의 엑손 2는 서열번호 12의 103-685번째 염기서열로 이루어진 것이다.
본 발명의 상기 형질전환 동물은 조직 특이적으로 Htr2b 유전자가 넉아웃 된 것이고, 구체적으로는 췌장의 β 세포 특이적으로 Htr2b 유전자가 넉아웃 된 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환 동물은 마우스인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 토끼 등을 포함하는 모든 동물이 이에 해당할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환 동물은 Htr2b fl/fl x Insulin-Cre +/- 마우스(Htr2b beta cell specific knockout mouse, Htr2b βKO mouse) 또는 Htr2b fl/fl x Pdx1-CreER +/- 마우스(Htr2b beta cell specific inducible knockout mouse, Htr2b βiKO mouse)이다.
상기 형질전환 동물은 Htr2b fl/fl x Insulin-Cre +/- 마우스(Htr2b beta cell specific knockout mouse, Htr2b βKO mouse)는 출생시부터 Htr2b 유전자가 제거된 형질전환 마우스이고, 상기 Htr2b fl/fl x Pdx1-CreER +/- 마우스(Htr2b beta cell specific inducible knockout mouse, Htr2b βiKO mouse)는 출생 이후 타목시펜을 투여하는 경우 타겟 유전자의 넉아웃이 유도되는 형질전환 마우스이다.
본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 형질전환 동물은 제2형 당뇨병, 비알코올성 지방간질환 및 간염 또는 대사증후군의 모델로 사용될 수 있으나, 반드시 이에 용도가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 조직-특이적으로 Htr2b 유전자가 넉아웃 된 마우스의 제조방법을 제공한다:
(a) Htr2b의 엑손 2 양 옆에 loxp site를 삽입한 Htr2b floxed 마우스 및 조직-특이적으로 Cre-recombinase를 발현하는 마우스를 교배하는 단계; 및
(b) 상기 교배 결과 얻어진 다음 세대 마우스를 얻는 단계.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조직-특이적으로 Cre-recombinase를 발현하는 마우스는 췌장 특이적으로 Cre-recombinase를 발현하는 Insulin2-Cre 마우스이다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 조직-특이적인 넉아웃이 이루어지는 조직은 췌장의 β 세포이다.
본 발명자들은 Htr2b floxed mouse를 Insulin Cre mouse와 교배하여 본 발명의 Htr2b 베타 세포 특이적 넉아웃 (Htr2b βKO ) 마우스를 제작하였다. 상기 Htr2b floxed 마우스는 Columbia대학의 Gerard Karsenty 교수로부터 얻었다.
본 발명의 Htr2b βKO 마우스는 대조군과 체중차이는 보이지 않았고, GTT(Glucose tolerance test) 상, Htr2b βKO 마우스의 혈당이 악화되어 제 2형 당뇨와 유사한 표현형을 가진다. 반면, Htr2b βKO 마우스는 ITT(Insulin tolerance test) 상으로는 표현형의 차이가 없어, 인슐린 저항성에는 차이가 없다.
또한, 본 발명의 Htr2b βKO 마우스의 β 세포양이 절반 미만으로 감소되어 있어, 제2형 당뇨와 유사한 표현형을 나타낸다.
또한, 본 발명의 Htr2b βKO 마우스는 췌장 β 세포의 인슐린 분비능력을 평가하는 GSIS(Glucose stimulated insulin secretion) 검사에서 인슐린 분비능이 저하되어 있는 것으로 나타났다. 즉 췌장 베타 세포에서 세로토닌이 없으면 인슐린 분비에 문제가 생기고, 이러한 점에서 본 발명의 Htr2b βKO 마우스는 제2형 당뇨의 표현형과 유사한 표현형을 나타낸다.
또한, 본 발명의 Htr2b βKO 마우스는 출생 당일 Htr2b βKO의 베타세포 양이 줄어들어 있음이 H&E염색 및 면역형광염색을 통해 확인되었고, 베타 세포의 증식(proliferation) 능력을 phosphohistone H3 (pHH3) 및 Ki-67을 통해 확인하였고, Htr2b βKO 마우스에서 베타 세포 증식능이 감소되어 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 Htr2b βKO 마우스는 출생 전후 베타세포의 양과 증식능의 감퇴로 인한 성인기 2형 당뇨 발병 모델로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 변형된 STAM 마우스 모델에서 확인한 바와 같이, 췌장 베타세포의 감소는 비알코올성 지방간, 간염, 간섬유화 및/또는 간경변을 유발하는 바, 본 발명의 Htr2b βKO 마우스는 비알코올성 지방간질환 및 간염의 모델 동물로서도 유용하게 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 대사질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 본 발명의 상기 Tph1 또는 Htr2b가 넉아웃된 형질전환 동물에 대사질환 치료제 후보물질을 투여하는 단계;
(b) 상기 후보물질을 투여한 형질전환 동물을 후보물질을 투여하지 않은 대조군 동물과 비교하여 질환에 대한 지표를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 지표가 후보물질을 투여한 형질전환 동물에서 대조군 동물에 비해 개선되는 경우, 후보물질을 대사질환의 치료제로 판정하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 "후보물질"은 대사질환의 치료제로서 테스트할 물질을 의미하며, 예컨대 본 발명에서 분석하고자 하는 후보물질은 다양한 물질을 포함한다. 예를 들어, 상기 후보물질은 화학물질, 단백질, 펩타이드, 항체, 핵산 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 분석되는 후보물질은 단일 화합물 또는 화합물들의 혼합물(예컨대, 천연 추출물 또는 세포 또는 조직 배양물)일 수 있다. 후보물질은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 이러한 화합물의 라이브러리를 얻는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(영국), Comgenex(미국), Brandon Associates(미국), Microsource(미국) 및 Sigma-Aldrich(미국)에서 상업적으로 구입 가능하며, 천연 화합물의 라이브러리는 Pan Laboratories(미국) 및 MycoSearch(미국)에서 상업적으로 구입가능하다. 단백질, 펩타이드 등의 후보물질은 당업계에 공지된 다양한 조합 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있으며, 예를 들어, 생물학적 라이브러리, 공간 어드레서블 패러럴 고상 또는 액상 라이브러리(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries), 디컨볼루션이 요구되는 합성 라이브러리 방법, "1-비드 1-화합물" 라이브러리 방법, 그리고 친화성 크로마토그래피 선별을 이용하는 합성 라이브러리 방법에 의해 얻을 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법은, DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994 등에 개시되어 있다.
본 발명에 있어서, 상기 대사질환은 제2형 당뇨병, 비알코올성 지방간질환 및 간염, 또는 대사증후군 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 "질환에 대한 지표"는 상술한 대사질환과 관련하여 당업계에서 통상적으로 수행되는 검사에 의한 결과값을 의미한다. 예컨대 당뇨병의 경우는 금식 후 혈당 검사와 당부하 검사 결과 등을 의미하고, 이상지질혈증 중 고지혈증의 경우에는 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤, 중성지방 검사 등의 결과값을 의미한다. 비만의 경우는 체중이나 체질량 지수(BMI)가 이에 해당한다. 또한, 지방간의 경우에는 ALT, AST, 또는 혈중 빌리루빈 농도의 변화, 복부초음파, 간생검에 의한 간 조직내 지방의 분포도, 간염의 경우에는 간세포의 풍선화, 섬유화, 염증세포 침윤 등의 결과를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 스크리닝 방법에 사용되는 형질전환 동물은 대사질환이 발병하도록 유도하는 처치가 수행된다. 예컨대 상기 형질전환 동물은 고지방식이를 급여할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 스크리닝 방법에 사용되는 형질전환 동물은 상술한 본 발명의 형질전환 동물과 동일하므로, 이들 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 Tph1 또는 Htr2b 넉아웃 마우스 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 Tph1 또는 Htr2b 넉아웃 마우스는 타겟 유전자의 넉아웃 효율이 높고, 췌장의 β 세포의 증식능이 감소되어 있으므로 제2형 당뇨 및 대사증후군을 비롯한 다양한 대사 질환 연구에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1g는 Tph1 tm1kry 를 이용하여 제작된 Tph1 KO 마우스는 부분적인 TPH 활성을 보유한다는 결과를 나타낸다. 도 1a는 Tph1 tm1kry 의 유전적 구조를 나타낸다. 도 2b는 야생형 및 Tph1 tm1kry GKO 마우스의 공장(jejunum) 내 5-HT 농도를 나타낸다 (n = 3-7 per group). 모든 데이터는 평균 ± 표준편차 로 표시되었다. (**P < 0.01 vs. 야생형, Student’s t-test). 도 1c는 야생형 및 Tph1 tm1kry GKO 마우스의 공장(jejunum) 내 5-HT를 나타내는 면역조직화학 염색 결과를 나타낸다. Scale bar, 50 μm.
도 1d는 Tph1 tm1kry βKO 마우스의 췌장 소도의 면역조직화학 염색 결과를 나타낸다 (n = 3 per group). 췌장 절편은 인슐린(녹색)과 5-HT(적색)으로 염색되었다. 대조군: MIP-Cre-hGH; βKO: Tph1 tm1kry βKO. Scale bar, 50 μm.
도 1e는 TPH1의 아미노산 서열을 나타낸다. 적색 글씨는 중첩되는 스플라이싱 위치; RD, regulatory domain; CD, catalytic domain; TD, tetramerization domain. 도 1f는 야생형 마우스의 Tph1 전사체와 Tph1 tm1kry GKO 마우스의 십이지장의 KO 전사체를 Tph1 Exon1 forward 및 Tph1 Exon11 reverse 프라이머를 이용하여 RT-PCR로 증폭한 결과를 나타낸다. 빈 삼각형은 1000 bp를 가리키고, 검은 삼각형은 1500 bp를 가리킨다. 도 1g는 Tph1 tm1kry βKO 마우스와 hetero βKO 마우스의 췌장 소도로부터 면역블랏 분석에 의해 TPH1 (50 kD) 및 절단된 TPH1 (37kD)를 검출한 결과를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2e는 새로운 Tph1 floxed 마우스 모델의 제작에 관한 것이다. 도 2a는 새로운 Tph1 floxed 마우스의 제작을 위한 타겟팅 전략의 개략도이다. 도 2b는 Tph1 tm1a 및 Tph1 tm1c 마우스의 유전자 타이핑(genotyping)을 나타낸 도이다. 도 1c는 Tph1 tm1c βKO 마우스에서 췌장 소도의 유전자 타이핑을 나타낸 도이다. 빈 삼각형(empty triangles)은 500 bp를 나타내고, 검은 삼각형은 1000 bp를 나타낸다. 도 2d 및 도 2e는 야생형 및 Tph1 tm1a 마우스의 뇌 (2d) 및 소장 (2e)에서 X-gal 염색 결과를 나타낸 도이다 (n = 그룹당 3마리). 빨간색 원은 송과체(pineal grand)이다. 이미지는 입체현미경 stereomicroscope)을 이용하여 촬영되었다.
도 3a 내지 도 3c는 Tph1 tm1a 마우스에서 Tph1 의 발현 및 5- HT 수준을 나타낸다. 도 3a는 Tph1 tm1a 마우스의 공장(jejunum)에서 Tph1 mRNA 수준은 정량적 실시간 RT-PCR로 측정하고, 야생형 마우스의 Tph1 mRNA 수준에 대해서 상대적으로 표현한 결과를 나타낸다. 도 3b는 야생형 마우스와 Tph1 tm1a 마우스의 공장에서 5-HTl 면역조학화학 염색를 나타낸다. Scale bar, 50 μm. 도 3c는 혈청, 공장, 및 뇌에서의 5-HT 수준을 LC-MS/MS로 측정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다 (n = 5-8 per group; *P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001 vs. Tph1+/+, Student’s t-test).
도 4a 내지 도 4d는 새롭게 제작한 Tph1 floxed 마우스에서 Tph1 발현과 5-HT 수준을 나타낸 도이다. 도 4a는 야생형 마우스와 Tph1 tm1c GKO 마우스의 십이지장, 공장, 회장, 및 결장에서의 Tph1 mRNA 수준을 정량적 실시간 RT-PCT에 의해 측정한 결과를 나타내고, 야생형과 비교한 상대치로 표현되었다 (n = 3-5 per group). 도 4b는 십이지장, 공장, 회장, 결장, 및 뇌에서의 5-HT 수준을 LC-MS/MS로 측정한 결과를 나타낸다 (n = 3-8 per group). 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현되었다 (**P < 0.01, ***P < 0.001 vs. wild type, Student’s t-test). 도 4c는 야생형 마우스와 Tph1 tm1c GKO 마우스의 십이지장, 공장, 회장, 및 결장에서의 5-HT에 대한 대표적인 면역조직화학염색. Scale bar, 50 μm. 도 4d는 MIP-Cre-hGH (Control) 및 Tph1 tm1c βKO 마우스의 췌장 소도에서의 대표적인 면역형광염색 결과를 나타낸다(n = 3 per group). 췌장 절편은 인슐린(녹색) 및 5-HT (적색)으로 염색되었다. Scale bar, 50 μm.
도 5a 내지 도 5f는 주산기(perinatal period)에 세로토닌이 β 세포 매스 및 증식을 조절함을 나타낸다. 도 5a는 인간의 주산기 췌장의 조직학을 H&E 및 5-HT 에 대한 면역조직화학 염색으로 나타낸 도이다(임신 후 24주령, 생후 8일령, 및 생후 3개월령). 도 5b는 C57BL6/J 마우스에서 얻은 주산기 췌장 소도(perinatal islet)의 면역형광 이미지를 나타낸 도이다. 녹색은 인슐린을, 적색은 5-HT를 나타낸다. 도 5c 내지 도 5f는 대조군과 Tph1 βKO 마우스의 췌장을 생후 0일령(P0)에 평가한 도이다. 도 5c는 전체 췌장을 H&E와 면역형광염색으로 나타낸 도이다. 인슐린은 녹색이고, 아밀라아제는 적색으로 나타내었다. 도 5d는 β 세포 매스(β cell mass)를 전체 췌장 면적에 대한 β 세포 면적의 백분율로 정량화한 결과를 나타낸 도이다. 도 5e는 β 세포 증식에 대한 면역 형광 이미지이다. 인슐린은 녹색, 인-히스톤 H3 (phosphor-Histone H3, PHH3)는 적색으로 나타내었으며, 화사표는 인슐린과 PHH3에 모두 양성인 세포를 나타낸다. 이의 정량화는 모든 β 세포에서 인슐린 및 PHH3에 대해 모두 양성인 세포의 백분율로 나타내었다. 도 5f는 P0의 췌장에서 사이클린 패밀리(cyclin family)의 mRNA 발현을 qRT-PCR로 나타낸 도이다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001.
도 6a 내지 도 6f는 세로토닌이 성체의 β 세포 매스(β cell mass)을 결정하고, 글루코스 항상성을 유지한다는 것을 나타낸다. 도 6a는 9주령 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Tph1 βKO 마우스의 16시간 금식 후 복강내 글루코스 주사(2 g/kg) 후에 측정된 혈당을 나타낸 도이다. 도 6b는 9주령 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Tph1 βKO 마우스의 16시간 금식 후 복강내 글루코스 주사(2 g/kg) 후에 측정된 혈장 인슐린 수준을 나타낸 도이다. 도 6c는 9주령 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Tph1 βKO 마우스의 ex vivo GSIS 분석 결과를 나타낸 도이다. 2.8mM 또는 16.8mM 의 글루코스를 투여한 후의 인슐린 분비를 기초 인슐린 분비량을 기준으로 배수로 나타내었다. 도 6d는 9주령 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Tph1 βKO 마우스의 전체 췌장 면적에 대한 β 세포 면적의 백분율로 β 세포 매스를 정량화하여 나타낸 도이다. 도 6e는 9주령 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Tph1 βKO 마우스의 β 세포 증식을 면역형광이미지 및 정량적 결과로 나타낸 도이다. 인슐린은 녹색이고, Ki-67은 적색으로 나타내었으며, 화살표는 인슐린과 Ki-67이 모두 양성인 세포를 나타낸다. 도 6f는 9주령 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Tph1 βKO 마우스의 췌장 중량을 나타낸 도이다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001.
도 7a 내지 도 7j는 세로토닌 수용체 2b(HTR2B)가 주산기 β 세포(perinatal β cell)에서 5-HT의 다운스트림 타겟임을 나타낸다. 도 7a는 qRT-PCR로 평가된 췌장의 발달 과정에서의 HTR의 mRNA 발현을 나타낸 도이다. 도 7b는 대조군 및 Htr2b βKO 마우스의 생후 0일령 (Postnatal day 0, P0)의 췌장을 H&E 염색으로 나타낸 도이다. 도 7c는 대조군 및 Htr2b βKO 마우스의 생후 0일령 (Postnatal day 0, P0)의 췌장의 β 세포 매스를 나타낸 도이다. 도 7d는 대조군 및 Htr2b βKO 마우스의 생후 0일령 (Postnatal day 0, P0)의 췌장 중량을 나타낸 도이다. 도 7e는 대조군 및 Htr2b βKO 마우스의 생후 0일령 (Postnatal day 0, P0)의 췌장의 β 세포 증식 면역형광 이미지와 정량결과를 나타낸 도이다. 인슐린은 녹색, PHH3는 적색으로 나타내었고, 화살표는 인슐린과 PHH3가 모두 양성인 세포를 나타낸다. 정량결과는 모든 β 세포 중 인슐린과 PHH3가 모두 양성인 세포를 백분율로 나타내었다. 도 7f는 9주령의 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Htr2b βKO 마우스의 16시간 금식 후 복강내 글루코스 주사(2 g/kg) 후에 측정된 혈당을 나타낸 도이다. 도 7g는 9주령의 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Htr2b βKO 마우스의 16시간 금식 후 복강내 글루코스 주사(2 g/kg) 후에 측정된 혈장 인슐린 수준을 나타낸 도이다. 도 7h는 9주령의 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Htr2b βKO 마우스의 ex vivo GSIS 분석 결과를 나타낸 도이다. 2.8mM 또는 16.8mM 의 글루코스를 투여한 후의 인슐린 분비를 기초 인슐린 분비량을 기준으로 배수로 나타내었다. 도 7i는 9주령의 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Htr2b βKO 마우스의 전체 췌장 면적에 대한 β 세포 면적의 백분율로 β 세포 매스를 정량화하여 나타낸 도이다. 도 7j는 9주령의 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Htr2b βKO 마우스의 췌장의 중량을 나타낸 도이다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001.
도 8a는 고지방 식이를 4주간 먹인 12주령의 마우스를 16시간 동안 금식시킨 후 복강 내 글루코스 주사(2 g/kg)를 한 후, 혈당을 나타낸 도이다. 도 8b는 고지방 식이를 8주간 먹인 12주령의 마우스를 16시간 동안 금식시킨 후 복강 내 글루코스 주사(2 g/kg)를 한 후, 혈당을 나타낸 도이다. 도 8c는 이들 마우스에 인슐린 수용체 길항제인 S-961을 7일간 투여한 후 β 세포 증식을 나타낸 도이다. β 세포 증식의 정량 결과는 전체 β 세포에 대한 인슐린 및 Ki-67이 모두 양성인 세포를 백분율로 나타내었다. 도 8d 내지 8e는 대조군, Prlr βKO, Stat5 βKO, 및 Ghr βKO 마우스의 0일령 췌장의 나타낸 도이다. 도 8d는 대조군, Prlr βKO, Stat5 βKO, 및 Ghr βKO 마우스의 0일령 췌장의 5-HT(적색) 및 인슐린(녹색)을 면역형광염색으로 나타낸 도이다. 도 8e는 대조군, Prlr βKO, Stat5 βKO, 및 Ghr βKO 마우스의 0일령 췌장의 H&E 염색 및 β 세포 증식에 대한 면역형광 이미지를 나타낸 도이다. 인슐린은 녹색, 인-히스톤 H3(phosphor-histone H3, PHH3)은 적색으로 나타내었고, 화살표는 인슐린과 PHH3가 모두 양성인 세포를 나타낸다. 도 8f는 생후 0일령의 대조군과 Ghr βKO 마우스의 β 세포 증식에 대한 정량 결과를 모든 β 세포 중 인슐린 및 PHH3가 모두 양성인 세포를 백분율로 나타낸 도이다. 도 8g는 생후 0일령의 대조군과 Ghr βKO 마우스의 β 세포 매스에 대한 정량 결과를 전체 췌장 면적에 대한 β 세포 면적의 백분율로 나타낸 도이다. 도 8h는 주산기 동안의 β 세포 증식에 관한 GHR- STAT5-TPH1-HTR2B 축의 개략도이다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001.
도 9a 내지 도 9b는 세로토닌이 주산기 기간 동안 사람과 마우스의 β 세포에서 생산된다는 점을 나타낸다. 도 9a는 임신 14주령의 태아 췌장을 면역형광 염색한 결과이다. 인슐린(녹색), 글루카곤 (회색) 및 5-HT (적색). 도 9b는 주산기 기간 동안 C57BL6/J 췌장에서 Tph1 및 Tph2 mRNA 전사체의 발현을 나타낸 도이다.
도 10a 내지 도 10e는 Tph1 βKO의 주산기 특징을 나타낸다. 도 10a는 출생 당일 (P0)에서 대조군과 Tph1 βKO 췌장에서의 Tph1 mRNA 발현을 나타낸 도이다. 도 10b는 P0 및 임신중 (14 일)에서 대조군 및 Tph1 βKO 췌장 소도의 5-HT의 IF 염색 결과를 나타낸 도이다. 도 1c는 대조군과 Tph1 βKO를 β 세포 마커(PDX1 및 NKX6.1)의 출생당일 면역염색한 결과를 나타낸 도이다. 도 10d는 P0에서의 췌장 무게를 나타낸 도이다. 도 10e 는 P0에서 Tφ1 βKO 및 Htr2b βKO의 TUNEL IF 염색을 나타낸 도이다. 아폽토시스는 모든 샘플에서 드물게 나타났고, DNase로 처리된 부분을 양성 대조군으로 사용하였다.
도 11a 내지 11c는 Tph1 βKO의 성체기 특징을 나타낸다. 도 11a는 체중을, 도 11b는 6시간 금식 후 복강내 인슐린 저항성 테스트(0.75 U/kg) 결과를 나타낸다. 도 11c는 β 세포 마커(PDX1 및 NKX6.1)의 면역염색 결과를 나타낸 도이다.
도 12a는 Htr1b KO 마우스의 베타 세포 증식능력을 출생 당일 인슐린 및 pHH3가 모두 양성인 세포의 백분율로 정량하여 나타낸 도이다. 도 12b는 Htr1d KO 마우스의 베타 세포 증식능력을 출생 당일 인슐린 및 pHH3가 모두 양성인 세포의 백분율로 정량하여 나타낸 도이다.
도 13a 내지 도 13c는 Htr2b βKO의 성체기 특징을 나타낸다. 도 13a는 체중을, 도 13b는 6시간 금식 후 복강내 인슐린 저항성 테스트(0.75 U/kg) 결과를 나타낸다. 도 13c는 β 세포 마커(PDX1 및 NKX6.1)의 면역염색 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 변형된 STAM 마우스 모델의 제작방법 및 그에 따른 표현형을 나타낸 도이다.
도 15는 인슐린 면역염색을 통한 STZ(streptozotocin)의 투여 전후의 췌장 베타세포의 양의 변화를 나타낸 도이다.
도 16은 STZ 투여가 마우스의 금식 후 혈당에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 17은 STZ 투여가 마우스의 간에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 1d는 Tph1 tm1kry βKO 마우스의 췌장 소도의 면역조직화학 염색 결과를 나타낸다 (n = 3 per group). 췌장 절편은 인슐린(녹색)과 5-HT(적색)으로 염색되었다. 대조군: MIP-Cre-hGH; βKO: Tph1 tm1kry βKO. Scale bar, 50 μm.
도 1e는 TPH1의 아미노산 서열을 나타낸다. 적색 글씨는 중첩되는 스플라이싱 위치; RD, regulatory domain; CD, catalytic domain; TD, tetramerization domain. 도 1f는 야생형 마우스의 Tph1 전사체와 Tph1 tm1kry GKO 마우스의 십이지장의 KO 전사체를 Tph1 Exon1 forward 및 Tph1 Exon11 reverse 프라이머를 이용하여 RT-PCR로 증폭한 결과를 나타낸다. 빈 삼각형은 1000 bp를 가리키고, 검은 삼각형은 1500 bp를 가리킨다. 도 1g는 Tph1 tm1kry βKO 마우스와 hetero βKO 마우스의 췌장 소도로부터 면역블랏 분석에 의해 TPH1 (50 kD) 및 절단된 TPH1 (37kD)를 검출한 결과를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2e는 새로운 Tph1 floxed 마우스 모델의 제작에 관한 것이다. 도 2a는 새로운 Tph1 floxed 마우스의 제작을 위한 타겟팅 전략의 개략도이다. 도 2b는 Tph1 tm1a 및 Tph1 tm1c 마우스의 유전자 타이핑(genotyping)을 나타낸 도이다. 도 1c는 Tph1 tm1c βKO 마우스에서 췌장 소도의 유전자 타이핑을 나타낸 도이다. 빈 삼각형(empty triangles)은 500 bp를 나타내고, 검은 삼각형은 1000 bp를 나타낸다. 도 2d 및 도 2e는 야생형 및 Tph1 tm1a 마우스의 뇌 (2d) 및 소장 (2e)에서 X-gal 염색 결과를 나타낸 도이다 (n = 그룹당 3마리). 빨간색 원은 송과체(pineal grand)이다. 이미지는 입체현미경 stereomicroscope)을 이용하여 촬영되었다.
도 3a 내지 도 3c는 Tph1 tm1a 마우스에서 Tph1 의 발현 및 5- HT 수준을 나타낸다. 도 3a는 Tph1 tm1a 마우스의 공장(jejunum)에서 Tph1 mRNA 수준은 정량적 실시간 RT-PCR로 측정하고, 야생형 마우스의 Tph1 mRNA 수준에 대해서 상대적으로 표현한 결과를 나타낸다. 도 3b는 야생형 마우스와 Tph1 tm1a 마우스의 공장에서 5-HTl 면역조학화학 염색를 나타낸다. Scale bar, 50 μm. 도 3c는 혈청, 공장, 및 뇌에서의 5-HT 수준을 LC-MS/MS로 측정하였다. 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다 (n = 5-8 per group; *P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001 vs. Tph1+/+, Student’s t-test).
도 4a 내지 도 4d는 새롭게 제작한 Tph1 floxed 마우스에서 Tph1 발현과 5-HT 수준을 나타낸 도이다. 도 4a는 야생형 마우스와 Tph1 tm1c GKO 마우스의 십이지장, 공장, 회장, 및 결장에서의 Tph1 mRNA 수준을 정량적 실시간 RT-PCT에 의해 측정한 결과를 나타내고, 야생형과 비교한 상대치로 표현되었다 (n = 3-5 per group). 도 4b는 십이지장, 공장, 회장, 결장, 및 뇌에서의 5-HT 수준을 LC-MS/MS로 측정한 결과를 나타낸다 (n = 3-8 per group). 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현되었다 (**P < 0.01, ***P < 0.001 vs. wild type, Student’s t-test). 도 4c는 야생형 마우스와 Tph1 tm1c GKO 마우스의 십이지장, 공장, 회장, 및 결장에서의 5-HT에 대한 대표적인 면역조직화학염색. Scale bar, 50 μm. 도 4d는 MIP-Cre-hGH (Control) 및 Tph1 tm1c βKO 마우스의 췌장 소도에서의 대표적인 면역형광염색 결과를 나타낸다(n = 3 per group). 췌장 절편은 인슐린(녹색) 및 5-HT (적색)으로 염색되었다. Scale bar, 50 μm.
도 5a 내지 도 5f는 주산기(perinatal period)에 세로토닌이 β 세포 매스 및 증식을 조절함을 나타낸다. 도 5a는 인간의 주산기 췌장의 조직학을 H&E 및 5-HT 에 대한 면역조직화학 염색으로 나타낸 도이다(임신 후 24주령, 생후 8일령, 및 생후 3개월령). 도 5b는 C57BL6/J 마우스에서 얻은 주산기 췌장 소도(perinatal islet)의 면역형광 이미지를 나타낸 도이다. 녹색은 인슐린을, 적색은 5-HT를 나타낸다. 도 5c 내지 도 5f는 대조군과 Tph1 βKO 마우스의 췌장을 생후 0일령(P0)에 평가한 도이다. 도 5c는 전체 췌장을 H&E와 면역형광염색으로 나타낸 도이다. 인슐린은 녹색이고, 아밀라아제는 적색으로 나타내었다. 도 5d는 β 세포 매스(β cell mass)를 전체 췌장 면적에 대한 β 세포 면적의 백분율로 정량화한 결과를 나타낸 도이다. 도 5e는 β 세포 증식에 대한 면역 형광 이미지이다. 인슐린은 녹색, 인-히스톤 H3 (phosphor-Histone H3, PHH3)는 적색으로 나타내었으며, 화사표는 인슐린과 PHH3에 모두 양성인 세포를 나타낸다. 이의 정량화는 모든 β 세포에서 인슐린 및 PHH3에 대해 모두 양성인 세포의 백분율로 나타내었다. 도 5f는 P0의 췌장에서 사이클린 패밀리(cyclin family)의 mRNA 발현을 qRT-PCR로 나타낸 도이다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001.
도 6a 내지 도 6f는 세로토닌이 성체의 β 세포 매스(β cell mass)을 결정하고, 글루코스 항상성을 유지한다는 것을 나타낸다. 도 6a는 9주령 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Tph1 βKO 마우스의 16시간 금식 후 복강내 글루코스 주사(2 g/kg) 후에 측정된 혈당을 나타낸 도이다. 도 6b는 9주령 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Tph1 βKO 마우스의 16시간 금식 후 복강내 글루코스 주사(2 g/kg) 후에 측정된 혈장 인슐린 수준을 나타낸 도이다. 도 6c는 9주령 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Tph1 βKO 마우스의 ex vivo GSIS 분석 결과를 나타낸 도이다. 2.8mM 또는 16.8mM 의 글루코스를 투여한 후의 인슐린 분비를 기초 인슐린 분비량을 기준으로 배수로 나타내었다. 도 6d는 9주령 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Tph1 βKO 마우스의 전체 췌장 면적에 대한 β 세포 면적의 백분율로 β 세포 매스를 정량화하여 나타낸 도이다. 도 6e는 9주령 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Tph1 βKO 마우스의 β 세포 증식을 면역형광이미지 및 정량적 결과로 나타낸 도이다. 인슐린은 녹색이고, Ki-67은 적색으로 나타내었으며, 화살표는 인슐린과 Ki-67이 모두 양성인 세포를 나타낸다. 도 6f는 9주령 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Tph1 βKO 마우스의 췌장 중량을 나타낸 도이다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001.
도 7a 내지 도 7j는 세로토닌 수용체 2b(HTR2B)가 주산기 β 세포(perinatal β cell)에서 5-HT의 다운스트림 타겟임을 나타낸다. 도 7a는 qRT-PCR로 평가된 췌장의 발달 과정에서의 HTR의 mRNA 발현을 나타낸 도이다. 도 7b는 대조군 및 Htr2b βKO 마우스의 생후 0일령 (Postnatal day 0, P0)의 췌장을 H&E 염색으로 나타낸 도이다. 도 7c는 대조군 및 Htr2b βKO 마우스의 생후 0일령 (Postnatal day 0, P0)의 췌장의 β 세포 매스를 나타낸 도이다. 도 7d는 대조군 및 Htr2b βKO 마우스의 생후 0일령 (Postnatal day 0, P0)의 췌장 중량을 나타낸 도이다. 도 7e는 대조군 및 Htr2b βKO 마우스의 생후 0일령 (Postnatal day 0, P0)의 췌장의 β 세포 증식 면역형광 이미지와 정량결과를 나타낸 도이다. 인슐린은 녹색, PHH3는 적색으로 나타내었고, 화살표는 인슐린과 PHH3가 모두 양성인 세포를 나타낸다. 정량결과는 모든 β 세포 중 인슐린과 PHH3가 모두 양성인 세포를 백분율로 나타내었다. 도 7f는 9주령의 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Htr2b βKO 마우스의 16시간 금식 후 복강내 글루코스 주사(2 g/kg) 후에 측정된 혈당을 나타낸 도이다. 도 7g는 9주령의 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Htr2b βKO 마우스의 16시간 금식 후 복강내 글루코스 주사(2 g/kg) 후에 측정된 혈장 인슐린 수준을 나타낸 도이다. 도 7h는 9주령의 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Htr2b βKO 마우스의 ex vivo GSIS 분석 결과를 나타낸 도이다. 2.8mM 또는 16.8mM 의 글루코스를 투여한 후의 인슐린 분비를 기초 인슐린 분비량을 기준으로 배수로 나타내었다. 도 7i는 9주령의 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Htr2b βKO 마우스의 전체 췌장 면적에 대한 β 세포 면적의 백분율로 β 세포 매스를 정량화하여 나타낸 도이다. 도 7j는 9주령의 웅성 대조군 마우스와 9주령의 웅성 Htr2b βKO 마우스의 췌장의 중량을 나타낸 도이다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001.
도 8a는 고지방 식이를 4주간 먹인 12주령의 마우스를 16시간 동안 금식시킨 후 복강 내 글루코스 주사(2 g/kg)를 한 후, 혈당을 나타낸 도이다. 도 8b는 고지방 식이를 8주간 먹인 12주령의 마우스를 16시간 동안 금식시킨 후 복강 내 글루코스 주사(2 g/kg)를 한 후, 혈당을 나타낸 도이다. 도 8c는 이들 마우스에 인슐린 수용체 길항제인 S-961을 7일간 투여한 후 β 세포 증식을 나타낸 도이다. β 세포 증식의 정량 결과는 전체 β 세포에 대한 인슐린 및 Ki-67이 모두 양성인 세포를 백분율로 나타내었다. 도 8d 내지 8e는 대조군, Prlr βKO, Stat5 βKO, 및 Ghr βKO 마우스의 0일령 췌장의 나타낸 도이다. 도 8d는 대조군, Prlr βKO, Stat5 βKO, 및 Ghr βKO 마우스의 0일령 췌장의 5-HT(적색) 및 인슐린(녹색)을 면역형광염색으로 나타낸 도이다. 도 8e는 대조군, Prlr βKO, Stat5 βKO, 및 Ghr βKO 마우스의 0일령 췌장의 H&E 염색 및 β 세포 증식에 대한 면역형광 이미지를 나타낸 도이다. 인슐린은 녹색, 인-히스톤 H3(phosphor-histone H3, PHH3)은 적색으로 나타내었고, 화살표는 인슐린과 PHH3가 모두 양성인 세포를 나타낸다. 도 8f는 생후 0일령의 대조군과 Ghr βKO 마우스의 β 세포 증식에 대한 정량 결과를 모든 β 세포 중 인슐린 및 PHH3가 모두 양성인 세포를 백분율로 나타낸 도이다. 도 8g는 생후 0일령의 대조군과 Ghr βKO 마우스의 β 세포 매스에 대한 정량 결과를 전체 췌장 면적에 대한 β 세포 면적의 백분율로 나타낸 도이다. 도 8h는 주산기 동안의 β 세포 증식에 관한 GHR- STAT5-TPH1-HTR2B 축의 개략도이다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001.
도 9a 내지 도 9b는 세로토닌이 주산기 기간 동안 사람과 마우스의 β 세포에서 생산된다는 점을 나타낸다. 도 9a는 임신 14주령의 태아 췌장을 면역형광 염색한 결과이다. 인슐린(녹색), 글루카곤 (회색) 및 5-HT (적색). 도 9b는 주산기 기간 동안 C57BL6/J 췌장에서 Tph1 및 Tph2 mRNA 전사체의 발현을 나타낸 도이다.
도 10a 내지 도 10e는 Tph1 βKO의 주산기 특징을 나타낸다. 도 10a는 출생 당일 (P0)에서 대조군과 Tph1 βKO 췌장에서의 Tph1 mRNA 발현을 나타낸 도이다. 도 10b는 P0 및 임신중 (14 일)에서 대조군 및 Tph1 βKO 췌장 소도의 5-HT의 IF 염색 결과를 나타낸 도이다. 도 1c는 대조군과 Tph1 βKO를 β 세포 마커(PDX1 및 NKX6.1)의 출생당일 면역염색한 결과를 나타낸 도이다. 도 10d는 P0에서의 췌장 무게를 나타낸 도이다. 도 10e 는 P0에서 Tφ1 βKO 및 Htr2b βKO의 TUNEL IF 염색을 나타낸 도이다. 아폽토시스는 모든 샘플에서 드물게 나타났고, DNase로 처리된 부분을 양성 대조군으로 사용하였다.
도 11a 내지 11c는 Tph1 βKO의 성체기 특징을 나타낸다. 도 11a는 체중을, 도 11b는 6시간 금식 후 복강내 인슐린 저항성 테스트(0.75 U/kg) 결과를 나타낸다. 도 11c는 β 세포 마커(PDX1 및 NKX6.1)의 면역염색 결과를 나타낸 도이다.
도 12a는 Htr1b KO 마우스의 베타 세포 증식능력을 출생 당일 인슐린 및 pHH3가 모두 양성인 세포의 백분율로 정량하여 나타낸 도이다. 도 12b는 Htr1d KO 마우스의 베타 세포 증식능력을 출생 당일 인슐린 및 pHH3가 모두 양성인 세포의 백분율로 정량하여 나타낸 도이다.
도 13a 내지 도 13c는 Htr2b βKO의 성체기 특징을 나타낸다. 도 13a는 체중을, 도 13b는 6시간 금식 후 복강내 인슐린 저항성 테스트(0.75 U/kg) 결과를 나타낸다. 도 13c는 β 세포 마커(PDX1 및 NKX6.1)의 면역염색 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명의 변형된 STAM 마우스 모델의 제작방법 및 그에 따른 표현형을 나타낸 도이다.
도 15는 인슐린 면역염색을 통한 STZ(streptozotocin)의 투여 전후의 췌장 베타세포의 양의 변화를 나타낸 도이다.
도 16은 STZ 투여가 마우스의 금식 후 혈당에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 17은 STZ 투여가 마우스의 간에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1: Tph1 KO 마우스의 제작
1-1. Tph1 KO 마우스의 제작
Tph1-표적화 된 배아 줄기 (ES) 세포 클론 EPD0195_1_C03은 trans-NIH Knock-Out Mouse Project (KOMP)에서 얻었다. 돌연변이 Tph1 대립 유전자 (Tph1tm1a (KOMP) Wtsi)는 Tph1 유전자의 엑손 4와 5 사이에 위치한 인트론에 삽입된 En2 SA, FRT 사이트, loxP 사이트, lacZ 및 네오마이신 카세트를 포함한다 (도 2a).
표적 ES 세포를 BALB/c 마우스의 배반포에 주입하고, Tph1tm1a (KOMP) Wtsi 대립 유전자를 보유하는 C57BL/6N × BALB/c 키메라 파운더를 C57BL/6J 마우스와 교배시켰다. F1 마우스에서의 생식선 전달(Germline transmission)을 분석하고 확인된 자손을 형질전환 플리페이스 마우스(transgenic flippase mice)와 교배시켜 LacZ 엑손 트랩과 네오 마이신 내성 카세트에 인접한 FRT 부위를 재조합시켰다. FRT-KO 대립 유전자를 보유하는 마우스(Tph1 tm1c (KOMP) Wtsi )를 표시된 조직 특이적 Cre 마우스와 교배시켰다. Tph1 tm1a (KOMP) Wtsi 또는 Tph1 tm1c (KOMP) Wtsi 대립 유전자를 보유한 마우스는 C57BL/6J 유전적 배경에서 역교배 되고, 유지되었다.
이하에서 돌연변이 대립 유전자는 Tm1a (Tph1 tm1a (KOMP) Wtsi ), tm1c (Tph1 tm1c (KOMP) Wtsi) 및 tm1d (Tph1 tm1d (KOMP) Wtsi )로 약칭되고, 상기 돌연변이 대립 유전자인 Tph1 tm1a (KOMP) Wtsi 또는 Tph1 tm1c (KOMP) Wtsi 를 보유하는 마우스는 각각 Tph1 tm1a 마우스 및 Tph1 tm1c 마우스로 약칭된다.
유전자형의 분석을 위해 사용된 프라이머들은 표 1에 기재되었다.
| 프라이머 | 서열 | SEQ ID NO |
| Tph1 forward | TTCTGACCTGGACTTCTGCG | 1 |
| Tph1 reverse | GGGGTCCCCATGTTTGTAGT | 2 |
| 36B4 forward | TCCAGGCTTTGGGCATCA | 3 |
| 36B4 reverse | CTTTATCAGCTGCACATCACTCAGA | 4 |
| CSD-Tph1-F | TCAACATAGCCCTGAGCTCCTTAGC | 5 |
| CSD-neo-F | GGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCG | 6 |
| CSD-Tph1-ttR | ATGCAAAGCTCCTACAGTGACAACG | 7 |
| CSD-Tph1-R | CACATTCCCTTGCAACTCTGCTACC | 8 |
| Tph1 exon1 forward | GACTCTTTAAACTCCAGTGG | 9 |
| Tph1 exon11 reverse | TCACACACTGGGCCACCTGG | 10 |
1-2. 동물 관리
Tph1 tm1kry (MGI: 3837399), Villin-Cre (MGI: 2448639), 및 MIP-Cre-hGH 마우스는 SPF 시설(specific pathogen-free barrier facility)에서 12시간 명암주기로 기후-조절 환경 하에 사육되었고, 일반 사료와 물을 무제한 급이하였다. 모든 마우스 연구는 한국과학기술원의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다고, 모든 실험은 관련된 가이드라인과 규정에 의해 수행되었다.
1-3. 5-HT의 수준 측정을 위한 혈청 및 조직의 준비
마우스의 후안와 출혈로 얻은 혈액 샘플을 혈청-분리 튜브 (BD, 365967)에 수집하였다. 혈액을 실온에서 15 분 동안 응고시킨 다음 4 ℃에서 10 분간 2000 × g으로 원심 분리하였다. 수집된 혈청을 1:9의 비율로 메탄올과 혼합한 후 4 ℃에서 15 분간 12000 × g으로 원심 분리 하였다. 생성된 상층 액을 즉시 동결시키고 추가 분석시까지 -80 ℃에서 보관하였다. 십이지장, 공장, 회장, 및 결장은 절개하여 인산완충용액(phosphate-buffered saline, PBS)으로 세척하였다. 송과체는 뇌로부터 절제하였다. 십이지장, 공장, 회장, 결장, 및 뇌는 RIPA 완충용액 (Thermo Fisher Scientific)에서 FastPrep-24 비드 균질기 (MP Biomedicals)를 이용하여 균질화시키고, 12,000 × g로 4 °C에서 5분간 원심분리하였다. 상층액은 메탄올과 1:1의 비율로 혼합하고, 12000 × g로 4 °C에서 15분간 원심분리하였으며, 그후 즉시 동결하여 추가 분석시까지 80 °C에서 보관하였다. 상층액 분액 (100 μL)은 새로운 샘플 튜브에 옮겨 제조사(Thermo Fischer Scientific)의 프로토콜에 따라 BCA 분석으로 단백질 정량에 사용하였다. 별도의 100-μL 상층액 분액을 깨끗한 샘플 튜브에 옮기고, 300 ml의 HPLC-수준의 순수한 메탄올 (Sigma-Aldrich)과 혼합하였다. 혼합 후, 12000 × g로 4 °C에서 15분간 원심분리하였다. 100 μL의 상층액 샘플은 5-HT를 동위원소-희석 LC-MS(isotope-dilution liquid chromatography-mass spectrometry)로 측정하는데 사용되었다. 이 분석을 위하여, 20 μL의 1 mg/kg 5-HT-α,α,β,β-d4 Creatinine Sulfate 복합체 용액 (CDN isotopes Inc.)을 샘플 용액에 첨가하고, 100 μL의 메탄올을 첨가하였다. 혼합 후, 샘플을 진공에서 증류시켰다. 잔여물은 50 μL의 증류수에 용해시켜, 1회용 주사기 필터로 여과한 다음, 분석을 위해 LC-MS 시스템에 투입하였다.
LC-MS/MS 분석은 Xevo TQ-S electrospray ionization triple quadrupole-mass spectrometer (Waters, Waltham, MA, USA)에 연결된 ACQUITY 시리즈 UPLC 시스템을 사용하여 한국표준과학연구원(Korea Research Institute of Standards and Science)에서 수행되었다. 샘플을 Capcell core ADME column (2.1 mm I.D. × 100 mm, 2.6 μm; Shiseido, Japan)에 넣고, 75% 이동상 A (30 mM ammonium formate):25% 이동상 B (methanol) 에서 60% 이동상 A:40% 이동상 B 까지의 선형 농도구배로 3분동안 400 μL/min의 속도로 용출시켰고, 20% 이동상 A:80% 이동상 B로 1분간 세척 단계를 거치고, 1분간 재평형시켰다. 투입량은 3 μL이었고, 5-HT와 이의 동위원소의 이온 변화 (m/z)는 각각 159.8 > 104.9, 및 163.8 > 109.1 이었다.
샘플의 분석 전, 소스 이온화와 조각화 파라미터는 MS 신호를 모니터링함으로써 최적화하였다. 분석 소프트웨어 MassLynx (Version 4.1; Waters)는 데이터 입수 및 시스템 조작을 위해 사용되었다. 5-HT의 농도는 상응하는 단백질 농도에 정규화되었다.
1-4. X-gal 염색
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) 염색은 Seymour 등에 의해 기술된 바와 같이 수행되었다. 뇌와 소장은 ice-cold 조직 고정액 (4% paraformaldehyde, 2 mM MgSO4, 5 mM EGTA)에서 1 시간 동안 위치시켜 고정하였다. 고정된 조직은 헹굼 용액 A (2 mM MgCl2, 5 mM EGTA in buffer)로 30분간 실온에서 세척되었고, 헹굼 용액 B (2 mM MgCl2, 0.01% w/v sodium deoxycholate, 0.02% w/v Nonidet P-40 in buffer)로 5분간 실온에서 세척되었다. 그 후, 조직을 염색 시약(2 mM MgCl2, 0.01% sodium deoxycholate, 0.02% Nonidet P-40, 5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6·6H2O, 및 1 mg/mL X-gal in 100 mM Sorensen’s phosphate buffer, pH 7.4)에 넣고 37 °C에서 하룻밤 배양되었다. 염색된 조직은 PBS에서 3회 세척되었다. 이미지는 입체현미경 (SZ61, Olympus)을 이용하여 분석되었다.
1-5. 면역조직화학 및 면역형광 염색
면역 염색을 위해, 먼저 조직을 실온에서 4 시간 동안 10 % 중성 완충 포르말린 용액 (Sigma-Aldrich)에서 고정시키고, 탈이온수로 실온에서 1 시간 동안 세척한 후 파라핀에 포매하고 4 μm 두께의 절편(section)으로 슬라이스 하였다. 파라핀을 제거하고, 재수화시킨 후, 조직 절편을 구연산 나트륨 완충액 (10 mM sodium citrate, pH 6.0)에 넣고 가열함으로써 항원을 회수하였고, 5% 당나귀 혈청에서 30분간 실온에 배양하여 블로킹하였다. 그 다음, 조직 절편을 기니피그의 항-인슐린 항체 또는 토끼의 항-5-HT 항체와 4 °C에서 16시간동안 배양하였다. 면역조직화학 분석은 VECTASTAIN ABC HRP Kit (PK-4001; Vector Labs)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 일차 항체와 배양한 절편을 공급된 완충액으로 세척한 후, 비오틴화 항-토끼 항체와 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 조직을 VECTASTAIN ABC 시약으로 30 분 동안 배양한 후 DAB 퍼옥시다아제 기질 용액 (SK-4100; Vector Labs)에서 배양하였다. 그 후 절편을 염색 및 마운팅하였다.
면역 형광 염색을 위해, 1 차 항체로 배양한 조직 절편을 PBS로 세척하고 실온에서 2 시간 동안 다음 중 선택된 하나의 2차 항체로 배양하였다:
FITC 컨쥬게이션 된 당나귀 항-기니피그 IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch), 로다민 컨쥬게이션 된 당나귀 항-토끼 IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch), 또는 알렉사 프로 647 당나귀 항-마우스 IgG (1:1000; Jackson ImmunoResearch). 이미지는 공 촛점 현미경 (LSM 780, Carl Zeiss)과 명 시야 현미경 (DS-Ri2; Nikon)을 사용하여 분석하였다.
1-6. RT-qPCR
FastPrep-24를 이용하여 십이지장, 공장, 회장 및 결장을 개별적으로 균질화하고, TRIzol (Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. Viia7 시스템 (Thermo Fisher Scientific) 및 Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 실시간 PCR로 cDNA (반응 당 10 ng / μl)를 분석 하였다. 유전자 발현 수준 분석에 사용된 프라이머는 표 1에 기재되었다.
1-7. 면역블랏 분석(Immunoblot analysis)
췌장 소도는 분리하고 프로테아제 억제 칵테일(Sigma-Aldrich)을 포함하는 RIPA 완충액에 용해(lysis)시켰다. 단백질 농도는 Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 측정하였다. 전체 세포 용해물의 단백질을 10% 폴리 아크릴 아미드 겔에서 SDS-PAGE로 분리하고, 폴리 비닐리덴 다이플루오라이드 멤브레인(polyvinylidene difluoride membrane)으로 옮겼다. TBST (150mM 염화나트륨, 20mM Tris, 0.1 % Tween-20, pH 7.6) 중 5 % (w/v) 스킴 밀크로 멤브레인을 블로킹하고, 토끼 항-TPH1 항체 (1:1000; Cell Signaling, # 12339)로 4 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 실온에서 TBST로 3 회(각각 10 분) 세척한 후, 멤브레인을 HRP-컨쥬게이션 된 항-토끼 IgG 2 차 항체 (1:5000; Cell Signaling, # 7074)로 1 시간 동안 실온에서 배양하였다. 실온에서 TBST로 3회(각각 10 분) 세척한 후, 면역 반응성 단백질을 Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 검출하였다. 이미지는 ChemiDoc MP 시스템 (Bio-Rad)을 사용하여 분석하였다.
1-8. 결과
지금까지, Tph1 tm1kry 는 Cre-loxP 시스템을 사용하여 조직-특이적 Tph1 KO 마우스를 생성하는 데 사용할 수 있는 유일한 조건 대립 유전자였다.
Tph1 tm1kry 를 생성하는 데 사용되는 KO 전략은 Tph1 유전자의 엑손 2와 3을 타겟팅 하는 것이다 (도 1a). Tph1 tm1kry KO 마우스가 장 및 지방 조직에서 5-HT 및 관련 표현형의 기능을 묘사하는데 유용함이 입증되었지만, 본 발명자들은 장-특이적인 Tph1 tm1kry KO (Tph1 tm1kry GKO) 마우스의 장에서 5-HT 생산이 완전히 중단되지 않았음을 입증하였다. 전반적으로, 5-HT 수준은 54.7 % 감소하였고, 5-HT 양성 세포는 Tph1 tm1kry GKO 마우스의 공장에서 용이하게 검출되었다 (도 1b, 도 1c).
본 발명자들은 이전에 보고한 바와 같이, 5-HT는 증가된 Tph1 발현으로 인해 면역 형광 염색 (immunofluorescence staining) (도 1d)에 의해 MIP-Cre-hGH 마우스의 췌장 β 세포에서 용이하게 검출됨을 확인하였다.
본 발명자들은 췌장 β 세포에서 Tph1 tm1kry 대립 유전자의 KO 효율을 평가하기 위해, Tph1 tm1kry 마우스와 MIP-Cre-hGH 마우스를 교배시킴으로써 β 세포-특이적인 Tph1 tm1kry KO (Tph1 tm1kry βKO) 마우스를 제작하였다. 면역형광염색은 MIP-Cre-hGH 마우스의 β 세포에서 강력한 5-HT 생산을 보였다; 특히, 이 생산은 Tph1 tm1kry βKO 마우스의 β 세포에서 감소하지 않았다 (도 1d). 이 데이터는 Tph1 tm1kry 대립 유전자의 2 번과 3 번의 exon이 삭제된 후에도 5-HT 생산이 크게 변하지 않았음을 나타낸다.
Tph1 tm1kry βKO 및 Tph1 tm1kry GKO 마우스에서 관찰된 잔여 TPH1 활성에 대한 한 가지 설명은 Tph1 tm1kry 조건적 대립 유전자의 불완전한 결실이다. 그러나 Villin-Cre 및 MIP-Cre-hGH 마우스의 높은 재조합 효율을 고려할 때, Cre 재조합 Tph1 tm1kry 대립 유전자가 잔류 TPH1 촉매 활성을 갖는 단백질을 코딩하는, 이상 Tph1 전사물을 생성하기 때문일 가능성이 더 높다.
Tph1 유전체 구조의 상세한 검토는 Tph1 tm1kry 대립 유전자 (도 1e)에서 엑손 2 및 엑손 3의 결실 후 절단된 TPH1 단백질을 생성하기 위한 시작 코돈으로서 작용할 수 있는 엑손 4에서의 메티오닌의 존재를 밝혀냈다.
역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR) 및 후속 서열 분석 결과, 엑손 2 및 3이 없는 Tph1의 3 가지 스플라이스 변이체가 Tph1 tm1kry GKO 마우스의 십이지장에서 발현되었음이 밝혀졌다(도 1f). 이러한 전사체(transcript)는 야생형 Tph1 과 동일한 리딩 프레임을 가진 폴리펩티드를 생산할 것으로 예측되는 엑손 4의 시작 코돈을 포함하고 있다.
실제로, Tph1 tm1kry βKO 마우스의 췌장 소도로부터 조직 용해물의 면역 블롯 분석은 37kD 절단된 TPH1 단백질의 존재를 밝혀냈다 (도 1g). TPH 단백질은 조절 도메인, 촉매 도메인 및 테트라머화 도메인으로 구성된다. 절단된 TPH1은 촉매 도메인 및 테트라머화 도메인을 포함한다. 따라서 본 발명자들은 Tph1 tm1kry GKO 및 Tph1 tm1kry βKO 마우스에서 지속적인 5-HT 생산은 엑손 2 및 3의 결실의 결과로서 절단된 TPH1 단백질의 발현에 기인할 수 있다고 결론을 내렸다.
실시예 2. 새로운 Tph1 floxed 마우스의 제작 및 KO 효율의 분석
2-1. 새로운 Tph1 floxed 마우스의 제작
TPH1에 의한 5-HT 합성을 완전히 중단시키기 위해, 본 발명자들은 TPH1의 촉매 도메인을 코딩하는 엑손 5와 6이 표적화 된 Tph1tm1a 대립 유전자를 포함하는 새로운 마우스를 제작하였다. Tph1tm1a 대립 유전자의 후속 Flp-매개 재조합은 TGF1tm1c 대립 유전자를 만들었으며, 이 대립 유전자는 엑손 5 및 6의 Cre 매개된 결실을 겪을 수 있다 (도 2a). Tph1tm1a 대립 유전자는, 642bp의 생성물을 생성하는 CSD-neo-F 및 CSD-Tph1-ttR 프라이머 (도 2b)로 게놈 DNA의 PCR 증폭에 의해 검출되었다.
Flp-매개 재조합을 통한 Tph1 tm1c 대립 유전자의 생성은 826 bp 생성물을 생성하는 프라이머인 CSD-Tph1-F 및 CSD-Tph1-ttR로 PCR 증폭에 의해 확인되었다(도 2b). 우리는 Tph1 tm1c 마우스를 MIP-Cre-hGH 마우스와 교배시켜 β 세포-특이적 Tph1 tm1c KO (Tph1 tm1c βKO) 마우스를 생성하고, PCR 프라이머인 CSD-Tph1-F와 CSD-Tph1-R (그림 2c)을 사용하여 793 bp의 게놈 조각을 증폭함으로써 Tph1 tm1c βKO 마우스의 β 세포에서 Tph1의 엑손 5와 6의 결실을 확인했다. Tph1tm1a 대립 유전자는 Tph1 유전자 발현의 내인성 패턴에 따라, β-갈락토시다제를 발현하도록 설계된 스플라이스 수용체 서열(splice acceptor sequence)을 함유한다. 내인성 Tph1 유전자 발현을 위한 β-갈락토시다아제 리포터는 송과체(pineal gland)와 장에서 X-gal 염색을 사용하여 β-갈락토시다아제 활성을 시각화함으로써 확인되었다 (도 2d, 도 2e).
2-2. 새로운 Tph1 KO 마우스에서 Tph1 KO의 효율
본 발명자들은 새롭게 개발된 Tph1 KO 마우스에서 Tph1 KO의 효율을 평가하였다.
본 발명자들은 처음에는 말초 5-HT 시스템의 완전히 소실했을 것으로 예상했던 Tph1 tm1a 마우스를 검사하였다. Tph1 mRNA의 수치가 유의하게 감소하고 5-HT 양성 세포의 수가 감소되었지만, 5-HT 양성 세포는 여전히 공장에서 관찰되었다 (도 3a, b). 혈청 5-HT 수준은 91.4 % 감소하였고, 반면에 공장의 5-HT 수준은 77.6 % 감소하였다. 예상했지만, 이와 대조적으로, 뇌에서 5-HT 수준은 야생형의 마우스의 수준과 유사하였다 (도 3c). 이 데이터는 5-HT 합성의 제거가 Tph1tm1a 마우스의 장에서는 여전히 불완전하다는 것을 나타낸다; 따라서, Tph1tm1a 마우스의 일부 세포는 KO를 피할 수 있었다. 엑손-포착 접근법(exon-trapping approach)이 null 대립 형질이라기 보다 hypomorphic 대립 형질을 유도했던 유사한 예는 Slc25a21 tm1a (KOMP) Wtsi 대립 유전자를 보유하는 Slc25a21 KO 마우스를 포함한다.
다음으로, 조직 특이적인 KO 효율을 평가하기 위해, Tph1 tm1c 마우스를 각각 Villin-Cre 및 MIP-Cre-hGH 마우스와 교배시켜 장-특이적인 Tph1 tm1c KO 마우스(Tph1 tm1c GKO) 및 β 세포-특이적인 Tph1 tm1c KO 마우스 (Tph1 tm1c βKO)를 제작하였다. Tph1 mRNA 수준은 Tph1 tm1c GKO 마우스의 소장 및 대장에서 유의하게 감소하였다 (도 4a). 따라서, 조직 5-HT 수준은 Tph1 tm1c GKO 마우스의 소장 및 대장에서 실질적으로 감소되었다 (도 4b). Villin-Cre의 공지된 재조합 효율 및 장내 신경계에서 TPH2의 활성을 고려하면, 5-HT 합성은 장내에서 거의 완전하게 중지되었다. 특히, Tph1 tm1c GKO 마우스의 장내 점막 또는 Tph1 tm1c βKO 마우스의 β 세포에는 5-HT 양성 세포가 관찰되지 않았으며(도 4c, d), 이는 장 및 췌장 β 세포에서 5-HT 생산이 거의 완전히 제거되었음을 나타낸다. 이 데이터는 5-HT 생산이 새로 제작된 Tph1 tm1c 마우스 모델을 사용하여 완전히 중지되었음을 나타낸다.
2-3. 토의
5-HT는 신경 조직 뿐만 아니라 말초 조직에서도 많은 생리 기능을 담당한다. 지금까지는 장에서 유래한 5-HT는 말초 조직에서 주로 기능한다고 생각되어 왔다. 그러나 최근 연구에 따르면 췌장 베타 세포와 지방 세포를 비롯한 말초 조직의 세포가 국소 조직에서 중요한 역할을 하는 5-HT를 합성 및 분비 할 수 있는 것으로 나타났다. 췌장 β 세포에서, 5-HT는 보상적 β 세포 증식을 유도하고 임신기간 중 포도당 자극에 의한 인슐린 분비를 증가시킨다. 지방 조직에서, 5-HT는 에너지 소비를 줄이고 지질 축적을 증가시키는 비만 호르몬으로서 기능한다. 이와 같이, 5-HT는 말초 조직에서 자가 분비(autocrine) 또는 주변 분비(paracrine) 방식으로 작용할 수 있다.
대부분의 연구가 전통적인 Tph1 KO 마우스 또는 TPH 억제제 또는 5-HT 수용체를 겨냥한 화학 물질을 사용하여 수행되었기 때문에 지난 수십 년 동안 말초 5-HT의 기능을 설명해온 연구결과에는 한계가 있다.
따라서, 국소 조직(local tissue)에서 5-HT의 생체 내(in vivo) 기능을 분석하기 위한 효율적인 도구를 개발하는 것은 조직-특이적 KO 전략은 5-HT의 조직-자율 기능을 부여하기위한 실험적 접근으로서 큰 가치를 제공한다.
지금까지 Tph1 tm1kry 는 조직-특이적 Tph1 KO 모델을 만드는데 사용되었던 유일한 Tph1 floxed 대립 유전자이다. Tph1 tm1kry 마우스는 5-HT의 수많은 말초에서의 기능의 초기 동정에 기여했다. 그러나 본 발명자들은 Tph1의 엑손 2와 3의 성공적 삭제에도 불구하고 5-HT가 Tph1 tm1kry KO 마우스의 표적 조직에서 계속 생산된다는 것을 발견했다. 이전 연구에서 Tph1 tm1kry 마우스가 효과적이었음이 입증되었지만 이 조건에서는 특정 표현형이 불분명하게 나타났다. 주어진 생리적 기능을 유지하기 위해 필요한 5-HT의 양은 조직의 유형, 관찰하고자 하는 표현형 또는 실험 조건에 따라 다를 수 있다. 실제로 5-HT의 유의한 감소에도 불구하고, 유선-특이적 파괴가 젖 분비 과정에서 유생산 또는 꽈리 형태(alveolar morphology)를 변화시키지 않은 것으로 나타났다. 이전의 보고들과는 대조적으로, 이러한 결과는 5-HT 생산의 불완전한 중지가 표현형에 영향을 미쳤음을 나타낸다. 따라서 완전한 Tph1 KO 마우스는 특정 조직에서 Tph1 결실의 모든 범위의 효과를 모호하지 않게 해석하기 위해 필수적이다.
보다 향상된 Tph1 조건적 대립 유전자를 만들기 위해, 본 발명자들은 새로운 Tph1 floxed 마우스 모델 인 Tph1 tm1c 마우스를 제작하였다. Tph1 tm1c 대립 유전자는 TPH1의 촉매 도메인을 코딩하는 엑손 5 및 6의 Cre-매개된 결실을 유도하도록 고안되었다. Tph1 tm1c 마우스는 장 및 췌장 β 세포와 같은 대표적인 5-HT 양성 조직에서, 보다 높은 KO 효율을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 Tph1 tm1c 마우스를 사용하면, 잔류 5-HT로 인한 결과의 오해를 줄이고 이전에 가능했던 것 보다 정확한 분석을 제공하여, 궁극적으로 말초 5-HT 시스템의 새로운 기능을 공개할 수 있다.
실시예 3. Tph1, Htr2b 조직-특이적 KO 마우스의 제작
3-1. KO 마우스의 제작 및 사육 관리
본 실시예에서 사용된 모든 마우스는 C57BL/6J 백그라운드의 스트레인이었다. 마우스는 KAIST의 특정 병원체 부재 시설에서 12시간 명암주기의 동일 온도 및 동일 습도 조건 하에서 사육되었다. 일반 식이 (SCD, D10001, Research Diets, Inc.)와 물은 무제한으로 급여되었다.
Insulin-Cre 마우스는 다른 floxed 마우스 (Tph1 floxed, Htr2b, Prlr floxed, 및 Stat5 floxed), 및 Ghr floxed 된 Ins2-Cre 마우스와 교배하여 β 세포-특이적인 넉아웃 마우스를 제작하였다. Htr1b tm1.1(KOMP)Vlcg 마우스와 Htr1d tm1.1(KOMP)Vlcg 마우스는 KOMP에서 구매하였다.
성체 마우스 실험에는, 9주령의 웅성 마우스가 사용되었다. 고지방 식이 실험에는 60% kcal가 지방인 사료(D12492, Research Diets Inc.)를 12주령의 웅성 마우스에 4-8주간 급이하였다. S-961 (인슐린 길항제) 연구에는, 100 nmol/kg의 S-961을 하루에 2번 복강내로 7일간 투여하였다.
3-2. 면역염색 및 β 세포 영역 측정
마우스 췌장 조직은 채취한 즉시 10% 중성-완충 포르말린 용액에 2시간(주산기 마우스의 경우), 또는 4시간(성체 마우스의 경우) 동안 실온에서 고정된 후, 3차 증류수로 30분간 세척하였다.
세척 후, 췌장 조직은 조직 처리기(Leica)로 탈수되었고, 파라핀에 포매되었다. FFPE 조직은 4-μm 두께로 슬라이스 되어 글라스 슬라이드에 마운팅되었다. 이 슬라이드들은 자일렌으로 파라핀을 제거하고, 이어질 염색을 위해 에탄올에서 재수화하였다. 항원 회수는 구연산 나트륨 완충액(10 mM sodium citrate, pH 6.0)으로 압력 솥(pressure cooker)에서 15분간 수행되었다.
면역형광 염색을 위해, 샘플을 PBS로 희석한 2% 당나귀 혈청으로 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 1차 항체-처리된 슬라이드를 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다; 항-5-HT 항체(토끼, ImmunoStar, dilution factor 1:1000), 항-글루카곤 항체 (mouse, Sigma, 1:1000), 항-인슐린 항체 (guinea pig, Dako, 1:1000), 항 -Nkx6.1 항체 (mouse, DSHB, 1:100), 항-Pdx1 항체 (mouse, DSHB, 1:100), 및 항-인-히스톤 H3 항체(anti-phospho-Histone H3 antibody) (rabbit, Millipore, 1:1000).
인큐베이션 및 세척 후, 2차 항체를 실온에서 2시간 동안 처리하고 인큐베이션하였다: Alexa594-컨쥬게이션 된 당나귀 항-마우스 IgG (Jackson ImmunoResearch, 1:1000), Alexa647-컨쥬게이션 된 당나귀 항-토끼 IgG (Jackson ImmunoResearch, 1:1000), 및 FITC- 컨쥬게이션 된 당나귀 항-기니피그 IgG (Jackson ImmunoResearch, 1:1000). 샘플들은 DAPI (Invitrogen, 1:2000)로 5분간 처리된 후 형광 마운팅 시약 (Dako)으로 마운팅되었다. 이미지는 공초점 현미경 LSM780 (Cal Zeiss) 또는 DS-Ri2 카메라가 장착된 형광 현미경 (Nikon)을 이용하여 얻었다. 면역조직화학은 5-HT에 대해서 비오틴 부재 폴리머 검출 시스템(MACH3, Biocare Medical LCC)으로 수행되었다. 토끼 IgG에 대한 2차 항체를 적용한 후, 면역 반응 산물을 디아미노벤지딘(diaminobenzidine (Thermo Fisher Scientific))으로 발색하였다. 특이성은 1차 항체 미처리 또는 비-면역 혈청으로 교체한 후 양성 염색이 없는 것을 통해 확인하였다. 절편 이미지는 명시야 현미경으로 관찰하고 캡쳐하였다(Axio imager A1 or Axio imager M1, Carl Zeiss). β 세포 매스(β cell mass)의 측정을 위하여서는, FFPE 췌장 절편을 80 μm 간격으로 (최소 8개 슬라이드) 얻었다. 이 췌장 슬라이드들을 인슐린으로 면역 염색하고, 모든 슬라이드를 JuLI stage (NanoEnTek)로 스캐닝하였다. β 세포 매스(β cell mass )은 인슐린 면역 반응성 면적을 전체 췌장 면적으로 나누어 측정하였다.
3-3. 당 역학(Glucose dynamics)
복강내 당 내성 테스트(glucose tolerance test, GTT) 및 in vivo 당-자극 인슐린 분비 테스트(glucose-stimulated insulin secretion test, GSIS)를 위해, 마우스를 16시간 동안 하룻 밤 금식 시키고, D-glucose (2 g/kg body weight)를 복강내 주사하였다. 혈당 수준은 미정맥에서 채혈을 하여 글루코미터 (GlucoDr Plus, Allmedicus)를 사용해 측정하였다. 인슐린 측정을 위해, 혈액을 당 주사 후 0, 15, 및 30분에 헤파린 튜브에 채혈하였고, 1500g 로 10 분간 4°C에서 원심분리 되었다. 혈장 내 인슐린 농도는 초감수성 인슐린 ELISA 키트(80-INSMSU-E01, ALPCO)를 이용해 측정되었다. 인슐린 내성 테스트(insulin tolerance test, ITT)를 위해, 마우스를 6시간동안 금식한 후, 복강 내로 Humulin R (Eli Lilly)를 주사하였다 (0.75 U/kg body weight).
ex vivo GSIS를 위해서, 마우스 췌장 소도(pancreas islet)를 콜라게나아제로 분리하였다. 먼저 췌장 소도를 37℃에서 5% CO2 조건 하에서 10% FBS (Thermo Scientific) 및 100 U/ml 페니실린-스트렙토마이신 (Thermo Scientific)을 첨가한 RPMI-1640 배지(Thermo Scientific)에서 배양하였다. 4시간 동안 배양한 후, 췌장 소도를 2.8 mM의 글루코스를 포함하는 Krebs-Ringer-HEPES (KRH) 완충액 (pH 7.4, 115 mM NaCl, 25 mM HEPES, 24 mM NaHCO3, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, and 1 mg/ml BSA) 으로 옮기고, 30분 간 배양하였다. 배양된 췌장 소도는 샘플당 10개의 취하여 12웰 비코팅 디쉬로 옮겨졌다. 기저 인슐린 분비량을 측정하기 위하여, 샘플들을 2.8mM의 글루코스를 포함하는 KRH 완충액에서 15분간 배양하고, 상층액 50 μL를 취하여 인슐린 측정에 사용하였다. 또한, 고당 자극(high glucose stimulation)을 위하여, 샘플들을 16.8mM 의 글루코스를 포함하는 KRH 완충액에서 15분간 인큐베이션하고, 상층액을 취하였다. 모든 상층액은 즉시 액체질소로 동결되어 ELISA 실험에 사용될 때까지 -80℃에서 동결 보존되었다.
3-4. 정량적 역전사 PCT(qRT-PCR)
RNA는 TRIzol (Invitrogen)을 이용해 제조사의 프로토콜에 따라 추출되었다.
총 RNA 1 μg을 High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems)으로 cDNA를 제작하는데 사용하였다. qRT-PCR은 Fast SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems)로 Viia 7 Real-time PCR System (Applied Biosystems)를 이용해 수행되었다. 유전자 발현은 delta Ct (threshold cycle) 방법을 이용하여 상대적 유전자 발현 분석에 의해 계산되었고, Actb 유전자를 내부 대조군으로 사용하였다.
통계적 분석
모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 측정되었다. 통계적인 유의성은 Student's t-test (two-tailed)로 얻었다. 통계적 분석은 SPSS version 22 (IBM Co)를 이용하여 수행되었다. 통계적 유의성의 수준은 다음과 같다:*; P < 0.05, **; P < 0.01 and ***; P < 0.001.
3-5. 결과
본 발명자들은 주산기(perinatal period)의 인간 췌장 소도에서 5-HT가 존재함을 임신 14주부터 생후 3개월까지의 면역조직화학을 통해 확인하였다 (도 5a 및 도 9a). 5-HT 염색은 주산기 동안의 내분시 세포에 제한되었으며, 그 강도는 생후 8일에 피크 값을 가졌다. 강한 5-HT 염색이 출생 당일(P0) 마우스의 베타 세포에서도 관찰되었다 (도 5b). 마우스 배아 췌장에서의 Tph1 mRNA 의 발현은 Tph2 보다 높았고, 이의 발현 패턴은 5-HT 면역염색에서의 변화와 상응하였다(도 9b). 인간의 태아 및 성인의 베타세포에서는 모두, TPH1 mRNA 발현이 TPH2 mRNA보다 높았고, TPH1 mRNA발현은 성인의 베타세포보다 태아의 베타세포에서 더 높았다. 이러한 데이터는 5-HT가 주산기 동안 인간과 설치류의 베타세포에서 모두 공통된 기능을 수행하고, 베타 세포에서 5-HT의 생산이 TPH2 보다는 TPH1 에 주로 의존하는 것일 수 있음을 암시한다.
베타 세포에서 5-HT의 생리학적인 역할을 자세히 설명하기 위하여, 본 발명자들은 베타 세포-특이적으로 파괴된 Tph1 유전자를 보유하는 마우스(Tph1 βKO) 를 제작하였다. Tph1 βKO마우스는 출생당일(P0) Tph1 mRNA 발현이 췌장에서 감소되고(도 10a), 주산기 및 임신 중 마우스의 베타 세포에서의 5-HT 생산이 면역형광 염색으로 검출불가한 수준으로 감소(도 10b) 된다는 점이 확인되었다. 5-HT 생산의 손실은, PDX1 및 NKX6.1 이 정상적으로 발현된다는 점에서, 베타 세포의 분화에는 영향을 미치지 않는다는 점이 입증되었다. (도 10c)
흥미롭게도, Tph1 βKO 마우스에서 β 세포 매스(β cell mass )는 현저하게 감소한 반면, 췌장의 크기는 변화가 없었다(도 5c, 5d, 및 도 10d Fig). pHH3(phospho-Histone H3 )와 TUNEL에 대한 면역형광 염색은 β 세포 증식이 β 세포의 사멸 증가 없이 Tph1 βKO 마우스에서 75%까지 감소되었음을 밝혀내었다 (도 5e 및 도 10e). 또한, cyclin family members (i.e. D1, D2, D3, A2, and B1)의 mRNA 발현은 출생 당일(P0) Tph1 βKO 마우스의 췌장에서 감소되었다(도 5f). 이러한 데이터는 5-HT가 주산기 β 세포(perinatal β cell)의 증식을 촉진함으로써 β 세포 매스를 증가시킨다는 점을 암시한다.
본 발명자들은 나아가 성체기 Tph1 βKO 마우스에서 Tph1 βKO의 장기적 효과를 확인하기 위하여, 9주령의 Tph1 βKO 마우스의 대사적 표현형을 평가하였다. Tph1 βKO 마우스는 정상적으로 성장하였고, 정상적인 인슐린 감수성을 나타내었다(도 11a, 11b). 그러나 당 내성은 손상되었다(도 6a).
금식 및 당 투여 15분 후의 혈장 내 인슐린 수준은 낮았고, Tph1 βKO 췌장 소도의 인슐린 분비 능력은 손상되었다(도 6b, 6c).
성체 Tph1 βKO 마우스에서 β 세포 매스(β cell mass)는 β 세포 증식에도 불구하고 대조군 마우스의 절반 이상(40%까지) 감소되었으나, 췌장의 크기는 대조군 마우스와 유사하였다 (도 6d, 6e, 6f). 따라서, 주산기 β 세포 증식에 대한 5-HT 자극은 완전한 성체 β 세포 매스 발달 및 당뇨의 발병을 예방하는데 필수적임을 알 수 있었다.
설치류의 14종의 HTR 중에서, 6개의 HTR이 췌장 소도에서 발현된다. 주산기의 β 증식에 관여하는 다운스트림 HTR을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 6종의 HTR (HTR1B, 1D, 2A, 2B, 3A, and 3B)의 발현을 배아 췌장에서 확인하였다.
Htr1b, Htr2b 및 Htr3a mRNA의 발현은 배아가 발달하면서 증가되는 추세를 나타내었다 (도 7a). 이러한 HTR 중에서, HTR3 는 인슐린 분비에는 관여하였으나, β 세포의 증식에는 관여하지 않았고, HTR1B 또는 HTR1D의 상실은 P0에서 β 세포 증식을 감소시키지 않았다(도 12). 이와 대조적으로, β 세포 매스(β cell mass)는 β 세포-특이적으로 Htr2b가 파괴된 마우스(Htr2b βKO)에서 P0에서 55% 까지 감소되었으며, 총 췌장 중량은 변하지 않고 유지되었다 (도 7b, 7c, 7d). β 세포 매스의 감소는 Htr2b βKO 마우스에서 β 세포 증식의 감소와 연관되어 있으며, β 세포 아폽토시스의 증가는 관찰되지 않았다 (도 7e 및 도 10e).
성체기(adulthood)에서, Htr2b βKO 마우스들은 체중과 인슐린 감수성은 정상이었음에도 당 내성이 있었다(도 7f and 도 13a, 13b). 금식 및 당 급이 15분 후 혈장 내 인슐린 수준은 Htr2b βKO 마우스에서 더 낮았다 (도 7g). 그러나 분리된 Htr2b βKO 췌장 소도로부터의 당-자극 인슐린 분비는 유의적으로 손상되지 않았다 (도 7h). 대신, β 세포 매스(β cell mass)은 성체 Htr2b βKO 마우스에서 대조군 마우스의 40% 수준까지 지속적으로 감소되었다 (도 7i). 췌장의 크기는 대조군과 유사하였고, β 세포 마커들은 Htr2b βKO 마우스에서 적절하게 발현되었다 (도 7j 및 도 13c). 따라서, Htr2b βKO 마우스는 Tph1 βKO 마우스의 표현형과 매우 유사(phenocopied) 하였다. 이러한 데이터는 5-HT가 주산기(perinatal period)에 HTR2B를 통하여 β 세포 증식을 자극하고 성체 β 세포 매스(adult β cell mass)을 결정한다는 결론을 뒷받침한다.
고지방 식이(High fat diet, HFD)는 β 세포에서 5-HT 생산을 유도하지는 않지만, 증가된 인슐린 요구를 보상하기 위하여 β 세포 증식을 유도하는 것으로 알려져 있다. 5-HT가 β 세포로 하여금 대사 스트레스를 견디기 위하여 필요한지 여부를 추가적으로 평가하기 위하여, 마우스를 12주령부터 8주간 HFD를 먹였다. Tph1 mRNA 도, 5-HT 생산도 모두 HFD에 의해 β 세포에서 유도되지 않았다.
Tph1 βKO 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 유사한 체중 증가와 인슐린 감수성의 악화를 나타내었다. 당 내성은 대조군 마우스보다 HFD를 먹인 Tph1 βKO 마우스에서 더 급격하게 악화된 반면에, β 세포증식은 비슷하게 나타났다 (도 8a, 8b). 이러한 데이터는 5-HT가 대사 스트레스에 대응하여 β 세포 증식을 유도하는데 관여하지 않는다는 점을 암시한다. 이러한 결론은 인슐린 수용체 길항제인 S961에 의해 유도된 인슐린 저항성을 가진 마우스에서 β 세포 증식을 측정함으로써 추가적으로 뒷받침되었다 (도 8c). 따라서 5-HT는 β 세포 증식을 대사 스트레스에 반응하여서가 아니라, 주산기(perinatal period) 동안의 보다 생리학적인 자극에 반응하여 β 세포의 증식을 자극한다.
실시예 4. 변형된 STAM (Stelic Animal Model) 마우스의 제작
4-1. 변형된 STAM 마우스의 제작 및 사육 관리
본 발명자들은 췌장의 베타 세포 파괴 또는 감소에 따른 대사질환의 표현형을 추가로 확인하고자, 변형된 STAM(Stelic Animal model)을 제작하였다. 간략히 설명하면, C57BL6/J 수컷 7주령 마우스에 streptozotocin (STZ, Sigma, S0130)을 복강내 투여로 40 mg/kg(체중) 의 용량으로 5일간 매일 투여하였고, STZ (streptozotocin)을 투여한 후 8주령차부터 마우스가 62주령이 될 때까지 고지방 식이를 54주간 급여하였다. 대조군으로는 STZ를 투여하지 않은 7주령의 마우스를 사용하였다. 또한, 고지방 식이를 급여하기 시작하면서 6주마다(즉, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 및 62주령) 마우스를 희생하여 이하의 시험을 수행하였다(도 14).
4-2. 췌장 베타 세포의 면역조직화학
본 발명자들은 STZ 투여가 췌장 베타 세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 췌장 베타 세포의 면역염색을 수행하였다. 췌장 베타 세포의 면역 염색을 위해서는, 췌장 조직을 실시예 1-5에 기재된 것과 같이 전처리한 후, 1차 항체로 항-인슐린 항체(A0564, Dako)를 사용하였고, 2차 항체로 항-돼지 IgG(희석 비율; 제조사)를 사용하였다. 면역조직화학 염색 결과는 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, STZ (streptozotocin) 투여 후 STZ를 투여하지 않은 마우스보다 염색되는 베타세포 양이 감소되는 것이 확인되었다. 따라서, 상기 변형된 STAM 마우스는 STZ의 투여로 인해 췌장 베타 세포가 파괴됨을 확인할 수 있었다.
4-3. 절식 후 혈당 측정 결과
본 발명자들은 STZ의 투여가 변형된 STAM 마우스의 혈당에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 4-1에서 제작된 변형된 STAM 마우스를 희생하기 전 6시간 동안 금식시키고, 미정맥에서 채혈을 하여 글루코미터 (GlucoDr Plus, Allmedicus)를 사용해 혈당을 측정하였다. 결과는 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 상기 변형된 STAM 마우스는 14주령부터 대조군 마우스의 혈당과 비교하여 2배 이상 증가하여 당뇨병의 표현형을 나타내었다. 상기 4-2의 결과를 고려하였을 때, 변형된 STAM 마우스는 췌장 베타 세포의 파괴로 인해 혈당이 상승되는 것으로 추정된다.
4-4. 간조직의 H&E 염색 결과
본 발명자들은 STZ 투여 및 고지방 식이를 급여한 변형된 STAM 마우스의 간조직의 변화를 확인하기 위하여, 상기 4-1에서 제작된 변형된 STAM 마우스를 각 주령별(7, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 및 44주령)로 희생하여 간조직을 채취한 후 H&E 염색을 수행하였다. 결과는 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 변형된 STAM 마우스의 간조직은 간세포의 간세포 내 지질 입자의 크기 및 수가 증가하여 지방간이 유도되었을 뿐만 아니라, 간세포의 풍선화(ballooning), 섬유화가 확인되어 간염증 소견이 확인되었으며, 간 경변의 증상이 심하게 나타남을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명자들은 상기 변형된 STAM 마우스를 이용하여 얻은 4-2 및 4-3의 결과로부터, 췌장 베타 세포가 파괴되면 지방간 및 간경변이 발생함을 확인하였다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology
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Claims (8)
- Htr2b floxed 마우스와 췌장 β세포-특이적으로 Cre-recombinase를 발현하는 Insulin-Cre 마우스를 교배시켜 제조한 Htr2b 유전자의 엑손 2가 발생단계에서 췌장 β세포 특이적으로 넉아웃(knock-out)된 Htr2b fl/fl x Insulin-Cre +/- 형질전환 마우스.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 형질전환 마우스는 대사질환의 모델로 사용되는 것인, 형질전환 마우스.
- 다음 단계를 포함하는, 췌장 β세포 특이적으로 Htr2b 유전자가 넉아웃 된 마우스의 제조방법:
(a) Htr2b의 엑손 2 양 옆에 loxp site를 삽입한 Htr2b floxed 마우스 및 췌장 β세포 특이적으로 Cre-recombinase를 발현하는 Insulin-Cre 마우스를 교배하는 단계; 및
(b) 상기 교배 결과 얻어진 다음 세대 마우스를 얻는 단계.
- 삭제
- 다음 단계를 포함하는 대사질환 치료제의 스크리닝 방법:
(a) 제1항 및 제5항 중 어느 한 항의 형질전환 마우스에 대사질환 치료제 후보물질을 투여하는 단계;
(b) 상기 후보물질을 투여한 형질전환 마우스를 후보물질을 투여하지 않은 대조군 마우스와 비교하여 질환에 대한 지표를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 지표가 후보물질을 투여한 형질전환 마우스에서 대조군 마우스에 비해 개선되는 경우, 후보물질을 대사질환의 치료제로 판정하는 단계.
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Patent Citations (1)
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Also Published As
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