KR102351653B1 - Diagonstic kits for SARS coronavirus 2 comprising the receptor and the antibody binding to SARS coronavirus 2 spike protein - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사스 코로나바이러스 2(SARS coronaviru 2; SARS-CoV-2)의 검출 또는 사스 코로나바이러스 2 감염증(COVID-19) 진단을 위해 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체와 항체를 이용한 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물, 사스 코로나바이러스 2 감염증 진단용 조성물, 사스 코로나바이러스 2 검출방법 및 사스 코로나바이러스 2 감염증 진단 키트에 관한 것이다. The present invention is SARS coronavirus using a receptor and antibody that binds to the SARS coronavirus 2 spike protein for detection of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2) or diagnosis of SARS coronavirus 2 infection (COVID-19) It relates to a composition for detecting virus 2, a composition for diagnosing SARS-CoV-2 infection, a method for detecting SARS-CoV-2, and a kit for diagnosing SARS-CoV-2 infection.
Description
본 발명은 사스 코로나바이러스 2(SARS coronaviru 2; SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질의 효과적인 검출 또는 진단을 위해 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체와 항체를 이용한 진단 키트에 관한 것이다.The present invention relates to a diagnostic kit using a receptor and antibody binding to the
처음 중국 우한에서 시작되어 유행으로 번진 사스 코로나바이러스 2의 유전자 서열이 공개되면서 WHO는 SARS-CoV-2의 분자 유전자 진단법을 홈페이지에 공개하였다 (https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance).As the gene sequence of
사스 코로나바이러스 2는 제1급감염병 신종감염병증후군으로 분류되어 있고 Coronaviridae에 속하는 RNA 바이러스다. 현재까지는 비말(침방울), 접촉을 통해 전파되고 있는데 특히 기침이나 재채기를 할 때 생긴 비말(침방울)을 통한 전파와 사스 코로나바이러스 2에 오염된 물건을 만진 뒤 눈, 코, 입을 만지는 경우 전파가 가능한 것으로 알려져 있다. 보통 1 내지 14일의 잠복기로 알려져 있고 평균 4 내지 7일 정도의 잠복기를 갖는다. 주요 증상으로는 발열, 권태감, 기침, 호흡곤란 및 폐렴 등 경증에서 중증가지 다양한 호흡기 감염증이 나타나고 그 외 가래, 인후통, 두통, 객혈과 오심, 설사 등을 동반하고 이를 치료하기 위해 수액 보충, 해열제 등 대증치료와 범용 항바이러스제를 임상에서 투약하고 있으나, 특이적인 항바어리스제는 전무한 상태이다. 이러한 사스 코로나바이러스 2의 감염을 진단하기 위해서는 상기도 또는 하기도 검체에서 바이러스를 분리하여 특이 유전자를 실시간 유전자 증폭을 통해서 감염 여부를 진단하고 있다.SARS-CoV-2 is an RNA virus belonging to Coronaviridae, classified as a Class I Infectious Disease Syndrome. Until now, it is spread through droplets (saliva drops) and contact. it is known It is usually known with an incubation period of 1 to 14 days, and has an average incubation period of about 4 to 7 days. The main symptoms include fever, malaise, cough, shortness of breath, and pneumonia, and various other mild to severe respiratory infections, along with sputum, sore throat, headache, hemoptysis, nausea, and diarrhea. Although symptomatic treatment and general-purpose antiviral agents are being administered in clinical practice, there is no specific anti-barrier agent. In order to diagnose the SARS-CoV-2 infection, the virus is isolated from an upper or lower respiratory tract sample and a specific gene is used to diagnose infection through real-time gene amplification.
1960년대에 처음 발견된 코로나바이러스의 명칭은 독특한 형태의 스파이크 단백질 때문에 라틴어로 왕관을 뜻하는 코로나(corona)에서 유래되었다. 원래 사람에게 감염되면 일반적인 감기 증상을 유발하지만 변종 바이러스인 사스(2003년)와 메르스(2012년)는 폐렴, 중증급성호흡기증후군을 일으켜 높은 치사율로 사망에 이르기도 했다. 사스 코로나바이러스 2는 가장 최근에 밝혀진 코로나바이러스 변종으로 유전자 구조가 사스 바이러스와 79.5%, 박쥐의 코로나바이러스와 96% 일치한다.The name of the coronavirus, first discovered in the 1960s, is derived from the Latin word corona, meaning crown, because of the unique shape of the spike protein. Originally, it caused common cold symptoms when infected with humans, but SARS (2003) and MERS (2012), which are mutated viruses, caused pneumonia and severe acute respiratory syndrome, leading to death with a high fatality rate. SARS coronavirus 2 is the most recently identified strain of coronavirus, whose genetic structure is 79.5% identical to the SARS virus and 96% identical to the bat coronavirus.
사스 코로나바이러스 2는 기존의 사스 코로나바이러스와 같이 주로 구강 점막과 폐를 통해 인체에 감염된다. 그 이유는 앤지오텐신전환효소2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)라는 수용체와 사스 코로나바이러스 2의 스파이크 단백질이 결합해야 인체 숙주 세포 내부로 침투(entry)할 수 있다. ACE2는 심장 기능과 혈압조절에 작용하는 효소로 심장과 콩팥, 위장 점막 또는 폐에 많이 있고 그 중에서 혈류를 타고 가야하는 내장기관보다 호흡기를 통해 감염될 활률이 더 높다고 알려져 있다. 중국 서호 고등연구원과 칭화대 공동연구팀은 사스 코로나바이러스 2가 어떻게 인체 세포에 침투하는지를 연구한 결과, ACE2 수용체와 사스 코로나바이러스 2 스파이트 단백질의 결합 기전을 규명하는데 성공했다. 또한, 미국 텍사스대학교 미국알러지감염병연구소 백신 연구센터 공동연구팀도 중국 공동연구팀과 동일하게 Cryo-EM 기술을 이용해서 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질이 기존 사스 코로나바이러스 스파이크 단백질 보다 ACE2 수용체에 대한 결합력이 훨씬 높다는 결과를 보고했다. 이러한 결합력의 차이는 인체 숙주 세포의 수용체인 ACE2와 더 잘 달라붙기 때문에 사스 코로나바이러스 2의 높은 전염성을 설명하는 하나의 단서가 될 수도 있다
기존 바이러스 검출은 PCR(유전자 증폭) 등의 분자생물학적 방법을 사용하는데 PCR 기법은 시간에 비례해서 지수적으로 증폭되기 때문에 민감도는 높지만 전문적인 전처리가 필요하고 복잡하고 전문적인 실험의 수행과 장비가 필요해 현장 적용의 어려움이 있다. 현재 사스 코로나바이러스 2 감염 환자의 검체로부터 실험실에서 바이러스 RNA를 추출하고 이를 움로 역전사하여 얻은 cDNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 및/또는 프로브를 이용해 실시간 유전자 증폭(Real-time RT-PCR)을 통해 바이러스 감염 여부를 진단하고 있다. 그러나 이러한 실시간 유전자 증폭은 신속한 현장진단(pint-of care)에 활용이 어렵다는 단점이 있다.Existing virus detection uses molecular biological methods such as PCR (gene amplification), but the PCR technique has high sensitivity because it is amplified exponentially in proportion to time, but it requires specialized pretreatment and complicated and specialized experiments and equipment. There are difficulties in field application. Viruses through real-time RT-PCR using primers and/or probes that specifically bind to cDNA obtained by extracting viral RNA from a sample of a patient currently infected with SARS-CoV-2 in the laboratory and reverse transcribed it Diagnosing infection. However, such real-time gene amplification has a disadvantage in that it is difficult to utilize it for rapid pint-of care.
현재 사스 코로나바이러스 2 진단 검사에 사용되는 혈청학적 검사를 통한 항체를 검출하는 진단법이 개발되어 있으나, 이는 감염 환자 혈액의 IgM과 IgG 항체의 형성 유무를 검출하는 것으로 감염 초기 항체가 형성되어 있지 않아 진단이 어려운 단점이 있다.Currently, a diagnostic method to detect antibodies through a serological test used for the
사스 코로나바이러스 2 항원 진단을 위해 효소면역분석법이 개발되었으나, 이는 여러 과정이 필요하고 많은 시간이 소요되며 고장의 장비가 필요하기 때문에 간편하고 신속한 진단에는 어려움이 있으며, 신속검사방법(rapid kit) 보다 비용이 비싼 단점이 있다. 한편 측방 유동 검정방법(lateral flow assay)을 이용한 면역검사법은 항원과 항체의 반응 유무를 눈으로 식별할 수 있는 나노입자나 형광을 검침하는 방법으로 신속한 진단이 가능하며 효소면역분석법에 비해 비용이 저렴한 장범이 있다. 그러나 기존의 측방 유동 검정방법을 이용한 신속검사방법은 항원에 결합하는 2종의 항체 짝이 필요 하는 등 항체 개발에 많은 비용과 시간이 소요되는 단점이 있다.Enzyme immunoassay has been developed for the diagnosis of the
이에 본 발명에서는 기존의 항원에 결합하는 2종의 항체 짝 대신 수용체와 항체 간의 짝을 이용해 측방 유동 검정방법을 이용한 신속한 진단기술을 개발하고자 하였다.Therefore, in the present invention, it was attempted to develop a rapid diagnostic technology using a lateral flow assay method using a pair between a receptor and an antibody instead of two types of antibody pairs that bind to an existing antigen.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질의 검출 또는 진단을 위하여 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체와 항체가 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다. The present invention was derived from the above needs, and the present inventors completed the present invention by confirming that the receptor and antibody binding to the
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체; 상기 수용체와 짝을 이룰 수 있으면서 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질에 결합하는 항체; 상기 항체는 눈으로 식별 가능한 나노구조체가 결합되어 있거나, 상기 항체를 인식하는 눈으로 식별 가능한 나노구조체가 결합된 이차항체를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물을 제공한다. In order to solve the above problems, the present invention is a receptor that binds to the
또한, 본 발명은 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체; 상기 수용체와 짝을 이룰 수 있으면서 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질에 결합하는 항체; 상기 항체는 눈으로 식별 가능한 나노구조체가 결합되어 있거나, 상기 항체를 인식하는 눈으로 식별 가능한 나노구조체가 결합된 이차항체를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 감염증 진단용 조성물을 제공한다. In addition, the present invention is a receptor that binds to the
또 다른 예로, 본 발명은 제1항의 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물과 분리된 시료를 반응시키는 단계; 대조군으로 항원이 포함되어 있지 않은 시료를 반응시키는 단계; 20분 동안 반응시키는 단계; 및 검출점에서 나오는 신호를 분석하는 단계;를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출방법을 제공한다.In another example, the present invention comprises the steps of reacting the separated sample with the composition for detecting
본 발명은 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체; 상기 수용체와 짝을 이룰 수 있으면서 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질에 결합하는 항체; 상기 항체는 눈으로 식별 가능한 나노구조체가 결합되어 있거나, 상기 항체를 인식하는 눈으로 식별 가능한 나노구조체가 결합된 이차항체를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물 및 사용설명서를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 감염증 진단용 키트를 제공한다. The present invention relates to a receptor that binds to the
본 발명은 기존의 항원 단백질을 검출하는 대표적인 방법으로 포획항체와 검출항체를 이용한 면역진단법을 대체하여 개발한 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체 및 항체를 포함하는 진단 키트에 대한 것으로서, 사스 코로나바이러스 2 검출 또는 사스 코로나바이러스 2 감염증 진단에 유용하게 사용될 수 있다. The present invention relates to a diagnostic kit comprising a receptor and an antibody that binds to the
도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 세포내 수용체(ACE2)-기반 LFIA를 나타낸 것이다. a) 사스 코로나바이러스 2에 의한 ACE2 수용체 인식의 모식도. ACE2는 폐, 심장, 신장 및 장에서 발현되는 제1형 막 단백질로서 사스 코로나바이러스 2에 대한 세포 수용체이다. b) 샘플 패드, 결합 패드, 니트로셀룰로스 멤브레인 및 ㅎ흡수 패드로 구성된 E2-기반 LFIA의 모식도. 니트로셀룰로스 멤브레인에 위치한 검출선은 사스 코로나바이러스 2 스파이크 항원의 검출을 위한 ACE2를 포함한다. 항-IgG 항체는 대조선에 사용된다. 제안된 LFIA는 20분 내에 사스 코로나바이러스 2 스파이크 항원에 대한 민감하고 선택적인 검출을 달성할 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 세가지 다른 코로나바이러스 (사스 코로나바이러스 S1, 사스 코로나바이러스 2 S1 및 메르스 S1)의 스파이크 항원에 대한 간접 ELISA 결과를 나타낸 것이다. a) S1 항원과 ACE2 사이의 상호작용은 연속적인 희석 샘플(농도범위는 200 내지 0.05 ng/mL)에서 검사되었다. 추가적으로 3가지 다른 항체인 CR3022(black) (b); F26G19 (red) (c); 및 S1-mAb (orange) (d)를 동일 농도로 사용하여 스파이크 항원에 대한 상호작용을 검사하였다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 사스 코로나바이러스 2 S1 항원에 대한 ACE2, CR3022, F26G19 및 S1-mAb의 바이오레이어 간섭(BLI) 결과를 나타낸 것이다. 점이 형성된 선(dotted line)은 BLI 측정의 반응 곡선을 나타내는 것이고, 실선(solid lines)은 1:1 결합 모델에 기반한 적정 곡선을 나타내는 것이다. 결합역학은 S1 항원의 4가지 다른 농도에 대하여 측정되었다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 사스 코로나바이러스 2 스파이크 항원의 검출을 위한 샌드위치 짝의 확인 결과를 나타낸 것이다. a) 검출 프로브(capture probe)로서 ACE2를 사용한 LFIA의 개략적인 다이어그램 및 짝을 이룬 항체(CR3022, F26G19 및 S1mAb)로부터 얻은 샌드위치 분석 결과. 사스 코로나바이러스 2 S1 항원 (50 ng)은 양성 대조군으로 사용되었고, S1 항원을 포함하지 않은 버퍼는 음성 대조군으로 사용되었다. 20분 후, 스트립은 스마트폰으로 촬영되었고, 피크 밀도를 분석하였다. b) 검출 프로브로서 항체를 사용한 경우 LFIA 모식 다이어그램 및 샌드위치 분석 결과. c) 검출 프로브(capture probe, PC)-진단 프로브(detection probe, PD) 짝의 피크 밀도. 전체 12짝의 양성 대조군 (50 ng S1 항원)이 시험되었고, 밀도가 분석되었다. 피크 밀도는 점의 평균 밀도로부터 스트립의 배경 밀도를 제거하여 계산되었다.
도 5는 본 발명의 일 구현 예에 따른 ACE2-기반 LFIA의 민감도 및 특이도를 나타낸 것이다. a) 사스 코로나바이러스 2 S1 항원의 검출 민감도를 위한 ACE2-기반 LFIA의 결과. 연속 희석된 항원 농도(농도 범위는 500 내지 5 ng/mL)에서 ACE2-기반 LFIA로 시험하였다. 20분 후, LFIA 스트립은 스마트폰으로 촬영되었다. 검출선과 대조선의 밀도는 이미지 분석기에서 피크 히스토그램으로 변형되었다. b) 검출 선택성의 비교 분석결과: 양성 대조군 - 사스 코로나바이러스 S1, 음성 대조군 - 사스 코로나바이러스 S1, 메르스 S1 및 버퍼 용액. 세가지 다른 농도 (1 μg/mL, 200 ng/mL, and 50 ng/mL) 의 항원 샘플을 사용하여 ACE2-기반 LFIA의 검출 효율을 입증하였다. c) 검출선에 대한 피크 밀도 막대 그래프. 샘플 흐름을 위하여 20분 후, 검출선의 밀도가 휴대용 선 분석기로 측정되었다. Inset) 각 대조군의 반응 당 5 ng 항원에 대한 검출 밀도. 검출 한계 (limit of detection, LOD)는 음성 대조군의 평균 값 더하기 3회 시험의 표준 편차로 결정된다. P-values: ns > 0.05, *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001.
도 6은 본 발명의 일 구현 예에 따른 임상 샘플을 사용한 ACE2-기반 LFIA의 실험실 확인 결과를 나타낸 것이다. a) ACE2-기반 LFIA를 사용한 COVID-19 시험의 모식도. COVID-19 환자의 비인두 도말은 UTM에 놓는다. 사스 코로나바이러스 2를 포함하는 UTM 50 μL는 1:1(v/v) 비율로 전개 버퍼에 혼합되어 100 μL 혼합 용액이 LFIA 장치에 주입된다. 20분 후, LFIA 스트립의 선 밀도는 휴대용 분석기에서 반-정량된다. b) 배양된 사스 코로나바이러스 2의 검출 민감도에 대한 ACE2-기반 LFIA의 결과. 연속 희석된 바이러스 농도 (농도 범위는 1.07 x 108 copies/mL 내지 5.35 x 106 copies/mL) 에서 시험되었다. 20분 후, LFIA 스트립은 스마트폰으로 촬영되었고 이미지 분석기로 스캔되었다. 검출선과 대조선의 선 밀도는 피크 히스토그램으로 변환되었다. 또한, 검출선의 밀도는 휴대용 라인 분석기(IL: 검출선의 선 밀도)에서 측정되었다. 추가적으로 사람 코로나바이러스 (OC43)이 음성대조군으로 사용되었다. c) 휴대용 분석기에서 측정된 검출선에 대한 밀도의 막대 그래프. 검출 한계 (limit of detection, LOD)는 음성 대조군(0 copies/mL 사스 코로나바이러스 2)의 평균 값 더하기 3회 시험의 표준 편차로 결정된다. d) 임상 샘플을 사용하여 RT-qPCR과 비교한 ACE2-기반 LFIA의 실험실 확인결과. i) COVID-19 환자 (n=4) 및 건강한 개체 (n=4)의 비인두 도말 샘플이 ACE2-기반 LFIA 및 RT-qPCR 모두에서 측정되었다. 민감도는 실제 양성 샘플 수를 시험된 양성 샘플의 수로 나누어 결정되었다. 특이도는 실제 음성 샘플 수를 시험된 음성 샘플의 수로 나누어 결정되었다. ii) 사스 코로나바이러스 2 특이 유전자 (Env 유전자) 검출에 대한 RT-qPCR 결과. Ct 값과 임상 샘플에서 상대적인 바이러스 양이 평가되었다. e) COVID-19 환자 임상 샘플을 사용하여 실험실 확인에 관한 ACE2-기반 LFIA 결과. 샘플 로딩 후 20분에 LFIA 스트립의 검출선 밀도는 휴대용 선 분석기로 측정되었다. 검출 한계 (limit of detection, LOD)는 음성 대조군(건강 대조군)의 평균 값 더하기 3회 시험의 표준 편차로 결정된다. 1 shows an intracellular receptor (ACE2)-based LFIA according to an embodiment of the present invention. a) Schematic diagram of ACE2 receptor recognition by
2 shows the results of indirect ELISA for the spike antigen of three different coronaviruses (SARS coronavirus S1,
Figure 3 shows the bio-layer interference (BLI) results of ACE2, CR3022, F26G19 and S1-mAb to the
4 shows the results of identification of a sandwich pair for detection of the
5 shows the sensitivity and specificity of ACE2-based LFIA according to an embodiment of the present invention. a) Results of ACE2-based LFIA for detection sensitivity of
6 shows laboratory confirmation results of ACE2-based LFIA using clinical samples according to an embodiment of the present invention. a) Schematic diagram of the COVID-19 test using ACE2-based LFIA. A nasopharyngeal smear from a COVID-19 patient is placed in a UTM. 50 µL of UTM containing SARS-CoV-2 is mixed in the running buffer at a 1:1 (v/v) ratio, and 100 µL of the mixed solution is injected into the LFIA device. After 20 minutes, the linear density of the LFIA strips is semi-quantified on a handheld analyzer. b) Results of ACE2-based LFIA on detection sensitivity of
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail. In addition, in the following description, many specific details such as specific components are shown, which are provided to help a more general understanding of the present invention, and it is common in the art that the present invention can be practiced without these specific details. It will be self-evident to those who have the knowledge of And, in describing the present invention, if it is determined that a detailed description of a related known function or configuration may unnecessarily obscure the gist of the present invention, the detailed description thereof will be omitted.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체; 상기 수용체와 짝을 이룰 수 있으면서 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질에 결합하는 항체; 상기 항체는 눈으로 식별 가능한 나노구조체가 결합되어 있거나, 상기 항체를 인식하는 눈으로 식별 가능한 나노구조체가 결합된 이차항체를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a receptor that binds to the
본 발명은 숙주 세포의 표면에 발현된 수용체와 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질 간의 결합을 이용하면서, 상기 수용체와 상기 스파이크 단백질과 결합하는 항체 간의 짝을 이용한 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질 검출 또는 진단을 할 수 있는 기술을 의미한다.The present invention utilizes the binding between the receptor expressed on the surface of a host cell and the SARS-CoV-2 spike protein, and can detect or diagnose the SARS-CoV-2 spike protein using a pair between the receptor and the antibody binding to the spike protein. means the skills
본 발명의 일 구현예에 따른 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체는 ACE2(angiotensin converting enzyme 2), ACE2가 발현 또는 과발현된 세포주의 lysate가 포함되고, 바람직하게는 ACE2 단백질이나, 이에 제한되지 않는다. The receptor binding to the
본 발명의 일 구현예에 따른 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질에 대한 항체는 ACE2와 페어가 가능한 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질 항체로서, 완전한 항체, 항체 분자의 항원 결합 단편, 합성 항체, 재조합 항체, 또는 항체 하이브리드(antibody hybrid)를 포함할 수 있다. 바람직하게는 단클론 항체 또는 다클론 항체를 포함하고, 더욱 바람직하게 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질에 결합하는 항체는 S1, RBD(Receptor binding domain) 및 RBM(Receptor binding motif) 중 어느 하나를 항원으로 인식하는 항체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. The antibody against the SARS-CoV-2 spike protein according to an embodiment of the present invention is a SARS-CoV-2 spike protein antibody capable of pairing with ACE2, a complete antibody, an antigen-binding fragment of an antibody molecule, a synthetic antibody, a recombinant antibody, or an antibody It may include an antibody hybrid. Preferably, the antibody comprises a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and more preferably, the antibody binding to the
본 발명의 일 구현예에 따른 나노구조체는 눈으로 식별이 가능한 나노구조체로서, 눈으로 식별가능한 염료가 결합된 나노구조체이고, 바람직하게는 눈으로 식별가능한 염료가 결합된 셀룰로오즈 나노 입자 또는 골드 나노 입자가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. The nanostructure according to an embodiment of the present invention is a nanostructure that can be identified by the eye, and is a nanostructure to which a dye that can be identified by the eye is bound, preferably cellulose nanoparticles or gold nanoparticles to which a dye that can be identified by the eye is bound. includes, but is not limited to.
상기 눈으로 식별가능한 염료는 검출 항체 또는 이차 항체로서 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예를 들어, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예를 들어, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예를 들어, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함할 수 있다.The visually identifiable dye has a label that generates a detectable signal as a detection antibody or a secondary antibody. The label may include chemicals (eg biotin), enzymes (alkaline phosphatase, β-galactosidase, horse radish peroxidase and cytochrome P450), radioactive materials (eg C14, I125). , P32 and S35), a fluorescent material (eg, fluorescein), a light emitting material, a chemiluminescent material, and fluorescence resonance energy transfer (FRET).
상기 시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질일 수 있다. 상기 개체는 척추동물일 수 있다. 상기 척추동물은 포유동물일 수 있다. 상기 포유동물은 인간 및 비인간 영장류를 포함한 영장류, 낙타, 또는 마우스 및 래트를 포함한 설치류일 수 있다. 상기 시료는 냉동 보관된 것 또는 자연 상태에 방치된 것일 수 있다. 상기 시료는 물 시료, 흙 시료, 음식 시료, 공기 시료, 비강 면봉 시료, 비인두 세척액(nasopharyngeal wash), 기관지폐포세척액(branchioalveolar lavage), 또는 흉수(Pleural fluid)일 수 있다. 상기 생물학적 물질은 비강 도말(nasal swap), 비강 흡인액 (nasal aspirate), 비인두도말(nasopharyngeal swab), 비인두흡인액(nasopharyngeal aspirate), 혈액 또는 혈액 구성성분(blood constituent), 체액 (bodily fluid), 타액, 가래, 또는 이들의 조합일 수 있다.The sample may be a biological material derived from a subject. The subject may be a vertebrate. The vertebrate may be a mammal. The mammal may be a primate including humans and non-human primates, a camel, or a rodent including mice and rats. The sample may be stored frozen or left in a natural state. The sample may be a water sample, a soil sample, a food sample, an air sample, a nasal swab sample, a nasopharyngeal wash, a branchioalveolar lavage, or a pleural fluid. The biological material may include nasal swap, nasal aspirate, nasopharyngeal swab, nasopharyngeal aspirate, blood or blood constituent, body fluid. fluid), saliva, sputum, or a combination thereof.
본 발명은 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체; 상기 수용체와 짝을 이룰 수 있으면서 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질에 결합하는 항체; 상기 항체는 눈으로 식별 가능한 나노구조체가 결합되어 있거나, 상기 항체를 인식하는 눈으로 식별 가능한 나노구조체가 결합된 이차항체를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 감염증 진단용 조성물을 제공한다. The present invention relates to a receptor that binds to the
본 발명은 사스 코로나바이러스 2가 감염될 수 있는 다양한 개체에서 사스 코로나바이러스 2 감염증(COVID-19) 진단용 조성물을 제공한다. 상기 사스 코로나바이러스 2 감염증은 독감, 감기, 인후염, 기관지염 또는 폐렴을 포함하는 것일 수 있으나, 사스 코로나바이러스 2 감염으로 인해 발생하는 질환이라면 이에 한정되는 것은 아니다. The present invention provides a composition for diagnosing SARS-CoV-2 infection (COVID-19) in various individuals that can be infected with SARS-CoV-2. The SARS-CoV-2 infection may include flu, cold, sore throat, bronchitis or pneumonia, but is not limited thereto as long as it is a disease caused by SARS-CoV-2 infection.
또한, 본 발명은 제1항의 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물과 분리된 시료를 반응시키는 단계; 대조군으로 항원이 포함되어 있지 않은 시료를 반응시키는 단계; 20분 동안 반응시키는 단계; 및 검출점에서 나오는 신호를 분석하는 단계;를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출방법을 제공한다.In addition, the present invention comprises the steps of reacting the separated sample with the composition for detecting
본 발명은 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체; 상기 수용체와 짝을 이룰 수 있으면서 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질에 결합하는 항체; 상기 항체는 눈으로 식별 가능한 나노구조체가 결합되어 있거나, 상기 항체를 인식하는 눈으로 식별 가능한 나노구조체가 결합된 이차항체를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물 및 사용설명서를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 감염증 진단용 키트를 제공한다. The present invention relates to a receptor that binds to the
본 발명의 진단키트에서 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체는 고체 지지체 상에 고정된 상태로 이용될 수 있다. 다양한 물질이 고체 지지체로 사용될 수 있으며, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐클로라이드, 실리카겔, 폴리스티렌, 나일론, 활성화된 비드 등을 예로 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In the diagnostic kit of the present invention, the receptor binding to the
이러한 진단키트에는 본 발명의 당 분야에서 면역학적 분석에 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 도구 또는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.Such a diagnostic kit may further include tools, reagents, and the like generally used for immunological analysis in the field of the present invention. Such tools or reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labels capable of generating a detectable signal, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like.
본 발명의 일 구현예에서 "키트"는 분석물을 포함하는 액체 시료가 적용되는 부위인 검체 패드(sample pad), 상기 검체 패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고, 눈으로 식별가능한 염료가 결합된 나노구조체가 이동가능하게 지지되어 있는 결합 패드(conjugate pad)로서, 상기 눈으로 식별가능한 염료가 결합된 나노구조체는 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 항체 또는 그의 단편과 눈으로 식별가능한 염료가 결합된 나노구조체이고, 상기 결합 패드와 유체 소통가능하게 연결되어 있고 모세관 이동에 의하여 상기 액체 시료가 이동하는 크로마토그래피 막 물질로서, 상기 결합 패드의 하류에 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체 또는 그의 단편이 비확산적으로 고정화되어 있는 검출 영역을 포함하는 크로마토그래피 막 물질, 상기 크로마토그래피 막 물질과 유체 소통가능하게 연결되어 있는 흡습 패드(absorbent pad) 및 상기 검체 패드, 결합 패드, 크로마토그래피 막 물질 및 흡습 패드를 지지하는 고체 지지체를 포함하는 사스 코로나바이러스 2를 검출하기 위한 진단 키트일 수 있다. In one embodiment of the present invention, a "kit" is a sample pad, which is a site to which a liquid sample containing an analyte is applied, is fluidly connected to the sample pad, and a dye that can be identified by the eye is bound. As a conjugate pad on which the nanostructure is movably supported, the nanostructure to which the eye identifiable dye is bound is an antibody or fragment thereof that binds to the
도 1b는 본 발명의 사스 코로나바이러스 2 또는 사스 코로나바이러스 2의 스파이크 단백질을 검출 또는 진단하기 위한 진단 키트의 일 예를 나타내는 모식도이다.1B is a schematic diagram showing an example of a diagnostic kit for detecting or diagnosing
상기 키트는 고체 지지체 상에 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질에 결합할 수 있는 수용체가 고정화되어 있는 검출 영역(T)과 대조 영역(C)이 형성되어 있는 크로마토그래피 물질 막이 지지되어 있고, 여기에 검체 패드, 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질에 결합하는 항체와 눈으로 식별가능한 염료가 결합된 나노구조체가 지지되어 있는 결합 패드 및 흡습 패드가 중첩되어 연결되어 있다. 스트립에 시료를 검체패드에 첨가하면, 모세관 현상에 의하여 결합 패드로 이동하여 시료 중의 항원은 결합 패드 중의 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질에 결합하는 항체와 눈으로 식별가능한 염료가 결합된 나노구조체와 결합하고 크로마토그래피 물질 막을 통하여 흡습 패드의 방향의 하류로 모세관 이동하게 된다. 항원과 나노구조체의 결합체가 검출 영역(T)에 도달하게 되면 발색하게 되고, 결합체가 없는 경우 발색을 하지 않게 된다. 또한, 시료와 함께 항체와 나노구조체의 접합체는 대조 영역(C)을 통과하는 경우에는 접합체에 특이적인 항체와 결합하여 발색함으로써, 모세관 이동이 제대로 되었는지를 확인할 수 있다. In the kit, a chromatography material membrane having a detection region (T) and a control region (C) on which a receptor capable of binding to the SARS-CoV-2 spike protein is immobilized is supported on a solid support, and a sample pad is supported therein. , A binding pad and a moisture absorption pad on which a nanostructure in which an antibody binding to the SARS-CoV-2 spike protein and an eye-distinguishable dye are supported are superimposed and connected. When the sample is added to the sample pad on the strip, it moves to the binding pad by capillary action, and the antigen in the sample binds to the nanostructure in which the antibody binding to the SARS-CoV-2 spike protein in the binding pad and the visually identifiable dye are bound. A capillary migration occurs downstream in the direction of the absorbent pad through the membrane of the chromatography material. When the antigen-nanostructure conjugate reaches the detection region (T), color is developed, and when the conjugate is not present, color is not developed. In addition, when the conjugate of the antibody and the nanostructure together with the sample passes through the control region (C), it is combined with an antibody specific for the conjugate and develops color, thereby confirming whether the capillary movement is correct.
상기 키트는 항원 또는 항체와 같은 면역화학 성분의 고상 담체로서 다공성 물질을 이용하는 면역분석 키트일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서 사용되는 검체패드, 결합 패드, 크로마토그래피 막 물질 및 흡습 패드는 분석될 액체 시료를 수용하고 포함하기 충분한 다공성 (porosity)과 부피를 가진 물질이며, 예를 들면 마이크로다공성 막 물질일 수 있다. 상기 마이크로다공성 막 물질의 예에는 나일론, 셀룰로즈 물질, 폴리술폰, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 폴리에스테르 및 유리 섬유가 포함된다. 상기 마이크로다공성 막 물질의 바람직한 예는, 니트로셀룰로오즈 막이다. 상기 분석 장치는 스트립의 형태를 가질 수 있다.The kit may be an immunoassay kit using a porous material as a solid carrier of an immunochemical component such as an antigen or antibody. The sample pad, binding pad, chromatography membrane material and moisture absorption pad used in one embodiment of the present invention are materials having sufficient porosity and volume to accommodate and contain a liquid sample to be analyzed, for example, a microporous membrane. It may be a substance. Examples of the microporous membrane material include nylon, cellulosic material, polysulfone, polyvinylidene difluoride, polyester, and glass fiber. A preferred example of the microporous membrane material is a nitrocellulose membrane. The analysis device may have the form of a strip.
본 발명의 일 구현예의 키트에 사용되는 항체와 눈으로 식별가능한 염료가 결합된 나노구조체는 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 의하여 제조될 수 있다. The nanostructure in which the antibody used in the kit of one embodiment of the present invention is coupled with an eye-identifiable dye can be prepared by a method well known in the art.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.Advantages and features of the present invention, and methods for achieving them, will become apparent with reference to the embodiments described below in detail. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but will be implemented in a variety of different forms, and only these embodiments allow the disclosure of the present invention to be complete, and common knowledge in the technical field to which the present invention belongs It is provided to fully inform the possessor of the scope of the invention, and the present invention is only defined by the scope of the claims.
<실시예 1> Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)<Example 1> Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
Maxisorp 면역플레이트 (ThermoFisher SCIENTIFIC, MA, USA)를 웰당 다양한 농도(200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 0 ng/mL)의 SARS-CoV-2 S1 단백질(S1 subunit, Cat. No. 40591-V08H; Sino Biological, Beijing, China)로 100 μL씩 분주하여 4°C에서 밤새 코팅하였다. 면역플레이트는 1시간 동안 블로킹버퍼 (Cat. No. DS98200; Invitrogen, CA, USA)로 블로킹한 다음 hACE2, CR3022, F26G19 또는 S1-mAb를 100 μL 블로킹버퍼에 용해하여 각 웰에 첨가한 후 1시간 동안 반응시켰다. 워싱버퍼(Cat. No. WB01; Invitrogen)로 세척한 후, 결합된 수용체와 항체는 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG (1:2000; Cat. No. 31437; Invitrogen), anti-human IgG (1:2000; Cat. No. 31413; Invitrogen) 또는 anti-rabbit IgG (1:2000; Cat. No. 31463; Invitrogen) 검출 항체와 1시간 동안 반응시켰다. 다시 세척과정을 진행하고 TMB 용액(TMB solution, Cat. No. SB01; Invitrogen)을 100 μL 씩 분주하여 면역플레이트 내에서 색깔이 변화하는 과정을 지켜본 후, STOP 용액(1M HCl)을 분주하여 반응을 정지시킨다. 그후 마이크로플레이트 리더(BioTek, VT, USA)를 사용하여 450 nm에서 시료의 흡광도를 측정하였다. Maxisorp immunoplates (ThermoFisher SCIENTIFIC, MA, USA) were applied to various concentrations (200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12, 0 ng/mL) per well of SARS-CoV-2 S1 protein (S1 subunit, Cat. No 40591-V08H; Sino Biological, Beijing, China) was aliquoted in 100 μL and coated overnight at 4 °C. Immunoplate was blocked with blocking buffer (Cat. No. DS98200; Invitrogen, CA, USA) for 1 hour, and then hACE2, CR3022, F26G19 or S1-mAb was dissolved in 100 μL blocking buffer and added to each well for 1 hour. reacted while After washing with washing buffer (Cat. No. WB01; Invitrogen), the bound receptor and antibody were horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG (1:2000; Cat. No. 31437; Invitrogen), anti-human IgG (1:2000; Cat. No. 31413; Invitrogen) or anti-rabbit IgG (1:2000; Cat. No. 31463; Invitrogen) detection antibody was reacted for 1 hour. Continue the washing process again, and after dispensing 100 μL of TMB solution (TMB solution, Cat. No. SB01; Invitrogen) to watch the process of color change in the immunoplate, STOP solution (1M HCl) is dispensed to initiate the reaction. stop Then, the absorbance of the sample was measured at 450 nm using a microplate reader (BioTek, VT, USA).
<실시예 2> Biolayer interferometry (BLI, 바이오레이어 간섭측정)<Example 2> Biolayer interferometry (BLI, biolayer interferometry)
Fc-tag가 결합된 사람 ACE2 (ACE2, Cat. No. 10108-H05H) 및 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단클론 항체(S1-mAb, Cat. No. 40150-R007), 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질(S1 subunit, Cat. No. 40591-V08H) 및 사스 코로나바이러스 2 RBD (Cat. No. 40592-V08B)를 Sino Biological로부터 구입하였다. 각 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 플라스미드는 1:6의 비율로 혼합하여 PEI 용액(PolyScience, PA, USA)을 사용하여 293-F 세포에 일시적으로 공동감염시켰다. 감염 후 6일에 상층액을 수거하여 단백질 A 컬럼(GE Healthcare, IL, USA)을 이용하여 CR3022와 F26G19를 정제하였다. 사스 코로나바이러스 2 스파이크 항원(S1과 RBD)에 대한 결합 친화도 및 4 종의 다른 항체(ACE2, CR3022, F26G19, 및 S1-mAb)로 BLITz 장치(ForteBio, CA, USA) 상에서 BLI를 분석하였다. 바이오센서(포르테바이오, 미국)를 10분간 3차 증류수에서 수화반응 시킨 후, 바이오레이어 간섭측정법을 이용한 결합 친화도 측정은 5단계로 이루어진다 [1. 초기 기준선 설정 (30초), 2. 항체 고정화 (300초), 3. 2차 기준선 설정 (120초), 4. 항체-항원 결합 (300초), 5. 항체-항원 해리 (300초)]. 모든 과정은 샘플 희석 완충액(0.02% Tween 20, 150 mM NaCl, and 1 mg/mL BSA in 10 mM PBS with 0.05% sodium azide, pH 7.4)을 사용하여 수행된다. 샘플 로딩 단계에서, 각 항체(100 μg/mL)는 바이오센서 표면에 코팅되어 있는 단백질 A와 항체 (또는 수용체)의 Fc 도메인과의 결합을 통해 고정화된다. 초기 기준선 설정 후, 네 종류의 각기 다른 농도의 항원을 항체-결합 바이오센서와 반응시켜 항체-항원 결합을 확인하였다. 4 종류의 결합곡선은 1:1 결합 모델을 기반으로 분석되었으며, 이를 기반으로 결합상수를 구하였다. Fc-tag-bound human ACE2 (ACE2, Cat. No. 10108-H05H) and
<실시예 3> 항체-결합 CNB 준비<Example 3> Antibody-binding CNB preparation
Red cellulose nanobeads (CNBs) 1% 스탁 용액을 Asahi Kasei Fibers Corporation (NanoAct, Cat. No. RE2AA; Miyazaki, Japan)로부터 구입하였고, 비드의 평균 직경은 345 nm 였다. CNB 결합 키트는 결합버퍼, 블로킹버퍼, 및 워싱 버퍼를 포함하고 있고, DCN Diagnostics (CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 사스 코로나바이러스 2 항원-특이적인 항체(CR3022, F26G19, S1mAb) 와 결합 단백질(ACE2)을 CNB의 표면에 결합시켜 제조자의 지침에 따라 시험을 수행하였다. 간단히 요약하면, 0.5 mg/mL 항체 0.12 mL을 1% CNB 스탁 용액 0.60 mL과 결합버퍼 0.12 mL에 혼합하여 37°C에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 블로킹 버퍼 7.2 mL을 혼합하여 37°C에서 1시간 동안 추가적으로 반응시켰다. 용액을 원심분리(14,400 x g, 20 minutes, 4°C)하였고, 펠렛을 워싱버퍼 7.2 mL에 재현탁하였다. 원심분리(14,400 x g, 20 minutes, 4°C) 후, 워싱된 펠렛을 워싱버퍼 0.5 mL에 재현탁하였다. 항체-결합 CNB의 최종 농도는 대략 0.1%였다. CNB의 정확한 농도는 UV-vis spectrophotometry (Synergy H1; BioTek)로 554 nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였다. A 1% stock solution of red cellulose nanobeads (CNBs) was purchased from Asahi Kasei Fibers Corporation (NanoAct, Cat. No. RE2AA; Miyazaki, Japan), and the average diameter of the beads was 345 nm. The CNB binding kit includes a binding buffer, a blocking buffer, and a washing buffer, and was purchased from DCN Diagnostics (CA, USA).
<실시예 4> LFIA 스트립 제조<Example 4> LFIA strip preparation
LFIA 스트립은 도 1b에서 제시한 바와 같이, 샘플 패드(Ahlstrom, Helsinki, Finland), 결합패드 (Ahlstrom, Helsinki, Finland), 니트로셀룰로오즈 멤브레인 (nitrocellulose membrane, NC membrane), 및 흡수 패드 (Ahlstrom, Helsinki, Finland)로 구성된다. 결합 패드를 CNB 고정 전 0.1% Triton X-100 (Cat. No. T8787; Sigma-Aldrich, MO, USA)으로 처리하였다. 완전히 건조시킨 후, 항체-결합 CNB 용액 0.05%를 포함하는 안정화버퍼(10 mM 2-amino-2-methyl-1-propanol (pH 9.0), 0.5% BSA, 0.5%β-Lactose, 0.05% Triton X-100, and 0.05% sodium azide)를 결합 패드에 스프레이하였고, 진공 건조기(FDU-1200, EYELA, Tokyo, Japan; JSVO-30T, JSR, Gongju, Korea)에서 37°C로 1시간 동안 반응시켰다. 검출 프로브 (capture probe)를 포함하는 검출선(test line)과 대조선(control line)은 선 분리기 (line dispenser, BTM Inc., Uiwang, Korea)를 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인 상에서 다음 조건으로 나누어졌다(dispensing speed, 50 mm/s; dispensing rate, 1 uL/cm). 샘플희석버퍼(Cat. No. ab154873; Abcam, Cambridge, UK)에 ACE2 (1 mg/mL)과 0.5 mg/mL 항-면역글로불린 G 항체 혼합액 [1:1:1 (v/v/v)의 anti-human IgG (Cat. No. I2136, Sigma-Aldrich)/anti-rabbit IgG antibody (Cat. No. R5506, Sigma-Aldrich)/anti-mouse IgG antibody (Cat. No. A4416, Sigma-Aldrich)]을 포함하여 시험선 및 대조선 각각의 형성에 사용하였다. 선 분리 후, 니트로셀룰로스 멤브레인은 3°C에서 1시간 동안 건조시켰다. 진단 프로브 (detection probe) 및 검출선에서 검출 프로브 (capture probe) 사이의 비-특이적인 반응을 감소시키기 위하여, 니트로셀룰로스 멤브레인에 블로킹 용액(10 mM 2-amino-2-methyl-1-propanol (pH 9.0), 0.5% BSA, 0.5% β-Lactose, 0.05% Triton X-100, 0.05% sodium azide)을 진공 건조기(37°C)에서 1시간 동안 처리하였다. LFIA 스트립의 각 구성은 정확하게 조립되었고 38 mm 넓이로 잘라 단일 LFIA 테스트를 위하여 보관하였다. As shown in Fig. 1b, the LFIA strips were prepared from a sample pad (Ahlstrom, Helsinki, Finland), a bonding pad (Ahlstrom, Helsinki, Finland), a nitrocellulose membrane (NC membrane), and an absorbent pad (Ahlstrom, Helsinki, Finland). Binding pads were treated with 0.1% Triton X-100 (Cat. No. T8787; Sigma-Aldrich, MO, USA) prior to CNB fixation. After complete drying, a stabilization buffer containing 0.05% antibody-conjugated CNB solution (10 mM 2-amino-2-methyl-1-propanol (pH 9.0), 0.5% BSA, 0.5% β-Lactose, 0.05% Triton X) -100, and 0.05% sodium azide) was sprayed onto the bonding pad, and reacted in a vacuum dryer (FDU-1200, EYELA, Tokyo, Japan; JSVO-30T, JSR, Gongju, Korea) at 37°C for 1 hour. A test line and a control line containing a capture probe were divided into the following conditions on a nitrocellulose membrane using a line dispenser (BTM Inc., Uiwang, Korea). speed, 50 mm/s; dispensing rate, 1 uL/cm). A mixture of ACE2 (1 mg/mL) and 0.5 mg/mL anti-immunoglobulin G antibody [1:1:1 (v/v/v)] in sample dilution buffer (Cat. No. ab154873; Abcam, Cambridge, UK) anti-human IgG (Cat. No. I2136, Sigma-Aldrich)/anti-rabbit IgG antibody (Cat. No. R5506, Sigma-Aldrich)/anti-mouse IgG antibody (Cat. No. A4416, Sigma-Aldrich)] was used for the formation of test lines and control lines, respectively. After line separation, the nitrocellulose membrane was dried at 3 °C for 1 h. To reduce non-specific reactions between the diagnostic probe and the capture probe at the detection line, a blocking solution (10 mM 2-amino-2-methyl-1-propanol (pH) 9.0), 0.5% BSA, 0.5% β-Lactose, 0.05% Triton X-100, 0.05% sodium azide) in a vacuum dryer (37°C) for 1 hour. Each component of the LFIA strip was correctly assembled and cut to 38 mm wide and stored for single LFIA testing.
<실시예 5> Dot-blot assay for the discovery of sandwich pairs<Example 5> Dot-blot assay for the discovery of sandwich pairs
사스 코로나 바이러스 2 스파이크 항원을 검출하기 위한 적절한 짝을 찾기 위하여 12개의 검출 프로브-진단 프로브 짝을 시험하였다. 4개의 다른 사스 코로나 바이러스 2 S1 및 RBD 항체의 친화도는 ELISA, Western blot 및 BLI로 확인하였다. 검출 프로브(1 mg/mL)와 0.5 mg/mL 항-면역글로불린 G 항체 혼합액 [1:1:1 (v/v/v)의 anti-human IgG/anti-rabbit IgG antibody/anti-mouse IgG antibody]을 포함하여 시험점(test dots) 및 대조선(control dots) 각각의 형성에 사용하였다. 점들은 니트로셀룰로스 멤브레인(Advanced Microdevices) 상에 검출 또는 대조 용액 0.5 uL를 떨어뜨려 고정화하였다. 니트로셀룰로스 멤브레인은 블로킹 용액(10 mM 2-amino-2-methyl-1-propanol (pH 9.0), 0.5% BSA, 0.5 % β-lactose, 0.05% Triton X-100, 0.05% sodium azide) 으로 진공건조기(1시간, 37°C)에서 반응시켰다. Dot-blot 분석을 위한 LFIA 스트립은 상기에서 제시한 방법으로 제작하였다. 12 쌍의 비교분석을 위하여 50 ng의 표적 항원(사스 코로나바이러스 2 스파이크 S1)을 각 검출 프로브로 전개버퍼(running buffer)[10 mM adenosine monophosphate (AMP, pH 9.0), 5 mM EDTA, 200 mM Urea, 1% Triton X-100, 0.5% Tween 20, 500 mM NaCl, 1% PEG (MW 200)] 로 실온에서 10분간 반응시켰고, 이후 LFIA 스트립 상에 혼합된 샘플을 로딩하였다. 20분 후 항원 검출을 나타내는 빨간 신호를 통해 직접 관찰(naked eye) 및 스마트폰 카메라를 통해 확인하였다. 추가적으로 모든 점들은 image analyzer (Sapphire Biomolecular Imager, Azure Biosystems, CA, USA)를 사용하여 정량적으로 분석하였고, 상대적인 각 점의 밀도는 배경을 제외한 점의 평균 밀도에 근거하여 계산하였다.Twelve detection probe-diagnostic probe pairs were tested to find an appropriate pair for detecting the
<실시예 6> LFIA 분석의 민감도 및 특이도<Example 6> Sensitivity and specificity of LFIA assay
사스 코로나 바이러스 2 검출을 위한 높은 민감도와 특이성을 갖는 LFIA의 개발을 위하여 CNB의 농도, 고정화된 ACE2의 농도, 및 전개 버퍼의 조성을 최적화하였다. 최종적으로 진단 프로브(detection probe)를 위한 CNB 0.05%, 고정화된 검출 프로브(capture probe)를 위한 ACE2 1 mg/mL 및 전개 버퍼 [10 mM AMP, (pH 9.0), 5 mM EDTA, 200 mM urea, 1% Triton X-100, 0.5% Tween 20, 500 mM NaCl, 1% PEG (MW 200)] 를 선택하였다. 사스 코로나바이러스 2 S1 및 사스 코로나바이러스 2 RBD 항원을 연속희석법으로 샘플희석버퍼 (Cat. No. ab154873; Abcam)에 희석하였고, 희석된 샘플은 1:9(v/v)의 비율로 전개버퍼에 혼합하였다. 희석된 샘플의 최종 농도는 500 내지 5 ng/mL 범위였다. 각 항원 농도를 포함하는 전개버퍼 100 uL를 LFIA 장치의 내부에 떨어뜨렸다. 이 시스템에서 샘플은 LFIA 스트립을 따라 모세관 힘으로 흐르고 첫번째로 항체(S1-mAb)-결합된 CNB와 만난다. 샘플의 항원은 S1-mAb와 결합된 CNB에 결합하여 항원-프로브 복합체가 형성되면 니트로셀룰로스 멤브레인에 사전-고정화된 검출 프로브 (ACE2)를 진단하게 된다. 샘플 로딩 후 20분에 검출 및 대조선에 빨간색이 나타남이 확인되고 Sapphire Biomolecular Imager에 분석된다. For the development of LFIA with high sensitivity and specificity for the detection of SARS-CoV-2, the concentration of CNB, the concentration of immobilized ACE2, and the composition of the development buffer were optimized. Finally, 0.05% CNB for the detection probe, 1 mg/mL of ACE2 for the immobilized capture probe, and development buffer [10 mM AMP, (pH 9.0), 5 mM EDTA, 200 mM urea, 1% Triton X-100, 0.5
특이성 테스트를 위하여 2가지 다른 코로나 연관 스파이크 항원(예, 사스 코로나바이러스 S1 및 메르스 S1 항원)을 세가지 농도(100, 20 및 50 ng/mL)로 준비하였다. 세가지 농도의 각 항원을 LIFA 장치에 로딩하였고, 선의 밀도는 휴대용 선 분석기(portable line analyzer, Light-G; WellsBio, Seoul, Korea)로 정량하였다. 검출선에서 양성 밀도는 휴대용 분석기의 제조자 지침에 따라 50 이상인 경우였다. 모든 실험은 3회 수행되었고, 도 5c에서 검출 한계는 음성대조군의 평균 값 더하기 3회의 표준 편차로 계산되었다. For specificity testing, two different corona-associated spike antigens (eg, SARS coronavirus S1 and MERS S1 antigen) were prepared at three concentrations (100, 20 and 50 ng/mL). Three concentrations of each antigen were loaded into the LIFA device, and the line density was quantified with a portable line analyzer (Light-G; WellsBio, Seoul, Korea). The positive density in the detection line was 50 or higher according to the manufacturer's instructions for the portable analyzer. All experiments were performed in triplicate, and the detection limit in FIG. 5c was calculated as the mean value of the negative control plus the standard deviation of 3 times.
<실시예 7> 사람 코로나바이러스-OC43 (HCoV-OC43) 및 사스 코로나바이러스 2의 분리 및 카피 수 정량<Example 7> Isolation and copy number quantification of human coronavirus-OC43 (HCoV-OC43) and
HCoV-OC43의 바이러스, 감마 방사선 처리 사스 코로나바이러스 2(Cat. No. NR-52287, BEI Resources, VA, USA)의 RNA 분리는 제조자의 지침에 따라 QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)로 수행되었다. 바이러스 RNA의 연속희석으로 HCoV-OC43 (1.16 x 1012-100 copies/μL)의 뉴클레오캡시드(N) 유전자 또는 사스 코로나바이러스 2 (7.7 x 106-100 copies/μL)의 엔벨로프 (Env) 유전자를 표준으로 표적화되었고, 분리된 바이러스 RNA는 상보적 DNA로 합성되었으며, 연속적인 RT-qPCR을 Luna® Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (New England BioLabs, MA, USA)로 제조자의 지침에 따라 수행하였다. Virus of HCoV-OC43, RNA isolation of gamma-irradiated SARS coronavirus 2 (Cat. No. NR-52287, BEI Resources, VA, USA) was performed using the QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer's instructions. was performed with Nucleocapsid (N) gene of HCoV-OC43 (1.16 x 10 12 -10 0 copies/μL) or envelope of SARS coronavirus 2 (7.7 x 10 6 -10 0 copies/μL) by serial dilution of viral RNA (Env ) gene was targeted as standard, isolated viral RNA was synthesized with complementary DNA, and continuous RT-qPCR was performed using the Luna® Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit (New England BioLabs, MA, USA) according to the manufacturer's instructions. was performed according to
HCoV-OC43 유전자의 프라이머: Primers of the HCoV-OC43 gene:
Forward 5'-AGC AAC CAG GCT GAT GTC AAT ACC Forward 5'-AGC AAC CAG GCT GAT GTC AAT ACC
Reverse 5'-AGC AGA CCT TCC TGA GCC TTC AATReverse 5'-AGC AGA CCT TCC TGA GCC TTC AAT
사스 코로나바이러스 2 Env 유전자의 프라이머: Primers of the
Forward 5'-ACA GGT ACG TTA ATA GTT AAT AGC GT Forward 5'-ACA GGT ACG TTA ATA GTT AAT AGC GT
Reverse 5'-ATA TTG CAG CAG TAC GCA CAC AReverse 5'-ATA TTG CAG CAG TAC GCA CAC A
FAM (6-carboxyfluorescein) 및 BHQ-1 (Back Hole Quencher-1) 표지 프로브:FAM (6-carboxyfluorescein) and BHQ-1 (Back Hole Quencher-1) labeled probes:
ACA CTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CGACA CTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CG
단일 스텝 RT-qPCR은 역전사 55°C 10분, 45 주기 증폭 95°C 10초, 60°C 30초로 세팅하였다. 반응은 Bio-Rad CFX 96 Touch Real-Time PCR System (CA, USA)로 분석하였다.Single-step RT-qPCR was set for reverse transcription at 55 °C for 10 min, 45 cycles of amplification at 95 °C for 10 s, and at 60 °C for 30 s. The reaction was analyzed by Bio-Rad CFX 96 Touch Real-Time PCR System (CA, USA).
<실시예 8> ACE2 기반 LFIA의 임상 사용 평가<Example 8> Evaluation of clinical use of ACE2-based LFIA
감마 방사선 처리된 사스 코로나바이러스 2의 전개버퍼에서 연속 희석하였고, 1.07 X 108 copies/mL 내지 5.35 X 106 copies/mL의 배양한 사스 코로나바이러스 2 샘플을 준비하였다. 각 바이러스 농도를 포함하는 전개버퍼 100 μL를 LFIA 장치에 떨어뜨렸다. 20분 후에 검출선에서 빨간색이 나타남이 확인되었고 LightG portable analyzer (IL: line intensity)로 정량하였다. 추가적으로 검출선 및 대조선의 밀도는 Sapphire Biomolecular Imager를 사용하여 피크 히스토그램으로 전환하였다. 사람 코로나바이러스-OC43 (HCoV-OC43)은 RT-qPCR에서 음성대조군으로 시험되었다. 두개의 다른 농도(5 X 107 copies/mL, and 5 X 106 copies/mL)가 LFIA 장치에 로딩되었다. 샘플로딩 후 20분에 검출선에서 비특이적 반응이 동일한 방법으로 평가되었다. ACE2 기반 LFIA의 임상적 사용 가능성을 평가하기 위하여 COVID-19 환자(n=4) 및 건강한 대상(n=4)로부터 채취한 비인두도말 샘플을 ACE2 기반 LFIA에 적용하였다. COVID-19 환자로부터 채취한 universal transport media (UTM) 내 비인두도말 샘플은 전북대학교병원(Korea)에서 제공받았다. 건강한 대상의 비인두도말 샘플은 LEE Biosolutions (Cat. No. 991-31-NC, MO, USA)로부터 구입하였다. 건강한 비인두도말 샘플은 UTM (Cat. No. UTNFS-3B-1, Noble Bio, Korea) 에 현탁하여 LFIA 시험에 사용하였다. COVID-19 환자 및 건강한 대상으로부터 채취한 비인두도말로부터 획득한 UTM 50 uL를 전개버퍼에 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 LFIA 장치에 로딩하였다. 20분 후에 검출선의 밀도를 LightG portable analyzer로 분석하였다. 검출 한계는 건강한 대조군의 평균값 더하기 3회의 표준 편차로 결정하였다. RT-qPCR도 임상 샘플을 사용하여 검사 효율 비교에 사용하였다. 사스 코로나바이러스 2 특이적인 엔벨로프 유전자(Env 유전자)를 검출하기 위하여 프라이머-프로브 세트를 사용하였다. 프라이머는 하기와 같다. Serial dilutions were made in the development buffer of
사스 코로나바이러스 2 Env 유전자의 프라이머: Primers of the
Forward 5'-ACA GGT ACG TTA ATA GTT AAT AGC GT Forward 5'-ACA GGT ACG TTA ATA GTT AAT AGC GT
Reverse 5'-ATA TTG CAG CAG TAC GCA CAC AReverse 5'-ATA TTG CAG CAG TAC GCA CAC A
FAM (6-carboxyfluorescein) 및 BHQ-1 (Back Hole Quencher-1) 표지 프로브:FAM (6-carboxyfluorescein) and BHQ-1 (Back Hole Quencher-1) labeled probes:
ACA CTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CGACA CTA GCC ATC CTT ACT GCG CTT CG
단일 스텝 RT-qPCR은 역전사 55°C 10분, 45 주기 증폭 95°C 10초, 60°C 30초로 세팅하였다. 반응은 Bio-Rad CFX 96 Touch Real-Time PCR System (CA, USA)로 분석하였다.Single-step RT-qPCR was set for reverse transcription at 55 °C for 10 min, 45 cycles of amplification at 95 °C for 10 s, and at 60 °C for 30 s. The reaction was analyzed by Bio-Rad CFX 96 Touch Real-Time PCR System (CA, USA).
<시험예 1> 사스 코로나바이러스 2 S1 항원과 사람 세포 수용체(ACE2)의 상호작용<Test Example 1> The interaction of
사스 코로나바이러스의 표면 스파이크 (S) 당단백질은 ACE2 수용체에 의해 인식되어 세포내 유입이 발생한다. 사스 코로나바이러스 2 및 사스 코로나바이러스의 S 단백질은 매우 유사하다(아미노산 서열 상동성: ~77%). 몇몇 연구에서 사스 코로나바이러스 2의 S 단백질은 ACE2와 반응 친화도에 있어 사스 코로나바이러스보다 뛰어나다. 표적 항원과 항체(또는 수용체) 사이의 강한 친화도는 치료제와 백신의 개발 뿐 아니라 항원 검출을 위한 민감도 높고 정확한 진단 플랫폼의 개발에 필수적이다. 사스 코로나바이러스 2 S1 단백질과 ACE2의 상호작용은 Western blot 분석, 간접 ELISA 및 BLI로 사스 코로나바이러스 2 S 단백질을 검출하여 측정하였다.The surface spike (S) glycoprotein of SARS coronavirus is recognized by the ACE2 receptor, resulting in endocytosis.
수용체 (또는 항체)와 사스 코로나바이러스 2 S1 단백질의 상호작용은 Western blot으로 측정하였다. 항-사스 코로나바이러스 2 항체(CR3022, F26G19, S1-mAb)와 사람 FC 표지된 ACE2 수용체(ACE2-Fc)는 사스 코로나바이러스 2 S1 단백질을 검출할 수 있는 것을 나타내었다. 이 상호작용은 ELISA로 확인하였고, 결과는 ACE2 수용체가 사스 코로나바이러스 S1 단백질과 비교하여 사스 코로나바이러스 2 S1 단백질과 더욱 강하게 결합하지만, 메르스 코로나바이러스 S1 단백질과는 결합하지 않는다는 것이었다. 대조적으로 상업적인 항-사스 코로나바이러스 2 항체는 사스 코로나바이러스 S1 단백질과 사스 코로나바이러스 2 S1 단백질과 비슷한 친화도를 나타내었다. ELISA에서 사스 코로나바이러스 2 S1 단백질에 대한 ACE2 수용체, CR3022, F26G19 및 S1-mAb의 검출 한계는 약 125, 3.13, 3.13 및 0.78 ng/mL이었다. 게다가 사스 코로나바이러스 2 RBD에 대한 ACE2 수용체, CR3022, F26G19 및 S1-mAb의 검출 한계는 3.13, 125, 0.05 및 0.05 ng/mL이었다. ACE2와 사스 코로나바이러스 2 S1 단백질의 자세한 결합 역학을 확인하기 위하여 BLI 방법을 사용한 결과 사스 코로나바이러스 2 스파이크(S1 및 RBD) 단백질의 2가지 변이에 대한 ACE2의 친화도를 측정하였다. 세가지 다른 상업적인 항체(CR3022, F26G19 및 S1-mAb)는 BLI 시험에서 사스 코로나바이러스 2 S1과 결합하는 것을 확인하기 위하여 사용하였다. BLI는 결합 후 간섭 패턴의 변화에 관한 생분자적 상호작용을 측정하기 위한 표지-제외 기술이다. BLI 바이오센서의 말단은 단백질 A로 코딩하였고, 이는 효과적인 표적 항체를 검출하기 위한 것이다. 세가지 다른 상업적인 항체(CR3022, F26G19 및 S1-mAb)와 ACE2-Fc는 단백질 A와 특이적인 상호작용을 통해 BLI 바이오센서의 표면에 고정화되었다. 사스 코로나바이러스 2 S1 및 RBD로 상기 항체와 상호작용을 검사하였다. 수용체(또는 항체)-항원에 대한 대표적인 실시간 결합 센스그램(dotted line) 및 보정 커브(solid line)는 도 3에 나타내었다. 4개의 다른 항원 농도에서 결합역학 분석을 수행하였고, 역학 상수는 1:1 결합 모델에 근거하여 4개의 커브로부터 계산되었다. S1 및 RBD에 대한 ACE의 KD 값은 319.7 및 13.18 nM이었다. S1의 RBD는 숙주세포의 수용체인 ACE2와 반응에 주된 역할을 한다. 이전 연구에서 사스 코로나바이러스의 삼량체 S 단백질의 각 단일체가 ACE에 결합한다는 것이 제시되었다. 전단백질 변이효소인 퓨린(furin)에 의해 사스 코로나바이러스 2의 단백질 분해적으로 활성화된 S 단백질은 RBD를 통해 ACE2에 더 높은 결합친화도를 갖는 것으로 알려져 있다. 그리하여 본 발명에서 RBD가 S1과 비교하여 더 효과적으로 ACE2에 결합할 수 있기 때문에 ACE2의 KD 값이 S1 결합과 비교하여 RBD에서 더 낮을 것으로 예상된다. 이는 또한 사스 코로나바이러스 2 S1의 단량체를 표적하여 ACE2와 항체 짝을 사용하여 항원을 검출함으로 인하여 S1 단백질을 표적화하는 것과 비교하여 더욱 효과적일 수 있음을 나타내는 것이며, RBD 자체의 검출을 수행하지 않은 이유이기도 하다. The interaction of the receptor (or antibody) with the
반면에, CR3022, F26G19 및 S1-mAb의 KD 값은 각각 S1에 대하여 185.1, 242.3 및 73.35 nM였고, RBD에 대하여 21.52, 17.99 및 12.42 nM이었다. 상기 항체 가운데 S1-mAb는 사스 코로나바이러스 2 S1에 가장 친화도가 높게 나타났고, 이는 ELISA의 결과에 상응하는 것이다. CR3022와 F26G19는 사스 코로나바이러스의 RBD르르 표적하여 중화하는 항체이다. 최근 연구에서 이 항체들이 사스-코로나바이러스 2의 RBD에 반응할 수 있다는 것이 밝혀졌음에도 불구하고, 사스 코로나바이러스 2 S1 및 RBD에 대한 상기 항체들의 친화도는 면역화 항원으로 사스 코로나바이러스 2 S1을 사용하여 제조한 S1-mAb와 비교하여 낮았다. 사스 코로나바이러스 2의 S1의 결합을 고려하더라도 ACE2가 가장 높은 KD 값을 가지고 있었다. 그러나, 사스 코로나바이러스 2 RBD에 대한 ACE2의 친화도는 다른 상업적인 항체와 유사하였으므로, 항원 검출을 위한 진단 플랫폼에서 상업적인 항체를 대신하여 ACE를 대체로 사용할 수 있는 중요한 가능성을 제기하는 것이다. 본 발명에서 KD 값은 각 실험에서 사용한 KD 값이 상이함에도 불구하고 유사한 경향성을 나타낸다. In contrast, the K D values of CR3022, F26G19 and S1-mAb were 185.1, 242.3 and 73.35 nM for S1 and 21.52, 17.99 and 12.42 nM for RBD, respectively. Among the antibodies, S1-mAb showed the highest affinity to
<시험예 2> 사스 코로나바이러스 2 S1 항원의 검출을 위한 샌드위치 짝 <Test Example 2> Sandwich pair for detection of
성공적인 표적 항원의 검출을 위하여 2가지 형태의 프로브인 검출 프로브(capture probe) 및 진단 프로브(detection probe)가 필요하고, 이는 특이적인 항원의 다른 부위를 인식한다. 그러나, 현재의 COVID-19 유행과 같은 예측할 수 없는 환경에서 2가지 다른 항체 짝의 개발은 매우 시간 소비적이고 비싼 비용을 유발하는 것일 수 있으므로, 질병의 유행을 방지하기 위한 목적을 필요하는 신속 진단 분야에 적용되기 어려운 점이 있다. 항체 생산의 이러한 단점을 극복하기 위하여 본 발명에서 세포내 수용체인 사람 ACE2를 사용하였고, 이는 표적 항원에 대한 결합 친화도가 항체를 대신하여 항체와 유사한 수준을 나타내는 것이다. For successful detection of a target antigen, two types of probes, a capture probe and a diagnostic probe, are required, which recognize different sites of specific antigens. However, in an unpredictable environment such as the current COVID-19 epidemic, the development of two different antibody pairs can be very time consuming and costly, so the field of rapid diagnostics that needs the purpose of preventing the epidemic of the disease It is difficult to apply to In order to overcome this disadvantage of antibody production, human ACE2, an intracellular receptor, was used in the present invention, which indicates that the binding affinity for the target antigen is similar to that of the antibody instead of the antibody.
본 발명에서 샌드위치 항원 검출을 위한 짝을 발견하기 위하여 dot-blot 분석을 사용하였다. ACE2와 3개의 상업적인 가용한 항체(CR3022, F26G19 및 S1-mAb)는 니트로셀룰로스 멤브레인(NC membrane)에 검출 프로브로서 고정화되었다. 그 후 다른 단백질(항체 또는 수용체)은 고정화에 사용되지 않았지만, 진단 프로브로서 신호 생성을 위한 셀룰로스 나노입자(cellulose nanobeads, CNB)에 결합되었고, 검출 효율을 평가하였다. 도 4a 및 4b에 제시한 바와 같이, 전체 12짝을 사스 코로나바이러스 2 S1 항원 검출에 사용하였고, 검출 프로브와 진단 프로브 사이의 비특이적인 상호작용을 평가하였다. 추가적으로, 각 점의 밀도는 이미지 스캐너로 분석하였다. ACE2는 검출 프로브(capture probe)로 사용하였고, S1 항원의 샌드위치 검출은 세가지 다른 진단 프로브(detection probes)에 의해 성공적으로 달성되었다. 이는 ACE의 사스 코로나바이러스 2 S1 항원에 대한 결합 사이트가 항체의 에피토프와 중복되지 않는다는 것을 나타내는 것이다. 추가적으로 본 발명에서 음성대조군(예, 항원 없음)에서 어떠한 거짓-양성 신호도 관찰되지 않았다. In the present invention, dot-blot analysis was used to find a mate for sandwich antigen detection. ACE2 and three commercially available antibodies (CR3022, F26G19 and S1-mAb) were immobilized as detection probes on a nitrocellulose membrane (NC membrane). After that, other proteins (antibodies or receptors) were not used for immobilization, but were bound to cellulose nanoparticles (CNB) for signal generation as diagnostic probes, and the detection efficiency was evaluated. As shown in FIGS. 4A and 4B , a total of 12 pairs were used for the detection of the
반면에, 항체가 검출 프로브로서 사용되면 거짓-양성 신호가 검출 및 진단 항체 상이의 비-특이적인 상호작용으로 인해 발견되었다. 알려져 있는 바와 같이, S1-mAb와 CR3022 및 S1-mAb와 F26G19 사이에서 발생하는 비-특이적인 상호작용이 발생하였다(도 4b에서 음성대조군의 빨간원). 추가적으로 CR3022의 에피토프는 F26G19의 에피토프와 중복되는 것으로 나타났으므로, 검출 점의 신호가 감소하는 결과가 나타났다. 본 발명의 결과는 샌드위치 분석을 위한 적합항 항체 짝을 찾는 것이 일부 편수에 의해 복잡하다는 것을 나타내는 것이다. 항체들을 대체하여 ACE2를 사용하는 것은 항원 진단 키트 개발을 가속화시키고 질병 유행을 효과적으로 관리할 수 있도록 돕는다. 더욱이 전체 신호로서 검출점 및 대조점 모두 ACE2가 결합된 CNB의 경우 감소하는 결과를 나타내었다. 12개의 검출-진단 프로브 짝의 평가를 통해 가장 적합한 사스 코로나바이러스-2 S1 항원을 민감하게 검출할 수 있는 짝은 검출 프로브로서 ACE2 및 진단 프로브로서 S1-mAb임을 나타내었다. On the other hand, when an antibody was used as a detection probe, a false-positive signal was found due to the non-specific interaction between the detection and diagnostic antibodies. As is known, non-specific interactions occurred between S1-mAb and CR3022 and S1-mAb and F26G19 (red circles in the negative control group in Fig. 4b). Additionally, since the epitope of CR3022 overlapped with the epitope of F26G19, the signal at the detection point decreased. The results of the present invention indicate that finding suitable antibody pairs for sandwich assays is complicated by some factors. The use of ACE2 to replace antibodies accelerates the development of antigen diagnostic kits and helps to effectively manage disease outbreaks. Moreover, as a total signal, both the detection point and the control point showed a decrease in the case of ACE2-conjugated CNB. Evaluation of 12 detection-diagnostic probe pairs indicated that the most suitable pair capable of sensitively detecting the SARS coronavirus-2 S1 antigen was ACE2 as detection probe and S1-mAb as diagnostic probe.
<시험예 3> 사스 코로나바이러스 2 S1에 대한 ACE2-기반 LFIA의 민감도 및 특이도 <Test Example 3> Sensitivity and specificity of ACE2-based LFIA for
LFIA 센서 스트립은 샘플 패드, 결합 패드, 니트로셀룰로스 멤브레인 및 흡수 패드로 구성된다. 표적 항원을 포함하는 샘플은 샘플 패드에 주입되어 연속적으로 결합 패드 상에 건조된 CNB에 접하게 된다. CNB는 소수적 및/또는 정전기적 상호작용을 통해 진단 항체(detection antibody, S1-mAb)로 코팅되어 있다. 진단 항체가 코팅된 CNB는 표적 사스 코로나바이러스 2 S1 항원에 결합하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 이동한다. 검출 프로브(ACE2)를 포함하는 검출선은 진단 프로브(S1-mAb 결합 CNB)에 의해 사전에 결합된 사스 코로나바이러스 2 S1 항원을 검출하여 사스 코로나바이러스 2 S1 항원의 샌드위치 검출이 가능하게 된다. 반면, 대조선은 샘플의 이동 및 결합 패드 상의 생물학적 분자가 활성인지 확인할 수 있는 역할을 한다. 이러한 목적으로, 항-IgG 항체가 CNB에 이미 결합된 모든 항체를 확인하기 위하여 사용된다. 검출선 및 대조선은 선 분리기(line dispenser)를 사용하여 니트로셀룰로스 멤브레인 상에 형성된다. LFIA의 검출선에서 표적항원이 검출되기 때문에 CNB의 빨간 신호는 샘플이 표적 항원을 포함하고 있는지 여부를 시각적으로 확인할 수 있게 해준다. 검출선에서 검출프로브와 진단 프로브 사이의 비특이적인 상호작용을 회피하기 위하여 니트로셀룰로스 멤브레인은 블로킹 용액으로 적절하게 처리되었다. 결합하지 않은 진단 프로브는 니트로셀룰로스 멤브레인을 통과하여 스트립의 끝에 위치한 흡수 패드에 도달하게 되고, 이는 모세관 힘에 의해 유지된다. The LFIA sensor strip consists of a sample pad, a bonding pad, a nitrocellulose membrane and an absorbent pad. A sample comprising the target antigen is injected into the sample pad, continuously contacting the dried CNB on the binding pad. CNBs are coated with a detection antibody (S1-mAb) through hydrophobic and/or electrostatic interactions. The diagnostic antibody-coated CNBs bind to the
ACE-2 기반 LFIA (ACE2-LFIA)의 검출능력을 입증하기 위하여 본 발명에서는 사스 코로나바이러스 2 특이적인 항원(S1 및 RBD, 농도범위는 5-500 ng/mL)의 연속적인 희석 샘플을 사용하여 민감도 분석을 수행하였다 샘플로딩후 20분에 LFIA 장치의 창은 스마트폰을 사용하여 촬영되었고, 검출선과 대조선의 밀도는 선의 색밀도를 신호 피크로 전환해주는 이미지 스캐너 및 분석기를 사용하여 분석하였다. S1 검출의 경우 검출 신호는 점차적으로 희석배수에 따라 감소되는 것을 알 수 있었고, 5 ng 항원인 경우에도 신호가 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 추가적으로 본 발명에서는 검출 시그날이 모든 희석샘플에서 S1과 비교하여 RBD의 경우 높다는 것을 확인하였고, RBD 1 ng에서도 ACE2-LFIA에서 검출되는 것을 확인하였다. 여기에서 음성 대조군(예, 표적 항원 부존재)에서는 거짓-양성 신호가 관찰되지 않았다. 셀룰로스 나노입자(cellulose nanobead, CNB)는 LFIA에서 색 표지를 위해 사용되는 것으로 콜로이드성 금보다 더 높은 민감도를 갖는 것으로 알려져 있다. 그리하여, 본 발명에서 콜로이드성 금과 CNB의 검출 민감도를 비교하였다. 콜로이드성 금-기반 LFIA는 20 ng 농도에서 RBD 항원을 검출하였고, 이는 CNB-기반 LFIA와 비교하여 더 낮은 민감도를 나타내는 것이었다. CNB가 동일한 용량에서 콜로이드성 금과 비교하여 더 높은 색 밀도 및 표면적을 갖고 있기 때문에 CNB-기반 LFIA는 콜로이드성 금-기반 LFIA와 비교하여 약 10배 높은 민감도를 나타내는 것으로 최근 연구결과들과 일맥상통하는 것이다. In order to prove the detection ability of ACE-2 based LFIA (ACE2-LFIA), in the present invention, using serially diluted samples of
다음으로, 본 발명은 다른 코로나바이러스(사스 코로나바이러스 및 메르스 코로나바이러스)의 S1 항원을 사용하여 ACE2-LFIA의 검출 민감도를 확인하였다. 3가지 다른 농도(100, 20 및 5 ng/reaction)의 각 S1 항원을 LFIA 장치에 주입하였고, 검출선의 밀도는 휴대용 선 분석기를 사용하여 20분 후에 측정하였다. 각 LFIA 장치의 선 밀도를 10초 이내에 측정하였고, 이는 현장진단 또는 실험실 세팅에서 신속하고 정확한 진단이 가능한지를 확인하기 위한 것이다. 사스 코로나바이러스 2 S1 (< 5 ng 항원) 및 RBD (< 1 ng 항원)이 LFIA 장치에서 성공적으로 검출되었고, 낮은 농도에서도 마찬가지였다. ACE2-기반 LFIA를 사용하여 나타나는 사스 코로나바이러스 2 S1 및 RBD 사이의 민감도 차이는 ACE2의 KD 값과 관련되어 있고, S1-mAb는 S1과 비교하여 RBD에 대하여 더 적게 결합하였다. 반면, 메르스 코로나바이러스 S1 항원은 비교적 높은 농도(100 ng 항원)에서도 검출되지 않았고, 사스 코로나바이러스 S1 100 ng 항원은 약하게 검출되었다. 이는 100 ng 사스 코로나바이러스 S1 항원이 ACE2-LFIA를 사용하여 구분되지 않음을 의미한다. 밀도는 사스 코로나바이러스 S1 고농도에서 약하게 증가하였으나, 제안된 ACE2-LFIA가 밀도에서 의미있는 차이로 인하여 다른 코로나바이러스와 사스 코로나바이러스 2를 구분할 수 있음을 나타내는 것이다. 도 5c에서 제시한 바와 같이, S1 항원에 대한 검출 밀도는 세가지 다른 코로나바이러스에서 5 ng 항원 농도였다. 사스 코로나바이러스 2 S1 검출 신호는 검출한계(limit of detection, LOD, mean value of negative controls + 3 Х standard deviation)보다 더 높았고, 사스 코로나바이러스 S1 및 메르스 코로나바이러스 S1은 음성 대조군과 유사하였다. 그리하여 제안된 ACE2-LFIA는 다른 코로나바이러스에 대한 의미있는 교차반응성 없이 사스 코로나바이러스 2 항원에 높은 특이도를 나타내는 것을 확인하였다. Next, the present invention confirmed the detection sensitivity of ACE2-LFIA using the S1 antigen of other coronaviruses (SARS coronavirus and MERS coronavirus). Three different concentrations (100, 20 and 5 ng/reaction) of each S1 antigen were injected into the LFIA device, and the density of the detection line was measured after 20 minutes using a portable line analyzer. The line density of each LFIA device was measured within 10 seconds, in order to confirm whether rapid and accurate diagnosis is possible in a point-of-care or laboratory setting.
<시험예 4> 임상 샘플을 사용한 실험실 확인 <Test Example 4> Laboratory confirmation using clinical samples
배양된 바이러스와 임상 샘플을 사용하여 ACE2-LFIA의 실험실에서 효과를 확인하였다. 배양된 사스 코로나바이러스 2 및 사람 코로나바이러스 OC43의 바이러스 양은 정량 RT-PCR로 측정하였고, 표준곡선은 각각 E 및 N 유전자를 사용하였다. ACE2-LFIA의 검출한계는 배양된 사스 코로나바이러스 2 샘플에서 5.35 x 106 copies/mL 이었지만, 사람 코로나바이러스 OC43 배양 샘플에서는 ACE2-LFIA 시험에서 양성 신호(> 50)가 없었다. The effectiveness of ACE2-LFIA was confirmed in the laboratory using cultured virus and clinical samples. The virus amounts of the
임상 샘플에서 바이러스 양(copy/mL)을 측정하기 위하여 COVID-19 환자(n=4) 및 건강한 개체(n=4)에서 채취한 비인두 및 비강 도말 샘플로 RT-qPCR 분석을 수행하였다. COVID-19 환자의 비인두 도말에서 바이러스 양은 사스 코로나바이러스 2의 E 유전자에 대한 표준곡선으로 조사되었고, 환자 1은 2.49x107 copies/mL 환자 2는 1.15x106 copies/mL, 환자 4는 1.86x105 copies/mL 이었다. 환자 3에서 사스 코로나바이러스 2 RNA는 검출되지 않았다. 이 결과는 다른 독립적인 RT-qPCR 분석에서도 확인된 것이고, UTM에서 바이러스 RNA의 분해와 연관되었을 것으로 예상된다. COVID-19 환자의 임상 샘플로 ACE2-LFIA의 실험실 확인 결과 RT-qPCR 분석과 같이 3개의 임상 샘플에서만 양성을 나타내었다. ACE2-LFIA의 검출 한계는 1.86x105 copies/mL (환자 4)였지만, 건강한 개체(n=4)의 비강 도말로 ACE2-LFIA 시험을 수행한 결과 양성 신호가 관찰되지 않았다. 그러므로, ACE2-기반 LFIA 시험은 COVID-19 환자로부터 사스 코로나바이러스 2의 S1 항원을 검출하는데 도움이 될 수 있을 것이다. 더욱 특이적인 항체, 압타머, 애피머 또는 나노바디를 사용한 추가적인 ACE2-기반 LFIA의 개발을 통해 더욱 민감하고 특이적인 사스 코로나바이러스 2 S1 항원 검출이 가능할 것이다. RT-qPCR analysis was performed with nasopharyngeal and nasal smear samples taken from COVID-19 patients (n=4) and healthy individuals (n=4) to determine the amount of virus (copy/mL) in clinical samples. The amount of virus in the nasopharyngeal smear from COVID-19 patients was investigated as a standard curve for the E gene of
Claims (12)
상기 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체는 ACE2(angiotensin converting enzyme 2) 및 ACE2가 발현 또는 과발현된 세포주의 용해액(lysate)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 사스 코로나바이러스 2 검출용 조성물a receptor that binds to the SARS coronavirus 2 spike protein; an antibody that binds to the SARS coronavirus 2 spike protein; The antibody comprises a secondary antibody to which a visibly identifiable nanostructure is bound, or an ocularly identifiable nanostructure is bound to recognize the antibody,
The SARS coronavirus 2 spike protein-binding receptor includes at least one selected from the group consisting of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) and a lysate of a cell line in which ACE2 is expressed or overexpressed. 2 composition for detection
상기 사스 코로나바이러스 2 스파이크 단백질과 결합하는 수용체는 ACE2(angiotensin converting enzyme 2) 및 ACE2가 발현 또는 과발현된 세포주의 용해액(lysate)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 사스 코로나바이러스 2 감염증 진단용 조성물a receptor that binds to the SARS coronavirus 2 spike protein; an antibody that binds to the SARS coronavirus 2 spike protein; The antibody comprises a secondary antibody to which a visibly identifiable nanostructure is bound, or an ocularly identifiable nanostructure is bound to recognize the antibody,
The SARS coronavirus 2 spike protein-binding receptor includes at least one selected from the group consisting of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) and a lysate of a cell line in which ACE2 is expressed or overexpressed. 2 Composition for diagnosing infectious diseases
대조군으로 항원이 포함되어 있지 않은 시료를 반응시키는 단계;
20분 동안 반응시키는 단계; 및
검출점에서 나오는 신호를 분석하는 단계;를 포함하는 사스 코로나바이러스 2 검출방법Reacting the composition for detecting SARS-CoV-2 of claim 1 and the separated sample;
reacting a sample containing no antigen as a control;
reacting for 20 minutes; and
Analyzing the signal coming from the detection point; SARS coronavirus 2 detection method comprising
A kit for diagnosing SARS coronavirus 2 infection comprising the composition of claim 1 and instructions for use
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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KR102485429B1 (en) | 2022-09-30 | 2023-01-09 | 주식회사 학메디칼 | Composition for diagnosis of sars-cov-2 infection and diagnostic kit using thereof |
KR20230137754A (en) | 2022-03-22 | 2023-10-05 | 이주현 | Virus diagnostic unit and diagnostic system comprising same |
KR20240057516A (en) | 2022-10-24 | 2024-05-03 | 대한민국(질병관리청 국립보건연구원장) | Antibody for binding SARS coronavirus 2 spike antigen and uses thereof |
KR20240057515A (en) | 2022-10-24 | 2024-05-03 | 대한민국(질병관리청 국립보건연구원장) | Antibody for binding SARS coronavirus 2 spike antigen and uses thereof |
KR20240057517A (en) | 2022-10-24 | 2024-05-03 | 대한민국(질병관리청 국립보건연구원장) | Antibody for binding SARS coronavirus 2 spike antigen and uses thereof |
Families Citing this family (3)
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KR102694604B1 (en) * | 2022-02-24 | 2024-08-12 | 중앙대학교 산학협력단 | Surface-enhanced Raman scattering-based lateral flow assay strip for simultaneous diagnosis of SARS-CoV-2 and influenza A infections |
KR102500714B1 (en) * | 2022-09-30 | 2023-02-17 | 주식회사 학메디칼 | Composition for diagnosis of sars-cov-2 infection and diagnostic kit using thereof |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080248043A1 (en) | 2006-05-19 | 2008-10-09 | Amgen Inc. | Antibodies to SARS coronavirus |
US20090304683A1 (en) * | 2006-01-19 | 2009-12-10 | Dimitrov Dimiter S | Soluble Fragments of The Sars-Cov Spike Glycoprotein |
KR101895228B1 (en) | 2017-08-23 | 2018-10-30 | 대한민국 | Monoclonal antibody against spike protein of middle east respiratory syndrome coronavirus and uses therof |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016080591A1 (en) | 2014-11-17 | 2016-05-26 | 유한회사 바이오노트 | Antibody recognizing nucleocapsid of middle east respiratory syndrome coronavirus, and use thereof |
JP6496839B2 (en) * | 2015-01-08 | 2019-04-10 | ヒュヴェット・バイオ・インコーポレイテッド | Virus detection kit |
KR102100813B1 (en) | 2018-11-08 | 2020-04-16 | 주식회사 보레다바이오텍 | Fusion protein from hepatitis C virus and diagnosing kit comprising the same |
-
2020
- 2020-11-11 KR KR1020200149886A patent/KR102351653B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090304683A1 (en) * | 2006-01-19 | 2009-12-10 | Dimitrov Dimiter S | Soluble Fragments of The Sars-Cov Spike Glycoprotein |
US20080248043A1 (en) | 2006-05-19 | 2008-10-09 | Amgen Inc. | Antibodies to SARS coronavirus |
KR101895228B1 (en) | 2017-08-23 | 2018-10-30 | 대한민국 | Monoclonal antibody against spike protein of middle east respiratory syndrome coronavirus and uses therof |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Martine DENIS et al. (2020, updated on a weekly basis). COVIPENDIUM. Transdisciplinary Insights. http://doi.org/10.5281/zenodo.4072014. |
Xiuyuan Ou et al, Nature Communications (2020.03.27.), Artical number: 1620(2020), pp 1-12. |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20230137754A (en) | 2022-03-22 | 2023-10-05 | 이주현 | Virus diagnostic unit and diagnostic system comprising same |
KR102485429B1 (en) | 2022-09-30 | 2023-01-09 | 주식회사 학메디칼 | Composition for diagnosis of sars-cov-2 infection and diagnostic kit using thereof |
KR20240057516A (en) | 2022-10-24 | 2024-05-03 | 대한민국(질병관리청 국립보건연구원장) | Antibody for binding SARS coronavirus 2 spike antigen and uses thereof |
KR20240057515A (en) | 2022-10-24 | 2024-05-03 | 대한민국(질병관리청 국립보건연구원장) | Antibody for binding SARS coronavirus 2 spike antigen and uses thereof |
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