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KR102370727B1 - 감마-ｃ-사이토카인의 활성을 저해하는 합성 펩타이드 및 이를 이용한 키트 - Google Patents

감마-ｃ-사이토카인의 활성을 저해하는 합성 펩타이드 및 이를 이용한 키트 Download PDF

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KR102370727B1
KR102370727B1 KR1020187013183A KR20187013183A KR102370727B1 KR 102370727 B1 KR102370727 B1 KR 102370727B1 KR 1020187013183 A KR1020187013183 A KR 1020187013183A KR 20187013183 A KR20187013183 A KR 20187013183A KR 102370727 B1 KR102370727 B1 KR 102370727B1
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Abstract

본 발명은 중요한 인간 질병, 예컨대 백혈병, 자가면역 질병, 콜라겐 질병, 당뇨병, 피부병, 퇴행성 신경 질환 및 이식편대숙주병(GvHD; graft-versus-host disease)과 연관이 있는 γc-패밀리 사이토카인의 펩타이드 길항제에 관한 것이다. 따라서, γc-사이토카인 활성의 저해제는 중요한 치료적 및 미용적 제제일 뿐만 아니라 연구 툴이다. γc-사이토카인 활성을 저해하기 위한 전형적인 접근법은 각각의 개별 γc-사이토카인 패밀리 구성원/ 수용체 하위단위에 대한 중화 항체를 생성하는 것을 포함한다. 그러나, 성공은 제한적이었으며, 종종 다수의 γc-사이토카인 패밀리 구성원들이 공동 협력하여 질병 상태를 야기하기도 한다. 각각의 인자에 대해 생성된 중화 항체들의 병용은 비실용적이고, 부작용 면역 반응(adverse immune reaction)을 야기할 위험이 크다. 본 발명은 γc-사이토카인 활성을 저해하기 위해 공통(consensus) γc-하위단위 결합 부위를 기반으로 한 펩타이드 길항제를 이용함으로써 이들 단점을 극복한다. 이러한 접근법은 길항제 설계에 융통성을 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 펩타이드는 다수의 γc-사이토카인 패밀리 구성원들의 활성을 저해하는 사이뮬-블락(Simul-Block) 활성을 나타낸다.

Description

감마-Ｃ-사이토카인 활성의 조정
관련 출원에 대한 우선권 및 교차 참조
본 출원은 2015년 10월 9일에 출원된 미국 가출원 62/239,761의 이득을 주장하며, 상기 문헌은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
전자 포맷의 서열 목록
본 출원은 EFS-웹을 통해 ASCII 텍스트 파일 형태의 서열 목록과 함께 출원되어 있다. 서열 목록은 2016년 10월 6일에 제작되어 마지막으로 저장되었으며, BION006WOSEQLIST.txt의 명칭으로 제공되고, 크기는 5,981 바이트이다. 전자 포맷의 서열 목록 내의 정보는 35 U.S.C. § 1.52(e)에 따라 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
기술분야
일부 실시형태는 주로 상피 세포, 기질(stromal) 세포 및 면역 세포에 의해 생성되고 다양한 림프구들의 정상적인 활성화 및 병리학적 활성화를 조절하는 포유류 사이토카인 그룹인 γc-패밀리 사이토카인의 펩타이드 길항제에 관한 것이다. 일부 실시형태는 또한, 소정의 인간 질병의 치료를 위한 이러한 펩타이드의 치료적 용도에 관한 것이다. 본 실시형태는 또한, 이러한 펩타이드의 약용 화장품 적용에 관한 것이다. 투여, 제조 및 상용화 방법뿐만 아니라 펩타이드의 표적 질병, 약용 화장품 적용에 관한 설명이 개시되어 있다.
사이토카인은 다양한 세포 기능들, 예컨대 성장, 기능적 분화, 및 프로그래밍된 세포 사멸(세포 자멸사)의 촉진 또는 예방을 매개해는 다양한 용해성 인자들의 그룹이다. 호르몬과는 달리, 사이토카인은 특수화된 선상 조직(glandular tissue)에 의해 생성되지 않으며, 광범위하게 다양한 유형의 세포들, 예컨대 상피 세포, 기질 세포 또는 면역 세포에 의해 생성될 수 있다.
γc-패밀리 사이토카인은 주로 상피 세포, 기질 세포 및 면역 세포에 의해 생성되고 다양한 림프구들의 정상적인 활성화 및 병리학적 활성화를 조절하는 포유류 사이토카인 그룹이다. 이들 사이토카인은 흉선에서의 T 세포의 초기 발생(early development)뿐만 아니라 말초(periphery)에서의 이들 T 세포의 항상성에 결정적으로 필요하다.
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개요
지금까지 100개가 넘는 사이토카인이 식별(identify)되었으며, 원시 유전자(primordial gene) 풀(pool)로부터 유전자 중복에 의해 개발된 것으로 여겨진다(문헌[Bazan, J.F. 1990, Immunol. Today 11:350 ~ 354] 참조). 이러한 관점을 지지하여, 사이토카인 그룹은 이들의 다중-하위단위 수용체 시스템 내 구성성분과 공유하는 것이 보편적이다. T 세포 내의 가장 잘-문서화된 공유 사이토카인 하위단위는 공통(common) γ 하위단위(γc-하위단위)이다.
γc-하위단위는 6개의 공지된 사이토카인(인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨-15(IL-15) 및 인터루킨-21(IL-21)로서, "γc-사이토카인" 또는 " γc-패밀리 사이토카인"으로 총칭함)에 의해 공유되며, 이들 모든 사이토카인들에 대한 세포 활성화 신호의 전달에 필수 불가결한 역할을 한다. 부가적으로 각각의 γc 사이토카인에 대해, 1개 또는 2개의 전용(private) 사이토카인-특이적 수용체 하위단위들이 존재하며, 이들 하위단위는 γc-하위단위와 복합체를 형성한 경우 완전히 기능적인 수용체를 초래한다(문헌[Rochman et al., 2009, Nat Rev Immunol. 9: 480 ~ 90] 참조).
γc-패밀리 사이토카인은, 주로 상피 세포, 기질 세포 및 면역 세포에 의해 생성되고 다양한 림프구들의 정상적인 활성화 및 병리학적 활성화를 조절하는 포유류 사이토카인 그룹이다. 이들 사이토카인은 흉선에서의 T 세포의 초기 발생뿐만 아니라 말초에서의 이들 T 세포의 항상성에 결정적으로 필요하다. 예를 들어, γc-하위단위의 부재 시, T, B 및 NK 세포가 마우스에서 발달하지 않는다(문헌[Sugamura et al., 1996, Annu. Rev. Immunol.14:179 ~ 205] 참조).
γc-사이토카인은 면역계를 구성하는 림프구양 세포(lymphoid cell), 특히 T 세포, B 세포 및 NK 세포의 발달에 중요한 역할을 한다. 나아가, γc-사이토카인은 다양한 인간 질병에 관여해 왔다. 따라서, γc-사이토카인 활성을 저해하는 인자는 림프구의 서브셋(subset)의 발달 메커니즘을 설명하고 면역 장애 및 γc-사이토카인-매개 질병을 치료하는 데 유용한 툴을 제공할 것이다.
마우스에서 γc-하위단위를 인코딩하는 유전자의 생식선 결실(Germ line depletion) 또는 인간에서 γc-하위단위의 돌연변이는 NK 세포, T 세포 및 B 세포의 정상적인 외양 또는 기능을 방해함으로써 중증 복합형 면역 부전증(SCID; severe combined immunodeficiency)을 유발하는 것으로 공지되어 있다. γc-사이토카인, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21의 신호 전달에 있어서 γc-하위단위의 중요성은, γc-사이토카인에 대한 이들 마우스 및 인간 환자 유래 림프구의 반응을 설명하고 있는 연구에 나타나 있다(문헌[Sugamura et al., 1995 Adv. Immunol. 59:225~277]에서 리뷰되어 있음). 이는, γc-하위단위와 γc-사이토카인 사이의 상호작용의 방해가 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 의한 세포내 신호전달 사건을 효율적으로 차단할 것을 나타낸다. 따라서, 본 실시형태에 따른 길항제 펩타이드는, γc-사이토카인 패밀리 구성원의 조절 실패(misregulation)에 의해 매개되는 질병을 앓고 있는 인간에서 병원성(pathogenic) 변화를 효과적으로 차단할 것으로 예상된다.
개개의 γc-사이토카인의 활성을 조정하기 위한 항체-매개 접근법에 대한 대안으로서, 출원인들은 다수의 γc-사이토카인들의 활성을 억제하는 신규 저분자량 화합물을 창안하였으며, 이러한 화합물은 본원에서 "사이뮬-블락(Simul-Block)"으로 지칭된다. 화학물질 및 펩타이드를 둘 다 포함하는 이들 저분자량 화합물은 항체보다 면역원성이 더 낮다. 이러한 특성들에 의해 사이뮬-블락은, 임상 개입에서 γc-사이토카인 활성을 매개하는 데 보다 효율적인 전략으로서 구별된다.
γc-사이토카인과 연관된 병리학적 현상
최근의 연구는, γc-사이토카인의 발현 조절 장애(dysregulation) 및 기능 장애가 광범위하게 다양한 인간 면역 질병 및 조혈(hematopoietic) 질병을 초래할 수 있을 것이라고 언급하였다.
IL-2
IL-2가 역사적으로 원형(prototype) T 세포 성장 인자로 여겨졌지만, IL-2 발현이 결여된 넉아웃 마우스의 발생은, IL-2가 생체내에서 종래의 T 세포의 성장 또는 발달에 중요하지 않음을 밝혀냈다. 그러나, IL-2의 과발현은 T-세포의 서브셋인 조절 T 세포(T-reg)의 우선적인 증식(preferential expansion)을 초래한다(문헌[Antony et al., 2006, J. Immunol. 176:5255 ~ 66] 참조). T-reg는 다른 세포의 면역 반응을 억제하고, 따라서 말초 관용(peripheral tolerance)을 유지하는 작용을 한다(문헌[Sakaguchi et al., 2008, Cell 133:775 ~ 87]에서 리뷰되어 있음). 말초 관용의 와해(breakdown)는 인간에서 자가면역 질병을 야기하는 것으로 생각된다.
따라서, T-reg의 면역억제 기능은 자가면역 질병의 발병을 예방하는 것으로 생각된다(문헌[Sakaguchi et al., 2008, Cell 　133:775 ~ 87] 참조). T-reg는 또한 암에 관여해 왔으며, 이때 고형 종양 및 혈액 악성 종양이 증가된 T-reg 수와 연관이 있어 왔다(문헌[De Rezende et al., 2010, Arch. Immunol. Ther. Exp. 58:179 ~ 190] 참조).
IL-4
IL-4는 T 헬퍼 세포가 Th2(T-헬퍼 유형 2) 서브셋으로 분화하는 데 관여하는 풍부하지 않은(non-redundant) 사이토카인으로서, Th2(T-헬퍼 유형 2) 서브셋은 미성숙 B 세포가 IgE-생성 혈장 세포로 분화하는 것을 촉진한다. IgE 수준은 알레르기 천식에서 상승된다. 따라서, IL-4는 알레르기 천식의 발병에 관여한다. IL-4를 표적으로 하는 항체는 알레르기 천식을 치료하거나 심지어 알레르기 천식의 발병을 예방하는 데 사용될 수 있다(문헌[Le Buanec et al., 2007, Vaccine 25:7206 ~ 16] 참조).
IL-7
IL-7은 B 세포 발생 및 흉선에서의 T 세포의 초기 발생에 필수적이다. 마우스에서, IL-7의 비정상적인 발현은 T-세포-연관 백혈병을 야기한다(문헌[Fisher et al., 1993, Leukemia 2:S66 ~ 68] 참조). 그러나, 인간에서는 IL-7의 조절 실패가 T-세포-연관 백혈병을 야기하는 것으로 보이지 않는다. 인간에서는, IL-7이 단독으로 또는 또다른 γc-사이토카인 패밀리 구성원인 IL-15과 조합하여 상향 조절되는 것이 대형 과립 림프구(LGL; Large Granular Lymphocyte) 백혈병과 관련이 있다.
IL-9
IL-9의 역할은 다른 γc-사이토카인 패밀리 구성원들과 비교하여 여전히 덜 특징화되어 있다. IL-9 유전자가 결손된 마우스는 정상적으로 보이고, 림프구양 및 조혈 구획에서 임의의 서브셋의 세포가 결여되어 있지 않다. 그러나, 최근의 연구는 Th17(인터루킨-17에 의해 유도되는 T-헬퍼) 세포의 발생에서 IL-9의 생체내 역할을 보여준다(문헌[Littman et al., 2010, Cell 140(6):845 ~ 58; 및 Nowak et al., 2009, J. Exp. Med. 206: 1653 ~ 60] 참조).
IL-15
IL-15는 NK 세포, NK-T 세포, 상피내 림프구(IEL)의 일부 서브셋, γδ-T 세포 및 기억-표현형 CD8 T-세포의 발생에 결정적으로 관여한다(문헌[Waldmann, 2007, J. Clin. Immunol. 27:1 ~ 18; 및 Tagaya et al., 1996, EMBO J. 15:4928 ~ 39] 참조). 마우스에서 IL-15의 과발현은 NK-T 세포 및 CD8 세포 유형 T 세포 백혈병의 발병을 초래한다(문헌[Fehniger et al., 2001, J. Exp. Med. 193:219 ~ 31; Sato et al. 2011 Blood in press] 참조). 이들 실험적으로 유도된 백혈병은 인간에서 LGL(대형 과립 림프구) 백혈병과 유사하게 보이는데, 두 경우 모두에서 백혈구 세포가 CD8 항원을 발현하기 때문이다.
또한, IL-15-매개 자가분비 메커니즘이 CD4 T 림프구의 백혈병성 변환(leukemic transformation)에 관여할 수 있는 것으로 의심된다(문헌[Azimi et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95:2452-7; Azimi et al., 1999, J. Immunol. 163:4064-72; Azimi et al., 2000, AIDS Res. Hum. Retroviruses 16:1717-22; 및 Azimi et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:14559-64] 참조). 예를 들어, 인간에서 성인 T 세포 백혈병을 야기하는 CD4-향성(tropic) HTLV-I은 IL-15 및 IL-15Rα의 생성을 통해 바이러스-변환(virus-transformed) T 세포의 자가분비 성장을 유도한다(문헌[Azimi et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. 95:2452-7).
백혈병성 변환 외에도, 최근의 연구는 자가면역 질병인 소아 지방변증(CD) 의 병리학적 발병에 IL-15를 연관시킨다. IL-15는 세포용해 효소(즉, 그랜자임 및 퍼포린) 뿐만 아니라 인터페론-γ의 발현을 유도함으로써 NK, CD8 및 장 상피내 림프구(IEL) 세포로부터 림포카인-활성화된 살해(LAK; lymphokine-activated killer) 세포로의 분화를 자극하는 것으로 공지되어 있다. 소아 지방변증(본원에서는 CD로 지칭됨)은 특이적인 HLA-DQ 대립 유전자(allele)를 발현하는 개체에서 글루텐-함유 식품의 섭취에 의해 유발되는 면역-매개 장질환이다.
이 질병의 유병률은 서양인 집단에서 1%이다. 현재로서 유일한 CD 치료법은 환자의 식이요법에서 글루텐을 완전히 배제하는 것이다. CD의 발병은 주로 장 점막에의 광범위한 손상에 의해 야기되고, 이러한 손상은 장 고유층(intestinal lamina propria)에 침윤된 활성화된 CD8 T 세포에 의해 야기된다. 이들 CD8 T 세포는 IL-15를 수반하는 메커니즘을 통해 활성화되는 것으로 보인다. 최근의 한 공개문헌에서, 마우스에서 장세포에 의한 IL-15의 이소성(ectopic) 과발현이 CD 환자에서의 병변과 근접하게 유사한 장질환의 발병을 초래한다고 언급되었다. IL-15 활성의 중화는 병리학적 변화를 급격하게 저하시켰다. 따라서, IL-15에 의한 CD8 T 세포의 활성화를 차단하는 개입은 종래의 글루텐-무함유 식이요법에 대안적인 CD 관리 전략을 제공하는 것으로 보인다.
IL-21
IL-21은γc-패밀리 중 가장 최근에 발견된 구성원이다. 다른 패밀리 구성원들과는 달리, IL-21은 강력한 성장-촉진 효과를 갖고 있는 것으로 보이지 않는다. 그 대신, IL-21은 세포 증식을 조절하는 인자라기보다는 분화 인자로서 더 작용하는 것으로 생각된다(문헌[Tagaya, 2010, J. Leuk. Biol. 87:13 ~ 15).
γc-사이토카인-매개 장애의 치료를 위한 현재의 전략
γc-사이토카인이 수많은 인간 질병에 관여하는 것으로 생각되기 때문에, γc-사이토카인 패밀리 활성을 저해함으로써 γc-사이토카인-관여 질병을 치료하려는 몇몇 방법들이 제안되어 있다. 이들 방법은, 생체내에서 표적화된 사이토카인의 활성을 중화시키기 위해 사이토카인-특이적 모노클로날 항체의 사용; 사이토카인 활성을 선택적으로 저해하기 위해 전용 사이토카인-특이적 수용체 하위단위(공유된 γc-하위단위가 아닌 하위단위)를 표적화하는 모노클로날 항체의 사용; 및 다운스트림 세포내 사이토카인 신호 전달 경로를 차단하는 화학적 저해제의 사용을 포함한다.
사이토카인-특이적 항체가 종종 치료법의 설계 시 제1 선택사항이긴 하지만, 수용체 구성성분을 공유하는 사이토카인들은 중복되는(overlapping) 기능을 나타내고(문헌[Paul, W.E., 1989, Cell 57:521 ~ 24), 1개 초과의 사이토카인들이 공동 협력하여 질병을 야기할 수 있다(하기 기재된 실시예 참조). 따라서, 단일 사이토카인의 중화를 수반하는 접근법은 사이토카인-관여 인간 질병의 치료에 효과적이지 않을 수 있다.
공유된 수용체 구성성분을 인지하는 항체를 통해 다수의 사이토카인들의 기능을 저해하는 치료를 설계하기 위한 전략이 또한 제안되어 왔다. 그러나, 사이토카인 수용체 시스템의 다중-하위단위 성질 및 단일 사이토카인에 대한 기능성 수용체가 상이한 배치를 취할 수 있다는 사실은 이러한 접근법을 어렵게 만든다.
예를 들어, 기능성 IL-15 수용체는 IL-15Rβ/γc 또는 IL-15Rα/β/γc일 수 있다(문헌[Dubois et al., 2002, Immunity 17:537 ~ 47] 참조). IL-15Rβ 수용체에 대한 항체(TMβ1)가 IL-15 기능의 효율적인 저해제이긴 하지만, IL-15Rα 분자가 수용체 복합체에 부재할 때만이다(문헌[Tanaka et al., 1991, J. Immunol. 147:2222 ~ 28] 참조). 따라서, 공유된 하위단위 또는 전용 하위단위에 대한 모노클로날 항-수용체 항체의 효능은 정황-의존적(context-dependent)일 수 있고, 생체내에서 예측 불가능하다.
질병의 발병과 연관이 있는 생물학적 활성 인자 또는 수용체에 대한 모노클로날 항체의 임상적 사용이 구축된 관행이라 하더라도, 성공적인 결과에 대한 언급은 몇 가지 경우밖에 없다. 더욱이, 임상적으로-적합한 모노클로날 항체 치료의 구축은 장기간의 어려운 과정이며, 중화 항체의 성공적인 생성은 대체로 운에 달려 있다. 예를 들어, γc-패밀리 사이토카인에 의한 신호전달의 매개에 있어서 γc-하위단위의 결정적인 중요성으로 인해, γc-하위단위에 대한 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 생성하려는 노력들이 많이 이루어져 왔으며, 마우스 및 인간에서 γc-하위단위를 중화시키는 상업적인 항체들이 많이 존재한다. 그러나, 이상하게도, 이들 항-γc-하위단위 항체 중 어느 것도 γc-사이토카인의 기능을 차단하지 못한다.
모노클로날 항체의 치료적 용도와 관련된 또 다른 문제점은, 모노클로날 항체는 통상 설치류에 인간 단백질을 면역화함으로써 생성되어, 생성된 항체가 외래 단백질이고 따라서 고도로 면역원성이라는 점이다. 이러한 문제점을 피하기 위해, 항체 분자가 인간 면역글로불린으로서 인지되도록 모노클로날 항체의 아미노산 서열이 분자적으로 변형되지만(소위 인간화 과정), 이러한 과정에는 시간 및 비용이 요구된다.
다수의 γc-사이토카인들의 저해를 위한 기존의 대안적인 예로서 JAK3의 표적화
γc-사이토카인과 γc-하위단위 사이의 상호작용은 야누스 키나제 3(Jak3)로 지칭되는 세포내 단백질 트롯인 키나제의 활성화를 초래한다. Jak3는 다시 STAT5 및 PI3 키나제를 포함하는 다수의 신호전달 분자들을 인산화시킨다. γc-하위단위와 Jak3의 상호작용은 매우 특이적이다. 사실상, 신호 전달을 위해 Jak3를 동원하는 다른 수용체 분자는 존재하지 않는다(문헌[O'Shea, 2004, Ann. Rheum. Dis. 63:(suppl. II):ii67-7] 참조). 따라서, γc-하위단위를 통한 사이토카인 신호전달의 저해는 Jak3 키나제의 활성을 저해함으로써 달성될 수 있다. 이에, Jak3의 키나제 활성을 표적화하는 다수의 화학적 저해제들이 시장에 도입되어 왔다(문헌[Pesu et al., 2008, Immunol. Rev. 223:132 ~ 142] 참조). 이러한 일례는 CP690,550이다.
이들 단백질 키나제 저해제의 주요 단점은 Jak3 키나제에 대한 특이성의 결여이다. 이들 약물은, 많은 단백질 키나제들에 보편적인 생화학적 반응인 Jak3 키나제에의 ATP(아데노신-트리포스페이트) 분자의 결합을 방해하고, 따라서 다양한 조직들에서 정상 세포의 웰빙(well-being)에 결정적으로 필요한, Jak3 키나제와 무관한 다수의 세포내 단백질 키나제들의 작용을 차단하는 경향이 있다. 따라서, γc-하위단위를 통한 신호전달의 보다 특이적인 저해제가 요망된다.
따라서, γc-사이토카인-관여 질병을 치료하기 위한 대안적인 전략이 상당히 요망되고 있다.
일부 실시형태에서, 합성(composite) 펩타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 합성 펩타이드는 적어도 2개의 인터루킨(IL) 단백질 감마-c-박스(box) D-헬릭스(helix) 영역의 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 합성 펩타이드는 아미노산 서열 P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(서열 번호: 3)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 청구항 제1항의 합성 펩타이드가 제공되며, 여기서 합성 펩타이드는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 γc-사이토카인의 활성을 저해한다. 일부 실시형태에서, 합성 펩타이드는 적어도 IL-15 및 IL-21의 활성을 저해한다.
일부 실시형태에서, 합성 펩타이드는 신호 펩타이드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 합성 펩타이드는 추가로, 이러한 합성 펩타이드의 N-말단, C-말단 또는 측 잔기(side residue)에서 하나 이상의 부가적인 모이어티에 컨쥬게이션(conjugation)된다. 합성 펩타이드의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 부가적인 모이어티는 소 혈청 알부민(BSA), 알부민, 키홀드 림펫 혈색소(KLH; Keyhold Limpet Hemocyanin), IgG의 Fc 영역, 스캐폴드(scaffold)로서 작용하는 생물학적 단백질, 세포-특이적 항원에 대한 항체, 수용체, 리간드, 금속 이온 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 합성 펩타이드는 서열 번호: 3과 적어도 90%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열로 구성된다. 일부 실시형태에서, 합성 펩타이드는 서열 번호: 3과 적어도 95%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열로 구성된다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 펩타이드 컨쥬게이트 또는 이의 유도체, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 이들의 조합을 포함하며, 여기서 펩타이드 컨쥬게이트 또는 이의 유도체는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 γc-사이토카인의 활성을 조정하고, 펩타이드 컨쥬게이트는 아미노산 서열 P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(서열 번호: 3)를 포함한다.
약제학적 조성물의 일부 실시형태에서, 펩타이드 컨쥬게이트 또는 이의 유도체는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 γc-사이토카인의 활성을 저해한다.
약제학적 조성물의 일부 실시형태에서, 펩타이드 컨쥬게이트 또는 이의 유도체는 이의 N-말단, C-말단 또는 측 잔기에 부가적인 컨쥬게이트를 추가로 포함한다. 약제학적 조성물의 일부 실시형태에서, 펩타이드 컨쥬게이트 또는 이의 유도체는 신호 펩타이드를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 펩타이드 컨쥬게이트 또는 이의 유도체의 구조를 안정화시키고 이의 생물학적 활성을 개선하는 단백질을 추가로 포함하며, 이러한 단백질은 소 혈청 알부민(BSA), 알부민, 면역글로불린 G(IgG)의 Fc 영역, 스캐폴드로서 작용하는 생물학적 단백질, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
약제학적 조성물의 일부 실시형태에서, 이의 유도체는 서열 번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 공유하는 펩타이드 서열을 포함한다. 약제학적 조성물의 일부 실시형태에서, 이의 유도체는 서열 번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 공유하는 펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 2개 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 의한 신호전달의 차단 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 세포를 본원에 제공된 합성 펩타이드 및/또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, γc-사이토카인이 γc 하위단위(subunit)에 결합하는 것을 저해하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 세포의 γc 하위단위를 본원에 제공된 합성 펩타이드 및/또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, γc-사이토카인-매개 질병의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 본원에 제공된 합성 펩타이드 및/또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 γc-사이토카인-매개 질병은 CD4-백혈병, CD8-백혈병, LGL-백혈병, 전신 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosis), 쇼그렌 증후군(Sjφegren's syndrome), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 소아 지방변증(Celiac disease), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 류마티스 관절염, 당뇨병, 건선, 다발성 경화증, 포도막염(uveitis), 눈의 염증(inflammation of the eye) 및 이식편대숙주병(GvHD; graft-versus-host disease)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, HTLV-1-연관 골수병(HAM; HTLV-1-associated myelopathy)/열대성 강직 하반신마비(TSP; tropical spastic paraparesis)-연관 질병의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 본원에 제공된 합성 펩타이드 및/또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 HAM/TSP-연관 질병은 성인 T-세포 백혈병(ATL), HTLV-연관 골수병/열대성 강직 하반신마비(HAM/TSP), 및 HTLV와 연관된 다른 비-신생물성 염증 질병, 예컨대 포도막염(HU), 관절증, 폐병증, 피부염, 외분비병증(exocrinopathy) 및 근염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 염증성 호흡기 질병(inflammatory respiratory disease)의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 본원에 제공된 합성 펩타이드 및/또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 염증성 호흡기 질병은 천식, 부비동염, 건초열, 기관지염, 만성 폐색성 폐질환(COPD; chronic obstructive pulmonary disease), 알레르기성 비염, 급성 및 만성 이염, 및 폐 섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 미용 질환(cosmetic condition)의 치료 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 본원에 제공된 합성 펩타이드 및/또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 피험자에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 미용 질병(cosmetic disease)은 여드름, 탈모, 일광 화상, 손발톱 유지 및 노화의 출현으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 환자에서의 질환 치료용 약제학적 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 펩타이드 컨쥬게이트 또는 이의 유도체, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 이들의 조합을 포함하며, 여기서 펩타이드 컨쥬게이트 또는 이의 유도체는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 γc-사이토카인의 활성을 조정하고, 펩타이드 컨쥬게이트는 아미노산 서열 P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(서열 번호: 3)를 포함한다.
약제학적 조성물의 일부 실시형태에서, 이의 유도체는 서열 번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 공유하는 펩타이드 서열을 포함한다. 약제학적 조성물의 일부 실시형태에서, 이의 유도체는 서열 번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 공유하는 펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 γc-사이토카인-매개 질병의 치료용으로 제공되며, 여기서 γc-사이토카인-매개 질병은 CD4-백혈병, CD8-백혈병, LGL-백혈병, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 베게너 육아종증, 소아 지방변증, 하시모토 갑상선염, 류마티스 관절염, 당뇨병, 건선, 다발성 경화증, 포도막염, 눈의 염증 및 이식편대숙주병(GvHD)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 HTLV-1-연관 골수병(HAM)/열대성 강직 하반신마비(TSP)-연관 질병의 치료에 사용하기 위해 제공되며, 여기서 HAM/TSP-연관 질병은 성인 T-세포 백혈병(ATL), HTLV-연관 골수병/열대성 강직 하반신마비(HAM/TSP), 및 HTLV와 연관된 다른 비-신생물성 염증 질병, 예컨대 포도막염(HU), 관절증, 폐병증, 피부염, 외분비병증 및 근염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 염증성 호흡기 질병의 치료에 사용하기 위해 제공되며, 여기서 염증성 호흡기 질병은 천식, 부비동염, 건초열, 기관지염, 만성 폐색성 폐질환(COPD), 알레르기성 비염, 급성 및 만성 이염, 및 폐 섬유증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 미용 질환의 치료에 사용하기 위해 제공되며, 여기서 미용 질병은 여드름, 탈모, 일광 화상, 손발톱 유지 및 노화의 출현으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 환자에서의 질환 치료용 키트가 제공된다. 키트의 일부 실시형태에서, 질환은 γc-사이토카인-매개 질병, HTLV-1-연관 골수병(HAM)/열대성 강직 하반신마비(TSP)-연관 질병, 염증성 호흡기 질병, 미용 상태 또는 이들의 조합이고, 상기 키트는 본원에 제공된 약제학적 조성물을 포함한다.
키트의 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 펩타이드 컨쥬게이트 또는 이의 유도체, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 이들의 조합을 포함하며, 여기서 펩타이드 컨쥬게이트 또는 이의 유도체는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 γc-사이토카인의 활성을 조정하고, 펩타이드 컨쥬게이트는 아미노산 서열 P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(서열 번호: 3)를 포함한다.
키트의 일부 실시형태에서, 이의 유도체는 서열 번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 공유하는 펩타이드 서열을 포함한다. 약제학적 조성물의 일부 실시형태에서, 이의 유도체는 서열 번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 공유하는 펩타이드 서열을 포함한다.
키트의 일부 실시형태에서, 질환은 CD4-백혈병, CD8-백혈병, LGL-백혈병, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 베게너 육아종증, 소아 지방변증, 하시모토 갑상선염, 류마티스 관절염, 당뇨병, 건선, 다발성 경화증, 포도막염, 눈의 염증, 이식편대숙주병(GvHD), 성인 T-세포 백혈병(ATL), HTLV-연관 골수병/열대성 강직 하반신마비(HAM/TSP), 및 HTLV와 연관된 다른 비-신생물성 염증 질병, 예컨대 포도막염(HU), 관절증, 폐병증, 피부염, 외분비병증, 근염, 천식, 부비동염, 건초열, 기관지염, 만성 폐색성 폐질환(COPD), 알레르기성 비염, 급성 및 만성 이염, 및 폐 섬유증, 여드름, 탈모, 일광 화상, 손발톱 유지 또는 노화의 출현 중 하나 이상이다.
본 발명의 일 실시형태에 따른 커스텀 펩타이드 유도체의 사용은 치료제의 설계(펩타이드의 주문 설계)에 융통성을 허용하고, 보다 포괄적인 결과를 가능하게 하며, 이는 항-사이토카인 항체 또는 항-사이토카인 수용체 항체를 이용하는 종래의 전략에 의해서는 달성되지 않을 것이다.
도 1a는 인간 γc-사이토카인 패밀리 구성원의 D-헬릭스 영역의 정렬을 보여준다.
도 1b는 γc-사이토카인의 D-헬릭스 영역 주변으로 공통 서열(consensus sequence)을 유발하는 γc-박스(서열 번호: 10) 및 IL-2/IL-15 박스(서열 번호: 11) 모티프를 도시한 것이다.
도 2는 아미노산들의 생화학적 특성의 다이어그램 대표도(diagramed representation)를 도시한 것이다.
도 3a는 PT-18 증식 검정법에서 BNZ- γ에 의한 IL-15 및 IL-9 활성의 저해를 보여준다.
도 3b는 IL-2 또는 IL-15 및 0 uM, 0.1 uM, 1 uM 또는 10 uM BNZ- γ의 존재 하에 성장된 CTTL2 세포의 증식 검정법을 보여준다.
도 3c는 BNZ- γ에 의한, STAT5의 IL-15-매개 티로신-인산화의 저해를 보여준다.
도 4a는 HAM/TSP 말초 혈액을 사용한 생체외(ex vivo) T-세포 증식 검정법을 보여준다. T-세포 증식은 BNZ- γ의 첨가에 의해 저해된다.
도 4b는, HAM/TSP 말초 혈액을 사용한 생체외 T-세포 증식 검정법에서 CD4+CD25+ 세포 집단(population)이 BNZ- γ를 배양물에 첨가한 후 감소됨을 보여준다.
도 4c는, HAM/TSP 말초 혈액을 사용한 생체외 T-세포 증식 검정법에서 CD4+Ki67 세포 집단이 BNZ- γ를 배양물에 첨가한 후 감소됨을 보여준다.
도 4d는, HAM/TSP 말초 혈액을 사용한 생체외 T-세포 증식 검정법에서 구아바 염색(Guava staining)에 의해 확인된 살아 있는 세포의 퍼센트가 BNZ- γ를 배양물에 첨가한 후에도 영향을 받지 않음을 보여준다.
도 5는 상이한 인간 γc-사이토카인 패밀리 구성원들의 D-헬릭스 영역에 서열 번호: 3의 서열을 정렬한 결과를 보여준다. 음영 영역(shaded area)은, 서열 번호: 3의 서열 내의 상응하는 아미노산들과 동일한 인간 γc-사이토카인 패밀리 구성원의 아미노산 서열들을 나타낸다.
γc-박스의 발견
γc-사이토카인의 C-말단(D-헬릭스)은 다단위(multi-unit) 사이토카인 수용체의 공통 γc-하위단위와 상호작용하기 위한 제안된 부위를 함유한다(문헌[Bernard et al., 2004 J. Biol. Chem. 279:24313-21] 참조). 마우스 및 인간에서 식별된 모든 γc-사이토카인들의 생화학적 특성의 비교를 통해, 아미노산의 화학적 성질, 예를 들어 소수성, 친수성, 염기성/산성이, 동일하지 않은 경우, γc-사이토카인 패밀리의 구성원들에 걸쳐 D-헬릭스 내 많은 위치들에서 보존되는 것으로 나타났다.
이와는 대조적으로, γc-사이토카인인 IL-4와 관련이 있지만 γc-하위단위에 결합하지 않는 IL-13의 서열은 D-헬릭스 영역에서 γc-사이토카인과 유의한 상동성을 나타내지 않으며, 이는 D-헬릭스 영역 내 서열 상동성이 γc-하위단위에의 결합과 상관관계가 있음을 제시한다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 인간에서 γc-사이토카인 패밀리 구성원의 D-헬릭스 영역의 아미노산 서열의 정렬은 이들 사이토카인에서의 적정한(moderate) 서열 상동성의 모티프를 보여주며, 이러한 모티프는 본원에서 "γc-박스"로 지칭된다.
γc-박스(서열 번호: 10)는 19개의 위치들 중에서, 위치 4, 5 및 13이 각각 페닐알라닌, 루신 및 글루타민으로서 완전히 보존되어 있는 19개의 아미노산을 포함한다. 덜 빈번한(less) 보존은 γc-박스의 위치 6, 7 및 11에서 관찰되며, 이때 아미노산은 물리화학적 특성을 공유하는 2개 또는 3개의 관련 아미노산들 중 하나이다. 위치 6은 극성 아미노산인 글루타메이트, 아스파라긴 또는 글루타민에 의해 점유될 수 있으며, 비극성 아미노산인 세린 또는 아르기닌은 위치 7을 점유할 수 있고; 위치 11은 비극성 지방족 아미노산 루신 또는 이소루신 중 하나에 의해 점유된다. 위치 9 및 16은 비극성 아미노산인 이소루신 또는 극성 아미노산인 리신에 의해 점유될 수 있다. 도 1b를 참조한다. γc-박스의 아미노산 조성에 있어서 일부 차이는 γc-사이토카인의 서브패밀리 중에서 위치 9 및 16에서 관찰된다. 화학종들간의 γc-사이토카인의 비교는, IL-2/15 서브패밀리에서 위치 9 및 16에 이소루신이 종종 존재하는 반면, 다른 γc-패밀리 구성원들에서는 이들 위치에 종종 리신이 있음을 가리킨다. 특정한 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이소루신 및 리신은 생화학적으로 상이하고, 따라서 IL-2/15 서브패밀리와 다른 γc-사이토카인 사이에서 특이적인 구조 차이(conformational difference)를 부여할 수 있다.
γc-사이토카인들 사이에서의 γc-박스 모티프의 보존은, D-헬릭스 영역에 위치하는 글루타민(Gln, Q) 잔기가 γc-사이토카인과 γc-하위단위의 결합에 결정적이라는 발견에 의해 지지된다(문헌[Bernard et al., 2004 J. Biol. Chem. 279: 24313-21] 참조).
γc-사이토카인 활성의 펩타이드 저해제
γc-패밀리 사이토카인의 활성은, 예를 들어 다중-하위단위 사이토카인 수용체를 통한 신호전달의 자극 없이 γc-하위단위와 상호작용할 수 있는 경쟁적 저해제를 도입함으로써 γc-사이토카인과 γc-하위단위 사이의 상호작용을 방해함으로써 차단될 수 있다. 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, γc-패밀리 사이토카인과 γc-하위단위의 결합에 참여하는 보존된 γc-박스 모티프는, γc-사이토카인 신호전달의 펩타이드 저해제를 설계하는 데 이용될 수 있는 코어 베이스(core base) 아미노산 서열을 제시한다.
코어 γc-박스 아미노산 서열은 D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q(서열 번호: 2)(여기서, X는 임의의 아미노산을 의미함)를 포함한다. 본원에 기재된 적어도 일부 실시형태는, 하나 이상의 γc-사이토카인의 활성을 저해할 수 있는 코어 γc-박스 아미노산 서열의 커스텀(custom) 펩타이드 유도체에 관한 것이다. 커스텀 펩타이드 유도체는, 부분적인 아미노산 서열이 코어 γc-박스 아미노산 서열과 대략 50%, 50 ~ 60%, 60 ~ 70%, 70 ~ 80%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.8%의 동일성을 보여주는 임의의 펩타이드를 포함한다. 커스텀 펩타이드 유도체는, 해당 펩타이드 유도체의 부분적인 아미노산 서열이 코어 γc-박스의 아미노산과 유사한 물리화학적 특성을 가진 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드를 추가로 포함한다. 예를 들어, 유사한 물리화학적 특성을 가진 아미노산은 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 히스티딘을 포함할 것이며, 이들은 모두 방향족 아미노산이다. 도 2는, 코어 γc-박스를 포함하는 아미노산을 대체할 수 있는 유사한 물리화학적 특성을 가진 아미노산의 다이어그램 대표도를 보여준다. 코어 γc-박스의 펩타이드 유도체는 길이가 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 24, 25-30, 30 ~ 35, 35 ~ 40, 40 ~ 45, 45 ~ 50, 또는 50개 초과의 아미노산일 수 있다. 일부 실시형태에서, 커스텀 펩타이드 유도체는 기존의 생물학적 단백질/펩타이드의 N-말단, C-말단 및/또는 측 잔기에 컨쥬게이션될 수 있다.
γc-하위단위에 결합하는 사이토카인 내 보존된 γc-박스 모티프의 식별을 기반으로, 출원인들은 인간 IL-2와 IL-15 γc-박스의 아미노산 서열을 조합하는 인공 합성 펩타이드인 신규 19량체 커스텀 유도체 펩타이드를 고안하였다. 본원에서 BNZ-γ로 지칭되는 19량체 펩타이드는 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I -I-N-T-S(서열 번호: 1)로 구성되며, 여기서, 볼드체로 표시된 아미노산은 IL-2와 IL-15 사이에서 보존되고, 밑줄 표시된 아미노산은 아미노산의 물리화학적 특성이 보존되는 위치를 나타낸다.
출원인은, 19량체 BNZ-γ가 IL-15 및 IL-9에 의해 유도되는 세포 증식을 억제하지만 IL-3 또는 IL-4에 의해 유도되는 세포 증식은 억제하지 않음을 발견하였다. 도 3a 및 실시예 2를 참조한다. 출원인들은 추가로, BNZ-γ가 세포내 사이토카인 신호 전달 분자인 STAT-5의 IL-15-매개 인산화를 억제한다고 언급하였다. 도 3c 및 실시예 5를 참조한다. 이들 결과는, 보존된 γc-박스 모티프의 커스텀 펩타이드 유도체가 다수의 γc-사이토카인들의 활성을 저해할 수 있음을 나타낸다.
몇몇 실시형태는 19량체 BNZ-γ 아미노산 서열, I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 커스텀 유도체 펩타이드에 관한 것이며, 이러한 펩타이드는 하나 이상의 γc-사이토카인의 활성을 저해할 수 있다. 19량체 BNZ-γ 아미노산 서열의 커스텀 펩타이드 유도체는, 이의 부분적인 아미노산 서열이 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)과 대략 50%, 50 ~ 60%, 60 ~ 70%, 70 ~ 80%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.8%의 동일성을 보여주는 임의의 펩타이드를 포함한다. 커스텀 펩타이드 유도체는, 해당 펩타이드 유도체의 부분적인 아미노산 서열이 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 아미노산과 유사한 물리화학적 특성을 가진 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 커스텀 유도체 펩타이드의 아미노산 잔기는 BNZ-γ의 아미노산 잔기와 유사한 물리화학적 특성을 보유하지만, 6개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원들에 대해 오리지널 19량체 펩타이드와 상이한 생물학적 저해 특이성을 나타낸다. BNZ-γ의 펩타이드 유도체의 길이는 19, 20, 21, 22, 24, 25 ~ 30, 30 ~ 35, 35 ~ 40, 40 ~ 45, 45 ~ 50, 또는 50개 초과 아미노산일 수 있다. 일부 실시형태에서, 커스텀 펩타이드 유도체는 기존의 생물학적 단백질/펩타이드의 N-말단, C-말단 및/또는 측 잔기에 컨쥬게이션될 수 있다.
몇몇 실시형태는 도 1a에 도시되어 있는 IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 또는 IL-7의 γc-박스 모티프의 커스텀 펩타이드 유도체에 관한 것이다. 다른 실시형태는 인간 IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 및 IL-7 γc-박스 모티프들 중 2개 이상의 아미노산 서열들을 조합한 인공 합성 펩타이드인 커스텀 유도체 펩타이드에 관한 것이다. 몇몇 실시형태는, IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 또는 IL-7의 γc-박스 모티프의 아미노산 서열과 대략 50%, 50 ~ 60%, 60 ~ 70%, 70 ~ 80%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.8%의 동일성을 보여주는 부분적인 아미노산 서열을 가진, IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 또는 IL-7의 γc-박스 모티프의 커스텀 펩타이드 유도체에 관한 것이다. IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 또는 IL-7의 γc-박스 모티프의 커스텀 펩타이드 유도체는, 해당 펩타이드 유도체의 부분적인 아미노산 서열이 IL-15, IL-2, IL-21, IL-4, IL-9 또는 IL-7의 γc-박스 모티프의 서열의 아미노산과 유사한 물리화학적 특성을 가진 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태는 γc-사이토카인의 하나의, 모든 또는 선택적인 구성원의 기능을 저해할 커스텀 펩타이드 유도체에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 커스텀 펩타이드 유도체는 개별 γc-사이토카인 패밀리 구성원을 선택적으로 표적화한다. 예를 들어, 커스텀 펩타이드 유도체는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 또는 IL-21의 기능을 선택적으로 저해할 수 있다. 다른 실시형태에서, 커스텀 펩타이드 유도체는 2개 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원들을 저해할 수 있다.
예를 들어, 본 실시형태의 커스텀 펩타이드 유도체는, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21 중 하나 이상과 조합된 IL-2; IL-7, IL-9, IL-15 및 IL-21 중 하나 이상과 조합된 IL-4; IL-9, IL-15 및 IL-21 중 하나 이상과 조합된 IL-7; IL-2, IL-4, IL-7, IL-15 및 IL-21 중 하나 이상과 조합된 IL-9; IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-21 중 하나 이상과 조합된 IL-15; 또는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 및 IL-15 중 하나 이상과 조합된 IL-21의 기능을 선택적으로 저해할 수 있다. 다른 실시형태에서, 커스텀 펩타이드 유도체는 모든 γc-사이토카인 패밀리 구성원들을 포괄적으로 표적화할 수 있다.
특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 커스텀 펩타이드 유도체는 예를 들어 경쟁적 저해제로서, γc-사이토카인과 γc-하위단위의 결합을 저하시킴으로써 γc-사이토카인의 모든 또는 선택적인 구성원의 기능을 저해할 수 있다. 이러한 커스텀 펩타이드 유도체는 임상 약물로서의 적용을 포함하여 다양한 적용들에서 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태는 γc-사이토카인의 1개, 2개 또는 그 이상의 선택적인 구성원의 기능을 조정(증강 또는 감소를 포함함)할 커스텀 펩타이드 유도체에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 커스텀 펩타이드 유도체는 개별 γc-사이토카인 패밀리 구성원을 선택적으로 표적화한다. 예를 들어, 커스텀 펩타이드 유도체는 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 또는 IL-21의 기능을 선택적으로 증강시키거나 저해할 수 있다. 다른 실시형태에서, 커스텀 펩타이드 유도체는 2개 이상의 γc-사이토카인 패밀리 구성원들을 증강시키거나 저해할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 커스텀 펩타이드 유도체는 P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(서열 번호: 3)를 포함할 수 있으며, 이는 1개, 2개 또는 그 이상의 γc-사이토카인의 활성을 증강시키거나 저해할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 커스텀 펩타이드 유도체는 P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(서열 번호: 3)를 포함할 수 있으며, 이는 적어도 IL-15 및 IL-21의 활성을 저해할 수 있다.
일부 실시형태에서, 커스텀 펩타이드 유도체는, 이의 부분적인 아미노산 서열이 아미노산 서열 P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(서열 번호: 3)와 대략 50%, 50 ~ 60%, 60 ~ 70%, 70 ~ 80%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.8%의 동일성을 보여주는 임의의 펩타이드를 포함할 수 있다. 커스텀 펩타이드 유도체는, 펩타이드 유도체의 부분적인 아미노산 서열이 서열 P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(서열 번호: 3)의 아미노산과 유사한 물리화학적 특성을 가진 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드를 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 커스텀 유도체 펩타이드의 아미노산 잔기는 P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(서열 번호: 3)의 아미노산 잔기와 유사한 물리화학적 특성을 보유하지만, 6개의 γc-사이토카인 패밀리 구성원들(즉, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 또는 IL-21)에 대해 P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(서열 번호: 3)의 오리지널 펩타이드와 상이한 생물학적 저해 특이성을 나타낸다. 서열 P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(서열 번호: 3)의 펩타이드 유도체의 길이는 19, 20, 21, 22, 24, 25 ~ 30, 30 ~ 35, 35 ~ 40, 40 ~ 45, 45 ~ 50, 또는 50개 초과의 아미노산일 수 있다.
일부 실시형태에서, 커스텀 펩타이드 유도체는 기존의 생물학적 단백질/펩타이드의 N-말단, C-말단 및/또는 측 잔기에 컨쥬게이션될 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열 번호: 3의 합성 펩타이드는 상기 합성 펩타이드의 N-말단, C-말단 또는 측 사슬을 통해 다른 모이어티에 컨쥬게이션될 수 있다. 다른 모이어티는 합성 펩타이드를 안정화시키는 단백질 또는 펩타이드, 또는 다른 모이어티, 예컨대 비제한적으로 소 혈청 알부민(BSA), 알부민, 키홀드 림펫 혈색소(KLH), IgG의 Fc 영역, 스캐폴드로서 작용하는 생물학적 단백질, 세포-특이적 항원에 대한 항체, 수용체, 리간드, 금속 이온 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다.
용어 '올리고펩타이드,' '폴리펩타이드,' '펩타이드' 및 '단백질'은 본 실시형태에 따라 제공되는 커스텀 펩타이드 유도체를 지칭할 때 상호호환적으로 사용될 수 있고, 임의의 길이의 일련의 아미노산 잔기를 지정하는 데 사용될 수 있다. 본 실시형태에 따른 펩타이드는 또한, 비-천연 아미노산을 함유할 수 있다. 링커 요소는 펩타이드 결합 또는 화학적 결합을 통해 본 실시형태의 펩타이드에 접합될 수 있다. 본 실시형태의 펩타이드는 선형 또는 환형일 수 있고, (L) 아미노산뿐만 아니라 (D) 아미노산을 포함할 수 있다.
본 실시형태의 펩타이드는 또한, 광범위하게 다양한 측 사슬 변형 및/또는 치환(예를 들어 메틸화, 벤질화, t-부틸화, 토실화, 알콕시카르보닐아미노 등)과 함께 또는 없이, 하나 이상의 희귀(rare) 아미노산(예컨대 4-하이드록시프롤린 또는 하이드록시리신), 유기 산 또는 아미드 및/또는 공통 아미노산의 유도체, 예컨대 에스테르화된(예를 들어 벤질, 메틸 또는 에틸 에스테르) 또는 아미드화된 C-말단 카르복실레이트를 가지고/거나 N-말단 아미노기의 변형(예를 들어 아세틸화 또는 알콕시카르보닐아미노)을 가진 아미노산을 함유할 수 있다.
존재할 수 있는 공통 아미노산 이외의 잔기로는, 페니실라민, 테트라메틸렌 시스테인, 펜타메틸렌 시스테인, 머캅토프로피온산, 펜타메틸렌-머캅토프로피온산, 2-머캅토벤젠, 2-머캅토아닐린, 2-머캅토프롤린, 오르니틴, 다이아미노부티르산, 아미노아디프산, m-아미노메틸벤조산 및 다이아미노프로피온산 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 실시형태의 펩타이드는 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법들에 의해 생성되고 수득될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 본 실시형태의 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 기반으로 한 유전자 조작에 의해 생성되거나, 펩타이드 고체상 합성 등에 의해 화학적으로 합성되거나, 이들의 조합에 의해 생성되고 수득될 수 있다.
통상의 기술자는 보존된 γc-박스 모티프에 관한 본 발명의 개시내용 및 도 2에 기재된 바와 같은 아미노산의 생화학적 특성에 대한 지식을 기반으로, 커스텀 펩타이드 유도체를 합성할 수 있다. 일부 실시형태는 또한, 본 발명의 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. '뉴클레오타이드 서열,' '폴리뉴클레오타이드' 또는 '핵산'은 상호호환적으로 사용될 수 있고, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, 또는 상기 DNA의 전사 생성물(예를 들어 RNA 분자)을 의미하는 것으로 이해된다. 폴리뉴클레오타이드는, 펩타이드 자체를 투여하기보다는 세포 또는 피험자에게 투여된 다음 이러한 세포 또는 피험자에 의해 발현될 수 있다. 몇몇 실시형태는 또한 본 발명의 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 구축물에 관한 것이다. 유전자 구축물은 또한, 부가적인 조절 요소, 예컨대 프로모터 및 인핸서, 및 선택적으로 선별 마커를 함유할 수 있다.
γc-사이토카인-매개 질병의 치료 방법
몇몇 실시형태는 γc-사이토카인-매개 질병의 치료에서 γc-길항제 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 본 실시형태에 따른 커스텀 펩타이드 유도체의 사용은 치료제의 설계(펩타이드의 주문 설계)에 융통성을 허용하고, 보다 포괄적인 결과를 가능하게 하며, 이는 항-사이토카인 항체 또는 항-사이토카인 수용체 항체를 이용하는 종래의 전략에 의해서는 달성되지 않을 것이다.
γc-패밀리 사이토카인의 작용을 차단하는 신규 방법이 본원에 기재되어 있다. 이러한 조작을 통해, γc-사이토카인의 조절 장애 또는 기능 장애와 관련된 질병의 치료에 있어서 효과적인 임상적 개입 방법이 수득될 수 있다. γc-사이토카인과 γc-하위단위 사이의 상호작용을 방해함으로써 치료될 수 있는 질병의 예로는, 자가면역 질병, 예컨대 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 베게너 육아종증, 소아 지방변증, 하시모토 갑상선염 또는 자가면역 갑상선염; 콜라겐 질병, 예컨대 류마티스 관절염, 염증성 장질환, 당뇨병, 피부의 자가면역 질병, 예컨대 건선; 퇴행성 신경 질병, 예컨대 다발성 경화증, 포도막염 또는 눈의 염증 및 교감성 안염(sympathetic ophthalmia), 이식편대숙주병(GvHD) 및 중증 근무력증(myasthenia gravis) 등이 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 γc-길항제 펩타이드는 1-인간 T-세포 림프친화성 유형 I 및 II(HTLV-I 및 HTLV-II)-연관 질병, 예컨대 성인 T-세포 백혈병(ATL), HTLV-연관 골수병/열대성 강직 하반신마비(HAM/TSP), 및 HTLV와 연관된 다른 비-신생물성 염증 질병, 예컨대 포도막염(HU), 관절증, 폐병증, 피부염, 외분비병증 및 근염의 치료에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 γc-길항제 펩타이드는 다른 바이러스 질병, 예컨대 인플루엔자, AIDS, HBV 및 헤르페스 또는 기생충 질병의 치료에 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, γc-길항제 펩타이드는 다양한 장기들의 이식 이전, 도중 또는 이후에 면역억제제로서 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 γc-길항제 펩타이드는 면역-매개 질병, 예컨대 천식 및 다른 염증성 호흡기 질병, 예를 들어 비제한적으로 부비동염, 건초열, 기관지염, 만성 폐색성 폐질환(COPD), 알레르기성 비염, 급성 및 만성 이염, 폐 섬유증의 치료에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, γc-길항제 펩타이드는 알레르기원(allergen), 화학적 제제 또는 급성 호흡기 질병의 다른 공통 원인에의 노출로 인한 알레르기 반응을 치료하거나 예방하기 위해 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, γc-길항제 펩타이드는 바이러스, 박테리아, 화학적 시약 및 생화학적 시약에 야기되는 염증 반응을 치료하거나 예방하기 위해 투여될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, γc-길항제 펩타이드는 일부 유형의 악성 종양, 예컨대 LGL-백혈병, 불응성 소아 지방변증(Refractory Celiac disease)에서의 상피내 림프종 및 백혈병, NK 백혈병/림프종 및 NK-T 백혈병/림프종의 치료를 위해 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 실시형태에 따른 커스텀 펩타이드 유도체는 여드름, 탈모, 일광 화상 및 손발톱 유지의 치료와 같이 미용 목적을 위해 사용되고, 이들 유도체의 항-염증 성질때문에 항-노화 구성성분으로서 연고에 포함될 수 있다.
몇몇 실시형태는 γc-사이토카인의 모든 또는 선택적인 구성원의 기능을 저해할 치료용 길항제 펩타이드에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 치료용 길항제 펩타이드는 개별 γc-사이토카인 패밀리 구성원(커스텀 펩타이드)을 선택적으로 저해한다. 다른 실시형태에서, 치료용 길항제 펩타이드는 모든 γc-사이토카인 패밀리 구성원들을 포괄적으로 저해할 수 있다(사이뮬-블락). 일부 실시형태에서, 치료용 길항제 펩타이드는 γc-사이토카인의 서브셋을 선택적으로 저해한다. 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 펩타이드 길항제는 예를 들어 경쟁적 저해제로서 γc-사이토카인과 γc-하위단위의 결합을 저하시킴으로써 γc-사이토카인의 모든 또는 선택적인 구성원의 기능을 저해할 수 있다.
IL-4를 제외한 γc-사이토카인 패밀리의 몇몇 구성원들인 IL-2, IL-7 및 IL-15는 실험용 마우스 모델에서 이식편대숙주병(GvHD)에 관여하는 것으로 나타나 있다(문헌[Miyagawa et al., 2008 J. Immunol. 181:1109 ~ 19] 참조). 일 실시형태는 인간에서 GvHD의 치료를 위해, IL-2, IL-7 및 IL-15의 활성을 선택적으로 저해하며 이식된 조직 또는 골수 세포의 생존을 허용하는 치료용 길항제 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 다른 실시형태는 GvHD의 치료를 위해, IL-2와 IL-7의 조합, IL-2와 IL-15의 조합 또는 IL-7과 IL-15의 조합을 선택적으로 저해하는 치료용 길항제 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 다른 실시형태는 IL-2, IL-7 또는 IL-15를 선택적으로 저해하는 치료용 길항제 펩타이드들의 조합의 용도에 관한 것이다.
일부 실시형태는, T-reg가 역할을 하는 것으로 나타나 있는 자가면역 장애의 치료를 위해 IL-2 기능을 선택적으로 저해하는 치료용 길항제 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, T-reg의 펩타이드-매개 저해는 인간에서 천연 항암 면역성을 증강시켜, 신규 항암 치료법을 제공할 수 있다.
몇몇 실시형태는 천식의 치료를 위해, IL-4를 선택적으로 저해하는 치료용 길항제 펩타이드의 용도에 관한 것이다.
일부 실시형태는 LGL-백혈병의 치료제로서 단독으로, 또는 γc-사이토카인 패밀리 구성원인 IL-15를 선택적으로 저해하는 치료용 길항제 펩타이드와 조합하여, IL-7을 선택적으로 저해하는 치료용 길항제 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, IL-7 활성 및 IL-15 활성을 둘 다 선택적으로 저해하는 치료용 길항제 펩타이드가 LGL-백혈병의 치료에 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태는 LGL-백혈병의 치료를 위한 BNZ-γ의 용도에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, IL-15만 선택적으로 저해하는 특이적인 γc-길항제 펩타이드, 또는 IL-15 및 IL-7을 선택적으로 저해하는 특이적인 γc-길항제 펩타이드는, HTLV-I에 의해 야기되는 백혈병을 포함하여 CD4/CD8 T 림프구-연관 백혈병에 대한 치료제로서 사용된다.
몇몇 실시형태는, Th17 세포의 비정상적인 발생을 수반하는 인간 질병에 대한 치료제로서, 단독으로 또는 다른 γc-사이토카인 패밀리 구성원과 조합하여 IL-9의 활성을 선택적으로 저해하는 γc-길항제 펩타이드의 용도에 관한 것이다.
몇몇 실시형태는 CD 치료용 치료제로서, IL-15 활성을 선택적으로 저해하는 치료용 길항제 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 최근의 한 공개문헌은, IL-15 외에도 IL-21이 CD 발병에 역할을 할 수 있는 것으로 제시하였다(문헌[Bodd et al., 2010, Mucosal Immunol. 3:594 ~ 601] 참조). 이는, 종래의 항-사이토카인 또는 사이토카인-수용체 항체에 의한 CD의 최적의 치료가, IL-15 및 IL-21 시스템에 속하는 구성성분을 인지하는 적어도 2개의 항체들의 조합으로부터 이득을 얻을 것임을 제시한다. 일부 실시형태에서, IL-15 활성 및 IL-21 활성을 둘 다 선택적으로 저해하는 커스텀 유도체 길항제 펩타이드가 CD 치료용 치료제로서 사용된다.
치료적인 적용을 갖는 것 외에도, γc-길항제 펩타이드는 소비자 제품에도 적용된다. 몇몇 실시형태는 항-노화, 항-염증, 항-여드름 및 다른 관련된 적용들과 같은 스킨 케어 제품에서의 γc-길항제 펩타이드의 용도에 관한 것이다. 일부 실시형태는 자가면역 장애에 의해 야기되는 탈모의 치료를 위한 항-탈모 성분으로서 헤어 제품에서의 γc-길항제 펩타이드의 용도에 관한 것이다.
또 다른 실시형태는, 19량체 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)와 닮은 공간적 구조를 가지며, γc-사이토카인이 결합을 위해 γc-하위단위에 접근하는 것을 구조적으로 방해하기 위해 γc-하위단위의 포켓 내에 맞춰질 수 있는 화학적 화합물(비-펩타이드, 비-단백질)의 개발에 관한 것이다. 일부 실시형태는 γc-사이토카인 활성의 저해제로서 구조적으로 유사한 화학적 화합물의 용도에 관한 것이다. 기존의 생물학적 펩타이드/단백질과 구조가 닮은 합성 화합물의 개발을 더 설명하기 위한 이러한 분자적 모방 전략은 문헌[Orzaez et al., 2009 Chem. Med. Chem. 4:146 ~ 160]에 기재되어 있다. 또 다른 실시형태는 γc-사이토카인-매개 질병의 치료를 위한, 19량체 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)와 닮은 3D 구조를 가진 화학적 화합물(비-펩타이드, 비-단백질)의 투여에 관한 것이다.
몇몇 실시형태는 γc-사이토카인-매개 질병의 치료를 위한 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 펩타이드의 투여에 관한 것이다. 또 다른 실시형태는 γc-사이토카인-매개 질병의 치료를 위한 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 유도체 펩타이드의 투여에 관한 것이며, 여기서 유도체 펩타이드의 아미노산 서열은 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 펩타이드와 유사한 물리화학적 특성을 가지지만 별개의 생물학적 활성을 가진다. 또 다른 실시형태는 γc-사이토카인-매개 질병의 치료를 위해, 기존의 생물학적 단백질/펩타이드의 N-말단 및 C-말단 또는 측 잔기에 컨쥬게이션된 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 펩타이드를 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다.
몇몇 실시형태는 γc-사이토카인-매개 질병의 치료를 위해, 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)를 포함하는 펩타이드에 대해 생성된 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 면역원으로서 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다. 또 다른 실시형태는 γc-사이토카인-매개 질병의 치료를 위해, 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 유도체 펩타이드에 대해 생성된 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 환자에게 면역원으로서 투여하는 것에 관한 것이며, 여기서 유도체 펩타이드의 아미노산 서열은 아미노산 서열 I-K-E-F-L-Q-R-F-I-H-I-V-Q-S-I-I-N-T-S(서열 번호: 1)의 펩타이드와 유사한 물리화학적 특성을 가지지만 별개의 생물학적 활성을 가진다.
γc-길항제 펩타이드의 투여
본 실시형태는 또한, 질병 치료용 약제의 제조를 위한 γc-길항제 펩타이드의 용도를 포함한다. 본 실시형태는 또한, γc-길항제 펩타이드를 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 무독성의 치료적 유효량의 γc-길항제 펩타이드, 또는 본 실시형태의 조성물을 포함할 수 있다.
본 실시형태는 γc-사이토카인에 대한 유효량의 길항제를 적합한 희석제 또는 담체 내에 포함하는 약제학적 조성물의 사용 방법을 제공한다. 본 실시형태의 γc-길항제는 약제학적으로 유용한 조성물의 제조에 사용되는 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. γc-길항제는 단독 활성 물질로서 또는 다른 공지된 활성 물질과 함께, 약제학적으로 적합한 희석제(예를 들어 포스페이트, 아세테이트, Tris-HCl), 보존제(예를 들어 티메로살, 벤질 알코올, 파라벤), 유화제 화합물, 용해제, 보조제 및/또는 담체, 예컨대 소 혈청 알부민과 혼합물로서 조합될 수 있다.
적합한 담체들 및 이들의 제형은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980 Mack Publishing CO]에 기재되어 있다. 부가적으로, 이러한 조성물은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 금속 이온과 복합체를 이룬 γc-길항제, 또는 폴리아세트산, 폴리글리콜산, 하이드로겔, 리포좀, 마이크로에멀젼, 미쉘, 유니라멜라 또는 멀티라멜라 비히클, 적혈구 고스트 또는 스페로블라스트와 같은 중합체성 화합물 내에 혼입된 γc-길항제를 함유할 수 있다. 이러한 조성물은 γc-길항제의 물리적 상태, 용해성, 안정성, 생체내 방출 속도 및 생체내 제거 속도에 영향을 미칠 것이다. γc-길항제는 세포-특이적 항원에 대한 항체, 수용체, 리간드에 컨쥬게이션되거나, 조직-특이적 수용체에 대한 리간드에 커플링될 수 있다.
본 실시형태의 γc-길항제의 투여 방법은 질병 유형, 피험자의 상태 및/또는 표적 부위 등과 같은 인자들에 따라 적절하게 선택될 수 있다. γc-길항제는 국소, 경구, 비경구, 직장내 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 용어 '비경구'는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 복강내, 수조내(intracisternal) 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 이들 조성물은 전형적으로, 유효량의 γc-길항제를 단독으로 또는 유효량의 임의의 다른 활성 물질과 조합하여 포함할 것이다.
본 실시형태의 약제학적 조성물에 함유되는 펩타이드의 양, 약제학적 조성물의 투약 형태, 투여 빈도 등은 질병 유형, 피험자의 상태 및/또는 표적 부위 등과 같은 인자들에 따라 적절하게 선택될 수 있다. 조성물 내에 함유되는 이러한 투여량 및 요망되는 약물 농도는 의도되는 용도, 환자의 체중과 연령 및 투여 경로를 포함하는 많은 파라미터에 따라 달라질 수 있다. 파일럿 연구는 처음에 동물 연구를 사용하여 수행될 것이고, 인간 투여로의 규모 확장은 이러한 기술분야의 관행에 따라 수행될 것이다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 γc-길항제 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 유전자 조작된 숙주 세포는 증식 장애를 치료하고/거나 악성 세포의 성장을 감소시키기 위해 피험자에게 투여된다. 폴리뉴클레오타이드는 숙주 세포에 의해 발현되고, 이로 인해 피험자 내에서 펩타이드를 생성한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 피험자에게 동종이계(allogeneic) 또는 자가(autogeneic)이다.
추가의 양태에서, γc-길항제 펩타이드는 다른 치료법, 예를 들어 암세포 증식 및 성장을 저해하는 치료법과 병용될 수 있다. '병용 치료법'이라는 구어는 γc-길항제 펩타이드 및 부가적인 치료제를 이들 치료제의 공동 작용으로 인한 유익한 효과를 제공하고자 특정한 치료 섭생의 일부로서 투여하는 것을 포함한다. 전형적으로 이들 치료제의 병용 투여는 정해진 기간(통상적으로, 선택된 병용에 따라 수분, 수시간, 수일 또는 수주)에 걸쳐 수행된다.
병용 치료법은, 각각의 치료제가 상이한 시점에 투여되는 이들 치료제의 순차적인 방식의 투여, 뿐만 아니라 이들 치료제 또는 적어도 2개의 치료제의 실질적으로 동시적인 방식의 투여를 포함하고자 한다. 실질적으로 동시적인 투여는 예를 들어, 각각의 치료제를 고정된 비율로 갖는 단일 캡슐, 또는 각각의 치료제에 대한 단일 캡슐들 다수를 피험자에게 투여함으로써 달성될 수 있다. 각각의 치료제의 순차적인 투여 또는 실질적으로 동시적인 투여는 비제한적으로 경구 경로, 정맥내 경로, 근육내 경로 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 적절한 경로에 의해 수행될 수 있다. 이들 치료제는 동일한 경로 또는 상이한 경로들에 의해 투여될 수 있다. 치료제가 투여되는 순서는 좁은 의미로 결정적이지 않다.
병용 치료법은 또한, 상기 기재된 바와 같은 치료제를 다른 생물학적 활성 성분(예컨대 비제한적으로 제2의 상이한 치료제) 및 비-약물 치료법(예컨대 비제한적으로 수술 또는 방사선 치료)과 추가로 조합하여 투여하는 것을 포함할 수 있다. 병용 치료법이 방사선 치료를 추가로 포함하는 경우, 이러한 방사선 치료는 치료제와 방사선 치료의 병용 시 그 공동 작용으로 인한 유익한 효과가 달성되는 한 임의의 적합한 시점에 수행될 수 있다. 예를 들어 적절한 경우, 방사선 치료가 치료제의 투여로부터 일시적으로, 아마도 수일 또는 심지어 수주 동안 배제될 때에도 유익한 효과가 여전히 달성된다.
소정의 실시형태에서, γc-길항제 펩타이드는 화학치료제, 항-대사물질, 항-종양 제제, 항-유사분열제, 항-바이러스제, 항-신생물제, 면역치료제 및 방사선치료제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 항-증식 제제와 병용하여 투여될 수 있다.
소정의 실시형태에서, γc-길항제 펩타이드는 스테로이드, 코티코스테로이드 및 비스테로이드성 항-염증 약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 항-염증제와 병용하여 투여될 수 있다.
본원에 제공된 방법들 중 임의의 방법을 수행하기 위한 키트가 또한 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트는 본원에 제공된 임의의 실시형태에 따른 하나 이상의 γc-길항제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키트는 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 글자로 쓰여져 있거나 그림 문자 형태일 수 있거나, 오디오 테이프, 오디오 CD, 비디오 테이프, DVD, CD-ROM 등을 포함하는 기록 매체일 수 있다. 키트는 포장재를 포함할 수 있다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 '환자'는 치료 목적의 치료의 수여자를 지칭하고, 동물계 내의 모든 개체들을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 동물은 포유류과 내에 존재하며, 예컨대 인간, 소, 양, 돼지, 고양이, 버팔로, 개, 염소, 말, 당나귀, 사슴 및 영장류이다. 가장 바람직한 동물은 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 '치료하다' 또는 이의 변화형(예를 들어 치료, 치료하는 등)은 생물학적 질환, 예컨대 CD4-백혈병, CD8-백혈병 및 LGL-백혈병, 자가면역 질병, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 베게너 육아종증, 소아 지방변증, 하시모토 갑상선염, 콜라겐 질병, 류마티스 관절염, 염증성 장질환, 당뇨병, 건선, 퇴행성 신경 질병, 다발성 경화증, 포도막염, 눈의 염증, 이식편대숙주병(GvHD), 중증 근무력증, 1-인간 T-세포 림프친화성 유형 I 및 II(HTLV-I 및 HTLV-II)-연관 질병, 성인 T-세포 백혈병(ATL), HTLV-연관 골수병/열대성 강직 하반신마비(HAM/TSP), 포도막염(HU), 관절증, 폐병증, 피부염, 외분비병증, 근염, 인플루엔자, AIDS, HBV, 헤르페스, 천식, 부비동염, 건초열, 기관지염, 만성 폐색성 폐질환(COPD), 알레르기성 비염, 급성 및 만성 이염, 폐 섬유증, NK 백혈병/림프종 및 NK-T 백혈병/림프종을 진단받은 환자의 임의의 치료를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 '치료하다'라는 용어는, (i) 관심 생물학적 질환과 연관된 증상이 아직 나타나지 않았지만 그럴 위험이 있는 환자에서 상기 생물학적 질환과 연관된 증상의 출현을 예방하거나 지연시키는 것, (ii) 관심 생물학적 질환을 진단받은 환자에서 상기 생물학적 질환과 연관된 증상을 완화하는 것, (iii) 관심 생물학적 질환이 나타날 위험이 있는 환자 또는 진단받은 환자에서 상기 생물학적 질환과 연관된 합병증, 질환 또는 질병과 연관된 증상의 출현을 예방하거나, 지연시키거나 완화하는 것, (iv) 생물학적 질환의 진행을 늦추거나, 지연시키거나 중단시키는 것; 및/또는 (v) 세포 염증 사건을 예방하거나, 지연시키거나, 늦추거나, 중단시키거나 완화하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 '증상(들)'은, 환자가 특정한 질환 또는 질병을 앓고 있다는 공통의 징후 또는 적응증을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 '유효량'은 요망되는 생물학적 반응을 이끌어내는 데 필요한 양을 지칭한다. 본 실시형태에 따르면, γc-길항제의 유효량은, 생물학적 질환의 치료에 사용되기 위한 적어도 하나의 생물학적 인자에서 관찰 가능한 효과를 제공하는 데 필요한 양이다.
'재조합 DNA 기술' 또는 '재조합'은, 이종(heterologous) 펩타이드의 생합성을 할 수 있기 위해, 클로닝된 DNA 서열 또는 합성 DNA 서열로 형질변환되거나 형질감염된 미생물(예를 들어 박테리아, 효모), 무척추동물(곤충), 포유류의 세포 또는 유기체(예를 들어 유전자 도입 동물 또는 식물)로부터 특정한 폴리펩타이드를 생성하기 위한 기술 및 과정의 사용을 지칭한다. 본래의(native) 글리코실화 패턴은 포유류의 세포 발현 시스템을 이용해서만 달성될 것이다. 원핵생물 발현 시스템에는 합성된 단백질에 글리코실화를 부가하는 능력이 결여되어 있다. 효모 및 곤충 세포는 본래의 패턴과 상이할 수 있는 독특한 글리코실화 패턴을 제공한다.
'뉴클레오타이드 서열'은, 실질적으로 순수한 형태로 적어도 1회 단리된 DNA 또는 RNA 유래의 더 큰 DNA 구축물의 구성성분 또는 개별 단편 형태의 폴리뉴클레오타이드를 지칭하며, 이는 오염성 내인성 물질을 포함하고 있지 않으며, 표준 분자생물학 방법(문헌[Current Protocols in Molecular Biology]에 기재된 바와 같음)에 의해 이의 구성성분 뉴클레오타이드 서열의 식별, 조작 및 회수를 가능하게 하는 양 또는 농도로 존재한다.
'재조합 발현 벡터'는 (1) 유전자 발현에 있어서 조절 역할을 하는 유전적 요소 또는 요소들, 예컨대 프로모터 및 인핸서, (2) 본 실시형태에 따른 폴리펩타이드를 인코딩하는 구조 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 서열, 및 요망되는 경우 종결 서열의 어셈블리를 함유하는 전사 단위를 포함하는 플라스미드를 지칭한다. 효모 및 포유류 시스템에서 사용하고자 하는 구조적 요소는 바람직하게는 효모 또는 포유류 숙주 세포에 의한 번역된 폴리펩타이드의 세포외 분비를 가능하게 하는 신호 서열을 포함한다.
'재조합 미생물 발현 시스템'은 재조합 전사 단위가 염색체 DNA 내에 안정하게 통합되었거나 재조합 전사 단위를 잔여 플라스미드의 구성성분으로서 운반하는 적합한 숙주 미생물, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 같은 박테리아 또는 에스. 세레비시애(S. cerevisiae)와 같은 효모의 실질적으로 균질한 단일 배양물(monoculture)을 지칭한다. 일반적으로, 재조합 미생물 발현 시스템을 구성하는 숙주 세포는 형질변환된 단일 조상 세포의 자손이다. 재조합 미생물 발현 시스템은, 발현되는 구조적 뉴클레오타이드 서열에 연결된 조절 요소의 유도 시 이종성 폴리펩타이드를 발현할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 문두(section heading)는 오로지 조직화가 목적이고, 기재되는 주제를 임의의 방식으로 제한하는 것으로 이해되지 않아야 한다. 비제한적으로 특허, 특허 출원, 기사, 서적, 논문 및 인터넷 웹페이지를 포함하여 본 출원에서 인용된 모든 문헌 및 유사한 재료들은 이들 전체가 임의의 목적을 위해 원용에 의해 표현적으로 포함되어 있다. 포함된 참조문헌들에서의 용어의 정의가 본 교시에서 제공된 정의와 상이하게 보이는 경우, 본 교시에서 제공된 정의가 우선해야 한다. 본 교시에서 언급된 온도, 농도, 시간 등의 앞에 '약'이 내포되어 있어서, 약간의 비실질적인 편차가 본원의 교시의 범위 내에 존재하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명이 소정의 실시형태 및 실시예의 맥락에서 개시되어 있긴 하지만, 당업자는 본 발명이 구체적으로 개시된 실시형태뿐만 아니라 본 발명의 다른 대안적인 실시형태 및/또는 용도 및 이들의 명백한 변형 및 등가물까지 확장됨을 이해할 것이다. 또한, 본 발명의 몇몇 변화가 상세히 나타나고 기재되어 있긴 하지만, 당업자는 본 개시내용을 기반으로 본 발명의 범위 내에 포함되는 다른 변형들도 쉽게 알게 될 것이다.
또한, 실시형태의 특정한 특징 및 양태들의 다양한 조합 또는 하위조합이 이루어질 수 있고, 여전히 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 여겨진다. 개시된 실시형태의 다양한 특징 및 양태들은 개시 발명의 다양한 방식 또는 실시형태를 형성하기 위해 서로 조합되거나 대체될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본원에 개시된 본 발명의 범위는 상기 기재된 특정한 개시된 실시형태에 의해 제한되지 않아야 한다.
그러나, 당업자는 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형들을 알게 될 것이기 때문에, 이러한 상세한 설명이 본 발명의 바람직한 실시형태를 가리키기는 하지만 단지 예시에 의해 주어질 뿐임을 이해해야 한다.
실시예
하기 실시예는 예시를 목적으로 제시되어 있을 뿐, 제한하려는 것으로 간주되어서는 안 된다.
실시예 1 - γc-길항제 펩타이드의 저해 활성의 평가 방법
본 실시형태에 따라 제조된 임의의 커스텀 유도체 펩타이드가 하나의 γc-사이토카인 패밀리 구성원의 작용을 저해하는 능력을 포유류 세포 검정법들을 사용하여 확인하여 γc-사이토카인 패밀리 구성원에 대한 이들의 증식 반응을 측정한다.
6개의 γc-사이토카인 각각에 대해, 지시 세포주 American Type Culture Collection사로부터 입수 가능한 뮤린 CD8 T 세포주 CTLL-2, 및 뮤린 비만 세포주인 PT-18 및 이의 서브클론 PT-18β에 인간 IL-2Rβ 유전자를 형질감염시켜, IL-2 및 IL-15에 반응성인 세포로 만들고(문헌[Tagaya et al., 1996, EMBO J. 15:4928 ~ 39]), 이러한 지시 세포주를 γc-사이토카인의 성장-촉진 활성을 정량적으로 확인하는 데 사용한다(문헌[Current protocols in Immunology from Wiley and Sons for a methodological reference] 참조). 지시 세포는 광범위한 농도에 걸쳐 비색(colorimetric) WST-1 검정법에 의해 측정되는 경우 반-선형(semi-linear) 용량-의존적 반응을 나타낸다(시약 및 방법에 대한 상세한 설명에 대해 원용에 의해 본 명세서에 포함된 문헌[Clontech PT3946-1] 및 관련된 사용자 매뉴얼을 참조).
지시 세포주로부터 최대 반응의 50% 및 95%를 수득하는 사이토카인의 적절한 용량이 일단 확인되면, 다양한 농도(1 pM 내지 10 μM 범위)의 정제된 또는 합성된 커스텀 유도체 펩타이드를 사이토카인 및 지시 세포를 함유하는 각각의 웰에 첨가한다. 450 nm에서의 흡광도의 감소를 사이토카인-자극 세포 증식의 저해에 대한 지시자(indicator)로서 사용한다. 전형적으로, 지시 세포주 및 사이토카인을 함유하는 웰의 흡광도가 2.0 내지 3.0이 되도록, 즉 저해성 펩타이드의 첨가에 의해 0.1 내지 0.5의 범위까지 감소되도록, 세포를 사이토카인에 의해 자극한다.
실시예 2 - BNZ-γ 펩타이드는 IL-9 및 IL-15의 성장-촉진 활성을 특이적으로 저해한다
상기 기재된 바와 같은 PT-18β 세포를 사용하여, 선택된 γc-사이토카인의 성장-촉진 활성을 특이적으로 저해하는 BNZ-γ 펩타이드의 능력을 확인하였다(도 3a). PT-18β 세포의 성장을 지지하는 비-γc-사이토카인인 IL-3를 음성 대조군으로서 사용하였다. 간략하게는 PT-18β 세포를, HEK293T 세포에 의해 생성되는 BNZ-γ 펩타이드의 2개의 상이한 희석물들(BNZ-γ 발현 구축물로 형질감염된 HEK293T 세포의 오리지널 상층액의 1:20 희석물 또는 1:50 희석물)과 함께, 또는 IL-3, IL-9, IL-15 또는 IL-4(배양물 내 각각의 사이토카인의 농도는 1 nM임)의 존재 하에 BNZ-γ 펩타이드 없이 인큐베이션하였다.
세포의 성장-반응을, BNZ-γ 펩타이드 및 사이토카인의 도입 후 2일째에 WST-1 검정법을 사용하여 확인하였다. IL-3(비-γc-사이토카인)의 성장-촉진 활성은 BNZ-γ에 의해 저해되지 않았다. 이와는 대조적으로, IL-15 및 IL-9의 활성은 BNZ-γ 펩타이드에 의해 상당히 감소되었다(p<0.01, 스튜던츠 t-테스트). 또 다른 γc-사이토카인인 IL-4에 의해 자극된 세포 증식은 BNZ-γ 펩타이드의 첨가에 의해 영향을 받지 않았다. IL-3, IL-9, IL-15 및 IL-4에 대한 결과를 도 3a에 나타낸다.
유사한 검정법에서, 뮤린 세포주 CTTL2를 사용하였다. 이 검정법에서, 세포를 RPMI 10% 태아 소 혈청 중 0.5 nM의 재조합 IL-2와 함께 배양하였다. 증식 검정법을 세팅하기 위해, 세포를 사이토카인으로부터 3회 세정하였다. 세포를 96-웰 플레이트의 1개 웰 당 1 x 10(5)개 세포로 접종하였으며, IL-2 또는 IL-15의 최종 농도는 50 pM이었다. 다양한 농도의 BNZ-γ 펩타이드(0.1, 1 및 10 ug/ml)를 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 20시간 동안 배양하고, 마지막 4시간에는 3H-티미딘을 플레이트에 첨가하였다. 세포를 플레이트 판독기를 사용하여 수합하였다. 데이터를 도 3b에 나타낸다.
실시예 3 - 세포 증식의 마커로서 3 H-티미딘 혼입을 검정함으로써 γc-사이토카인 활성의 저해를 측정하는 방법
길항제 커스텀 유도체 펩타이드에 의한 지시 세포 집단의 γc-사이토카인-유도 증식의 저해를 3H-티미딘 혼입 검정법에 의해 측정한다. 간략하게는, 방사능표지된 티미딘(1 마이크로Ci)을 사이토카인의 존재 하에 증식을 수행하는 20개 내지 50,000개의 세포에 제공한다. 세포-결합된 방사능을 유리-섬유 필터에 종래의 수합기 장치(예를 들어, Perkin-Elmer사의 Filtermate Universal Harvester)를 사용하여 가두어서(trap) 세포-혼입된 방사능을 측정하고, 이후 방사능을 b-계수기(예를 들어, 1450 Trilux 마이크로플레이트 섬광 계수기)를 사용하여 측정한다.
실시예 4 - 세포 증식의 마커로서 세포-추적자(Cell-Tracker) 염료의 혼입을 검정함으로써 γc-사이토카인 활성의 저해를 측정하는 방법
지시 세포를 선택된 γc-사이토카인의 존재 하에, 또는 선택된 γc-사이토카인 및 선택된 커스텀 유도체 펩타이드의 존재 하에 인큐베이션한다. 그런 다음, 세포 집단을 시험관내에서 세포-추적자 염료, 예를 들어 Invitrogen사의 C2925인 CMFDA를 사용하여 표지하고, 각각의 세포 분열 시 세포 녹색 형광의 붕괴를 유세포분석기(예를 들어, Beckton-Dickinson FACScalibur)를 사용하여 모니터링한다. 전형적으로, γc-사이토카인 자극에 반응하여, 세포가 수행한 분열 횟수에 상응하는 7개 내지 10개의 상이한 피크들이 녹색 형광 채널 상에 나타날 것이다. 세포를 선택된 γc-사이토카인 및 길항제 커스텀 유도체 펩타이드와 함께 인큐베이션하면, 저해도에 따라 피크 수가 불과 1 내지 3까지 감소한다.
실시예 5 - BNZ-γ 및 이의 유도체 길항제에 의한 세포내 신호전달의 저해
세포 증식을 자극하는 것 외에도, γc-사이토카인과 이의 수용체간의 결합은 다양한 세포내 사건들을 야기한다(문헌[Rochman et al. 2009 Nat. Rev. Immunol. 9:480 ~ 90, Pesu et al. 2005 Immunol. Rev. 203:127 ~ 142] 참조). 사이토카인이 이의 수용체에 결합한 직후, Jak3(야누스-키나제 3)로 지칭되는 티로신 키나제가 혈장막에서 수용체로 동원된다. 이 키나제는 γc-하위단위, STAT5(전사의 신호 트랜스듀서 및 액티베이터 5) 및 PI3(포스파티딜이노시톨 3) 키나제의 하위단위를 포함하여 다수의 단백질들의 티로신 잔기를 인산화시킨다. 이 중에서, STAT5의 인산화는 많은 연구들에서 γc-사이토카인에 의해 개시되는 세포 증식과 연관되어 있는 것으로 추정되어 왔다(문헌[Hennighausen and Robinson, 2008 Genes Dev. 22:711 ~ 21]에서 리뷰됨). 이들 공개된 데이터에 따라, BNZ-γ 펩타이드가 IL-15에 의해 자극받은 PT-18β 세포에서 STAT5 분자의 티로신 인산화를 저해하는지의 여부를 검사하였다(결과는 도 3c에 나타나 있음).
PT-18β 세포를 BNZ-γ 펩타이드의 존재 또는 부재 하에 IL-15에 의해 자극하였다. 세포질 단백질을 문헌[Tagaya et al. 1996 EMBO J. 15:4928 ~ 39]에 기재된 바와 같이 종래의 방법에 따라 세포로부터 추출하였다. 추출된 세포질 단백질을 표준 SDS-PAGE(소듐 도데실-설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동)를 사용하여 분해하고(resolve), 인산화 상태를 항-포스포-STAT5 항체(Cell Signaling Technology, 카탈로그 번호 9354, Danvers MA)를 사용하여 면역블로팅(문헌[도 3c, 상부 패널)에 의해 확인하였다. 각각의 레인(lane)이 유사한 총 단백질 로드(load)를 나타냈는지 확인하기 위해, 막을 스트리핑(stripping)하고, 항-STAT5 항체(Cell Signaling Technology, 카탈로그 번호 9358)를 사용하여 재-프로브(re-probe)하였다(도 3c, 하부 패널 참조).
이들 결과는, 신호 전달의 마커인 STAT5의 티로신 인산화가 PT-18β 세포에서 IL-15에 의해 유도되었으며, STAT5의 티로신 인산화가 BNZ-γ 펩타이드에 의해 상당히 감소되었음을 나타내었다.
실시예 6 - BNZ-γ 유도체 길항제 펩타이드에 대한 합리적인 설계
유도체 펩타이드를, 코어 서열 D/E-F-L-E/Q/N-S/R-X-I/K-X-L/I-X-Q(서열 번호: 2)(여기서 X는 임의의 아미노산을 의미함)를 기반으로 하여 상기 코어 서열의 한정된(defined) 아미노산을 도 2에 지정된 바와 같이 동일한 물리화학적 특성을 가진 아미노산으로 치환함으로써 제조한다.
대안적으로, 커스텀 펩타이드들 또는 이의 유도체 펩타이드들을 상이한 γc-사이토카인 패밀리 구성원들의 D-헬릭스 영역의 서열 정렬을 기반으로 제조할 수 있다. 예를 들어 도 5에 나타낸 바와 같이, γc-사이토카인 패밀리(서열 번호: 4 내지 서열 번호: 9) 구성원에 보존된 하나 이상의 서열을 조합하여, 서열 번호: 3과 같은 펩타이드를 형성할 수 있다.
실시예 7 - 길항제 커스텀 유도체 펩타이드의 저해 특이성의 식별 방법
길항제 커스텀 유도체 펩타이드의 γc-사이토카인 저해 특이성을, 6개의 γc-사이토카인 각각에 대한 사이토카인-반응성 세포주의 증식 반응을 저해하는 커스텀 유도체 펩타이드의 능력을 검정함으로써 확인한다. 예를 들어, 마우스 세포주인 CTLL-2를 사용하여 후보 펩타이드가 IL-2 및 IL-15의 기능을 저해하는지 확인한다. PT-18(β) 세포를 사용하여 후보 펩타이드가 IL-4 및 IL-9의 기능을 저해하는지 확인한다. PT-18(7α) 세포를 사용하여 후보 펩타이드가 IL-7의 기능을 저해하는지 확인하고, PT-18(21α) 세포를 사용하여 후보 펩타이드가 IL-21의 기능을 저해하는지 확인한다. PT-18(β)는, 유전자 형질감염에 의해 인간 IL-2Rβ를 외인적으로 발현하는 PT-18 세포의 서브클론을 의미하며(문헌[Tagaya et al. 1996]), PT-18(7α)는 유전자 형질감염에 의해 인간 IL-7Rα를 발현하는 서브클론을 의미하고, PT-18(21Rα) 세포는 인간 IL-21Rα를 발현한다.
또 다른 대안적인 방법은, 다수의 사이토카인들에 반응하는 다른 세포주들을 사용하는 것이다. 이러한 세포주의 일례는 ATCC에 의해 상업적으로 입수 가능한 인간 NK 세포주 NK92(카탈로그 번호 CRL-2407)이다. 이러한 세포주는, IL-9, IL-7, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21을 포함하는 다른 사이토카인들에 반응하는 IL-2-의존적 세포주이다(문헌[Gong et al. 1994 Leukemia 8: 652 ~ 658, Kingemann et al., 1996, Biol Blood Marrow Transplant 2:68;75, Hodge DL et al., 2002 J. Immunol. 168:9090 ~ 8]).
실시예 8 - γc-길항제 펩타이드의 제조
커스텀 유도체 γc-길항제 펩타이드를 매뉴얼 과정 및 자동화된 과정에 의해 화학적으로 합성한다.
매뉴얼 합성: 하나의 아미노산의 카르복실기 또는 C-말단을 또 다른 아미노산의 아미노기 또는 N-말단에 커플링하는 단계를 수반하는 전형적인 액체상 합성을 이용한다. 대안적으로, 고체상 펩타이드 합성(SPPS)을 이용한다.
자동화된 합성: 많은 회사들이 자동화된 펩타이드 합성을 유료로 제공한다. 이들 회사는 Applied Biosystems(ABI)사에 의해 제공되는 합성기를 포함하여 다양한 상업용 펩타이드 합성기들을 사용한다. 커스텀 유도체 γc-길항제 펩타이드를 자동화된 펩타이드 합성기에 의해 합성한다.
실시예 9 - 커스텀 유도체 γc-길항제 펩타이드의 생물학적 제조
재조합 기술을 이용
커스텀 유도체 γc-길항제 펩타이드를, 적절한 태깅(tagging) 펩타이드, 신호 펩타이드, 또는 BNZ-γ 펩타이드 또는 서열 번호: 3의 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이들의 유도체의 구조를 증강시키거나 안정화시켜 이들의 생물학적 활성을 개선하는 것으로 공지된 인간 단백질 유래의 펩타이드로 구성된 프로-펩타이드로서 생물학적으로 합성한다. 요망되는 경우, 펩타이드의 N-말단 앞의 적절한 효소-절단 서열은 태그 또는 펩타이드의 임의의 일부를 최종 단백질로부터 제거하도록 설계되어야 한다.
3' 말단에 정지 코돈을 포함하며 커스텀 유도체 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을, 이. 콜라이의 티오레독신 유래의 태그 부분, 및 상기 태그 부분과 커스텀 유도체 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 정지 코돈 사이에 개입되어 있는 적절한 단백분해 효소(예를 들어 엔테로키나제)에 의해 인지되고 분해되는 특수한 펩타이드 서열을 포함하는 상업적인 벡터 내로 삽입한다. 적합한 벡터의 일례는 미국 캘리포니아 소재의 Invitrogen사로부터 입수 가능한 pThioHis 플라스미드이다. 다른 발현 벡터가 사용될 수도 있다.
실시예 10 - 커스텀 펩타이드 및 유도체를, 상기 커스텀 펩타이드에 대한 항체의 면역화 및 생성을 위해 담체 단백질에 컨쥬게이션한다
BNZ-γ 및 다른 커스텀 유도체 펩타이드, 예컨대 서열 번호: 3의 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이의 유도체를 사용하여 동물에게 면역화하여, 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 수득한다. 펩타이드를 적절한 담체 단백질(예를 들어, 소 혈청 알부민, 키홀드 림펫 혈색소(KLH) 등)의 N-말단 또는 C-말단에, 글루타르알데하이드 또는 m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르를 사용하는 종래의 방법들에 의해 컨쥬게이션한다. 그런 다음, 적절한 보조제와 함께 컨쥬게이션된 펩타이드를 사용하여 토끼, 설치류 또는 당나귀와 같은 동물을 면역화한다. 생성된 항체를 종래의 방법을 사용하여 특이성에 대해 검사한다. 생성된 항체가 면역원성 펩타이드와 반응하는 경우, 이러한 항체를 실시예 1 내지 실시예 3에 기재된 세포 증식 검정법에 따라 개별 γc-사이토카인 활성을 저해하는 능력에 대해 시험한다. 유도체 펩타이드의 합성 성질로 인해, 이들 펩타이드의 합성 성질 때문에 2개의 상이한 사이토카인들을 동시에 인지하는 단일 항체를 생성할 수 있다.
실시예 11 - 커스텀 유도체 γc-길항제 펩타이드의 대규모 제조 방법
재조합 단백질을 어느 문헌에서나 기재된 바와 같이 세포-무함유 시스템을 사용하여 대규모로 제조한다(문헌[Takai et al., 2010 Curr. Pharm. Biotechnol. 11(3):272 ~ 8] 참조). 간략하게는, γc-길항제 펩타이드를 인코딩하는 cDNA 및 태그를 적절한 벡터 내로 서브클로닝하고(문헌[Takai et al., 2010 Curr. Pharm. Biotechnol. 11(3):272 ~ 8] 참조), 이를 시험관내에서 전사시키고, 그런 다음 바로 시험관내 번역을 수행하여, 태깅된 펩타이드를 제조한다. 그런 다음, 프로-폴리펩타이드를 태깅된 에피토프를 인지하는 고정된 항체를 사용하여 정제하고, 단백분해 효소에 의해 처리한 다음, 용리물(주로 관심 커스텀 유도체 펩타이드를 함유함)을 종래의 18% Tricine-SDS-PAGE(Invitrogen) 및 종래의 쿠마시 염색을 사용하여 순도에 대해 시험한다. 펩타이드의 요망되는 순도(98% 초과)가 충족되지 않는 경우, 혼합물을 추가의 정제를 위해 종래의 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)로 처리한다.
실시예 12 - HAM/TSP에서 사이토카인 기능을 차단하기 위한 커스텀 유도체 γc-길항제 펩타이드의 용도
HTLV-1-연관 골수병(HAM)/열대성 강직 하반신마비(TSP)는 인간 T-림프친화성 바이러스 유형 I(HTLV-I)에 의해 감염된 일부 인간들에서 관찰되는 만성 진행성 골수병이다. 척수에 림프구가 침윤되는 것은 HTLV-I에 대한 면역 반응, 및 소정의 사이토카인의 방출 결과와 연관이 있다. 이들 사이토카인 중 일부는 신경을 손상시킬 수도 있다.
HAM/TSP 환자는 자가면역 질병에서 관찰되는 것과 유사한 면역계의 상승된 상태를 보여준다(문헌[Oh et al. 2008 Neurol Clin. 26:781 ~ 785]). 이러한 상승된 상태는 HAM/TSP 환자의 T-세포가 외인성으로 첨가되는 사이토카인의 부재 시에도 생체외 배양물에서 약 1주일 동안 자발적 증식을 수행하는 능력에 의해 나타난다. HAM/TSP 환자에서 T-세포의 자발적 증식은 적어도 부분적으로, IL-2, IL-9 및 IL-15의 자가분비/측분비 루프로 인한 것이다. IL-2 또는 IL-15 수용체에 대한 차단성 항체를 첨가하면, HAM/TSP 생체외 배양 시스템에서 자발적인 T-세포 증식을 저해할 수 있는 것으로 나타나 있다.
이들 관찰은, 생체외 연구로부터 유래된 다른 데이터와 더불어, HAM/TSP 치료를 위한 임상에 2개의 모노클로날 항체들(항-IL-2 수용체 알파 또는 항-Tac 및 항-IL-15 수용체 베타 사슬)을 채택하는 근거를 제공하였다(문헌[Azimi et al. 2001 Proc. Natl. Acad. Sci. 98:14559 ~ 64., Azimi et al., 1999 J. Immunol 163:4064 ~ 72]).
본원에 기재된 실시형태에 따른 항-사이토카인 수용체 길항제는 HAM/TSP의 치료를 위한 치료용 면역-조정제로서 중요할 뿐만 아니라, HAM/TSP에서 본 실시형태에 따른 항-사이토카인 수용체 길항제에 의한 면역 반응의 조정은 다른 자가-면역 질병의 치료에서 본 실시형태에 따른 항-사이토카인 수용체 길항제의 용도에 대한 개념 증명(proof-of-concept)으로서 작용할 것이다.
본원에 기재된 실시형태에 따른 커스텀 유도체 γc-길항제 펩타이드의 효능을 알아보기 위해, 본 발명자들은 HAM/TSP 생체외 배양 시스템을 사용하여 자발적 T-세포 증식 검정법에서 HTLV-I에 대한 면역 반응을 차단하는 BNZ-γ 펩타이드의 능력을 시험하였다. 증식 검정법을 BNZ-γ의 첨가와 함께, 그리고 첨가 없이 HAM/TSP 환자 혈액 시료 상에서 수행하였다. 이들 검정법은 생체외 HAM/TSP 환자의 혈액 배양물에 존재하는 IL-2 및 IL-15와 같은 사이토카인의 기능을 차단하고 이들 시료에서 자발적인 T-세포 증식을 예방하는 BNZ-γ의 능력을 평가하였다.
생체외에서의 자발적인 T-세포 증식 검정법에서, HAM/TSP 환자 유래의 PBMC를 96-웰 플레이트의 1개 웰 당 1 x 10(6)개 세포로 RPMI-10% FCS 내에서 배양하였다. 증가하는 농도의 BNZ-γ 펩타이드를 각각의 웰에 첨가하였다. 대조군으로서, 관련이 없는 펩타이드를 유사한 방식으로 사용하였다. 세포를 37°C CO2 인큐베이터에서 3일, 4일 및 6일 동안 인큐베이션하였다. 1 uCi 양의 3H-티미딘을 세포에 첨가하였다. 6시간 동안 더 인큐베이션한 후, 세포를 수합하여, 이들 세포의 증식 속도를 측정하였다. 대표적인 HAM/TSP 환자에 대한 데이터를 도 4a 내지 도 4d에 나타낸다. 도 4a 내지 도 4d에 나타낸 바와 같이, BNZ-γ 펩타이드는 약 1 ug/ml의 농도에서, HAM/TSP 배양물에서의 T-세포의 자발적인 증식을 저해한다.
다른 면역학적 마커들을 이 검정법에서 부가적으로 측정하였다. 바이러스 특이적 CD8 세포의 퍼센트를 생체외 배양 동안 바이러스 단백질 4량체를 사용하여 측정하였다. T-세포 활성화의 마커인 CD4+CD25+ 세포 집단, 및 T-세포 증식의 마커인 Ki67 염색을 유세포 검정법에서 모니터링하였다.
다른 형태의 컨쥬게이션된 BNZ-γ 펩타이드 유도체 또는 서열 번호: 3의 서열을 포함하는 커스텀 펩타이드, 및 이들의 유도체를 유사한 향후 검정법에 사용할 수 있다. 이들은 화학적 합성 후 펩타이드에 컨쥬게이션될 수 있는 PEG, BSA, 알부민을 포함한다. 다른 생물학적 형태의 커스텀 펩타이드, 예컨대 BNZ-γ 펩타이드 컨쥬게이트 또는 서열 번호: 3의 서열을 포함하는 커스텀 펩타이드, 및 이들의 유도체는, 커스텀 펩타이드에 융합된 공지된 단백질 엔터티 영역(비제한적으로 인간 IgG의 Fc 영역을 포함함)을 포함할 수 있다.
실시예 13 - 인간 환자에서 커스텀 유도체 γc-길항제 펩타이드의 투여에 의한 성인 T-세포 백혈병(ATL)치료 방법
성인 T-세포 백혈병을 앓고 있는 인간 환자를 식별한다. 의사에 의해 결정된 바와 같은 커스텀 유도체 γc-길항제 펩타이드, 예를 들어 BNZ-γ, 서열 번호: 3의 서열을 포함하는 커스텀 펩타이드, 또는 이들의 유도체의 유효 용량을 의사에 의해 결정된 기간 동안 환자에게 투여한다. 환자가 차도를 보인다면, 치료가 효과적인 것으로 결정된다.
실시예 14 - 인간 환자에서 커스텀 유도체 γc-길항제 펩타이드의 투여에 의한 HAM/TSP의 치료 방법
HAM/TSP를 앓고 있는 인간 환자를 식별한다. 의사에 의해 결정된 바와 같은 커스텀 유도체 γc-길항제 펩타이드, 예를 들어 BNZ-γ, 서열 번호: 3의 서열을 포함하는 커스텀 펩타이드, 또는 이들의 유도체의 유효 용량을 의사에 의해 결정된 기간 동안 환자에게 투여한다. 환자의 증상이 개선되거나 질병의 진행이 중단되었거나 늦춰졌다면, 치료가 효과적인 것으로 결정된다.
실시예 15 - 사이토카인 기능을 차단하기 위한 커스텀 유도체 γc-길항제 펩타이드의 용도
적어도 IL-15 및 IL-21의 기능을 감소시킬 필요가 있는 인간 환자를 식별한다. 의사에 의해 결정된 바와 같은 커스텀 유도체 γc-길항제 펩타이드, 예를 들어 서열 번호: 3의 서열을 포함하는 합성 펩타이드, 또는 이들의 유도체의 유효 용량을 의사에 의해 결정된 기간 동안 환자에게 투여한다. 환자의 증상이 개선되거나 질병의 진행이 중단되었거나 늦춰졌다면, 치료가 효과적인 것으로 결정된다.
실시예 16 - 인간 환자에서 커스텀 유도체 γc-길항제 펩타이드의 투여에 의한 소아 지방변증의 치료 방법
소아 지방변증을 앓고 있는 인간 환자를 식별한다. 의사에 의해 결정된 바와 같은 커스텀 유도체 γc-길항제 펩타이드, 예를 들어 서열 번호: 3의 서열을 포함하는 합성 펩타이드, 또는 이들의 유도체의 유효 용량을 의사에 의해 결정된 기간 동안 환자에게 투여한다. 환자의 증상이 개선되거나 질병의 진행이 중단되었거나 늦춰졌다면, 치료가 효과적인 것으로 결정된다.
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Claims (32)

  1. 2개의 인터루킨(IL) 단백질 감마-c-박스(box) D-헬릭스(helix) 영역의 아미노산 서열을 포함하는 합성(composite) 펩타이드로서, 여기서 합성 펩타이드는 아미노산 서열 P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(서열 번호: 3)를 포함하는 것을 특징으로 하되,
    상기 합성 펩타이드는, IL-15 및 IL-21의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는, 합성 펩타이드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 합성 펩타이드는 신호 펩타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 합성 펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 합성 펩타이드는 추가로, 상기 합성 펩타이드의 N-말단, C-말단 또는 측 잔기(side residue)에서 하나 이상의 부가적인 모이어티에 컨쥬게이션(conjugation)되는 것을 특징으로 하는, 합성 펩타이드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 부가적인 모이어티는 소 혈청 알부민(BSA), 알부민, 키홀드 림펫 혈색소(KLH; Keyhold Limpet Hemocyanin), IgG의 Fc 영역, 스캐폴드(scaffold)로서 작용하는 생물학적 단백질, 세포-특이적 항원에 대한 항체, 수용체, 리간드, 금속 이온 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 합성 펩타이드.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
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  11. 삭제
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  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 환자에서의 질환 치료용 키트로서,
    상기 질환은 γc-사이토카인-매개 질병, HTLV-1-연관 골수병(HAM)/열대성 강직 하반신마비(TSP)-연관 질병, 염증성 호흡기 질병 또는 이들의 조합이며,
    상기 키트는 제1항 및 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 합성 펩타이드; 및
    약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 이들의 조합을 포함하고,
    상기 합성 펩타이드는, IL-15 및 IL-21의 활성을 저해하고,
    상기 합성 펩타이드는, 아미노산 서열 P-K-E-F-L-E-R-F-V-H-L-V-Q-M-F-I-H-Q-S-L-S(서열 번호: 3)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 치료용 키트.
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 제29항에 있어서, 상기 질환은 CD4 백혈병, CD8 백혈병, LGL 백혈병, 전신 홍반성 루푸스, 쇼그렌 증후군, 염증성 장질환, 중증 근무력증, 베게너 육아종증, 소아 지방변증, 하시모토 갑상선염, 류마티스 관절염, 당뇨병, 건선, 다발성 경화증, 포도막염, 눈의 염증, 이식편대숙주병(GvHD), 성인 T-세포 백혈병(ATL), HTLV-연관 골수병/열대성 강직 하반신마비(HAM/TSP), 및 HTLV와 연관된 다른 비-신생물성 염증 질병, 예컨대 포도막염(HU), 관절증, 폐병증, 피부염, 외분비병증, 근염, 천식, 부비동염, 건초열, 기관지염, 만성 폐색성 폐질환(COPD), 알레르기성 비염, 급성 및 만성 이염, 및 폐 섬유증, 여드름, 탈모 및 일광 화상 중 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 치료용 키트.
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Class et al. Patent application title: COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING GAMMA-C-CYTOKINE ACTIVITY Inventors: Yutaka Tagaya (Rockville, MD, US) Nazli Azimi (San Juan Capistrano, CA, US) Nazli Azimi (San Juan Capistrano, CA, US)

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