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KR102337954B1 - 뇌졸중 치료용 조성물 및 이를 스크리닝하는 방법 - Google Patents

뇌졸중 치료용 조성물 및 이를 스크리닝하는 방법 Download PDF

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KR102337954B1
KR102337954B1 KR1020180095737A KR20180095737A KR102337954B1 KR 102337954 B1 KR102337954 B1 KR 102337954B1 KR 1020180095737 A KR1020180095737 A KR 1020180095737A KR 20180095737 A KR20180095737 A KR 20180095737A KR 102337954 B1 KR102337954 B1 KR 102337954B1
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김혜선
이민지
김지혜
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차의과학대학교 산학협력단
(주)차바이오텍
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Abstract

뇌졸중 치료용 조성물 및 이를 스크리닝하는 방법에 관한 것으로서, IL-1 수용체 길항제를 유효성분으로 포함하는 뇌졸중의 치료용 약학적 조성물, 및 이를 이용한 뇌졸중 치료제를 스크리닝하는 방법 등을 제공한다.

Description

뇌졸중 치료용 조성물 및 이를 스크리닝하는 방법{Composition for treating stroke and method for screening the same}
뇌졸중 치료용 조성물 및 이를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
통계청에서 2010년 발표한 자료에 따르면, 우리나라는 2011년 65세 이상 노령인구가 총인구에서 차지하는 비중이 11.4%에 이르렀고, 2050년에는 37.4%가 되어 초고령화 사회에 진입할 것으로 전망되고 있다. 이와 같이 최근 고령화 문제가 사회적인 이슈로 대두됨에 따라 고령인구의 특성이나 주거, 보건, 문화, 여가 등 노인복지 등에 대한 국민의 관심이 높아지고, 이에 대한 통계 수요도 늘어나고 있다. 특히, 지난 50여 년간 사망의 주된 원인이 되었던 급성 전염성 질병에 비해, 만성 퇴행성 질병이 더욱 큰 문제로 대두되고 있다. 또한, 만성 퇴행성 질병 중에서 뇌혈관 질환은 단일질환에 의한 사망률 중에서 2위를 기록하고 있는 매우 중요한 질환 중 하나로서, 이에 대한 관심이 높아지고 있다.
이러한 뇌혈관 질환은 크게 2가지 형태로 분류될 수 있다. 하나는 뇌출혈 등에서 볼 수 있는 출혈성 뇌질환이고, 다른 하나는 뇌혈관의 폐쇄 등에 의해 나타나는 허혈성 뇌질환이다. 출혈성 뇌질환은 교통사고 등에 의해서 주로 나타나며, 허혈성 뇌질환은 주로 노인에게 자주 나타나는 질환이다.
대뇌에 일시적인 뇌경색 또는 뇌출혈이 유발되는 경우, 산소와 포도당의 공급의 차단되어 신경세포에서는 ATP 감소 및 부종(edema)이 발생하며, 결국 뇌의 광범위한 손상이 유발된다. 신경세포의 사멸은 뇌경색 등이 발생한지 상당한 시간이 경과한 후에 나타나는데, 이를 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)라고 한다. 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil)을 이용한 일과성 전뇌 경색모델(transient forebrain ischemic model)을 통한 실험에서 살펴보면, 지연성 신경세포사는 5분간 뇌경색 유도 4일 후 해마(hippocampus)의 CA1 영역에서 신경세포사가 관찰되는 것으로 보고된 바 있다.
한편, 지금까지 가장 널리 알려진 뇌 경색에 의한 신경세포사 기전으로는 2가지가 알려져 있다. 하나는 뇌 경색에 의해 세포 바깥에 과도한 글루타메이트(glutamate)가 축적되게 되며, 이러한 글루타메이트가 세포 내로 유입되어 결국 과도한 세포 내 칼슘의 축적으로 신경세포사가 유발된다는 흥분성 신경세포사 기전이고, 다른 하나는 경색-재관류시에 갑작스러운 산소 공급으로 인한 생체 내 라디칼의 증가로 인해 DNA 및 세포질에 손상을 입어 유발된다는 산화성 신경세포사이다. 이러한 기전적인 연구를 바탕으로 해서 뇌 경색시에 나타나는 신경세포사를 효과적으로 억제하는 물질을 탐색하거나, 물질에 대한 기전을 밝히는 연구가 많이 수행되고 있다. 그러나 아직까지도 효과적으로 뇌졸중을 치료할 수 있는 물질은 거의 없는 실정이다.
이러한 기술적 배경 하에서, 새로운 분자적 기작에 기반을 둔 뇌졸중 치료용 조성물에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나(한국 등록특허 10-1532211), 아직은 미비한 실정이다.
일 양상은 IL-1(Interleukin-1) 수용체 길항제를 유효성분으로 포함하는, 뇌졸중의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 뇌졸중의 치료를 위한 후보 물질과 접촉된, 개체의 시료로부터 IL-1RA(interleukin-1 receptor antagonist)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 IL-1RA의 발현 수준을 상기 후보 물질과 비접촉된 대조군 개체의 시료 내 IL-1RA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 뇌졸증 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 탯줄 유래 중간엽 기질 세포를 포함하는, IL-1 수용체 길항제를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 탯줄 유래 중간엽 기질 세포를 포함하는,CREB(cAMP-response element-binding) 단백질 활성 증가제를 제공하는 것이다.
일 양상은 IL-1(Interleukin-1) 수용체 길항제를 유효성분으로 포함하는, 뇌졸중의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "치료"는 일 실시예에 따른 조성물의 투여에 의해 뇌졸중에 대한 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
상기 조성물의 투여에 의해 치료되는 대상 질병인 "뇌졸중(Stroke)"은 흔히 중풍이라고도 하며, 뇌에 혈액을 공급하고 있는 혈관이 막히거나 터져서 손상 받은 부위의 뇌 세포가 죽게 되어 그에 따른 의식 소실, 언어 장애, 반신 마비 등 신체장애가 동반되는 신경학적 증상을 의미한다. 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중을 모두 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 뇌졸중의 급성 단계, 즉, 뇌 경색 또는 뇌 출혈 후 약 24시간 이내, 상기 IL-1 수용체 길항제의 투여는 단지 염증 반응을 저해시킴에 그치는 것이 아니라, 신경 손상의 회복 및 기능 개선에 기여할 수 있었으며, 이를 통해 뇌졸중의 병리학적 진행을 막을 뿐만 아니라, 이와 관련된 후유증을 최소화시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 일 실시예에 따른 IL-1 수용체 길항제는 뇌졸중의 치료를 위한 유효 물질로 활용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 IL-1 수용체 길항제는 세포에 발현되어 있는 IL-1 수용체와 IL-1과의 결합을 방해함으로써, 이에 따른 작용의 일부 또는 전부를 감쇄시키는 역할을 하는 물질을 지칭한다. 상기 IL-1 수용체 길항제로는 예를 들어, 탯줄 유래 중간엽 기질 세포, 또는 IL-1RA(Interleukin-1 receptor antagonist) 단백질일 수 있으며; 이 밖에도 IL-1에 대한 항체, 앱타머, 안티센스 뉴클레오티드일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 IL-1 수용체 길항제는 뇌졸중 병변 조직 내 염증세포에 작용하여, IL-1 매개의 염증 반응을 저해시키는 것일 수 있으며, 여기에서, 상기 염증세포는 병변 조직 내 미세아교세포 또는 대식세포일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 이때, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으며, 이 밖에도 바이러스 벡터, 비바이러스성 벡터, 및 생체적합성 폴리머 등도 포함할 수 있다. 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기“약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 1 내지 500 mg 또는 치료학적으로 유효한 양의 세포 또는 벡터를 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 5회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
일 양태로서, 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌졸중의 치료방법을 제공한다. 상기 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
다른 양상은 뇌졸중의 치료를 위한 후보 물질과 접촉된, 개체의 시료로부터 IL-1RA(interleukin-1 receptor antagonist)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 측정된 IL-1RA의 발현 수준을 상기 후보 물질과 비접촉된 대조군 개체의 시료 내 IL-1RA의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 뇌졸증 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 스크리닝하는 방법에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "후보 물질"은 뇌졸중의 치료에 효과를 나타낼 것으로 기대되는 물질로서, 예를 들어, 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드, 저분자 유기화합물(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함할 수 있다. 또한, 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.
상기 방법에서, "접촉(Contacting)"은 일반적인 의미이며, 2개 이상의 제제(예를 들어, 2개 폴리펩티드)를 결합시키거나, 제제와 세포(예를 들어, 단백질과 세포)를 결합시키는 것 등을 지칭할 수 있다. 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 시험관(test tube) 또는 다른 컨테이너(container)에서 2개 이상의 제제를 결합시키거나, 시험 제제와 세포 또는 세포 용해물과 시험 제제를 결합시킬 수 있다. 또한, 접촉은 세포 또는 인 시투(in situ)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴오티드를 세포 내에서 공동발현(coexpression)시킴으로써 세포 또는 세포 용해물에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시킬 수 있다. 또한 테스트하고자 하는 단백질이 고정상의 표면에 배열된 단백질 칩(protein chip)이나 단백질 어레이(protein array)를 이용할 수도 있다
상기 시료는 개체로부터 분리된 혈액, 혈장, 혈청, 뇨, 대변, 타액, 눈물, 뇌척수액, 세포, 조직 또는 그 조합일 수 있다. 상기 시료는 개체의 염색체를 포함하는 것일 수 있다. 상기 조직은 뇌, 뇌신경 또는 말초 혈관일 수 있다. 상기 세포는 염증 세포, 예를 들어, 미세아교세포 또는 대식세포일 수 있다.
상기 개체는 포유동물일 수 있다. 또한, 상기 개체는 그로부터 분리된 조직 또는 세포를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 포유동물은 인간, 영장류, 마우스, 랫, 소, 돼지, 말, 양, 개, 고양이 또는 그 조합일 수 있다.
상기 방법에서, 개체의 시료로부터 측정된 IL-1RA의 발현 수준이 비접촉된 대조군에 비해 증가된 경우, 뇌졸중 치료제로 결정 또는 선정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 발현 수준의 변화는 개체의 발현 수준이 비처리된 대조군 또는 음성 대조군에 비하여 유사한 수준 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 증가하는 것을 포함할 수 있다.
상기 IL-1RA의 발현 수준을 측정하는 단계는 당업계에서 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 웨스턴 블롯팅(western blotting), 닷 블롯팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩 방법 등이 사용될 수 있다.
상기 방법에서, 뇌졸중의 치료를 위한 후보 물질과 접촉된 개체의 시료로부터 CREB(cAMP-response element-binding) 단백질의 활성 수준을 측정하고, 및 상기 측정된 CREB 단백질의 활성 수준을 비접촉된 대조군 개체의 시료 내 CREB 단백질의 활성 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기에서, 개체의 시료로부터 측정된 CREB 단백질의 활성 수준이 비처리된 대조군에 비해 증가된 경우, 뇌졸중 치료제로 결정 또는 선정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어, IL-1RA의 발현 수준 및 CREB 단백질의 활성 수준이 비처리된 대조군에 비해 증가된 경우, 뇌졸중 치료제로 결정 또는 선정할 수 있다.
상기 CREB 단백질의 활성 수준을 측정하는 단계는 당업계에서 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 예를 들어, 역전사 중합효소 연쇄반응 (reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응 (real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블롯팅, 노던 블롯팅, 효소면역분석법, 방사면역확산법 (radioimmunodiffusion) 및 면역침전법 등이 사용될 수 있다.
상기 스크리닝 방법을 통해 얻은, 대상 시료 내 IL-1RA의 발현 수준을 증가시키고 및/또는 CREB 단백질의 활성 수준을 증가시키는 후보 물질은 뇌졸중 치료를 위한 유효 물질이 될 수 있다. 이와 같은 뇌졸중 치료를 위한 후보 물질은 이후 뇌졸중 치료제의 개발 과정에서 선도물질 (leading compound)로서 작용하게 되며, 상기 선도물질이 보다 유효한 뇌졸중 치료 효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 뇌졸중 치료제를 개발할 수 있다.
또 다른 양상은 탯줄 유래 중간엽 기질 세포를 포함하는, IL-1(Interleukin-1) 수용체 길항제를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 탯줄 유래 중간엽 기질 세포는 염증 세포, 예를 들어, 미세아교세포 또는 대식세포 내 IL-1RA의 발현을 증가시켰으며, 이를 통해, IL-1 수용체 길항제로서 역할을 수행함을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 탯줄 유래 중간엽 기질 세포는 표적 세포 내 분자 기작을 조절하는데 사용될 수 있고, 나아가, 뇌졸중 치료를 위한 유효 물질로 활용될 수도 있다.
또 다른 양상은 탯줄 유래 중간엽 기질 세포를 포함하는, CREB(cAMP-response element-binding) 단백질 활성 증가제를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 탯줄 유래 중간엽 기질 세포는 염증 세포, 예를 들어, 대식세포 내 인산화된 CREB 단백질의 발현을 증가시켰으며, 이를 통해 CREB 단백질 활성 증가제로서 역할을 수행함을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 탯줄 유래 중간엽 기질 세포는 표적 세포 내 분자 기작을 조절하는데 사용될 수 있고, 나아가, 뇌졸중 치료를 위한 유효 물질로 활용될 수도 있다.
일 양상에 따른 조성물에 의하면, IL-1(Interleukin-1) 수용체 길항제를 포함하며, 뇌졸중 급성 단계에서 상기 조성물의 투여는 신경 손상의 회복 및 기능 개선에 크게 기여할 수 있는바, 뇌졸중의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
일 양상에 따른 스크리닝하는 방법에 의하면, 핵심적 분자 기작에 기초하여 우수한 치료 효과를 갖는 뇌졸중 치료 물질을 발굴할 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(hMSCs)에 의한 VEGF, TGF-β1, HGF, 및 IDO의 분비 수준을 측정한 결과이다.
도 2는 뇌졸중 동물모델을 대상으로, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포(hMSCs)의 용량 및 투여 시점에 따른 기능적 변화를 확인한 것으로서, 도 2의 A는 행동학적 테스트 결과; 및 도 2의 B는 경색 크기 변화를 측정한 결과이다.
도 3은 뇌졸중 동물모델을 대상으로, hMSCs의 정맥 투여에 따른 치료 효과를 확인한 것으로서, 도 3의 A는 행동학적 테스트 결과; 및 도 3의 B는 경색 크기 변화를 측정한 결과이다.
도 4는 뇌졸중 동물모델을 대상으로, hMSCs의 정맥 투여에 따른 신경 세포 사멸 억제 효과를 TUNEL 어세이를 통해 확인한 결과이다.
도 5는 뇌졸중 동물모델을 대상으로, 면역조직화학검사를 실시하여 hMSCs의 정맥 투여에 따른 뇌 경색 조직의 병리학적 변화를 확인한 것으로서, 도 5의 A는 ED-1-양성 세포 및 Iba-1-양성 세포의 수를 비교한 결과; 도 5의 B는 ED-1-양성 세포 내 iNOS 세포의 비율을 비교한 결과; 및 도 5의 C는 ELANE 양성 세포의 수를 비교한 결과이다.
도 6은 뇌졸중 동물모델을 대상으로, Myeloperoxidase(MPO)에 대한 ELISA를 실시하여, hMSCs의 정맥 투여에 따른 뇌 경색 조직의 병리학적 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 뇌졸중 동물모델을 대상으로, 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 실시하여, hMSCs의 정맥 투여에 따른 뇌 경색 조직 내 염증성 사이토카인의 발현 변화를 확인한 것으로서, 도 7의 A는 IL1B의 발현 변화를 비교한 결과; 도 7의 B는 TNF의 발현 변화를 비교한 결과; 및 도 7의 C는 MMP9의 발현 변화를 비교한 결과이다.
도 8은 뇌졸중 동물모델을 대상으로, hMSCs의 정맥 투여에 따른 뇌 경색 조직 내 유전자의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 9는 뇌졸중 동물모델을 대상으로, hMSCs의 정맥 투여에 따른 뇌 조직 내 유전자 발현 변화를 정량적으로 비교한 것으로서, 도 9의 A는 IL1RN mRNA의 발현 변화를 비교한 결과; 및 도 9의 B는 IL-1ra 단백질의 발현 변화를 비교한 결과이다.
도 10은 뇌졸중 동물모델을 대상으로, hMSCs의 정맥 투여에 따른 IL-1ra의 상향조절에 기여하는 세포 아집단을 확인한 것으로서, 도 10의 A는 ED-1-양성 세포 내 IL-1ra 양성 세포를 면역조직화학 검사를 통해 확인한 결과; 도 10의 B는 D-1-양성 세포 내 IL-1ra 양성 세포의 비율을 정량적으로 비교한 결과이다.
도 11은 Raw 264.7 세포를 대상으로, LPS 및 hUMSCs-CM의 공동-처리에 의한 염증성 사이토카인의 발현 변화를 확인한 것으로서, 도 11의 A는 IL-1β의 발현 변화를 확인한 결과; 및 도 11의 B는 IL-1ra의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 12는 Raw 264.7 세포를 대상으로, hUMSCs-매개 IL-1ra 발현과 cAMP-반응 요소-결합성 단백질(CREB)간 관련성을 확인한 것으로서, 도 12의 A는 p-CREB 단백질 등의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과; 도 12의 B는 p-CREB 단백질의 발현을 정량적으로 비교한 결과; 및 도 12의 C는 p-NF-κB의 발현을 정량적으로 비교한 결과이다.
도 13은 Raw 264.7 세포를 대상으로, LPS와 hUMSCs-CM의 공동-처리에 의한 p-CREB 및 p-NF-κB의 발현 변화를 면역조직화학 검사를 통해 확인한 결과이다.
도 14는 Raw 264.7 세포에 hUMSCs-CM 및 CREB 저해제(KG501)를 공동-처리한 경우, IL-1ra의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 15는 Raw 264.7 세포에 CREB siRNA (siCREB)를 형질감염시킨 경우, 이에 따른 IL-1ra의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 16은 LPS로 자극된 Raw 264.7 세포에 CREB siRNA (siCREB)를 형질감염시킨 후, hUMSCs-CM의 처리에 의한 IL1RN의 발현 변화를 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1. 실험준비 및 실험과정
(1) hUMSC의 준비 및 이들의 특성 확인
탯줄 유래 중간엽 줄기세포(hUMSC)를 건강한 기증자의 동의 하에서 차 분당 의료 센터(성남, 대한민국)에 보관 중인 제대(탯줄)로부터 채취하였다. hUMSC의 준비는 GMP 시설에서 수행되었으며, hUMSC의 분리 및 확장은 Master Cell Bank의 Good Clinical Practice(GCP) 가이드라인에 따라 수행되었다. 우선, 채취된 hUMSC로부터 제대 혈관을 제거한 후, Wharton's jelly를 1-5mm의 이식편으로 슬라이스하여 hUMSCs를 분리하였다. 분리된 hUMSCs를 10% FBS(HyClone, IL), FGF4(R&D Systems, MN), 및 헤파린(Sigma-Aldrich, MO)이 첨가된 α-MEM(HyClone, IL)을 포함하는 배양 플레이트에 부착시키고, 이를 배양시켰으며, 상기 배지는 3일 마다 교체되었다. 이로부터 15일 경과 후, 제대 절편을 버리고, 상기 hUMSC를 TrypLE(Invitrogen, MA)와 함께 계대 배양시키고, 서브-컨플루언스(80-90%)에 도달할 때까지 확장시켰다. 상기 hUMSC는 저산소 조건(3% O2, 5% CO2, 및 37℃) 하에서 인큐베이션되었고, 7 계대의 hUMSC가 본 실험에 사용되었다.
이후, 핵형 분석을 통하여, 상기 hUMSC가 정상적인 인간 핵형을 함유하고 있음을 확인하였다. 또한, 역전사 중합효소연쇄반응을 사용하여, 세포 펠렛 내 바이러스성 병원균(인간 면역결핍증 바이러스-1 및 -2, 시토메갈로바이러스, 간염 B 바이러스, 간염 C 바이러스, 인간 T 림프구 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 및 마이코플라스마)이 부재함을 확인하였다. 형광표지 세포분류기(FACS) 분석을 수행하여 전술한 바와 같이 hUMSCs의 면역 표현형을 확인하였다. 상기 hUMSC는 MSCs(CD44, CD73, CD90, 및 CD105)와 관련된, 세포 표면 마커를 높은 수준으로 발현하였으나, 조혈 줄기세포(CD31, CD34, 및 CD45) 및 HLA-DR에 대한 마커의 발현은 무시할 만한 수준이었다. hUMSCs(n=3)이 100% 컨플루언스에 도달하였을 때, 이들을 무혈청 배지에서 48시간 배양하고, 이로부터 hUMSCs-CM을 수득하였다. 이후, hUMSCs-CM로부터 유래한 TGF-β1(Human TGF-β1 ELISA kit, R&D Systems, MN), VEGF(Human VEGF ELISA kit, R&D Systems, MN), HGF(Human HGF ELISA kit, Cloud-Clone Corp., TX), 및 IDO(Human IDO ELISA kit, BlueGene Biotech., Shanghai, China) 단백질 농도를 상업적으로 이용 가능한 효소결합 면역흡착법(ELISA) 키트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, hUMSCs은 높은 수준의 TGF-β1, HGF, 및 IDO를 분비하였다. 이러한 실험 데이터는 hUMSCs가 MSC의 특성을 가지며, 면역 반응 및 조직 회복과 관련된 사이토카인 및 영양 인자를 분비할 수 있음을 나타내는 것이다.
(2) 뇌졸중 동물 모델의 구축
본 실험에서 270-300g의 체중을 갖는 총 151 마리의 수컷 Sprague-Dawley 렛트가 사용되었으며, Longa et al.에 의해 보고된 바 있는 방법에 의하여, 상기 렛트에 중뇌동맥협착(middle cerebral artery occlusion: MCAo)을 유발시켰다.
(3) 통계 분석 및 윤리적 규정
통계 분석은 Statistical Analysis System program(Enterprise 4.1; SAS Korea) 및 MedCalc statistical software(MedCalc software, ver. 11.6, Mariakerke, Belgium)를 사용하여 수행되었다. 조직학적 또는 경색 크기의 측정에서 두 그룹 사이의 통계적 유의성은 Mann-Whitney U test에 의해 분석되었다. 실시간 PCR 또는 ELISA에 대한 다중 비교의 통계적 유의성은 하위 그룹의 쌍대 비교에 대한 a post hoc Conover's test와 함께 Kruskal-Wallis test를 사용하여 분석되었다. 기능성 테스트의 분석은 분산(혼합된 ANOVA) 테스트의 양방향 혼합 분석을 사용하여 수행되었다. 통계학적 유의성은, p < 0.05 및 p < 0.001에서 고려되었고, 모든 값은 평균 ± 표준 오차(SEM)으로 나타내었다. 마이크로어레이 데이터의 통계학적 분석은 이전의 실험과 동일한 방법으로 평가하였다.
또한, 본 실험에서는 탯줄(Umbilical cord)의 사용을 위하여 차 분당 의료 센터의 임상시험심사위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았고(IRB no.: BD2013-004D), 모든 실험 동물은 차의과대학교의 실험동물운영위원회로부터 제공된 가이드라인에 따라 조작되었다.
실험예 1. 뇌졸중 동물 모델에서 hUMSCs에 의한 신경 손상 감소 및 기능 개선 효과 확인
본 실험예에서는 행독학적 테스트, 경색 크기의 평가, 및 TUNEL를 실시하여, hUMSCs의 정맥 투여(IV-hUMSCs)에 따른 뇌 경색의 급성 단계에서 신경 손상 감소 및 기능 개선 효과를 확인하고자 하였다.
(1) hUMSCs의 정맥 투여
IV-hUMSCs의 용량 및 투여 시점에 따른 기능적 변화를 평가하기 위하여, 전술한 뇌졸중 동물 모델(MCAo가 유발된 렛트)를 hUMSCs의 용량 및 투여 시점에 따라 총 5개의 그룹으로 분류하였다.
그룹 1(G1): MCAo 유발후 24시간째, 생리 식염수를 투여한 렛트
그룹 2(G2): MCAo 유발후 24시간째, 1 × 105 개의 IV-hUMSCs를 투여한 렛트
그룹 3(G3): MCAo 유발후 24시간째, 5 × 105 개의 IV-hUMSCs를 투여한 렛트
그룹 4(G4): MCAo 유발후 24시간째, 1 × 106 개의 IV-hUMSCs를 투여한 렛트
그룹 5(G5): MCAo 유발후 7일째, 1 × 106 개의 IV-hUMSCs를 투여한 렛트
상기 각각의 투여 시점(MCAo 24시간째, 또는 MCAo 7일째)에서, 500μl의 생리 식염수와 혼합된 hUMSCs를 해당 그룹의 미정맥에 5분 동안 투여하였다. 투여 과정에서 심한 출혈은 없었으며, 모든 렛트의 생체 신호는 수술 중 안정적이었다. 모든 렛트에게는 투여 전날로부터 세포 투여 후 8주째까지 사이클로스포린 A(5 mg/kg)가 복강 내 주사되었다.
또한, IV-hUMSCs의 용량 및 투여 시점에 따른 기능적 변화를 평가한 뒤, 이와 독립적으로 실험을 실시하여, IV-hUMSCs 투여에 의한 치료 효과를 확인하고자 하였다. 뇌 경색을 유발한 날로부터 총 4주에 걸쳐, MCAo 24시간 후부터, 1 × 106 개의 IV-hUMSCs가 투여되었고(IV-hUMSC 그룹, n=10), 대조군으로는 생리 식염수가 투여되었다(Saline 그룹, n=10).
(2) 행동학적 테스트
행동학적 테스트는 각 그룹에 대한 정보가 맹검인 수행자에 의해 수행되었고, 로타로드 테스트 및 mNSS 테스트는 이전과 동일한 방식으로 수행되었다. 로타로드 테스트에서, 각각의 렛트에 대하여 MCAo 유발 전, 3일 동안 하루에 세 번씩 사전 훈련을 실시하여 동물들간의 변이를 최소화시켰다. 로타로드 휠 상에 렛트를 위치시켜, 휠 상에서의 지구력 시간을 측정하였다. 로타로드 장치의 로드 속도는 2분 동안 4rpm으로부터 40rpm까지 점진적으로 증가시켰다. 이후, 회전하는 바퀴에서 렛트가 떨어지는데 걸리는 시간을 기록하였고, 총 3회의 실험에서 이들의 평균 시간을 계산하였다. 상기 테스트는 MCAo 전 1일(pre), MCAo 유도된 날(D0), MCAo 유발후 2일째(D2) 실시되었다. 이후, 상기 테스트는 총 8주에 걸쳐, 일주일에 한 번씩 실시되었다.
수정된 신경학적 중증도 점수(mNSS) 테스트에서, 각각의 렛트는 MCAo 유발 후 1일째부터 테스트되었고, 세포 투여 후, 총 8주에 걸쳐 실시되었다. 상기 렛트에 대하여, 각각의 신경학적 테스트 점수의 합계인 점수가 주어졌다. 높은 점수는 가장 심각한 상태를 나태는 반면, 낮은 점수는 정상 상태를 의미한다.
(3) 경색 크기의 측정 및 TUNEL 분석
MCAo 8주째, 크레실 바이올렛 염색을 사용하여, MCAo 모델에서 경색 부피를 측정하였다(각 그룹에 대하여 n=7). 독립적인 in vivo 실험 그룹에서, MCAo 후 72시간째(IV-hUMSC 투여 48시간 후), IV-hUMSC 및 생리 식염수 투여 그룹(각 그룹에 대하여 n=5) 사이의 경색 크기를 2,3,5-트리페닐테트라조리움 클로라이드를 사용하여 비교하였다. 세부적인 조직의 준비 방법은 이전과 동일한 방식으로 수행되었다. 이후, 경색의 크기를 손상되지 않은 대측성 반구에 대한 백분율로 평가하였으며, 하기 [식 1]을 통하여 산출하였다.
[식 1]
추정된 경색 크기(%)=[1-(잔존하는 동측성 반구의 부분/손상되지 않은 대측성 반구의 부분)] × 100.
목적 부분(areas of interest)은 ImageJ 소프트웨어(ImageJ, National Institutes of Health)에 의해 측정되었고, 상기 측정된 값은 뇌 당 6개의 연속적인 관상 절편에 대하여 합산한 결과를 나타낸다.
세포 사멸에 대한 TUNEL 분석은 이전과 동일한 방식으로 수행되었다. 대상 조직은 핵 마커, 4', 6-디아미딘-29-패닐인돌 디하이드로클로라이드(DAP6I)로 대조 염색되었다. 형광 표지된 시료는 공 초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM510; Carl Zeiss Microimaging Inc., Munchen,Germany) 상에서 관찰되었다.
(4) 실험 결과
IV-hUMSCs의 용량 및 투여 시점에 따른 기능적 변화을 평가한 결과, 로타로드 및 mNSS 테스트에서, 도 2의 A에 나타낸 바와 같이, MCAo 유발후 24시간 째, 1 × 106 투여 용량의 hUMSCs를 투여한 렛트(G4 그룹)는 대조군인 G1 그룹(생리 식염수 투여 그룹)에 비해, 유의적인 신경 기능의 개선 효과를 나타내었다. 또한, 경색 크기의 평가에 있어서도, 도 2의 B에 나타낸 바와 같이, G1 그룹에 비해 G4 그룹에서 유의적으로 감소되었음을 확인할 수 있었다(G4 vs G1: 33.6 ± 3.3% vs. 49.4 ± 1.5%, p = 0.004). 다만, G4 그룹과 동일한 용량의 hUMSC를 처리하였음에도 불구하고, 뇌졸중의 후기 단계(G5 그룹)에서는 기능적 테스트 등에서 어떠한 유의적 효과도 관찰되지 않았다.
또한, IV-hUMSCs 투여에 의한 치료 효과를 확인한 결과, 도 3의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, MCAo 유발후 24시간 째, 1 × 106 투여 용량의 IV-hUMSCs를 투여한 렛트(IV-hUMSC group)는 상기의 행동학적 검사에서 4주에 걸쳐 유의적인 개선 효과을 보여주었으며, MCAo 유발후 72시간째, 경색의 크기가 대조군에 비해 현격하게 감소되어 있음을 확인할 수 있었다.
끝으로, 신경 세포 사멸에 대한 IV-hUMSCs의 효과를 조사하고자 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling) 어세이를 실시한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 생리 식염수 처리 그룹에서는 경색 주위 부분에 수많은 TUNEL-양성 세포가 존재하여, 광범위한 신경 세포 사멸을 관찰할 수 있었던 반면, IV-hUMSC 투여 그룹에서, MCAo 유도 후 72시간 째, 경색 주위 부분에 존재하는 TUNEL-양성 세포의 수는 생리 식염수 처리 그룹보다 유의적으로 적게 관찰되었다(IV-hUMSCs vs saline: 22.1 ± 1.9% vs 39.5 ± 3.8%, p = 0.006).
따라서, 일련의 실험 결과들은 급성 단계의 뇌 경색 조직에 대한 약 1 × 106 개의 hUMSCs 정맥 투여는 손상 부위, 즉, 경색 크기의 감소 뿐만 아니라, 유의적인 신경 기능의 개선을 가져다 줄 수 있음을 나타내는 것이다.
한편, 이하의 실험예에서는, MCAo 유발후 24시간째, 1 × 106 개의 hUMSCs를 정맥 투여한 렛트(IV-hUMSCs)와 대조군으로서 생리 식염수만을 처리한 렛트 (saline group)를 대상으로 하는, 생화학적 및/또는 조직학적 분석을 실시하였다.
실험예 2. 뇌 경색의 급성 단계에서 hUMSCs에 의한 염증 완화 효과 확인
본 실험예에서는 면역조직화학 검사, 및 실시간 PCR 등을 실시하여, hUMSCs의 정맥 투여(IV-hUMSCs)에 따른 염증 완화 효과를 확인하고자 하였다.
(1) 면역조직화학 검사 및 MPO 분석
MCAo 유발후 72시간째, 면역조직화학 검사를 실시하여 뇌 경색 조직의 병리학적 변화를 관찰하였다(각 그룹에 대하여 n=5). 대식세포(macrophages)/미세아교세포(microglia) (Iba-1, iNOS, 및 CD206), 호중구(ELANE)와 같은 면역조직화학 마커를 사용하여, IV-hUMSC 투여 후, 경색된 뇌 조직 내 관련 인자의 변화를 평가하였다. 또한, MPO(Myeloperoxidase) 분석 키트 (Hycult Biotech, Uden, the Netherlands)를 사용하여 렛트 뇌 조직의 상층액에서 MPO를 측정하였다. ELISA 절차는 제조사의 지침에 따라 수행되었으며, 각각 다른 날에 독립적인 실험이 2회 실시되었다.
(2) 실시간 중합효소 연쇄 반응 (Real-time polymerase chain reaction)
MCAo 유발후 72시간째, MCAo 처리된 동측성 반구(Ipsilateral hemisphere)를 대상으로 실시간 PCR을 실시하여, IL1B(interleukin-1β coding gene), TNF(TNF-α coding gene), MMP9(matrix metalloproteinase 9 coding gene)를 포함하는 뇌졸중 병태 생리와 관련된 염증성 사이토카인의 변화를 조사하였다. 본 실험에서, 대조군으로서, 생리 식염수가 처리된 MCAo 렛트 뇌 조직 뿐만 아니라, 정상 렛트 뇌 조직 유래의 RNA을 대상으로도 실험을 실시하여, IV-hUMSCs의 투여에 따른 뇌 경색 조직 내 염증성 유전자 발현의 변화를 조사하였다. 총 RNAs는 SuperScript® II First-Strand Synthesis System(Invitrogen, MA)를 사용하여 상보적인 DNA 가닥으로 역전사되었다. mRNA의 발현은 CFXTM real-time system(Bio-Rad Laboratories, CA) 및 Quantitect® SYBR Green PCR kit(Qiagen, Hilden, Germany를 사용하여 정량화되었다. 실시간 PCR은 각 유전자에 대하여 2회 실시되었고, 이들의 평균값이 통계 분석에 사용되었다. 선택된 유전자의 mRNA 수준은 GAPDH로 정규화되었다. 배수 차이는 비교 임계(CT) 주기 방법으로 산술된 2-ddCT 값으로 나타내었다.
(3) 실험 결과
면역조직화학 검사 결과, 도 5의 A에 나타낸 바와 같이, MCAo 유발후 72 시간째, 대조군(생리 식염수 투여 그룹)에서 ED-1 인간 CD68의 렛트 동족체)-양성 세포, 및 이온화된 칼슘 결합 단백질 어댑터 분자 1(Iba-1)-양성 세포가 경색 주위 부분에서 다량 발견되었으나, 이러한 ED-1-양성 세포(IV-hUMSCs vs saline: 20.2 ± 2.1% vs 39.3 ± 2.9%, p = 0.006) 및 Iba-1-양성 세포(IVhUMSCs vs saline: 25.6 ± 2.1% vs. 34.9 ± 2.9%, p = 0.017)의 수는 IV-hUMSCs 투여 그룹에서 유의적으로 감소되었다. 또한, 도 5의 B에 나타낸 바와 같이, ED-1-양성 세포에서 유도성 산화질소 합성 효소-양성 세포(iNOS)의 비율은 IV-hUMSC 투여 그룹이 대조군에 비해 낮았던 반면(IV-hUMSCs vs saline: 43.7 ± 4.3% vs 60.3 ± 5.1%, p = 0.003), ED-1-양성 세포에서 CD206-양성 세포의 비율은 IV-hUMSC 투여 그룹이 대조군에 비해 높았다(IVhUMSCs vs saline: 66.5 ± 3.3% vs 34.1 ± 4.3%, p < 0.001). 아울러, IV-hUMSC 투여 후, 경색 부분에 침윤된 호중구의 변화를 호중구 엘라스타제 (ELANE) 면역 염색을 통해 평가한 결과, 도 5의 C에 나타낸 바와 같이, IV-hUMSC 투여 그룹에서 관찰된 ELANE 양성 세포의 수가 대조군에 유의적으로 적게 관찰되었다(IVhUMSCs vs saline: 4.9 ± 0.9% vs 16.7 ± 1.9%, p = 0.001).
다음으로, Myeloperoxidase(MPO)에 대한 ELISA를 실시한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, MCAo 유발후 72시간째 MPO의 수준은 IV-hUMSC 투여 그룹이 대조군에 비해 더 낮게 관찰되었다(IV-hUMSCs vs. saline: 74.1 ± 4.8 pg/ml vs 225.1 ± 4.7 pg/ml, p < 0.001).
끝으로, 염증 관련 유전자에 대한 실시간 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 분석에서는, 도 7에 나타낸 바와 같이, 뇌 경색 조직에서 IL1B, TNF, 및 MMP9 모두의 발현이 상향조절되었으나, 이러한 경향은 IV-hUMSC 투여 그룹에서 모두 현격하게 감소되었다.
따라서, 일련의 실험 결과들은 급성 단계의 뇌 경색 조직에 대한 hUMSCs 정맥 투여는 해당 부위의 염증을 완화시키는데 기여함을 나타내는 것이다.
실험예 3. 급성 단계의 뇌 경색 조직에서 내인성 IL-1ra의 발현 변화
본 실험예에서는 마이크로어레이 분석, 및 실시간 PCR 등을 실시하여, hUMSCs의 정맥 투여(IV-hUMSCs)에 따른 치료 효과와 밀접한 관련이 있는 인자를 도출하고자 하였다.
(1) 마이크로어레이 분석
MCAo 유발후 72시간째, MCAo 처리된 동측성 반구를 mRNA 마이크로어레이 분석에 사용하였다. RNA는 MCAo 비유발된 렛트(대조 그룹, n=5), MCAo 유발후 24시간째, 1 × 106 IV-hUMSCs가 투여된 렛트(n=6), 및 MCAo 유발후 24시간째, 생리 식염수가 투여된 MCAo 렛트 내 동측성 반구에 대하여, TRIzol® 시약 (Thermo Fisher Scientific, MA) 및 RNeasy 컬럼(Qiagen, Hilden)으로 균질화하고 가능한 신속하게 분리되었다. 샴(sham) 대조군에 추가하여, 본 발명자들은 추가 대조군으로 MCAo 비유발된 정상 렛트 뇌를 사용하여, 뇌 경색 조직에서 IV-hUMSCs 처리후 염증성 유전자 발현의 변화를 조사하였다. RNA의 품질을 보장하기 위하여, Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, CA)를 사용하여, 260 nm/280 nm의 광학 밀도가 1.08 이상을 나타내는 시료만이 마이크로어레이 분석에 사용되었다. RNA 표지 및 정제를 수행하고, 상기 샘플은 제조사의 지침에 따라 Agilent 렛트 mRNA 마이크로어레이 칩 (SurePrint G3 Rat Gene Expression 8 Х 60 k, Agilent Inc., CA)에 혼성화시켰다. 상기 어레이는 Agilent Technologies G2600DSG12494263 (Agilent Inc., CA)를 사용하여 스캔되었다. 어레이 데이터의 내보내기 과정 및 분석은 Agilent Feature Extraction software(v100.0.1.1)을 사용하여 수행되었다. 상기 데이터는 로그 변화 및 양자화 정규화를 통해 필터링되었다. 상기 어레이 데이터는 각각의 그룹들간 쌍대 비교를 위하여, false discovery rate correction (Benjamini-Hochberg test)을 통한 Student's t-test를 사용하여 통계학적으로 분석되었다. 차별적으로 발현된 전사체는 복합비교 가설을 고려하여, 2배 이상의 차이(FD)와 보정된 p값(p) <0.01의 유의한 차이를 갖는 유전자로 기술되었다. 차별적으로 발현된 전사체에 대한 모든 데이터 분석 및 시각화는 R 3.0.1 (www.r-project.org)을 사용하여 수행되었다. 마이크로 어레이 데이터는 GEO 리포지터에 등록되었다(accession no. GSE78731).
(2) 면역조직화학 검사 등
IL-1ra 상향조절에 기여하는 세포 아집단을 확인하기 위하여, 뇌 경색 조직을 대상으로, IL-1ra 및 ED-1(미세아교세포 마커), NeuN (뉴런성 마커), 또는 Reca-1(내피 세포 마커)에 대한 항체를 사용하여 이중 면역화학 검사를 실시하였다. 또한, MCAo 유발후 72시간째, MCAo 처리된 동측성 반구를 대상으로 실시간 PCR을 실시하여, IL-1-매개 염증 조절인자, 즉 IL1RN, 및 IL-1ra의 발현을 확인하였다. 한편, 구체적인 실험은 상기 실험예 2의 (1) 및 (2)와 동일한 방식으로 실시되었다.
(3) 실험 결과
MCAo 유발후 72시간째 IV-hUMSC 투여 그룹 및 생리 식염수 투여 그룹으로부터 유래한 뇌 조직을 대상으로, mRNA 마이크로어레이를 실시하였다. 그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, MCAo 유발후 72시간째, 대조 그룹 및 생리 식염수 투여 그룹과의 유전자 발현 비교를 통하여, 총 595개의 전사체(이 중에서, 553개의 전사체는 상향 조절, 42개의 전사체는 하향 조절됨.)가 IV-hUMSC 투여 그룹에서 차별적으로 발현되었다. 또한, IV-hUMSC 투여 그룹과 생리 식염수 투여 그룹간 유전자 발현 프로파일을 비교하였을때, 총 85개의 전사체(이 중에서, 77개의 전사체는 상향조절, 8개의 전사체는 햐향 조절됨.)가 차별적으로 발현되었다. 특히, 이 중에서도, 인터루킨-1 수용체 길항제(IL-1ra)를 코딩하는 유전자인 IL1RN은 생리 식염수 투여 그룹에 비해 IV-hUMSC 투여 그룹에서 매우 강력하게 상향조절된 유전자 중 하나였다.
한편, IL-1ra는 IL-1의 천연 길항제로서, 뇌 경색 조직에서 IL-1-매개 염증을 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기의 실험 결과에 기초하여, IV-hUMSC의 투여에 따른 뇌 경색 치료 효과는 IL-1ra에 의해 매개되는 것으로 전제하여, IV-hUMSC 투여 이후, 뇌 경색 조직에서 IL1RN mRNA 및 IL-1ra 단백질의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, MCAo 유발후 IV-hUMSC의 투여는 IL1RN mRNA를 상향조절하였으며, 이에 따라, IL-1ra 단백질의 수준이 유의적으로 증가됨을 확인할 수 있었다(IV-hUMSCs vs saline: 237.5 ± 49.0 pg/ml vs 119.6 ± 15.6 pg/ml, p = 0.01).
상기의 실험 결과로부터, IL-1ra는 hUMSCs의 정맥 투여(IV-hUMSCs)에 따른 치료 효과와 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다.
또한, IL-1ra 상향조절에 기여하는 세포 아집단을 확인하기 위하여, 면역조직화학 검사를 실시한 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, IV-hUMSC 투여 그룹의 ED-1-양성 세포 내 IL-1ra-양성 세포의 비율이 생리 식염수 투여 그룹에 비해 유의적으로 높음을 확인할 수 있었다(IV-hUMSCs vs saline: 34.8 ± 2.5% vs 22.1 ± 3.4%, p = 0.01). 특히, MCAo 유발후 72시간째 및 4주째, 뇌 셩색 조직에 IV 투여된 hUMSCs가 거의 검출되지 않음을 인간-특이적 핵 항체를 사용한 면역염색에 의해 관찰할 수 있었으며(투여된 세포 중 1% 미만), ELISA 실험에서도 IL-1ra은 hUMSCs의 컨디셔닝된 배지(hUMSCs-CM)에서 검출되지 않았다(<3.2 pg/ml).
이러한 일련의 실험 결과는 상기 hUMSCs의 정맥 투여(IV-hUMSCs)에 따른 IL-1ra의 상향 조절은 이식된 세포로부터 유래하는 것이 아니라, 미세아교세포 및 대식세포와 같은 뇌 경색 조직 내 염증 세포로부터 기인한 것임을 제시한다.
실험예 4. 대식세포에서 hUMSCs에 의한 CREB 활성 및 IL-1ra 방출 변화
(1) Raw 264.7 세포에 대한 hUMSCs의 조건화된 배지의 처리
마우스 대식세포 세포주(Raw 264.7 세포, ATCC, VA)는 제조사의 지침에 따라 배양되었다. 상기 Raw 264.7 세포는 LPS(100 ng/ml, Sigma-Aldrich, MO) 또는 hUMSCs-CM와 함께 LPS로 24시간 동안 처리되었고, 각 처리 그룹으로부터 상등액을 분리하였다.
(2) 웨스턴 블롯 분석
Raw 264.7 세포를 균질화시킨 후, 단백질 용해 완충액(PRO-PREP??, Intron Biotechnology, Seongnam, Republic of Korea)을 사용하여 단백질을 분리하고, 제조사의 지침에 따라 면역블롯 분석을 실시하였다. 전체 단백질을 SDS-PAGE 겔 상에서 분리하고, 1차 항체를 사용하여 면역블롯팅을 실시하였다. 사용된 1차 항체는 다음과 같다: (1) anti-CREB 및 anti-p-CREB(1:1000, Cell Signaling Technology, MA); (2) anti-NF-κB p65 및 anti-p-NF-κB p65 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, TX); 및 (3) anti-IL-1ra(1:500, Santa Cruz Biotechnology, TX). GAPDH (1:5000, Santa Cruz Biotechnology, TX)이 내부 대조군으로 사용되었으며, 밴드의 정량화는 NIH ImageJ 프로그램을 사용하여 수행되었다. 각각 다른 날에 독립적인 실험이 3회 실시되었다.
(3) p-CREB의 저해
Raw 264.7 세포(2 × 105)를 플레이트 상에 씨딩한 후, 이를 24시간 동안 인큐베이팅시켰다. 상기 세포들을 KG501(2, 5, 및 10 μM, Sigma-Aldrich, MO)를 함유하는 무혈청 배지에 45분 동안 전처리하였다. 이후, 배양 접시로부터 상등액을 제거하고, LPS (200 ng/ml) 존재 하에서 hUMSCs-CM를 상기 세포에 처리하였다. 상기 상등액은 IL-1ra ELISA 분석을 위하여 사용되었다. 각각 다른 날에 독립적인 실험이 3회 실시되었다.
(4) CREB의 넉다운
Raw 264.7 세포(2Х105)를 6-웰 플레이트에 플레이팅한 후, 제조사의 지침에 따라, Lipofectamine 3000 reagent (Invitrogen, MA)를 사용하여, 100 nM의 CREB siRNA (siCREB) 및 대조군 (siCtr)로 48시간 동안 형질감염시켰다. 상기 siCREB(센스: 5′- CCACAAAUCAGAUUAAUUUUU-3′', 안티센스: 5′-AAAUUAAUCUGAUUUGUGGUU-3′') 및 siCtr(센스: 5-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′, 안티센스: 5′- UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′')는 Genolution Pharmaceuticals, Inc로부터 입수하였다. 형질감염 이후, 상기 RNA 및 단백질은 분리되었고, 각각 PCR 및 웨스턴 블롯을 위하여 사용되었다.
(5) 효소결합 면역흡착법 (ELISA)
상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트(IL-1
Figure 112018081130545-pat00001
Quantikine ELISA 및 IL-1ra Quantikine ELISA kits, R&D Systems, MN)를 사용하여, Raw 264.7 세포의 상층액에서 IL-1β 및 IL-1ra 수준을 측정하였다.
(6) 실험 결과
중추 신경계의 미세아교세포와 더불어, 순환하는 대식세포 역시 뇌의 실질에 침투하고, 전-염증성 사이토카인을 방출함으로써, 뇌 경색 후 야기되는 염증 반응에 중요한 역할을 한다. 또한, MSC는 순환하는 대식세포를 항-염증성 표현형으로 분극화시키고, 손상된 조직의 치료에 기여하는 수많은 염증세포들을 모이게 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 마우스 대식세포주(Raw 264.7 세포)의 IL-1ra 발현에 대한 hUMSCs-CM의 영향을 조사하였다. 우선, 리포폴리사카라이드 (LPS)의 처리는 Raw 264.7 세포에서 Il-1β 및 IL-1ra 모두의 발현을 강력하게 증가시켰으며, 이에 따라, IL-1ra의 발현은 IL-1β 활성화, 보상적 기작과 같은 염증성 환경 하에서, 염증 반응에 관여하는 NF-κB 신호에 의해 상향조절되는 것으로 예상되었다. 그러나, 도 11에 나타낸 바와 같이, Raw 264.7 세포에 LPS 및 hUMSCs-CM와 공동-처리하였을 때, IL-1β의 수준은 감소되었던 반면, IL-1ra 수준은 오히려 증가되어 전혀 다른 경향을 나타내었는바, 이러한 결과로부터, hUMSCs-CM의 처리에 따른 IL-1ra의 상향조절은 NF-κB외의 다른 기작이 관여함을 알 수 있었다.
이에 따라, 대식세포 내 hUMSCs-매개 IL-1ra 발현에 cAMP-반응 요소-결합성 단백질(CREB)의 영향을 추가로 확인하였다. 웨스턴 블롯 분석 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, Raw 264.7 세포에 hUMSCs-CM 및 LPS를 공동-처리하였을 때, 인산화된 CREB(p-CREB) 단백질의 발현이 유의적으로 증가되었던 반면, 인산화된 NF-κB(p-NF-κB)은 감소되었다. 또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, p-CREB 및 p-NF-κB에 대한 면역조직화학 검사 결과, Raw 264.7 세포에서 LPS와 hUMSCs-CM의 공동-처리는 LPS 단독 처리에 비해, p-CREB의 발현을 강력하게 증가시킴을 보여주었다.
한편, 도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같이, hUMSCs-CM을 CREB 저해제 (KG501)와 함께 처리한 경우, hUMSCs-CM 처리에 의한 IL-1ra 발현 증가가 CREB 저해제의 용량 의존적으로 저해되었고, CREB siRNA(siCREB)으로의 형질감염은 Raw 264.7 세포에서 IL-1ra 단백질의 발현을 감소시켰다. 또한, 도 16에 나타낸 바와 같이, LPS로 자극된 Raw 264.7 세포에서, CREB의 넉다운은 hUMSCs-CM의 처리에 의해 유도된 IL1RN의 증가된 발현을 감소시켰다.
이러한 일련의 실험 결과는 대식세포를 포함하는 염증세포 내 IL-1ra의 발현 증가는 뇌 졸증의 치료에 기여할 수 있으며, 상기의 발현은 CREB에 의해 매개됨을 나타내는 것이다.

Claims (15)

  1. 염증 세포 내 IL-1RA(Interleukin-1 receptor antagonist)의 발현을 증가시키는 물질을 유효 성분으로 포함하는, 급성 뇌졸중 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 염증 세포 내 IL-1RA의 발현을 증가시키는 물질은 탯줄 유래 중간엽 기질 세포이고,
    상기 탯줄 유래 중간엽 기질 세포는 TGF-β1, HGF, 및 IDO 중 선택되는 어느 하나 이상의 인자를 분비하되, 상기 각 인자의 분비 수준은 VEGF의 분비 수준에 비해 높으며,
    상기 탯줄 유래 중간엽 기질 세포는 FGF4 및 헤파린을 포함하는 배지에서 3%의 O2 조건으로 7 계대 배양된 후, 무혈청 배지에서 배양된 것인, 급성 뇌졸중 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 염증 세포는 미세아교세포 또는 대식세포인 것인, 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 정맥 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 뇌 경색 후 24시간 이내에 투여되는 것인, 약학적 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 탯줄 유래 중간엽 기질 세포는 TGF-β1, HGF, 및 IDO 중 선택되는 인자를 VEGF의 분비 수준에 비해 2 내지 14 배 더 높은 수준으로 분비하는 것인, 약학적 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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