따라서, 본 명세서의 측면들은 전위 영역 또는 HCN 결합 서브영역(subdomain)에 위치하는 불활성화 분해 부위 부분 내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소를 제공한다. 이러한 기술된 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위를 포함하는 디-쇄 루프 부분, 및 불활성화 분해 부위 부분 내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함할 수 있다. 불활성화 분해 부위의 비-제한적 예로는 트롬빈 분해 부위, 플라즈민 분해 부위, 응고인자 VIIa 분해 부위, 응고인자 IXa 분해 부위, 응고인자 Xa 분해 부위, 응고인자 XIa 분해 부위, 응고인자 XIIa 분해 부위, 혈장 칼리크레인 분해 부위, 프로테아제-활성화된 G 단백질-커플링된 수용체-1(PAR1) 분해 부위, PAR2 분해 부위, PAR3 분해 부위, PAR4 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2) 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9) 분해 부위, 푸린(Furin) 분해 부위, 유로키나제-타입 플라즈미노겐 활성화제(uPA) 분해 부위, 조직-타입 플라즈미노겐 활성화제(tPA) 분해 부위, 트립타제-ε 분해 부위, 마우스 비만세포 프로테아제-7(mMCP-7) 분해 부위, 엔도텔린-전환효소-1(ECE-1) 분해 부위, 켈 혈액형(Kell blood group) 분해 부위, DPPIV 분해 부위, 트롬보스폰딘 타입 1 모티프-13(ADAMTS13) 분해 부위를 갖는 ADAM 메탈로펩티다제, 및 카텝신 L 분해 부위가 포함된다. 불활성화 분해 부위의 첨가는 추가의 불활성화 분해 부위가 없는 동일하거나 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 비해 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 증가시킨다.
본 명세서의 다른 측면들은 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 및 전위 영역 또는 HCN 결합 서브영역에 위치하는 불활성화 분해 부위 부분 내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 키메릭을 제공한다. 이러한 기술된 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위를 포함하는 디-쇄 루프 부분, 및 불활성화 분해 부위 부분 내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함할 수 있다. 불활성화 분해 부위의 비-제한적 예로는 트롬빈 분해 부위, 플라즈민 분해 부위, 응고인자 VIIa 분해 부위, 응고인자 IXa 분해 부위, 응고인자 Xa 분해 부위, 응고인자 XIa 분해 부위, 응고인자 XIIa 분해 부위, 혈장 칼리크레인 분해 부위, 프로테아제-활성화된 G 단백질-커플링된 수용체-1(PAR1) 분해 부위, PAR2 분해 부위, PAR3 분해 부위, PAR4 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2) 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9) 분해 부위, 푸린 분해 부위, 유로키나제-타입 플라즈미노겐 활성화제(uPA) 분해 부위, 조직-타입 플라즈미노겐 활성화제(tPA) 분해 부위, 트립타제-ε 분해 부위, 마우스 비만세포 프로테아제-7(mMCP-7) 분해 부위, 엔도텔린-전환효소-1(ECE-1) 분해 부위, 켈 혈액형 분해 부위, DPPIV 분해 부위, 트롬보스폰딘 타입 1 모티프-13(ADAMTS13) 분해 부위를 갖는 ADAM 메탈로펩티다제, 및 카텝신 L 분해 부위가 포함된다. 불활성화 분해 부위의 첨가는 추가의 불활성화 분해 부위가 없는 동일하거나 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 비해 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 증가시킨다.
본 명세서의 다른 측면들은 본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화한 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 이러한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화한 폴리뉴클레오타이드 분자는 발현 벡터를 더 포함할 수 있다.
본 명세서의 다른 측면들은 본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 이러한 약제학적 조성물은 본 명세서에 기술된 변형된 클로스트리듐 독소 이외에도 약제학적 담체, 약제학적 성분, 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
본 명세서의 다른 측면들은 세포 내에서 본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소를 코드화한 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현(여기에서, 폴리뉴클레오타이드 분자로부터의 발현은 코드화된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 생산한다)시키는 단계를 포함하여, 본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 생산하는 방법을 제공한다. 다른 측면들에서, 상기 방법은 세포 내로 본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화한 폴리뉴클레오타이드 분자를 도입시키고, 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현시키는 단계를 포함하며, 여기에서 폴리뉴클레오타이드 분자로부터의 발현은 코드화된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 생산한다.
클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클로스트리듐 바라티(Clostridium baratii) 및 클로스트리듐 부티리쿰(Clostridium butyricum)에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소는 인간 및 그 밖의 다른 포유동물의 치료학적 및 미용적 치료에 가장 광범하게 사용된다. 시. 보툴리눔(C. botulinum)의 균주는 인간(BoNT/A, /B, /E 및 /F), 동물(BoNT/C1 및 /D)에서의 보툴리즘 발생을 조사함으로써 확인되었거나, 토양(BoNT/G)으로부터 분리된 7 개의 항원적으로-상이한 타입의 보툴리눔 독소(BoNTs)를 생산한다. BoNT는 서로 약 35% 아미노산 동일성을 가지며, 동일한 기능성 영역 조직화 및 전반적인 구조적 구성을 공유한다. 클로스트리듐 독소의 각각의 타입에는 그들의 아미노산 서열, 및 또한 이들 단백질을 코드화한 핵산에 있어서 약간 상이한 서브타입(subtype)이 있을 있다는 것은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 인식된다. 예를 들어, 현재는 5 개의 BoNT/A 서브타입인 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5가 있으며, 특정한 서브타입들은 SEQ ID NO: 1의 BoNT/A 서브타입과 비교하였을 때 약 84% 내지 93% 아미노산 동일성을 나타낸다. 또 다른 예로서는, 현재 5 개의 BoNT/B 서브타입인 BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/Bnp, 및 BoNT/Bbv가 있으며, 특정한 서브타입들은 SEQ ID NO: 6의 BoNT/B 서브타입과 비교하였을 때 약 93% 내지 96% 아미노산 동일성을 나타낸다. 또 다른 예로서, 현재 3 개의 BoNT/E 서브타입 BoNT/E1 , BoNT/E2, 및 BoNT/E3가 있으며, 특정한 서브타입들은 SEQ ID NO: 15의 BoNT/E 서브타입과 비교하였을 때 약 95% 내지 99% 아미노산 동일성을 나타낸다. 7 개의 BoNT 혈청형 모두는 유사한 구조적 및 약물학적 특성을 갖지만, 각각은 또한 이질적인 세균학적 특징을 나타낸다. 그에 반해서, 테타누스 독소(TeNT)는 클로스트리듐 테타니(C. tetani)의 균일한 그룹에 의해서 생산된다. 2 개의 다른 클로스트리듐 종인 클로스트리듐 바라티(C. baratii) 및 클로스트리듐 부티리쿰(C. butyricum)은 각각 BoNT/F 및 BoNT/E와 유사한 BaNT 및 BuNT를 생산한다.
클로스트리듐 독소는 각각 약 150 kDa의 단일 쇄 폴리펩타이드로서 해독되고, 이어서 천연적으로-존재하는 프로테아제에 의해 디설파이드 루프 내에서 단백분해적 절단에 의해 분해된다(도 1). 이 분해는 디설파이드 브릿지를 형성한 2 개의 시스테인 잔기 사이에서 발생된 불연속적인 디-쇄 루프 부분 내에서 일어난다. 이러한 해독후 과정은 단일 디설파이드 결합 및 2 개의 쇄 사이의 비-공유적 상호작용에 의해서 함께 결합된 약 50 kDa 경쇄(LC) 및 약 100 kDa 중쇄(HC)를 포함하는 디-쇄 분자를 제공한다. 단일 쇄 분자를 디-쇄로 전환시키기 위해서 사용된 천연적으로-존재하는 프로테아제는 현재 알려지지 않았다. 예를 들어, BoNT/A와 같은 일부의 혈청형에서, 천연적으로-존재하는 프로테아제는 박테리아 혈청형에 의해서 내인성으로 생산되며, 분해는 독소가 환경 내로 방출되기 전에 세포 내에서 일어난다. 그러나, 예를 들어, BoNT/E와 같은 다른 혈청형에서는 박테리아 균주가 독소의 단일 쇄 형태를 디-쇄 형태로 전환시킬 수 있는 내인성 프로테아제를 생산하지 않는 것으로 보인다. 이들 상황에서는, 독소는 단일-쇄 독소로서 세포로부터 방출되고, 이어서 환경에 존재하는 천연적으로-존재하는 프로테아제에 의해서 디-쇄 형태로 전환된다.
각각의 성숙 디-쇄 분자는 3 개의 기능적으로 상이한 영역을 포함한다: 1) 신경전달물질 방출 기구의 코어 성분을 특이적으로 표적으로 하는 아연-의존적 엔도펩티다제 활성을 함유하는 메탈로프로테아제 부분을 포함하는 LC 내에 위치하는 효소 영역; 2) 세포내 소포로부터 표적 세포의 세포질 내로 LC의 방출을 용이하게 하는 HC의 아미노-말단 절반(HN) 내에 함유된 전위 영역; 및 3) 표적 세포의 표면에 위치한 수용체 컴플렉스에 대한 독소의 결합 활성 및 결합 특이성을 결정하는 HC의 카복실-말단 절반(HC) 내에서 발견되는 결합 영역 [D. B. Lacy and R. C. Stevens, Sequence Homology and Structural Analysis of the Clostridial Neurotoxins, J. Mol. Biol. 291: 1091-1104(1999)]. HC 영역은 α-나선에 의해서 분리된 것으로, HCN 및 Hcc 서브영역으로 지정된 대략 동일한 크기의 2 개이 상이한 구조적 특징을 포함한다. 표 1은 예시적인 클로스트리듐 독소에서 발견된 각각의 영역 및 서브영역에 대한 대략적인 경계 부분을 제공한다.
표1. 클로스트리듐 독소 기준 서열 및 부분 |
독소 |
SEQ ID NO: |
LC |
디-쇄 루프 |
HN |
HC |
HCN |
α-링커 |
HCC |
이들 3 개의 기능적 영역의 결합, 전위 및 효소 활성은 모두 독성에 필수적이다. 이 과정의 모든 상세한 사항은 아직 정확하게 알려지지 않았지만, 클로스트리듐 독소가 뉴론 내로 들어가서 신경전달물질 방출을 억제하는 전반적인 세포 중독 기전은 혈청형 또는 서브타입과는 무관하게 유사하다. 비록 본 출원인들이 다음의 설명으로 제한하기를 원치는 않지만, 중독 기전은 적어도 4 개의 단계를 포함하는 것으로 설명될 수 있다: 1) 수용체 결합, 2) 컴플렉스 내재화, 3) 경쇄 전위, 및 4) 효소 표적 변형(도 3). 이 과정은 클로스트리듐 독소의 HC 영역이 표적 세포의 원형질막 표면상에 위치하는 독소-특이적 수용체 시스템에 결합하면 개시된다. 수용체 컴플렉스의 결합 특이성은 부분적으로, 명백하게 각각의 클로스트리듐 독소 수용체 컴플렉스를 포함하는 것으로 보이는 단백질 수용체 및 갱글리오사이드의 특이적 조합에 의해서 달성되는 것으로 생각된다. 일단 결합되면, 독소/수용체 컴플렉스는 세포내이입에 의해서 내재화되고, 내재화된 소포는 특이적 세포내 경로들로 구분된다. 전위 단계는 소포 구획의 산성화에 의해서 유발되는 것으로 보인다. 이 과정은 소수성을 증가시키고, 독소의 디-쇄 형태 형성을 촉진시키는 2 개의 중요한 pH-의존성 구조적 재배열을 개시시키는 것으로 보인다. 일단 활성화되면, 독소의 경쇄 엔도펩티다제가 세포내 소포로부터 사이토졸 내로 방출되고, 여기에서 이것은 신경전달물질 방출 기구의 3 개의 공지된 코어 성분 중의 하나를 특이적으로 표적으로 하는 것으로 보인다. 이들 코어 단백질인 소포-결합된 막단백질(VAMP)/시냅토브레빈, 25 kDa의 시냅토좀-결합된 단백질(SNAP-25) 및 신택신(Syntaxin)은 신경 말단에서의 시냅스 소포 도킹 및 융합에 필수적이며, 가용성 N-에틸말레이미드-민감성 인자-부착 단백질-수용체(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor-attachment protein-receptor; SNARE) 패밀리의 구성원들을 구성한다. BoNT/A 및 BoNT/E는 카복실-말단 부분에서 SNAP-25를 분해하여 각각 9 개 또는 26 개의 아미노산 분절을 방출하며, BoNT/C1은 또한 SNAP-25를 카복실-말단에 근접해서 분해시킨다. 보툴리눔 혈청형 BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F 및 BoNT/G, 및 테타누스 독소는 VAMP의 보존된 중앙 부분에 작용하여 VAMP의 아미노-말단 부분을 사이토졸 내로 방출시킨다. BoNT/C1은 사이토졸 막 표면에 근접한 단일 부위에서 신택신을 분해한다. 시냅스 SNAREs의 선택적 단백분해는 생체내에서 클로스트리듐 독소에 의해서 야기된 신경전달물질 방출의 차단을 설명한다. 클로스트리듐 독소의 SNARE 단백질 표적은 다양한 비-뉴론성 타입에서의 세포외유출에 공통적이며; 뉴론에서와 같이 이들 세포에서 경쇄 펩티다제 활성은 세포외유출을 억제한다. [참조: 예를 들어, Yann Humeau et al., How Botulinum and Tetanus Neurotoxins Block Neurotransmitter Release, 82(5) Biochimie. 427-446(2000); Kathryn Turton et al., Botulinum and Tetanus Neurotoxins: Structure, Function and Therapeutic Utility, 27(11) Trends Biochem. Sci. 552-558.(2002); Giovanna Lalli et al., The Journey of Tetanus and Botulinum Neurotoxins in Neurons, 11(9) Trends Microbiol. 431-437,(2003)].
BoNT/A, BoNT/B 및 TeNT의 Hc 영역의 삼차원 결정 구조는 클로스트리듐 신경독의 3 개의 기능적 영역이 모든 클로스트리듐 독소에 의해서 공유되는 구조적으로 상이한 영역임을 시사한다. 경쇄의 HEXXH 공통 모티프(consensus motif)는 채널에 의해서 접근하기 쉬운 단백질 표면상의 깊은 클레프트(cleft)에 위치하는 촉매적 부위의 사면체 아연 결합 포켓을 형성한다. HN 및 HC 영역의 구조는 주로, 단일 α-나선에 의해서 연결된 β-시트 토폴로지(topologies)로 구성된다. 원통-형상의 HN 영역은 일부의 바이러스 단백질에서 발견되는 감긴 코일(coiled-coil) 모티프와 닮은 긴 양친매성 α-나선들을 포함한다. HN 영역은 또한, 활성 부위의 촉매적-결합 포켓에 대한 아연 원자의 접근을 차단하는 경쇄의 음으로 하전된 큰 클레프트 주위를 감싸는 '전위 벨트(translocation belt)'로 불리는 긴 비구조적(unstructured) 루프를 형성한다. HC 영역은 기능을 나타내는 대략 동등한 크기의 2 개의 상이한 구조적 특징을 포함한다. HCN 영역으로 지정된 첫 번째 것은 HC 영역의 아미노 절반에 위치한다. HCN 영역은 β-배럴(barrel), 젤리-롤 폴드를 형성한다. HCC 영역은 HC 영역을 포함하는 두 번째 영역이다. 이 카복실-말단 영역은 예를 들어, 혈청 아밀로이드 P, 시알리다제, 크리아(cryia), 살충성 3-엔도톡신 및 렉틴과 같은 다수의 당-결합성 단백질에서 발견되는 탄수화물 결합 부분을 닮은 3 개의 상이한 탄수화물 결합 부분을 형성하는 변형된 β-트레포일 영역을 포함한다. 생화학적 연구는 HCC 영역의 β-트레포일 영역 구조가 세포 표면상의 클로스트리듐 독소 수용체의 특이적 탄수화물 함유 성분에 대한 결합을 매개하는 것으로 보임을 시사하였다. [참조: 예를 들어, Krzysztof Ginalski et al., Structure-based Sequence Alignment for the Beta-Trefoil Subdomain of the Clostridial Neurotoxin Family Provides Residue Level Information About the Putative Ganglioside Binding Site, 482(1-2) FEBS Lett. 119-124(2000)]. HC 영역은 HN 영역으로부터 기울어져서 표면 루프를 노출시키고, 이들이 결합을 위해서 접근할 수 있도록 만든다. 경쇄와 HC 영역 사이에서 접촉은 일어나지 않는다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로 클로스트리듐 독소를 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소"는 클로스트리듐 독소가 세포를 중독시키고, 클로스트리듐 독소의 저 또는 고 친화성 수용체 컴플렉스에 대한 결합, 독소/수용체 컴플렉스의 내재화, 클로스트리듐 독소 경쇄의 세포질 내로의 전위 및 클로스트리듐 독소 기질의 효소적 변형을 포함하는 전반적인 세포 기전을 실행할 수 있는 클로스트리듐 독소 균주에 의해서 생산되는 모든 신경독을 나타낸다. 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 및 클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함한다. 예시적인 클로스트리듐 독소에는 클로스트리듐 보툴리눔, 클로스트리듐 테타니, 클로스트리듐 바라티 및 클로스트리듐 부티리쿰에 의해서 생산된 것들이 포함된다.
클로스트리듐 독소에는 제한이 없이, 예를 들어, 클로스트리듐 독소 이소형태 및 클로스트리듐 독소 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 변이체; 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체 및 그의 활성 클로스트리듐 독소 단편과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 변이체, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 변이체"는 천연적으로 존재하든지 비-천연적으로 존재하는지, 기술된 기준 서열(표 1)의 상응하는 부분으로부터 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며, 그 기준 서열의 상응하는 부분에 대해서 동일성 퍼센트로 설명될 수 있는 클로스트리듐 독소를 나타낸다. 비-제한적인 예로서, SEQ ID NO: 1의 BoNT/A 변이체는 SEQ ID NO: 1의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; SEQ ID NO: 6의 BoNT/B 변이체는 SEQ ID NO: 6의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; SEQ ID NO: 11의 BoNT/C1 변이체는 SEQ ID NO: 11의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; SEQ ID NO: 13의 BoNT/D 변이체는 SEQ ID NO: 13의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; SEQ ID NO: 15의 BoNT/E 변이체는 SEQ ID NO: 15의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; SEQ ID NO: 18의 BoNT/F 변이체는 SEQ ID NO: 18의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; SEQ ID NO: 21의 BoNT/G 변이체는 SEQ ID NO: 21의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; SEQ ID NO: 22의 TeNT 변이체 c는 SEQ ID NO: 22의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; SEQ ID NO: 23의 BaNT 변이체는 SEQ ID NO: 23의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; SEQ ID NO: 24의 BuNT 변이체는 SEQ ID NO: 24의 상응하는 위치(들)와 비교하여, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 변이체"는 제한이 없이, 선택적으로 스플리싱된 전사물로부터 생산된 클로스트리듐 독소 이소형태, 자발적 돌연변이에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 이소형태 및 클로스트리듐 독소 서브타입을 포함하는, 어떤 인간 조작의 도움도 없이 생산된 모든 클로스트리듐 독소를 나타낸다. 클로스트리듐 독소 이소형태의 비-제한적 예로는 예를 들어, BoNT/A 이소형태, BoNT/B 이소형태, BoNT/C1 이소형태, BoNT/D 이소형태, BoNT/E 이소형태, BoNT/F 이소형태, BoNT/G 이소형태, TeNT 이소형태, BaNT 이소형태 및 BuNT 이소형태가 포함된다. 클로스트리듐 독소 서브타입의 비-제한적 예로는 예를 들어, BoNT/A 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5; BoNT/B 서브타입 BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, 2가 BoNT/B 2가 및 비단백분해성 BoNT/B; BoNT/C1 서브타입 BoNT/C1-1 및 BoNT/C1-2; BoNT/E 서브타입 BoNT/E1, BoNT/E2, 및 BoNT/E3; BoNT/F 서브타입 BoNT/F1, BoNT/F2, 및 BoNT/F3; 및 BuNT 서브타입 BuNT-1, 및 BuNT-2가 포함된다. 클로스트리듐 독소 서브타입의 그 밖의 다른 비-제한적 예로는 예를 들어, BoNT/A 서브타입 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 및 SEQ ID NO: 5; BoNT/B 서브타입 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 및 SEQ ID NO: 10; BoNT/C1 서브타입 SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12; BoNT/E 서브타입 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 및 SEQ ID NO: 17; BoNT/F 서브타입 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 및 SEQ ID NO: 20; 및 BuNT 서브타입 SEQ ID NO: 24 및 SEQ ID NO: 25가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 변이체"는 제한이 없이 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 디자인을 사용한 유전자 조작에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 및 화학적 합성에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소를 포함하는, 인간 조작의 도움을 받아서 생산된 모든 클로스트리듐 독소를 나타낸다. 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체, 및 활성 클로스트리듐 독소 단편이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "보존적 클로스트리듐 독소 변이체"는 기준 클로스트리듐 독소 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 클로스트리듐 독소를 나타낸다. 특성의 예로는 제한이 없이 유사한 크기, 토포그래피(topography), 전하, 소수성, 친수성, 친유성, 공유-결합능, 수소-결합능, 물리화학적 특성 등, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 보존적 클로스트리듐 독소 변이체는 보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소와 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소에 대체될 수 있다. 보존적 클로스트리듐 독소 변이체는 보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소로부터 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개 또는 그 이상의 아미노산을 치환시킬 수 있다. 보존적 클로스트리듐 독소 변이체는 또한, 보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기로로 하는 기준 클로스트리듐 독소로부터 적어도 5, 10, 15, 20, 또는 25 개의 인접한 아미노산들을 치환시킬 수 있다. 보존적 클로스트리듐 독소 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 BoNT/A 변이체, 보존적 BoNT/B 변이체, 보존적 BoNT/C1 변이체, 보존적 BoNT/D 변이체, 보존적 BoNT/E 변이체, 보존적 BoNT/F 변이체, 보존적 BoNT/G 변이체, 보존적 TeNT 변이체, 보존적 BaNT 변이체 및 보존적 BuNT 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체"는 1) 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소로부터 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나; 2) 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소에 적어도 하나의 아미노산이 첨가되거나; 3) 기준 클로스트리듐 독소 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 어떤 특성도 공유하지 않는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 적어도 하나의 아미노산이 치환된 클로스트리듐 독소를 나타낸다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소와 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있고, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소에 대체될 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산, 2 개 또는 그 이상의 아미노산, 3 개 또는 그 이상의 아미노산, 4 개 또는 그 이상의 아미노산, 5 개 또는 그 이상의 아미노산, 및 10 개 또는 그 이상의 아미노산을 결실시킬 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소에 하나 또는 그 이상의 아미노산, 2 개 또는 그 이상의 아미노산, 3 개 또는 그 이상의 아미노산, 4 개 또는 그 이상의 아미노산, 5 개 또는 그 이상의 아미노산, 및 10 개 또는 그 이상의 아미노산을 첨가할 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소로부터 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개 또는 그 이상의 아미노산을 치환시킬 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 치환체는 또한, 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소로부터 적어도 5, 10, 15, 20, 또는 25 개의 인접한 아미노산들을 치환시킬 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 비-보존적 BoNT/A 변이체, 비-보존적 BoNT/B 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 변이체, 비-보존적 BoNT/D 변이체, 비-보존적 BoNT/E 변이체, 비-보존적 BoNT/F 변이체, 비-보존적 BoNT/G 변이체, 비-보존적 TeNT 변이체, 비-보존적 BaNT 변이체 및 비-보존적 BuNT 변이체가 포함된다.
또한, 다양한 클로스트리듐 독소 단편 중의 어떤 것이라도 이들 활성 단편이 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 실행할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 이 구체예의 측면들은 예를 들어, 적어도 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 또는 적어도 1200 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 단편을 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들은 예를 들어, 최대 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 또는 최대 1200 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 단편을 포함할 수 있다.
또한, 경쇄를 포함하는 다양한 클로스트리듐 독소 단편 중의 어떤 것이라도 이들 경쇄 단편이 신경전달물질 방출 기구의 코어 성분을 특이적으로 표적으로 할 수 있고, 따라서 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 실행하는데 참여할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 클로스트리듐 독소의 경쇄는 길이가 대략 420-460 아미노산이며, 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함한다(표 1). 연구는 클로스트리듐 독소 경쇄의 전체 길이가 클로스트리듐 독소 효소 영역의 효소적 활성에 필수적인 것은 아님을 나타내었다. 비-제한적 예로서, BoNT/A 경쇄의 처음 8 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 또 다른 비-제한적 예로서, TeNT 경쇄의 처음 8 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 마찬가지로, 경쇄의 카복실-말단은 활성에 필수적이지 않다. 비-제한적 예로서, BoNT/A 경쇄의 마지막 32 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 또 다른 비-제한적 예로서, TeNT 경쇄의 마지막 31 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 따라서, 이 구체예의 측면들에는 예를 들어, 적어도 350, 375, 400, 425, 또는 450 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 경쇄가 포함된다. 이 구체예의 다른 측면들에는 예를 들어, 최대 350, 375, 400, 425, 또는 450 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 경쇄가 포함된다.
또한, 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는 다양한 클로스트리듐 독소 HN 부분 중의 어떤 것이라도 이들 활성 단편이 세포내 소포로부터 표적 세포의 세포질 내로 LC의 방출을 용이하게 할 수 있고, 따라서 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 실행하는데 참여할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 클로스트리듐 독소의 중쇄로부터의 HN 부분은 길이가 대략 410-430 아미노산이며, 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함한다(표 1). 연구는 클로스트리듐 독소 중쇄로부터의 HN 부분의 전체 길이가 클로스트리듐 독소 전위 영역의 전위 활성에 필수적인 것은 아님을 나타내었다. 따라서, 이 구체예의 측면들은 예를 들어, 적어도 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 HN 부분을 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들은 예를 들어, 최대 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 HN 부분을 포함할 수 있다.
또한, 클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함하는 다양한 클로스트리듐 독소 HC 부분 중의 어떤 것이라도 이들 활성 단편이 표적 세포의 표면에 위치한 수용체 컴플렉스에 대한 독소의 결합 활성 및 결합 특이성을 결정할 수 있고, 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 용이하게 할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 클로스트리듐 독소의 중쇄로부터의 HC 부분은 길이가 약 400-440 아미노산이며, 결합 영역을 포함한다(표 1). 연구는 클로스트리듐 독소 중쇄로부터의 HC 부분의 전체 길이가 클로스트리듐 독소 결합 영역의 결합 활성에 필수적인 것은 아님을 나타내었다. 따라서, 이 구체예의 측면들은 예를 들어, 적어도 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 결합 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 HC 부분을 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들은 예를 들어, 최대 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 결합 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 HC 부분을 포함할 수 있다.
제한이 없이 예를 들어, 분절 접근방법(segment approach methods)과 같은 포괄적 방법, 국소적 방법 및 하이브리드 방법을 포함한 다양한 서열 정렬방법 중의 어떤 것이라도 동일성 퍼센트를 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 프로토콜은 본 기술분야에서 숙련된 전문가의 범주 내에서, 및 본 명세서의 교시내용으로부터 일상적인 절차이다.
포괄적 방법은 분자의 처음부터 끝까지 서열을 정렬하고, 개개의 잔기쌍의 점수를 합하고, 갭(gap) 벌점을 부과함으로써 최상의 정렬을 결정한다. 비-제한적 방법으로는 예를 들어, CLUSTAL W [참조: 예를 들어, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through Sequence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)]; 및 반복적인 개선방법[참조: 예를 들어, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. Mol. Biol. 823-838(1996)]이 포함된다.
국소적 방법은 입력 서열 모두에 의해서 공유된 하나 또는 그 이상의 보존적 모티프를 확인함으로써 서열을 정렬한다. 비-제한적 방법에는 예를 들어, 매치-박스(Match-box) [참조: 예를 들어, Eric Depiereux and Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences, 8(5) CABIOS 501-509(1992); 깁스(Gibbs) 샘플링 [참조: 예를 들어, C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle Sequence Signals: A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment, 262(5131) Science 208-214(1993)]; Align-M[참조: 예를 들어, Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences, 20(9) Bioinformatics,: 1428-1435(2004)]이 포함된다.
하이브리드 방법은 포괄적 및 국소적 정렬방법 둘 다의 기능적 측면들을 조합한 것이다. 비-제한적 방법에는 예를 들어, 분절-대-분절 비교 [참조: 예를 들어, Burkhard Morgenstern et al., Multiple DNA and Protein Sequence Alignment Based On Segment-To-Segment Comparison, 93(22) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 12098-12103(1996)]; T-Coffee [참조: 예를 들어, Cedric Notredame et al., T-Coffee: A Novel Algorithm for Multiple Sequence Alignment, 302(1) J. Mol. Biol. 205-217(2000)]; MUSCLE [참조: 예를 들어, Robert C. Edgar, MUSCLE: Multiple Sequence Alignment With High Score Accuracy and High Throughput, 32(5) Nucleic Acids Res. 1792-1797(2004)]; 및 DIALIGN-T[참조: 예를 들어, Amarendran R Subramanian et al., DIALIGN-T: An Improved Algorithm for Segment-Based Multiple Sequence Alignment, 6(1) BMC Bioinformatics 66(2005)]가 포함된다.
본 발명은 예를 들어, 클로스트리듐 독소 변이체, 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체, 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체, 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 및 프로테아제 분해 부위 변이체와 같은 하나의 아미노산이 또 다른 것으로 치환된 다양한 폴리펩타이드 변이체를 기술한다. 치환은 예를 들어, 치환된 아미노산의 물리적 특성(표 2) 또는 원래의 아미노산이 치환을 어떻게 견뎌낼지(표 3)와 같은 다양한 인자들에 의해서 평가될 수 있다. 폴리펩타이드 내의 또 다른 아미노산에 대해서 치환될 수 있는 아미노산의 선택은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 공지되어 있다.
표 2. 아미노산 특성
|
특성
|
아미노산
|
지방족 |
G, A, I, L, M, P, V |
방향족 |
F, H, W, Y |
C-베타 분지 |
I, V, T |
소수성 |
C, F, I, L, M, V, W |
소형 극성 |
D, N, P |
소형 비-극성 |
A, C, G, S, T |
대형 극성 |
E, H, K, Q, R, W, Y |
대형 비-극성 |
F, I, L, M, V |
하전됨 |
D, E, H, K, R |
비하전됨 |
C, S, T |
음성 |
D, E |
양성 |
H, K, R |
산성 |
D, E |
염기성 |
K, R |
아미드 |
N, Q |
표3. 아미노산 치환
|
아미노산 |
바람직한 치환 |
중립 치환 |
바람직하지 않은 치환 |
따라서, 구체예에서 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 및 클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 클로스트리듐 독소는 예를 들어, 클로스트리듐 독소 이소형태 또는 클로스트리듐 독소 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소는 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 변이체 또는 활성 클로스트리듐 독소 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역 또는 그의 활성 단편, 클로스트리듐 독소 전위 영역 또는 그의 활성 단편, 클로스트리듐 독소 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, 또는 BuNT를 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 소수성 아미노산의 예로는 예를 들어, C, F, I, L, M, V 및 W가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 지방족 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 지방족 아미노산의 예로는 예를 들어, A, I, L, P, 및 V가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 방향족 아미노산은 또 다른 방향족 아미노산으로 치환될 수 있다. 방향족 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 스태킹(stacking) 아미노산은 또 다른 스태킹 아미노산으로 치환될 수 있다. 스태킹 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성 아미노산의 예로는 예를 들어, D, E, K, N, Q, 및 R이 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 덜 극성이거나 중성인 아미노산은 또 다른 덜 극성이거나 중성인 아미노산으로 치환될 수 있다. 덜 극성이거나 중성인 아미노산의 예로는 예를 들어, A, H, G, P, S, T, 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 양으로 하전된 아미노산은 또 다른 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, K, R, 및 H가 포함된다. 이 구체예의 또한 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 음으로 하전된 아미노산은 또 다른 음으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, D 및 E가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 소형 아미노산은 또 다른 소형 아미노산으로 치환될 수 있다. 소형 아미노산의 예로는 예를 들어, A, D, G, N, P, S, 및 T가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서의 C-베타 분지된 아미노산은 또 다른 C-베타 분지된 아미노산으로 치환될 수 있다. C-베타 분지된 아미노산의 예로는 예를 들어, I, T 및 V가 포함된다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/A를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/A는 BoNT/A 효소 영역, BoNT/A 전위 영역, 및 BoNT/A 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A는 예를 들어, BoNT/A 이소형태 또는 BoNT/A 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/A 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A는 예를 들어, BoNT/A 이소형태 또는 BoNT/A 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 천연적으로 존재하는 BoNT/A 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A는 예를 들어, 보존적 BoNT/A 변이체, 비-보존적 BoNT/A 변이체 또는 활성 BoNT/A 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A는 예를 들어, 보존적 BoNT/A 변이체, 비-보존적 BoNT/A 변이체, 활성 BoNT/A 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A는 BoNT/A 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/A 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/A 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 BoNT/A 효소 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 BoNT/A 전위 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 BoNT/A 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A는 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면들에서, BoNT/A는 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A는 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/B를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/B는 BoNT/B 효소 영역, BoNT/B 전위 영역, 및 BoNT/B 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B는 예를 들어, BoNT/B 이소형태 또는 BoNT/B 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/B 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B는 예를 들어, BoNT/B 이소형태 또는 BoNT/B 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 천연적으로 존재하는 BoNT/B 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B는 예를 들어, 보존적 BoNT/B 변이체, 비-보존적 BoNT/B 변이체, 활성 BoNT/B 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B는 예를 들어, 보존적 BoNT/B 변이체, 비-보존적 BoNT/B 변이체, 활성 BoNT/B 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B는 BoNT/B 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/B 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/B 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 BoNT/B 효소 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 BoNT/B 전위 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 BoNT/B 결합 영역, 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B는 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B는 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B는 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/C1을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/C1은 BoNT/C1 효소 영역, BoNT/C1 전위 영역, 및 BoNT/C1 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 또는 BoNT/C1 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 또는 BoNT/C1 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 변이체, 활성 BoNT/C1 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 변이체, 활성 BoNT/C1 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1은 BoNT/C1 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/C1 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/C1 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 그의 모든 조합을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 BoNT/C1 효소 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 BoNT/C1 전위 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 BoNT/C1 결합 영역, 또는 그의 활성 단편, 또는 그의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1은 예를 들어, SEQ ID NO: 3에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/D를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/D는 BoNT/D 효소 영역, BoNT/D 전위 영역, 및 BoNT/D 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D는 예를 들어, BoNT/D 이소형태 또는 BoNT/D 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/D 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D는 예를 들어, BoNT/D 이소형태 또는 BoNT/D 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 천연적으로 존재하는 BoNT/D 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D는 예를 들어, 보존적 BoNT/D 변이체, 비-보존적 BoNT/D 변이체, 활성 BoNT/D 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D는 예를 들어, 보존적 BoNT/D 변이체, 비-보존적 BoNT/D 변이체, 활성 BoNT/D 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D는 BoNT/D 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/D 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/D 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 그의 모든 조합을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 BoNT/D 효소 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 BoNT/D 전위 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 BoNT/D 결합 영역, 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D는 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D는 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D는 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/E를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/E는 BoNT/E 효소 영역, BoNT/E 전위 영역, 및 BoNT/E 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E는 예를 들어, BoNT/E 이소형태 또는 BoNT/E 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/E 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E는 예를 들어, BoNT/E 이소형태 또는 BoNT/E 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 천연적으로 존재하는 BoNT/E 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E는 예를 들어, 보존적 BoNT/E 변이체, 비-보존적 BoNT/E 변이체, 활성 BoNT/E 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E는 예를 들어, 보존적 BoNT/E 변이체, 비-보존적 BoNT/E 변이체, 활성 BoNT/E 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E는 BoNT/E 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/E 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/E 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 그의 모든 조합을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 BoNT/E 효소 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 BoNT/E 전위 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 BoNT/E 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 그의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E는 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E는 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E는 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/F를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, BoNT/F는 BoNT/F 효소 영역, BoNT/F 전위 영역, 및 BoNT/F 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F는 예를 들어, BoNT/F 이소형태 또는 BoNT/F 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/F 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F는 예를 들어, BoNT/F 이소형태 또는 BoNT/F 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 천연적으로 존재하는 BoNT/F 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F는 예를 들어, 보존적 BoNT/F 변이체, 비-보존적 BoNT/F 변이체, 활성 BoNT/F 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F는 예를 들어, 보존적 BoNT/F 변이체, 비-보존적 BoNT/F 변이체, 활성 BoNT/F 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F는 BoNT/F 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/F 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/F 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 그의 모든 조합을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 BoNT/F 효소 영역, 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 BoNT/F 전위 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 BoNT/F 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F는 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F는 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F는 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BoNT/G를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/G는 BoNT/G 효소 영역, BoNT/G 전위 영역, 및 BoNT/G 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G는 SEQ ID NO: 21을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G는 예를 들어, BoNT/G 이소형태 또는 BoNT/G 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/G 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G는 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 BoNT/G 이소형태 또는 BoNT/G 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 21의 천연적으로 존재하는 BoNT/G 변이체를 포함한다. 또한, 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G는 예를 들어, 보존적 BoNT/G 변이체, 비-보존적 BoNT/G 변이체 또는 활성 BoNT/G 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G는 예를 들어, 보존적 BoNT/G 변이체, 비-보존적 BoNT/G 변이체, 활성 BoNT/G 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 21의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G는 BoNT/G 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/G 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BoNT/G 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G는 SEQ ID NO: 21의 BoNT/G 효소 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 21의 BoNT/G 전위 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 21의 BoNT/G 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G는 예를 들어, SEQ ID NO: 21에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 21에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G는 예를 들어, SEQ ID NO: 21에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G는 예를 들어, SEQ ID NO: 21에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 TeNT를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, TeNT는 TeNT 효소 영역, TeNT 전위 영역, 및 TeNT 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT는 SEQ ID NO: 22를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT는 예를 들어, TeNT 이소형태 또는 TeNT 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 TeNT 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT는 예를 들어, TeNT 이소형태 또는 TeNT 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 22의 천연적으로 존재하는 TeNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT는 예를 들어, 보존적 TeNT 변이체, 비-보존적 TeNT 변이체, 활성 TeNT 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 TeNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT는 예를 들어, 보존적 TeNT 변이체, 비-보존적 TeNT 변이체, 활성 TeNT 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 22의 비-천연적으로 존재하는 TeNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT는 TeNT 효소 영역 또는 그의 활성 단편, TeNT 전위 영역 또는 그의 활성 단편, TeNT 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT는 SEQ ID NO: 22의 TeNT 효소 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 22의 TeNT 전위 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 22의 TeNT 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 22에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 22에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 22에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 22에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BaNT를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BaNT는 BaNT 효소 영역, BaNT 전위 영역, 및 BaNT 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT는 SEQ ID NO: 23을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT는 예를 들어, BaNT 이소형태 또는 BaNT 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BaNT 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT는 예를 들어, BaNT 이소형태 또는 BaNT 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 23의 천연적으로 존재하는 BaNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT는 예를 들어, 보존적 BaNT 변이체, 비-보존적 BaNT 변이체 또는 활성 BaNT 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BaNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT는 예를 들어, 보존적 BaNT 변이체, 비-보존적 BaNT 변이체, 활성 BaNT 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 23의 비-천연적으로 존재하는 BaNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT는 BaNT 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BaNT 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BaNT 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT는 SEQ ID NO: 23의 BaNT 효소 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 23의 BaNT 전위 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 23의 BaNT 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 23에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 23에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 23에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 23에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소는 BuNT를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BuNT는 BuNT 효소 영역, BuNT 전위 영역, 및 BuNT 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT는 예를 들어, BuNT 이소형태 또는 BuNT 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 BuNT 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT는 예를 들어, BuNT 이소형태 또는 BuNT 서브타입과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 천연적으로 존재하는 BuNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT는 예를 들어, 보존적 BuNT 변이체, 비-보존적 BuNT 변이체, 활성 BuNT 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BuNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT는 예를 들어, 보존적 BuNT 변이체, 비-보존적 BuNT 변이체, 활성 BuNT 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 비-천연적으로 존재하는 BuNT 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT는 BuNT 효소 영역 또는 그의 활성 단편, BuNT 전위 영역 또는 그의 활성 단편, BuNT 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 BuNT 효소 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 BuNT 전위 영역 또는 그의 활성 단편, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 BuNT 결합 영역 또는 그의 활성 단편, 또는 이들의 모든 조합을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT는 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 500 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 키메릭" 또는 "클로스트리듐 독소 키메라"는 표 1의 기준 클로스트리듐 독소와 상이한 적어도 하나의 특성을 갖는 독소를 형성하도록 적어도 하나의 클로스트리듐 독소로부터의 부분 및 적어도 하나의 다른 단백질로부터의 부분을 포함하는 분자를 나타낸다. 클로스트리듐 독소 키메라의 비-제한적 예로는 비-클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소, 비-클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 클로스트리듐 독소 키메라의 그 밖의 다른 비-제한적 예로는 상이한 클로스트리듐 독소로부터의 효소 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소, 상이한 클로스트리듐 독소로부터의 전위 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소, 상이한 클로스트리듐 독소로부터의 결합 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다.
클로스트리듐 독소 키메릭의 한가지 클래스는 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소의 효소 영역 또는 그의 일부분, 전위 영역 또는 그의 일부분, 및/또는 결합 영역 또는 그의 일부분이 변형되거나 상이한 클로스트리듐 독소의 효소 영역 또는 그의 일부분, 전위 영역 또는 그의 일부분, 및/또는 결합 영역 또는 그의 일부분으로 치환된 변형된 클로스트리듐 독소를 포함한다. 비-제한적 예로서, BoNT/A의 결합 영역은 BoNT/B의 결합 영역으로 대체되어 BoNT/A 효소 영역, BoNT/A 전위 영역, 및 BoNT/B 결합 영역을 갖는 클로스트리듐 독소 키메릭을 생산할 수 있다. 이러한 클로스트리듐 독소 키메라는 예를 들어, 그 전문이 참고로 포함된 문헌 [J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 제7,132,259호]에 기술되어 있다. 또 다른 비-제한적 예로서, BoNT/A로부터의 류신 모티프를 생물학적 지속성을 증가시키기 위해서 BoNT/E의 경쇄 내로 삽입시킬 수 있다. 이러한 클로스트리듐 독소 키메라는 예를 들어, 문헌 [Lance E. Steward et al., Leucine-based Motif and Clostridial Toxins, 미국 특허공개 제2003/0027752호(Feb. 6, 2003); Lance E. Steward et al., Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins, 미국 특허공개 제2003/0219462호(Nov. 27, 2003); 및 Lance E. Steward et al., Clostridial Neurotoxin Compositions and Modified Clostridial Neurotoxins, 미국 특허공개 제2004/0220386호; 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다]에 기술되어 있다.
클로스트리듐 독소 키메릭의 또 다른 클래스는 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소의 결합 영역이 변형되거나 비-클로스트리듐 독소의 결합 영역으로 대체된 클로스트리듐 독소를 포함한다. 이러한 클로스트리듐 독소 키메라는, 변형된 독소가 예를 들어, 1) 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 강화된 세포 결합 활성으로 불리는 것으로서, 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소에 의해서 사용되는 것과 동일한, 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포의 표면상에 존재하는 수용체를 사용할 수 있거나; 2) 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 변화된 세포 결합 활성으로 불리는 것으로서, 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포의 표면상에 존재하는 상이한 수용체를 사용할 수 있거나; 3) 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 변화된 세포 결합 활성, 재-표적화 독소 또는 TVEMP로 불리는 것으로서 비-클로스트리듐 독소 표적 세포의 표면상에 존재하는 상이한 수용체를 사용할 수 있기 때문에 변화된 세포 결합 활성을 갖는다.
클로스트리듐 독소 키메릭은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포, 예를 들어, 운동 뉴론을 중독시킬 수 있는 강화된 세포 결합 활성을 갖는 클로스트리듐 독소일 수 있다. 한가지 방법으로 이 강화된 결합 활성은 독소의 천연적으로 존재하는 수용체에 대한 독소의 세포 결합 활성을 증진시키기 위해서 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소의 내인성 결합 영역을 변형시킴으로써 달성된다. 표적화 영역에 대한 이러한 변형은 예를 들어, 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포 상에 존재하는 내인성 클로스트리듐 독소 수용체에 대한 결합 친화성을 증가시킨 강화된 세포 결합 활성; 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포 상에 존재하는 내인성 클로스트리듐 독소 수용체의 서브그룹에 대한 결합 특이성을 증가시킨 강화된 세포 결합 활성; 또는 결합 친화성 및 결합 특이성 둘 다를 증가시킨 강화된 세포 결합 활성을 제공한다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 수용체에 대한 강화된 세포 결합 활성을 갖는 변형된 클로스트리듐 독소의 비-제한적 예는 예를 들어, 문헌 [Lance E. Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Targeting Capabilities For Endogenous Clostridial Toxin Receptor Systems, 미국 특허공개 제2008/0096248호; Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Enhanced Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, 국제특허공개 제2008/105901호; 이들은 각각 이에 의해서 그 전문이 참고로 포함된다]에 기술되어 있다.
클로스트리듐 독소 키메릭은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포, 예를 들어, 운동 뉴론을 중독시킬 수 있는 변화된 세포 결합 활성을 갖는 클로스트리듐 독소일 수 있다. 한가지 방법으로 이 변화된 능력은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소의 내인성 결합 영역을 클로스트리듐 독소 표적 세포의 표면상에 존재하는 상이한 수용체에 우선적으로 결합하는 또 다른 분자의 결합 영역으로 대체시킴으로써 달성된다. 결합 영역에 대한 이러한 변형은 클로스트리듐 독소 표적 세포 상에 존재하는 비-클로스트리듐 독소 수용체에 우선적으로 결합할 수 있는 변형된 독소를 제공한다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 이 강화된 결합 활성은, 더 많은 독소가 표적 세포에 송달될 것이기 때문에, 개체에게 변형된 클로스트리듐 독소의 더 적은 유효용량이 투여되도록 할 수 있다. 따라서, 강화된 결합 활성을 갖는 변형된 클로스트리듐 독소는 치료를 위해서 표적화되지 않은 영역에 대한 독소의 바람직하지 않은 분산을 감소시킬 것이며, 이에 의해서 원치 않는 위치에 클로스트리듐 독소가 확산되는 것과 연관된 바람직하지 않은 부작용을 감소시키거나 방지할 것이다. 클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 변화된 세포 결합능을 갖는 변형된 클로스트리듐 독소의 비-제한적 예는 예를 들어, 문헌 [Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, 미국 특허 제7,514,088호; Lance E. Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells, 미국 특허공개 제2008/0161543호; Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity for Clostridial Toxin Target Cells, 미국 특허공개 제2008/0241881호; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, 미국 특허공개 제2009/0048431호; Lance E. Steward et al., Modified Clostridial Toxins with Altered Targeting Capabilities For Clostridial Toxin Target Cells, 국제특허공개 제WO 2007/106115호; 이들은 각각 이에 의해서 그 전문이 참고로 포함된다]에 기술되어 있다.
클로스트리듐 독소 키메릭은 클로스트리듐 독소 표적 세포 이외의 세포, 예를 들어, 운동 뉴론 이외의 세포를 중독시킬 수 있는 변화된 세포 결합 활성을 갖는 클로스트리듐 독소일 수 있다. TVEMP라 불리는 이들 분자는 비-클로스트리듐 독소 표적 세포 상에 존재하는 표적 수용체를 사용함으로써 이 중독을 달성한다. 이러한 재-표적화된 능력은 클로스트리듐 독소의 천연적으로 존재하는 결합 영역을 비-클로스트리듐 독소 표적 세포에 존재하는 비-클로스트리듐 독소 수용체에 대한 우선적 결합 활성을 나타내는 결합 영역으로 대체시킴으로써 달성된다. 결합 영역에 대한 이러한 변형은 비-클로스트리듐 독소 표적 세포 상에 존재하는 비-클로스트리듐 독소 수용체에 우선적으로 결합할 수 있는 변형된 독소를 제공한다. 비-클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 변화되 표적화 활성을 갖는 클로스트리듐 독소 키메릭은 표적 세포에 결합하고, 세포질 내로 전위하여 비-클로스트리듐 독소 표적 세포의 SNARE 컴플렉스에 대한 그의 단백분해적 효과를 발휘할 수 있다. 비-클로스트리듐 독소 표적 세포에 대한 변화된 표적화 활성을 갖는 클로스트리듐 독소 키메라의 비-제한적 예는 예를 들어, 문헌 [Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, 미국 특허 제5,989,545호; Clifford C. Shone et al., Recombinant Toxin Fragments, 미국 특허 제6,461,617호; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, 미국 특허 제6,632,440호; Lance E. Steward et al., Methods and Compositions for the Treatment of Pancreatitis, 미국 특허 제6,843,998호; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 제7,132,259호; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, 미국 특허 제7,244,437호; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, 미국 특허 제7,413,742호; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, 미국 특허 제7,415,338호; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, 미국 특허 제7,514,088호; Keith A. Foster et al., Inhibition of Secretion from Non-neural Cells, 미국 특허공개 제2006/0216283호; Keith A. Foster, Fusion Proteins, 미국 특허공개 제2008/0064092호; Keith A. Foster, Fusion Proteins, 미국 특허공개 제2009/0035822호; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, 미국 특허공개 제2009/0048431호; Keith A. Foster, Non-Cytotoxic Protein Conjugates, 미국 특허공개 제2009/0162341호; Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, 국제특허공개 제WO 2005/023309호; 및 Lance E. Steward, Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Capabilities for Non-Clostridial Toxin Target Cells, 국제특허공개 제WO 2008/008805호; 이들은 각각 이에 의해서 그 전문이 참고로 포함된다]에 기술되어 있다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로 클로스트리듐 독소 효소 영역을 제공하다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 효소 영역"은 중독과정의 효소적 표적 변형화 단계를 실행할 수 있는 모든 클로스트리듐 독소 폴리펩타이드를 나타낸다. 따라서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 특이적으로 클로스트리듐 독소 기질을 표적으로 하고, 예를 들어, SNAP-25 기질, VAMP 기질, 및 신택신 기질과 같은 SNARE 단백질과 같은 클로스트리듐 독소 기질의 단백분해적 분해를 포함한다. 클로스트리듐 독소 효소 영역의 비-제한적 예로는 예를 들어, BoNT/A 효소 영역, BoNT/B 효소 영역, BoNT/C1 효소 영역, BoNT/D 효소 영역, BoNT/E 효소 영역, BoNT/F 효소 영역, BoNT/G 효소 영역, TeNT 효소 영역, BaNT 효소 영역, 및 BuNT 효소 영역을 포함한다.
클로스트리듐 독소 효소 영역은 제한이 없이, 예를 들어, 클로스트리듐 독소 효소 영역 이소형태 및 크로마토그래피 효소 영역 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체; 및 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체, 그의 활성 클로스트리듐 독소 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체"는 천연적으로 존재하는 것이든 비-천연적으로 존재하는 것이든, 기술된 기준 서열(표 1)의 상응하는 부분으로부터 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며, 그 기준 서열의 상응하는 부분에 대한 동일성 퍼센트로 기술될 수 있는 클로스트리듐 독소 효소 영역을 나타낸다. 명백하게 나타내지 않는 한, 기술된 구체예를 실시하는데 유용한 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체는 중독과정의 효소적 표적 변형화 단계를 실행하는 변이체이다. 비-제한적 예로서, BoNT/A 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; BoNT/B 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/C1 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; BoNT/D 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/E 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; BoNT/F 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BoNT/G 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-438과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; TeNT 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이고; BaNT 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이며; BuNT 효소 영역 변이체는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 1/2-411과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 것이다.
클로스트리듐 독소의 각 혈청형 내에 그들의 아미노산 서열, 및 또한 이들 단백질을 코드화한 핵산이 다소 상이한 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체가 있을 수 있다는 것을 본 기술분야에서 숙련된 전문가들이 인정한다. 예를 들어, 현재 5 개의 BoNT/A 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5과 있으며, 특정한 효소 영역 서브타입은 SEQ ID NO: 1의 BoNT/A 효소 영역과 비교할 때 약 80% 내지 95% 아미노산 동일성을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체"는 제한되지 않지만, 선택적으로 스플리싱된 전사물로부터 생산된 클로스트리듐 독소 효소 영역 이소형태, 자발적 돌연변이에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 효소 영역 이소형태 및 클로스트리듐 독소 효소 영역 서브타입을 포함한, 천연적으로 존재하는 과정에 의해서 생산된 모든 클로스트리듐 독소 효소 영역을 나타낸다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체는 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역에 대체될 수 있다.
천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체의 비-제한적 예는 예를 들어, BoNT/A 효소 영역 이소형태, BoNT/B 효소 영역 이소형태, BoNT/C1 효소 영역 이소형태, BoNT/D 효소 영역 이소형태, BoNT/E 효소 영역 이소형태, BoNT/F 효소 영역 이소형태, BoNT/G 효소 영역 이소형태, TeNT 효소 영역 이소형태, BaNT 효소 영역 이소형태, 및 BuNT 효소 영역 이소형태와 같은 클로스트리듐 독소 효소 영역 이소형태이다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체의 또 다른 비-제한적 예는 예를 들어, 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 또는 BoNT/A5로부터의 효소 영역; 서브타입 BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/Bbv, 또는 BoNT/Bnp로부터의 효소 영역; 서브타입 BoNT/C1-1 또는 BoNT/C1-2로부터의 효소 영역; 서브타입 BoNT/E1, BoNT/E2 및 BoNT/E3으로부터의 효소 영역; 서브타입 BoNT/F1, BoNT/F2, 또는 BoNT/F3으로부터의 효소 영역; 및 서브타입 BuNT-1 또는 BuNT-2로부터의 효소 영역과 같은 클로스트리듐 독소 효소 영역 서브타입이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체"는 제한이 없이 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 디자인을 사용한 유전자 조작에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 효소 영역 및 화학적 합성에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는, 인간 조작의 도움을 받아서 생산된 모든 클로스트리듐 독소 효소 영역을 나타낸다. 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체, 클로스트리듐 독소 효소 영역 키메릭 변이체, 및 활성 클로스트리듐 독소 효소 영역 단편이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체"는 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 클로스트리듐 독소 효소 영역을 나타낸다. 특성의 예로는 제한이 없이 유사한 크기, 토포그래피, 전하, 소수성, 친수성, 친유성, 공유-결합능, 수소-결합능, 물리화학적 특성 등, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체는 보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역에 대체될 수 있다. 보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 보존적 BaNT 효소 영역 변이체 및 보존적 BuNT 효소 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체"는 1) 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나; 2) 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역에 적어도 하나의 아미노산이 첨가되거나; 3) 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 어떤 특성도 공유하지 않는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 적어도 하나의 아미노산이 치환된 클로스트리듐 독소 효소 영역을 나타낸다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있고, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 효소 영역에 대체될 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 비-보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 효소 영역 변이체 및 비-보존적 BuNT 효소 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "활성 클로스트리듐 독소 효소 영역 단편"은 이들 효소 영역 단편이 신경전달물질 방출 기구의 코어 성분을 특이적으로 표적으로 할 수 있고, 따라서 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 실행하는데 참여할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는, 효소 영역을 포함하는 다양한 클로스트리듐 독소 단편 중의 어떤 것을 나타낸다. 클로스트리듐 독소의 효소 영역은 길이가 대략 420-460 아미노산이며, 효소 영역을 포함한다(표 1). 연구는 클로스트리듐 독소 효소 영역의 전체 길이가 효소 영역의 효소적 활성에 필수적인 것은 아님을 나타내었다. 비-제한적 예로서, BoNT/A 효소 영역의 처음 8 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 또 다른 비-제한적 예로서, TeNT 효소 영역의 처음 8 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 마찬가지로, 효소 영역의 카복실-말단은 활성에 필수적이지 않다. 비-제한적 예로서, BoNT/A 효소 영역의 마지막 32 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 또 다른 비-제한적 예로서, TeNT 효소 영역의 마지막 31 개의 아미노산은 효소적 활성에 필요하지 않다. 따라서, 이 구체예의 측면들에는 예를 들어, 적어도 350, 375, 400, 425, 또는 450 아미노산의 길이를 갖는 효소 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 효소 영역이 포함된다. 이 구체예의 다른 측면들에는 예를 들어, 최대 350, 375, 400, 425, 또는 450 아미노산의 길이를 갖는 효소 영역을 포함하는 클로스트리듐 독소 효소 영역이 포함된다.
제한이 없이 예를 들어, 분절 접근방법과 같은 포괄적 방법, 국소적 방법 및 하이브리드 방법을 포함한 다양한 서열 정렬방법 중의 어떤 것이라도 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체와 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 프로토콜은 본 기술분야에서 숙련된 전문가의 범주 내에서, 및 본 명세서의 교시내용으로부터 일상적인 절차이다.
따라서, 한가지 구체예에서, 본 명세서에 기술된 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 예를 들어, 클로스트리듐 독소 효소 영역 이소형태 또는 클로스트리듐 독소 효소 영역 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체, 활성 클로스트리듐 독소 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 효소 영역 변이체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 소수성 아미노산의 예로는 예를 들어, C, F, I, L, M, V 및 W가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 지방족 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 지방족 아미노산의 예로는 예를 들어, A, I, L, P, 및 V가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 방향족 아미노산은 또 다른 방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 방향족 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 스태킹 아미노산은 또 다른 스태킹 아미노산으로 치환될 수 있다. 스태킹 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성 아미노산의 예로는 예를 들어, D, E, K, N, Q, 및 R이 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 덜 극성이거나 중성인 아미노산은 또 다른 덜 극성이거나 중성인 아미노산으로 치환될 수 있다. 덜 극성이거나 중성인 아미노산의 예로는 예를 들어, A, H, G, P, S, T, 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 양으로 하전된 아미노산은 또 다른 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, K, R, 및 H가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 음으로 하전된 아미노산은 또 다른 음으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, D 및 E가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소형 아미노산은 또 다른 소형 아미노산으로 치환될 수 있다. 소형 아미노산의 예로는 예를 들어, A, D, G, N, P, S, 및 T가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 C-베타 분지된 아미노산은 또 다른 C-베타 분지된 아미노산으로 치환될 수 있다. C-베타 분지된 아미노산의 예로는 예를 들어, I, T 및 V가 포함된다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/A 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/A 효소 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 효소 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BoNT/A 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/A 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/A 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 천연적으로 존재하는 BoNT/A 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/A 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 1의 천연적으로 존재하는 BoNT/A 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-429를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/A 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/A 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/A 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 1의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-429를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/A 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 1/2-429에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/B 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/B 효소 영역은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 효소 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BoNT/B 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/B 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/B 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 천연적으로 존재하는 BoNT/B 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/B 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 6의 천연적으로 존재하는 BoNT/B 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/B 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/B 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/B 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 6의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/B 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 1/2-436에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/C1 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/C1 효소 영역은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 효소 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BoNT/C1 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/C1 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/C1 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 11의 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 11의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/C1 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 1/2-436에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/D 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/D 효소 영역은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BoNT/D 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/D 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/D 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 천연적으로 존재하는 BoNT/D 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/D 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 13의 천연적으로 존재하는 BoNT/D 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/D 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/D 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/D 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 13의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-436을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/D 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 1/2-436에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/E 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/E 효소 영역은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 효소 영역은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BoNT/E 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/E 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/E 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 천연적으로 존재하는 BoNT/E 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/E 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 15의 천연적으로 존재하는 BoNT/E 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-411을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/E 효소 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/E 효소 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/E 효소 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 15의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-411을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/E 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 1/2-411에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/F 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 효소 영역은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BoNT/F 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/F 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/F 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 천연적으로 존재하는 BoNT/F 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/F 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 18의 천연적으로 존재하는 BoNT/F 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-428을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/F 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/F 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/F 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 18의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-428을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/F 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 1/2-428에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/G 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/G 효소 영역은 SEQ ID NO: 21의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 효소 영역은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-4435를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BoNT/G 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/G 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/G 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 21의 천연적으로 존재하는 BoNT/G 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태 효소 영역 또는 BoNT/G 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 21의 천연적으로 존재하는 BoNT/G 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-4435를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/G 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/G 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 21의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 효소 영역 변이체, 활성 BoNT/G 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 21의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-4435를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 21의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-4435에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-4435에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-4435에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-4435에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/G 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-4435에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 1/2-4435에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 TeNT 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, TeNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 22의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태로부터의 효소 영역 또는 TeNT 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 TeNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태 효소 영역 또는 TeNT 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 22의 천연적으로 존재하는 TeNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태 효소 영역 또는 TeNT 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 22의 천연적으로 존재하는 TeNT 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-438을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 활성 TeNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 TeNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 활성 TeNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 22의 비-천연적으로 존재하는 TeNT 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 효소 영역 변이체, 활성 TeNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 22의 비-천연적으로 존재하는 TeNT 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-438을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 22의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, TeNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 1/2-438에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BaNT 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BaNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 23의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BaNT 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BaNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태 효소 영역 또는 BaNT 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 23의 천연적으로 존재하는 BaNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태 효소 영역 또는 BaNT 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 23의 천연적으로 존재하는 BaNT 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-420을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 효소 영역 변이체, 활성 BaNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BaNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 효소 영역 변이체, 활성 BaNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 23의 비-천연적으로 존재하는 BaNT 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 효소 영역 변이체, 활성 BaNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 23의 비-천연적으로 존재하는 BaNT 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-420을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 23의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BaNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 1/2-420에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BuNT 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BuNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 효소 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 24의 아미노산 1/2-411을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태로부터의 효소 영역 또는 BuNT 서브타입으로부터의 효소 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BuNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태 효소 영역 또는 BuNT 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 천연적으로 존재하는 BuNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태 효소 영역 또는 BuNT 서브타입 효소 영역과 같은 SEQ ID NO: 24의 천연적으로 존재하는 BuNT 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-411을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 효소 영역 변이체, 활성 BuNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BuNT 효소 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 효소 영역 변이체, 활성 BuNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 비-천연적으로 존재하는 BuNT 효소 영역 변이체의 효소 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 효소 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 효소 영역 변이체, 활성 BuNT 효소 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 24의 비-천연적으로 존재하는 BuNT 효소 영역 변이체의 아미노산 1/2-411을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 효소 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 효소 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 효소 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 1/2-411에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 1/2-411에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 1/2-411에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 1/2-411에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 효소 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 효소 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BuNT 효소 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 1/2-411에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 1/2-411에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
"전위 영역"은 전위 활성을 갖는 클로스트리듐 신경독 중쇄의 일부분을 포함한다. "전위(translocation)"는 소포막을 통한 폴리펩타이드의 운반을 촉진시킴으로써 폴리펩타이드의 일부 또는 전부가 세포질에 노출되도록 하는 능력을 의미한다. 다양한 보툴리눔 신경독에서 전위는 엔조좀(endosome) 내에서 pH의 감소에 의해서 야기된 중쇄의 알로스테릭 배좌 변화(allosteric conformational change)를 수반하는 것으로 생각된다. 이 배좌 변화는 중쇄의 N 말단 절반을 포함하고 이에 의해서 매개되며, 소포막에서 막의 형성을 야기하는 것으로 보이며; 이 변화는 단백분해적 경쇄가 엔도좀 소포로부터 세포질 내로 이동하는 것을 허용한다. [참조: 예를 들어, Lacy, et al., Nature Struct. Biol. 5:898-902(October 1998)].
보툴리눔 신경독 중쇄의 전위-매개성 부분의 아미노산 서열은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있으며; 추가로 전위 활성을 부여하는데 필수적인 것으로 알려진 이 부분 내의 아미노산 잔기도 또한 공지되어 있다. 따라서, 예를 들어, 다양한 클로스트리듐 테타누스(Clostridium tetanus) 또는 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum) 신경독 서브타입 중의 어떤 것의 중쇄의 천연적으로 존재하는 N-말단 펩타이드 절반을 전위 영역으로 이용하거나, 다양한 중쇄의 N-말단 절반의 일차 서열을 정렬하고, 서열들 사이의 보존된 아미노산, 극성, 입체 및 소수성 특징을 기초로 하여 공통 일차 전위 서열을 선택함으로써 유사한 전위 영역을 디자인하는 것은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가의 능력으로 충분할 것이다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 클로스트리듐 독소 전위 영역을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 전위 영역"은 클로스트리듐 독소 경쇄 전위를 매개하는 중독과정의 전위 단계를 실행할 수 있는 모든 클로스트리듐 독소 폴리펩타이드를 나타낸다. 따라서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 클로스트리듐 독소 경쇄가 막을 가로질러서 이동하는 것을 촉진하며, 세포내 소포의 막을 통한 클로스트리듐 독소 경쇄의 세포의 세포질 내로의 이동을 포함한다. 클로스트리듐 독소 전위 영역의 비-제한적 예로는 예를 들어, BoNT/A 전위 영역, BoNT/B 전위 영역, BoNT/C1 전위 영역, BoNT/D 전위 영역, BoNT/E 전위 영역, BoNT/F 전위 영역, BoNT/G 전위 영역, TeNT 전위 영역, BaNT 전위 영역, 및 BuNT 전위 영역이 포함된다.
클로스트리듐 독소 전위 영역에는 제한이 없이, 예를 들어, 클로스트리듐 독소 전위 영역 이소형태 및 클로스트리듐 독소 전위 영역 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체; 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체, 그의 활성 클로스트리듐 독소 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체"는 천연적으로 존재하는 것이든 비-천연적으로 존재하는 것이든, 기술된 기준 서열(표 1)의 상응하는 부분으로부터 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며, 그 기준 서열의 상응하는 부분에 대한 동일성 퍼센트로 기술될 수 있는 클로스트리듐 독소 전위 영역을 나타낸다. 명백히 나타내지 않는 한, 기술된 구체예를 실시하는데 유용한 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체는 클로스트리듐 독소 경쇄 전위를 매개하는 중독과정의 전위 단계를 실행하는 변이체이다. 비-제한적 예로서, BoNT/A 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BoNT/B 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BoNT/C1 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BoNT/D 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BoNT/E 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BoNT/F 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BoNT/G 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; TeNT 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BaNT 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BuNT 전위 영역 변이체는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 427-847과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있다.
클로스트리듐 독소의 각 혈청형 내에 그들의 아미노산 서열, 및 또한 이들 단백질을 코드화한 핵산이 다소 상이한 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체가 있을 수 있다는 것을 본 기술분야에서 숙련된 전문가들이 인정한다. 예를 들어, 현재 5 개의 BoNT/A 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5과 있으며, 특정한 전위 영역 서브타입은 SEQ ID NO: 1의 BoNT/A 전위 영역 서브타입과 비교할 때 약 85-87% 아미노산 동일성을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체"는 제한되지 않지만, 선택적으로 스플리싱된 전사물로부터 생산된 클로스트리듐 독소 전위 영역 이소형태, 자발적 돌연변이에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 전위 영역 이소형태 및 클로스트리듐 독소 전위 영역 서브타입을 포함한, 천연적으로 존재하는 과정에 의해서 생산된 모든 클로스트리듐 독소 전위 영역을 나타낸다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체는 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역에 대체될 수 있다.
천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체의 비-제한적 예는 예를 들어, BoNT/A 전위 영역 이소형태, BoNT/B 전위 영역 이소형태, BoNT/C1 전위 영역 이소형태, BoNT/D 전위 영역 이소형태, BoNT/E 전위 영역 이소형태, BoNT/F 전위 영역 이소형태, BoNT/G 전위 영역 이소형태, TeNT 전위 영역 이소형태, BaNT 전위 영역 이소형태, 및 BuNT 전위 영역 이소형태와 같은 클로스트리듐 독소 전위 영역 이소형태이다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체의 또 다른 비-제한적 예는 예를 들어, 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5로부터의 전위 영역; 서브타입 BoNT/B1, BoNT/B2, 2 가 BoNT/B, 및 비단백분해성 BoNT/B로부터의 전위 영역; 서브타입 BoNT/C1-1 및 BoNT/C1-2로부터의 전위 영역; 서브타입 BoNT/E1, BoNT/E2 및 BoNT/E3으로부터의 전위 영역; 서브타입 BoNT/F1, BoNT/F2, 및 BoNT/F3으로부터의 전위 영역; 및 서브타입 BuNT-1 및 BuNT-2로부터의 전위 영역과 같은 클로스트리듐 독소 전위 영역 서브타입이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체"는 제한이 없이 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 디자인을 사용한 유전자 조작에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 전위 영역 및 화학적 합성에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는, 인간 조작의 도움을 받아서 생산된 모든 클로스트리듐 독소 전위 영역을 나타낸다. 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체, 및 활성 클로스트리듐 독소 전위 영역 단편이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체"는 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 클로스트리듐 독소 전위 영역을 나타낸다. 특성의 예로는 제한이 없이 유사한 크기, 토포그래피, 전하, 소수성, 친수성, 친유성, 공유-결합능, 수소-결합능, 물리화학적 특성 등, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체는 보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역에 대체될 수 있다. 보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 보존적 BaNT 전위 영역 변이체 및 보존적 BuNT 전위 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체"는 1) 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나; 2) 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역에 적어도 하나의 아미노산이 첨가되거나; 3) 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 어떤 특성도 공유하지 않는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 적어도 하나의 아미노산이 치환된 클로스트리듐 독소 전위 영역을 나타낸다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있고, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 전위 영역에 대체될 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 비-보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 전위 영역 변이체 및 비-보존적 BuNT 전위 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "활성 클로스트리듐 독소 전위 영역 단편"은 이들 활성 단편이 세포내 소포로부터 표적 세포의 세포질 내로의 LC의 방출을 촉진시킬 수 있고, 따라서 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 실행하는데 참여할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는, 전위 영역을 포함하는 다양한 클로스트리듐 독소 단편 중의 어떤 것을 나타낸다. 클로스트리듐 독소의 중쇄로부터의 전위 영역은 길이가 대략 410-430 아미노산이며, 전위 영역을 포함한다(표 1). 연구는 클로스트리듐 독소 중쇄로부터의 전위 영역의 전체 길이가 전위 영역의 전위 활성에 필수적인 것은 아님을 나타내었다. 따라서, 이 구체예의 측면들에는 예를 들어, 적어도 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 전위 영역이 포함된다. 이 구체예의 다른 측면들에는 예를 들어, 최대 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 전위 영역이 포함된다.
제한이 없이 예를 들어, 분절 접근방법과 같은 포괄적 방법, 국소적 방법 및 하이브리드 방법을 포함한 다양한 서열 정렬방법 중의 어떤 것이라도 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체와 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 프로토콜은 본 기술분야에서 숙련된 전문가의 범주 내에서, 및 본 명세서의 교시내용으로부터 일상적인 절차이다.
따라서, 한가지 구체예에서, 본 명세서에 기술된 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 예를 들어, 클로스트리듐 독소 전위 영역 이소형태 또는 클로스트리듐 독소 전위 영역 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체, 활성 클로스트리듐 독소 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 전위 영역 변이체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 소수성 아미노산의 예로는 예를 들어, C, F, I, L, M, V 및 W가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 지방족 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 지방족 아미노산의 예로는 예를 들어, A, I, L, P, 및 V가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 방향족 아미노산은 또 다른 방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 방향족 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 스태킹 아미노산은 또 다른 스태킹 아미노산으로 치환될 수 있다. 스태킹 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성 아미노산의 예로는 예를 들어, D, E, K, N, Q, 및 R이 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 덜 극성이거나 중성인 아미노산은 또 다른 덜 극성이거나 중성인 아미노산으로 치환될 수 있다. 덜 극성이거나 중성인 아미노산의 예로는 예를 들어, A, H, G, P, S, T, 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 양으로 하전된 아미노산은 또 다른 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, K, R, 및 H가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 음으로 하전된 아미노산은 또 다른 음으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, D 및 E가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소형 아미노산은 또 다른 소형 아미노산으로 치환될 수 있다. 소형 아미노산의 예로는 예를 들어, A, D, G, N, P, S, 및 T가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 C-베타 분지된 아미노산은 또 다른 C-베타 분지된 아미노산으로 치환될 수 있다. C-베타 분지된 아미노산의 예로는 예를 들어, I, T 및 V가 포함된다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/A 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/A 전위 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 전위 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BoNT/A 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/A 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/A 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 천연적으로 존재하는 BoNT/A 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/A 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 1의 천연적으로 존재하는 BoNT/A 전위 영역 변이체의 아미노산 455-873을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/A 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/A 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/A 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 1의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 전위 영역 변이체의 아미노산 455-873을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/A 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 455-873에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/B 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/B 전위 영역은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 전위 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BoNT/B 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/B 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/B 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 천연적으로 존재하는 BoNT/B 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/B 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 6의 천연적으로 존재하는 BoNT/B 전위 영역 변이체의 아미노산 447-860을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/B 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/B 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/B 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 6의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 전위 영역 변이체의 아미노산 447-860을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/B 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 447-860에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/C1 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/C1 전위 영역은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 전위 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BoNT/C1 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/C1 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/C1 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 11의 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 전위 영역 변이체의 아미노산 454-868을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 11의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 전위 영역 변이체의 아미노산 454-868을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/C1 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 454-868에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/D 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/D 전위 영역은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 전위 영역은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BoNT/D 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/D 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/D 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 천연적으로 존재하는 BoNT/D 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/D 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 13의 천연적으로 존재하는 BoNT/D 전위 영역 변이체의 아미노산 451-864를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/D 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/D 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/D 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 13의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 전위 영역 변이체의 아미노산 451-864를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/D 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 451-864에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/E 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/E 전위 영역은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 전위 영역은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BoNT/E 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/E 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/E 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 천연적으로 존재하는 BoNT/E 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/E 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 15의 천연적으로 존재하는 BoNT/E 전위 영역 변이체의 아미노산 427-847을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/E 전위 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/E 전위 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/E 전위 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 15의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 전위 영역 변이체의 아미노산 427-847을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/E 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 427-847에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/F 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/F 전위 영역은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 전위 영역은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BoNT/F 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/F 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/F 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 천연적으로 존재하는 BoNT/F 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/F 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 18의 천연적으로 존재하는 BoNT/F 전위 영역 변이체의 아미노산 446-865를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/F 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/F 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/F 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 18의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 전위 영역 변이체의 아미노산 446-865를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/F 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 446-865에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/G 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/G 전위 영역은 SEQ ID NO: 21의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 전위 영역은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BoNT/G 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/G 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/G 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 21의 천연적으로 존재하는 BoNT/G 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태 전위 영역 또는 BoNT/G 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 21의 천연적으로 존재하는 BoNT/G 전위 영역 변이체의 아미노산 451-865를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/G 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/G 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 21의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 전위 영역 변이체, 활성 BoNT/G 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 21의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 전위 영역 변이체의 아미노산 451-865를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 21의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/G 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 451-865에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 TeNT 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, TeNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 22의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태로부터의 전위 영역 또는 TeNT 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 TeNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태 전위 영역 또는 TeNT 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 22의 천연적으로 존재하는 TeNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태 전위 영역 또는 TeNT 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 22의 천연적으로 존재하는 TeNT 전위 영역 변이체의 아미노산 468-881을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 활성 TeNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 TeNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 활성 TeNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 22의 비-천연적으로 존재하는 TeNT 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 전위 영역 변이체, 활성 TeNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 22의 비-천연적으로 존재하는 TeNT 전위 영역 변이체의 아미노산 468-881을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 22의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, TeNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 468-881에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BaNT 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BaNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 23의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BaNT 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BaNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태 전위 영역 또는 BaNT 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 23의 천연적으로 존재하는 BaNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태 전위 영역 또는 BaNT 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 23의 천연적으로 존재하는 BaNT 전위 영역 변이체의 아미노산 436-857을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 전위 영역 변이체, 활성 BaNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BaNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 전위 영역 변이체, 활성 BaNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 23의 비-천연적으로 존재하는 BaNT 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 전위 영역 변이체, 활성 BaNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 23의 비-천연적으로 존재하는 BaNT 전위 영역 변이체의 아미노산 436-857을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 23의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BaNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 436-857에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BuNT 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BuNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 전위 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 24의 아미노산 427-847을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태로부터의 전위 영역 또는 BuNT 서브타입으로부터의 전위 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BuNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태 전위 영역 또는 BuNT 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 천연적으로 존재하는 BuNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태 전위 영역 또는 BuNT 서브타입 전위 영역과 같은 SEQ ID NO: 24의 천연적으로 존재하는 BuNT 전위 영역 변이체의 아미노산 427-847을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 전위 영역 변이체, 활성 BuNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BuNT 전위 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 전위 영역 변이체, 활성 BuNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 비-천연적으로 존재하는 BuNT 전위 영역 변이체의 전위 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 전위 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 전위 영역 변이체, 활성 BuNT 전위 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 24의 비-천연적으로 존재하는 BuNT 전위 영역 변이체의 아미노산 427-847을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 전위 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 전위 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 전위 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 427-847에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 427-847에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 427-847에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 427-847에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 전위 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 전위 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BuNT 전위 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 427-847에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 427-847에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로 결합 영역을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "결합 영역"은 "리간드" 또는 "표적화 부위"와 동의어이며, 생리적 조건 하에서 세포의 표면상에 존재하는 또 다른 분자와 우선적으로 상호작용할 수 있는 모든 분자를 나타낸다. 세포 표면 분자는 폴리펩타이드, 폴리사카라이드, 지질을 포함할 수 있거나, 이들 중의 하나 이상의 구조적 특징을 가질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "우선적으로 상호작용"한다는 것은 분자가 생리적 조건 하에서, 또는 실질적으로 생리적 조건을 모방한 시험관내 조건에서, 다른 비-표적 수용체에 비해서 통계학적으로 유의적으로 더 큰 정도까지 그의 표적 수용체에 결합할 수 있음을 나타낸다. 본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 결합 영역에 관하여, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 다른 수용체에 비해 그의 동족성 수용체에 대해서 차별적인 결합을 한다. 본 명세서에 기술된 비-클로스트리듐 독소 결합 영역에 관하여, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 다른 수용체에 비해 그의 동족성 수용체에 대해서 차별적인 결합을 한다.
따라서, 한가지 구체예에서, 표적 세포에 선택적으로 결합하는 결합 영역은 비-표적 수용체에 비해 표적 수용체에 대해, 예를 들어, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 10 배, 적어도 50 배, 적어도 100 배, 적어도 1000, 적어도 10,000, 또는 적어도 100,000 배만큼 더 큰 해리 평형 상수(dissociation equilibrium constant; KD)를 갖는다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 클로스트리듐 독소 결합 영역을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 결합 영역"은 본 명세서에 기술된 변형된 클로스트리듐 독소가 표적 세포를 중독시키는 전반적인 내재화 기전을 개시하는 중독과정의 결합 단계를 실행할 수 있는 모든 클로스트리듐 독소 폴리펩타이드를 나타낸다. 클로스트리듐 독소 결합 영역의 비-제한적 예로는 예를 들어, BoNT/A 결합 영역, BoNT/B 결합 영역, BoNT/C1 결합 영역, BoNT/D 결합 영역, BoNT/E 결합 영역, BoNT/F 결합 영역, BoNT/G 결합 영역, TeNT 결합 영역, BaNT 결합 영역, 및 BuNT 결합 영역이 포함된다. 클로스트리듐 독소 결합 영역의 그 밖의 다른 비-제한적 예로는 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296, SEQ ID NO: 2의 아미노산 861-1291, SEQ ID NO: 3의 아미노산 869-1291, SEQ ID NO: 4의 아미노산 865-1291, SEQ ID NO: 5의 아미노산 848-1252, SEQ ID NO: 6의 아미노산 866-1274, SEQ ID NO: 7의 아미노산 866-1297, SEQ ID NO: 8의 아미노산 882-1315, SEQ ID NO: 9의 아미노산 858-1268, 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 848-1251이 포함된다.
클로스트리듐 독소 결합 영역에는 제한이 없이, 예를 들어, 클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태 및 클로스트리듐 독소 결합 영역 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체; 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 그의 활성 클로스트리듐 독소 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 천연적으로 존재하는 것이든 비-천연적으로 존재하는 것이든, 기술된 기준 서열(표 1)의 상응하는 부분으로부터 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며, 그 기준 서열의 상응하는 부분에 대한 동일성 퍼센트로 기술될 수 있는 클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 명백히 나타내지 않는 한, 기술된 구체예를 실시하는데 유용한 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 클로스트리듐 독소 경쇄 전위를 매개하는 중독과정의 전위 단계를 실행하는 변이체이다. 비-제한적 예로서, BoNT/A 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BoNT/B 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BoNT/C1 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BoNT/D 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BoNT/E 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BoNT/F 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BoNT/G 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; TeNT 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315와 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있고; BaNT 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있으며; BuNT 결합 영역 변이체는 SEQ ID NO: 24의 아미노산 848-1251과 비교하여 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 첨가와 같은 적어도 하나의 아미노산 차이를 가질 수 있다.
클로스트리듐 독소의 각 혈청형 내에 그들의 아미노산 서열, 및 또한 이들 단백질을 코드화한 핵산이 다소 상이한 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 있을 수 있다는 것을 본 기술분야에서 숙련된 전문가들이 인정한다. 예를 들어, 현재 5 개의 BoNT/A 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5과 있으며, 특정한 결합 영역 서브타입은 SEQ ID NO: 1의 BoNT/A 결합 영역 서브타입과 비교할 때 약 83-97% 아미노산 동일성을 나타낸다. 또 다른 예로서, 현재 5 개의 BoNT/A 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5과 있으며, 특정한 결합 영역 서브타입은 SEQ ID NO: 1의 BoNT/A 결합 영역 서브타입과 비교할 때 약 83-97% 아미노산 동일성을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 제한되지 않지만, 선택적으로 스플리싱된 전사물로부터 생산된 클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태, 자발적 돌연변이에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태 및 클로스트리듐 독소 결합 영역 서브타입을 포함한, 천연적으로 존재하는 과정에 의해서 생산된 모든 클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역에 대체될 수 있다.
천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예는 예를 들어, BoNT/A 결합 영역 이소형태, BoNT/B 결합 영역 이소형태, BoNT/C1 결합 영역 이소형태, BoNT/D 결합 영역 이소형태, BoNT/E 결합 영역 이소형태, BoNT/F 결합 영역 이소형태, BoNT/G 결합 영역 이소형태, TeNT 결합 영역 이소형태, BaNT 결합 영역 이소형태, 및 BuNT 결합 영역 이소형태와 같은 클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태이다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 또 다른 비-제한적 예는 예를 들어, 서브타입 BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4, 및 BoNT/A5로부터의 결합 영역; 서브타입 BoNT/B1, BoNT/B2, 2 가 BoNT/B, 및 비단백분해성 BoNT/B로부터의 결합 영역; 서브타입 BoNT/C1-1 및 BoNT/C1-2로부터의 결합 영역; 서브타입 BoNT/E1, BoNT/E2 및 BoNT/E3으로부터의 결합 영역; 서브타입 BoNT/F1, BoNT/F2, 및 BoNT/F3으로부터의 결합 영역; 및 서브타입 BuNT-1 및 BuNT-2로부터의 결합 영역과 같은 클로스트리듐 독소 결합 영역 서브타입이다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 제한이 없이 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 디자인을 사용한 유전자 조작에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 결합 영역 및 화학적 합성에 의해서 생산된 클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함하는, 인간 조작의 도움을 받아서 생산된 모든 클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 클로스트리듐 독소 결합 영역 키메릭 변이체, 및 활성 클로스트리듐 독소 결합 영역 단편이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 특성의 예로는 제한이 없이 유사한 크기, 토포그래피, 전하, 소수성, 친수성, 친유성, 공유-결합능, 수소-결합능, 물리화학적 특성 등, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역에 대체될 수 있다. 보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 보존적 BaNT 결합 영역 변이체 및 보존적 BuNT 결합 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 1) 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나; 2) 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역에 적어도 하나의 아미노산이 첨가되거나; 3) 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역 서열(표 1)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 어떤 특성도 공유하지 않는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 적어도 하나의 아미노산이 치환된 클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있고, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 클로스트리듐 독소 결합 영역에 대체될 수 있다. 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 비-보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 결합 영역 변이체 및 비-보존적 BuNT 결합 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "활성 클로스트리듐 독소 결합 영역 단편"은 이들 활성 단편이 세포내 소포로부터 표적 세포의 세포질 내로의 LC의 방출을 촉진시킬 수 있고, 따라서 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 실행하는데 참여할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는, 결합 영역을 포함하는 다양한 클로스트리듐 독소 단편 중의 어떤 것을 나타낸다. 클로스트리듐 독소의 중쇄로부터의 결합 영역은 길이가 대략 400-440 아미노산이며, 결합 영역을 포함한다(표 1). 연구는 클로스트리듐 독소 중쇄로부터의 결합 영역의 전체 길이가 결합 영역의 전위 활성에 필수적인 것은 아님을 나타내었다. 따라서, 이 구체예의 측면들에는 예를 들어, 적어도 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 결합 영역이 포함된다. 이 구체예의 다른 측면들에는 예를 들어, 최대 350, 375, 400, 또는 425 아미노산의 길이를 갖는 클로스트리듐 독소 결합 영역이 포함된다.
제한이 없이 예를 들어, 분절 접근방법과 같은 포괄적 방법, 국소적 방법 및 하이브리드 방법을 포함한 다양한 서열 정렬방법 중의 어떤 것이라도 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체와 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 프로토콜은 본 기술분야에서 숙련된 전문가의 범주 내에서, 및 본 명세서의 교시내용으로부터 일상적인 절차이다.
따라서, 한가지 구체예에서, 본 명세서에 기술된 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태 또는 클로스트리듐 독소 결합 영역 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-보존적 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 활성 클로스트리듐 독소 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 소수성 아미노산의 예로는 예를 들어, C, F, I, L, M, V 및 W가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 지방족 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 지방족 아미노산의 예로는 예를 들어, A, I, L, P, 및 V가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 방향족 아미노산은 또 다른 방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 방향족 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 스태킹 아미노산은 또 다른 스태킹 아미노산으로 치환될 수 있다. 스태킹 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성 아미노산의 예로는 예를 들어, D, E, K, N, Q, 및 R이 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 덜 극성이거나 중성인 아미노산은 또 다른 덜 극성이거나 중성인 아미노산으로 치환될 수 있다. 덜 극성이거나 중성인 아미노산의 예로는 예를 들어, A, H, G, P, S, T, 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 양으로 하전된 아미노산은 또 다른 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, K, R, 및 H가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 음으로 하전된 아미노산은 또 다른 음으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, D 및 E가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소형 아미노산은 또 다른 소형 아미노산으로 치환될 수 있다. 소형 아미노산의 예로는 예를 들어, A, D, G, N, P, S, 및 T가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 C-베타 분지된 아미노산은 또 다른 C-베타 분지된 아미노산으로 치환될 수 있다. C-베타 분지된 아미노산의 예로는 예를 들어, I, T 및 V가 포함된다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BoNT/A 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/A 결합 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 결합 영역은 SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BoNT/A 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/A 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/A 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 천연적으로 존재하는 BoNT/A 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, BoNT/A 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/A 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 1의 천연적으로 존재하는 BoNT/A 결합 영역 변이체의 아미노산 874-1296을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/A 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/A 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/A 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/A 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 1의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/A 결합 영역 변이체의 아미노산 874-1296을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/A 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 874-1296에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BoNT/B 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/B 결합 영역은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 결합 영역은 SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BoNT/B 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/B 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/B 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 천연적으로 존재하는 BoNT/B 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, BoNT/B 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/B 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 6의 천연적으로 존재하는 BoNT/B 결합 영역 변이체의 아미노산 861-1291을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/B 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/B 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/B 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/B 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 6의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/B 결합 영역 변이체의 아미노산 861-1291을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 SEQ ID NO: 10의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/B 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 861-1291에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BoNT/C1 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/C1 결합 영역은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 결합 영역은 SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BoNT/C1 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/C1 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, BoNT/C1 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/C1 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 11의 천연적으로 존재하는 BoNT/C1 결합 영역 변이체의 아미노산 869-1291을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/C1 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/C1 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 11의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/C1 결합 영역 변이체의 아미노산 869-1291을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/C1 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 869-1291에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BoNT/D 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/D 결합 영역은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 결합 영역은 SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BoNT/D 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/D 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/D 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 천연적으로 존재하는 BoNT/D 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, BoNT/D 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/D 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 13의 천연적으로 존재하는 BoNT/D 결합 영역 변이체의 아미노산 865-1291을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/D 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/D 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/D 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/D 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 13의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/D 결합 영역 변이체의 아미노산 865-1291을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/D 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 13의 아미노산 865-1291에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BoNT/E 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/E 결합 영역은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 결합 영역은 SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BoNT/E 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/E 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/E 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 천연적으로 존재하는 BoNT/E 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, BoNT/E 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/E 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 15의 천연적으로 존재하는 BoNT/E 결합 영역 변이체의 아미노산 848-1252를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/E 결합 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/E 결합 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/E 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/E 결합 영역 단편, 또는 그의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 15의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/E 결합 영역 변이체의 아미노산 848-1252를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, 또는 SEQ ID NO: 17의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/E 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 848-1252에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BoNT/F 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/F 결합 영역은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 결합 영역은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BoNT/F 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/F 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/F 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 천연적으로 존재하는 BoNT/F 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, BoNT/F 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/F 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 18의 천연적으로 존재하는 BoNT/F 결합 영역 변이체의 아미노산 866-1274를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/F 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/F 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/F 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/F 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 18의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/F 결합 영역 변이체의 아미노산 866-1274를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, 또는 SEQ ID NO: 20의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/F 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 18의 아미노산 866-1274에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BoNT/G 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BoNT/G 결합 영역은 SEQ ID NO: 21의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 결합 영역은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BoNT/G 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BoNT/G 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/G 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 21의 천연적으로 존재하는 BoNT/G 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, BoNT/G 이소형태 결합 영역 또는 BoNT/G 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 21의 천연적으로 존재하는 BoNT/G 결합 영역 변이체의 아미노산 866-1297을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/G 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/G 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 21의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 비-보존적 BoNT/G 결합 영역 변이체, 활성 BoNT/G 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 21의 비-천연적으로 존재하는 BoNT/G 결합 영역 변이체의 아미노산 866-1297을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 21의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BoNT/G 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 21의 아미노산 866-1297에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 TeNT 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, TeNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 22의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태로부터의 결합 영역 또는 TeNT 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 TeNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태 결합 영역 또는 TeNT 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 22의 천연적으로 존재하는 TeNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, TeNT 이소형태 결합 영역 또는 TeNT 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 22의 천연적으로 존재하는 TeNT 결합 영역 변이체의 아미노산 882-1315를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 활성 TeNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 TeNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 활성 TeNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 22의 비-천연적으로 존재하는 TeNT 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 TeNT 결합 영역 변이체, 활성 TeNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 22의 비-천연적으로 존재하는 TeNT 결합 영역 변이체의 아미노산 882-1315를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 22의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, TeNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 22의 아미노산 882-1315에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BaNT 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BaNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 23의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BaNT 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BaNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태 결합 영역 또는 BaNT 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 23의 천연적으로 존재하는 BaNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, BaNT 이소형태 결합 영역 또는 BaNT 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 23의 천연적으로 존재하는 BaNT 결합 영역 변이체의 아미노산 858-1268을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 결합 영역 변이체, 활성 BaNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BaNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 결합 영역 변이체, 활성 BaNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 23의 비-천연적으로 존재하는 BaNT 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BaNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 BaNT 결합 영역 변이체, 활성 BaNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 23의 비-천연적으로 존재하는 BaNT 결합 영역 변이체의 아미노산 858-1268을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 23의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BaNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 23의 아미노산 858-1268에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 결합 영역은 BuNT 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, BuNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 24의 아미노산 848-1251을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태로부터의 결합 영역 또는 BuNT 서브타입으로부터의 결합 영역과 같은 천연적으로 존재하는 BuNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태 결합 영역 또는 BuNT 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 천연적으로 존재하는 BuNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, BuNT 이소형태 결합 영역 또는 BuNT 서브타입 결합 영역과 같은 SEQ ID NO: 24의 천연적으로 존재하는 BuNT 결합 영역 변이체의 아미노산 848-1251을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 결합 영역 변이체, 활성 BuNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 BuNT 결합 영역 변이체를 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 결합 영역 변이체, 활성 BuNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 비-천연적으로 존재하는 BuNT 결합 영역 변이체의 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, 보존적 BuNT 결합 영역 변이체, 비-보존적 BuNT 결합 영역 변이체, 활성 BuNT 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 SEQ ID NO: 24의 비-천연적으로 존재하는 BuNT 결합 영역 변이체의 아미노산 848-1251을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 결합 영역에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 결합 영역에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 결합 영역은 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 848-1251에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 848-1251에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90%, 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 848-1251에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 848-1251에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 결합 영역에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 결합 영역에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 추가의 다른 측면들에서, BuNT 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 848-1251에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 848-1251에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 또는 100 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-클로스트리듐 독소 결합 영역"은 본 명세서에 기술된 변형된 클로스트리듐 독소가 표적 세포를 중독시키는 전반적인 내재화 기전을 개시하는 중독과정의 결합 단계를 실행할 수 있는 모든 폴리펩타이드를 나타낸다. 결합 영역의 예는 예를 들어, 문헌 [Keith A. Foster et al., Clostridial Toxin Derivatives Able To Modify Peripheral Sensory Afferent Functions, 미국 특허 제5,989,545호; Clifford C. hone et al., Recombinant Toxin Fragments, 미국 특허 제6,461,617호; Conrad P. Quinn et al., Methods and Compounds for the Treatment of Mucus Hypersecretion, 미국 특허 제6,632,440호; Lance E. Steward et al., Methods And Compositions For The Treatment Of Pancreatitis, 미국 특허 제6,843,998호; J. Oliver Dolly et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 제7,132,259호; Stephan Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods For Treating Pain, 미국 특허공개 제2002/0037833호; Keith A. Foster et al., Inhibition of Selection from Non-neural Cells, 미국 특허공개 제2003/0180289호; Lance E. Steward et al., Multivalent Clostridial Toxin Derivatives and Methods of Their Use, 미국 특허공개 제2006/0211619호; Keith A. Foster et al., Non-Cytotoxic Protein Conjugates, 미국 특허공개 제2008/0187960호; Steward, L.E. et al., Modified Clostridial Toxins with Enhanced Translocation Capabilities and Altered Targeting Activity For Non-Clostridial Toxin Target Cells, 미국 특허출원 제11/776,075호; Keith A. Foster et al., Re-targeted Toxin Conjugates, 미국 특허출원 제11/792,210호; 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다]에 기술되어 있다.
비-클로스트리듐 독소 결합 영역에는 제한이 없이, 예를 들어, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태 및 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 서브타입과 같은 천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체; 및 예를 들어, 보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 키메라, 그의 활성 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 천연적으로 존재하는 것이든 비-천연적으로 존재하는 것이든, 기준 서열의 상응하는 부분으로부터 적어도 하나의 아미노산 변화를 가지며, 그 기준 서열의 상응하는 부분에 대한 동일성 퍼센트로 기술될 수 있는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 명백히 나타내지 않는 한, 기술된 구체예를 실시하는데 유용한 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 중독과정의 결합 단계를 실행하는 변이체이다.
각각의 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 내에 그들의 아미노산 서열, 및 또한 이들 단백질을 코드화한 핵산이 다소 상이한 천연적으로 존재하는 변이체가 있을 수 있다는 것을 본 기술분야에서 숙련된 전문가들이 인정한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 제한되지 않지만, 선택적으로 스플리싱된 전사물로부터 생산된 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태 및 자발적 돌연변이에 의해서 생산된 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태를 포함한, 천연적으로 존재하는 과정에 의해서 생산된 모든 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역에 대체될 수 있다. 천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태이다. 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태의 비-제한적 예로는 예를 들어, 오피오이드(opiod) 결합 영역 이소형태, 타키키닌(tachykinin) 결합 영역 이소형태, 멜라노코르틴(melanocortin) 결합 영역 이소형태, 갈라닌(galanin) 결합 영역 이소형태, 그라닌(granin) 결합 영역 이소형태, 뉴로펩타이드(Neuropeptide) Y 관련된 펩타이드 결합 영역 이소형태, 신경호르몬 결합 영역 이소형태, 신경조절성 사이토킨 결합 영역 이소형태, 키닌 펩타이드 결합 영역 이소형태, 성장인자 결합 영역 이소형태, 및 글루카곤 유사 호르몬 결합 영역 이소형태가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 제한이 없이 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 디자인을 사용한 유전자 조작에 의해서 생산된 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 화학적 합성에 의해서 생산된 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함하는, 인간 조작의 도움을 받아서 생산된 모든 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 비-천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 키메릭 변이체, 및 활성 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 단편이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 서열로부터의 원래의 아미노산과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 특성의 예로는 제한이 없이 유사한 크기, 토포그래피, 전하, 소수성, 친수성, 친유성, 공유-결합능, 수소-결합능, 물리화학적 특성 등, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역에 대체될 수 있다. 보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 오피오이드 결합 영역 변이체, 보존적 타키키닌 결합 영역 변이체, 보존적 멜라노코르틴 결합 영역 변이체, 보존적 갈라닌 결합 영역 변이체, 보존적 그라닌 결합 영역 변이체, 보존적 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역 변이체, 보존적 신경호르몬 결합 영역 변이체, 보존적 신경조절성 사이토킨 결합 영역 변이체, 보존적 키닌 펩타이드 결합 영역 변이체, 보존적 성장인자 결합 영역 변이체, 및 보존적 글루카곤 유사 호르몬 결합 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체"는 1) 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역으로부터 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나; 2) 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역이 기초로 하는 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역에 적어도 하나의 아미노산이 첨가되거나; 3) 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 서열로부터의 원래의 아미노산과 유사한 어떤 특성도 공유하지 않는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 적어도 하나의 아미노산이 치환된 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 나타낸다. 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체는 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체가 기초로 하는 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역과 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있고, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 비-클로스트리듐 독소 결합 영역에 대체될 수 있다. 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 비-보존적 오피오이드 결합 영역 변이체, 비-보존적 타키키닌 결합 영역 변이체, 비-보존적 멜라노코르틴 결합 영역 변이체, 비-보존적 갈라닌 결합 영역 변이체, 비-보존적 그라닌 결합 영역 변이체, 비-보존적 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역 변이체, 비-보존적 신경호르몬 결합 영역 변이체, 비-보존적 신경조절성 사이토킨 결합 영역 변이체, 비-보존적 키닌 펩타이드 결합 영역 변이체, 비-보존적 성장인자 결합 영역 변이체, 및 비-보존적 글루카곤 유사 호르몬 결합 영역 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "활성 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 단편"은 이들 결합 영역 단편이 동족성 수용체와 우선적으로 상호작용할 수 있고, 따라서 클로스트리듐 독소가 기질을 단백분해적으로 분해하는 전반적인 세포 기전을 실행하는데 참여할 수 있다는 단서하에서 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는, 결합 영역을 포함하는 다양한 클로스트리듐 독소 단편 중의 어떤 것을 나타낸다.
제한이 없이 예를 들어, 분절 접근방법과 같은 포괄적 방법, 국소적 방법 및 하이브리드 방법을 포함한 다양한 서열 정렬방법 중의 어떤 것이라도 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체와 비-천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 프로토콜은 본 기술분야에서 숙련된 전문가의 범주 내에서, 및 본 명세서의 교시내용으로부터 일상적인 절차이다.
따라서, 한가지 구체예에서, 본 명세서에 기술된 변형된 클로스트리듐 독소는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 이소형태와 같은 천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 비-보존적 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체, 활성 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 변이체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 소수성 아미노산의 예로는 예를 들어, C, F, I, L, M, V 및 W가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 지방족 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 지방족 아미노산의 예로는 예를 들어, A, I, L, P, 및 V가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 방향족 아미노산은 또 다른 방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 방향족 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 스태킹 아미노산은 또 다른 스태킹 아미노산으로 치환될 수 있다. 스태킹 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성 아미노산의 예로는 예를 들어, D, E, K, N, Q, 및 R이 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 덜 극성이거나 중성인 아미노산은 또 다른 덜 극성이거나 중성인 아미노산으로 치환될 수 있다. 덜 극성이거나 중성인 아미노산의 예로는 예를 들어, A, H, G, P, S, T, 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 양으로 하전된 아미노산은 또 다른 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, K, R, 및 H가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 음으로 하전된 아미노산은 또 다른 음으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, D 및 E가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 소형 아미노산은 또 다른 소형 아미노산으로 치환될 수 있다. 소형 아미노산의 예로는 예를 들어, A, D, G, N, P, S, 및 T가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역의 폴리펩타이드 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 C-베타 분지된 아미노산은 또 다른 C-베타 분지된 아미노산으로 치환될 수 있다. C-베타 분지된 아미노산의 예로는 예를 들어, I, T 및 V가 포함된다.
또 다른 구체예에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 엔케팔린, 엔도모르핀, 엔도르핀, 다이노르핀, 노시셉틴 또는 헤모르핀과 같은 오피오이드 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 물질 P, 뉴로펩타이드 K(NPK), 뉴로펩타이드 감마(NP 감마), 뉴로키닌 A(NKA; 물질 K, 뉴로키닌 알파, 뉴로메딘 L), 뉴로키닌 B(NKB), 헤모키닌 또는 엔도키닌과 같은 타키키닌 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소는 예를 들어, 멜라노사이트 자극 호르몬, 아드레노코르티코트로핀, 또는 리포트로핀과 같은 멜라노코르틴 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 갈라닌 또는 갈라닌 메시지-연관된 펩타이드와 같은 갈라닌 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 크로모그라닌(Chromogranin) A, 크로모그라닌 B 또는 크로모그라닌 C와 같은 그라닌 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 뉴로펩타이드 Y, 펩타이드 YY, 췌장 펩타이드 또는 췌장 이코사펩타이드와 같은 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 코르티코트로핀-방출 호르몬, 부갑상선 호르몬, 타이로트로핀-방출 호르몬 또는 소마토스타틴과 같은 신경호르몬 결합 영역을 포함한다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 섬모 향신경성 인자, 글리코포린-A, 백혈병 억제인자, 콜린성 분화인자, 인터류킨, 오노스타틴 M, 카디오트로핀-1, 카디오트로핀-유사 사이토킨, 또는 뉴로류킨과 같은 신경조절성 사이토킨 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 브래디키닌, 칼리딘, 데스Arg9 브래디키닌 또는 데스Arg10 브래디키닌과 같은 키닌 펩타이드 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 섬유아세포 성장인자 결합 영역, 신경 성장인자 결합 영역, 인슐린 성장인자 결합 영역, 표피 성장인자 결합 영역, 혈관 내피 성장인자 결합 영역, 뇌 유도된 향신경성 인자 결합 영역, 성장 유도된 향신경성 인자 결합 영역, 예를 들어, 뉴로트로핀-3, 뉴로트로핀-4/5와 같은 뉴로트로핀 결합 영역, 두부 활성화제(head activator) 펩타이드 결합 영역, 뉴르투린(neurturin) 결합 영역, 퍼세프린(persephrin) 결합 영역, 아르테민(artemin) 결합 영역, 예를 들어, TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3 또는 TGFβ4와 같은 변형 성장인자 β 결합 영역, 예를 들어, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8 또는 BMP10과 같은 골형성 단백질 결합 영역, 예를 들어, GDF1, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF10, GDF11 또는 GDF15와 같은 성장 분화인자 결합 영역, 또는 예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 E 또는 인히빈 A와 같은 액티빈 결합 영역과 같은 성장인자 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 예를 들어, 세크레틴, GLP-1 및 GLP-2와 같은 글루카곤-유사 펩타이드, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 펩타이드 결합 영역, 성장 호르몬-방출 호르몬 결합 영역, VIP1 또는 VIP2와 같은 혈관활성 장 펩타이드 결합 영역, 위 억제성 폴리펩타이드 결합 영역, 가스트린, 가스트린-방출 펩타이드 또는 콜레시스토키닌과 같은 칼시토닌-관련된 펩타이드내 장 펩타이드 결합 영역, 또는 PARP1 펩타이드, PARP2 펩타이드, PARP3 펩타이드 또는 PARP4 펩타이드와 같은 PAR 펩타이드 결합 영역과 같은 글루카곤 유사 호르몬 결합 영역을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 오피오이드 펩타이드는 엔케팔린 펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 엔케팔린 펩타이드는 Leu-엔케팔린, Met-엔케팔린, Met-엔케팔린 MRGL 또는 Met-엔케팔린 MRF를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔케팔린 펩타이드는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 엔케팔린은 예를 들어, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔케팔린은 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29에 비해서 적어도 1, 2, 또는 3 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29에 비해서 최대 1, 2, 또는 3 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔케팔린은 예를 들어, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29에 비해서 적어도 1, 2, 또는 3 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 또는 SEQ ID NO: 29에 비해서 최대 1, 2, 또는 3 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 오피오이드 펩타이드는 소 부신수질(bovine adrenomedullary)-22(BAM22) 펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, BAM22 펩타이드는 BAM22 펩타이드(1-12), BAM22 펩타이드(6-22), BAM22 펩타이드(8-22) 또는 BAM22 펩타이드(1-22)를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, BAM22 펩타이드는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 31의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 32의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 33의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 34의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, BAM22 펩타이드는 예를 들어, SEQ ID NO: 30의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 31의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 32의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 33의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 34의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 31의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 32의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 33의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 34의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BAM22 펩타이드는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 31의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 32의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 33의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 34의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 31의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 32의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 33의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 34의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또한 이 구체예의 다른 측면들에서, BAM22 펩타이드는 예를 들어, SEQ ID NO: 30의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 31의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 32의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 33의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 34의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 30의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 31의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 32의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 33의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; SEQ ID NO: 34의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22; 또는 SEQ ID NO: 35의 아미노산 1-12, 아미노산 6-22, 아미노산 8-22 또는 아미노산 1-22에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 오피오이드 펩타이드는 엔도모르핀 펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 엔도모르핀 펩타이드는 엔도모르핀-1 또는 엔도모르핀-2를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도모르핀 펩타이드는 SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 37을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도모르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 37에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 37에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도모르핀은 SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 37에 비해서 적어도 1, 2, 또는 3 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 37에 비해서 최대 1, 2, 또는 3 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도모르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 37에 비해서 적어도 1, 2, 또는 3 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 36 또는 SEQ ID NO: 37에 비해서 최대 1, 2, 또는 3 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 오피오이드 펩타이드는 엔도르핀 펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 엔도르핀 펩타이드는 엔도르핀-α, 네오엔도르핀-α, 에도르핀-β, 네오엔도르핀-β 또는 엔도르핀-γ를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도르핀 펩타이드는 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도르핀은 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 또는 SEQ ID NO: 43에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 오피오이드 펩타이드는 다이노르핀 펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 다이노르핀 펩타이드는 다이노르핀 A, 다이노르핀 B(류모르핀) 또는 리모르핀을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 다이노르핀 펩타이드는 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73 또는 SEQ ID NO: 74를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 다이노르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 또는 SEQ ID NO: 69에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 또는 SEQ ID NO: 69에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도르핀은 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 또는 SEQ ID NO: 69에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 또는 SEQ ID NO: 69에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 엔도르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 또는 SEQ ID NO: 69에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 53 또는 SEQ ID NO: 69에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 오피오이드 펩타이드는 노시셉틴 펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 노시셉틴 펩타이드는 노시셉틴 RK, 노시셉틴, 뉴로펩타이드 1, 뉴로펩타이드 2, 또는 뉴로펩타이드 3을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 노시셉틴 펩타이드는 SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, 또는 SEQ ID NO: 84를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 노시셉틴은 예를 들어, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, 또는 SEQ ID NO: 84에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, 또는 SEQ ID NO: 84에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 노시셉틴은 SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, 또는 SEQ ID NO: 84에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, 또는 SEQ ID NO: 84에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 노시셉틴은 예를 들어, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, 또는 SEQ ID NO: 84에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, 또는 SEQ ID NO: 84에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 오피오이드 펩타이드는 헤모르핀 펩타이드를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 헤모르핀 펩타이드는 LVVH7, VVH7, VH7, H7, LVVH6, LVVH5, VVH5, LVVH4 및 LVVH3을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 헤모르핀 펩타이드는 SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, 또는 SEQ ID NO: 93을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 헤모르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, 또는 SEQ ID NO: 93에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, 또는 SEQ ID NO: 93에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 헤모르핀은 SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, 또는 SEQ ID NO: 93에 비해서 적어도 1, 2, 또는 3 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, 또는 SEQ ID NO: 93에 비해서 최대 1, 2, 또는 3 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 헤모르핀은 예를 들어, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, 또는 SEQ ID NO: 93에 비해서 적어도 1, 2, 또는 3 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, 또는 SEQ ID NO: 93에 비해서 최대 1, 2, 또는 3 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또한 또 다른 구체예에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 갈라닌 펩타이드 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 갈라닌 펩타이드 결합 영역은 갈라닌 또는 갈라닌 메시지-연관된 펩타이드(GMAP)를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 갈라닌 펩타이드 결합 영역은 SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 95를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 갈라닌 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 95에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 95에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 갈라닌 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 95에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 95에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 갈라닌 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 95에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 94 또는 SEQ ID NO: 95에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또한 또 다른 구체예에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 타키키닌 펩타이드 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 타키키닌 펩타이드 결합 영역은 물질 P, 뉴로펩타이드 K(NPK), 뉴로펩타이드 감마(NP 감마), 뉴로키닌 A(NKA; 물질 K, 뉴로키닌 알파, 뉴로메딘 L), 뉴로키닌 B(NKB), 헤모키닌 또는 엔도키닌을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 타키키닌 펩타이드 결합 영역은 SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, 또는 SEQ ID NO: 107을 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 타키키닌 펩타이드 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, 또는 SEQ ID NO: 107에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, 또는 SEQ ID NO: 107에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 타키키닌 펩타이드 결합 영역은 SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, 또는 SEQ ID NO: 107에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, 또는 SEQ ID NO: 107에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 타키키닌 펩타이드 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, 또는 SEQ ID NO: 107에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, 또는 SEQ ID NO: 107에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 또는 5 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
또한 또 다른 구체예에서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역을 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역은 뉴로펩타이드 Y(NPY), 펩타이드 YY(PYY), 췌장 펩타이드(PP) 또는 췌장 이코사펩타이드(PIP)를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역은 SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, 또는 SEQ ID NO: 112를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, 또는 SEQ ID NO: 112에 대해서 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95%; 또는 SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, 또는 SEQ ID NO: 112에 대해서 최대 70%, 최대 75%, 최대 80%, 최대 85%, 최대 90% 또는 최대 95%의 아미노산 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, 또는 SEQ ID NO: 112에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, 또는 SEQ ID NO: 112에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 비-인접 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한 이 구체예의 다른 측면들에서, 뉴로펩타이드 Y 관련된 펩타이드 결합 영역은 예를 들어, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, 또는 SEQ ID NO: 112에 비해서 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환; 또는 SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, 또는 SEQ ID NO: 112에 비해서 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 인접한 아미노산 결실, 첨가, 및/또는 치환을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 키메릭은 클로스트리듐 독소 키메릭이 중독과정을 수행할 수 있다는 단서하에, 어떤 위치에서라도 비-클로스트리듐 결합 영역을 포함할 수 있는 것으로 생각된다. 비-제한적 예로는 변형된 클로스트리듐 독소의 아미노 말단에 비-클로스트리듐 결합 영역이 위치하고; 변형된 클로스트리듐 독소의 클로스트리듐 독소 효소 영역과 전위 영역 사이에 비-클로스트리듐 결합 영역이 위치하고; 변형된 클로스트리듐 독소의 카복실 말단에 비-클로스트리듐 결합 영역이 위치하는 것이 포함된다. 그 밖의 다른 비-제한적 예로는 변형된 클로스트리듐 독소의 클로스트리듐 독소 효소 영역과 클로스트리듐 독소 전위 영역 사이에 비-클로스트리듐 결합 영역이 위치하는 것이 포함된다. 천연적으로 존재하는 클로스트리듐 독소의 효소 영역은 천연의 출발 메티오닌을 함유한다. 따라서, 효소 영역이 아미노-말단 위치에 있지 않은 영역 조직화에서는 출발 메티오닌을 포함하는 아미노산 서열이 아미노-말단 영역의 전방에 위치하여야 한다. 마찬가지로, 비-클로스트리듐 결합 영역이 아미노-말단 위치에 있는 경우에, 출발 메티오닌 및 프로테아제 분해 부위를 포함하는 아미노산 서열은 비-클로스트리듐 결합 영역이 유리 아미노 말단을 필요로 하는 상황에서 작동가능하게-연결될 수 있다. [참조: 예를 들어, Shengwen Li et al., Degradable Clostridial Toxins, 미국 특허출원 제11/572,512호(2007년 1월 23일); 이것은 이에 의해서 그 전문이 참고로 포함된다]. 또한, 출발 메티오닌을 포함하는 또 다른 폴리펩타이드의 아미노 말단에 작동가능하게 연결된 폴리펩타이드를 첨가하는 경우에 원래의 메티오닌 잔기가 결실될 수 있다는 것은 본 기술분야에서 공지되어 있다.
따라서, 구체예에서 변형된 클로스트리듐 독소는 비-클로스트리듐 결합 영역, 전위 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위 및 효소 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 3a). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 비-클로스트리듐 결합 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위 및 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 비-클로스트리듐 결합 영역, 효소 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 및 전위 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 3b). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 비-클로스트리듐 결합 영역, 클로스트리듐 독소 효소 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또한 또 다른 구체예에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 효소 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 비-클로스트리듐 결합 영역, 및 전위 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 4a). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 비-클로스트리듐 결합 영역, 및 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또한 또 다른 구체예에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 전위 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 비-클로스트리듐 결합 영역, 및 효소 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 4b). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 전위 영역, 비-클로스트리듐 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위 및 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 효소 영역, 비-클로스트리듐 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 및 전위 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 4c). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 비-클로스트리듐 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 클로스트리듐 독소 전위 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또한 또 다른 구체예에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 전위 영역, 비-클로스트리듐 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위 및 효소 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 4d). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 전위 영역, 비-클로스트리듐 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위 및 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또한 또 다른 구체예에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 효소 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 전위 영역, 및 비-클로스트리듐 결합 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 5a). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 및 비-클로스트리듐 결합 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
또한 또 다른 구체예에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 전위 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 효소 영역 및 비-클로스트리듐 결합 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다(도 5b). 이 구체예의 측면들에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 전위 영역, 비-클로스트리듐 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위 및 클로스트리듐 독소 효소 영역을 포함하는 아미노에서 카복실로의 단일 폴리펩타이드 선형 순서를 포함할 수 있다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위를 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "불활성화 분해 부위"는 예를 들어, 심혈관계 또는 림프계와 같은 순환기계 또는 간질액 내에 존재하는 프로테아제에 의한 절단가능한 결합에서의 선택적 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 이러한 불활성화 분해 부위는 본 명세서에 기술된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 융합 단백질로서 작동가능하게-연결된다. 의미상, 불활성화 분해 부위는 간질액 또는 순환기계에 존재하는 적어도 하나의 프로테아제에 의한 선택적 분해에 민감하다. 불활성화 분해 부위의 비-제한적 예로는 트롬빈 분해 부위, 플라즈민 분해 부위, 응고인자 VIIa 분해 부위, 응고인자 IXa 분해 부위, 응고인자 Xa 분해 부위, 응고인자 XIa 분해 부위, 응고인자 XIIa 분해 부위, 혈장 칼리크레인 분해 부위, 프로테아제-활성화된 G 단백질-커플링된 수용체-1(PAR1) 분해 부위, PAR2 분해 부위, PAR3 분해 부위, PAR4 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2) 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9) 분해 부위, 푸린 분해 부위, 유로키나제-타입 플라즈미노겐 활성화제(uPA) 분해 부위, 조직-타입 플라즈미노겐 활성화제(tPA) 분해 부위, 트립타제-ε 분해 부위, 마우스 비만세포 프로테아제-7(mMCP-7) 분해 부위, 엔도텔린-전환효소-1(ECE-1) 분해 부위, 켈 혈액형 분해 부위, DPPIV 분해 부위, 트롬보스폰딘 타입 1 모티프-13(ADAMTS13) 분해 부위를 갖는 ADAM 메탈로펩티다제, 및 카텝신 L 분해 부위가 포함된다(표 4).
표 4. 불활성화 분해 부위
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프로테아제 분해 부위
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기준 서열
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SEQ ID NO:
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트롬빈 |
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응고인자 VIIa(FVIIA) |
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응고인자 IXa(FIXa) |
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응고인자 Xa(FXa) |
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응고인자 XIa(FXIa) |
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응고인자 XIIa(FXIIa) |
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칼리크레인 1 |
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단백질 C |
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플라즈미노겐 |
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매트릭스 메탈로프로테이나제-2(MMP-2) |
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매트릭스 메탈로프로테이나제-9(MMP-9) |
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푸린 |
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u-플라즈미노겐 활성화제(u-PA) |
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t-플라즈미노겐 활성화제(t-PA) |
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트립타제-ε(프로세민) |
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마우스 비만세포 프로테아제-7(mMCP-7) |
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엔도텔린-전환효소-1(ECE-1) |
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켈 혈액형 단백질(KBGP) |
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카텝신 L |
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PAR1 |
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PAR2 |
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PAR3 |
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PAR4 |
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ADAMTS13 |
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별표(*)는 지시된 프로테아제에 의해서 분해되는 P1-P1' 분해 부위의 펩타이드 결합을 나타낸다. |
불활성화 분해 부위가 간질액 또는 순환기계 프로테아제에 의해서 분해될 수 있다는 단서하에, 모든 길이의 불활성화 분해 부위가 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위는 길이가 예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20 아미노산일 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위는 길이가 예를 들어, 최대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 또는 20 아미노산일 수 있다.본 명세서의 측면들에서 유용한 불활성화 분해 부위에는 제한이 없이 천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위; 천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체; 및 예를 들어, 보존적 불활성화 분해 부위 변이체, 비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체 및 불활성화 분해 부위 펩타이드유사체(peptidomimetic)와 같은 비-천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체가 포함된다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "불활성화 분해 부위 변이체"는 천연적으로 존재하는 것이든 비-천연적으로 존재하는 것이든, 기술된 기준 서열의 상응하는 부분으로부터 적어도 하나의 아미노산 변화를 갖고, 그 기준 서열의 상응하는 부분에 대한 동일성 퍼센트로 기술될 수 있는 불활성화 분해 부위를 나타낸다. 제한이 없이 예를 들어, 분절 접근방법과 같은 포괄적 방법, 국소적 방법 및 하이브리드 방법을 포함한 다양한 서열 정렬방법 중의 어떤 것이라도 동일성 퍼센트를 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 프로토콜은 본 기술분야에서 숙련된 전문가의 범주 내에서, 및 본 명세서의 교시내용으로부터 일상적인 절차이다.본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체"는 인간 조작의 도움이 없이 생산된 모든 불활성화 분해 부위를 나타낸다. 불활성화 분해 부위의 비-제한적 예로는 트롬빈 분해 부위 변이체, 플라즈민 분해 부위 변이체, 응고인자 V 분해 부위 변이체, 응고인자 VII 분해 부위 변이체, 응고인자 VIII 분해 부위 변이체, 응고인자 IXa 분해 부위 변이체, 응고인자 Xa 분해 부위 변이체, 응고인자 XIa 분해 부위 변이체, 응고인자 XIIa 분해 부위 변이체, 혈장 칼리크레인 분해 부위 변이체, MMP-2 분해 부위 변이체, MMP-9 분해 부위 변이체, 푸린 분해 부위 변이체, u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 변이체, t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 변이체, 트립타제-ε 분해 부위 변이체, mMCP-7 분해 부위 변이체, ECE-1 분해 부위 변이체, KBGP 분해 부위 변이체, 카텝신 L 분해 부위 변이체, PAR1 분해 부위 변이체, PAR2 분해 부위 변이체, PAR3 분해 부위 변이체, PAR4 분해 부위 변이체, 및 ADAM-TS13 분해 부위 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체"는 제한이 없이 무작위 돌연변이유발 또는 합리적 디자인을 사용한 유전자 조작에 의해서 생산된 불활성화 분해 부위 변이체 및 화학적 합성에 의해서 생산된 불활성화 분해 부위 변이체를 포함하는, 인간 조작의 도움을 받아서 생산된 모든 불활성화 분해 부위를 나타낸다. 비-천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 불활성화 분해 부위 변이체, 비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체, 및 불활성화 분해 부위 펩타이드유사체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "보존적 불활성화 분해 부위 변이체"는 기준 불활성화 분해 부위 서열로부터의 원래의 아미노산과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 불활성화 분해 부위를 나타낸다. 특성의 예로는 제한이 없이 유사한 크기, 토포그래피, 전하, 소수성, 친수성, 친유성, 공유-결합능, 수소-결합능, 물리화학적 특성 등, 또는 이들의 모든 조합이 포함된다. 보존적 불활성화 분해 부위 변이체는 보존적 불활성화 분해 부위 변이체가 기초로 하는 기준 불활성화 분해 부위와 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 불활성화 분해 부위에 대체될 수 있다. 보존적 불활성화 분해 부위 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 보존적 트롬빈 분해 부위 변이체, 보존적 플라즈민 분해 부위 변이체, 보존적 응고인자 V 분해 부위 변이체, 보존적 응고인자 VII 분해 부위 변이체, 보존적 응고인자 VIII 분해 부위 변이체, 보존적 응고인자 IXa 분해 부위 변이체, 보존적 응고인자 Xa 분해 부위 변이체, 보존적 응고인자 XIa 분해 부위 변이체, 보존적 응고인자 XIIa 분해 부위 변이체, 보존적 혈장 칼리크레인 분해 부위 변이체, 보존적 MMP-2 분해 부위 변이체, 보존적 MMP-9 분해 부위 변이체, 보존적 푸린 분해 부위 변이체, 보존적 u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 변이체, 보존적 t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 변이체, 보존적 트립타제-ε 분해 부위 변이체, 보존적 mMCP-7 분해 부위 변이체, 보존적 ECE-1 분해 부위 변이체, 보존적 KBGP 분해 부위 변이체, 보존적 카텝신 L 분해 부위 변이체, 보존적 PAR1 분해 부위 변이체, 보존적 PAR2 분해 부위 변이체, 보존적 PAR3 분해 부위 변이체, 보존적 PAR4 분해 부위 변이체, 및 보존적 ADAM-TS13 분해 부위 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체"는 1) 비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체가 기초로 하는 기준 불활성화 분해 부위로부터 적어도 하나의 아미노산이 결실되거나; 2) 비-보존적 불활성화 분해 부위가 기초로 하는 기준 불활성화 분해 부위에 적어도 하나의 아미노산이 첨가되거나; 3) 기준 불활성화 분해 부위 서열(표 4)로부터의 원래의 아미노산과 유사한 어떤 특성도 공유하지 않는 또 다른 아미노산 또는 아미노산 유사체에 의해서 적어도 하나의 아미노산이 치환된 불활성화 분해 부위를 나타낸다. 비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체는 비-보존적 불활성화 분해 부위가 기초로 하는 기준 불활성화 분해 부위와 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있고, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 불활성화 분해 부위에 대체될 수 있다. 비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 비-보존적 트롬빈 분해 부위 변이체, 비-보존적 플라즈민 분해 부위 변이체, 비-보존적 응고인자 V 분해 부위 변이체, 비-보존적 응고인자 VII 분해 부위 변이체, 비-보존적 응고인자 VIII 분해 부위 변이체, 비-보존적 응고인자 IXa 분해 부위 변이체, 비-보존적 응고인자 Xa 분해 부위 변이체, 비-보존적 응고인자 XIa 분해 부위 변이체, 비-보존적 응고인자 XIIa 분해 부위 변이체, 비-보존적 혈장 칼리크레인 분해 부위 변이체, 비-보존적 MMP-2 분해 부위 변이체, 비-보존적 MMP-9 분해 부위 변이체, 비-보존적 푸린 분해 부위 변이체, 비-보존적 u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 변이체, 비-보존적 t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 변이체, 비-보존적 트립타제-ε 분해 부위 변이체, 비-보존적 mMCP-7 분해 부위 변이체, 비-보존적 ECE-1 분해 부위 변이체, 비-보존적 KBGP 분해 부위 변이체, 비-보존적 카텝신 L 분해 부위 변이체, 비-보존적 PAR1 분해 부위 변이체, 비-보존적 PAR2 분해 부위 변이체, 비-보존적 PAR3 분해 부위 변이체, 비-보존적 PAR4 분해 부위 변이체, 및 비-보존적 ADAM-TS13 분해 부위 변이체가 포함된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "불활성화 분해 부위 펩타이드유사체"는 첫 번째 아미노산과 유사한 적어도 하나의 특성을 갖는 비-천연 올리고머에 의해서 치환된 적어도 하나의 아미노산을 갖는 불활성화 분해 부위를 나타낸다. 특성의 예로는 이에 한정되지 않고 펩타이드 일차 구조 요소의 토포그래피, 펩타이드 일차 구조 요소의 작용성, 펩타이드 이차 구조 요소의 토폴로지(topology), 펩타이드 이차 구조 요소의 작용성 등, 또는 이들의 조합이 포함된다. 불활성화 분해 부위 펩타이드유사체는 불활성화 분해 부위 펩타이드유사체가 기초로 하는 기준 불활성화 분해 부위와 실질적으로 동일한 방식으로 작용할 수 있으며, 본 명세서의 어떤 측면에서라도 기준 불활성화 분해 부위에 대해 대체될 수 있다. 펩타이드유사체 방법의 예로는 예를 들어, 문헌 [Amy S. Ripka & Daniel H. Rich, Peptidomimetic design, 2(4) Curr. Opin. Chem. Biol. 441-452(1998); 및 M. Angels Estiarte & Daniel H. Rich, Peptidomimetics for Drug Design, 803-861(Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery Vol. 1 Principle and Practice, Donald J. Abraham ed., Wiley-Interscience, 6th ed 2003)]을 참고로 한다. 불활성화 분해 부위 펩타이드유사체의 비-제한적 예로는 예를 들어, 트롬빈 분해 부위 펩타이드유사체, 플라즈민 분해 부위 펩타이드유사체, 응고인자 V 분해 부위 펩타이드유사체, 응고인자 VII 분해 부위 펩타이드유사체, 응고인자 VIII 분해 부위 펩타이드유사체, 응고인자 IXa 분해 부위 펩타이드유사체, 응고인자 Xa 분해 부위 펩타이드유사체, 응고인자 XIa 분해 부위 펩타이드유사체, 응고인자 XIIa 분해 부위 펩타이드유사체, 혈장 칼리크레인 분해 부위 펩타이드유사체, MMP-2 분해 부위 펩타이드유사체, MMP-9 분해 부위 펩타이드유사체, 푸린 분해 부위 펩타이드유사체, u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 펩타이드유사체, t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위 펩타이드유사체, 트립타제-ε 분해 부위 펩타이드유사체, mMCP-7 분해 부위 펩타이드유사체, ECE-1 분해 부위 펩타이드유사체, KBGP 분해 부위 펩타이드유사체, 카텝신 L 분해 부위 펩타이드유사체, PAR1 분해 부위 펩타이드유사체, PAR2 분해 부위 펩타이드유사체, PAR3 분해 부위 펩타이드유사체, PAR4 분해 부위 펩타이드유사체, 및 ADAM-TS13 분해 부위 펩타이드유사체가 포함된다.
따라서, 구체예에서 클로스트리듐 독소는 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 클로스트리듐 독소는 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 클로스트리듐 독소 결합 영역, 및 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소는 예를 들어, 불활성화 분해 부위 이소형태와 같은 천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소는 예를 들어, 보존적 불활성화 분해 부위 변이체, 비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체 또는 활성 불활성화 분해 부위 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 클로스트리듐 독소 키메릭은 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 및 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 키메릭은 예를 들어, 불활성화 분해 부위 이소형태와 같은 천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 키메릭은 예를 들어, 보존적 불활성화 분해 부위 변이체, 비-보존적 불활성화 분해 부위 변이체 또는 활성 불활성화 분해 부위 단편, 또는 이들의 모든 조합과 같은 비-천연적으로 존재하는 불활성화 분해 부위 변이체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 소수성 아미노산은 또 다른 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 소수성 아미노산의 예로는 예를 들어, C, F, I, L, M, V 및 W가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위 쇄 내의 하나의 특정한 위치에서 지방족 아미노산은 또 다른 지방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 지방족 아미노산의 예로는 예를 들어, A, I, L, P, 및 V가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 방향족 아미노산은 또 다른 방족 아미노산으로 치환될 수 있다. 방향족 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 스태킹 아미노산은 또 다른 스태킹 아미노산으로 치환될 수 있다. 스태킹 아미노산의 예로는 예를 들어, F, H, W 및 Y가 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 극성 아미노산은 또 다른 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 극성 아미노산의 예로는 예를 들어, D, E, K, N, Q, 및 R이 포함된다. 이 구체예의 추가의 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 덜 극성이거나 중성인 아미노산은 또 다른 덜 극성이거나 중성인 아미노산으로 치환될 수 있다. 덜 극성이거나 중성인 아미노산의 예로는 예를 들어, A, H, G, P, S, T, 및 Y가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 양으로 하전된 아미노산은 또 다른 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 양으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, K, R, 및 H가 포함된다. 또한 이 구체예의 추가의 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 음으로 하전된 아미노산은 또 다른 음으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있다. 음으로 하전된 아미노산의 예로는 예를 들어, D 및 E가 포함된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 소형 아미노산은 또 다른 소형 아미노산으로 치환될 수 있다. 소형 아미노산의 예로는 예를 들어, A, D, G, N, P, S, 및 T가 포함된다. 또한 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위 내의 하나의 특정한 위치에서 C-베타 분지된 아미노산은 또 다른 C-베타 분지된 아미노산으로 치환될 수 있다. C-베타 분지된 아미노산의 예로는 예를 들어, I, T 및 V가 포함된다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 트롬빈 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "트롬빈 분해 부위"는 트롬빈 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 트롬빈에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 트롬빈에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, 트롬빈 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 113)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 S, T, 또는 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 어떤 아미노산이라도 되며; X3은 선택적으로 F, S, T, 또는 N 또는 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 선택적으로 S, T, 또는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 트롬빈에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 114-123). 추가의 트롬빈 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 트롬빈 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 트롬빈 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 113을 포함하며, 여기에서 X1은 S, T, 또는 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 어떤 아미노산이라도 되며; X3은 F, S, T, 또는 N 또는 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 S, T, 또는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 트롬빈 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 113을 포함하며, 여기에서 X1은 S, Q, K, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 N, Q, G, P, A, V, L, 또는 I이며; X4는 S, T, H, G, A, L, 또는 I이고; X5는 S, T, Q, K, R, F, Y, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 S, T, Q, K, R, G, P, A, V, L, 또는 I이고; X7은 S, T, Q, K, R, G, P, A, V, L 또는 I이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 트롬빈 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 113을 포함하며, 여기에서 X1은 Q, G, P, A, V, L, I 또는 M이고; X2는 S, T, D, E, G, A, V 또는 I이며; X3은 G, P, A, V, 또는 L이며; X4는 S, G, A, 또는 L이고; X5는 Q, K, F, A, V, 또는 L이며; X6은 S, Q, K, R, G, P, V, 또는 L이고; X7은 S, T, K, G, V, L 또는 I이다. 이 구체예의 다른 측면에서, 트롬빈 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, 또는 SEQ ID NO: 123을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 플라즈민 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "플라즈민 분해 부위"는 플라즈민 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 플라즈민에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 플라즈민에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 플라즈민은 트립신의 경우와 유사한 특이성으로 Lys| 및 Arg| 결합의 분해를 촉진시킨다. 그러나, 플라즈민은 트립신보다 훨씬 덜 효율적인 효소이며, 단백질 내의 이들 결합 중의 단지 일부만을 분해시킨다. 트립신은 주로 아미노산 리신 또는 아르기닌의 카복실 측면에서 펩타이드 쇄를 분해시키는데, 이들 중의 어떤 것의 다음에 프롤린이 있는 경우는 예외로 한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 응고인자 VIIa 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "응고인자 VIIa 분해 부위" 또는 "FVIIa 분해 부위"는 FVIIa 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 FVIIa에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. FVIIa에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, FVIIa 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 124)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 Q, S, T, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 Q, S, T, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4, X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 FVIIa에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 125-133). 추가의 FVIIa 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, J. H. Morrissey, Coagulation Factor VIIa, In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1659-1662(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 응고인자 VIIa 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 응고인자 VIIa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 124를 포함하며, 여기에서 X1은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 Q, S, T, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 Q, S, T, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4, X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 응고인자 VIIa 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, 또는 SEQ ID NO: 133을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 응고인자 IXa 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "응고인자 IXa 분해 부위" 또는 "FIXa 분해 부위"는 FIXa 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 FIXa에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. FIXa에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, FIXa 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 134)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 S, T, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4, X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 FIXa에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 135-138). 추가의 FIXa 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, A. T. Thompson, Molecular Biology of Factor IX. In Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, pp. 128-129(R. W. Colman, J. Hirsh, V. J. Marder, A. W Clowes, J. N. George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001); S. Kawabata and S. Iwanaga, Russellysin. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 683-684(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); A. E. Schmidt and S. P. Bajaj, Coagulatio factor IXa. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1655-1659(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 응고인자 IXa 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 응고인자 IXa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 134를 포함하며, 여기에서 X1은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 S, T, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4, X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 응고인자 IXa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 134를 포함하며, 여기에서 X1은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 S, T, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4, X5, X6 및 X7은 독립적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 응고인자 IXa 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, 또는 SEQ ID NO: 138을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 응고인자 Xa 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "응고인자 Xa 분해 부위" 또는 "FXa 분해 부위"는 FXa 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 FXa에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. FXa에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, FXa 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 139)이며, 여기에서 X1은 어떤 아미노산이라도 되며; X2는 선택적으로 G, A, S, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 FXa에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 140-155). 추가의 FXa 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, D. L. Greenberg and E. W. Davie, Blood Coagulation Factors: Their Complementary DNAs, Genes, and Expression. In Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, pp. 34-35(R. W. Colman, J. Hirsh, V. J. Marder, A. W Clowes, J. N. George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 응고인자 Xa 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 응고인자 Xa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 139를 포함하며, 여기에서 X1은 어떤 아미노산이라도 되며; X2는 G, A, S, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이며; X3은 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 응고인자 Xa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 139를 포함하며, 여기에서 X1은 E, F, P, A, L, 또는 I이며; X2는 S, Q, D, E, F, G 또는 A이며; X3은 F, G, 또는 P이며; X4는 S, T, L, 또는 I이고; X5는 S, F, A 또는 V이며; X6은 S, T, E, N, H, G, A, 또는 M이고; X7은 S, N, D, Q, K, R, 또는 G이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 응고인자 Xa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 139를 포함하며, 여기에서 X1은 I 또는 A이며; X2는 E 또는 F이며; X3은 F, G, 또는 P이며; X4는 S, T, 또는 I이고; X5는 S, F, 또는 V이며; X6은 E 또는 G이고; X7은 S 또는 G이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 응고인자 Xa 분해 부위는 예를 들어, 아미노산 서열 SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 154, 또는 SEQ ID NO: 155를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 응고인자 XIa 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "응고인자 XIa 분해 부위" 또는 "FXIa 분해 부위"는 FXIa 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 FXIa에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. FXIa에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, FXIa 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 156)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 D 또는 E와 같은 산성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 선택적으로 D 또는 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 H, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 선택적으로 H, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 선택적으로 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 선택적으로 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 FXIa에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 157-166). 추가의 FXIa 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, P. N. Walsh, Coagulation Factor XIa. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1651-1655(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F, Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 응고인자 XIa 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 응고인자 XIa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 156을 포함하며, 여기에서 X1은 D 또는 E와 같은 산성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D 또는 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 H, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 H, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 응고인자 XIa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 156을 포함하며, 여기에서 X1은 D 또는 E와 같은 산성 아미노산, 또는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산이고; X2는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 응고인자 XIa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 156을 포함하며, 여기에서 X1은 D 또는 K이며; X2는 F 또는 L이며; X3은 T 또는 P이며; X4는 A 또는 V이고; X5는 E 또는 V이며; X6은 T 또는 G이고; X7은 G 또는 V이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 응고인자 XIa 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, 또는 SEQ ID NO: 166을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 응고인자 XIIa 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "응고인자 XIIa 분해 부위" 또는 "FXIIa 분해 부위"는 FXIIa 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 FXIIa에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. FXIIa에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, FXIIa 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 167)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 선택적으로 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 FXIIa에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 168-172). 추가의 FXIIa 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, O. D. Ratnoff, Coagulation Factor XIIa. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1642-1644(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F, Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 응고인자 XIIa 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 응고인자 XIIa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 167을 포함하며, 여기에서 X1은 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X4는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 응고인자 XIIa 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 167을 포함하며, 여기에서 X1은 S, T, P 또는 I이며; X2는 Q, K, S 또는 M이며; X3은 K, T, G 또는 P이며; X4는 L, I 또는 V이고; X5는 T 또는 V이며; X6은 G 또는 L이고; X7은 G이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 응고인자 XIIa 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171, 또는 SEQ ID NO: 172를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 칼리크레인 1 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "칼리크레인 1 분해 부위"는 칼리크레인 1 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 칼리크레인 1에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 칼리크레인 1에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, 칼리크레인 1 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4 *(R/K/S)X5X6X7(SEQ ID NO: 173)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 어떤 아미노산이라도 되며; X3은 어떤 아미노산이라도 되고; X4는 선택적으로 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, I, L, M 및 V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이고; X5는 어떤 아미노산이라도 되며; X6은 어떤 아미노산이라도 되고; X7은 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 칼리크레인 1에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 174-198). 추가의 칼리크레인 1 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, R. W. Colman, Contact Activation Pathway: Inflammation, Fibrinolytic, Anticoagulant, Antiadhesive, and Antiangiogenic Activities. In Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice, pp. 103-104(R. W. Colman, J. Hirsh, V. J. Marder, A. W. Clowes, J. N. George, eds; Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2d, 2001); J. Chao, Human Kallikrein 1, Tissue Kallikrein. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1577-1580(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F, Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); H. X. Li, et al., Substrate Specificity of Human Kallikreins 1 ad 6 Determined by Phage Display, Protein Sci. 17: 664-672(2008); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 칼리크레인 1 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 칼리크레인 1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 173을 포함하며, 여기에서 X1은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 어떤 아미노산이라도 되며; X3은 어떤 아미노산이라도 되고; X4는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, I, L, M 및 V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이고; X5는 어떤 아미노산이라도 되며; X6은 어떤 아미노산이라도 되고; X7은 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 칼리크레인 1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 173을 포함하며, 여기에서 X1은 D, S, T, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 S, T, A, P, 또는 V이며; X3은 S, F 또는 L이고; X4는 R 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이고; X5는 R, S, T, 또는 A이며; X6은 R, S, 또는 G이고; X7은 R, G, 또는 A이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 칼리크레인 1 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, 또는 SEQ ID NO: 198을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 단백질 C 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "단백질 C 분해 부위"는 단백질 C 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 단백질 C에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 단백질 C에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, 단백질 C 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 199)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 선택적으로 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 선택적으로 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 선택적으로 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이고; X7은 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 단백질 C에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 200-209). 추가의 단백질 C 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, L. Shen and B. Dahiback, Protein C. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1673-1677(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F, Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 단백질 C 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 단백질 C 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 199를 포함하며, 여기에서 X1은 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3 및 X4는 독립적으로 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이고; X7은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, Q 및 N과 같은 아미드성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 단백질 C 분해 부위는 서열 SEQ ID NO: 199를 포함하며, 여기에서 X1은 K, R, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D, E, Q, N, 또는 K이며; X3은 P, L, T, Q, K 또는 R이고; X4는 G, I, S, N, 또는 K이고; X5는 Q, N, K, F, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 F, S, N, Q, K, 또는 H이고; X7은 L, I, T, K, D, E, Q 또는 N이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 단백질 C 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 208, 또는 SEQ ID NO: 209를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 플라즈미노겐 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "플라즈미노겐 분해 부위"는 플라즈미노겐 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 플라즈미노겐에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 플라즈미노겐에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, 플라즈미노겐 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 210)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 선택적으로 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 선택적으로 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 어떤 아미노산이라도 되며; X7은 선택적으로 H, F, Y, R, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 플라즈미노겐에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 211-240). 추가의 플라즈미노겐 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 플라즈미노겐 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 플라즈미노겐 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 211을 포함하며, 여기에서 X1은 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 어떤 아미노산이라도 되며; X7은 H, F, Y, R, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 플라즈미노겐 분해 부위는 서열 SEQ ID NO: 211을 포함하며, 여기에서 X1은 K, R, S, T, A, G, L, 또는 P이고; X2는 D, E, Q, N, K, R, S, T, A, G, I, 또는 L이며; X3은 N, Q, S, F, Y, A, 또는 L이고; X4는 K, R, S, A, G, L, 또는 V이고; X5는 K, R, N, S, F, Y, A, I, L, P, 또는 V이며; X6은 K, R, N, S, F, Y, A, G, L, P, 또는 V이고; X7은 R, S, T, F, Y, A, G, I, L, 또는 P이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 플라즈미노겐 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, 또는 SEQ ID NO: 240을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위" 또는 "MMP-2 분해 부위"는 MMP-2 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 MMP-2에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. MMP-2에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, MMP-2 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1(P/A/V/L/I)X2X3 *(V/L/I/F/Q)X4X5X6(SEQ ID NO: 241)이며, 여기에서 X1, X2, X3, X4, X5, 및 X6은 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 MMP-2에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 242-273). 추가의 MMP-2 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 241을 포함하며, 여기에서 X1, X2, X3, X4, X5, 및 X6은 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 241을 포함하며, 여기에서 X1은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 H, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, K 및 R과 같은 염기성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위는 서열 SEQ ID NO: 241을 포함하며, 여기에서 X1은 G, P, A, V, L, I, S, T, E, 또는 Q이고; X2는 G, A, L, S, N, Q, W, 또는 K이며; X3은 G, P, A, S, Q, D, E, 또는 H이고; X4는 G, A, V, L, I, F, S, T, Q, 또는 K이고; X5는 G, A, V, S, T, Q, 또는 K이며; X6은 G, P, A, V, L, I, S, T, D, E, K, N, 또는 Q이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위는 서열 SEQ ID NO: 241을 포함하며, 여기에서 X1은 G, A, 또는 L, 또는 Q이고; X2는 G, A, 또는 S이며; X3은 G, A, S, 또는 N이고; X4는 A, V, L, I, 또는 K이고; X5는 G, A, 또는 S이며; X6은 G, P, A, V, L, 또는 D이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, SEQ ID NO: 255, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, SEQ ID NO: 261, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, SEQ ID NO: 264, SEQ ID NO: 265, SEQ ID NO: 266, SEQ ID NO: 267, SEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 269, SEQ ID NO: 270, SEQ ID NO: 271, SEQ ID NO: 272, 또는 SEQ ID NO: 273을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "매트릭스 메탈로프로테이나제-9 분해 부위" 또는 "MMP-9 분해 부위"는 MMP-9 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 MMP-9에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. MMP-9에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, MMP-9 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4 *X5X6X7X8(SEQ ID NO: 274)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 F, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 선택적으로 F, Y, S, T, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 어떤 아미노산이라도 되며; X5는 선택적으로 S, T, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X6은 어떤 아미노산이라도 되며; X7은 어떤 아미노산이라도 되고; X8은 선택적으로 F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 MMP-9에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 275-319). 추가의 MMP-9 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, S. L. Kridel, et al., Substrate Hydrolysis by Matrix Metalloproteinase-9, J. Biol. Chem. 276: 20572-20578(2001); E. Y. Zhen, et al., Characterization of Metalloprotease Cleavage Products of Human Articular Cattilage, Arthritis Rheum. 58: 2420-2431(2008); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 274를 포함하며, 여기에서 X1은 F, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 F, Y, S, T, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 어떤 아미노산이라도 되며; X5는 S, T, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X6은 어떤 아미노산이라도 되며; X7은 어떤 아미노산이라도 되고; X8은 F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 274를 포함하며, 여기에서 X1은 G, V, L, I, F, S, Q, K, 또는 R이고; X2는 P, A, V, L, I, 또는 S이며; X3은 G, P, A, V, L, S, Q, E, K, 또는 R이고; X4는 G, P, A, V, L, F, S, N, E, 또는 K이고; X5는 A, V, L, I, M, F, S, Q, 또는 K이며; X6은 P, A, V, L, I, S, T, Q, E, K, 또는 R이고; X7은 G, A, V, L, S, 또는 T이며; X8은 G, P, A, V, L, F, T, D, E, K, 또는 R이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 274를 포함하며, 여기에서 X1은 G 또는 L이고; X2는 P, A, 또는 V이며; X3은 P, A, R, K, 또는 S이고; X4는 G이고; X5는 A, V, L, 또는 I이며; X6은 T, Q, K, 또는 R이고; X7은 G, A, 또는 S이며; X8은 G, P, A, V, 또는 E이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 275, SEQ ID NO: 276, SEQ ID NO: 277, SEQ ID NO: 278, SEQ ID NO: 279, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 281, SEQ ID NO: 282, SEQ ID NO: 283, SEQ ID NO: 284, SEQ ID NO: 285, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 287, SEQ ID NO: 288, SEQ ID NO: 289, SEQ ID NO: 290, SEQ ID NO: 291, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 293, SEQ ID NO: 294, SEQ ID NO: 295, SEQ ID NO: 296, SEQ ID NO: 297, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO: 299, SEQ ID NO: 300, SEQ ID NO: 301, SEQ ID NO: 302, SEQ ID NO: 303, SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 305, SEQ ID NO: 306, SEQ ID NO: 307, SEQ ID NO: 308, SEQ ID NO: 309, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 311, SEQ ID NO: 312, SEQ ID NO: 313, SEQ ID NO: 314, SEQ ID NO: 315, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 318, 또는 SEQ ID NO: 319를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 푸린 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "푸린 분해 부위"는 푸린 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 푸린에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 푸린에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, 푸린 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은(R/I/A)X1(R/K/A/P)R*X2 *X3X4X5(SEQ ID NO: 320)이며, 여기에서 X1, X2, X3, X4 및 X5는 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 푸린에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 321-346). 추가의 푸린 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, A. Basak, et al., Implication of the Proprotein Convertases Furin, PC5 And PC7 in the Cleavage of Surface Glycoproteins of Hong Kong, Ebola and Respiratory Syncytial Viruses: A Comparative Analysis with Fluorogenic Peptides, Biochem. J. 353: 537-545(2001); O. Bader, et al., Processing of Predicted Substrates of Fungal Kex2 Proteinases from Candida albicans, C. glabrata, Saccharomyces serevisiae and Pichia pastoris, BMC Microbiol. 8: 116(2008); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 푸린 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 푸린 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 320을 포함하며, 여기에서 X1, X2, X3, X4 및 X5는 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 푸린 분해 부위는 서열 SEQ ID NO: 320을 포함하며, 여기에서 X1은 F, S, T, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 G, P, M, F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산이며; X3은 G, P, A, V, L, I, F, W, S, T, N, Q, D, H, K, 또는 R이고; X4는 F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X5는 F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 푸린 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 320을 포함하며, 여기에서 X1은 K, R, S, 또는 T이고; X2는 D, E, S, A, 또는 G이며; X3은 A, V, L, 또는 I이고; X4는 S, G, D, E 또는 R이고; X5는 G, P, A, S, T, Q, D, 또는 E이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 푸린 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 324, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 326, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 330, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 332, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 336, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 345, 또는 SEQ ID NO: 346을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위" 또는 "u-PA"는 u-PA 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 u-PA에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. u-플라즈미노겐 활성화제에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, u-PA 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4 *X5X6X7(SEQ ID NO: 347)이며, 여기에서 X1은 어떤 아미노산이라도 되며; X2는 선택적으로 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 어떤 아미노산이라도 되며; X5는 선택적으로 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 선택적으로 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 u-PA에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 347-368). 추가의 u-PA 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, V. Ellis, u-Plasminogen Activator. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1677-1683(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 347을 포함하며, 여기에서 X1은 어떤 아미노산이라도 되며; X2는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 어떤 아미노산이라도 되며; X5는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 347을 포함하며, 여기에서 X1은 P, A, L, S, T, C, N, 또는 R이며; X2는 G, P, L, Y, S, 또는 T이고; X3은 G, A, S, 또는 N이고; X4는 G, A, V, I, Y, S, 또는 R이고; X5는 P, V, L, F, 또는 R이며; X6은 G, A, V, Y, S, 또는 T이고; X7은 G, V, L, F, Y, N, 또는 H이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 347을 포함하며, 여기에서 X1은 P, A, L, S, T, C, N, 또는 R이며; X2는 G, Y, 또는 S이고; X3은 G, 또는 S이고; X4는 G, A, V, I, Y, S, 또는 R이고; X5는 V, 또는 R이며; X6은 T, 또는 Y이고; X7은 G, V, L, F, Y, N, 또는 H이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, u-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 361, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 363, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 365, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 367, 또는 SEQ ID NO: 368을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위" 또는 "t-PA"는 t-PA 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 t-PA에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. t-PA에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, t-PA 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(R/K)*X4 *X5X6X7(SEQ ID NO: 369)이며, 여기에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 어떠한 아미노산이라도 된다. 표 4는 t-PA에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 370-373). 추가의 t-PA 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, H. R. Lijnen and D. Collen, t-Plasminogen Activator. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 1684-1689(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 369를 포함하며, 여기에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 어떠한 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 369를 포함하며, 여기에서 X1은 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X7은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 369를 포함하며, 여기에서 X1은 A, P, C, 또는 N이고; X2는 A, L, P, 또는 Q이며; X3은 G, L, S, 또는 F이고; X4는 I, V, M, 또는 Y이고; X5는 A, V, 또는 K이며; X6은 G, V, 또는 P이고; X7은 G, L, 또는 D이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, t-플라즈미노겐 활성화제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 371, SEQ ID NO: 372, 또는 SEQ ID NO: 373을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 트립타제-ε 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "트립타제-ε 분해 부위" 또는 "프로세민 분해 부위"는 트립타제-ε 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 트립타제-ε에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 트립타제-ε에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, 트립타제-ε 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 *(R/K)X1X2X3X4(D/E)(SEQ ID NO: 374)이며, 여기에서 X1, X2, X3 및 X4는 독립적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 트립타제-ε에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 375-386). 추가의 트립타제-ε 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다 [참조: 예를 들어, O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 트립타제-ε 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 트립타제-ε 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 374를 포함하며, 여기에서 X1, X2, X3 및 X4는 독립적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 트립타제-ε 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 374를 포함하며, 여기에서 X1은 I 또는 V이고; X2는 I 또는 V이며; X3은 G 또는 S이고; X4는 G 또는 S이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 트립타제-ε 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 379, SEQ ID NO: 380, SEQ ID NO: 381, SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 383, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 385, 또는 SEQ ID NO: 386을 포함한다.
본 명세서의 측면들들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 마우스 비만세포 프로테아제-7 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "마우스 비만세포 프로테아제-7 분해 부위" 또는 "mMCP-7 분해 부위"는 mMCP-7 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 mMCP-7에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. mMCP-7에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, mMCP-7 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3(K/R)*X4X5X6X7(SEQ ID NO: 387)이며, 여기에서 X1은 어떠한 아미노산이라도 되며; X2는 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4, X5, X6, X7은 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 mMMCP-7에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 388-391). 추가의 mMMCP-7 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 마우스 비만세포 프로테아제-7 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 마우스 비만세포 프로테아제-7 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 387을 포함하며, 여기에서 X1은 어떠한 아미노산이라도 되며; X2는 N 또는 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4, X5, X6, X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 측면들에서, 마우스 비만세포 프로테아제-7 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 387을 포함하며, 여기에서 X1은 어떤 아미노산이라도 되고; X2는 G, S, 또는 Q이며; X3은 A, P, 또는 S이고; X4, X5, X6, X7은 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 마우스 비만세포 프로테아제-7 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 389, SEQ ID NO: 390, 또는 SEQ ID NO: 391을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 엔도텔린-전환효소-1 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "엔도텔린-전환효소-1 분해 부위" 또는 "ECE-1 분해 부위"는 ECE-1 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 ECE-1에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. ECE-1에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, ECE-1 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4 *(F/L/I/V/Y)5X6X7(SEQ ID NO: 392)이며, 여기에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 ECE-1에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 393-412). 추가의 ECE-1 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, K. Ahn and G. D. Johnson, Endothelin-Converting Enzyme-1. In Handbook of Proteolytic Enzymes, pp. 429-434(A. J. Barrett, N. D. Rawlings, and J. F. Woessner, eds; Elsevier, London, 2d, 2004); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 엔도텔린-전환효소-1 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 엔도텔린-전환효소-1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 392을 포함하며, 여기에서 X1, X2, X3, X4, X5, X6 및 X7은 독립적으로 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 엔도텔린-전환효소-1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 392을 포함하며, 여기에서 X1은 G, P, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산이고; X2는 F, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 S, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, W 및 Y과 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 S, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, F, W 및 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 F, W, S, C, N, E, 또는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 G, P, V, L, F, Y, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산이고; X7은 P, A, V, L, M, F, Y, S, N, D, 또는 K이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 엔도텔린-전환효소-1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 392를 포함하며, 여기에서 X1은 G, P, Y, C, D, K, R 또는 H이고; X2는 P, L, I, F, S, C, Q, D, R, 또는 H이며; X3은 V, L, I, S, Q, K, 또는 R이고; X4는 G, P, L, F, Y, W, 또는 R이고; X5는 V, I, M, F, N, R, 또는 H이며; X6은 P, L, F, T, E, 또는 H이고; X7은 P, V, L, F, S, N, D, 또는 K이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 엔도텔린-전환효소-1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 392를 포함하며, 여기에서 X1은 G, D, 또는 H이고; X2는 I, 또는 F이며; X3은 V, I, S, Q, 또는 K이고; X4는 P, F, 또는 W이고; X5는 I, N, R, 또는 H이며; X6은 L, T, 또는 H이고; X7은 P, S, 또는 D이다. 이 구체예의 다른 측면들에서 엔도텔린-전환효소-1 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 401, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 405, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 407, SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 409, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 411, 또는 SEQ ID NO: 412를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 켈 혈액형 단백질 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "켈 혈액형 단백질 분해 부위" 또는 "KBGP 분해 부위"는 KBGP 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 KBGP에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. KBGP에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, KBGP 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4 *X5X6X7X8(SEQ ID NO: 413)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산이고; X2는 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 선택적으로 F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산이고; X5는 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산이고; X7은 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산이며; X8은 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 KBGP에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 414-415). 추가의 KBGP 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 켈 혈액형 단백질 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 켈 혈액형 단백질 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 413을 포함하며, 여기에서 X1은 D 및 E와 같은 산성 아미노산이고; X2는 T, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산이고; X5는 T, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X6은 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산이고; X7은 C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 I, V, 또는 T와 같은 C-베타 분지된 아미노산이며; X8은 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 켈 혈액형 단백질 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 413을 포함하며, 여기에서 X1은 D이고; X2는 I, V, 또는 T이며; X3은 I, V, 또는 T이고; X4는 W이고; X5는 I, V, 또는 T이며; X6은 N이고; X7은 T이며; X8은 P이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 켈 혈액형 단백질 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 414, 또는 SEQ ID NO: 415를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 카텝신 L 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "카텝신 L 분해 부위"는 카텝신 L 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 카텝신 L에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. 카텝신 L에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, 카텝신 L 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4 *X5X6X7X8(SEQ ID NO: 416)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 W, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 어떤 아미노산이라도 되며; X3은 선택적으로 L, V, F, 또는 Y이고; X4, X5, X6, X7 및 X8은 어떤 아미노산이라도 된다. 표 4는 카텝신 L에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 417-443). 추가의 카텝신 L 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다. [참조: 예를 들어, J. C. Kelly, et al., Profiling of Calpain Activity with a Series of FRET-Based Substrates, Biochim. Biophys. Acta 1794: 1505-1509(2009); O. Schilling and C. M. Overall, Proteome-Derived, Database-Searchable Peptide Libraries for Identifying Protease Cleavage Sites, Nat. Biotechnol. 26: 685-694(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 36(Database issue): D320-D325(2008); Neil D. Rawlings, et al., MEROPS: The Peptidase Database, Nucleic Acids Res. 38(Database issue): D227-D233(2010); Neil D. Rawlings, et al., A Large and Accurate Collection of Peptidase Cleavages in the MEROPS Database, Database in press(2010); 이들은 각각 그 전문이 참고로 포함된다].
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 카텝신 L 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 카텝신 L 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 416을 포함하며, 여기에서 X1은 W, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, C, S 및 T와 같은 비하전된 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X2는 어떤 아미노산이라도 되며; X3은 L, V, F, 또는 Y이고; X4, X5, X6, X7 및 X8은 어떤 아미노산이라도 된다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 카텝신 L 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 416을 포함하며, 여기에서 X1은 G, P, A, L, Q, E, 또는 K이고; X2는 F, W 및 Y와 같은 방향족 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X3은 L, V, F, 또는 Y이고; X4는 G, A, F, T, Q, E, K, 또는 R이고; X5는 G, A, S, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산이며; X6은 P, A, L, I, S, Q, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, 또는 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산이고; X7은 H, K 및 R과 같은 양성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이며; X8은 P, L, S, T, 또는 D 및 E와 같은 산성 아미노산, N및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 카텝신 L 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 416을 포함하며, 여기에서 X1은 G, A, Q, E, 또는 K이고; X2는 G, P, L, 또는 F이며; X3은 L, V, F, 또는 Y이고; X4는 G, A, F, T, Q, E, K, 또는 R이고; X5는 A, S, Q, E, K, 또는 R이며; X6은 P, A, L, I, S, 또는 E이고; X7은 P, L, 또는 R이며; X8은 P, L, S, 또는 K이다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 카텝신 L 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 417, SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 419, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 423, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 425, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 427, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 429, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 431, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 435, SEQ ID NO: 436, SEQ ID NO: 437, SEQ ID NO: 438, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 440, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 442, 또는 SEQ ID NO: 443을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 PAR1 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "PAR1 분해 부위"는 PAR1 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 PAR1에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. PAR1에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, PAR1 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4(K/R)X5(SEQ ID NO: 444)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, H, W, 또는 Y와 같은 방향족 아미노산이며; X3은 선택적으로 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, H, W, 또는 Y와 같은 방향족 아미노산이고; X4는 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 F, W 또는 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이다. 표 4는 PAR1에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 445-452). 추가의 PAR1 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다.
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 PAR1 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, PAR1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 444를 포함하며, 여기에서 X1은 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, H, W, 또는 Y와 같은 방향족 아미노산이며; X3은 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, H, W, 또는 Y와 같은 방향족 아미노산이고; X4는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 F, W 또는 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, PAR1 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 444를 포함하며, 여기에서 X1은 S, T 또는 G이고; X2는 F 또는 Y이며; X3은 L, P, 또는 F이고; X4는 A, G, I, 또는 L이고; X5는 F 또는 N이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, PAR1 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 450, SEQ ID NO: 451, 또는 SEQ ID NO: 452를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 PAR2 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "PAR2 분해 부위"는 PAR2 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 PAR2에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. PAR2에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, PAR2 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4(K/R)X5(SEQ ID NO: 453)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이며; X3은 선택적으로 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이고; X4는 선택적으로 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 선택적으로 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이다. 표 4는 PAR2에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 454-455). 추가의 PAR2 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다.
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 PAR2 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, PAR2 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 453을 포함하며, 여기에서 X1은 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이며; X3은 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이고; X4는 G, P, A, V, L, I 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, PAR2 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 453을 포함하며, 여기에서 X1은 S이고; X2는 I 또는 L이며; X3은 I, 또는 L이고; X4는 A, 또는 G이고; X5는 L 또는 V이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, PAR2 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 454, 또는 SEQ ID NO: 455를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 PAR3 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "PAR3 분해 부위"는 PAR3 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 PAR3에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. PAR3에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, PAR3 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4X5X6(SEQ ID NO: 456)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 선택적으로 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이며; X3은 선택적으로 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산이고; X4는 선택적으로 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X5는 선택적으로 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산, 또는 D, N 또는 P와 같은 소형 극성 아미노산이며; X6은 선택적으로 D 및 E와 같은 산성 아미노산, 또는 D, N 또는 P와 같은 소형 극성 아미노산이다. 표 4는 PAR3에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 457-459). 추가의 PAR3 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다.
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 PAR3 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, PAR3 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 456을 포함하며, 여기에서 X1은 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산이며; X3은 N 및 Q와 같은 아미드성 아미노산, 또는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산이고; X4는 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X5는 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산, 또는 D, N 또는 P와 같은 소형 극성 아미노산이며; X6은 D 및 E와 같은 산성 아미노산, 또는 D, N 또는 P와 같은 소형 극성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, PAR3 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 456을 포함하며, 여기에서 X1은 S 또는 T이고; X2는 F이며; X3은 N 또는 R이고; X4는 A 또는 G이고; X5는 A, G 또는 N이며; X6은 P 또는 E이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, PAR3 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 458, 또는 SEQ ID NO: 459를 포함한다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로, 불활성화 분해 부위로서 PAR4 분해 부위를 기술한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "PAR4 분해 부위"는 PAR4 프로테아제 활성에 적합한 조건 하에서 PAR4에 의한 절단가능한 결합에서의 검출가능한 단백분해에 충분한, 인접하거나 비-인접한 인지 요소 또는 둘 다를 포함하는 절단가능한 결합을 나타낸다. PAR4에 의해서 분해된 어떤 아미노산 서열이라도 본 명세서의 측면들에서 유용할 수 있는 것으로 생각된다. 예외들이 알려져 있지만, PAR4 분해 부위에 대한 일반화된 공통 서열은 X1X2X3X4(K/R/Q/F)X5(SEQ ID NO: 460)이며, 여기에서 X1은 선택적으로 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 선택적으로 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, H, W, 또는 Y와 같은 방향족 아미노산이며; X3은 선택적으로 G, P, A, V, L, I, 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 선택적으로 G, P, A, V, L, I, 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 선택적으로 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W, 또는 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I, 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 표 4는 PAR4에 대한 예시적인 기준 분해 부위를 열거한다(SEQ ID NO: 461-478). 추가의 PAR4 분해 부위는 본 기술분야에서 잘 알려져 있거나, 일상적인 방법에 의해서 정의될 수 있다.
따라서, 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 PAR4 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, PAR4 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 460을 포함하며, 여기에서 X1은 A, C, G, S 및 T와 같은 소형 비-극성 아미노산이고; X2는 F, I, L, M, V와 같은 대형 비-극성 아미노산, 또는 F, H, W, 또는 Y와 같은 방향족 아미노산이며; X3은 G, P, A, V, L, I, 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X4는 G, P, A, V, L, I, 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이고; X5는 K 및 R과 같은 염기성 아미노산, F, W, 또는 Y와 같은 방향족 소수성 아미노산, 또는 G, P, A, V, L, I, 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산이다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, PAR4 분해 부위는 공통 서열 SEQ ID NO: 460을 포함하며, 여기에서 X1은 A, G, S 또는 T이고; X2는 F 또는 Y이며; X3은 A 또는 P이고; X4는 A 또는 G이고; X5는 A, V, P, F, W, Y 또는 K이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, PAR4 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 462, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, 또는 SEQ ID NO: 478을 포함한다.
불활성화 분해 부위의 위치는 여러 기준에 의해 좌우되는 중요한 측면이다. 첫째, 불활성화 분해 부위의 배치는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 그의 표적 세포를 중독시킬 수 있는 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않아야 한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 중독과 관련하여 용어 "실질적으로 영향을 미치지 않는" 것은 전반적인 중독 기전을 실행할 수 있음으로써, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 표적 세포에 세포내이입하고, 표적 기질을 단백분해적으로 분해하여, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 저친화도 또는 고친화도 수용체 컴플렉스로 결합하는 것, 독소/수용체 컴플렉스의 내재화, 경쇄의 세포질로의 전위, 및 표적 기질의 효소적 변형을 포함하는, 본 명세서의 상세한 설명에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 의미한다.
이 구체예의 한 측면에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 변형이 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭과 같은 정도로 표적 세포를 중독시킬 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 변형이 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭과 같은 정도, 예를 들면 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%까지 표적 세포를 중독시킬 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 변형없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭과 같은 정도, 예를 들면 최대 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%까지 표적 세포를 중독시킬 수 있다.
둘째, 불활성화 분해 부위의 배치는 상기 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 표면 노출 부분에 있어야 하며, 단백질 내부로 묻히지 않거나, 또는 2차 구조 요소들에 의해 가려지지 않아야 한다. 불활성화 분해 부위의 적당한 표면 노출은 상기 부위가 이것의 해당 프로테아제에 적당하게 접속하는 것을 용이하게 함으로써 단백분해적 분해를 가능하게 한다. 해당 프로테아제에 의한 상기 불활성화 분해 부위의 단백분해적 분해는 세포를 중독시킬 수 있는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 능력을 실질적으로 불활성화시킨다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 중독과 관련하여, 용어 "실질적으로 불활성화시키는" 것은 불활성화 분해 부위에서 분해한 후 전반적인 중독 기전을 실행시킬 수 있는 감소된 능력을 가짐으로써, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 표적 세포에 세포내이입하고, 표적 기질을 단백분해적 분해하여, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 저친화도 또는 고친화도 수용체 컴플렉스로 결합하는 것, 독소/수용체 컴플렉스의 내재화, 경쇄의 세포질로의 전위, 및 표적 기질의 효소적 변형을 포함하는 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 의미한다.
이 구체예의 한 측면에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 불활성화 분해 부위에서 단백분해적으로 분해하면, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭과 대조적으로, 독소가 표적세포를 중독시키는 능력이 완전히 무능해지지만, 단백분해적 비분해 상태(즉, 중독 분해 부위가 온전하거나, 또는 분해되지 않은 상태)에서는 그렇지 않다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 불활성화 분해 부위에서의 단백분해적 분해는 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭과 대조적으로 표적 세포를 중독시킬 수 있는 능력을 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 감소시키지만, 단백분해적 비분해 상태에서는 그렇지 않다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 불활성화 분해 부위에서의 단백분해적 분해는 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭과 대조적으로 표적 세포를 중독시킬 수 있는 능력을 예를 들면, 최대 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 감소시키지만, 단백분해적 비분해 상태에서는 그렇지 않다.
본 명세서의 한 측면에서, 불활성화 분해 부위는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "불활성화 분해 부위 부분"은 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형될 수 있는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 아미노산 서열을 의미하며, 상기 변형은 단백질의 표적 세포 중독능력을 실질적으로 방해하지 않을 것이므로; 및 동족 프로테아제에 노출시에 불활성화 분해 부위가 분해되어, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 실질적으로 불활성화시킬 것이다. 불활성화 분해 부위의 위치는 이 위치가 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 표적 세포 중독능력에 실질적으로 악영향을 미치지 않을 조건에서, 불활성화 분해 부위 부분내에 어디에나 있을 수 있으며; 동족 프로테아제에 노출시에 불활성화 분해 부위의 분해는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 실질적으로 불활성화시킬 것이다. 표 5는 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭과 함께 사용하기에 적당한 예시적인 불활성화 분해 부위를 개시한다.
따라서, 이 구체예에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 결합 서브영역으로부터 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 462-496; SEQ ID NO: 3의 아미노산 458-492; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 464-487; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 463-496; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 458-491; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 434-467; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 453-486; SEQ ID NO: 21의 아미노산 458-491; SEQ ID NO: 22의 아미노산 475-508; SEQ ID NO: 23의 아미노산 443-476; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 434-467을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 618-634; SEQ ID NO: 3의 아미노산 614-630; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 605-621; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 613-629; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 609-625; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 587-603; SEQ ID NO: 18의 아미노산 604-620; SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 605-621; SEQ ID NO: 21의 아미노산 610-626; SEQ ID NO: 22의 아미노산 627-643; SEQ ID NO: 23의 아미노산 596-612; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 587-603을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
표5. 클로스트리듐 독소의 불활성화 분해 부위 부분들
|
독소
|
SEQ ID NO: |
불활성화 분해 부위 부분들
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
8
|
BoNT/A |
1 |
L462- L496 |
T618- I634 |
G638- D651 |
L665- N687 |
N752- N765 |
N826- D835 |
T844- L863 |
K871- A895 |
BoNT/B |
2 |
L464- P487 |
A605- V621 |
G625- N638 |
L652- N674 |
N739- D752 |
N813- A824 |
Y831- I850 |
S858- G882 |
BoNT/C1 |
3 |
L463- S496 |
I613- I629 |
G633- N646 |
L660- E682 |
K747- Q760 |
H821- D830 |
S839- K858 |
N866- N890 |
BoNT/D |
4 |
L458- S491 |
I609- I625 |
G629- N642 |
L656- E678 |
K743- Q756 |
H817- D826 |
S835- K854 |
N862- N886 |
BoNT/E |
5 |
L434- D467 |
A587- V603 |
G607- N620 |
L634- N659 |
N724- D739 |
H800- Q809 |
T818- I837 |
K845- D869 |
BoNT/F |
6 |
L453- N486 |
A605- V621 |
G625- N638 |
L652- N677 |
N742- N757 |
H818- N827 |
T836- I855 |
K863- G887 |
BoNT/G |
7 |
L458- S491 |
S610- I626 |
G630- N643 |
M657- N679 |
N744- D757 |
N818- N827 |
H836- I855 |
S863- G887 |
TeNT |
8 |
L475- S508 |
S627- V643 |
G647- N660 |
L674- Q696 |
K761- E774 |
N835- K844 |
V854- V871 |
V879- N903 |
BaNT |
9 |
L443-N476 |
A596- V612 |
G616- N629 |
L643- S668 |
N733- N748 |
N809- P819 |
T828- I847 |
K855- G879 |
BuNT |
10 |
L434- D467 |
A587- V603 |
G607- N620 |
L634- S659 |
N724- D739 |
H800- Q809 |
T818-I837 |
K845- D869 |
이 구체예의 또 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 638-651; SEQ ID NO: 3의 아미노산 634-647; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 625-638; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 633-646; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 629-642; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 607-620; SEQ ID NO: 18의 아미노산 624-637; SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 625-638; SEQ ID NO: 21의 아미노산 630-643; SEQ ID NO: 22의 아미노산 647-660; SEQ ID NO: 23의 아미노산 616-629; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 607-620을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 665-687; SEQ ID NO: 3의 아미노산 661-683; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 652-674; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 660-682; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 656-678; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 634-659; SEQ ID NO: 18의 아미노산 651-676; SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 652-677; SEQ ID NO: 21의 아미노산 657-679; SEQ ID NO: 22의 아미노산 674-696; SEQ ID NO: 23의 아미노산 643-668; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 634-659를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 752-765; SEQ ID NO: 3의 아미노산 748-761; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 739-752; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 747-760; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 743-756; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 724-739; SEQ ID NO: 18의 아미노산 741-756; SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 742-757; SEQ ID NO: 21의 아미노산 744-757; SEQ ID NO: 22의 아미노산 761-774; SEQ ID NO: 23의 아미노산 733-748; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 724-739를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 826-835; SEQ ID NO: 3의 아미노산 824-831; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 813-824; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 821-830; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 817-826; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 800-809; SEQ ID NO: 18의 아미노산 817-826; SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 818-827; SEQ ID NO: 21의 아미노산 818-827; SEQ ID NO: 22의 아미노산 835-844; SEQ ID NO: 23의 아미노산 809-819; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 800-809를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 844-863; SEQ ID NO: 3의 아미노산 840-859; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 831-850; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 839-858; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 835-854; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 818-837; SEQ ID NO: 18의 아미노산 835-854; SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 836-855; SEQ ID NO: 21의 아미노산 836-855; SEQ ID NO: 22의 아미노산 854-871; SEQ ID NO: 23의 아미노산 828-847; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 818-837을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 871-895; SEQ ID NO: 3의 아미노산 867-891; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 858-882; SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 866-890; SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 862-886; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 845-869; SEQ ID NO: 18의 아미노산 862-886; SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 863-887; SEQ ID NO: 21의 아미노산 863-887; SEQ ID NO: 22의 아미노산 879-903; SEQ ID NO: 23의 아미노산 855-879; 또는 SEQ ID NO: 24 또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 845-869를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/A 또는 BoNT/A 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/A 또는 BoNT/A 키메릭은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 462-496, 618-634, 638-651, 665-687, 752-765, 826-835, 844-863 또는 871-895를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분; 또는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 458-492, 614-630, 634-647, 665-687, 748-761, 822-831, 840-859 또는 867-891을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/A는 SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 534, 또는 SEQ ID NO: 536에 의해 코드화된다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/A는 SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 535 또는 SEQ ID NO: 537을 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/B 또는 BoNT/B 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/B 또는 BoNT/B 키메릭은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 464-487, 605-621, 625-638, 652-674, 739-752, 813-824, 831-850 또는 858-882를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/C1 또는 BoNT/C1 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/C1 또는 BoNT/C1 키메릭은 SEQ ID NO: 11 또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 463-496, 613-629, 633-646, 660-682, 747-760, 821-830, 839-858 또는 866-890을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/D 또는 BoNT/D 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/D 또는 BoNT/D 키메릭은 SEQ ID NO: 13 또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 458-491, 609-625, 629-642, 656-678, 743-756, 817-826, 835-854 또는 862-886을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/E 또는 BoNT/E 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/E 또는 BoNT/E 키메릭은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837 또는 845-869를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/F 또는 BoNT/F 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/F 또는 BoNT/F 키메릭은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 453-486, 604-620, 624-637, 651-676, 741-756, 817-826, 835-854 또는 862-886을 포함하는; 또는 SEQ ID NO: 19 또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 453-486, 605-621, 625-638, 652-677, 742-757, 818-827, 836-855 또는 863-887을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/G 또는 BoNT/G 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BoNT/G 또는 BoNT/G 키메릭은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 458-491, 610-626, 630-643, 657-679, 744-757, 818-827, 836-855 또는 863-887을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 TeNT 또는 TeNT 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 TeNT 또는 TeNT 키메릭은 SEQ ID NO: 22의 아미노산 475-508, 627-643, 647-660, 674-696, 761-774, 835-844, 854-871 또는 879-903을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BaNT 또는 BaNT 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BaNT 또는 BaNT 키메릭은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 443-476, 596-612, 616-629, 643-668, 733-748, 809-819, 828-847 또는 855-879를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 본 명세서에 개시된 BuNT 또는 BuNT 키메릭은 전위 영역 또는 HCN 서브영역으로부터의 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 BuNT 또는 BuNT 키메릭은 SEQ ID NO: 25의 아미노산 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837 또는 845-869를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함한다.
본 명세서의 한 측면에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대한 안전역보다 큰 안전역을 가진다. 즉, 불활성화 분해 부위를 첨가하면, 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역이 증가된다.
따라서, 한 구체예에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 큰 안전역을 가진다. 이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 예를 들면, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 또는 적어도 300%보다 큰 안전역을 가진다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 예를 들면, 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%, 최대 80%, 최대 90%, 최대 100%, 최대 110%, 최대 120%, 최대 130%, 최대 140%, 최대 150%, 최대 160%, 최대 170%, 최대 180%, 최대 190%, 최대 200%, 최대 210%, 최대 220%, 최대 230%, 최대 240%, 최대 250%, 최대 260%, 최대 270%, 최대 280%, 최대 290%, 또는 최대 300%보다 큰 안전역을 가진다. 본 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 예를 들면, 약 10% ~ 약 300%, 약 20% ~ 약 300%, 약 30% ~ 약 300%, 약 40% ~ 약 300%, 약 50% ~ 약 300%, 약 60% ~ 약 300%, 약 70% ~ 약 300%, 약 80% ~ 약 300%, 약 90% ~ 약 300% 또는 약 100% ~ 약 300% 이상인 안전역을 가진다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 예를 들어 적어도 1-배, 적어도 1-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배 또는 적어도 10-배 이상인 안전역을 가진다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 예를 들어 적어도 1-배, 최대 1-배, 최대 3-배, 최대 4-배, 최대 5-배, 최대 6-배, 최대 7-배, 최대 8-배, 최대 9-배 또는 최대 10-배 이상인 안전역을 가진다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 예를 들어, 약 1-배 ~ 약 10-배, 약 1-배 ~ 약 9-배, 약 1-배 ~ 약 8-배, 약 1-배 ~ 약 7-배, 약 1-배 ~ 약 6-배, 약 1-배 ~ 약 5-배, 약 2-배 ~ 약 10-배, 약 2-배 ~ 약 9-배, 약 2-배 ~ 약 8-배, 약 2-배 ~ 약 7-배, 약 2-배 ~ 약 6-배 또는 약 2-배 ~ 약 5-배 이상인 안전역을 가진다.
다른 구체예에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 증가시키는 불활성화 분해 부위 첨가를 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 예를 들어, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 또는 적어도 300%까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을, 예를 들어 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%, 최대 80%, 최대 90%, 최대 100%, 최대 110%, 최대 120%, 최대 130%, 최대 140%, 최대 150%, 최대 160%, 최대 170%, 최대 180%, 최대 190%, 최대 200%, 최대 210%, 최대 220%, 최대 230%, 최대 240%, 최대 250%, 최대 260%, 최대 270%, 최대 280%, 최대 290%, 또는 최대 300% 까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 예를 들어 약 10% ~ 약 300%, 약 20% ~ 약 300%, 약 30% ~ 약 300%, 약 40% ~ 약 300%, 약 50% ~ 약 300%, 약 60% ~ 약 300%, 약 70% ~ 약 300%, 약 80% ~ 약 300%, 약 90% ~ 약 300% 또는 약 100% ~ 약 300%까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함한다.
이 구체예의 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 예를 들어, 적어도 1-배, 적어도 1-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배 또는 적어도 10-배까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 예를 들어, 최대 1-배, 최대 3-배, 최대 4-배, 최대 5-배, 최대 6-배, 최대 7-배, 최대 8-배, 최대 9-배 또는 최대 10-배까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 또는 유사한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 예를 들어, 약 1-배 ~ 약 10-배, 약 1-배 ~ 약 9-배, 약 1-배 ~ 약 8-배, 약 1-배 ~ 약 7-배, 약 1-배 ~ 약 6-배, 약 1-배 ~ 약 5-배, 약 2-배 ~ 약 10-배, 약 2-배 ~ 약 9-배, 약 2-배 ~ 약 8-배, 약 2-배 ~ 약 7-배, 약 2-배 ~ 약 6-배 또는 약 2-배 ~ 약 5-배까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함한다.
다른 구체예에서, 불활성화 분해 부위 부분은 단일 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 불활성화 분해 부위 부분은 복수의 불활성화 분해 부위들을 포함하도록 변형될 수 있다. 이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위 분해 부위 부분은 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 불활성화 분해 부위들을 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위 분해 부위 부분은 예를 들어, 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 불활성화 분해 부위들을 포함할 수 있다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 불활성화 분해 부위 분해 부위 부분은 예를 들어, 2-10개의 불활성화 분해 부위들, 2-8개의 불활성화 분해 부위들, 2-6개의 불활성화 분해 부위들, 2-4개의 불활성화 분해 부위들, 2-3개의 불활성화 분해 부위들, 3-9개의 불활성화 분해 부위들, 3-7개의 불활성화 분해 부위들, 3-5개의 불활성화 분해 부위들 또는 3-4개의 불활성화 분해 부위들을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 불활성화 분해 부위 부분은 예를 들어, 트롬빈 분해 부위와 같은 한 종류의 불활성화 분해 부위만을 포함하도록 변형될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 불활성화 분해 부위 부분은 트롬빈 분해 부위, 인자 Xa 분해 부위, MMP-2 분해 부위 및 MMP-9 분해 부위와 같은 복수의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들을 포함하도록 변형될 수 있다. 이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 예를 들어, 적어도 2, 3, 4 또는 5개의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들을 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 예를 들어, 최대 2, 3, 4 또는 5개의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들을 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 예를 들어, 2-5개의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들, 2-4개의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들, 2-3개의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들, 3-5개의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들 또는 3-4개의 다른 종류의 불활성화 분해 부위들을 포함할 수 있다.
불활성화 분해 부위를 포함하도록 불활성화 분해 부위 부분들을 변형시키는 것은 불활성화 분해 부위 부분내에서 아미노산들 중 적어도 하나를 변경시킴으로써 수행될 수 있다. 아미노산 변경법의 비-제한적인 예로는 아미노산의 결실, 아미노산의 첨가, 또는 다른 아미노산에 의한 원 아미노산의 치환이 포함된다. 이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 불활성화 분해 부위 부분내에서 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산들을 변경시킴으로써 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형된다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 불활성화 분해 부위 부분내에서 예를 들어, 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산들을 변경시킴으로써 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형된다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 예를 들어, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-5개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-4개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-3개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-2개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 2-5개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 2-4개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 2-3개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 3-5개의 아미노산들, 또는 불활성화 분해 부위 부분내에서 4-5개의 아미노산들을 변경시킴으로써 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형된다.
이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 불활성화 분해 부위 부분내에서 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산들을 결실, 첨가, 치환 또는 이들을 조합함으로써, 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형된다. 이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 불활성화 분해 부위 부분내에서 예를 들어, 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산들을 결실, 첨가, 치환 또는 이들을 조합함으로써, 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형된다. 이 구체예의 측면들에서, 불활성화 분해 부위 부분은 예를 들어, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-5개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-4개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-3개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 1-2개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 2-5개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 2-4개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 2-3개의 아미노산들, 불활성화 분해 부위 부분내에서 3-5개의 아미노산들 또는 불활성화 분해 부위 부분내에서 4-5개의 아미노산들을 결실, 첨가, 치환 또는 이들을 조합함으로써, 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형된다.
불활성화 분해 부위를 포함하도록 불활성화 분해 부위 부분을 변형시키는 것은 당 분야의 기술을 가진 자에게 공지된 표준 돌연변이생성 과정들을 사용하여 얻어질 수 있다. 돌연변이생성 과정들뿐만 아니라 특성화 제제들, 조건들 및 프로토콜들의 비-제한적인 예들은 BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; 및 Stratagene, La Jolla, CA를 포함하는 상업용 판매사로부터 쉽게 입수 가능하며, 이에 제한되지는 않는다. 이들 프로토콜들은 당 분야에 기술을 가진 자의 범주내의 과정들, 및 본 명세서의 과정들이다.
위에서 언급한 바와 같이, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 디설파이드 루프 부분내에서 단백분해적 절단에 의해 분해되는 단일쇄 폴리펩티드들로서 해독된다. 이 해독후 프로세싱은 단일 디설파이드 결합 및 비공유 상호작용을 사용하여 함께 유지되는 디-쇄 분자를 생성한다. 디설파이드 루프 부분내 단백분해적 절단은 디-쇄 루프 부분내에서 자연발생하는 내인성 프로테아제 분해 부위들을 사용함으로써, 또는 외인성 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 디-쇄 루프 부분을 조작함으로써 수행될 수 있다.
본 명세서의 측면들은 디-쇄 루프 부분을 부분적으로 개시한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "디-쇄 루프 부분"은 단일-쇄 형태의 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 그의 디-쇄 형태로 전환하기 위해 사용되는 프로테아제 분해 부위를 함유하고 시스테인 아미노산에 의해 측면에 배치된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 아미노산 서열을 의미한다(표 6). 디-쇄 루프 부분의 비-제한적인 예로는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 430-454를 포함하는 BoNT/A의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 2의 아미노산 437-446을 포함하는 BoNT/B의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 3의 아미노산 437-453을 포함하는 BoNT/C1의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 4의 아미노산 437-450을 포함하는 BoNT/D의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 5의 아미노산 412-426을 포함하는 BoNT/E의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 6의 아미노산 429-445를 포함하는 BoNT/F의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 7의 아미노산 436-450를 포함하는 BoNT/G의 디-쇄 루프 부분; 및 SEQ ID NO: 8의 아미노산 439-467을 포함하는 TeNT의 디-쇄 루프 부분이 포함된다(표 6).
표 6. 디-쇄 루프 부분
|
독소
|
자연-발생 프로테아제 분해 부위를 함유하는 디-쇄 루프 부분
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BoNT/A |
CVRGIITSKTKSLDKGYNK*---ALNDLC |
BoNT/B |
CKSVK*--------------APGIC |
BoNT/C1 |
CHKAIDGRSLYNK*------TLDC |
BoNT/D |
CLRLTKNSR*---------DDSTC |
BoNT/E |
CKNIVSVKGIR*-------KSIC |
BoNT/F |
CKSVIPRKGTK*------APPRLC |
BoNT/G |
CKPVMYKNTGK*-------SEQC |
TeNT |
CKKIIPPTNIRENLYNRTA*SLTDLGGELC |
BaNT |
CKS-IVSKKGTK*------NSLC |
BuNT |
CKN-IVSVKGIR*------KSIC |
표시된 아미노산 서열은 다음과 같다: BoNT/A, SEQ ID NO: 1의 잔기 430-454; BoNT/B, SEQ ID NO: 2의 잔기 437-446; BoNT/C1, SEQ ID NO: 3의 잔기 437-453; BoNT/D, SEQ ID NO: 4의 잔기 437-450; BoNT/E, SEQ ID NO: 5의 잔기 412-426; BoNT/F, SEQ ID NO: 6의 잔기 429-445; BoNT/G, SEQ ID NO: 7의 잔기 436-450; TeNT, SEQ ID NO: 8의 잔기 439-467; BaNT, SEQ ID NO: 9의 잔기 421-435; 및 BuNT, SEQ ID NO: 10의 잔기 412-426. 별표(*)는 클로스트리듐 독소 프로테아제에 의해 분해되는 펩티드 결합을 가리킨다. |
따라서, 한 구체예에서, 디-쇄 루프 부분은 클로스트리듐 독소 디-쇄 루프 부분을 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 디-쇄 루프 부분은 예를 들어, BoNT/A 디-쇄 루프 부분, BoNT/B 디-쇄 루프 부분, BoNT/C1 디-쇄 루프 부분, BoNT/D 디-쇄 루프 부분, BoNT/E 디-쇄 루프 부분, BoNT/F 디-쇄 루프 부분, BoNT/G 디-쇄 루프 부분, TeNT 디-쇄 루프 부분, BaNT 디-쇄 루프 부분 또는 BuNT 디-쇄 루프 부분을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분은 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 430-454를 포함하는 BoNT/A 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 2의 아미노산 437-446을 포함하는 BoNT/B 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 3의 아미노산 437-453을 포함하는 BoNT/C1 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 4의 아미노산 437-450을 포함하는 BoNT/D 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 5의 아미노산 412-426을 포함하는 BoNT/E 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 6의 아미노산 429-445를 포함하는 BoNT/F 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 7의 아미노산 436-450을 포함하는 BoNT/G 디-쇄 루프 부분; 또는 SEQ ID NO: 8의 아미노산 439-467을 포함하는 TeNT 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 9의 아미노산 421-435를 포함하는 BaNT 디-쇄 루프 부분; 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 412-426을 포함하는 BuNT 디-쇄 루프 부분을 포함한다.본 명세서의 측면들은 부분적으로, 내인성 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위를 개시하고 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "내인성 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위"는 "자연발생 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위"와 동의어이며, 자연발생 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 디-쇄 루프 부분내에서 발견되는 자연발생 프로테아제 분해 부위를 의미하며, 예를 들어 클로스트리듐 독소 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위 이소형태 및 클로스트리듐 독소 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위 서브타입과 같은 자연발생 클로스트리듐 독소 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위 변이체들을 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 내인성 프로테아제 분해 부위의 비-제한적인 예로는, 예를 들어 BoNT/A 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/B 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/C1 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/D 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/E 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/F 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/G 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위 및 TeNT 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위가 포함된다.프로테아제의 정체는 현재 알려져 있지 않지만, 많은 클로스트리듐 독소들에 대한 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위는 측정되어 왔다. BoNT들에서, K448-A449에서의 분해는 BoNT/A의 단일 폴리펩티드 형태를 디-쇄 형태로 전환하며; K441-A442에서의 분해는 BoNT/B의 단일 폴리펩티드 형태를 디-쇄 형태로 전환하며; K449-T450에서의 분해는 BoNT/C1의 단일 폴리펩티드 형태를 디-쇄 형태로 전환하며; R445-D446에서의 분해는 BoNT/D의 단일 폴리펩티드 형태를 디-쇄 형태로 전환하며; R422-K423에서의 분해는 BoNT/E의 단일 폴리펩티드 형태를 디-쇄 형태로 전환하며; K439-A440에서의 분해는 BoNT/F의 단일 폴리펩티드 형태를 디-쇄 형태로 전환하며; 및 K446-S447에서의 분해는 BoNT/G의 단일 폴리펩티드 형태를 디-쇄 형태로 전환한다. A457-S458에서 TeNT의 단일 폴리펩티드 형태를 단백분해적 분해하면 디-쇄 형태가 형성된다. K431-N432에서 BaNT의 단일 폴리펩티드 형태를 단백분해적 분해하면 디-쇄 형태가 형성된다. R422-K423에서 BuNT의 단일 폴리펩티드 형태를 단백분해적 분해하면 디-쇄 형태가 형성된다. 상기 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위는 융합 단백질로서 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 조작가능하게-결합된다. 그러나, 디-쇄 루프내 추가의 분해 부위들이 분해되어, 손실된 작은 펩티드 단편을 발생시키는 것이 밝혀졌다는 것을 주목해야 한다. 비-제한적인 예로서, BoNT/A 단일-쇄 폴리펩티드가 궁극적으로 분해되어, 디-쇄 루프내 10개의 아미노산 단편들이 손실된다.
따라서, 한 구체예에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 내인성 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위를 포함하는 디-쇄 루프 부분을 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 내인성 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, BoNT/A 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/B 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/C1 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/D 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/E 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/F 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BoNT/G 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, TeNT 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, BaNT 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위, 또는 BuNT 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 내인성 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 아미노산 430-454를 포함하는 BoNT/A의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 2의 아미노산 437-446을 포함하는 BoNT/B의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 3의 아미노산 437-453을 포함하는 BoNT/C1의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 4의 아미노산 437-450을 포함하는 BoNT/D의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 5의 아미노산 412-426을 포함하는 BoNT/E의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 6의 아미노산 429-445를 포함하는 BoNT/F의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 7의 아미노산 436-450을 포함하는 BoNT/G의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 8의 아미노산 439-467을 포함하는 TeNT의 디-쇄 루프 부분; SEQ ID NO: 9의 아미노산 421-435를 포함하는 BaNT의 디-쇄 루프 부분; 또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 412-426을 포함하는 BuNT의 디-쇄 루프 부분을 포함한다.
본 명세서의 측면들은 외인성 프로테아제 분해 부위를 부분적으로 개시하고 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "외인성 프로테아제 분해 부위"는 "조작된 프로테아제 분해 부위", "비-자연발생 프로테아제 분해 부위" 또는 "비-천연 프로테아제 분해 부위"와 동의어이며, 자연발생 클로스트리듐 독소로부터 디-쇄 루프 부분내에 정상적으로 존재하지 않는 프로테아제 분해 부위를 의미한다. 디-쇄 루프 부분내 상기 조작된 또는 외인성 프로테아제 분해 부위들은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 단일-쇄 폴리펩티드 형태를 그의 디-쇄 형태로 전환시키는데 사용된다. 모든 및 일부 외인성 프로테아제 분해 부위들은 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 단일-쇄 폴리펩티드 형태를 그의 활성 디-쇄 형태로 전환시키기 위해 사용될 수 있으며, 본 명세서의 측면들을 실시하기 위해 사용될 수 있다고 생각된다. 외인성 프로테아제 분해 부위들의 비-제한적인 예로는, 예를 들어 식물 파파인 분해 부위, 곤충 파파인 분해 부위, 크러스타시안 파파인 분해 부위, 엔테로키나제 분해 부위, 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제 분해 부위, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 분해 부위, 담배식각바이러스(TEV) 프로테아제 분해 부위, 담배 베인 모틀링 바이러스(TVMV) 분해 부위, 서브틸리신 분해 부위 또는 하이드록실아민 분해 부위 또는 카스파제 3 분해 부위가 포함된다. 디-쇄 루프내에 위치한 조작된 프로테아제 분해 부위들은 예를 들면, Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 제7,419,676호, Dolly, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허 제7,422,877호, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허공개 제2008/0032930호, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허공개 제2009/0018081호, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허공개 제2009/0005313호, Steward, et al., Activatable Recombinant Neurotoxins, 미국 특허공개 제2009/0004224호에 기술되어 있으며; 이들은 각각 이에 의해서 그 전문이 참고로 포함된다.
외인성 프로테아제 분해 부위가 각각의 프로테아제에 의해 분해될 수 있다는 조건하에, 본 명세서의 측면들에서 특정 및 모든 길이의 외인성 프로테아제 분해 부위가 사용될 수 있다고 생각된다. 따라서, 이 구체예의 측면들에서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 적어도 60개의 아미노산; 또는 최대 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 적어도 60개의 아미노산들의 길이를 가질 수 있다.
한 구체예에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 외인성 프로테아제 분해 부위를 포함하는 디-쇄 루프 부분을 포함한다. 이 구체예의 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 식물 파파인 분해 부위, 곤충 파파인 분해 부위, 크러스타시안 파파인 분해 부위, 비-인간 엔테로키나제 분해 부위, 담배식각바이러스(TEV) 프로테아제 분해 부위, 담배 베인 모틀링 바이러스(TVMV) 분해 부위, 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제 분해 부위, 인간 엔테로바이러스 3C 프로테아제 분해 부위, 서브틸리신 분해 부위, 하이드록실아민 분해 부위, SUMO/ULP-1 프로테아제 분해 부위 및 비-인간 카스파제 3 분해 부위가 포함된다
이 구체예의 한 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 비-인간 엔테로키나제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 소 엔테로키나제 프로테아제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 480을 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 담배식각 바이러스 프로테아제 분해를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 컨센서스 서열 EX1X2YX3Q*G(SEQ ID NO: 481) 또는 EX1X2YX3Q*S(SEQ ID NO: 482)(여기에서, X1, X2 및 X3은 아미노산임)를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491 또는 SEQ ID NO: 492를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 담배 베인 모틀링 바이러스 프로테아제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 컨센서스 서열 X1X2VRFQ*G(SEQ ID NO: 493) 또는 X1X2VRFQ*S(SEQ ID NO: 494)(여기에서, X1 및 X2는 독립적으로 아미노산임)를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 497 또는 SEQ ID NO: 498을 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 컨센서스 서열 X1X2LFQ*GP(SEQ ID NO: 499)(여기에서, X1은 D 또는 E와 같은 산성 아미노산인 아미노산이며; 및 X2는 우선적으로 S, T, 및 G, P, A, V, L, I, 및 M과 같은 지방족 소수성 아미노산임)를 포함한다. 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 504 또는 SEQ ID NO: 505를 포함한다. 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 PRESCISSION®에 의해 분해된 인간 라이노바이러스 3C 프로테아제를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 서브틸리신 분해 부위를 포함한다. 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 컨센서스 서열 X1X2X3X4H*Y(SEQ ID NO: 506) 또는 X1X2X3X4YH*(SEQ ID NO: 507)(여기에서, X1, X2, X3 및 X4는 독립적으로 아미노산임)을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 509 또는 SEQ ID NO: 510을 포함한다. 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, GENENASE®에 의해 분해되는 서브틸리신 분해 부위를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 하이드록실아민 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 다이펩타이드 N*G를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 511 또는 SEQ ID NO: 512를 포함한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SUMO/ULP-1 프로테아제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 컨센서스 서열 GG*X1X2X3(SEQ ID NO: 513)(여기에서, X1, X2 및 X3은 독립적으로 아미노산임)을 포함한다. 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 514를 포함한다.
이 구체예의 한 측면에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 카스파제 3 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 비-인간 카스파제 3 프로테아제 분해 부위를 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, 컨센서스 서열 DX1X2D*X3(SEQ ID NO: 515)(여기에서, X1은 특정 아미노산이며, D 및 E와 같은 산성 아미노산이 바람직하며, X2는 특정 아미노산이고, X3은 아미노산이며, A, C, G, S 및 T와 같은 작은 비-극성 아미노산이 바람직함)을 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 디-쇄 루프 부분내에 위치한 외인성 프로테아제 분해 부위는 예를 들어, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 520 또는 SEQ ID NO: 521을 포함한다.
디-쇄 루프 부분은 자연발생 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위가 외인성 프로테아제 분해 부위에 의해 치환되도록 변형될 수 있다. 이 변형에서, 자연발생 디-쇄 루프 외인성 프로테아제 분해 부위는 동작불가능하게 되어서, 그의 프로테아제에 의해 분해될 수 없다. 외인성 프로테아제 분해 부위만 그의 해당 외인성 프로테아제에 의해 분해될 수 있다. 이 타입의 변형에서, 외인성 프로테아제 부위는 융합 단백질로서 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 동작가능하게 결합되며, 그 부위는 그의 각 외인성 프로테아제에 의해 분해될 수 있다. 외인성 프로테아제 분해 부위에 의해 내인성 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위를 치환하는 것은 내인성 부위의 분해 부위 위치에 접근하는 위치에서 외인성 부위가 조작되는 부위들을 치환하는 것이 될 수 있다. 외인성 프로테아제 분해 부위에 의해 내인성 디-쇄 루프 프로테아제 분해 부위를 치환하는 것은 외인성 부위가 내인성 부위의 분해 부위 위치(location)와 다른 위치(position)에서 조작되는 외인성 부위를 첨가하는 것이 될 수 있으며, 내인성 부위는 동작가능하도록 조작된다. 프로테아제 분해 부위의 위치 및 종류는 특정 결합 영역들이 유리 아미노-말단 또는 카복실-말단 아미노산을 필요로 하기 때문에 중요할 수 있다. 예를 들면, 펩타이드 결합 영역이 2개의 다른 영역들(예를 들면 도 4 참조) 사이에 위치하는 경우, 프로테아제 분해 부위의 선택기준은 그의 부위를 분해하는 프로테아제가 플러시 컷을 남기는지의 여부, 그의 수용체에 대하여 결합 영역을 선택적으로 결합하기 위해 필요한 결합 영역의 유리 아미노-말단 또는 카복실-말단을 노출시키는 것이다.
천연적으로 존재하는 프로테아제 분해 부위는 천연적으로 존재하는 디-쇄 루프 프로테아제에 의해 분해되는 펩티드 결합을 플랭킹하는 2개의 아미노산들 중 적어도 하나를 변경시킴으로써 동작불능하게 할 수 있다. 디-쇄 루프 부분의 2개의 시스테인 잔기들이 온전한 상태로 남아있고, 그 부분이 여전히 디설파이드 브릿지를 형성할 수 있다는 가정하게, 보다 광범위한 변경들이 이루어질 수 있다. 아미노산 변경의 비-제한적인 예로는 아미노산을 결실하거나, 또는 원래의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 것이 포함된다. 따라서, 한 구체예에서, 자연발생 프로테아제 분해 부위는 자연발생 프로테아제에 의해 분해되는 펩티드 결합을 플랭킹하는 2개의 아미노산들 중 적어도 하나를 포함하는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 개의 아미노산들을 변경시킴으로써 동작가능하게 된다. 다른 구체예에서, 자연발생 프로테아제 분해 부위는 자연발생 프로테아제에 의해 분해되는 펩티드 결합을 플랭킹하는 2개의 아미노산들 중 적어도 하나를 포함하는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개의 아미노산들을 변경시킴으로써 동작불능하게 된다.
본 명세서에 개시된 변형된 클로스트리듐 독소는 가요성 스페이서(flexible spacer)를 포함하는 가변 부분을 선택적으로 추가로 포함할 수 있다. 가요성 스페이서를 포함하는 가변 부분은 폴리펩타이드의 특성, 속성 또는 성질을 최적화하기 위해 폴리펩타이드 부분의 길이를 조정하기 위해 사용될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 1개 이상의 가요성 스페이서들을 나란히 포함하는 폴리펩타이드 부분은 프로테아제 분해 부위를 보다 잘 노출시키기 위해 사용될 수 있으며, 그럼으로써 프로테아제에 의해 이 부위를 제거하는 것이 용이해진다. 다른 비-제한적인 예로서, 1개 이상의 가요성 스페이서들을 나란히 포함하는 폴리펩타이드 부분은 펩타이드 결합 영역에 보다 잘 존재하도록 사용될 수 있으며, 그럼으로써 결합 영역이 그의 수용체에 결합하는 것이 용이해진다.
펩타이드를 포함하는 가요성 스페이서는 길이가 적어도 하나의 아미노산이며, A, C, G, S 및 T와 같은 작은 비-극성 아미노산과 같은, 소형 측쇄 R기들을 갖는 비하전된 아미노산들을 포함한다. 따라서, 한 구체예에서, 가요성 스페이서는 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산들; 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산들의 길이를 가질 수 있다. 또 다른 구체예에서, 가요성 스페이서는 예를 들어, 1-3개의 아미노산들 사이에, 2-4개의 아미노산들 사이에, 3-5개의 아미노산들 사이에, 4-6개의 아미노산들 사이에, 또는 5-7개의 아미노산들 사이에 있을 수 있다. 가요성 스페이서의 비-제한적인 예로는 예를 들어, GGG, GGGG(SEQ ID NO: 522) 및 GGGGS(SEQ ID NO: 523)와 같은 G-스페이서, 또는 AAA, AAAA(SEQ ID NO: 524) 및 AAAAT(SEQ ID NO: 525)와 같은 A-스페이서가 포함된다. 상기 가변 부분은 융합 단백질로서, 변형된 클로스트리듐 독소에 인-프레임 동작가능하게 결합된다.
따라서, 한 구체예에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 가요성 스페이서를 포함하는 가변 부분을 추가로 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 복수의 가요성 스페이서들을 나란히 포함하는 가변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 이 구체예의 측면들들에서, 가변 부분은 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 G-스페이서들; 또는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 G-스페이서들을 나란히 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 가변 부분은 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 A-스페이서들; 또는 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 A-스페이서들을 나란히 포함할 수 있다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 같은 가요성 스페이서들의 1개 이상의 복제본들, 다른 가변-스페이서 부분들의 1개 이상의 복제본들 또는 이들의 조합들을 포함하는 가변 부분을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 전반적인 중독 과정을 수행할 수 있다는 조건하에, 모든 위치에서 가요성 스페이서를 포함할 수 있다고 생각된다. 이 구체예의 측면들에서, 가요성 스페이서는 예를 들어, 효소 영역과 전위 영역, 효소 영역과 결합 영역, 효소 영역과 외인성 프로테아제 분해 부위 사이에 위치한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 가요성 스페이서는 예를 들어, 결합 영역과 전위 영역, 결합 영역과 효소 영역, 결합 영역과 외인성 프로테아제 분해 부위 사이에 위치한다. 이 구체예의 또 다른 측면들에서, 가요성 스페이서는 예를 들어, 전위 영역과 효소 영역, 전위 영역과 결합 영역, 전위 영역과 외인성 프로테아제 분해 부위 사이에 위치한다.
임의 성분의 비-제한적인 예로서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 에피토프-결합 부분을 추가로 포함할 수 있다. 에피토프-결합 부분은 예를 들어, 단백질 정제 및 단백질 시각화를 포함하는 광범위한 과정들에 사용될 수 있다. 상기 에피토프-결합 부분은 변형된 클로스트리듐 독소에 융합 단백질로서 인-프레임 동작가능하게-결합된다. 에피토프-결합 부분의 비-제한적인 예로는 예를 들어, FLAG, ExpressTM, 인간 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA), 인간 p62c-Myc 단백질(c-MYC), 수포성 구내염 바이러스 글리코단백질(VSV-G), 단순 헤르페스 바이러스(HSV)의 글리코단백질-D 전구체, V5, AU1 및 AU5; 예를 들어, 폴리히스티딘(HIS), 스트렙타비딘 결합 펩타이드(strep), 및 바이오틴 또는 바이오틴화 서열과 같은 친화도-결합; 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제의 글루타티온 결합 영역, 칼모듈린 결합 단백질의 칼모듈린 결합 영역 및 말토스 결합 단백질의 말토스 결합 영역과 같은 펩타이드-결합 부분들이 포함된다. 적당한 결합 펩타이드를 선택, 제조 및 사용하기 위한 특정 프로토콜들의 비-제한적인 예들은 예를 들어, Epitope Tagging, pp. 17.90-17.93(Sambrook and Russell, eds., MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Vol. 3, 3rd ed. 2001); ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL(Edward Harlow & David Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1998); 및 USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL: PORTABLE PROTOCOL NO.I(Edward Harlow & David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998)에 기술되어 있다. 게다가, 결합 펩타이드 뿐만 아니라 잘-특성화된 제제들, 조건들 및 프로토콜들의 비-제한적인 예는 BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; 및 Stratagene, La Jolla, CA를 포함하는(제한되지 않음) 상업적 판매사에서 쉽게 입수할 수 있다. 이들 프로토콜들은 당 분야에 기술을 가진 자의 범주 및 이들의 교시내용에 있는 정규과정들이다.
따라서, 한 구체예에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 에피토프-결합 부분을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 복수의 에피토프-결합 부분들을 추가로 포함할 수 있다. 이 구체예의 측면들에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5개의 에피토프-결합 부분들을 포함할 수 있다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 예를 들어, 최대 1, 2, 3, 4 또는 5개의 에피토프-결합 부분들을 포함할 수 있다. 이 구체예의 또 다른 측면에서, 변형된 클로스트리듐 독소는 같은 에피토프-결합 부분의 1개 이상의 복제본들, 다른 에피토프-결합 부분들의 1개 이상의 복제본들 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
에피토프-결합 부분의 위치는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 아미노 말단, 내부 또는 카복실 말단을 포함하는 다양한 위치에 있을 수 있으며, 여기에 제한되지는 않는다. 따라서, 한 구체예에서, 에피토프-결합 부분은 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 아미노-말단에 위치한다. 다른 구체예에서, 에피토프-결합 부분은 변형된 클로스트리듐 독소의 카복실-말단에 위치되어 있다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로 폴리뉴클레오타이드 분자들을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "폴리뉴클레오타이드 분자"는 "핵산 분자"와 동의어이며, 예를 들어, 라이보뉴클레오타이드 및 데옥시라이보뉴클레오타이드들과 같은 폴리머 형태의 뉴클레오타이드들을 의미한다. 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화할 수 있는 특정의 폴리뉴클레오타이드 분자들 및 모든 폴리뉴클레오타이드 분자들이 사용될 수 있으며, 이들은 자연발생 및 비-자연발생 DNA 분자들 및 자연발생 및 비-자연발생 RNA 분자들을 포함하며, 여기에 제한되지 않는다. 자연발생 및 비-자연발생 DNA 분자들의 비-제한적인 예로는 단일가닥 DNA 분자들, 이중가닥 DNA 분자들, 게놈 DNA 분자들, cDNA 분자들, 벡터 구조물들, 예를 들면 플라스미드 구조물, 파그미드 구조물, 박테리오파지 구조물, 레트로바이러스 구조물 및 인조 염색체 구조물들이 포함된다. 자연발생 및 비-자연발생 RNA 분자들의 비-제한적인 예로는 단일가닥 RNA, 이중가닥 RNA 및 mRNA가 포함된다.
본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제조하기 위해 제조될 필요가 있는, 잘 정립된 분자생물학 기술들은 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭, 제한효소 반응, 아가로스 겔 전기영동, 핵산 연결법, 박테리아 형질전환, 핵산 정제법, 핵산 시퀀싱 및 재조합-기반 기술들을 포함하며(이에 제한되지는 않음), 이들은 당 분야에 기술을 가진 자의 범주 및 이의 교시내용 안에 있는 정규 과정들이다. 변형된 클로스트리듐 독소를 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제조하는데 필요한 특정 프로토콜들의 비-제한적인 예들은 예를 들어, MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001); 및 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Frederick M. Ausubel et al., eds. John Wiley & Sons, 2004)에 기술되어 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제조하기 위해 사용가능한 상업용으로 사용가능한 제품들의 다양성은 널리 사용가능하다. 이들 프로토콜들은 당 분야에 기술을 가진 자의 범주 및 이의 교시내용 안에 있는 정규 과정들이다.
따라서, 한 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드 분자는 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화한다.
본 명세서의 또 다른 측면은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 제조하는 방법을 부분제공하며, 상기 방법은 세포내에서 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하는 단계를 포함한다. 본 명세서의 또 다른 측면은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 제조방법을 제공하며, 상기 방법은 세포내에서 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 발현 구조물을 도입하는 단계, 및 세포내에서 발현 구조물을 발현시키는 단계들을 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법들은 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 부분 포함한다. 본 명세서에 개시된 특정의 및 모든 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메라들은 본 명세서에 개시된 방법들을 사용하여 제조될 수 있다고 생각된다. 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 특정의 및 모든 폴리뉴클레오타이드 분자들은 본 명세서에 개시된 방법들을 사용하여 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 제조하는데 사용할 수 있다고 생각된다.
본 명세서에 개시된 방법들은 발현 구조물을 부분 포함한다. 발현 구조물은 세포 또는 세포-유리 추출물내에서 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하기에 유용한 발현 벡터에 동작가능하게-결합된 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다. 매우 다양한 발현 벡터들은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하기 위해 사용될 수 있으며, 바이러스 발현 벡터; 원핵 발현 벡터; 진핵 발현 벡터, 예를 들면 효모발현 벡터, 곤충발현 벡터, 및 포유류발현 벡터; 및 세포-유리 추출물 발현 벡터를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들의 측면들을 실시하기 위해 사용가능한 발현벡터들은 구조적, 조직-특이적, 세포-특이적 또는 유도성 프로모터 요소, 증가 요소 또는 둘 모두의 조절하에 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 발현하는 것들을 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 상기 발현 벡터들로부터 발현 구조물을 제조하고 그 발현 구조물을 사용하기 위한 잘-정립된 제제들 및 조건들에 따른 발현 벡터들의 비-제한적인 예들은 BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; 및 Stratagene, La Jolla, CA를 포함하는 상업용 판매사로부터 쉽게 입수할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 적당한 발현 벡터를 선택, 제조 및 사용하는 것은 본 발명의 교시내용으로부터 및 당 분야에 기술을 가진 자의 범주내에 있는 정규 과정들이다.
따라서, 이 구체예의 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 발현 벡터에 동작가능하게 결합된다. 이 구체예의 측면들에서, 발현벡터는 예를 들어, 바이러스 발현 벡터, 원핵 발현 벡터, 효모 발현 벡터, 곤충 발현 벡터 또는 포유류 발현 벡터이다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 세포-유리 추출물 발현 벡터에 동작가능하게 결합된다.
본 명세서에 개시된 방법들은 부분적으로 세포를 포함한다. 특정의 세포 및 모든 세포들이 사용될 수 있다고 생각된다. 따라서, 이 구체예의 측면들은 예를 들어, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 클로스트리디아 퍼프린겐스(Clostridia perfringens), 클로스트리디아 디피실(Clostridia difficile), 카울로박터 크레센투스(Caulobacter cressentus), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 메틸로박테리움 엑스토퀴엔스(Methylobacterium extorquens), 네이세리아 메닌기룰스(Neisseria meningirulls), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 휴도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens) 및 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)으로부터 유도된 것들과 같은 호기성, 미호기성, 호탄산가스성, 조건혐기성, 혐기성, 그람-음성 및 그람-양성 박테리아 세포들; 및 예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica), 피치아 안구스타(Pichia angusta), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 및 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica)로부터 유도된 것들과 같은 효모 균주들을 포함하는 진핵 세포들; 예를 들어, 스포돕테라 프루기퍼(Spodoptera frugiperda)다, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 및 만두카 섹타(Manduca sexta)로부터 유도된 것들과 같은, 곤충으로부터 유도된 곤충 세포 및 세포주들; 및 마우스, 쥐, 햄스터, 돼지, 소, 말, 영장류 및 인간으로부터 유도된 것들과 같은 포유류 세포들로부터 유도된 포유류 세포 및 세포주들을 포함한다. 세포주들은 미생물 및 세포 배양물들의 American Type Culture Collection, European Collection of Cell Cultures 및 German Collection으로부터 얻어질 수 있다. 적당한 세포주를 선택, 제조 및 사용하기 위한 특정 프로토콜들의 비-제한적인 예는 예를 들어, INSECT CELL CULTURE ENGINEERING(Mattheus F.A. Goosen et al. eds., Marcel Dekker, 1993); INSECT CELL CULTURES: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS(J.M. Vlak et al. eds., Kluwer Academic Publishers, 1996); Maureen A. Harrison & Ian F. Rae, GENERAL TECHNIQUES OF CELL CULTURE(Cambridge University press, 1997); CELL AND TISSUE CULTUREL: LABORATORY PROCEDURES(Alan Doyle et al eds., John Wiley and Sons, 1998); R. Ian Freshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE(Wiley-Liss, 4th ed. 2000); ANIMAL CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH(John R. W. Masters ed., Oxford University Press, 3rd ed. 2000); MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, supra, (2001); BASIC CELL CULTURE: A PRACTICAL APPROACH(John M. Davis, Oxford Press 2nd ed. 2002): 및 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, supra, (2004)에 기술되어 있다. 이들 프로토콜들은 당 분야에 기술을 가진 자의 범주 및 교시내용에 있는 정규 과정들이다.
본 명세서에 개시된 방법들은 세포에 폴리뉴클레오타이드 분자를 이입시키는 단계를 포함한다. 세포에 이입된 폴리뉴클레오타이드 분자는 세포에 의해 일시적으로 또는 안정적으로 유지될 수 있다. 스탠리-유지된 폴리뉴클레오타이드 분자들은 염색체외적이고, 자발적으로 복제하거나, 또는 세포의 염색체 물질로 통합되고, 비자발적으로 복제한다. 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 분자를 세포에 이입시키는 특정 및 모든 방법들이 사용될 수 있다고 생각된다. 세포에 폴리뉴클레오타이드 분자를 이입시키기 위해 사용가능한 방법들은 예를 들어, 염화칼슘-매개, 인산칼슘-매개, 다이에틸-아미노에틸(DEAE) 덱스트란-매개, 지질-매개, 폴리에틸렌이민(PEI)-매개, 폴리라이신-매개 및 폴리브렌-매개와 같은 화학물-매개 트랜스펙션 또는 형질전환; 예를 들어, 생분해성 입자전달, 마이크로주입, 원형질 융합 및 전기천공과 같은 물리적-매개 트랜스펙션 또는 형질전환; 및 예를 들어, 레트로바이러스-매개 트랜스펙션과 같은 바이러스-매개 트랜스펙션을 포함하며(예를 들어, Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells, pp. 16.1-16.62(Sambrook & Russell, eds., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Vol. 3, 3rd ed. 2001 참조), 이에 제한되지 않는다. 당 분야에 기술을 가진 자는 세포에 발현 구조물을 이입시키기 위한 특정 방법을 선택하는 것은 세포가 발현 구조물을 일시적으로 함유할 것인지의 여부 또는 세포가 발현 구조물을 안정적으로 함유할 것인지의 여부에 부분적으로 의존할 것임을 이해한다. 이들 프로토콜들은 당 분야에 지식을 가진 자의 범주 및 이의 교시내용에서 정규 과정들이다.
이 구체예의 한 측면에서, 화학물-매개 방법, 일명 트랜스펙션은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 세포 폴리뉴클레오타이드 분자를 세포에 이입시키기 위해 사용된다. 트랜스펙션의 화학물-매개 방법에서, 화학물 제제는 세포에 흡수되는 것을 용이하게 하는 핵산과 컴플렉스를 형성한다. 상기 화학물 제제들은 인산칼슘-매개(예를 들어, Martin Jordan & Florian Worm, Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate, 33(2) Methods 136-143 (2004) 참조); 다이에틸-아미노에틸(DEAE) 덱스트란-매개, 지질-매개, 양이온성 폴리머-매개, 예를 들면 폴리에틸렌이민(PEI)-매개 및 폴리라이신-매개 및 폴리브렌-매개(예를 들어, Chun Zhang et al, Polyethylenimine strategies for plasmid delivery to brain-derived cells, 33(2) Methods 144-150(2004) 참조)를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 상기 화학물-매개 전달 시스템은 표준 방법들에 의해 제조될 수 있으며, 상업용으로 시판가능하다(예를 들면, CellPhect Transfection Kit(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ); Mammalian Transfection Kit, Calcium phosphate and DEAE Dextran, (Stratagene, Inc., La Jolla, CA); LIPOFECTAMINETM Transfection Reagent(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); ExGen 500 Transfection kit(Fermentas, Inc., Hanover, MD) 및 SuperFect and Effectene Transfection Kits(Qiagen, Inc., Valencia, CA 참조).
이 구체예의 또 다른 측면에서, 물리적-매개 방법은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 세포에 이입시키기 위해 사용된다. 물리적 기술들로는 전기천공법, 생분해법 및 마이크로주입법이 포함되며, 여기에 제한되지 않는다. 생분해법 및 마이크로주입 기술들은 세포에 핵산분자를 이입시키기 위해 세포벽을 천공시키며, 예를 들어, Jeike E. Biewenga et al., Plasmid-mediated gene transfer in neurons using the biolistics technique, 71(1) J. Neurosci. Methods 67-75(1997); 및 John O'Brien & Sarah C. R. Lummis, Biolistic and diolistic transfection: using the gene gun to deliver DNA and lipophilic dyes into mammalian cells, 33(2) Methods 121-125(2004)을 참조한다. 전기천공법, 일명 전기침투법은 핵산분자들이 들어오는 막에서 일시적인 구멍들을 생성하기 위해 짧은 고전압의 전기펄스를 사용하고, 모든 세포타입의 안정적이고 일시적인 트랜스펙션을 위해 효과적으로 사용될 수 있으며, 에를 들어, M. Golzio et al., In vitro and in vivo electric field-mediated permeabilization, gene transfer, and expression, 33(2) Methods 126-135 (2004); 및 Oliver Greschet al., New non-viral method for gene transfer into primary cells, 33(2) Methods 151-163 (2004)를 참조한다.
이 구체예의 또 다른 측면에서, 바이러스-매개 방법, 일명 형질도입은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 세포내에 이입시키기 위해 사용된다. 일시적인 형질도입의 바이러스-매개 방법에서, 바이러스 입자가 숙주세포내에서 감염 및 복제하는 방법은 세포내에 폴리뉴클레오타이드 분자를 이입하기 위해 본 메카니즘에 사용하기 위해 조작될 수 있다. 바이러스-매개 방법들은 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 단순헤르페스 바이러스, 피코르나바이러스, 알파바이러스 및 배큘로바이러스를 포함(이에 제한되지는 않음)하는 매우 다양한 바이러스들로부터 개발되었으며, 예를 들어, Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); 및 Maurizio Federico, From lentiviruses to lentivirus vectors, 229 Methods Mol. Biol. 3-15 (2003); E. M. Poeschla, Non-primate lentiviral vectors, 5(5) Curr. Opin. Mol. Ther. 529-540 (2003); Karim Benihoud et al., Adenovirus vectors for gene delivery 10(5) Curr. Opin. Biotechnol. 440-447 (1999); H. Bueler, Adeno-associated viral vectors for gene transfer and gene therapy, 380(6) Biol. Chem. 613-622 (1999); Chooi M. Lai et al., Adenovirus and adeno-associated virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 895-913 (2002); Edward A. Burton et al., Gene delivery using herpes simplex virus vectors, 21(12) DNA Cell Biol. 915-936 (2002); Paola Grandi et al., Targeting HSV amplicon vectors, 33(2) Methods 179-186 (2004); Ilya Frolov et al., Alphavirus-based expression vectors: strategies and applications 93(21) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 11371-11377 (1996); Markus U. Ehrengruber, Alphaviral gene transfer in neurobiology, 59(1) Brain Res. Bull. 13-22 (2002); Thomas A. Kost & J. Patrick Condreay, Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors, 20(4) Trends Biotechnol. 173-180 (202); 및 A. Huser & C. Hofmann, Baculovirus vectors: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their applications, 3(1) Am. J. Pharmacogenomics 53-63 (2003)을 참조한다.
비-봉입형 이중가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스는 약 36kb의 비교적 큰 폴리뉴클레오타이드 분자들을 취급하기 때문에 포유동물 세포 형질도입을 위해 종종 선택되며, 높은 적정에서 제조되고, 다양한 분열 및 비-분열 세포들을 효과적으로 감염시킬 수 있으며, 예를 들어, Wim T. J. M. C. Hermens et al., Transient gene transfer to neurons and glia: analysis of adenoviral vector performance in the CNS and PNS, 71(1) Neurosci. Methods 85-98 (1997); 및 Hiroyuki Mizuguchi et al., Approaches for generating recombinant adenovirus vectors, 52(3) Adv. Drug. Rev. 165-176 (2001)을 참조한다. 아데노바이러스-계 시스템을 사용한 형질도입은 핵산분자가 숙주세포 염색체로 통합되기보다 세포 핵내 에피솜에 의해 운반되기 때문에 연장된 단백질 발현을 지지하지 않는다. 아데노바이러스 벡터 시스템 및 상기 벡터들을 사용하는 방법을 위한 특정 프로토콜들은 예를 들어, VIRAPOWERTM Adenoviral Expression System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and VIRAPOWERTM Adenoviral Expression System Instruction Manual 25-0543 version A, Invitrogen, Inc., (Jul. 15, 2002); 및 ADEASYTM Adenoviral Vector System (Stratagene, Inc., La Jolla, CA)과 ADEASYTM Adenoviral Vector System Instruction Manual 064004f, Stratagene, Inc.을 참조한다.
폴리뉴클레오타이드 분자 전달은 예를 들어, 온코레트로바이러스 및 렌티바이러스와 같은 단일-가닥 RNA 레트로바이러스를 사용할 수도 있다. 레트로바이러스-매개 형질도입은 종종 100%에 가까운 형질도입 효율을 내며, 세포들을 일시적으로 또는 안정하게 형질도입하기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어 Tiziana Tonini et al., Transient production of retroviral- and lentiviral-based vectors for the transduction of Mammalian cells, 285 Methods Mol. Biol. 141-148 (2004); Armin Blesch, Lentiviral and MLV based retroviral vectors for ex vivo and in vivo gene transfer, 33(2) Methods 164-172 (2004); Felix Recillas-Targa, Gene transfer and expression in mammalian cell lines and transgenic animals, 267 Methods Mol. Biol. 417-433 (2004); 및 Roland Wolkowicz et al., Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells, 246 Methods Mol. Biol. 391-411 (2004)를 참조한다. 레트로바이러스 입자들은 지질 외피에 의해 둘러싸인, 단백질 캡시드에 포장된 RNA 게놈으로 구성되어 있다. 레트로바이러스는 역전사효소를 따라 세포질로 그의 RNA를 주입함으로써 숙주 세포를 감염시킨다. 그후, RNA 주형이 직쇄상 이중 가닥 cDNA로 역전사되어, 숙주 세포 게놈으로 삽입함으로써 그 자체를 복제한다. 바이러스 입자들은 모두 (프로바이러스를 통해 모세포로부터 딸세포까지) 수직으로뿐만 아니라, (비리온들을 통해 세포로부터 세포까지) 수평으로 퍼진다. 이 복제 전략은 장기간 지속적인 발현을 가능하게 하는데, 그 이유는 그 핵산분자들이 숙주 세포의 염색체로 안정적으로 삽입되어, 단백질의 장기간 발현을 가능하게 하기 때문이다. 예를 들면, 동물 연구들은 조직의 다양한 조직들에 주입된 렌티바이러스 벡터들이 1년 이상동안 지속적인 단백질 발현을 생성한다는 것을 보여주었으며, 예를 들어, Luigi Naldini et al., In vivo gene delivery and stable transduction of non-dividing cells by a lentiviral vector, 272(5259) Science 263-267 (1996)을 참조한다. 예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV)와 같은 온코레트로바이러스-유도된 벡터 시스템이 널리 사용되며, 많은 다른 비-분열 세포들을 감염시킨다. 렌티바이러스들도 또한, 분열 및 비-분열 세포들을 포함하는 많은 다른 세포 타입들을 감염시킬 수 있으며, 복합 외피 단백질들을 가지고 있어서 매우 특이적인 세포 타겟팅이 가능하게 된다.
상기 벡터들을 사용하는 방법들을 위한 레트로바이러스 벡터 및 특정 프로토콜들은 예를 들어, Manfred Gossen & Hermann Bujard, Tight control of gene expression in eukaryotic cells by tetracycline-responsive promoters, 미국 특허 제5,464,758호(Nov. 7, 1995)와 Hermann Bujard & Manfred Gossen, Methods for regulating gene expression, 미국 특허 제5,814,618호(Sep. 29, 1998) David S. Hogness, Polynucleotides encoding insect steroid hormone receptor polypeptides and cells transformed with same, 미국 특허 제5,514,578호(May 7, 1996)와 David S. Hogness, Polynucleotide encoding insect ecdysone receptor, 미국 특허 제6,245,531호(Jun. 12, 2001); Elisabetta Vegeto et al., Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations, 미국 특허 제5,364,791호(Nov. 15, 1994), Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, 미국 특허 제5,874,534호(Feb. 23, 1999) 및 Elisabetta Vegeto et al., Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy, 미국 특허 제5,935,934호(Aug. 10, 1999)에 개시되어 있다. 그리고, 상기 바이러스 전달 시스템은 표준 방법으로 제조될 수 있으며, 상업용으로 입수가능하며, 예를 들면, BDTM Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems(BD Biosciences-Clonetech, Palo Alto, CA) 및 BDTM Tet-Off and Tet-On Gene Expression Systems User Manual, PT3001-1, BD Biosciences Clonetech, (mar. 14, 2003), GENESWITCHTM System (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) and GENESWITCHTM System A Mifepristone-Regulated Expresion System for Mammalian Cells version D, 25-0313, Invitrogen, Inc., (Nov. 4, 2002); VIRAPOWERTM Lentiviral Expression System Instruction Manual 25-0501 version E, Invitrogen, Inc., (Dec. 8, 2003); 및 COMPLETE CONTROL® Retroviral Inducible Mammalian Expression System(Stratagene, La Jolla, CA)과 COMPLETE CONTROL® Retroviral Inducible Mammalian Expression System Instruction Manual, 064005e를 참조한다.
본 명세서에 개시된 방법들은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 부분 발효하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 폴리뉴클레오타이드 분자로부터 발현하기 위해, 다양한 발현 시스템들이 사용될 수 있고, 이 시스템은 세포-계 시스템 및 세포-유리 발현 시스템들을 포함하고, 여기에 제한되지 않는다고 생각된다. 세포-계 시스템들은 바이러스 발현 시스템, 원핵 발현 시스템, 효모 발현 시스템, 배큘로바이러스 발현 시스템, 곤충 발현 시스템, 및 포유류 발현 시스템을 포함하며, 이들에 제한되지는 않는다. 세포-유리 시스템들은 밀 배아 추출물, 토끼 망상적혈구 추출물 및 대장균 (E. coli) 추출물을 포함하며(이에 제한되지는 않음), 일반적으로 본 명세서에 개시된 방법과 동일하다. 발현 시스템을 사용한 폴리뉴클레오타이드 분자의 발현은 유도성 발현, 비-유도성 발현, 구조적 발현, 바이러스-매개 발현, 안정적-통합형 발현 및 일시적 발현을 포함하여, 여러 다양한 특징들을 포함할 수 있으며, 여기에 제한되지 않는다. 잘-특성화된 벡터, 제제, 조건들 및 세포들을 포함하는 발현 시스템들은 잘-정립되어 있으며, Ambion, Inc. Austin, TX; BD Biosciences-Clontech, Palo Alto, CA; BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA; Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA; QIAGEN, Inc., Valencia, CA; Roche Applied Science, Indianapolis, IN; 및 Stratagene, La Jolla, CA를 포함하는(여기에 제한되지 않음) 상업용 판매사들로부터 쉽게 입수가능하다. 적당한 이종발현 시스템들의 선택 및 용도에 대한 비-제한적인 예들은 예를 들어, PROTEIN RXPRESSION. A PRACTICAL APPROACH (S.J. Higgins and B. David Hames eds., Oxford University Press, 1999); Joseph M. Fernandez & James P. Hoeffler, GENE EXPRESSION SYSTEMS. USING NATURE FOR THE ART OF EXPRESSION (Academic Press, 1999); 및 Meena Rai & Harish Padh, Expression Systems for Production of Heterologous Proteins, 80(9) CURRENT SCIENCE 1121-1128, (2001)에 기술되어 있다. 이들 프로토콜들은 당 분야에 기술을 가진 자의 범주 및 이의 교시내용에 있는 정규과정들이다.
본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하기 위해 다양한 세포-계 발현 과정들이 사용될 수 있다. 그 예로는 바이러스 발현 시스템, 원핵 발현 시스템, 효모 발현 시스템, 배큘로바이러스 발현 시스템, 곤충 발현 시스템 및 포유류 발현 시스템이 포함되며, 여기에 제한되지 않는다. 바이러스 발현 시스템은 VIRAPOWERTM Lentiviral(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), Adenoviral Expression Systems(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), ADEASYTM XL Adenoviral Vector System(Stratagene, La Jolla, CA) 및 VIRAPORT® Retroviral Gene Expression System(Stratagene, La Jolla, CA)를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 원핵 발현 시스템들의 비-제한적인 예로는 CHAMPIONTM pET Expression System(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), TRIEXTM Bacterial Expression System(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), QIAEXPRESS® Expression System(QIAGEN, Inc.), 및 AFFINITY® Protein Expression and Purification System(Stratagene, La Jolla, CA)이 포함된다. 효모 발현 시스템은 EASYSELECTTM Pichia Expression Kit(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), YES-ECHOTM Expression Vector Kits(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) 및 SPECTRATM S. pombe Expression System(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)을 포함한다. 배큘로바이러스 발현 시스템의 비-제한적인 예로는 BACULODIRECTTM (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), BAC-TO-BAC® (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), 그리고 BD BACULOGOLDTM (BD Biosciences-Pharmigen, San Diego, CA)가 포함된다. 곤충 발현 시스템은 Drosophila Expression System(DES®)(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), INSECTSELECTTM System(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) 및 INSECTDIRECTTM System(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 포유류 발현 시스템의 비-제한적인 예로는 T-REXTM (Tetracycline-Regulated Expression) System(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), FLP-INTM T-REXTM System(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), pcDNATM system(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), pSecTag2 system(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA), EXCHANGER® System, INTERPLAYTM Mammalian TAP System(Stratagene, La Jolla, CA), COMPLETE CONTROL® Inducible Mammalian Expression System(Stratagene, La Jolla, CA) 및 LACSWITCH® II Inducible Mammalian Expression System(Stratagene, La Jolla, CA)이 포함된다.
본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하는 다른 방법은 원핵 추출물 및 진핵 추출물과 같은 세포-유리 발현 시스템을 사용하며, 여기에 제한되지는 않는다. 원핵 세포 추출물의 비-제한적인 예로는 RTS 100 대장균(E. coli) HY Kit(Roche Applied Science, Indianapolis, IN), ActivePro In Vitro Translation Kit(Ambion, Inc., Austin, TX), ECOPROTM System(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI), 및 EXPRESSWAYTM Plus Expression System(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)가 포함된다. 진핵세포 추출물로는 RTS 100 Wheat Germ CECF Kit(Roche Applied Science, Indianapolis, IN), TNT® Coupled Wheat Germ Extract Systems(Promega Corp., Madison, WI), Wheat Germ IVTTM Kit(Ambion, Inc., Austin, TX), Retic Lysate IVTTM Kit(Ambion, Inc., Austin, TX) PROTEINSCRIPT® II System(Ambion, Inc., Austin, TX) 및 TNT® Coupled Reticulocyte Lysate Systems(Promega Corp., Madison, WI)가 포함되며, 여기에 제한되지 않는다.
본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 단일-쇄 형태의 세포에 의해 생성된다. 완전한 활성을 얻기 위해, 단일-쇄 형태는 그의 디-쇄 형태로 전환되어야 한다. 위에서 언급한 바와 같이, 이 전환방법은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 디-쇄 루프 부분내에 위치한 프로테아제 분해 부위를 분해함으로써 얻어진다. 이러한 전환방법은 특허문헌 Ghanshani, et al., Methods of Intracellular Conversion of single-Chain Proteins into their Di-chain Form, Attorney Docket No. 18469 PROV(BOT)에 기술된 바와 같이, 표준 시험관내 원핵 분해분석법 또는 세포-계 원핵 분해시스템을 사용하여 수행될 수 있으며, 이 문헌은 그 전문이 참고로 통합된다.
본 명세서의 측면들은 부분적으로는, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 조성물을 개시하고 있다. 추가의 측면에서, 조성물은 약제학적으로 허용가능한 조성물이다. 본 명세서에 사용된 용어 "약제학적으로 허용가능한"은 개인에게 투여될 때 부작용, 알레르기반응 또는 다른 부작용 또는 원치않는 반응을 내지 않는 분자성분 또는 조성물을 의미한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한 조성물"은 "약제학적 조성물"과 동의어이며, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메라와 같은 치료적으로 유효한 농도의 유효성분을 의미한다. 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 약제학적 조성물은 의료용도 및 수의용도로 사용가능하다. 약제학적 조성물은 환자에게 단독으로 투여될 수 있거나, 또는 다른 보충 유효성분들, 제제, 약물 또는 호르몬과 조합하여 투여될 수 있다. 약제학적 조성물은 종래의 혼합법, 용해법, 과립화, 당제, 분쇄, 유제, 캡슐화, 엔트랩핑, 및 동결건조를 포함하는 다양한 방법들을 사용하여 제조될 수 있으며, 여기에 제한되지 않는다. 약제학적 조성물은 멸균용액, 현탁액, 에멀젼, 동결건조물, 정제, 필, 펠릿, 캡슐, 분말, 시럽, 엘릭시르 또는 투여에 적당한 다른 투여형태를 포함하는 다양한 형태를 취할 수 있으며, 여기에 제한되지 않는다.
본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 조성물에 유효 성분을 처리하는 것을 용이하게 하는 약제학적으로 허용가능한 담체들을 선택적으로 함유할 수 있다고 생각된다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "약물학적으로 허용가능한 담체"는 "약물학적 담체"와 동의어이며, 투여될 때 실질적으로 장기간 또는 영구적으로 해로운 효과를 갖지 않는 담체를 의미하며, "약물학적으로 허용가능한 부형제, 안정화제, 희석제, 첨가제, 보조제 또는 첨가제"와 같은 용어들을 포함한다. 상기 담체는 일반적으로 유효 화합물과 혼합되거나, 또는 유효 화합물을 희석 또는 둘러싸도록 허용되며, 고형, 반-고형 또는 액체 제제일 수 있다. 유효성분이 가용성일 수 있거나, 또는 원하는 담체 또는 희석제내 현탁액으로서 전달될 수 있음을 이해하고 있다. 예를 들어, 물, 식염수, 글리신, 히알루론산 등과 같은 수성 매질; 예를 들어, 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린나트륨, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스, 탄산마그네슘 등과 같은 고형 담체; 용매; 분산 매질; 코팅제; 항균제 및 항진균제; 등장성 및 흡수지연제; 또는 다른 불활성 성분을 포함하는 다양한 약제학적으로 허용가능한 담체들이 사용될 수 있으며, 여기에 제한되지는 않는다. 약제학적으로 허용가능한 담체의 선택은 투여방법에 따라 다를 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체가 유효 성분과 맞지않는 경우를 제외하고는, 약제학적 허용가능한 조성물에 있어서 사용하는 것을 고려한다. 상기 약제학적 담체의 특정 용도의 비-제한적인 예는 PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS(Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7th ed. 1999); REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY(Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20th ed. 2000); GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS(Joel G. Harman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10th ed. 2001); 및 HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL EXCIPIENTS(Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4th edition 2003)에서 찾아볼 수 있다. 이러한 프로토콜들은 정규 과정들이며, 특정 변형방법들은 당 분야에 지식을 가진 자의 범주 및 이의 교시 내용내에 잘 알려져 있다.
본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 버퍼, 방부제, 긴장성 조절제, 염, 산화방지제, 오스몰농도 조절제, 생리학적 물질, 약물학적 물질, 벌크제, 유화제, 습윤제, 감미제 또는 방향제 등을 포함(이에 제한되지는 않음)하는 다른 약제학적으로 허용가능한 성분들(또는 약제학적 성분들)을 선택적으로 포함(이에 제한되지는 않음)할 수 있음을 추가로 고려한다. 결과적으로 얻은 제제가 약제학적으로 허용가능하다는 조건하에, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물을 제조하기 위해 pH 조정을 위한 다양한 버퍼들이 사용될 수 있다. 상기 버퍼는 아세테이트 버퍼, 사이트레이트 버퍼, 포스페이트 버퍼, 중성 완충식염수, 인산완충식염수 및 보레이트 버퍼를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 필요에 따라, 조성물의 pH를 조정하기 위해 산 또는 염기가 사용될 수 있음을 이해한다. 약제학적으로 허용가능한 산화방지제로는 소듐 메타바이설파이트, 소듐 티오설페이트, 아세틸시스테인, 부틸화 하이드록시아니솔 및 부틸화 하이드록시톨루엔이 포함되며, 이에 제한되지는 않는다. 사용가능한 방부제로는, 벤즈알코늄 클로라이드, 클로로뷰테인올, 티머로살, 페닐머큐릭 아세테이트, 페닐머큐릭 나이트레이트, 안정화 옥시 클로로 조성물, 예를 들어, PURITE® 및 킬레이트제, 예를 들어 DTPA 또는 DTPA-비스아미드, 칼슘 DTPA 및 CaNaDTPA-비스아미드가 포함되며, 여기에 제한되지는 않는다. 약제학적 조성물에 사용가능한 긴장성 조절제로는 예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 만니톨 또는 글리세린 및 다른 약제학적으로 허용가능한 긴장성 조절제와 같은 염들을 포함하며, 여기에 제한되지는 않는다. 약제학적 조성물은 염으로 제공될 수 있으며, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산 및 숙신산을 포함하는 많은 다른 산들과 함께 형성될 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 염은 대응하는 유리 염기 형태와 다른 프로톤 용매 또는 수성 용매에 보다 잘 용해되도록 하는 경향이 있다. 이러한 및 다른 물질들은 당 분야에 알려져 있으며, 약물학 분야는 명세서에 사용가능한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다고 이해하고 있다.
한 구체예에서, 조성물은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함한다. 이 구체예의 한 측면에서, 조성물은 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 약제학적 조성물이다. 이 구체예의 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 약제학적 조성물은 약물학적 담체, 약제학적 성분 또는 약물학적 담체와 약제학적 성분 모두를 추가로 포함한다. 이 구체예의 다른 측면들에서, 본 명세서에 개시된 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 포함하는 약제학적 조성물은 적어도 하나의 약물학적 담체, 적어도 하나의 약제학적 성분 또는 적어도 하나의 약물학적 담체 및 적어도 하나의 약제학적 성분을 추가로 포함한다.
본 명세서의 측면들은 하기와 같이 설명될 수도 있다:
1. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 적어도 하나의 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치하며, 적어도 하나의 불활성화 분해 부위는 이중 트롬빈-트롬빈 부위, 인자 Xa 부위, 이중 인자 Xa-트롬빈 부위 및/또는 MMP-9 부위를 포함한다.
2. 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 클로스트리듐 독소 결합 영역, 디-쇄 루프 부분, 외인성 프로테아제 분해 부위 및, 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 적어도 2개의 불활성화 분해 부위들을 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치한다.
3. 측면 2의 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위는 이중 트롬빈-트롬빈 부위 및/또는 이중 인자 Xa-트롬빈 부위를 포함한다.
4. 클로스트리듐 독소 효소 영역, 클로스트리듐 독소 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역에 위치한다.
5. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 462-496; SEQ ID NO: 3의 아미노산 458-492; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 464-487; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 463-496; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 458-491; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 434-467; SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 453-486; SEQ ID NO: 21의 아미노산 458-491; SEQ ID NO: 23의 아미노산 443-476; 및/또는 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 434-467을 포함한다.
6. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 618-634; SEQ ID NO: 3의 아미노산 614-630; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 605-621; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 613-629; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 609-625; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 587-603; SEQ ID NO: 18의 아미노산 604-620; SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 605-621; SEQ ID NO: 21의 아미노산 610-626; SEQ ID NO: 23의 아미노산 596-612; SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 587-603을 포함한다.
7. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 638-651; SEQ ID NO: 3의 아미노산 634-647; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 625-638; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 633-646; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 629-642; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 607-620; SEQ ID NO: 18의 아미노산 624-637; SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 625-638; SEQ ID NO: 21의 아미노산 630-643; SEQ ID NO: 23의 아미노산 616-629; 및/또는 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 607-620을 포함한다.
8. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 665-687; SEQ ID NO: 3의 아미노산 661-683; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 652-674; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 660-682; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 656-678; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 634-659; SEQ ID NO: 18의 아미노산 651-676; SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 652-677; SEQ ID NO: 21의 아미노산 657-679; SEQ ID NO: 23의 아미노산 643-668; 및/또는 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 634-659를 포함한다.
9. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 752-765; SEQ ID NO: 3의 아미노산 748-761; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 739-752; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 747-760; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 743-756; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 724-739; SEQ ID NO: 18의 아미노산 741-756; SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 742-757; SEQ ID NO: 21의 아미노산 744-757; SEQ ID NO: 23의 아미노산 733-748; 및/또는 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 724-739를 포함한다.
10. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 826-835; SEQ ID NO: 3의 아미노산 824-831; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 813-824; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 821-830; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 817-826; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 800-809; SEQ ID NO: 18의 아미노산 817-826; SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 818-827; SEQ ID NO: 21의 아미노산 818-827; SEQ ID NO: 23의 아미노산 809-819; 및/또는 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 800-809를 포함한다.
11. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 844-863; SEQ ID NO: 3의 아미노산 840-859; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 831-850; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 839-858; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 835-854; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 818-837; SEQ ID NO: 18의 아미노산 835-854; SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 836-855; SEQ ID NO: 21의 아미노산 836-855; SEQ ID NO: 23의 아미노산 828-847; 및/또는 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 818-837을 포함한다.
12. 측면 1-4의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 871-895; SEQ ID NO: 3의 아미노산 867-891; SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 858-882; SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 866-890; SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 862-886; SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 845-869; SEQ ID NO: 18의 아미노산 862-886; SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 863-887; SEQ ID NO: 21의 아미노산 863-887; SEQ ID NO: 23의 아미노산 855-879; 및/또는 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 845-869를 포함한다.
13. 측면 1-12의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 클로스트리듐 독소 효소 영역은 BoNT/A 효소 영역, BoNT/B 효소 영역, BoNT/C1 효소 영역, BoNT/D 효소 영역, BoNT/E 효소 영역, BoNT/F 효소 영역, BoNT/G 효소 영역, BaNT 효소 영역, 및/또는 BuNT 효소 영역을 포함한다.
14. 측면 1-13의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위는 트롬빈 분해 부위, 플라즈민 분해 부위, 응고인자 VIIa 분해 부위, 응고인자 IXa 분해 부위, 응고인자 Xa 분해 부위, 응고인자 XIa 분해 부위, 응고인자 XIIa 분해 부위, 혈장 칼리크레인 분해 부위, 프로테아제-활성화된 G 단백질-커플링된 수용체-1 (PAR1) 분해 부위, PAR2 분해 부위, PAR3 분해 부위, PAR4 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2 (MMP-2) 분해 부위, 매트릭스 메탈로프로테이나제-9 (MMP-9) 분해 부위, 푸린 분해 부위, 유로키나제-타입 플라즈미노겐 활성화제 (uPA) 분해 부위, 조직-타입 플라즈미노겐 활성화제 (tPA) 분해 부위, 트립타제-ε 분해 부위, 마우스 비만세포 프로테아제-7 (mMCP-7) 분해 부위, 엔도텔린-전환효소-1 (ECE-1) 분해 부위, 켈 혈액형 분해 부위, DPPIV 분해 부위, 트롬보스폰딘 타입 1 모티프-13 (ADAMTS13) 분해 부위를 갖는 ADAM 메탈로펩티다제, 및/또는 카텝신 L 분해 부위를 포함한다.
15. 측면 1-14의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 클로스트리듐 독소 전위 영역은 BoNT/A 전위 영역, BoNT/B 전위 영역, BoNT/C1 전위 영역, BoNT/D 전위 영역, BoNT/E 전위 영역, BoNT/F 전위 영역, BoNT/G 전위 영역, TeNT 전위 영역, BaNT 전위 영역, 및 BuNT 전위 영역을 포함한다.
16. 측면 1-15의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위는 이중 트롬빈-트롬빈 부위, 인자 Xa 부위, 이중 인자 Xa-트롬빈 부위 및/또는 MMP-9 부위를 포함한다.
17. 측면 1-16의 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭으로서, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역은 오피오이드 (opiod) 결합 영역, 타키키닌 (tachykinin) 결합 영역, 멜라노코르틴 (melanocortin) 결합 영역, 갈라닌 (galanin) 결합 영역, 그라닌 (granin) 결합 영역, 뉴로펩타이드 (Neuropeptide) Y 관련된 펩타이드 결합 영역, 신경호르몬 결합 영역, 신경조절성 사이토킨 결합 영역, 키닌 펩타이드 결합 영역, 성장인자 결합 영역, 및/또는 글루카곤 유사 호르몬 결합 영역을 포함한다.
18. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/A로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
19. BoNT/A 효소 영역, BoNT/A 전위 영역, BoNT/A 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
20. BoNT/A 효소 영역, BoNT/A 전위 영역, BonT/A 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분, 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
21. BoNT/A 효소 영역, BoNT/A 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
22. BoNT/A 효소 영역, BoNT/A 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
23. 측면 18-22의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 및/또는 SEQ ID NO: 5의 아미노산 462-496, 618-634, 638-651, 665-687, 752-765, 826-835, 844-863 및/또는 871-895 및/또는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 458-492, 614-630, 634-647, 665-687, 748-761, 822-831, 840-859 및/또는 867-891을 포함한다.
24. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/B로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
25. BoNT/B 효소 영역, BoNT/B 전위 영역, BoNT/B 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
26. BoNT/B 효소 영역, BoNT/B 전위 영역, BoNT/B 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
27. BoNT/B 효소 영역, BoNT/B 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
28. BoNT/B 효소 영역, BoNT/B 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
29. 측면 24-28의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 및/또는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 464-487, 605-621, 625-638, 652-674, 739-752, 813-824, 831-850 및/또는 858-882를 포함한다.
30. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/C1로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
31. BoNT/C1 효소 영역, BoNT/C1 전위 영역, BoNT/C1 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
32. BoNT/C1 효소 영역, BoNT/C1 전위 영역, BoNT/C1 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
33. BoNT/C1 효소 영역, BoNT/C1 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
34. BoNT/C1 효소 영역, BoNT/C1 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
35. 측면 30-34의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 11 및/또는 SEQ ID NO: 12의 아미노산 463-496, 613-629, 633-646, 660-682, 747-760, 821-830, 839-858 및/또는 866-890을 포함한다.
36. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/D로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
37. BoNT/D 효소 영역, BoNT/D 전위 영역, BoNT/D 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
38. BoNT/D 효소 영역, BoNT/D 전위 영역, BoNT/D 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
39. BoNT/D 효소 영역, BoNT/D 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
40. BoNT/D 효소 영역, BoNT/D 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
41. 측면 36-40의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 13 및/또는 SEQ ID NO: 14의 아미노산 458-491, 609-625, 629-642, 656-678, 743-756, 817-826, 835-854 및/또는 862-886을 포함한다.
42. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/E로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
43. BoNT/E 효소 영역, BoNT/E 전위 영역, BoNT/E 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
44. BoNT/E 효소 영역, BoNT/E 전위 영역, BoNT/E 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
45. BoNT/E 효소 영역, BoNT/E 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
46. BoNT/E 효소 영역, BoNT/E 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
47. 측면 42-46의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 및/또는 SEQ ID NO: 17의 아미노산 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837 및/또는 845-869를 포함한다.
48. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/F로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
49. BoNT/F 효소 영역, BoNT/F 전위 영역, BoNT/F 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
50. BoNT/F 효소 영역, BoNT/F 전위 영역, BoNT/F 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
51. BoNT/F 효소 영역, BoNT/F 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
52. BoNT/F 효소 영역, BoNT/F 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
53. 측면 48-52의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 18의 아미노산 453-486, 604-620, 624-637, 651-676, 741-756, 817-826, 835-854 및/또는 862-886을 포함하며; 및/또는 SEQ ID NO: 19 및/또는 SEQ ID NO: 20의 아미노산 453-486, 605-621, 625-638, 652-677, 742-757, 818-827, 836-855 및/또는 863-887을 포함한다.
54. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/G로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
55. BoNT/G 효소 영역, BoNT/G 전위 영역, BoNT/G 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
56. BoNT/G 효소 영역, BoNT/G 전위 영역, BoNT/G 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
57. BoNT/G 효소 영역, BoNT/G 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
58. BoNT/G 효소 영역, BoNT/G 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
59. 측면 54-58의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 21의 아미노산 458-491, 610-626, 630-643, 657-679, 744-757, 818-827, 836-855 및/또는 863-887을 포함한다.
60. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BaNT로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
61. BaNT 효소 영역, BaNT 전위 영역, BaNT 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
62. BaNT 효소 영역, BaNT 전위 영역, BaNT 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
63. BaNT 효소 영역, BaNT 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
64. BaNT 효소 영역, BaNT 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
65. 측면 60-64의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 23의 아미노산 443-476, 596-612, 616-629, 643-668, 733-748, 809-819, 828-847 및/또는 855-879를 포함한다.
66. 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 BuNT로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
67. BuNT 효소 영역, BuNT 전위 영역, BuNT 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
68. BuNT 효소 영역, BuNT 전위 영역, BuNT 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
69. BuNT 효소 영역, BuNT 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
70. BuNT 효소 영역, BuNT 전위 영역, 비-클로스트리듐 독소 결합 영역, 외인성 프로테아제 분해 부위, 디-쇄 루프 부분 및 불활성화 분해 부위 부분내에 위치한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소로서, 외인성 프로테아제 분해 부위는 디-쇄 루프 부분내에 위치되며; 불활성화 분해 부위 부분은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한다.
71. 측면 66-70의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위 부분은 SEQ ID NO: 24 및/또는 SEQ ID NO: 25의 아미노산 434-467, 587-603, 607-620, 634-659, 724-739, 800-809, 818-837 및/또는 845-869를 포함한다.
72. 측면 1-71의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 큰 안전역을 가진다.
73. 측면 72의 독소 및/또는 키메릭으로서, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 및/또는 적어도 300%보다 큰 안전역을 가지며, 및/또는
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%, 최대 80%, 최대 90%, 최대 100%, 최대 110%, 최대 120%, 최대 130%, 최대 140%, 최대 150%, 최대 160%, 최대 170%, 최대 180%, 최대 190%, 최대 200%, 최대 210%, 최대 220%, 최대 230%, 최대 240%, 최대 250%, 최대 260%, 최대 270%, 최대 280%, 최대 290%, 및/또는 최대 300%보다 큰 안전역을 가지는 불활성화 분해 부위를 포함하며, 및/또는
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 약 10% ~ 약 300%, 약 20% ~ 약 300%, 약 30% ~ 약 300%, 약 40% ~ 약 300%, 약 50% ~ 약 300%, 약 60% ~ 약 300%, 약 70% ~ 약 300%, 약 80% ~ 약 300%, 약 90% ~ 약 300% 및/또는 약 100% ~ 약 300% 이상인 안전역을 가지며, 및/또는
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 적어도 1-배, 적어도 1-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배 및/또는 적어도 10-배 이상인 안전역을 가지며, 및/또는
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 적어도 1-배, 최대 1-배, 최대 3-배, 최대 4-배, 최대 5-배, 최대 6-배, 최대 7-배, 최대 8-배, 최대 9-배 및/또는 최대 10-배 이상인 안전역을 가지며, 및/또는
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 약 1-배 ~ 약 10-배, 약 1-배 ~ 약 9-배, 약 1-배 ~ 약 8-배, 약 1-배 ~ 약 7-배, 약 1-배 ~ 약 6-배, 약 1-배 ~ 약 5-배, 약 2-배 ~ 약 10-배, 약 2-배 ~ 약 9-배, 약 2-배 ~ 약 8-배, 약 2-배 ~ 약 7-배, 약 2-배 ~ 약 6-배 및/또는 약 2-배 ~ 약 5-배 이상인 안전역을 가진다.
74. 측면 1-73의 독소 및/또는 키메릭으로서, 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 불활성화 분해 부위를 첨가하면, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 증가시킨다.
75. 측면 74의 독소 및/또는 키메릭으로서, 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 110%, 적어도 120%, 적어도 130%, 적어도 140%, 적어도 150%, 적어도 160%, 적어도 170%, 적어도 180%, 적어도 190%, 적어도 200%, 적어도 210%, 적어도 220%, 적어도 230%, 적어도 240%, 적어도 250%, 적어도 260%, 적어도 270%, 적어도 280%, 적어도 290%, 및/또는 적어도 300%까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함하며, 및/또는
클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 최대 10%, 최대 20%, 최대 30%, 최대 40%, 최대 50%, 최대 60%, 최대 70%, 최대 80%, 최대 90%, 최대 100%, 최대 110%, 최대 120%, 최대 130%, 최대 140%, 최대 150%, 최대 160%, 최대 170%, 최대 180%, 최대 190%, 최대 200%, 최대 210%, 최대 220%, 최대 230%, 최대 240%, 최대 250%, 최대 260%, 최대 270%, 최대 280%, 최대 290%, 및/또는 최대 300% 까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함하며, 및/또는
클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 약 10% ~ 약 300%, 약 20% ~ 약 300%, 약 30% ~ 약 300%, 약 40% ~ 약 300%, 약 50% ~ 약 300%, 약 60% ~ 약 300%, 약 70% ~ 약 300%, 약 80% ~ 약 300%, 약 90% ~ 약 300% 및/또는 약 100% ~ 약 300%까지 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함하며, 또는
클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여, 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 적어도 1-배, 적어도 1-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배 및/또는 적어도 10-배까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함하며, 및/또는
클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 최대 1-배, 최대 3-배, 최대 4-배, 최대 5-배, 최대 6-배, 최대 7-배, 최대 8-배, 최대 9-배 및/또는 최대 10-배까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함하며, 및/또는
클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 추가의 불활성화 분해 부위 없을 때를 제외하고는, 같거나 및/또는 유사한 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭에 대하여 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 약 1-배 ~ 약 10-배, 약 1-배 ~ 약 9-배, 약 1-배 ~ 약 8-배, 약 1-배 ~ 약 7-배, 약 1-배 ~ 약 6-배, 약 1-배 ~ 약 5-배, 약 2-배 ~ 약 10-배, 약 2-배 ~ 약 9-배, 약 2-배 ~ 약 8-배, 약 2-배 ~ 약 7-배, 약 2-배 ~ 약 6-배 및/또는 약 2-배 ~ 약 5-배까지 증가시키는 불활성화 분해 부위의 첨가를 포함한다.
76. 측면 1-75 중 어느 하나에 따른 독소 및/또는 키메릭을 코드화하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
77. 폴리뉴클레오타이드 분자로서, 분자는 SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 534 및/또는 SEQ ID NO: 536을 포함한다.
78. 측면 76 및/또는 77에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자를 세포내에서 발현하는 단계를 포함하는, 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 제조방법으로서, 폴리뉴클레오타이드 분자로부터의 발현은 코드화된 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 생성한다.
79. 하기 단계 a.~b.를 포함하는 변형된 클로스트리듐 독소의 제조 방법으로서:
a. 측면 76 및/또는 77에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자를 세포내로 이입하는 단계; 및
b. 폴리뉴클레오타이드 분자를 발현하는 단계,
폴리뉴클레오타이드 분자로부터의 발현은 코드화된 클로스트리듐 독소 및/또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 생성한다.
80. SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 535 및/또는 SEQ ID NO: 537을 포함하는 클로스트리듐 독소.
81. SEQ ID NO: 531을 포함하는 클로스트리듐 독소.
82. SEQ ID NO: 533을 포함하는 클로스트리듐 독소.
83. SEQ ID NO: 535를 포함하는 클로스트리듐 독소.
84. SEQ ID NO: 537을 포함하는 클로스트리듐 독소.
실시예
하기 비-제한적인 실시예들은 개시한 구체예들을 쉽게 보다 완벽하게 이해할 수 있도록 오직 설명의 목적으로 제공되며, 어떤 방법으로도 본 명세서에 개시된 구체예들 중 어느 것을 한정하기 위한 것은 아니다.
실시예 1
불활성화 분해 부위 부분의 확인
본 실시예는 독소가 불활성화 분해 부위를 포함하도록 변형시키기에 적당한 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭내 부분들을 확인하는 방법 및 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 제조방법을 설명한다.
잠재적 불활성화 분해 부위 부분으로서 적당한 단백질 구조내 위치 또는 위치들을 확인하기 위해, BoNT/A의 3차원 구조를 컴퓨터 소프트웨어로 초기분석하여, 프로테아제에 보다 접근가능하게 되는 연장된 부분들 또는 표면노출된 루프들을 확인하였다. 접근가능할 것으로 예상되는 부분들 중, 추가 분석을 위해 8개의 부분들을 선택하였다: SEQ ID NO: 1의 아미노산 462-496, SEQ ID NO: 1의 아미노산 618-634, SEQ ID NO: 1의 아미노산 638-651, SEQ ID NO: 1의 아미노산 665-687, SEQ ID NO: 1의 아미노산 752-765, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 826-835, SEQ ID NO: 1의 아미노산 844-863, 및 SEQ ID NO: 1의 아미노산 871-895.
컴퓨터 분석에 의해 확인된 부분이 불활성화 분해 부위 부분으로서 기능할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 멀티-프라이머를 사용하여 트롬빈 분해 부위들을 이들 부분들로 유전자 조작시키고, 트롬빈에 의해 분해될 수 있는 그의 능력에 대하여 분석하였다. 각각 원하는 변형(각 프라이머 125ng)을 함유하는 단일 방향성 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 프라이머 풀을 포함하는 50μL 반응액을 SEQ ID NO: 527을 코드화하는 SEQ ID NO: 526을 포함하는 발현 구조물, 또는 dam 메틸라제에 의해 하이퍼메틸화된, SEQ ID NO: 529를 코드화하는 SEQ ID NO: 528을 포함하는 발현 구조물과 같은 BoNT/A를 코드화하는 발현 구조물을 포함하는 DNA 주형과 다른 비율로 혼합하였다. 이 혼합물에 5μL의 10×PCR 버퍼, 1μL의 데옥시리보뉴클레오타이드(dNTP), 1μL의 2.5units/μL PFUULTRATM High Fidelity DNA 폴리머라제(Stratagene, La Jolla, CA), Pfu DNA 리가아제, ATP 및 뉴클레아제-유리 물을 50μL의 최종 부피로 첨가하였다. 서모사이클러(thermocycler) 조건은: 96℃에서 1분, 60℃에서 30초 및 68℃에서 20분의 30주기. 서모사이클링후, 1μL의 Dpnl 제한효소(Stratagene, La Jolla, CA)를 반응에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하여, 주형 DNA를 소화시키고, 야생형 클론의 회수를 감소시켰다. 소화된 반응혼합물을 전기천공법에 의해 전자-경쟁적 대장균(E. coli) BL21(DE3) 아셀라(Acella) 세포(Edge BioSystems, Gaithersburg, MD)로 형질전환시키고, 카나마이신 50㎍/㎖를 함유하는 1.5% 루리아-버타니(Luria-Bertani) 아가 플레이트(pH 7.0) 상에 심고, 및 37℃ 인큐베이터에 넣어 밤새 배양하였다. 발현구조물을 함유하는 세균은 카나마이신내성 콜로니로 확인되었다. 알칼리 용해 플라스미드 미니-제조 과정을 사용하여 후보 구조물들을 분리하고, 통합된 돌연변이의 빈도 및 아이덴티티를 측정하기 위해 서열화에 의해 분석하였다. 표 7은 제조된 트롬빈 분해 부위(BoNT/A-TCS)를 포함하는 각 BoNT/A를 나타내며, 본 트롬빈 주사 분석법으로 시험하였다.
표 7. 트롬빈 스캐닝 분석
|
부위
|
변형
|
발현
|
트롬빈 민감도
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BoNT/A 잠재능
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각 BoNT/A-TCS에 대한 가용성 단백질의 발현 수준을 측정하기 위해, 각 BoNT/A-TCS를 포함하는 발현 구조물을 발현시키고, 고정금속 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하고, SDS-PAGE 분석법으로 분석하였다. 첫째, 96-웰 플레이트를 사용하여, 50㎍/mL 카나마이신을 함유하는 100㎕의 PA-0.5G 배지에 적당한 발현 구조물을 갖는 BL21(DE3) 세포들의 단일 콜로니로 접종하고, 셰이킹하면서 37℃에서 밤새 배양하였다. 이 스타터 배양액으로부터의 5㎕ 표본액을 사용하여, 50㎍/mL 카나마이신을 함유하는 ZYP-5052 1mL를 접종하고, 셰이킹하면서 37℃에서 3.5시간동안, 그후 22℃에서 16시간동안 배양하였다. 10× FASTBREAKTM 세포 분해 제제(Cell Lysis Reagent)(Promega Corp., Madison, WI)를 포함하는 단백질 추출 제제 110㎕ 표본액, 250U/mL 벤조나제 뉴클라제(EMD Biosciences-Novagen, Madison, WI) 및 10× 프로테아제 억제제 칵테일(Protease Inhibitor Cocktail) III(EMD Biosciences-Calbiochem, Gibbstown, NJ)를 96-웰 플레이트내 각 1mL 발현 배양액에 첨가했다. 75㎕의 HISLINKTM 수지(Promega Corp., Madison, WI)를 각 웰에 옮긴후, 그 혼합물을 피펫팅 및 900rpm에서 30분간 셰이킹함으로써 교대로 혼합하였다. 25㎛ 공극 크기를 갖고 막을 물로 미리 적신 여과 플레이트(Promega Corp., Madison, WI)에 상기 분해물을 옮기고, 그 액체를 진공 여과에 의해 제거하였다. 100mM HEPES(pH7.5), 10mM 이미다졸을 포함하는 200㎕ 세척 버퍼에 의해 수지를 3회 세척하였다. 100mM HEPES(pH 7.5), 500mM 이미다졸을 포함하는 200㎕ 용출 버퍼를 첨가하고, 5분간 배양함으로써 단백질을 용출하고, 그 용출액을 진공 여과에 의해 96-웰 플레이트에 수집하였다.
SDS-PAGE를 수행하기 위해, 트롬빈 분해 부위를 포함하는 IMAC 정제된 BoNT/A에 같은 부피의 2× Laemmli 샘플 버퍼를 첨가하고, 그 혼합물을 95℃에서 5분간 배양하였다. 15㎕ 표본액을 로딩하고, 변성, 환원조건하에, NUPAGE® Novex 4-12% Bis-Tris 프리캐스트 폴리아크릴아마이드 겔(Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA)을 사용하여 MOPS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법에 의해 분리하였다. 겔을 세척하고, 10% 메테인올 및 7% 아세트산에 고정시켰다. 세척용액을 제거하고, 그 겔을 실온에서 밤새 3시간동안 SYPRO Ruby 단백질 겔 염색용액내에서 배양하였다. 염색된 겔은 10% 메테인올 및 7% 아세트산에서 30분간 탈색시켰다. 탈색된 겔을 Fluoro-S-Max 디지털 이미저(Bio-Rad)에 의해 시각화하였다.
발현 분석 결과가 표 7에 개시되어 있다. 일반적으로, SEQ ID NO: 1의 아미노산 462-496, SEQ ID NO: 1의 아미노산 844-863, 또는 아미노산 871-895를 포함하는 불활성화 부분내 삽입된 트롬빈 분해 부위를 갖는 독소가 웰에 발현되었다. 예를 들어, A489insLVPRGS를 포함하는 독소는 야생형 대조군 구조물의 약 50%에서 발현되었으며, D848insLVPRGS 또는 N880insLVPRGS를 포함하는 독소는 대조군 수준 또는 그 부근에서 발현되었다(표 7). 이러한 결과들은 전위 영역 또는 HCN 결합 서브영역내에 위치한 불활성화 분해 부위 부분들이 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 부분들을 변형시키는 것을 견딘다는 것을 보여준다.
확인된 불활성화 분해 부위 부분들이 프로테아제 분해 부위를 이입한 변형을 견딜 수 있는 정도를 추가로 분석하기 위해, 독소를 변형시켜, 트롬빈 분해 부위들을 그 부분을 통해 포함시켰다. 예를 들어, SEQ ID NO: 1의 844-863을 포함하는 불활성화 분해 부위 부분을 조사하기 위해, T884insLVPRGS 또는 L862insLVPRGS를 포함하는 독소를 제조하였다. 이와 유사하게, SEQ ID NO: 1의 871-895를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분을 조사하기 위해, E868insLVPRGS, delE868YIKNI-insLVPRGS, delN872IINTS-insLVPRGS, T876insLVPRGS, L879insVPRGS, delE879NLRYE-insLVPRGS, L881insVPRGS, delL881RYESN-insLVPRGS, Y883insLVPRGS, E884insLVPRGS, S885insLVPRGS, delH887LIDLS-insLVPRGS, L888insLVPRGS, L891insVPRG, 및 delS892RYA-insVPRG를 포함하는 독소를 제조하였다. 변형타입이 어떤 영향을 미쳤는지의 여부를 조사하기 위해 삽입 및 치환 변형 모두를 실시했다. 일반적으로 상기 불활성화 부분내 삽입된 트롬빈 분해 부위를 갖는 모든 독소들을 야생형 대조군 구조물의 수준 또는 부근에서 발현시켰다. 이러한 결과들은 전위 영역 및/또는 HCN 결합 서브영역내 불활성화 분해 부위 부분이 불활성화 부위 부분내 어디에서 변형이 일어나든 견딜 수 있음을 보여준다.
끝으로, 2개 이상의 프로테아제 분해 부위들의 존재를 견딜 수 있는 불활성화 분해 부위 부분의 능력을 조사하였다(표 7). 이러한 결과들은 전위 영역 또는 HCN 결합 서브영역내 불활성화 분해 부위 부분들이 불활성화 분해 부위내에 2개 이상의 프로테아제 분해 부위들을 둠으로써 변형을 견딜 수 있음을 보여준다.
트롬빈 분해 부위를 포함하는 BoNT/A가 트롬빈에 의해 분해될 수 있는지의 여부를 측정하기 위해, 시험관내(in vitro) 트롬빈 분해분석을 수행하였다. 각 정제된 BoNT/A-TCS 5㎍을 1U의 트롬빈(Novagen)과 함께 23℃에서 1시간, 3시간, 및 18.5시간동안 배양하였다. 제로-효소 대조군도 또한 각 BoNT/A-TCS에 대하여 평행으로 준비하였다. 각 시간지점에서 샘플을 취하고, DTT를 포함하는 SDS-로딩 버퍼에 의해 퀸칭하고, 상기와 같이 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
발현분석 결과는 표 7에 개시되어 있다. 일반적으로, 프로테아제 분해 부위를 포함시키기 위해, SEQ ID NO: 1의 아미노산 467-496, 844-863 또는 871-895를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분의 변형시킴으로써, 적당한 프로테아제에 의해 단백분해적 분해되기 쉬운 독소가 얻어졌다.
트롬빈 분해 부위를 포함하는 BoNT/A가 그의 잠재능을 유지하는지의 여부를 측정하기 위해, 세포-계 활성 분석법을 사용하여 BoNT/A 활성 분석법을 수행하였다. 세포-계 활성 분석법을 진행하기 위해, 최소필수배지를 함유하는 혈청-유리 배지 1mL, Earle의 염을 갖는 2mM GLUTAMAXTM I, 1×N2 보충액, 0.1mM 비-필수 아미노산, 10mM HEPES 및 25㎍/mL GT1b를 함유하는 24-웰 조직 배양 플레이트에 약 1.2×106 Neuro-2a 또는 SiMa 세포들을 심었다. 세포들이 분화될 때까지 성장지연 및 신경세포 돌기신장과 같은 표준 및 규칙적인 형태학적 기준에 의해 평가되는 바와 같이, 5% 이산화탄소하에 37℃ 인큐베이터에서 세포들을 배양하였다(대략 3일). 각 웰에서 배지를 흡입하고, 1) 독소를 함유하지 않는 신선한 배지(비처리 세포주) 또는 2) 1nM의 BoNT/A 컴플렉스를 함유하는 신선한 배지(처리 세포주)로 치환하였다. 밤새 배양한후, 배지를 흡입하고, 각 웰을 200㎕의 1×PBS로 세정하여 세포들을 세척하였다. 세포들을 수확하기 위해, 1×PBS를 흡입시키고, 2×SDS 로딩 버퍼 50㎕를 첨가하여, 세포들을 용해(lysis)시키고, 용해물을 깨끗한 시험관으로 옮기고, 샘플을 95℃로 5분간 가열하였다.
분해된 SNAP-25 생성물의 존재에 대하여 검출하기 위해, 각 수확된 샘플로부터 표본액을 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 이 분석에서, 수확된 샘플의 12㎕ 표본액을 변성, 환원 조건하에, NUPAGE® Novex 12% Bis-Tris 프리캐스트 폴리아크릴아마이드 겔(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)를 사용하여 MOPS 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동에 의해, 분리하였다. TRANS-BLOT® SD 반-건조 전기영동 트랜스퍼 세포 장치(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 겔로부터 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) 상으로 상기 분리된 펩타이드들을 옮겼다. 트리스-완충 식염수(TBS)(25mM 2-아미노-2-하이드록시메틸-1,3-프로페인디올 염산(Tris-HCl)(pH 7.4), 137mM 염화나트륨, 2.7mM 염화칼륨), 0.1% TWEEN-20®(폴리옥시에틸렌(20) 소비탄 모노라우레이트), 2% 소혈청 알부민(BSA), 5% 탈지분유를 함유하는 용액에서 실온에서 2시간동안 배양하여, PVDF 막을 블록킹하였다. TBS, 0.1% TWEEN-20® (폴리옥시에틸렌(20) 소비탄 모노라우레이트), 2% BSA, 및 1) 1차 항체로서 α-SNAP-25 마우스 모노클론항체의 1:5,000 희석액(SMI-81; Sternberger Monoclonals Inc., Lutherville, MD) 또는 2) 1차 항체로서 S9684 α-SNAP-25 토끼 다클론 항혈청의 1:5,000 희석액(Sigma, St. Louis, MO)을 함유하는 5% 탈지분유에서 4℃에서 밤새 상기 블록킹된 막을 배양하였다. α-SNAP-25 마우스 모노클론 및 토끼 다클론 항체들 모두 분해되지 않은 SNAP-25 기질 및 SNAP-25 분해 생성물 모두를 결실시킬 수 있어서, BoNT/A 흡수량을 평가하기 위한 변수로서 BoNT/A 처리후 분해된 SNAP-25의 비율 및 각 세포주내 전반적인 SNAP-25 발현을 평가하게 된다. 1차 항체 프로브 블롯들을 TBS, TWEEN-20®(폴리옥시에틸렌(20) 소비탄 모노라우레이트)에서 각 시간에 15분간 3회 세척하였다. TBS, 0.1% TWEEN-20®(폴리옥시에틸렌(20) 소비탄 모노라우레이트), 2% BSA 및 1) 2차 항체로서 양고추냉이 과산화효소(Zymed, South San Francisco, CA)에 결합된 염소 다클론 항-마우스 면역글로불린 G, 중쇄 및 경쇄(IgG, H+L) 항체의 1:10,000 희석액; 또는 2) 2차 항체로서 양고추냉이 과산화효소(Zymed, South San Francisco, CA)에 결합된 염소 다클론 항-토끼 면역글로불린 G, 중쇄 및 경쇄(IgG, H+L) 항체의 1:10,000 희석액을 함유하는 5% 탈지분유에서 실온에서 2시간동안 상기 세척된 막들을 배양하였다. TBS, 0.1% TWEEN-20®(폴리옥시에틸렌(20) 소비탄 모노라우레이트)에서 각 시간에 15분간 3회 2차 항체-프로브 블롯들을 세척하였다. ECL PlusTM 웨스턴 블롯 검출 시스템(GE Healthcard, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)을 사용하여 표적화 SNAP-25 생성물의 신호검출을 시각화하고, Typhoon 9410 가변모드 이미저 및 이미저 분석 소프트웨어(Variable Mode Imager and Imager Analysis software)(GE Healthcare, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)에 의해 막을 이미지화하고, 분해율을 정량화하였다. 픽셀 크기(100~200픽셀) 및 PMT 전압 셋팅(350~600, 정상적으로 400)의 선택은 각 블롯에 따라 다르다.
발현분석결과는 표 7에 개시되어 있다. 일반적으로, SEQ ID NO: 1의 아미노산 467-496, 844-863 또는 871-895를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분을 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 변형시키면, 전반적인 중독과정을 수행할 수 있는 잠재 독소가 얻어졌다.
취합하면, 이러한 결과들은 8개의 다른 불활성화 분해 부위 부분들이 확인되더라도, 모두 기능적 트롬빈 분해 부위의 삽입을 지지할 수 있는 것은 아님을 보여준다. 일반적으로, SEQ ID NO: 1의 아미노산 467-496, 844-863 및 871-895를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분들을 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 변형시키면, 전반적인 중독 과정을 수행할 수 있고 적당한 프로테아제에 의한 단백분해적 분해에 대하여 민감한 안정적으로 생성된 독소가 얻어졌다.
모든 클로스트리듐 독소의 3차원적 구조는 유사하기 때문에, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, TeNT, BaNT, 및 BuNT에서 대응 위치들은 불활성화 분해 부위 부분들로서 적당하다. 표 5는 이러한 부분들을 보여준다.
실시예 2
프로테아제 분해 부위 분석
본 실시예는 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 제조하는 방법을 설명한다.
트롬빈과 다른 프로테아제 분해 부위가 불활성화 부위로서 사용할 수 있는지를 연구하기 위해, 많은 다른 프로테아제 분해 부위들을 포함하는 독소를 시험하였다.
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 제조하기 위해, 실시예 1에 설명된 멀티프라이머 돌연변이생성을 사용하여 프로테아제 분해 부위들을 불활성 분해 부위 부분으로 유전자조작하였다. 표 8은 프로테아제 분해 부위를 함유하도록 변형된 발현 구조물들을 개시하고 있다.
프로테아제 분해 부위를 포함하는 BoNT/A가 그의 동종 프로테아제에 의해 분해될 수 있는지의 여부를 측정하기 위해, 트롬빈 대신에 적당한 프로테아제를 사용한 것을 제외하고는, 상기와 같이 시험관내 프로테아제 분해 분석을 수행하였다. 각 시간 지점에서 샘플들을 취하고, DTT를 포함한 SDS-로딩 버퍼에 의해 퀸칭하고, 실시예 1에 설명한 바와 같이, SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
발현분석결과는 표 7에 개시되어 있다. 일반적으로, SEQ ID NO: 1의 아미노산 467-496, 844-863 또는 871-895를 포함하는 불활성화 분해 부위 부분을 프로테아제 분해 부위를 포함하도록 변형시키면, 적당한 프로테아제에 의해 단백분해적 분해되기 쉬운 독소가 얻어졌다.
표 8. 프로테아제 분해 부위 분석
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프로테아제
분해 부위
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부위
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변형
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프로테아제
민감도
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BoNT/A 잠재능
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프로테아제 분해 부위를 포함하는 BoNT/A가 그의 잠재능을 유지하는지의 여부를 측정하기 위해, 상기 세포-계 활성 분석을 수행하였다(표 8). 일반적으로, 약 20 이하의 EC50을 나타내는 프로테아제 분해 부위를 포함하는 독소들은 동물-계 분석법을 사용한 적정 평가에 대한 충분한 잠재능을 유지하였다.
실시예 3
생체내 분석
본 실시예는 동물-계 측정 분석을 사용하여 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭을 평가하는 방법을 설명한다.
세포-계 활성 분석이 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭이 동종 프로테아제에 의해 분해될 수 있는지의 여부를 평가하는 좋은 평가법이지만, 특정 후보물들은 동물-계 측정에서 평가되기 위해 선택되었다.
동물-계 측정을 사용한 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 활성을 시험하기 위해, 생체내 디짓 어브덕션 스코어(Digit Abduction Score(DAS)) 측정을 초기 수행하였다. CD-1 Fe 마우스를 칭량하고, 각 별개의 DAS 측정을 위해 10마리의 동물들의 서브셋으로 넣었다. 하기 기준: 1) 양호한 건강; 2) 0의 건강한 기준선 DAS 반응; 3) 선택된 서브셋에 대하여 수립된 X ±2g의 중간 중량 범위내에 포함; 및 4) 17.0g 이상의 중량에 기초한 특정 서브셋에 마우스를 포함시켰다.
각 마우스의 오른쪽 뒷다리의 비장근에 30-게이지 바늘을 사용하여 1) 불활성화 분해 부위를 포함하는 10.0nM BoNT/A 5㎕(단일-투여량 DAS 연구); 또는 2) 불활성화 분해 부위를 포함하는 BoNT/A의 7개의 다른 투여량(0.01nM, 0.04nM, 0.12nM, 0.37nM, 1.11nM, 3.33nM, 및 10.0nM; 전량-투여 DAS 연구) 중 하나 5㎕를 주사하였다. 대조군으로서, 왼쪽 뒷다리의 비장근에는 어떤 독소도 함유하지 않는 용액 5㎕를 주사하였다. 처음 4일간 연속해서 DAS 반응에 대하여 마우스를 관찰하였다. 꼬리에 의해 각 마우스를 들어올리고, 주사한 뒷다리를 정확하게 관찰함으로써, DAS를 읽었다. 다리의 디짓 어브덕션 또는 어브덕션 없음은 근육내에 주사된 시험 독소로 인한 중독 효과를 나타낸다. 주사된 뒷다리의 디짓 어브덕션을 비-주사된 뒷다리와 대조하고, 이에 따라 점수를 매겼다. DAS 데이터는 u/Kg 및/또는 ng/Kg의 측면에서 피크 평균 DAS 점수 및 AUC(곡선아래 면적)에 기초하여 ED50 투여량을 계산하여 DAS 데이터를 분석하였다. 이것은 하기와 같이 수행되었다: 1) 각 투여량에 대한 평균 피크 DAS 점수를 각 연구에서 계산하고; 2) 특정 연구에서 5마리 이상이 죽은 투여량은 계산에서 빼고; 3) 주어진 각 연구에 사용된 최고 투여량은 4.0의 평균 피크가 유도된 최저 투여량이며; 4) 주어진 각 연구에 사용된 최저 투여량은 0의 평균 피크가 유도된 최저 투여량이며; 5) 평균 피크 DAS 대 로그(투여량)의 각 개별적인 연구에 대하여 곡선을 그렸고; 6) 일부 연구에서 여러 그룹의 쥐 10마리의 각 그룹에 대하여 AUC 값을 계산하고; 7) 평균 AUC 대 로그(투여량)의 각 개별적인 연구에 대하여 곡선을 그렸고; 8) 각 시험 독소에 대하여; 여러 동일한 연구세트에 대하여 x, y 복제반응 곡선을 그렸고; 9) 하기 식을 사용한 3-변수 지수식(Sigma Plot v 8.0; SPSS Science, Chicago, Illinois)을 사용하여 비선형 퇴보(비-칭량)에 의해 투여량-반응 데이터를 분석하였다:
y = a/(1 + (x/xo)b)
(여기에서, y는 반응이며, a는 점근선 y최대이며, b는 기울기이며, x는 투여량이며, 및 0은 ED50 투여량이다)
피크 ED50 측정치에 대하여, Y최대는 4로 설정되었다(스케일로 최대 DAS 읽음). 평균(피크 및/또는 AUC) ED50 값을 수행된 각 8회-투여량 연구에 대하여 컴퓨팅하였다.
결과를 여기에 나타낸다(표 9). 일반적으로 약 10 이상의 상대 잠재능을 나타내는 불활성화 분해 부위를 포함하는 독소는 그의 안전역의 적정 평가에 충분한 잠재능을 보유하는 것으로 간주되었다.
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 측정하기 위해, 마우스 치사율 측정을 수행하였다.
불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭의 안전역을 계산하기 위해, 마우스 치사율 측정으로부터 얻은 LD50 값을 전체-투여 DAS 연구에서 얻은 EC50 값으로 나누었다. 불활성화 분해 부위를 포함하는 독소는 약 15 이상의 안전역 값을 나타낸다면 불활성화 분해 부위에서 충분한 활성을 가지는 것으로 간주되었다.
표 9. 동물계 측정 분석
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프로테아제 분해 부위
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부위
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변형
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단일-투여 DAS
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전체-투여 DAS
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치사율 분석
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안전역
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EC
50
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비교
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EC
50
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비교
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LD
50
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LD
50
/DAS ED
50
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DAS 분석후, 불활성화 분해 부위를 포함하는 클로스트리듐 독소 또는 클로스트리듐 독소 키메릭은 ED50을 LD50과 대조함으로써 안전역을 측정하기 위해 마우스 치사율 분석법을 사용하여 평가하였다.
본 명세서의 측면들이 개시된 구체예들을 참고로 설명되었지만, 당 분야의 기술자는 특정 실시예들이 본 측면들의 설명들만을 위한 것이며, 및 어떤 방법으로도 본 명세서를 제한하지 않는다는 것을 당업자라면 쉽게 알 것이다. 본 명세서의 정신으로부터 벗어나지 않으면서 여러 변형들이 이루어질 수 있다.