KR102365464B1

KR102365464B1 - 지카바이러스 재조합 서브유닛 백신의 개발 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102365464B1
Application number: KR1020190174075A
Authority: KR
Inventors: 한태욱; 신민나; 홍은진
Original assignee: 강원대학교산학협력단; 대한민국(질병관리청장)
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2022-02-22
Also published as: KR20210082306A

Abstract

본 발명은 지카바이러스의 외피 단백질을 발현시킬 수 있도록 재조합한 벡터를 제작하여 클로닝한 후 대장균을 형질전환하여 생산된 지카바이러스 EDⅢ(Envelope protein domain Ⅲ) 단백질을 포함하는 재조합 백신 조성물에 관한 것으로, 상기 재조합 백신 조성물을 마우스에 접종한 후 분리한 비장세포는 사이토카인인 IFN-γ, IL-12, 및 TNF-α의 생산이 증가되고, 상기 재조합 백신 조성물을 2회 또는 3회 반복 투여하였을 때 지카바이러스 EDⅢ 단백질을 인식하는 항체의 항체가가 증가하는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 재조합 백신 조성물은 지카바이러스에 대해 세포성 면역 및 체액성 면역을 유도하여 지카바이러스 감염에 대한 면역학적 방어 및 예방에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

지카바이러스 재조합 서브유닛 백신의 개발 및 이의 제조방법 {Development of recombinant subunit Zika virus vaccine and preparing method thereof}

본 발명은 지카바이러스의 재조합 서브유닛 백신 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

지카바이러스(Zika virus)는 모기를 매개체로 한 바이러스 중 하나이며, 단일 (+)가닥 RNA 바이러스(single positive-stranded RNA virus)로, 플라비비리데과(Flaviviridae family)의 하위 속인 플라비바이러스속(Flavivirus genus)에 해당하고, Guillain-Barre 증후군과 같은 소두증 및 신경 합병증 등의 태아, 신생아의 선천성 기형을 유도하는 전염병이다.

지카바이러스는 1952년 Nigeria에서 인간에게 처음 감염된 것으로 기록되어 있으며, 2013년 남태평양의 Polynesia에서 뎅기열을 수반한 전염병이 크게 나타나게 되고, 이 바이러스는 나중에 South pacific까지 퍼지게 되어 2015년 초 Brazil 18개주에서 발생한 후 Colombia 등 중앙아메리카 및 북아메리카까지 자생적으로 전염되었다. 지카바이러스는 크게 Asian lineage 와 African lineage 총 2가지로 나누어지는데 2015년 초 전 세계적으로 대두되었던 Brazil 및 중앙아메리카, 카리브해 근처에서 나타난 지카바이러스는 Asian lineage의 바이러스로 확인되었다. 지카바이러스는 수 십 년간 존재해왔지만 2013년 프랑스령 폴리네시아에서 발생한 이래 감염력 및 병원성이 증가하여 위험성이 대두되었고, 2015년 5월 브라질에서 첫 보고 후 중남미에서 급격히 확산되며 2015년 이후 발생국가 53개국이고 의심 및 진단 진행 중인 5천여 건에 달하는 등 감염이 지속적으로 확산 추세에 있다.

지카바이러스가 인간에서 질병을 유발한 경우, 미열, 발진, 두통, 결막염, 근육통, 관절통으로 나타나는 자가한 정적 열성 질환(self-limited febrile illness)이 발생한다. 최근에는, 지카바이러스의 감염이, 태아 및 유아 에서의 소두증 발현의 증가, 및 성인에서의 길랑바레 증후군(Guillain-Barre syndrome)과 관련이 있음이 밝혀졌다. 지카바이러스 질병에 대한 잠복기는 정확히 알려져 있지 않지만, 수일에서 일주일 정도일 것으로 예상되며, 일반적으로 가벼운 증상으로 수일에서 일주일 정도 지속된다. 지카바이러스는 일반적으로 감염된 사람의 혈액 속에 약 일주일 동안 머물러 있지만 일부 사람들에게는 더 오랜 기간 동안 머물러 있을 수도 있다.

지카바이러스와 같은 플라비바이러스는 모두 공통의 구조를 가지고 있는데, 구형(Spherical)의 구조로 크기는 40~65 nm 이며, 약 10,000~11,000개의 염기(base)로 구성되어 있다. 외피 단백질(envelope protein)과 정이십면체형의 캡시드 단백질(icosahedral-like nucleocapsid protein)은 대칭형태이며, 바이러스의 외형은 전자현미경으로 관찰이 가능하다. 플라비바이러스를 구성하는 단백질은 크게 구조단백질(structural protein)과 비구조단백질(nonstructural protein)로 분류할 수 있으며, 구조단백질에는 캡시드 단백질(capsid protein), 전구체 막 단백질(precursor membrane protein), 막 단백질(membrane protein), 외피 단백질(envelope protein) 등이 있으며, 비구조단백질에는 비구조단백질 1(non-structural protein 1, NS1), 비구조단백질 2A(NS2A), 비구조단백질 2B(NS2B), 비구조단백질 3(NS3), 비구조단백질 4A(NS4A), 비구조단백질 4B(NS4B), 비구조단백질 5(NS5) 등이 있다. 아직까지 모든 단백질의 기능이나 역할이 규명되지는 않았지만, 전구체 막 단백질, 외피 단백질, 비구조 단백질 1, 비구조단백질 2A 및 2B의 일부, 비구조단백질 4A 및 4B의 일부가 바이러스 외부에 노출되어 있는 것으로 파악되고 있다.

최근에는 지카바이러스에 대응할 백신의 개발로서 살아있는 병원체의 독성을 약화시킨 불활성화 백신 또는 증식능을 없앤 사균백신을 통한 백신 개발이 진행 중에 있다. 생백신 또는 사백신으로 대표되는 기존의 백신은 증식능 및 독성을 나타낼 수 있다는 단점이 있다. 재조합 서브유닛 백신은 생백신, 사백신보다 안전하며, 대량발현이 가능하다는 장점이 있는데 특히 대장균(E.coli) 재조합 발현 시스템의 경우 저렴한 균주 유지비용과 단순한 배지 조성 및 배양 조건, 생산 공정의 단순화 등의 장점이 있다. 현재까지 다른 바이러스에 대한 재조합 백신은 개발되었으나, 지카바이러스에 대한 재조합 서브유닛 백신은 아직 허가된 것이 없다.

따라서, 생체 내 부작용을 최소화하고 생산 비용을 절감 할 수 있는 지카바이러스 재조합 서브유닛 백신에 대한 연구가 필요한 실정이다.

한국등록특허공보 제2012123호

본 발명자들은 생체 내 부작용을 최소화 할 수 있는 지카바이러스에 대한 새로운 백신 조성물을 개발하고자 하였으며, 균체 대비 30~50% 정도의 높은 비율로 재조합 단백질의 생산이 가능할 뿐 아니라 인간에 적용되기 위한 단백질 완성도가 높고, 증식능 및 독성이 없기 때문에 보다 안전하다는 장점이 있는 대장균(E.coli) 발현 시스템을 이용하여 지카바이러스의 주요 면역원성 유발 항원 부위인 지카바이러스 EDⅢ(Envelope protein domain Ⅲ) 부분을 발현하도록 재조합 벡터를 제조하고, 이를 발현시켜 생산한 지카바이러스 EDⅢ 단백질을 마우스에 접종하였을 때 사이토카인 및 항체의 생산이 증가하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지카바이러스 EDⅢ을 발현하는 것을 특징으로 하는, 지카바이러스 백신 제조용 재조합 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지카바이러스 EDⅢ을 포함하는, 지카바이러스 감염 예방용 백신 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ(Envelope protein domain Ⅲ)을 암호화하는 유전자를 포함하는, 지카바이러스 백신 제조용 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ(Envelope protein domain Ⅲ)을 포함하는, 지카바이러스 감염 예방용 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 지카바이러스는 브라질(Brazil) 유래인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 백신 조성물은 면역증강제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 면역증강제는 Alum 및 MPL(monophosphoryl lipid A)의 혼합물일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 Alum 및 MPL은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ에 대하여 각각 1:40 내지 60(Alum) 및 1:1 내지 3(MPL)의 비율로 포함될 수 있다.

상기 Alum 및 MPL은 20 내지 30:1 내지 3의 중량 비율로 혼합될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 백신 조성물은 지카바이러스에 대한 사이토카인 생산을 유도할 수 있고, 상기 사이토카인은 인터페론-감마(IFN-γ), 인터루킨-12(IL-12), 및 종양괴사인자 알파(TNF-α)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 백신 조성물은 지카바이러스에 대한 항체의 생산을 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 항체는 모체 이행 항체일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 백신 조성물은 지카바이러스 또는 뎅기 바이러스(Dengue virus, DENV)에 대한 중화항체의 생산을 유도할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 백신 조성물은 뎅기 바이러스(Dengue virus, DENV)에 대한 교차방어 효능을 가질 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ(Envelope protein domain Ⅲ)을 암호화하는 유전자를 프로모터에 작동 가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; 및

상기 재조합 발현 벡터로 대장균(E.coli)을 형질전환 하는 단계; 및

상기 대장균으로부터 생산된 지카바이러스 EDⅢ 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 지카바이러스 감염 예방용 백신 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 재조합 발현 벡터는 대장균(E.coli) 발현 시스템을 이용한 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ을 포함하는 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 지카바이러스 감염 예방 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ을 포함하는 백신 조성물의, 지카바이러스 감염 예방 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ의, 지카바이러스 감염 예방에 이용되는 백신을 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 백신 조성물은 지카바이러스의 EDⅢ(Envelope protein domain Ⅲ)을 포함하며, 상기 재조합 백신 조성물을 마우스에 접종한 후 분리한 비장세포는 사이토카인인 IFN-γ, IL-12, 및 TNF-α의 생산이 증가되고, 상기 재조합 백신 조성물을 2회 또는 3회 반복 투여하였을 때 지카바이러스 EDⅢ을 인식하는 항체의 항체가가 증가하는 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 재조합 백신 조성물은 지카바이러스에 대해 세포성 면역 및 체액성 면역을 유도하여 지카바이러스 감염에 대한 면역학적 방어 및 예방에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ의 발현을 위해 제조한 재조합 발현 벡터 pET-30a(+)의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2a는 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ의 분자량을 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ의 발현을 western blot을 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2c는 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ을 BSA를 이용하여 정량한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 백신 후보물질(Brazil-EDⅢ)의 반복 접종 시 발생하는 세포성 면역 반응을 관찰하기 위한 실험 과정을 도식화한 것이다.
도 4a 내지 4b는 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ을 1회(도 4a), 2회(도 4b) 접종한 후 각각의 항원으로 자극하였을 때 IFN-γ 생산 면역세포를 ELISPOT assay를 통해 측정한 결과(도 4a 내지 4b의 좌측 도면) 및 접종 항원으로 재자극 하였을 때 발생한 spot의 수를 정량화한 결과(도 4a 내지 4b의 우측 도면)를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ을 1회 접종한 후 각각의 항원으로 자극하였을 때 IL-12 생산 면역세포를 ELISPOT assay를 통해 측정한 결과(도 5의 좌측 도면) 및 접종 항원으로 재자극 하였을 때 발생한 spot의 수를 정량화한 결과(도 5의 우측 도면)를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 6b 는 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ을 1회(도 6a), 2회(도 6b) 접종한 후 각각의 항원으로 재자극했을 때 IFN-γ 생산량을 ELISA assay를 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a 내지 7b는 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ을 1회(도 7a), 2회(도 7b) 접종한 후 각각의 항원으로 재자극했을 때 IL-12 생산량을 ELISA assay를 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 8b는 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ을 1회(도 8a), 2회(도 8b) 접종한 후 각각의 항원으로 재자극했을 때 TNF-α 생산량을 ELISA assay를 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9a 내지 9f는 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ을 접종한 마우스로부터 분리한 비장 면역세포에서 CD4⁺ 및 CD8⁺ 표지 세포를 유세포분석기를 사용하여 측정한 것으로, 1회 접종 시 CD3⁺CD4⁺T cell (도 9a) 및 CD3⁺CD8⁺T cell(도 9b), 2회 접종 시 CD3⁺CD4⁺T cell (도 9c) 및 CD3⁺CD8⁺T cell (도 9d), 3회 접종 시 CD3⁺CD4⁺T cell (도 9e) 및 CD3⁺CD8⁺T cell (도 9f)을 측정하여 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ의 반복 접종 시 발생하는 체액성 면역 반응을 관찰하기 위한 실험 과정을 도식화한 것이다.
도 11a 및 11b는 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ의 2회(도 11a) 및 3회(도 11b) 접종 시 지카바이러스 EDⅢ 인지 항체의 항체가를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11c는 도 11a 및 11b에서의 항체가를 측정하기 위해 사용한 ELISA kit의 standard 결과(좌측 도면) 및 standard값에 따른 정량 결과(우측 도면)를 나타낸 것이다.
도 12a는 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ의 접종 후 Zika virus-specific subclass 항체(IgG1, IgG2c)를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12b는 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ의 접종에 따른 Th1/Th2 IgG isotype 비율을 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ 접종 후 Uganda strain, Puerto Rico strain, 또는 DENV에 대한 중화항체 유도 수준을 확인한 도면이다.
도 14는 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ 접종 마우스의 새끼 마우스에서 Uganda strain, Puerto Rico strain, 또는 DENV에 대한 생존율 및 체중 변화를 확인한 도면이다.
도 15는 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ 접종 마우스의 새끼 마우스에서 Uganda strain, Puerto Rico strain, 또는 DENV 접종에 의한 혈액 내 바이러스 양을 확인한 도면이다.
도 16은 본 발명의 일 구현예에 따른 Brazil-EDⅢ 접종 마우스의 새끼 마우스에서 모체 이행 항체를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ(Envelope protein domain Ⅲ)을 암호화하는 유전자를 포함하는, 지카바이러스 백신 제조용 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 대장균으로부터 지카바이러스 EDⅢ 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 지카바이러스 감염 예방용 백신 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA의 발현을 수행할 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 구조물을 의미한다. 적합한 조절 서열은 전사를 수행하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 본 발명의 벡터는 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있고, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 플라스미드인 대장균 발현 벡터를 이용할 수 있으나, 숙주 내에서 복제 가능한 것이면 이에 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, "재조합 벡터"는 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주에서 발현 가능할 수 있다. 숙주의 종류에 따라 프로모터 (promotor), 종결자 (terminator), 인핸서 (enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 숙주는 바람직하게는 원핵생물일 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 대장균(E. Coli)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된” 이라는 용어는 발현이 필요한 유전자와 이의 조절 서열이 서로 기능적으로 결합되어 유전자 발현을 가능케 하는 방식으로 연결되는 것을 말한다.

본 발명에서 용어 "프로모터 (promotor)"는 전사조절인자들이 결합하는 DNA 염기서열 부위로 유전자 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미하며, 목적 유전자의 과발현을 유도하기 위한 것이다. 상기 프로모터의 예로는 프리브노 박스 (Pribnow box), 타타박스 (TATA box) 등이 있으며, 본 발명에 있어서 상기 프로모터는 당업계에 공지된 임의의 프로모터를 이용할 수 있고, 이의 종류에 특별히 제한은 없다.

본 발명에서 사용되는 용어 "발현"은 폴리펩타이드 (polypeptide)가 구조 유전자로부터 생산되는 과정을 지칭하며, 상기 과정은 유전자의 mRNA로의 전사, 및 이러한 mRNA의 폴리펩타이드(들)로의 해독을 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 의해 제조된 재조합 벡터로 형질전환 된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 "형질전환(transformation)"이란, 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "지카바이러스(Zika virus)"는 뎅기열을 유발하는 바이러스와 동일한 플라비바이러스(Flavivirus) 속(genus)의 positive sense single strand RNA 바이러스로 이집트숲모기가 주된 감염 매개체이나 국내 서식하는 흰줄숲모기도 잠재적으로 전파가능한 바이러스이며, 댕기열, 뇌척수염, 신경손상, 뇌막염 등의 원인이 되고, 임산부가 감염되는 경우 태아 소두증 증상이 나타난다. 본 발명에 있어서, 상기 지카바이러스는 브라질(Brazil) 유래인 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 지카바이러스의 "EDⅢ(Envelope protein domain Ⅲ)"은 지카바이러스를 구성하고 있는 단백질 중 하나인 외피 단백질의 도메인으로, 지카바이러스의 주요 면역원성 유발 항원 부위이다.

본 발명에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 지카바이러스 EDⅢ은 브라질(Brazil) 유래 지카바이러스의 외피 단백질(Brazil-EDⅢ)이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "감염"은 바이러스와 같은 병원성 미생물이 숙주가 되는 생물체의 체내에 침입하여 발육, 증식하는 것으로, 사람이나 동물, 식물의 조직, 체액, 표면에 정착하여 증식하는 것을 의미하며, 그 결과 숙주는 병리학적인 변화를 받아 질병이 발생할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "백신"은 동물에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적으로 활성인 성분을 함유하는 약학적 조성물을 의미한다. 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 살아있는 바이러스 또는 죽은 바이러스의 적절한 요소를 함유할 수 있고(서브유닛 백신), 이에 의해 이들 요소는 전체 바이러스 또는 이의 성장 배양물을 파괴하고, 이어서 원하는 구조물(들)을 수득하는 정제 단계에 의해, 또는 제한되는 것은 아니지만 박테리아, 곤충, 포유동물 또는 다른 종과 같은 적절한 시스템의 적절한 조작에 의해 유도된 합성과정 및 이어서 단리 및 정제과정에 의해, 또는 적절한 약학적 조성물을 사용하여 유전자 물질의 직접적인 혼입에 의한 백신을 필요로 하는 동물에서 상기 합성 과정의 유도에 의해 (폴리뉴클레오타이드 백신화) 제조된다.

백신은 상기 기술된 요소의 하나 또는 하나 이상을 포함할 수 있으며, 당업계에 알려져 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 백신은 유전자 재조합을 통해 제조된 재조합 벡터를 숙주세포에 발현시켜 발현된 단백질을 수득하는 단계를 통해 제조될 수 있으며, 본 발명의 백신은 당업계에 알려진 임의의 형태, 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 제제는 또한 리포좀이나 가용 유리 내로 유화 또는 캡슐화되거나 에어로졸이나 스프레이 형태로도 제조될 수 있다. 이들은 경피(transdermal) 패치에 함유시킬 수도 있다.

본 발명에 따른 백신은 필요에 따라, 약학적으로 허용되는 백신보호제, 면역강화제, 희석제, 흡수촉진제 등을 포함할 수 있다. 상기 백신보호제는, 예컨대, 락토오스 포스페이트 글루타메이트 젤라틴 혼합물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 백신이 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양(예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.

이때, "약학적으로 허용되는" 이란 생리학적으로 허용되고 개체에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성인 것을 의미한다.

상기 백신은 경구, 경피, 근육내, 복막내, 정맥내, 피하내 등의 투여경로를 통해 투여될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 예컨대, 경구 또는 근육 투여경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 면역증강제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "면역증강제(adjuvant)"는 DNA 플라스미드 및 인코딩 핵산 서열에 의해 인코딩된 지카바이러스 EDⅢ 항원의 항원성을 증강하기 위해 지카바이러스 EDⅢ 단백질을 포함하는 재조합 백신 조성물에 부가되는 임의의 물질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 면역증강제로 사용하는 물질에는 특별히 제한이 없으며, 예컨대 명반(Alum), MPL(monophosphoryl lipid A), 수산화 알루미늄, 광유 또는 다른 오일 또는 백신에 첨가되거나 이러한 추가의 성분에 의해 각각의 유도 후 신체에 의해 발생되는 보조 분자일 수 있고, 바람직하게는 Alum 및 MPL의 혼합물일 수 있다. 이 때 상기 Alum 및 MPL은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ에 대하여 각각 1:40 내지 60(Alum) 및 1:1 내지 3(MPL)의 비율로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 1:50(Alum) 및 1:2(MPL)의 비율로 포함될 수 있고, 상기 Alum 및 MPL은 20 내지 30:1 내지 3의 중량비율로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 25:1의 비율로 혼합될 때 가장 면역능이 높을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 백신 조성물은 지카바이러스에 대한 사이토카인 생산을 유도할 수 있고, 상기 사이토카인은 인터페론-감마(Interferon-gamma, 이하 IFN-γ), 인터루킨-12(Interleukin-12, 이하 IL-12), 및 종양괴사인자 알파(Tumor necrosis factor-alpha, 이하 TNF-α)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 항원에 특이적으로 결합하여 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편에서 유래하는 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론, 및 뮤 불변 영역 유전자를 비롯하여, 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류되었다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 결과적으로 각각 면역글로불린 부류 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 한정한다. 전형적으로, 항체의 항원-결합 영역은 결합 특이성 및 친화성에서 가장 핵심적이게 된다. 항체는 체액성 면역의 주역이고, 감작 림프구와 함께 생체 방어 기구의 중요한 역할을 담당하고 있으며, 항원 단백질을 면역원으로서 동물에게 투여하여 체액성 면역 반응을 유도시킴으로써 제조된다. 이 때, 면역원으로서 사용되는 항원 단백질은, 예를 들면 생체 시료 등으로부터 단리ㆍ정제된 것을 사용한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "항원"은 숙주에서 면역 반응을 생성하는 능력을 갖는 단백질을 나타낸다. 항원은 항체에 의해 인식되고 이에 결합될 수 있다. 항원은 체내에서 또는 외부 환경에서 유래될 수 있으며, 재조합된 형태의 단백질도 포함한다. 본 발명에 있어서 상기 백신 조성물은 지카바이러스에 대한 항체의 생산을 유도할 수 있으며, 이 때 지카바이러스는 항원으로 작용한다. 상기 백신 조성물을 1회 투여할 때에 비해 2회 또는 3회 반복 투여할 경우 항체 생산이 더 증가할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ(Envelope protein domain Ⅲ)을 포함하는 백신 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 지카바이러스 감염 예방 방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명에 따른 백신 조성물의 투여에 의해 지카바이러스 감염을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 백신 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개체"란 지카바이러스 감염 예방을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ(Envelope protein domain Ⅲ)을 포함하는 백신 조성물의, 지카바이러스 감염 예방 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ(Envelope protein domain Ⅲ)의, 지카바이러스 감염 예방에 이용되는 백신을 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서는 대장균(E.coli) 발현 시스템을 이용하여 재조합 벡터를 제작하고, 대장균을 형질전환하여 지카바이러스 재조합 백신 후보물질(Brazil-EDⅢ)을 제조하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 일 실험예에서는 제조한 지카바이러스 재조합 백신 후보물질의 접종에 따른 세포성 면역관련 cytokine에 대한 효과를 확인하였으며, 상기 백신 후보물질을 1회 접종한 후 접종 항원으로 재자극 하였을 때 IFN-γ, IL-12, TNF-α 등의 사이토카인의 생산이 유도되는 것을 확인하였다(실험예 1 참조).

본 발명의 다른 실험예에서는 유세포분석기를 사용하여 백신 후보물질 접종 시 활성화 되는 T 림프구 아형을 분석한 결과, 백신 후보물질의 접종 횟수에 따른 T 림프구 아형의 분포 차이는 없는 것을 확인하였다(실험예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 백신 후보물질 반복 접종 시 발생하는 체액성 면역 반응을 관찰하기 위하여 ELISA kit를 적용하여 체액성 면역을 평가한 결과, 반복 접종할수록 항체가가 증가하는 것을 관찰하였으며, Th1/Th2 IgG isotype 비율을 확인함으로써 백신 후보물질이 지카바이러스 특이적 항체의 생성을 광범위하게 유도할 수 있다는 것을 확인하였다(실험예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 백신 후보물질 접종 후 Uganda strain, Puerto Rico strain, 또는 DENV를 접종하였을 때 이에 대한 중화항체가 유도되는 것을 확인하였다(실험예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실험예에서는 백신 후보물질 접종 마우스의 새끼 마우스에서 Uganda strain, Puerto Rico strain, 또는 DENV에 대한 방어 효능을 가지는 것을 관찰하여, 뎅기 바이러스에 대해 교차방어 효능을 가지는 것을 확인하였으며, 백신 후보물질 접종에 의해 생성된 항체는 모체로부터 새끼 마우스로 이행되는 것을 확인하였다(실험예 5 참조).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. E.coli 발현 시스템을 이용한 재조합 지카바이러스 백신 후보군 제작

1-1. 재조합 지카바이러스 백신 후보군 제작

E.coli 발현 system을 활용한 Brazil strain의 ZIKV EDIII protein의 항원을 대상으로 His-tag 제거를 위한 TEV cleavage site를 추가하여 재조합 지카 백신 후보군을 디자인하였다.

구체적으로, 항원의 제작은 하기 표 1의 아미노산 서열로 제작하였고, 목적동물에서 백신 효능 실험을 진행하였다. 이 때, 표 1의 아미노산 서열은 하기 표 2의 염기서열로 이루어진 유전자로부터 암호화된 것이다.

백신 후보군	sequence
Brazil-EDⅢ [Brazil strain E. coli / EDⅢ 169aa] 서열번호 1	MHHHHHHENLYFQGMGVSYSLCTAAFTFTKIPAETLHGTVTVEVQYAGTDGPCKVPAQMAVDMQTLTPVGRLITANPVITESTENSKMMLELDPPFGDSYIVIGVGEKKITHHWHRSGSTIGKAFEATVRGAKRMAVLGDTAWDFGSVGGALNSLGKGIHQIFGAAFKS

백신 후보군

sequence

Brazil-EDⅢ
서열번호 2

CATATGCATCACCACCACCACCACGAAAATCTATATTTTCAGGGTGGAGTAAGCTATAGCCTGTGCACCGCGGCGTTTACCTTTACCAAGATCCCGGCGGAAACCCTGCACGGTACCGTGACCGTTGAAGTGCAATATGCGGGTACCGATGGTCCGTGCAAGGTTCCGGCGCAGATGGCGGTGGATATGCAAACCCTGACCCCGGTTGGTCGTCTGATCACCGCGAACCCGGTGATTACCGAGAGCACCGAAAACAGCAAAATGATGCTGGAGCTGGACCCGCCGTTCGGCGATAGCTATATCGTTATTGGTGTGGGCGAAAAGAAAATCACCCACCACTGGCACCGTAGCGGTAGCACCATTGGCAAGGCGTTCGAGGCGACCGTTCGTGGTGCGAAACGTATGGCGGTGCTGGGTGACACCGCGTGGGATTTTGGTAGCGTTGGCGGTGCGCTGAATAGCCTGGGCAAGGGTATCCATCAGATTTTCGGTGCGGCGTTTAAGAGCTAATGAAAGCTT

ZIKV EDⅢ protein은 도1의 vector system과 같은 template 서열을 이용해 PCR을 수행한 후, 이를 Gel extraction을 통해 추출하였고, primer에 삽입한 restriction enzyme site인 NdeI/HindⅢ 서열을 통해 E.coli expression vector인 pET-30a(+) vector에 ligation 하였으며, plasmid 보존 및 증식을 위해 E.coli- BL21 (DE3) strain에 transformation 하였다. 사용한 프라이머 서열은 하기 표 3에 나타내었다.

primer	서열	서열번호
Brazil-EDIII Forward	CATATGCATCACCACCACCA	3
Brazil-EDIIIReverse	GCTCTTAAACGCCGCACCGA	4

그런 다음, single colony를 항생제가 포함된 TB 배지에 접종하여 37℃ 200rpm에서 배양하였고, OD₆₀₀ 값이 약 1.2에 도달하였을 때, IPTG를 첨가하여 37℃에서 4시간동안 세포 배양을 유도한 후 원심분리를 통해 cell pellet을 모았다. Cell pellet을 lysis buffer로 재부유시켜 sonication한 후, target protein을 Ni column과 superdex 75 coloumn을 사용하여 정제하였다.

1-2. 재조합 지카 백신 후보군의 분자량 및 발현 확인

상기 1-1의 방법에 의해 정제한target 단백질을 SDS-PAGE 를 통해 분자량을 확인하였으며, His tag antibody를 이용한 Western blot으로 target 단백질의 발현을 측정하였으며, Bradford assay 방법으로 BSA를 standard로 하여 단백질의 농도를 정량하였다.

SDS-PAGE를 이용하여 재조합 지카 백신 후보군의 분자량을 확인한 결과를 도 2a에 나타내었으며, 도 2a는 Brazil-EDⅢ (EDⅢ, E. coli 발현)의 분자량(Lane M1, Protein Marker; Lane 1, BSA; Lane 2, EDⅢ)을 나타낸 것이다.

Western blot을 이용하여 His tag으로 EDⅢ protein의 발현(Lane M2, Protein Marker; Lane 3, EDⅢ)을 확인한 결과는 도 2b에 나타내었다.

상기와 같이 재조합 지카 백신 후보군의 분자량 및 발현을 확인한 결과, Brazil-EDⅢ는 모두 양성반응을 나타내는 것을 확인하였다.

또한, BSA를 이용하여 단백질을 정량한 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 Brazil-EDⅢ는 595nm에서 흡광도(OD₅₉₅)가 0.434이었으며, 농도는 각각 1 mg/ml로 나타나는 것을 확인하였다.

실험예 1. 세포성 면역관련 cytokine에 대한 백신 반복접종 효과 확인

1-1. 마우스 비장 면역세포 분리

백신 반복 접종 시 발생하는 세포성 면역 반응을 관찰하기 위하여 도 3에 나타낸 바와 같이 실험을 설계하고 진행하였다.

구체적으로, 마우스(C57BL/6, female, 8주령)에 음성 대조군(PBS) 및 사백신(Puerto Rico 유래 strain(BEI Resources Cat. No. NR-50240(Puerto Rico, Strain PRVABC59)))과 백신 후보군 Brazil-EDⅢ을 1~3회 접종(Day 0, 14, 42)하고 7일 후 또는 3일 후(Day 7, 17, 45) 비장을 적출하고, 적출한 비장을 차가운 RPMI 1640 배지에 넣고, 5 ml syringe를 이용하여 비장을 파쇄한 뒤 40 μm nylon cell strainer (BD Bioscience, USA)에 흘려보내 비장 세포를 분리하였다. 세포를 1,000 RPM에서 5분간 원심분리한 후, 적혈구를 제거하기 위하여 RBC lysis buffer를 5분 동안 처리하였다. 원심분리를 통해 RBC lysis buffer를 제거한 뒤, RPMI 1640 (10% FBS, 1% penicillin/streptomycin)으로 세포를 부유시켜 ELISPOT, ELISA 및 Flow cytometry 실험에 사용하였다.

백신 후보군은 마우스 한 마리에 1회 접종 시 백신 후보군 10μg 과 면역증강제(Adjuvant)인 Alum 500μg, MPL 20μg을 혼합하여 근육에 접종하였고, 사백신은 1μg 과 면역증강제인 Alum 500μg, MPL 20μg을 혼합하여 접종하였다.

1-2. ELISPOT을 이용한 IFN-γ 생산 면역세포 분석

세포매개성 면역반응 분석에 따른 면역능 평가를 수행하기 위해, 상기 실험예 1-1과 같은 방법으로 백신 후보군 Brazil-EDⅢ을1회 접종(Day 0)하고 7일 후(Day 7), 비장을 적출하여 얻은 비장 면역세포에 각각의 항원(PBS, PIV vaccine, Brazil-EDⅢ)들을 1 μg/ml의 농도로 처리하여 48시간 자극한 후 IFN-γ를 발현하는 림프구를 ELISPOT assay로 측정하였다. Negative control로는 PBS를 마우스에 접종하여 얻은 비장 면역세포를 사용하였고, spot 발색은 해당 ELISPOT kit에 기술된 바와 동일하게 시행하였다(MAB tech, BD). IFN-γ ELISPOT은 BD^TMELISPOTmouseIFN-γ ELISPOT set (BD Life Sciences, USA)를 사용하여 제조회사의 실험방법에 따라 수행하였다.

구체적으로, IFN-γ ELISPOT을 수행하기 위하여, IFN-γ capture antibody를 1:200으로 희석하여 100 μl/well씩 넣어준 뒤 4℃에서 16시간 반응시켰다. 이를 wash buffer로 3회 세척한 뒤, blocking reagent (RPMI 1640, 10% FBS)를 200 μl/well씩 넣어준 뒤 상온에서 2시간 반응시켰다. Wash buffer로 3회 세척한 뒤 splenocyte를 0.5ⅹ10⁵cells/well또는 1ⅹ10⁶cells/well로 분주하였고, 항원(백신 후보물질 또는 사백신)을 1 μg/ml의 농도로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 항원 처리 후 48시간에 wash buffer로 3회 세척한 뒤 detection antibody를 1:250으로 희석하여 100 μl/well씩 넣어준 뒤 2시간동안 상온에서 반응시켰다. 이를 wash buffer로 3회 세척한 뒤 streptavidin-HRP를 1:100으로 희석하여 100 μl/well씩 넣어주고 1시간동안 상온에서 반응시켰으며, wash buffer로 3회 세척한 뒤 PBS로 2회 세척하여 BD AEC substrate set (BD Life Sciences, USA)를 사용하여 발색반응을 관찰한 후, 3차 DW로 well들을 세척하여 반응을 정지시키고, 공기 중에서 말린 후 실체현미경 (Olympus, model no. SZH-ILLB)으로 촬영하여 각 well의 spot들을 계수하여 분석하였다.

그 결과, 도 4a의 좌측 도면에 나타낸 바와 같이 음성대조군인 PBS를 1회 근육 접종한 대조군 splenocyte에 각각의 항원을 처리하였을 때 IFN-γ 생산세포의 빈도가 증가하는 경향을 보였다.

사백신(Puerto Rico 유래 strain)을 1회 근육 접종하여 얻은 splenocyte에 각각의 항원을 처리하였을 때 IFN-γ 생산세포의 빈도는 Brazil-EDⅢ로 자극시킨 그룹에서 약 2.4배 증가되어 있었다.

또한, 백신 후보군인 Brazil-EDⅢ을 1회 근육 접종하여 얻은 splenocyte에 각각의 항원들을 재자극 했을 경우, IFN-γ 생산세포의 빈도는 Brazil-EDⅢ 항원을 재자극한 그룹에서 약 16.9배로 매우 많이 증가된 것을 확인할 수 있었다.

도 4a의 우측 그래프는 항원을 1회 근육 접종한 후 각각의 접종 항원으로 재자극하여 발행한 spot의 수를 정량화하여 나타낸 것으로, PBS 접종 후 아무것도 자극시키지 않은 대조군(control)과 비교하였다(흰색 막대). Brazil-EDⅢ을 접종 후 재자극하였을 때 IFN-γ 생산세포의 빈도는 대조군에 비해 많이 증가되는 것을 확인하였다.

반면, 백신 후보군인 Brazil-EDⅢ과 사백신을 2회 접종(Day 0, 14)하고 3일 후(Day 17) 비장을 적출하여 얻은 비장 면역세포에 각각의 항원으로 48시간 자극하였을 경우에는, 도 4b(2회 접종)의 좌측 도면에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 생산세포의 빈도가 1회 접종 시에 비해 확연히 감소되어 있음을 관찰하였다.

상기와 같이 백신 후보군의 접종 횟수에 따른 IFN-γ 생산세포의 빈도를 비교해본 결과, 백신 후보군을 2회 근육 접종하였을 경우, 접종 횟수가 증가할수록 IFN-γ 생산세포의 빈도 및 spot의 크기가 감소하는 것을 관찰할 수 있었으며, 이는 각 항원들의 반복 접종에 따른 T cell 소모(exhaustion)에 의해 세포성 면역 관련 사이토카인을 분비하는 세포들의 빈도가 감소한 것으로 유추되었다.

1-3. ELISPOT을 이용한 IL-12 생산 면역세포 분석

세포매개성 면역반응 분석에 따른 면역능 평가를 수행하기 위해, 상기 실험예 1-1에서와 동일한 방법으로 백신 후보군 Brazil-EDⅢ을 1회 접종(Day 0)하고 7일 후(Day 7), 비장을 적출하여 얻은 비장 면역세포에 각각의 항원(PBS, PIV vaccine, Brazil-EDⅢ)들을 1 μg/ml의 농도로 처리하여 48시간 자극한 후 IL-12를 발현하는 림프구를 ELISPOT assay로 측정하였다. IL-12 ELISPOT은mouse IL-12 (p70) ELISpot^BASIC(MABTECH, USA)을 사용하여 제조회사의 실험방법에 따라 수행하였다.

구체적으로, IL-12 ELISPOT을 수행하기 위하여, IL-12 capture antibody를 15 μg/ml로 희석하여 100 μl/well씩 넣어준 뒤 4℃에서 16시간 반응시켰다. 이를 wash buffer로 4회 세척한 뒤, blocking reagent (RPMI 1640, 10% FBS)를 200 μl/well씩 넣어주고 상온에서 1시간 반응시켰다. 그리고 나서 wash buffer로 4회 세척한 뒤 splenocyte를 0.5ⅹ10⁵cells/well또는 1ⅹ10⁶cells/well로 분주하였고, 항원(백신 후보물질 또는 사백신)을 1 μg/ml의 농도로 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 이를 wash buffer로 4회 세척한 뒤 detection antibody를 1 μg/ml으로 희석하여 100 μl/well씩 넣어준 뒤 2시간동안 상온에서 반응시켰으며, wash buffer로 3회 세척한 뒤 streptavidin-HRP를 1:100으로 희석하여 100 μl/well씩 넣어주고 1시간동안 상온에서 반응시켰다. 이후 wash buffer로 3회 세척한 뒤 PBS로 2회 세척하여 BD AEC substrate set (BD Life Sciences, USA)를 사용하여 발색반응을 관찰한 뒤, 3차 DW로 well들을 세척하여 반응을 정지시키고, 공기 중에서 말린 후 실체현미경 (Olympus, model no. SZH-ILLB)으로 촬영하여 각 well의 spot들을 계수하여 분석하였다.

항원을 1회 접종한 후 얻은 비장 면역세포에 각각의 항원들을 처리하여 자극한 다음 ELISPOT assay로 측정한 결과를 도 5의 좌측 도면에 나타내었으며, 상기 접종 항원으로 재자극 하였을 때 발생한 spot의 수를 정량화하여 도 5의 우측 그래프로 나타내었다.

ELISPOT assay 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 백신 후보군 1회 접종 시 IL-12 생산세포는 전반적으로 감작하지 않은 대조군에 비하여 각각의 항원을 재자극한 그룹에서 spot의 수가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.

백신 후보군 Brazil-EDⅢ을 1회 접종하여 얻은 splenocyte에 각각의 항원들을 재자극시켰을 경우 IL-12 생산세포의 빈도는 그룹 간에 유의성 있는 차이를 보이지는 않았으며, Brazil-EDⅢ을 1회 접종했을 때 확인된 IL-12 생산 면역세포 빈도 패턴은 IFN-γ 생산 면역세포와는 다르게 다른 그룹들에 비해 월등히 증가되어 있거나 spot의 크기가 커져있지는 않았다.

그러나, 각각의 백신후보군과 사백신을 2회 접종했을 때 IL-12 분비세포는 검출되지 않았고, 이는 IFN-γ 생산세포와 마찬가지로 각 항원들의 반복 접종에 따른 T cell 소모에 의해 세포성 면역 관련 사이토카인을 분비하는 세포들의 빈도가 감소한 것으로 유추되었다.

1-4. ELISA를 이용한 사이토카인의 생산량 확인

IFN-γ, IL-12, 및 TNF-α 생산량에 백신이 미치는 영향을 분석하고 ELISPOT 실험 결과에 대한 자세한 분석을 진행하기 위하여 각 cytokine에 대한 ELISA kit를 사용하여 생산량을 평가하였다.

구체적으로, 8주령의 C57BL/6 암컷 마우스에 PBS, 백신 후보군(Brazil-EDⅢ), 사백신(Puerto Rico 유래 strain)을 1회 접종하고 7일 후 spleen에서 splenocyte를 분리하거나 2회 접종하고 3일 후에 spleen으로부터 splenocyte를 분리하였다. 분리된 splenocyte는 1 μg/ml의 농도에 해당하는 각각의 항원들로 재자극 한 뒤 48시간 후에 ELISA assay로 사이토카인 생산 분석을 진행하였다.

IFN-γ, IL-12, TNF-α ELISA는 제조사의 kit에 기술된 바와 동일하게 시행하였다(Biolegend사 제품).

세포 배양액으로 분비된 cytokine의 측정은 mouse TNF-α ELISA MAX^TM standardset, mouse IFN-γ ELISA MAX^TM standardset, mouse IL-12 ELISA MAX^TM standardset (BioLgend,USA)를 사용하여 제조회사의 실험방법에 따라 수행하였다. 각각의 cytokine에 해당하는 capture antibody를 1:200으로 희석하여 96 well cell culture plate에 100 μl/well씩 넣어준 뒤 4℃에서 16시간 반응시켰으며, 이를 wash buffer로 4회 세척한 뒤 blocking reagent인 1% BSA/PBS로 1시간동안 반응시켰다. 그리고 나서 wash buffer로 4회 세척한 뒤 각각의 세포 배양액을 100 μl씩 넣어준 뒤 실온에서 2시간 반응시킨 후 wash buffer로 4회 세척하고 1:200으로 희석한 detection antibody 를 100 μl/well씩 넣어준 뒤 실온에서 2시간 반응시켰다. 이후 wash buffer로 4회 세척한 뒤 1:1,000으로 희석한 Avidin-HRP를 100 μl/well씩 넣어준 뒤 실온에서 30분 반응시키고 wash buffer로 5회 세척한 뒤 100 μl의 TMB solution을 넣고 빛을 차단시킨 상태에서 15분간 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 cytokine에 해당하는 표준곡선은 연속 희석시킨 각각의 정제된 항원을 사용하여 작성하였고, 각각의 cytokine 농도는 작성된 표준곡선에 따라 계산하였다.

<IFN-γ 생산량 확인>

백신 후보군 Brazil-ED²을 1회 접종하여 얻은 splenocyte를 각 항원으로 재자극 하였을 때, IFN-γ 생산은 도 6a에 나타낸 바와 같이 ELISPOT data와 일치하게 유의성 있게 증가함을 관찰할 수 있었으며, 또한 Brazil-EDIII를 1회 접종하여 얻은 splenocyte에 동일 항원을 재자극했을 때 control에 비해 IFN-γ의 생산이 약 22.3배 증가하였다.

도 6a에 나타낸 바와 같이 PBS와 사백신을 1회 접종하여 얻은 splenocyte를 각 항원으로 재자극하였을 때 역시 유의성 있게 증가함을 관찰할 수 있었으며, 여기서 PBS의 Ag stimulation이라고 표기한 검은색 막대는 PBS를 1회 접종하여 얻은 splenocyte에 각 백신 후보군과 사백신으로 재자극했을 때 IFN-γ 생산량의 평균값을 나타낸 것으로, control에 비해 IFN-γ의 생산이 평균 7.9배 증가하였고, 사백신을 1회 접종하여 얻은 splenocyte에 동일 항원을 재자극 했을 때는 control에 비해 IFN-γ의 생산이 약 4.8배 증가하였다.

또한, 각각의 백신 후보군들을 2회 접종하여 얻은 splenocyte에서 IFN-γ의 생산은 도 6b에 나타낸 바와 같이 1회 접종하였을 때에 비하여 확연히 감소하는 것을 관찰할 수 있었으나, 백신 후보군인 Brazil-EDⅢ을 2회 접종하여 얻은 splenocyte에서 각 접종 항원을 재자극 했을 때 IFN-γ의 생산이 320.7 pg/ml로 대조군과 비교하여 증가한 것을 관찰하였다.

상기로부터 IFN-γ의 생산은 접종 횟수가 반복될수록 감소하는 것을 확인하였고, 이는 IFN-γ ELISPOT data와 유사한 경향임을 알 수 있었다.

<IL-12의 생산량 확인>

IL-12의 생산 역시 백신 후보군을 2회(도 7b) 접종하였을 때에 비하여 1회(도 7a) 접종하여 얻은 splenocyte에 각 항원들을 재자극 했을 때 가장 높은 결과를 보였으며, 백신 후보군을 반복 접종할수록 IL-12의 생산은 접종 반복 횟수와 비례하게 감소하는 것을 볼 수 있었다. 이러한 패턴은 IFN-γ의 분비 패턴과 비슷함을 알 수 있었다.

<TNF-α의 생산량 확인>

TNF-α의 생산은 도 8a 에 나타낸 바와 같이, 백신 후보군 및 사백신 1회 접종 시 아무것도 재자극 시키지 않은 control에 비해 각각의 항원들을 재자극 했을 때 모든 그룹에서 증가하였다. Brazil-EDⅢ을 1회 접종하여 얻은 splenocyte에 동일 항원을 재자극 했을 때 control에 비해 TNF-α의 생산이 약 11.5배 증가하였다.

또한, PBS와 사백신을 1회 접종하여 얻은 splenocyte를 각 항원으로 재자극 하였을 때 역시 유의성있게 증가함을 관찰할 수 있었으며, 여기서 PBS의 Ag stimulation이라고 표기한 검은색 막대는 PBS를 1회 접종하여 얻은 splenocyte에 각 백신 후보군과 사백신으로 재자극 했을 때 TNF-α 생산량의 평균값을 나타낸 것으로, control에 비해 TNF-α의 생산이 평균 5.2배 증가하였고, 사백신을 1회 접종하여 얻은 splenocyte에 동일 항원을 재자극 했을 때 control에 비해 TNF-α의 생산이 약 12.4배 증가하였다.

IFN-γ 및 IL-12와 마찬가지로 TNF-α 생산은 백신 후보군의 접종 횟수가 2회(도 8b) 반복될수록 점차 감소하는 경향을 보였다.

실험예 2. T 림프구 아형 분석

백신 접종 시 활성화 되는 T 림프구 아형을 분석하기 위하여 각 백신 후보군을 접종한 마우스로부터 분리한 splenocyte에서 CD4⁺ 및 CD8⁺ 표지 세포를 유세포분석기를 사용하여 측정하였다.

구체적으로, 8주령의 암컷 C57BL/6 마우스에 음성 대조군(PBS) 및 사백신(Puerto Rico 유래 strain)과 백신 후보군(Brazil-EDⅢ)을 각각 1회 접종(Day 0)하고 7일 후(Day 7) 비장을 적출하여 얻은 비장 면역세포의 농도가 1ⅹ10⁶이 되도록 200 μl 1% BSA/PBS로 부유시켰다. CD4⁺ T cell은 FITC-anti-CD3/PE-anti-CD3 를 사용하였고, CD8⁺ T cell은 FITC-anti-CD3/ PE-anti-CD8a 를 사용하였고, 실험에 사용한 모든 항체는 BD bioscience사로부터 구입하였다. 각각의 샘플에 항체를 1:200으로 희석하여 넣은 뒤 1시간동안 4℃에서 반응시켰으며, 1시간 뒤 800 μl의 PBS를 넣어 6,000 RPM에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 300-500 μl의 1% BSA/PBS로 재부유시킨 후 유세포분석기를 통해 effector CD4⁺ T cell과 effector CD8⁺ T cell의 비율을 측정하였다. 유세포분석기는 FACSCalibur (BD bioscience, USA)를 사용하였고, 한 샘플 당 10,000개의 세포를 분석하였다.

그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이 PBS를 1회 접종하여 얻은 splenocyte에 존재하는 CD3⁺CD4⁺T cell은 13.81%로 나타났고, 도 9b에 나타낸 바와 같이 CD3⁺CD8⁺ T cell은 10.43%로 나타났으며, 이 수치는 백신 후보군과 사백신을 1회 접종하여 얻은 splenocyte에 존재하는 CD3⁺CD4⁺ T cell과 CD3⁺CD8⁺ T cell의 백분율과 유의성 있는 차이를 보이지 않았다.

또한, 백신 후보군과 사백신을 2회 접종(Day 0, 14)하고 3일 후(Day 17) 또는 3회 접종(Day 0, 14, 42)하고 3일 후(Day 45)에 얻은 splenocyte에 존재하는 CD3⁺CD4⁺ T cell과 CD3⁺CD8⁺ T cell의 백분율을 도 9c 내지 9f에 나타내었으며, 2회 접종하였을 때 CD3⁺CD4⁺ T cell(도 9c) 및 CD3⁺CD8⁺ T cell(도 9d)의 백분율과 3회 접종하였을 때 CD3⁺CD4⁺ T cell(도 9e) 및 CD3⁺CD8⁺ T cell(도 9f)의 백분율 모두 대조군인 PBS 접종군과 그룹 간에 유의성 있는 차이를 보이지 않았다.

상기와 같이 백신 후보군과 사백신 접종 횟수에 따른 T cell 아형의 변화를 비교해본 결과, 1회 접종 시에 비하여 2회 또는 3회 접종 시 CD3⁺CD4⁺ T cell과 CD3⁺CD8⁺ T cell의 백분율이 약 3% 증가하기는 하나 큰 유의성을 보이지는 않았다. 따라서 백신 후보군의 종류 또는 접종 횟수에 따른 T 림프구 아형의 분포 차이는 없는 것을 알 수 있었다.

실험예 3. 체액성 면역의 정량적 평가 및 항체의 subtype 분석

백신 반복 접종 시 발생하는 체액성 면역 반응을 관찰하기 위하여 정량적인 비교가 가능한 상용화된 ELISA kit를 적용하여 체액성 면역을 평가하였으며, 도 10에 나타낸 바와 같이 실험을 진행하였다.

구체적으로, 8주령의 C57BL/6 암컷 마우스에 음성 대조군(PBS) 및 사백신(Puerto Rico 유래 strain) 과 백신 후보군(Brazil-EDⅢ)을 1 내지 3회 접종(Day 0, 14, 42)하고 각각 -1일, 14일, 7일 후(Day -1, 28, 49), 안면부 채혈을 통해 분리한 혈청을 이용하여 분석을 진행하였다.

백신 후보물질은 마우스 한 마리 1회 접종 시 백신 10μg 과 Adjuvant인 Alum 500μg, MPL 20μg을 혼합하여 접종 하였고, 사백신은 1μg 과 Adjuvant인 Alum 500μg, MPL 20μg을 혼합하여 접종 하였다.

3-1. 지카 바이러스 EDⅢ 인지 항체 측정

백신 투여 시에 목표하는 수준의 항체의 생산을 평가하기 위해 시판되고 있는 지카바이러스 ELISA kit(Alpha diagnostic international)를 사용해서 상기 안면부 채혈을 통해 분리한 혈청 내 지카바이러스 항체를 측정하였다.

분리한 혈청을 kit내 dilution buffer에 희석하여 well에 분주하였으며, 37℃에서 1시간 반응 후 혈청 시료를 제거하기 위해 washing buffer로 세척 후 HRP가 결합된 2차 항체(Alpha diagnostic international #RV-403120-1이 포함되어 있는 2차 항체)를 dilution buffer에 희석하여 37℃에서 30분간 반응하였다. 그런 다음 washing buffer로 세척 후 TMB 용액으로 발색하여 450nm에서 흡광값을 측정하였고 kit에 포함된 standard를 기준으로 산정하여 항체의 유도와 유지의 정도를 정량적으로 평가하였다.

그 결과, 도 11a에 나타낸 바와 같이 지카바이러스의 EDⅢ에 대한 항체가 백신 후보군 2회(Day 0, 14) 접종 14일 후(Day 28) 음성대조군(PBS)과 사백신(Puerto Rico 유래 strain)에 비교하여 높은 항체가를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 11b에 나타낸 바와 같이 백신 후보군 3회(Day 0, 14, 42) 접종 7일 후(Day 49) 2회 접종 시보다 항체가가 1.6 배 이상 증가한 것을 확인할 수 있었다.

도 11c에는 kit standard 결과(좌측 그래프) 및 kit standard 값에 따른 정량 결과(우측 그래프)를 나타내었다.

3-2. 백신 후보군 접종 시 생성되는 항체의 subtype 분석

백신 투여 시에 생산되는 항체의 subtype을 비교하고자 자체 구축한 Indirect ELISA 방법을 통해 항체의 IgG1, IgG2c subtype을 비교 분석함으로써 Th1과 Th2 중 어떠한 세포 매개 면역 반응이 유도되는지 확인하였으며, 실험을 진행하기 전 적정 수준의 항원과 혈청량을 결정하기 위하여 재조합 항원과 면역한 마우스의 혈청을 2진희석하여 titer를 측정하였다.

백신 후보군(Brazil-EDⅢ)을 2회(Day 0, 14) 접종하고 14일 후(Day 28) 및 3회(Day 0, 14, 42) 접종하고 7일 후(Day 49)에 마우스로부터 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 지카바이러스 재조합 항원(Brazil-EDⅢ) 0.1ug/well을 immunoplate에 분주하여 4℃에서 12시간 이상 반응 시킨 후 washing buffer(0.05% tween20 in PBS)로 세척하고 blocking buffer(1% BSA in PBS)를 분주하여 2시간동안 37℃에서 반응시켜서 비특이적 결합을 완화하였다. 이어서 washing buffer로 세척하고 백신 접종 후 마우스로부터 얻은 혈청을 dilution buffer(0.1% BSA in PBS)에 희석하여 well에 분주하였다. 상온에서 1시간 반응 후 혈청 시료를 제거하기 위해 washing buffer로 세척 후 subtype IgG1, IgG2c를 검출하고자 1:10000으로 희석한 Goat anti-mouse IgG1(Bethyl Laboratories, TX)과 1:8000으로 희석한 Goat anti-mouse IgG2c HRP (Southern biotech, USA) 100㎕를 분주하여 37℃에서 1시간 반응하였다. 이후 washing buffer로 세척하고 TMB 용액으로 발색하여 450nm에서 흡광값을 측정하였다.

그 결과, 도 12a에 나타낸 바와 같이 백신 후보군 2회 및 3회 접종 시 IgG1의 비율이 IgG2c 보다 높게 나타나, 이를 통해 Th2 세포 매개 면역 반응을 주로 유도한다는 것을 확인할 수 있었으며, 백신 후보군(Brazil-EDⅢ)의 접종에 따른 Th1/Th2 IgG isotype 비율을 도 12b에서 확인하였다.

실험예 4. 중화항체 평가

백신 후보군(Brazil-EDⅢ), 사백신(Puerto Rico 유래 strain)의 체액성 면역 효능 평가를 위하여 바이러스에 대한 중화항체 유도 수준을 PRNT₅₀ (Plaque reduction neutralization test)를 통하여 값을 비교함으로써 평가하였다.

구체적으로, 백신 후보군(Brazil-EDⅢ) 및 사백신(Puerto Rico 유래 strain)을 마우스(C57BL/6, Female, 8주령)에 3회(Day 0, 14, 42) 근육 주사한 다음 2회(Day 0, 49) 채혈하였다. Negative control은 접종 전(Day 0) 채혈한 혈청을 사용하였으며, Test serum은 3회 접종 후(Day 49) 채혈한 혈청을 사용하였다. 중화항체 수준을 평가하기 위해 다음과 같이 PRNT₅₀ 측정시험을 실시하였다.

PRNT₅₀ 측정을 위하여 동일 그룹군의 마우스 5마리의 혈청을 pooling하여 사용하였으며, 56℃에서 30분간 비동화한 다음 대조군 혈청과 시험군 혈청을 각각 같은 희석 배율로 희석하였다. 역가 (PFU/ml)가 확인된 2종의 zika virus (Uganda 유래 strain 및 Puerto Rico 유래 strain) 또는 뎅기 바이러스(Dengue virus, DENV) (Type 2)를 희석하여 virus control에서 50개 정도의 plaque/well이 나오도록 준비한 다음 희석된 혈청과 1:1로 혼합하여 37℃에서 30분간 반응 시켰다. 그리고 나서 virus 반응 30분 후 혈청과 virus 반응액을 Vero cell 또는 Vero 76 cell에 접종하고 2시간 동안 흡착시킨 후 Overlay media(1% Sea plaque agar)를 첨가하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 5~14일간 배양한 다음 1% Crystal violet을 이용하여 염색하고 Plaque의 개수를 확인하였으며, % inhibition을 통하여 PRNT₅₀을 산출하였다.

실험결과, 도 13에 나타낸 바와 같이 plaque reduction(%)은 시험군 혈청을 1/40, 1/20, 1/10, 1/5 PRNT 결과 차례대로 plaque의 수가 줄어드는 경향을 보였으며, 2종의 zika virus (Uganda 유래 strain 및 Puerto Rico 유래 strain) 또는 DENV (Type 2)에 대한 중화항체 유도수준이 대략 PRNT₅₀=20으로 평가되었다.

또한, DENV (Type 2)에 대한 중화항체 유도수준이 2종의 zika virus (Uganda 유래 strain 및 Puerto Rico 유래 strain)와 유사하게 나타났는데 이는 DENV가 ZIKV와 같은 Flavivirus에 속하고 백신의 target으로 삼는 E, prM, NS1등에서 상당수의 아미노산 서열이 동일하고, 특히 관련 연구에 따르면 DENV와 ZIKV의 E protein 서열이53.9 %의 아미노산 서열 동일성을 가지고 특히 fusion loop는 100% 일치한다고 보고된 바 있다(Priyamvada L et al. 2016).

실험예 5. 지카바이러스 백신 후보물질의 방어효능 비교 평가

5-1. 지카바이러스 및 뎅기열 바이러스 공격접종에 대한 백신 후보물질의 방어능력 확인

본 발명의 백신 후보물질의 방어능을 평가하기 위해서 백신 후보군(Brazil-EDⅢ) 또는 사백신(PIV; Puerto Rico 유래 strain)을 3회(Day 0, 14, 42) 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스 2일령에 임상증상이 비교적 분명하게 나타나는 2종의 지카 바이러스(Uganda 유래 strain, Puerto Rico 유래 strain)와 교차 방어 효능을 평가하고자 뎅기열 바이러스(DENV type 2)를 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 감염시키고 체중, 이상행동, 혈청 내 바이러스 함량 측정을 진행하였다.

Virus	Virus titer	Inoculation dose
ZIKV Uganda strain	10^7.8TCID₅₀/ml	10^6.8TCID₅₀
ZIKV Puerto Rico strain	10^8.3TCID₅₀/ml	10^6.3TCID₅₀
DENV (type 2)	10⁸TCID₅₀/ml	10⁶TCID₅₀

그 결과, 도 14 및 표 5에 나타낸 바와 같이 African lineage인 Uganda 유래 strain을 10^6.8TCID₅₀/mouse로 새끼 마우스에게 피하접종 했을 때 모든 그룹 군의 새끼 마우스들이 10일 이내 체중이 감소하며 폐사하였으며, 단기간 폐사하여 뒷다리를 저는 등의 이상행동은 관찰할 수 없었다.

Virus	Vaccine	No. of mice	Symptom
Virus	Vaccine	No. of mice	Feeble (%)	Staggering march (%)	Death (%)
PBS	PBS	5	0 (0/5)	0 (0/5)	0 (0/5)
	PIV	5	0 (0/5)	0 (0/5)	0 (0/5)
	Brazil-EDIII	5	0 (0/5)	0 (0/5)	0 (0/5)
ZIKV Uganda strain	PBS	5	100 (5/5)	0 (0/5)	100 (5/5)
	PIV	5	100 (5/5)	0 (0/5)	100 (5/5)
	Brazil-EDIII	5	100 (5/5)	0 (0/5)	100 (5/5)
ZIKV Puerto Rico strain	PBS	5	100 (5/5)	100 (5/5)	100 (5/5)
	PIV	5	40 (2/5)	40 (2/5)	20 (1/5)
	Brazil-EDIII	5	40 (2/5)	0 (0/5)	40 (2/5)
DENV (type 2)	PBS	5	80 (4/5)	0 (0/5)	60 (3/5)
	PIV	5	20 (1/5)	0 (0/5)	20 (1/5)
	Brazil-EDIII	5	0 (0/5)	0 (0/5)	0 (0/5)

또한, Asian lineage인 Puerto Rico 유래 strain을 10^6.3TCID₅₀/mouse로 공격접종 했을 때 PBS를 접종한 어미에게서 태어난 새끼마우스 5마리 중 4마리는 3일째 모두 폐사하였고 한 마리는 감염 13일 후부터 체중이 감소하며 다리를 저는 임상증상을 나타내었으며 18일째에 폐사하였다. 반면 사백신(PIV; Puerto Rico 유래 strain)을 접종한 어미에게서 태어난 새끼마우스 5마리 중 한 마리는 감염 3일째 폐사하였고, 2마리는 뒷다리를 저는 이상행동과 함께 체중 감소가 관찰되었다. 백신 후보군인 Brazil-EDⅢ을 접종한 어미에게서 태어난 새끼마우스 5마리 중 한 마리는 감염 후 체중감소를 나타내며 3일째 폐사하였고, 한 마리는 감염 3일째부터 체중감소를 나타내며 12일째 폐사하였으나 뒷다리를 저는 이상행동은 관찰되지 않았다. 이로부터 백신 후보물질(Brazil-EDⅢ) 및 사백신(PIV; Puerto Rico 유래 strain) 접종 시 지카 바이러스 Puerto Rico strain에 대한 방어효과를 확인할 수 있었다.

또한, 백신 후보물질(Brazil-EDⅢ) 또는 사백신(PIV; Puerto Rico 유래 strain)이 뎅기열 바이러스(DENV type 2)에 대해 교차 방어 효과가 있는지 확인하기 위하여 백신 후보물질(Brazil-EDⅢ) 및 사백신(PIV; Puerto Rico 유래 strain)을 3회(Day 0, 14, 42) 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스 2일령에 뎅기열 바이러스(DENV type 2)를 10⁶ TCID₅₀/mouse 로 피하 접종하여 증상완화를 관찰하였다.

그 결과, PBS를 접종한 어미에게서 태어난 새끼마우스 5마리 중 한 마리는 감염 1일째 폐사하였고, 두 마리는 감염 4일째 폐사하였으며, 폐사하지 않은 마우스 중 한 마리는 성장이 다른 마우스에 비하여 매우 느렸고 감염 14일 후부터 체중이 감소하였다. 사백신(PIV; Puerto Rico 유래 strain)을 접종한 어미에게서 태어난 새끼마우스 5마리 중 한 마리는 감염 3일째 폐사하였고, 4마리에선 체중감소 또는 뒷다리를 저는 이상행동이 관찰되지 않았다. 백신 후보군인 Brazil-EDⅢ을 접종한 어미에게서 태어난 새끼마우스는 5마리 모두 생존하였고, 체중감소 및 뒷다리를 저는 이상행동이 관찰되지 않았음.

따라서, 이로부터 백신 후보물질(Brazil-EDⅢ) 및 사백신(PIV; Puerto Rico 유래 strain) 접종 시 뎅기열 바이러스에 대한 교차 방어효과를 확인할 수 있었다. 이러한 교차방어 효과는 DENV가 ZIKV와 같은 Flavivirus에 속하고 백신의 target으로 삼는 E, prM, NS1등에서 상당수의 아미노산 서열이 동일하기 때문으로 추정된다.

5-2. 바이러스 공격접종 후 혈액 내 바이러스 양 확인

백신 후보물질(Brazil-EDⅢ) 또는 사백신(PIV; Puerto Rico 유래 strain)을 3회(Day 0, 14, 42) 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스 2일령에 2종의 지카 바이러스(Uganda 유래 strain, Puerto Rico 유래 strain)와 뎅기열 바이러스(DENV type 2)를 각각 상기 표 4에 나타낸 접종량만큼 피하 접종하여 2일 후 얻은 혈청에서 TCID₅₀(Tissue culture infective dose 50)를 측정하여 혈청 내 바이러스 함량 측정을 진행하였다. 동일 그룹군의 마우스 5마리의 혈청을 pooling하여 사용하였으며, 56℃에서 30분간 비동화한 다음 대조군 및 시험군 혈청을 10¹~10³까지 각각 십진 희석하였다. 희석된 혈청을 Vero cell 또는 Vero 76 cell에 접종하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하면서 CPE 유무를 관찰하여 TCID₅₀값을 산출하였다.

그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이 백신 후보물질(Brazil-EDⅢ) 및 사백신(PIV; Puerto Rico 유래 strain)을 접종한 어미에게서 태어난 생후 2일령 마우스에 지카바이러스(Uganda 유래 strain)나 뎅기열 바이러스 공격접종 2일 후 얻은 혈청에서 감염력 있는 바이러스가 검출되었다.

구체적으로, 백신 후보물질(Brazil-EDⅢ) 및 사백신(PIV; Puerto Rico 유래 strain)을 접종한 어미에게서 태어난 생후 2일령 마우스에 지카바이러스(Puerto Rico 유래 strain) 공격접종 2일 후 얻은 혈청에서 대조군인 PBS를 접종한 어미에게서 태어난 새끼마우스에서는 혈중 바이러스량이 10^2.3 TCID₅₀/ml 로 측정되었으며, Brazil-EDⅢ 및 사백신(PIV; Puerto Rico 유래 strain)을 접종한 어미에게서 태어난 새끼마우스에서는 해당 바이러스 검출이 전혀 되지 않았다. 이는 ZIKV Puerto Rico 유래 strain의 공격에 대해 면역체계가 침입한 바이러스를 빠르게 제거했기 때문으로 판단되며, ZIKV 백신 접종 어미로부터 태어난 새끼가 어미의 항체를 넘겨받아 ZIKV Puerto Rico 유래 strain에 대한 방어능을 나타내는 것으로 나타났다.

또한 백신 후보물질(Brazil-EDⅢ) 및 사백신(PIV; Puerto Rico 유래 strain)을 접종한 어미에게서 태어난 생후 2일령 마우스에 뎅기열 바이러스(type 2) 공격접종 2일 후 얻은 혈청에서 대조군인 PBS를 접종한 어미에게서 태어난 새끼마우스에서는 혈중 바이러스량이 10^2.5 TCID₅₀/ml 로 측정되었으며, 사백신(PIV; Puerto Rico 유래 strain)을 접종한 어미에게서 태어난 새끼마우스에서는 혈중 바이러스량이 10^2.3 TCID₅₀/ml 로 측정되었으나, 백신 후보군Brazil-EDⅢ 을 접종한 어미에게서 태어난 새끼마우스에서는 바이러스량이 10^1.7 TCID₅₀/ml 까지 감소하여 뎅기열 바이러스에 대한 교차 방어 효능을 확인할 수 있었다.

5-3. 모체 이행 항체 평가

백신 후보물질(Brazil-EDⅢ) 및 사백신(Puerto Rico 유래 strain)을 3회(Day 0, 14, 42) 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스에게서 얻은 혈청 내 모체 이행 항체를 자체 구축한 Indirect ELISA 방법을 통해 측정하였다.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이 각 백신 후보물질(Brazil-EDⅢ)을 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스의 혈청에서 대조군인 PBS를 접종한 성체마우스와 PBS를 접종한 어미에게서 태어난 새끼마우스에 비해 높은 수준의 항체가를 나타내는 것을 관찰하여 모체 이행 항체를 측정할 수 있었다. 그러나 사백신(Puerto Rico 유래 strain)을 접종한 어미에게서 태어난 새끼 마우스의 혈청에서는 PBS를 접종한 성체마우스와는 비슷한 항체가를 나타내었으나 PBS를 접종한 어미에게서 태어난 새끼마우스에 비해선 높은 수준의 항체가를 나타내는 것을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation Korea Centers for Disease Control and Prevention <120> Development of recombinant subunit Zika virus vaccine and preparing method thereof <130> MP19-283 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 169 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Brazil-EDIII <400> 1 Met His His His His His His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Met Gly 1 5 10 15 Val Ser Tyr Ser Leu Cys Thr Ala Ala Phe Thr Phe Thr Lys Ile Pro 20 25 30 Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu Val Gln Tyr Ala Gly 35 40 45 Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln Met Ala Val Asp Met Gln 50 55 60 Thr Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Ala Asn Pro Val Ile Thr 65 70 75 80 Glu Ser Thr Glu Asn Ser Lys Met Met Leu Glu Leu Asp Pro Pro Phe 85 90 95 Gly Asp Ser Tyr Ile Val Ile Gly Val Gly Glu Lys Lys Ile Thr His 100 105 110 His Trp His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys Ala Phe Glu Ala Thr 115 120 125 Val Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Val Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp 130 135 140 Phe Gly Ser Val Gly Gly Ala Leu Asn Ser Leu Gly Lys Gly Ile His 145 150 155 160 Gln Ile Phe Gly Ala Ala Phe Lys Ser 165 <210> 2 <211> 519 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Brazil-EDIII <400> 2 catatgcatc accaccacca ccacgaaaat ctatattttc agggtggagt aagctatagc 60 ctgtgcaccg cggcgtttac ctttaccaag atcccggcgg aaaccctgca cggtaccgtg 120 accgttgaag tgcaatatgc gggtaccgat ggtccgtgca aggttccggc gcagatggcg 180 gtggatatgc aaaccctgac cccggttggt cgtctgatca ccgcgaaccc ggtgattacc 240 gagagcaccg aaaacagcaa aatgatgctg gagctggacc cgccgttcgg cgatagctat 300 atcgttattg gtgtgggcga aaagaaaatc acccaccact ggcaccgtag cggtagcacc 360 attggcaagg cgttcgaggc gaccgttcgt ggtgcgaaac gtatggcggt gctgggtgac 420 accgcgtggg attttggtag cgttggcggt gcgctgaata gcctgggcaa gggtatccat 480 cagattttcg gtgcggcgtt taagagctaa tgaaagctt 519 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Brazil-EDIII Forward Primer <400> 3 catatgcatc accaccacca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Brazil-EDIII Reverse Primer <400> 4 gctcttaaac gccgcaccga 20

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ(Envelope protein domain Ⅲ)을 암호화하는 유전자를 포함하는, 지카바이러스 백신 제조용 재조합 발현 벡터.
제1항에 있어서,
상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
제1항에 있어서,
상기 지카바이러스는 브라질(Brazil) 유래인 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 발현 벡터는 대장균(E.coli) 발현 시스템을 이용한 것을 특징으로 하는, 재조합 발현 벡터.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ(Envelope protein domain Ⅲ)을 포함하는, 지카바이러스 감염 예방용 백신 조성물.
제5항에 있어서,
상기 지카바이러스는 브라질(Brazil) 유래인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제5항에 있어서,
상기 백신 조성물은 면역증강제(adjuvant)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제7항에 있어서,
상기 면역증강제는 Alum 및 MPL(monophosphoryl lipid A)의 혼합물인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제8항에 있어서,
상기 Alum 및 MPL은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ에 대하여 각각 1:40 내지 60(Alum) 및 1:1 내지 3(MPL)의 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제8항에 있어서,
상기 Alum 및 MPL은 20 내지 30:1 내지 3의 중량 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제5항에 있어서,
상기 백신 조성물은 지카바이러스에 대한 사이토카인 생산을 유도하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제11항에 있어서,
상기 사이토카인은 인터페론-감마(IFN-γ), 인터루킨-12(IL-12), 및 종양괴사인자 알파(TNF-α)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제5항에 있어서,
상기 백신 조성물은 지카바이러스에 대한 항체의 생산을 유도하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제13항에 있어서,
상기 지카바이러스에 대한 항체는 모체 이행 항체인 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제5항에 있어서,
상기 백신 조성물은 지카바이러스 또는 뎅기 바이러스(Dengue virus, DENV)에 대한 중화항체의 생산을 유도하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제5항에 있어서,
상기 백신 조성물은 뎅기 바이러스(Dengue virus, DENV)에 대한 교차방어 효능을 가지는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 지카바이러스 EDⅢ(Envelope protein domain Ⅲ)을 암호화하는 유전자를 프로모터에 작동 가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; 및
상기 재조합 발현 벡터로 대장균(E.coli)을 형질전환 하는 단계; 및
상기 대장균으로부터 생산된 지카바이러스 EDⅢ 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 지카바이러스 감염 예방용 백신 조성물의 제조 방법.
제17항에 있어서,
상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 방법.
제17항에 있어서,
상기 재조합 발현 벡터는 대장균(E.coli) 발현 시스템을 이용한 것을 특징으로 하는, 방법.