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KR102311681B1 - 내산성을 갖는 효모 세포, 그를 이용하여 유기산을 생산하는 방법 및 상기 내산성 효모 세포를 생산하는 방법 - Google Patents

내산성을 갖는 효모 세포, 그를 이용하여 유기산을 생산하는 방법 및 상기 내산성 효모 세포를 생산하는 방법 Download PDF

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KR102311681B1
KR102311681B1 KR1020150106771A KR20150106771A KR102311681B1 KR 102311681 B1 KR102311681 B1 KR 102311681B1 KR 1020150106771 A KR1020150106771 A KR 1020150106771A KR 20150106771 A KR20150106771 A KR 20150106771A KR 102311681 B1 KR102311681 B1 KR 102311681B1
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추헌수
조화영
박진환
양동식
이홍순
조광명
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삼성전자주식회사
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Abstract

내산성을 갖는 효모 세포, 그를 이용하여 유기산을 생산하는 방법 및 상기 내산성 효모 세포를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

내산성을 갖는 효모 세포, 그를 이용하여 유기산을 생산하는 방법 및 상기 내산성 효모 세포를 생산하는 방법{Yeast cell resistant to acid, method for producing an organic acid using the same, and method for producing the same}
내산성을 갖는 효모 세포, 그를 이용하여 유기산을 생산하는 방법 및 상기 내산성 효모 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
유기산은 산업적으로 널리 이용된다. 예를 들면, 락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다.
유기산은 그의 Pka 값보다 높은 산도, 예를 들면, 중성 조건에서 수소 이온과 유기산의 음이온으로 분리된다. 그러나, 유기산, 예를 들면, 젖산은 Pka 값보다 낮은 산성 조건에서는 전자기력을 가지지 않는 유리산 (free acid) 형태로 존재한다. 음이온 형태는 세포막을 투과하지 못하나, 유리산 형태는 세포막을 투과할 수 있으므로, 유기산의 농도가 높은 환경에서 세포막 외부의 유기산이 세포 내부로 유입되어 세포 내 pH가 떨어지는 현상이 일어날 수 있다. 또한, 음이온 형태의 유기산은 분리시에 염을 첨가하여 염의 형태로 분리하여야 하는 단점이 있다. 그 결과, 내산성 (acid resistance)이 결여된 세포는 젖산이 포함된 산성 조건에서 세포의 활성을 잃고 사멸할 수 있다.
이노시톨 포스포릴세라미드 신타제 촉매 서브유니트(inositol phosphorylceramide synthase catalytice subunit) AUR1은 효모, 예를 들면, S.cerevisiae(ATCC204508/S288c)에서 세라미드 또는 피토세라미드 상에 포스포릴이노시톨 기를 첨가하여 이노시톨 포스포릴세라미드(IPC)를 형성하는 것을 촉매하는 IPC 신타제의 촉매 성분이다. 아실-CoA 데사투라제1(OLE1)은 여러 지방 아실-CoA 기질에 이중겹합을 촉매한다. 디아실글리세롤 O-아실트란스퍼라제1(diacylglycerol O-acyltransferase 1: DGA1)는 디아실글리세롤과 지방 아실-CoA를 기질로 사용하여 TG 합성을 촉매하는 효소이다. 또한, 포스포리피드:디아실글리세롤 아실트란스퍼라제(phospholipid:diacylglycerol acyltransferase: LRO1)는 포스포리피드와 디아실글리세롤를 기질로서 사용하여 트리아실글리세롤 합성을 촉매하는 효소이다.
그러나, 상기한 종래 기술에 의하더라도 산성에 대한 내성을 갖는 미생물에 대한 요구가 있다.
일 양상은 내산성을 갖는 효모 세포를 제공한다.
다른 양상은 유기산을 생산하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 내산성 효모 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 세포, 단백질, 또는 효소의 활성의 검출가능한증가를 나타낼 수 있다. "활성 증가 (increase in activity)", 또는 "증가된 활성 (increased activity)"은 주어진 유전적 변형 (genetic modification)을 갖지 않은 세포, 단백질, 또는 효소 (예, 본래 또는 "야생형 (wild-type)" 세포, 단백질, 또는 효소)와 같은, 동일한 타입의 비교 세포, 단백질, 또는 효소의 수준 보다 더 높은 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포, 단백질, 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. "세포의 활성"이란 세포의 특정 단백질 또는 효소의 활성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 상기 변형된 또는 조작된 세포, 단백질, 또는 효소의 활성은 동일 타입의 조작되지 않은 세포, 단백질, 또는 효소, 예를 들면, 야생형 세포, 단백질, 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 세포 중 특정 단백질 또는 효소의 활성은 모세포, 예를 들면, 조작되지 않은 세포 중의 동일 단백질 또는 효소의 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 단백질 또는 효소의 증가된 활성을 갖는 세포는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
효소 또는 폴리펩티드의 활성 증가는 발현 증가 또는 비활성 (specific activity)의 증가에 의하여 얻을 수 있다. 상기 발현 증가는 효소 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되거나 카피 수가 증가되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 유전자가 도입되는 효모 세포는 자체적으로 상기 유전자를 포함하는 것, 또는 포함하고 있지 않은 것일 수 있다. 상기 유전자는 그의 발현을 가능하게 하는 조절 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 폴리 아데닐화 부위, 또는 그 조합과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 외부에서 도입되거나 또는 카피 수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 외부로부터 세포 내로 도입되는 유전자를 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. "이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미할 수 있다.
용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.
상기 유전자의 도입은 형질전환, 형질도입 (transfection), 전기천공 (electroporation)과 같은 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. 상기 유전자는 운반체 (vehicle)를 통하여 도입되거나, 그 자체로서 도입될 수 있다. 본 명세서에 있어서, "운반체"란 연결되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 특정한 유전자의 도입을 매개하는 핵산 서열이라는 관점에서, 본 명세서에서 운반체는, 벡터, 핵산 구조체, 및 카세트와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 해석된다. 벡터에는 예를 들면 플라스미드 또는 바이러스 유래 벡터 등이 포함된다. 플라스미드란 추가의 DNA가 연결될 수 있는 원형의 이중가닥 DNA 고리를 포함한다. 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터, 예를 들면, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스, 또는 그 조합이 포함될 수 있다. 효모 발현 벡터는 예를 들면, 사카로미세스 세레비지애에서의 발현을 위한 벡터일 수 있고, 그의 예로 pYepSec1, 2i, pAG-1, Yep6, Yep13, PEMBLYe23, pMFa, pJRY88, 또는 pYES2를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 유전자의 조작은 당업계에 공지된 분자생물학적 방법에 의할 수 있다 (Roslyn M. Bill, Recombinant Protein Production in Yeast: Methods and Protocols (2012), R Daniel Gietz et al., Quick and easy yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method: Nature protocols (2007)).
반면, 본 명세서에서 사용된 용어 "불활성화된(inactivated)" 또는 "감소된(decreased)" 활성은 모세포 (예, 유전적으로 조작되지 않은 세포) 중에서 측정된 것보다 더 낮은 효소 또는 폴리펩티드의 활성을 갖는 세포를 나타낸다. 또한, "불활성화된(inactivated)" 또는 "감소된(decreased)" 활성은 본래의 (original) 또는 야생형 (wild-type) 효소 또는 폴리펩티드보다 더 낮은 활성을 갖는 분리된 효소 또는 폴리펩티드를 나타낸다. 불활성화된 또는 감소된 활성은 활성이 없는 것 (no activity)을 포함한다. 예를 들면, 변형된 (예, 유전적으로 조작된) 세포 또는 효소에 대한 기질에서 생성물로의 효소 전환 활성이 상기 변형을 갖지 않은 세포 또는 효소, 예를 들면, 모세포 또는 "야생형 (wild-type)" 세포 또는 효소의 효소 전환활성에 비하여 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 효소 또는 세포의 감소된 효소 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 불활성화 또는 감소는 변형되지 않은 유전자를 갖는 세포, 예를 들면, 모세포 또는 야생형 세포에 비하여, 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우, 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 유전자 조작이 되지 않은 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다.
용어 "모세포 (parent cell)"는 본래 세포 (original cell), 예를 들면, 조작된 효모 세포에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상황에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 상기 모세포는 주어진 단백질 (예를 들면, DGA1, 또는 LRO1과 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질)의 불활성화된 또는 감소된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포, 또는 주어진 단백질 (예를 들면, AUR1, 또는 OLE1과 약 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질)의 증가된 활성을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포를 생산하는데 출발 물질 (starting material)로 사용된 세포일 수 있다. 더 설명하면, DGA1, 또는 LRO1을 코딩하는 유전자가 변형되어 세포 중 DGA1, 또는 LRO1 활성이 감소된 효모 세포에 대하여, 상기 모세포는 변형되지 않은 "야생형" DGA1, 또는 LRO1 유전자를 포함하는 효모 세포일 수 있다. 동일한 비교가 다른 유전적 변형에도 적용된다.
상기 효소의 활성은 상기 효소를 코딩하는 유전자의 결실(deletion) 또는 파괴(disruption)에 의하여 불활성화 또는 감소될 수 있다. 유전자의 상기 "결실 (deletion)" 또는 "파괴 (disruption)"는 상기 유전자의 일부 또는 전체의 돌연변이, 또는 프로모터 또는 터미네이터와 같은 상기 유전자의 조절 서열의 일부 또는 전체의 돌연변이로서, 자연적 유전자 산물에 비하여 상기 유전자가 발현되지 않거나 감소된 수준으로 발현되거나, 또는 활성이 없거나 감소된 활성을 갖는 유전자 산물 (예, 효소)을 발현하도록 하는 것일 수 있다. 상기 돌연변이는 상기 유전자의 하나 이상의 뉴클레오티드의 부가, 치환, 삽입, 결실 또는 전환을 포함할 수 있다. 상기 유전자의 결실 또는 파괴는 상동 재조합, 지향된 돌연변이유발 (directed mutagenesis), 또는 분자 진화 (molecular evolution)와 같은 유전적 조작법에 의해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 동일 유전자, 또는 유전자의 2 이상의 파라로그 (paralogs)를 포함한 경우, 하나 이상의 유전자는 제거 또는 파괴될 수 있다. 예를 들면, 상기 효소의 불활성화 또는 파괴는 상동 재조합에 의하여 야기될 수 있으며, 또는 상기 유전자의 일부 서열을 포함하는 벡터를 세포에 형질전환하고, 세포를 배양하여 상기 서열이 세포의 내인성 유전자와 상동 재조합이 일어나도록 하여 상기 유전자를 결실 또는 파괴되도록 한 후, 상동 재조합이 일어난 세포를 선별 마커에 의해 선별함으로써 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에 있어서 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어서 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50%이상, 55%이상, 60%이상, 65%이상, 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전적 변형 (genetic modification)"이란 세포의 유전물질의 구성 또는 구조를 인위적으로 변경시키는 것을 포함한다.
본 명세서에 있어서, 유기산은 달리 언급이 없으면 중성 상태의 유기산뿐만 아니라 수소 이온이 해리된 음이오 형태의 유기산과 교환가능하게 사용된다. 예를 들면, 락트산은 락테이트와 교환가능하게 사용된다.
일 양상은 포스파티딜이노시톨(PI)과 세라미드를 이노시톨 포스포릴세라미드(inositol phosphorylceramide:IPC)와 디아실글리세롤(DG 또는 DAG)로의 전환을 촉매하는 효소의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification), 지방 아실(fatty acyl)-CoA의 지방 아실 부위에 이중결합의 도입을 촉매하는 효소의 활성을 증가시키는 유전적 변형, 또는 그 조합 및/또는 디아실글리세롤(DG)로부터 트리아실글리세롤(TG 또는 TAG)의 형성을 촉매하는 효소의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 포함하는 것인, 내산성을 갖는 효모 세포를 제공한다.
상기 포스파티딜이노시톨(PI)과 세라미드(ceramides)를 IPC와 DG로의 전환을 촉매하는 효소는 PI로부터 포스포릴이노시톨(phosphorylinositol) 기를 세라미드의 C1-히드록시기에 전달하여 IPC와 DG의 형성을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 세라미드는 아미드 결합에 의하여 지방산에 연결된 긴-사슬 또는 스핀고이드 베이스일 수 있다. 예를 들면, 상기 스핀고이드 베이스는 다양한 디- 또는 트리히드록시 스핀고이드 베이스일 수 있고, 상기 지방산은 2번 위치에 선택적으로 히드록실 기를 갖는, 포화 및 모노에노인(monoenoic)의 탄소 수 16 이상의 것일 수 있다.
상기 포스파티딜이노시톨(PI)과 세라미드를 IPC와 DG로의 전환을 촉매하는 효소는 예로서, 다음 반응을 촉매하는 것일 수 있다.
Figure 112015073463553-pat00001
(스킴1)
상기 스킴1에서, PI(1)와 DG(4) 중의 R1 및 R2는 지방산으로부터 유래된 것으로서 지방산의 카르보닐 기를 제외한 부분일 수 있다. R1 및 R2는 각각 서로 독립적으로 선형 또는 분지된, 포화 또는 불포화된, 선택적으로 모노- 또는 폴리히드록실화된, C1-C50, 예를 들면, C5-C50, C5-C35, C13-C33, 또는 C13-C25 히드로카본 라디칼이다. 여기서, R1 및 R2는 각각 서로 독립적으로, 예를 들면, 1개, 2개, 또는 3개의 이중결합을 포함하고, 및/또는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 히드록실화를 갖는 것일 수 있다. 세라미드(2)와 IPC(3) 중의 R3 및 R3은 각각 서로 독립적으로 선형 또는 분지된, 포화 또는 불포화된, 선택적으로 모노- 또는 폴리히드록실화된, C1-C50, 예를 들면, C5-C50, C5-C35, C13-C33, 또는 C13-C25 히드로카본 라디칼이다. 일 구체예에서, 상기 세라미드(2)와 IPC(3) 중의 R3 및 R4는 각각 서로 독립적으로 포화 또는 불포화된, 선형인 선택적으로 히드록실화된 C13-C25, 또는 C15-C25 알킬 라디칼이다. 여기서, R3 및 R4는 각각 서로 독립적으로, 예를 들면, 1개, 2개, 또는 3개의 이중결합을 포함하고, 및/또는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 히드록실화를 갖는 것일 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 세라미드(2)와 IPC(3) 중의 R3은 연결에 참여한 탄소를 1번으로 하였을 때, 1번 탄소가 히드록실화되거나, 1번 탄소와 2번 탄소에 이중결합을 갖는 C13-C15 알킬 라디칼이고, 상기 R4는 연결에 참여한 탄소를 1번으로 하였을 때, 1번 탄소 및/또는 2번 탄소가 선택적으로 히드록실화된 C16-C25 알킬 라디칼이다. 상기 R4는 연결에 참여한 탄소를 1번으로 하였을 때, 1번 탄소가 히드록실화된 C25 알킬 라디칼일 수 있다. 상기 세라미드는 피토세라미드일 수 있다.
상기 포스파티딜이노시톨(PI)과 세라미드(ceramides)를 IPC와 DG로의 전환을 촉매하는 효소는 IPC 신타제 또는 그의 서브유니트를 포함한다. 상기 효소는 IPC 신타제 촉매 서브유니트 AUR1일 수 있다. 상기 AUR1은 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. AUR1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. AUR1은 PI로부터 myo-이노시톨 포스페이트 기를 세라미드 또는 피토세라미드의 C1-히드록실에 DG의 방출과 함께 전달하여 IPC를 형성하는 것일 수 있다. 상기 피토세라미드는 지방산으로서 2번 위치에 히드록실기를 갖는 C26의 지방산일 수 있다.
상기 지방 아실-CoA의 지방 아실 부위에 이중결합의 도입을 촉매하는 효소에 있어서, 지방 아실 기는 생체 내에 발견되는 임의의 길이의 탄소 수를 갖는 것일 수 있다. 상기 지방 아실 기는 탄소 수 14 내지 50, 14 내지 40, 14 내지 36, 14 내지 30, 14 내지 26, 16 내지 30, 또는 16 내지 24인 것일 수 있다. 상기 효소는 효소코드(EC) 1.14.19.1에 속하는 효소일 수 있다. 상기 효소는 아실-CoA 데사투라제1(Acyl-CoA desaturase 1: OLE1)일 수 있다. 상기 OLE1은 서열번호 3 또는 5의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. OLE1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 5의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 4 또는 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. OLE1 또는 그 유전자는 S.cerevisiae 또는 Pichia kudriavzevii 유래의 것일 수 있다.
상기 디아실글리세롤(DG)로부터 트리아실글리세롤(TG)의 형성을 촉매하는 효소에 있어서, 상기 DG 또는 TG에 포함된 아실기는 생체 내에 발견되는 임의의 길이의 탄소 수를 갖는 것일 수 있다. 상기 지방 아실 기는 탄소 수 14 내지 50, 14 내지 40, 14 내지 36, 14 내지 30, 14 내지 26, 16 내지 30, 또는 16 내지 24인 것일 수 있다. 상기 효소는 효소코드(EC) 1.14.19.1에 속하는 효소일 수 있다. 상기 DG는 sn1,2 또는 sn1,3 DG일 수 있다. 상기 효소는 효소코드(EC) 2.3.1.22 및 2.3.1.158에 속하는 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 효소는 디아실글리세롤 O-아실트란스퍼라제1(diacylglycerol O-acyltransferase 1: DGA1) 또는 포스포리피드:디아실글리세롤 아실트란스퍼라제(phospholipid:diacylglycerol acyltransferase: LRO1)일 수 있다. DGA1은 아실-CoA +1,2-디아실글리세롤 -> CoA + 트리아실글리세롤의 반응을 촉매하는 것일 수 있다. LRO1은 아실-CoA 독립적 경로에 의하여 TG를 생성하는 것이다. LRO1은 포스포리피드의 sn-2 위치로부터 아실기를 디아실글리세롤로 특이적으로 전달하여, sn-1-리소포스포리피드와 트리아실글리세롤를 형성하는 것일 수 있다. LRO1은 포스포리피드+1,2-디아실글리세롤 -> 리소포스포리피드+트리아실글리세롤의 반응을 촉매하는 것일 수 있다.
상기 DGA1 및 LRO1은 각각 서열번호 7 및 9의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. DGA1 및 LRO1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 7 또는 9의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 각각 서열번호 8 또는 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포에 있어서, 상기 유전적 변형은 IPC의 형성을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자, 상기 지방 아실-CoA의 지방 아실 부위에 이중결합의 도입을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합의 발현을 증가시키는 것이거나, 디아실글리세롤(DG)로부터 트리아실글리세롤(TG)의 형성을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다.
상기 효모 세포에 있어서, 상기 유전적 변형은 서열번호 1, 3 또는 5의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 것, 또는 서열번호 7 또는 9의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 아스코미코타 (Ascomycota)에 속하는 것일 수 있다. 상기 아스코미코타는 사카로미세타세 (Saccharomycetaceae)일 수 있다. 상기 사카로미세타세는 사카로미세스 속 (Saccharomyces genus), 클루이베로미세스 속 (Kluyveromyces genus), 칸디다 속 (Candida genus), 피치아 속 (Pichia genus), 이사첸키아 속 (Issatchenkia genus), 데바리오미세스 속 (Debaryomyces genus), 지고사카로미세스 속 (Zygosaccharomyces genus), 또는 사카로미콥시스 속 (Saccharomycopsis genus)일 수 있다. 상기 사카로미세스 속은 예를 들면, 사카로미세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로미세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로미세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로미세스 불데리 (S. bulderi), 사카로미세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로미세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로미세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로미세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로미세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로미세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로미세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로미세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로미세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로미세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로미세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로미세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로미세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로미세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로미세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로미세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로미세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로미세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로미세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다. 상기 클루이베로미세스 속은 클루이베로미세스 터모톨레란스 (K. thermotolerans)일 수 있다. 상기 칸디다 속은 칸디다 글라브라타 (C. glabrata)일 수 있다. 지고사카로미세스 속은 지고사카로미세스 속은 지고사카로미세스 바일리 (Z. bailli) 또는 지고사카로미세스 로욱시 (Z. rouxii)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 효모 세포는 사카로미세스 세레비지애일 수 있다.
상기 효모 세포는, 내산성을 갖는 것일 수 있다. 본 명세서에 있어서, "내산성 (acid tolerant)"이란 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 좋은 성장을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20, 예를 들면, C1 내지 C18, C1 내지 C16, C1 내지 C14, C1 내지 C12, C1 내지 C10, C1 내지 C8, C1 내지 C6, C2 내지 C18, C3 내지 C16, C2 내지 C14, C3 내지 C12, C2 내지 C10, C2 내지 C8, 또는 C2 내지 C6을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 조작되지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 생장할 수 있는 것일 수 있다.
또는 "내산성 (acid tolerant)"이란 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 높은 생존을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20, 예를 들면, C1 내지 C18, C1 내지 C16, C1 내지 C14, C1 내지 C12, C1 내지 C10, C1 내지 C8, C1 내지 C6, C2 내지 C18, C3 내지 C16, C2 내지 C14, C3 내지 C12, C2 내지 C10, C2 내지 C8, 또는 C2 내지 C6을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 조작되지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 생존할 수 있는 것일 수 있다.
또는 "내산성 (acid tolerant)"이란 조작되지 않은 세포에 비하여, 산성 조건에서 더 좋은 대사 과정을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20, 예를 들면, C1 내지 C18, C1 내지 C16, C1 내지 C14, C1 내지 C12, C1 내지 C10, C1 내지 C8, C1 내지 C6, C2 내지 C18, C3 내지 C16, C2 내지 C14, C3 내지 C12, C2 내지 C10, C2 내지 C8, 또는 C2 내지 C6을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 조작도지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 대사할 수 있는 것일 수 있다. 이때 "대사할 수 있는 (metabolizable)"의 정도는 세포당 영양분 흡수율, 예를 들면, 세포당 포도당 흡수율을 통해 측정될 수 있다. 또는 "대사할 수 있는 (metabolizable)"의 정도는 세포당 산물 배출율, 예를 들면 세포당 이산화탄소 배출율을 통해 측정될 수 있다.
상기 효모 세포는 천연 효모 세포뿐만 아니라, 산물, 예를 들면, 락테이트와 같은 유기산 생산능을 갖는 변이 효모 세포도 포함할 수 있다. 상기 변이 효모 세포는 예를 들면, 상기 산물 (예, 유기산)의 합성에 관련된 단백질의 활성이 증가된 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 산물의 합성에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되거나, 상기 유전자의 발현이 증가되도록 그의 내재적 유전자가 증폭되거나, 그의 내재적 유전자 또는 그 조절 서열이 변이된 것일 수 있다. 또한, 상기 변이 효모는 상기 산물의 분해에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화되거나, 감소된 것일 수 있다.
상기 산물은 유기산, 단백질, 지방, 또는 당일 수 있다. 상기 산물은 예를 들면, 일정한 산도 이하에서는 전하, 예를 들면 음전하를 띠고 있지 않아, 유리된 화합물 (free compound)의 형태를 갖는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 산물을 분리하기 위하여 카운터 이온 (counter ion)을 사용하여 염의 형태로 제조할 필요가 없다. 상기 산물은 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20, 예를 들면, C1 내지 C18, C1 내지 C16, C1 내지 C14, C1 내지 C12, C1 내지 C10, C1 내지 C8, C1 내지 C6, C2 내지 C18, C3 내지 C16, C2 내지 C14, C3 내지 C12, C2 내지 C10, C2 내지 C8, 또는 C2 내지 C6을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 시트르산, 옥살산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 유기산은 분자 중에 탄소와 탄소 사이의 불포화 결합, 예를 들면, 이중결합 또는 삼중 결합을 갖지 않는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 젖산 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 락테이트 합성에 관련된 단백질의 활성이 증가된 것일 수 있다. 상기 증가는 예를 들면, 상기 젖산 합성에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자의 발현의 증가에 의한 것일 수 있다. 상기 증가는 예를 들면, 상기 젖산 합성에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되거나, 상기 유전자의 발현이 증가되도록 그의 내재적 유전자가 증폭되거나, 그의 내재적 유전자 또는 그 조절 서열이 변이된 것에 의할 수 있다. 상기 증가는 대조군 대비 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다.
상기 젖산 합성에 관련된 단백질은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성 즉, 락테이트 데히드로게나제일 수 있다. 락테이트 데히드로게나제의 활성은 락테이트를 생산하는데 충분한 정도로 증가된 것일 수 있다.
상기 "락테이트 데히드로게나제 (lactate dehydrogenase: LDH)"는 피루베이트를 락테이트로 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있으며, 또한 L-락테이트 또는 D-락테이트에 각각 작용할 수 있다. 상기 NAD(P)-의존성 효소는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.27, 또는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.1.28 로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 11의 락테이트 데히드로게나제 및 서열번호 12의 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 Sordaria macrospora로부터 유래한 것이다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 서열번호 13의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 13의 락테이트 데히드로게나제 및 서열번호 14의 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 일본 자라 (Pelodiscus sinensis japonicus)로부터 유래한 것이다.
상기 효모 세포는 단일 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 복수의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 예를 들면, 2 내지 10 카피 수를 포함할 수 있다. 상기 효소 세포는, 예를 들면, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 또는 2 내지 3 카피의 LDH 유전자를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 각각의 폴리뉴클레오티드는 동일한 폴리뉴클레오티드의 카피이거나 둘 이상의 상이한 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 카피를 포함할 수 있다. 외인성 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌(locus), 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있다.
또한, 상기 효모는 젖산의 분해에 관련된 단백질의 활성이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 제거 또는 감소는 젖산의 분해에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화되거나, 감쇄된 것일 수 있다. 상기 젖산의 분해에 관련된 단백질은 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 활성을 가진 폴리펩티드, 예를 들면 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: PDC), 락테이트를 피루베이트로 전환하는 활성을 가진 폴리펩티드, 예를 들면 락테이트 시트크롬-c 옥시도리덕타제 (CYB2), 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 예를 들면, 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (cytosolic glycerol-3-phosphate dehydrogenase: GPD1), 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활성의 감소는 대조군에 대하여 활성이 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다.
피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 활성을 가진 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 15의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: PDC)를 코딩하는 pdc1 또는 pdc2일 수 있다. 서열번호 15의 PDC 및 서열번호 16의 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 사카로미세스 세레비지애로부터 유래한 것이다.
상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 활성을 가진 폴리펩티드는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 활성을 가진 폴리펩티드는 락테이트 시트크롬-c 옥시도리덕타제 (CYB2)일 수 있다. 상기 락테이트 시트크롬 c-옥시도리덕타제는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.4, 또는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 17의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 17의 CYB2 및 서열번호 18의 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 사카로미세스 세레비지애로부터 유래한 것이다.
상기 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 활성을 가진 폴리펩티드는 NADH의 NAD+로의 산화를 이용하여 DHAP를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 효소는 EC 1.1.1.8로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (cytosolic glycerol-3-phosphate dehydrogenase: GPD1)일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 19의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 gdp1일 수 있다.
상기 효모 세포에 있어서, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제의 활성은 락테이트를 생산하는데, 또는 락테이트를 생산하는 효모 세포의 락테이트 생산을 개선하는데, 충분한 정도로 불활성화 또는 감소되어 있는 것일 수 있다.
상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 EC.1.6.5.9 또는 EC. 1.6.5.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 유형 Ⅱ NADH:유비퀴논 옥시도리덕타제 (type Ⅱ NADH:ubiquinone oxidoreductase)일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 세포질 (cytoplasm)을 향하는 내부 미토콘드리아막의 외부면에 위치한 것일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 시토졸 NADH (cytosolic NADH)의 NAD+로의 산화를 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 해당과정에 의해 형성된 시토졸 NADH의 재산화시키는 것일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 시토졸 NADH를 미토콘드리아 호흡 연쇄 (mitochondrial respiratory chain)에 제공하는 것일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 NDE1, NDE2, 또는 그의 조합일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 미토콘드리아 내부에 위치하여 작용하는 인터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (internal mitochondral NADH dehydrogenase) NDI1과 구별되는 것일 수 있다. 상기 NDE1 및 NDE2 각각은 개별적으로, 서열번호 21 및 22의 아미노산 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다. 상기 NDE1을 코딩하는 유전자 및 상기 NDE2를 코딩하는 유전자 각각은 개별적으로 서열번호 23 및 24의 뉴클레오티드 서열과 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는, 수탁번호 KCTC 12415 BP인 효모 세포에 포스파티딜이노시톨(PI)과 세라미드를 이노시톨 포스포릴세라미드(inositol phosphorylceramide:IPC)와 디아실글리세롤(DG)로의 전환을 촉매하는 효소의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification), 지방 아실(fatty acyl)-CoA의 지방 아실 부위에 이중결합의 도입을 촉매하는 효소의 활성을 증가시키는 유전적 변형, 또는 그 조합 및/또는 디아실글리세롤(DG)로부터 트리아실글리세롤(TG)의 형성을 촉매하는 효소의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 포함하고, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 NDE1 및/또는 NDE2의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기한 효모 세포를 배지 중에서 배양하여 배양물을 생성하는 단계; 및 상기 배양물로부터 유기산을 회수하는 단계를 포함하는 유기산을 생산하는 방법으로서, 상기 효모 세포는 상기 유기산의 형성을 촉매하는 효소의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 갖는 것인 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기한 내산성을 갖는 효모 세포를 배지 중에서 배양하는 단계를 포함한다. 상기한 내산성을 갖는 효모 세포에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 배양은 탄소원, 예를 들면, 글루코스를 함유하는 배지에서 수행될 수 있다. 효모 세포 배양에 사용되는 배지는 적절한 보충물을 함유한 최소 또는 복합 배지와 같은, 숙주 세포의 성장에 적합한 임의의 통상적인 배지일 수 있다. 적합한 배지는 상업적인 판매자로부터 입수 가능하고 또는 공지된 제조법에 따라 제조될 수 있다.
상기 배양에 선택되는 산물에 따라 특정한 효모 세포의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 염, 미량 원소, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 배양의 조건은 선택되는 산물, 예를 들면, 락테이트와 같은 유기산의 생산에 적합하게 적절히 조절될 수 있다. 상기 배양은 세포 증식을 위하여 호기성 조건에서 이루어질 수 있다. 선택적으로, 그 후 산물, 예를 들면, 락테이트와 같은 유기산을 생산하기 위하여 상기 세포를 혐기 또는 미세호기 조건에서 배양할 수 있다. 상기 산소 조건은 용존산소 (dissolved oxygen: DO) 농도가 0% 내지 10%, 예를 들면 0 내지 8%, 0 내지 6%, 0 내지 4%, 0 내지 2%, 0.1% 내지 10%, 1% 내지 10%, 2% 내지 10%, 3% 내지 10%, 4% 내지 10%, 5% 내지 10%, 6% 내지 10%, 7% 내지 10%, 8% 내지 10%, 9% 내지 10%, 1% 내지 8%, 2% 내지 8%, 3% 내지 8%, 4% 내지 8%, 5% 내지 8%, 6% 내지 8%, 7% 내지 8%, 1% 내지 6%, 2% 내지 6%, 3% 내지 6%, 4% 내지 6%, 5% 내지 6%, 1% 내지 5%, 2% 내지 5%, 2% 내지 4%, 또는 2% 내지 5%와 같은 미세 호기성(microaerobic) 조건을 포함할 수 있다.
용어, "배양 조건"은 효모 세포를 배양하기 위한 조건을 의미한다. 이러한 배양 조건은 예를 들어, 효모 세포가 이용하는 탄소원, 질소원 또는 산소 조건일 수 있다. 효모가 이용할 수 있는 탄소원은 단당류, 이당류 또는 다당류가 포함할 수 있다. 상기 탄소원은 자화가능한 당으로서, 글루코스, 프럭토스, 만노스, 또는 갈락토스를 포함할 수 있다. 상기 질소원은 유기 질소 화합물, 또는 무기 질소 화합물일 수 있다. 상기 질소원은 아미노산, 아미드, 아민, 질산염, 또는 암모늄염 일 수 있다. 효모 세포를 배양하는 산소 조건에는 정상 산소 분압의 호기성 조건, 대기중에 0.1% 내지 10%의 산소를 포함하는 저산소 조건, 또는 산소가 없는 혐기성 조건이 있다. 대사 경로는 효모 세포가 실제로 이용 가능한 탄소원 및 질소원에 맞추어 수정될 수 있다.
상기 배양은 배양 전부 또는 그 일부의 기간 동안 산성 조건에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위일 수 있다.
상기 산물은 유기산, 단백질, 지방, 또는 당일 수 있다. 상기 산물은 예를 들면, 일정한 산도 이하에서는 전하, 예를 들면 음전하를 띠고 있지 않아, 유리된 화합물 (free compound)의 형태로 갖는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 산물을 분리하기 위하여 카운터 이온 (counter ion)을 사용하여 염의 형태로 제조할 필요가 없다. 상기 산물은 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20, 예를 들면, C1 내지 C18, C1 내지 C16, C1 내지 C14, C1 내지 C12, C1 내지 C10, C1 내지 C8, C1 내지 C6, C2 내지 C18, C3 내지 C16, C2 내지 C14, C3 내지 C12, C2 내지 C10, C2 내지 C8, 또는 C2 내지 C6을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 시트르산, 옥살산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 유기산은 분자 중에 탄소와 탄소 사이의 불포화 결합, 예를 들면, 이중결합 또는 삼중 결합을 갖지 않는 것일 수 있다.
상기 방법은 배양물로부터 산물을 분리하는 단계;를 포함한다. 상기 분리는 선택되는 산물에 따라 알려진 분리 방법이 적절하게 선택될 수 있다. 상기 분리하는 단계는 배양물로부터 산물을 염의 형태가 아닌 유리 화합물 (free compound), 예를 들면, 유리산 (free acid)의 형태로 분리하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 효모 세포는 수탁번호 KCTC 12415 BP인 효모 세포에 포스파티딜이노시톨(PI)과 세라미드를 이노시톨 포스포릴세라미드(inositol phosphorylceramide:IPC)와 디아실글리세롤(DG)로의 전환을 촉매하는 효소의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification), 지방 아실(fatty acyl)-CoA의 지방 아실 부위에 이중결합의 도입을 촉매하는 효소의 활성을 증가시키는 유전적 변형, 또는 그 조합 및/또는 디아실글리세롤(DG)로부터 트리아실글리세롤(TG)의 형성을 촉매하는 효소의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 포함하고, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 NDE1 및/또는 NDE2의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 포함하는 것인 효모 세포이고, 젖산 생산능을 갖는 것일 수 있다.
다른 양상은 효모 세포에 포스파티딜이노시톨(PI)과 세라미드를 이노시톨 포스포릴세라미드(inositol phosphorylceramide:IPC)와 디아실글리세롤(DG)로의 전환을 촉매하는 효소의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification), 지방 아실(fatty acyl)-CoA의 지방 아실 부위에 이중결합의 도입을 촉매하는 효소의 활성을 증가시키는 유전적 변형, 또는 그 조합 및/또는 디아실글리세롤(DG)로부터 트리아실글리세롤(TG)의 형성을 촉매하는 효소의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 도입하는 단계;를 포함하는, 내산성 효모 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 효모 세포는 아스코미코타 (Ascomycota)에 속하는 것일 수 있다. 상기 아스코미코타는 사카로미세타세 (Saccharomycetaceae)일 수 있다. 상기 사카로미세타세는 사카로미세스 속 (Saccharomyces genus), 클루이베로미세스 속 (Kluyveromyces genus), 칸디다 속 (Candida genus), 피치아 속 (Pichia genus), 이사첸키아 속 (Issatchenkia genus), 데바리오미세스 속 (Debaryomyces genus), 지고사카로미세스 속 (Zygosaccharomyces genus), 또는 사카로미콥시스 속 (Saccharomycopsis genus)일 수 있다. 상기 사카로미세스 속은 예를 들면, 사카로미세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로미세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로미세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로미세스 불데리 (S. bulderi), 사카로미세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로미세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로미세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로미세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로미세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로미세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로미세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로미세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로미세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로미세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로미세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로미세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로미세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로미세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로미세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로미세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로미세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로미세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로미세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다. 상기 클루이베로미세스 속은 클루이베로미세스 터모톨레란스 (K. thermotolerans)일 수 있다. 상기 칸디다 속은 칸디다 글라브라타 (C. glabrata)일 수 있다. 지고사카로미세스 속은 지고사카로미세스 속은 지고사카로미세스 바일리 (Z. bailli) 또는 지고사카로미세스 로욱시 (Z. rouxii)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 효모 세포는 사카로미세스 세레비지애일 수 있다. 상기 효모 세포는 수탁번호 KCTC 12415 BP인 효모 세포일 수 있다.
상기 방법은 상기 효모 세포에 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 NDE1 및/또는 NDE2의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 유전적 변형은 상기 유전자를 증폭하는 것, 상기 유전자의 조절 서열을 조작하는 것, 또는 상기 유전자 자체의 서열을 조작하는 것을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조작은 뉴클레오티드의 삽입, 치환, 전환 또는 부가인 것일 수 있다.
상기 방법은, 출발 효모 세포에 산물, 예를 들면, 락테이트와 같은 유기산 생산능을 갖도록 하는 유전적 변형을 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 출발 효모 세포에 상기 산물 (예, 유기산)의 합성에 관련된 단백질의 활성이 증가되도록 하는 유전적 변형을 도입하는 것을 포함할 있다. 예를 들면, 상기 산물의 합성에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자가 도입되거나, 상기 유전자의 발현이 증가되도록 그의 내재적 유전자가 증폭되거나, 그의 내재적 유전자 또는 그 조절 서열이 변이되도록 하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 출발 효모에 상기 산물의 분해에 관련된 단백질을 코딩하는 유전자가 불활성화되거나, 감소되도록 하는 유전적 변형을 도입하는 것을 더 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 내산성을 갖는 효모 세포에 의하면, 산성이 조건에서 효모 세포를 배양할 수 있다.
다른 양상에 따른 유기산을 생산하는 방법에 의하면, 산성 조건에서도 유기산을 효율적으로 생산할 수 있다.
다른 양상에 따른 내산성 효모 세포를 생산하는 방법에 의하면, 내산성 효모 세포를 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다.
도 2는 pUC57-ura3HA 벡터를 나타내는 도면이다.
도 3은 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH 벡터를 나타내는 도면이다.
도 4는 pUC19-HIS3 벡터를 나타낸다.
도 5는 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3 벡터를 나타내는 도면이다.
도 6은 S.cerevisiae에 있어서 DGA1 및 LRO1 유전자의 결실이 산성 조건에서 세포 성장에 미치는 영향을 평가를 나타낸다.
도 7은 S.cerevisiae에 있어서 DGA1 및 LRO1 유전자의 결실이 산성 조건에서 세포 성장 및 락테이트 생산에 미치는 영향을 평가를 나타낸다.
도 8은 S.cerevisiae에 있어서 DGA1 및 LRO1 유전자의 결실이 산성 조건에서 세포 중 지질 성분 함량에 미치는 영향을 평가를 나타낸다.
도 9는 S.cerevisiae에 있어서 AUR1 유전자의 과발현이 산성 조건에서 세포 성장에 미치는 영향을 평가를 나타낸다.
도 10은 S.cerevisiae에 있어서 AUR1 유전자의 과발현이 산성 조건에서 세포 성장 및 락테이트 생산에 미치는 영향을 평가를 나타낸다.
도 11은 S.cerevisiae에 있어서 AUR1 유전자의 과발현이 산성 조건에서 세포 중 지질 성분 함량에 미치는 영향을 평가를 나타낸다.
도 12는 S.cerevisiae에 있어서 OLE1 유전자의 과발현이 산성 조건에서 세포 성장에 미치는 영향을 평가를 나타낸다.
도 13은 S.cerevisiae에 있어서 OLE1 유전자의 과발현이 산성 조건에서 세포 성장 및 락테이트 생산에 미치는 영향을 평가를 나타낸다.
도 14는 S.cerevisiae에 있어서 OLE1 유전자의 과발현이 산성 조건에서 세포 중 지질 성분 함량에 미치는 영향을 평가를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 락테이트의 고효율 생산을 위한 균주 제작
사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (MAT α ura3 -52; trp1 -289; leu2 -3,112; his3 ㅿ 1; MAL2 -8 C ; SUC2 , EUROSCARF accession number: 30000B)를 락테이트 생산 균주로 이용하여, 주요 부산물인 에탄올과 글리세롤 생산 경로 차단을 위해, 알코올 발효의 주요 효소인 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase: pdc1) 유전자, 글리세롤 생합성의 주요 효소인 NAD-의존성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제 (NAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase: gpd1) 유전자, 및 락테이트 분해 효소 락테이트 리아제(lactate lyase)인 L-락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제 (L-lactate cytochrome-c oxidoreductase2: cyb2) 유전자를 상동 재조합에 의하여 불활성화시켰다. 또한, trp1 부위에 ldh 유전자를 도입하고, nde1 및 nde2 유전자를 불활성화시켰다.
1. L- LDH 과발현 및 pdc1 , gpd1 , 및 cyb2 유전자가 불활성화된 균주의 제조
(1) L- LDH 과발현 벡터 제조
L-ldh 과발현을 위해 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 25와 26의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 얻어진 CCW12 프로모터 PCR 절편을 SacI과 XbaI으로 절단하고 이를 SacI과 XbaI으로 절단한 p416-GPD (ATCC 87360TM)에 도입하여 p416-CCW12p 벡터를 제작하였다.
그 후, 일본 자라 (Pelodiscus sinensis japonicus) 유래의 L-ldh(서열번호 14)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 27와 28의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 p416-CCW12p를 BamHI 과 SalI으로 절단하고 이들을 서로 연결하여 L-ldh 발현 벡터인 p416-CCW12p-LDH를 제작하였다.
또한, 상기 L-ldh 발현 벡터는 서열번호 29의 효모 자가복제 서열(ARS)/효모 동원체 서열(CEN), 서열번호 30의 CYC1 터미네이터 및 서열번호 13의 일본 자라 유래의 L-ldh 유전자를 포함한다. 또한, 상기 CCW12 프로모터는 서열번호 31의 CYC 프로모터, 서열번호 32의 GPD 프로모터, 및 서열번호 33의 ADH 프로모터로 치환될 수 있다.
도 1은 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 벡터에 일본 자라 유래의 LDH가 도입되어 있다.
(2) 유전자 교환 벡터 제조
PDC1, CYB2, 및 GPD1 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실하는 동시에 L-ldh 유전자를 삽입하기 위하여 유전자 교환벡터를 다음과 같이 제작하였다. 도 2는 pUC57-ura3HA 벡터 (서열번호 34)를 나타내는 도면이다. 3HA는 HA (haemagglutinin) 유전자의 3 반복을 나타낸다. 도 3은 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH 벡터를 나타내는 도면이다.
제작된 p416-CCW12p-LDH를 주형으로 하고, 서열번호 35과 36의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 pUC57-ura3HA 벡터를 SacI으로 절단하고 이들을 서로 연결하여 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH 벡터를 제작하였다.
PDC1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH를 주형으로 하고 서열번호 37과 38의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 PDC1 유전자 결실 카세트를 제작하였다.
CYB2 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH를 주형으로 하고 서열번호 39와 40의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 CYB2 유전자 결실 카세트를 제작하였다.
GPD1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA-CCW12p-LDH를 주형으로 하고 서열번호 41과 42의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 GPD1 유전자 결실 카세트를 제작하였다.
(3) pdc1 , gpd1 , 및 cyb2 유전자의 불활성화
사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D에서 pdc1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D를 YPD 한천 (10g yeast extract, 20g/L peptone, 20g/L 포도당 및 20g/L 한천) 플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체 배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD600이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15(v/v)% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.
pdc1 유전자 제거를 위해, 상기 1의 (2)에서 제작된 PDC1 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 및 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 한천 (YSD (Yeast Synthetic Drop-out) 배지: 6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y0626), 1.4g/L Yeast synthetic drop-out without uracil (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1501), 20g/L glucose, 및 20g/L 한천)에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 한천 플레이트에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 pdc1 결실을 확인하기 위해 서열번호 43과 44의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 pdc1 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh+ura3)을 수득하였다.
또한, 상기 유전자 치환 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 상기 CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh+ura3) 균주 제작을 위해 도입된 선발 마커 URA3 유전자를 상기 균주로부터 다음과 같이 제거하였다. 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh+ura3)를 YPD 액체 배지 (10 g/L Yeast extract, 20 g/L peptone and 20 g/L glucose) 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA 함유 YSD 플레이트 (YSD 배지: 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out, 20 g/L glucose, 1ug/L of 5-fluoroorotic acid (5-FOA) 및 20 g/L of agar)에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 10개 (URA3 pop-out 균주)를 선별해 다시 5-FOA 함유 YSD 배지 플레이트에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 43과 44의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh)을 수득하였다.
사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::ldh)에서 cyb2가 결실된 변이 균주를 다음과 같이 제작하였다. 수득된 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::ldh)를 YPD 한천 (10 g/L of yeast extract, 20 g/L of peptone, 20 g/L of glucose, and 20 g/L agar) 플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체 배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD600이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15(v/v)% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.
cyb2 유전자 제거를 위해, 상기 pdc1 유전자 결실과 동일한 방법으로 실시예 1.1.2에서 제작된 cyb2 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 및 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 한천 (YSD medium, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out without uracil, 20 g/L glucose, and 20 g/L of agar) 플레이트에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 한천 플레이트에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 cyb2 결실을 확인하기 위해, 서열번호 45과 46의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 cyb2 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldh +ura3)을 수득하였다.
또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 cyb2 결실을 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::ldh Δcyb2::ldh +ura3)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA (YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out, 20 g/L glucose, 1 ug/L of 5-fluoroorotic acid, and 20 g/L agar)에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 한천 배지에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 36과 37의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (Δpdc1::ldh Δcyb2::ldh)을 수득하였다.
사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldhΔcyb2::ldh)에서 gpd1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 수득된 사카로미세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (Δpdc1::ldhΔcyb2::ldh)를 YPD 한천 (10 g/L of yeast extract, 20 g/L of peptone, 20 g/L of glucose, and 20 g/L agar) 배지 플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD600이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15(v/v)% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.
gpd1 유전자 제거를 위해, 상기 pdc1 및 cyb2 유전자 결실과 동일한 방법으로 상기1의 (2)에서 제작된 gpd1 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA) 및 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldhΔcyb2::ldh)를 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 uracil 무첨가 최소 한천 (YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out without uracil, 20 g/L glucose, and 20 g/L of agar) 배지 플레이트에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 uracil 무첨가 최소 한천 배지 플레이트에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 gpd1 결실을 확인하기 위해 서열번호 47과 48의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 gpd1 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldhㅿgpd1::ldh +ura3)을 수득하였다.
또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 gpd1 결실을 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh Δcyb2::ldh ㅿgpd1::ldh +ura3)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA 함유 한천 (YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out, 20 g/L glucose, 1 ug/L of 5-fluoroorotic acid, and 20 g/L agar) 플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 함유 한천 배지 플레이트에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 47과 48의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh Δcyb2::ldh ㅿgpd1::ldh)을 수득하였다.
사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh ㅿcyb2::ldhΔgpd1::ldh)를 2013년 5월 30일에 한국생명공학연구원(KCTC)에 기탁하고, 수탁번호 제KCTC 12415BP호를 부여받았다.
2. LDH 유전자의 추가 도입
제작된 KCTC12415BP호에 산화 환원 밸런스 (redox balance) 강화와 같은 락테이트의 생산 증가를 위하여 추가 변형 및/또는 락테이트 생산 경로의 강화를 위해 L-ldh를 게놈 내에 추가적으로 도입할 수 있다. 그 방법은 다음과 같다.
L-ldh의 추가 도입을 위해 유전자 도입 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 도 4는 pUC19-HIS3 벡터 (서열번호 49)를 나타낸다. pRS413 (ATCC8758) 벡터를 주형으로 하고 서열번호 50 및 51의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 얻은 HIS3 PCR 단편을 SalI으로 자르고, 이를 SalI으로 자른 pUC19 벡터 (NEB, N3041)에 삽입하여, HIS3 유전자를 위한 선택 마커로서 사용될 수 있는 pUC19-HIS3 벡터를 제조하였다. 도 5는 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3 벡터를 나타내는 도면이다.
제작된 상기의 p416-CCW12p-LDH를 주형으로 하고, 서열번호 35과 36의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 pUC19-HIS3 벡터를 SacI으로 절단하고 이들을 서로 라이게이션하여 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3를 제작하였다.
또한, KCTC12415BP 균주의 게놈 내에 L-ldh 추가 도입하기 위하여, 제작된 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3를 주형으로 하고 서열번호 52과 53의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 TRP1 (phosphoribosyl-anthranilate isomerase) 유전자 위치에 삽입하기 위한 카세트를 제작하였다.
상기 L-ldh를 포함하는 카세트는 TRP1의 유전좌에 삽입될 수 있고, 이 경우 TRP1 유전자가 결실되면서 L-ldh가 삽입될 수 있다. L-ldh 삽입 변이 균주는 다음과 같이 제작하였다.
상기 제작된 KCTC12415BP 균주를 YPD 한천 플레이트agar plate (10 g/L of yeast extract, 20 g/L of peptone, 20 g/L of glucose, and 20 g/L of agar)에 도말하여 24시간 동안 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 10ml에 접종하여 18시간 동안 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250ml 플라스크에 담긴 YPD 액체배지 50ml에 1%(v/v) 접종하여 230rpm, 30℃ 배양기에서 배양하였다.
약 4-5시간 후, OD600이 0.5 정도가 되면 4,500rpm, 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 100mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그리고 다시 4,500rpm, 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 15(v/v)% 글리세롤이 첨가된 1M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 100ul씩 분주하였다.
TRP1 결실과 동시에 L-ldh 발현을 위해 실시예 1.3.1에서 제작된 HIS3 유전자를 선별마커로 포함한 L-ldh 발현 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 및 single stranded carrier DNA와 혼합 한 다음 42℃ 수조에서 1시간 동안 반응 후 배양액을 히스티딘(his) 무첨가 최소 한천 배지 플레이트 (YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out without histidine (Sigma-Aldrich: Cat. no. Y1751), 20 g/L glucose, and 20 g/L of agar)에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 히스티딘(his) 무첨가 최소 한천 배지 플레이트에 옮김과 동시에 히스티딘(his) 무첨가 최소 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여, TRP1 결실을 확인하기 위해 서열번호 54과 55의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 L-ldh 발현 카세트 삽입을 확인하였다. 이렇게 얻은 균주를 CEN . PK2 -1D KCTC12415BP ㅿtrp1::ldh로 명명하였다.
3. nde1 유전자가 결실된 사카로미세스 세레비지애 균주의 제조
(3.1) nde1 유전자 결실 카세트의 제조
nde1 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실시키기 위하여 nde1 유전자의 불활성화용 벡터는 상기 실시예 1.1.2에서 제작된 pUC57-ura3HA를 이용하였다. Nde1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA를 주형으로 하고 서열번호 56와 57의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 nde1 유전자 결실 카세트를 제작하였다.
(3.2) nde1 이 결실된 사카로미세스 세레비지애 균주의 제조
사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldh)에서 nde1이 결실된 변이균주를 다음과 같이 제작하였다. 수득된 사카로미세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldh)를 YPD 한천 배지 (10 g/L of yeast extract, 20 g/L of peptone, 20 g/L of glucose, and 20 g/L of agar) 플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체 배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD600이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15(v/v)% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.
nde1 유전자 제거를 위해, 상기 pdc1, cyb2 및 gpd1 유전자 결실과 동일한 방법으로 실시예 2.1에서 제작된 nde1 유전자 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 및 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 우라실(ura) 무첨가 최소 한천 배지(YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out without uracil, 20 g/L glucose , and 20 g/L of agar) 플레이트에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 한천 배지에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 nde1 결실을 확인하기 위해 서열번호 58과 59의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 nde1 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1+ura3)를 수득하였다.
또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 nde1 결실을 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1+ura3)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA 함유 한천 배지 (YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out , 20 g/L glucose, 1 ug/L of 5-fluoroorotic acid, and 20 g/L agar) 플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 함유 한천 배지 플레이트에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 58과 59의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1)을 수득하였다.
4. nde2 유전자가 결실된 사카로미세스 세레비지애 균주의 제작
(4.1) nde2 유전자의 결실 카세트의 제조
nde2 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실시키기 위하여 nde2 유전자의 불활성화용 벡터는 상기 1의 (2)에서 제작된 pUC57-ura3HA를 이용하였다. Nde2 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA를 주형으로 하고 서열번호 60과 61의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 nde2 유전자 결실 카세트를 제작하였다.
(4.2) nde1 및 nde2 이 결실된 S. cerevisiae 균주의 제조
사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1)에서 nde2가 결실된 변이 균주를 다음과 같이 제조하였다.
수득된 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1)를 YPD 한천 배지(10 g/L of yeast extract, 20 g/L of peptone, 20 g/L of glucose, and 20 g/L of agar) 플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 약 30℃에서 배양한 후, 콜로니를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 약 30℃에서 배양하였다. 충분히 자란 배양액을 250 ml 플라스크에 담긴 YPD 액체 배지 약 50 ml에 1%(v/v) 접종하여 약 230 rpm, 약 30℃ 배양기에서 배양하였다. 약 4-5시간 후, OD600이 약 0.5 정도가 되면 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득한 다음 약 100 mM 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하였다. 그 후, 약 4,500 rpm, 약 10분 조건으로 원심 분리하여 세포를 수득 후 약 15(v/v)% 글리세롤이 첨가된 약 1 M 농도의 리튬 아세테이트 용액에 세포를 재현탁하여 약 100 ul씩 분주하였다.
nde2 유전자 제거를 위해, 상기 pdc1, cyb2, gpd1 및 nde1 유전자 결실과 동일한 방법으로 상기 (4.1)에서 제작된 nde2 유전자 결실 카세트를 50% 폴리에틸렌글리콜, 및 단일 가닥 담체 DNA (single stranded carrier DNA)와 혼합한 다음, 약 42℃ 수조에서 약 1시간 동안 반응 후 배양액을 우라실 무첨가 최소 한천 배지 (YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out without uracil, 20 g/L glucose, and 20 g/L of agar) 플레이트에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (변이 균주) 10개를 선별해 다시 우라실 무첨가 최소 한천 배지 플레이트에 옮김과 동시에 같은 성분의 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 변이주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 nde2 결실을 확인하기 위해 서열번호 60과 61의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 nde2 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로미세스 세레비지애 CEN.PK2-1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1Δnde2+ura3)을 수득하였다.
또한, 상기 유전자 결실 벡터를 이용한 추가 유전자 결실을 위해 nde2 결실을 위해 이용한 선별 마커인 URA3 유전자를 상기 기재한 URA3 pop-out 방법을 이용하여 제거하였다. 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1Δnde2+ura3)를 YPD 액체 배지 약 10 ml에 접종하여 약 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 5-FOA 함유 배지 (YSD, containing 6.7 g/L of yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L of yeast synthetic drop-out, 20 g/L glucose, 1 ug/L of 5-fluoroorotic acid, and 20 g/L of agar) 플레이트에 도말하여 약 24시간 동안 30℃에서 24시간 이상 배양하였다. 상기 플레이트에서 형성된 콜로니 (URA3 pop-out 균주) 10개를 선별해 다시 5-FOA 함유 배지에 옮김과 동시에 YPD 액체 배지에 배양해 균주로부터 상용 키트 (Gentra Puregene Cell kit, Qiagen, USA)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. 상기 분리된 URA3 pop-out 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 URA3 결실을 확인하기 위해 서열번호 60과 61의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 URA3 결실을 확인하였다. 그 결과, 사카로미세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D (KCTC12415BP ㅿtrp1::ldhㅿnde1Δnde2)을 수득하였다. 이하 이 균주를 편의상 SAIT1이라 한다.
실시예 2. SAIT1 균주에서 DGA1 및/또는 LRO1 유전자가 결실된 균주의 제조
1. DGA1 및/또는 LRO1 유전자의 결실 카세트의 제조
DGA1 유전자 및 LRO1 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실시키기 위하여 DGA1 유전자 및 LRO1 유전자의 불활성화용 벡터는 상기 1의 (2)에서 제작된 pUC57-ura3HA를 이용하였다. DGA1 유전자 및 LRO1 유전자 결실 카세트를 제작하기 위하여, 제작된 pUC57-ura3HA를 주형으로 하고 서열번호 37와 38의 프라이머, 및 서열번호 39와 40의 프라이머를 각각 사용하여 PCR을 수행하여 DGA1 유전자 및 LRO1 유전자 결실 카세트를 제작하였다.
2. DGA1 유전자 및 LRO1 유전자가 결실된 S. cerevisiae 균주의 제조
출발 균주로서 SAIT1 균주를 사용하고, DGA1 결실을 확인하기 위한 프라이머로서 서열번호 62와 63의 프라이머를 이용한 것을 제외하고, 실시예 1의 4(2)에 기재된 방법과 동일한 방법에 의하여, SAIT1 △DGA1 균주를 제조하였다.
또한, 출발 균주로서 SAIT1 △DGA1 균주를 사용하고, LRO11 결실을 확인하기 위한 프라이머로서 서열번호 64와 65의 프라이머를 이용한 것을 제외하고, 실시예 1의 4(2)에 기재된 방법과 동일한 방법에 의하여, SAIT1 △DGA1△LRO1 균주, 즉 SIAT2 균주를 제조하였다.
실시예 3. SAIT1 균주에서 AUR1 및/또는 OLE1 유전자가 도입된 균주의 제조
AUR1 유전자 및 OLE1 유전자를 SAIT1 균주에 도입하였다.
1. AUR1 및/또는 OLE1 유전자 도입용 벡터의 제조
AUR1 유전자 및 OLE1 유전자 도입용 벡터는 다음과 같이 제작하였다.
구체적으로서, 실시예1의 1(1)에서 기재된 서열번호 25과 26의 프라이머 대신 서열번호 66, 및 67의 프라이머를 사용하여, TEF 프로모터를 증폭하고, 최종적으로 p416-TEF 벡터를 제조하고, S.cerevisiae의 AUR1 및 Pichia kudriavzevii M12의 OLE1 유전자를 증폭하기 위하여, 각각 서열번호 68과 69 및 서열번호 70과 71을 사용한 것을 제외하고, 실시예1의 1(1)에서 기재된 과정과 동일한 과정을 거쳐서, AUR1 및 OLE1 발현 벡터인 p416-TEFp-AUR1 및 p416-TEFp-OLE1를 각각 제작하였다.
2. AUR1 유전자 및 OLE1 유전자가 도입된 S. cerevisiae 균주의 제조
출발 균주로서 SAIT1 균주를 사용하고, 상기 1에서 제작된 AUR1 유전자 도입용 벡터 p416-TEFp-AUR1을 XbaI 및 XhoI 이중 소화(double digestion)한 후에 서열번호 72 및 73을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 얻어진 절편을 실시예1의 1(3)에 기재된 과정에 따라서 수행하여 SAIT1 균주의 게놈과의 상동 재조합(homology recombination)에 의하여 도입하고, 서열번호 74와 75의 프라이머를 사용한 PCR에 의하여 AUR1 유전자가 도입된 것을 확인하여 AUR1 과발현용 균주, SAIT1(+AUR1) 균주 (이하 SAIT3 균주라 한다)를 제조하였다.
출발 균주로서 SAIT1 균주를 사용하고, 상기 1에서 제작된 OLE1 유전자 도입용 벡터 p416-TEFp-AUR1을 XbaI 및 XhoI 이중 소화(double digestion)한 후에 서열번호 76 및 77을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과 얻어진 절편을 실시예1의 1(3)에 기재된 과정에 따라서 수행하여 SAIT1 균주의 게놈과의 상동 재조합(homology recombination)에 의하여 도입하고, 서열번호 78과 79의 프라이머를 사용한 PCR에 의하여 OLE1 유전자가 도입된 것을 확인하여, SAIT1(+OLE1) 균주(이하 SAIT4 균주라 한다)를 제조하였다. 이때 사용된 OLE1 유전자는 Pichia kudriavzevii M12 유래의 것을 사용하였다. Pichia kudriavzevii M12의 OLE1의 아미노산 서열 및 그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 5 및 6의 서열을 갖는다.
실시예 4. SAIT1 , SAIT1 △ DGA1 , SAIT2 , SAIT3 , 및 SAIT4 의 내산성 및 락테이 트 생산능 확인
실시예 1-3에서 제조된 SAIT1, SAIT1 △DGA1,SAIT2, SAIT3, 및 SAIT4 균주를 YPD 한천 배지에 도말하여 30℃에서 24시간 이상 배양한 후, 80 g/L 포당을 포함한 100 ml YPD에 접종하여 호기 조건으로 30℃에서 16 시간 동안 배양하였다. 발효는 100 ml의 상기 균주 배양액을 1 L의 합성 배지(60 g/L of glucose, 20 g/L of a yeast extract, 50 g/L of K2HPO4, 10 g/L of MgSO4, 0.1 g/L of tryptophane, and 0.1 g/L of histidine)를 함유한 미생물 반응기에 별도로 접종하여 수행하였다.
발효 조건은 초기 60 g/L 포도당 및 20 g/L 효모 추출물을 첨가하고 30℃ 하에서 발효하였다. 발효 중 pH는 5N Ca(OH)2 를 이용하여 16시간까지 pH 5, 24 시간까지 pH 4.5 및 60 시간까지 pH 3.0으로 제어하고 유지하였고 포도당 농도가 20 g/L가 유지되도록 하였다. 추가적인 합성 배지 성분은 포도당을 포함한 50 g/L K2HPO4, 10 g/L MgSO4, 0.1 g/L 트립토판, 및 0.1 g/L 히스티딘으로 구성되어 있다. 이때 배지 중에는 초기에 배지 총 부피에 대한 부피 기준으로 2%, 3%, 4%, 및 5%의 락테이트를 첨가하여 산성에 대한 저항성을 확인하였다.
배양액 내의 세포농도는 분광광도계를 이용하여 추정하였으며, 발효 중 생물 반응기로부터 주기적으로 샘플을 채취하였으며, 채취된 시료는 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리 후, 상층액의 각종 대사산물 및 락테이트와 포도당의 농도를 액체크로마토그래피 (HPLC)로 분석하였다. 또한, 상층액 중의 여러 지질 분자는 ultra-performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry (UPLC-qTOF-MS/MS)에 의하여 분석하였다.
도 6은 S.cerevisiae에 있어서 DGA1 및 LRO1 유전자의 결실이 산성 조건에서 세포 성장에 미치는 영향을 평가를 나타낸다. 도 6에서, 가로 축은 배양에 사용된 배지 중에 포함된 락테이트의 농도를 나타낸다. 또한, WT는 wild-type 균주, 즉 SAIT1. 세로축은 OD600 값을 나타낸다. 도 6에 나타낸 바와 같이, SAIT1에 비하여, SAIT1△DGA1, 및 SAIT2에서 세포 성장이, 특히 산성 조건에서 높았다.
도 7은 S.cerevisiae에 있어서 DGA1 및 LRO1 유전자의 결실이 산성 조건에서 세포 성장 및 락테이트 생산에 미치는 영향을 평가를 나타낸다. 도 7에서, 가로 축은 배양 시간을 나타내고, 세로축은 OD600 값 및 락테이트 농도(g/L)를 나타낸다. 락테이트 농도는 세포를 제외한 상층액 중의 농도를 나타낸다. 도 7에 나타낸 바와 같이, SAIT1에 비하여, SAIT1△DGA1, 및 SAIT2에서 세포 성장뿐만 아니라 락테이트 생산이 증가하였다. 구체적으로, 배양 50 시간에서 락테이트 생산에 대하여, SAIT1가 24.6g/l, SAIT1△DGA1가 25.9g/l, 및 SAIT2가 27.25g/l로서, SAIT1에 비하여 SAIT2에서 락테이트를 10.8 % 더 많이 생산하였다. 배양 50 시간에서 세포 생장에 대하여, SAIT1가 5.05, SAIT1△DGA1가 5.2, 및 SAIT2가 5.205이었다.
도 8은 S.cerevisiae에 있어서 DGA1 및 LRO1 유전자의 결실이 산성 조건에서 세포 중 지질 성분 함량에 미치는 영향을 평가를 나타낸다. 도 8에서, 하단의 바는 화합물의 농도를 색의 강도로 표시한 것으로서, WT 즉, SAIT1에 대한 결과를 O fold로 보았을 때, 4 fold는 4배 증가한 것을 나타내고, -1 fold는 1배 감소한 것을 나타낸다. 도 8에 나타낸 바와 같이, SAIT1에 비하여, SAIT2에서 TAG는 37.9% 감소하였다(화살표 참조). 도 8에서, PI는 phosphatidyl inositiol, PE는 phosphatidyl ethanol, PC는 phosphatidyl choline, PS는 phosphatidyl serine, cer는 ceramide, IPC는 inositol phosphorylceramide, MIPC는 mannosyl-inositol phosphorylceramide, FA는 fatty acid를 나타낸다.
도 9는 S.cerevisiae에 있어서 AUR1 유전자의 과발현이 산성 조건에서 세포 성장에 미치는 영향을 평가를 나타낸다. 도 9에서, 가로 축은 배양에 사용된 배지 중에 포함된 락테이트의 농도를 나타낸다. 또한, WT는 wild-type 균주, 즉 SAIT1을 사용하고 락테이트를 첨가하지 않은 것 즉, 첨가된 락테이트 농도는 0인 것을 제외하고는 동일한 조건에서 실험한 것을 나타낸다. 세로축은 OD600 값을 나타낸다. 도 9에 나타낸 바와 같이, SAIT1에 비하여, SAIT3에서 세포 성장이, 특히 산성 조건에서 높았다. 구체적으로, 3% LA에서 세포 성장에 대하여 SAIT3은 SAIT1에 비하여 1.8배 높았다.
도 10은 S.cerevisiae에 있어서 AUR1 유전자의 과발현이 산성 조건에서 세포 성장 및 락테이트 생산에 미치는 영향을 평가를 나타낸다. 도 10에서, 가로 축은 배양 시간을 나타내고, 세로축은 OD600 값 및 락테이트 농도(g/L)를 나타낸다. 락테이트 농도는 세포를 제외한 상층액 중의 농도를 나타낸다. 도 10에 나타낸 바와 같이, SAIT1에 비하여, SAIT13에서 세포 성장이 증가하였고 락테이트 생산은 약 11% 증가하였다.
도 11은 S.cerevisiae에 있어서 AUR1 유전자의 과발현이 산성 조건에서 세포 중 지질 성분 함량에 미치는 영향을 평가를 나타낸다. 도 11에서, 하단의 바 및 약자에 대하여는 도 8에서 설명한 바와 동일하다. 도 11에 나타낸 바와 같이, SAIT1에 비하여, SAIT3에서 IPC가 38.6% 증가하였다.
도 12는 S.cerevisiae에 있어서 OLE1 유전자의 과발현이 산성 조건에서 세포 성장에 미치는 영향을 평가를 나타낸다. 도 12에서, 가로 축은 배양에 사용된 배지 중에 포함된 락테이트의 농도를 나타낸다. 또한, WT는 wild-type 균주, 즉 SAIT1을 사용하고 락테이트를 첨가하지 않은 것 즉, 첨가된 락테이트 농도는 0인 것을 제외하고는 동일한 조건에서 실험한 것을 나타낸다. 세로축은 OD600 값을 나타낸다. 도 12에 나타낸 바와 같이, SAIT1에 비하여, SAIT4에서 세포 성장이, 특히 산성 조건에서 높았다.
도 13은 S.cerevisiae에 있어서 OLE1 유전자의 과발현이 산성 조건에서 세포 성장 및 락테이트 생산에 미치는 영향을 평가를 나타낸다. 도 13에서, 가로 축은 배양 시간을 나타내고, 세로축은 OD600 값 및 락테이트 농도(g/L)를 나타낸다. 락테이트 농도는 세포를 제외한 상층액 중의 농도를 나타낸다. 도 13에 나타낸 바와 같이, SAIT1에 비하여, SAIT14에서 세포 성장은 증가하였고 락테이트 생산은 약 10% 증가하였다.
도 14는 S.cerevisiae에 있어서 OLE1 유전자의 과발현이 산성 조건에서 세포 중 지질 성분 함량에 미치는 영향을 평가를 나타낸다. 도 14에서, 하단의 바 및 약자에 대하여는 도 8에서 설명한 바와 동일하다. 도 14에 나타낸 바와 같이, SAIT1에 비하여, SAIT14에서 불포화된 지방산인 palmitoleic acid(16:1)와 oleic acid(18:1) 함량이 각각 90% 및 78% 증가하였고, 반면 palmitoleic acid(16:0)와 oleic acid(18:0)은 감소하였다.
한국생명공학연구원 KCTC12415BP 20130530
<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Yeast cell resistant to acid, method for producing an organic acid using the same, and method for producing the same <130> PN110193KR <160> 79 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 401 <212> PRT <213> S.cerevisiae: AUR1 amino acid <400> 1 Met Ala Asn Pro Phe Ser Arg Trp Phe Leu Ser Glu Arg Pro Pro Asn 1 5 10 15 Cys His Val Ala Asp Leu Glu Thr Ser Leu Asp Pro His Gln Thr Leu 20 25 30 Leu Lys Val Gln Lys Tyr Lys Pro Ala Leu Ser Asp Trp Val His Tyr 35 40 45 Ile Phe Leu Gly Ser Ile Met Leu Phe Val Phe Ile Thr Asn Pro Ala 50 55 60 Pro Trp Ile Phe Lys Ile Leu Phe Tyr Cys Phe Leu Gly Thr Leu Phe 65 70 75 80 Ile Ile Pro Ala Thr Ser Gln Phe Phe Phe Asn Ala Leu Pro Ile Leu 85 90 95 Thr Trp Val Ala Leu Tyr Phe Thr Ser Ser Tyr Phe Pro Asp Asp Arg 100 105 110 Arg Pro Pro Ile Thr Val Lys Val Leu Pro Ala Val Glu Thr Ile Leu 115 120 125 Tyr Gly Asp Asn Leu Ser Asp Ile Leu Ala Thr Ser Thr Asn Ser Phe 130 135 140 Leu Asp Ile Leu Ala Trp Leu Pro Tyr Gly Leu Phe His Tyr Gly Ala 145 150 155 160 Pro Phe Val Val Ala Ala Ile Leu Phe Val Phe Gly Pro Pro Thr Val 165 170 175 Leu Gln Gly Tyr Ala Phe Ala Phe Gly Tyr Met Asn Leu Phe Gly Val 180 185 190 Ile Met Gln Asn Val Phe Pro Ala Ala Pro Pro Trp Tyr Lys Ile Leu 195 200 205 Tyr Gly Leu Gln Ser Ala Asn Tyr Asp Met His Gly Ser Pro Gly Gly 210 215 220 Leu Ala Arg Ile Asp Lys Leu Leu Gly Ile Asn Met Tyr Thr Thr Ala 225 230 235 240 Phe Ser Asn Ser Ser Val Ile Phe Gly Ala Phe Pro Ser Leu His Ser 245 250 255 Gly Cys Ala Thr Met Glu Ala Leu Phe Phe Cys Tyr Cys Phe Pro Lys 260 265 270 Leu Lys Pro Leu Phe Ile Ala Tyr Val Cys Trp Leu Trp Trp Ser Thr 275 280 285 Met Tyr Leu Thr His His Tyr Phe Val Asp Leu Met Ala Gly Ser Val 290 295 300 Leu Ser Tyr Val Ile Phe Gln Tyr Thr Lys Tyr Thr His Leu Pro Ile 305 310 315 320 Val Asp Thr Ser Leu Phe Cys Arg Trp Ser Tyr Thr Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Tyr Asp Ile Ser Lys Ser Asp Pro Leu Ala Ala Asp Ser Asn Asp Ile 340 345 350 Glu Ser Val Pro Leu Ser Asn Leu Glu Leu Asp Phe Asp Leu Asn Met 355 360 365 Thr Asp Glu Pro Ser Val Ser Pro Ser Leu Phe Asp Gly Ser Thr Ser 370 375 380 Val Ser Arg Ser Ser Ala Thr Ser Ile Thr Ser Leu Gly Val Lys Arg 385 390 395 400 Ala <210> 2 <211> 1206 <212> DNA <213> S.cerevisiae : AUR1 gene <400> 2 atggcaaacc ctttttcgag atggtttcta tcagagagac ctccaaactg ccatgtagcc 60 gatttagaaa caagtttaga tccccatcaa acgttgttga aggtgcaaaa atacaaaccc 120 gctttaagcg actgggtgca ttacatcttc ttgggatcca tcatgctgtt tgtgttcatt 180 actaatcccg caccttggat cttcaagatc cttttttatt gtttcttggg cactttattc 240 atcattccag ctacgtcaca gtttttcttc aatgccttgc ccatcctaac atgggtggcg 300 ctgtatttca cttcatcgta ctttccagat gaccgcaggc ctcctattac tgtcaaagtg 360 ttaccagcgg tggaaacaat tttatacggc gacaatttaa gtgatattct tgcaacatcg 420 acgaattcct ttttggacat tttagcatgg ttaccgtacg gactatttca ttatggggcc 480 ccatttgtcg ttgctgccat cttattcgta tttggtccac caactgtttt gcaaggttat 540 gcttttgcat ttggttatat gaacctgttt ggtgttatca tgcaaaatgt ctttccagcc 600 gctcccccat ggtataaaat tctctatgga ttgcaatcag ccaactatga tatgcatggc 660 tcgcctggtg gattagctag aattgataag ctactcggta ttaatatgta tactacagct 720 ttttcaaatt cctccgtcat tttcggtgct tttccttcac tgcattccgg gtgtgctact 780 atggaagccc tgtttttctg ttattgtttt ccaaaattga agcccttgtt tattgcttat 840 gtttgctggt tatggtggtc aactatgtat ctgacacacc attattttgt agaccttatg 900 gcaggttctg tgctgtcata cgttattttc cagtacacaa agtacacaca tttaccaatt 960 gtagatacat ctcttttttg cagatggtca tacacttcaa ttgagaaata cgatatatca 1020 aagagtgatc cattggctgc agattcaaac gatatcgaaa gtgtcccttt gtccaacttg 1080 gaacttgact ttgatcttaa tatgactgat gaacccagtg taagcccttc gttatttgat 1140 ggatctactt ctgtttctcg ttcgtccgcc acgtctataa cgtcactagg tgtaaagagg 1200 gcttaa 1206 <210> 3 <211> 510 <212> PRT <213> S.cerevisiae : OLE1 amino acid <400> 3 Met Pro Thr Ser Gly Thr Thr Ile Glu Leu Ile Asp Asp Gln Phe Pro 1 5 10 15 Lys Asp Asp Ser Ala Ser Ser Gly Ile Val Asp Glu Val Asp Leu Thr 20 25 30 Glu Ala Asn Ile Leu Ala Thr Gly Leu Asn Lys Lys Ala Pro Arg Ile 35 40 45 Val Asn Gly Phe Gly Ser Leu Met Gly Ser Lys Glu Met Val Ser Val 50 55 60 Glu Phe Asp Lys Lys Gly Asn Glu Lys Lys Ser Asn Leu Asp Arg Leu 65 70 75 80 Leu Glu Lys Asp Asn Gln Glu Lys Glu Glu Ala Lys Thr Lys Ile His 85 90 95 Ile Ser Glu Gln Pro Trp Thr Leu Asn Asn Trp His Gln His Leu Asn 100 105 110 Trp Leu Asn Met Val Leu Val Cys Gly Met Pro Met Ile Gly Trp Tyr 115 120 125 Phe Ala Leu Ser Gly Lys Val Pro Leu His Leu Asn Val Phe Leu Phe 130 135 140 Ser Val Phe Tyr Tyr Ala Val Gly Gly Val Ser Ile Thr Ala Gly Tyr 145 150 155 160 His Arg Leu Trp Ser His Arg Ser Tyr Ser Ala His Trp Pro Leu Arg 165 170 175 Leu Phe Tyr Ala Ile Phe Gly Cys Ala Ser Val Glu Gly Ser Ala Lys 180 185 190 Trp Trp Gly His Ser His Arg Ile His His Arg Tyr Thr Asp Thr Leu 195 200 205 Arg Asp Pro Tyr Asp Ala Arg Arg Gly Leu Trp Tyr Ser His Met Gly 210 215 220 Trp Met Leu Leu Lys Pro Asn Pro Lys Tyr Lys Ala Arg Ala Asp Ile 225 230 235 240 Thr Asp Met Thr Asp Asp Trp Thr Ile Arg Phe Gln His Arg His Tyr 245 250 255 Ile Leu Leu Met Leu Leu Thr Ala Phe Val Ile Pro Thr Leu Ile Cys 260 265 270 Gly Tyr Phe Phe Asn Asp Tyr Met Gly Gly Leu Ile Tyr Ala Gly Phe 275 280 285 Ile Arg Val Phe Val Ile Gln Gln Ala Thr Phe Cys Ile Asn Ser Leu 290 295 300 Ala His Tyr Ile Gly Thr Gln Pro Phe Asp Asp Arg Arg Thr Pro Arg 305 310 315 320 Asp Asn Trp Ile Thr Ala Ile Val Thr Phe Gly Glu Gly Tyr His Asn 325 330 335 Phe His His Glu Phe Pro Thr Asp Tyr Arg Asn Ala Ile Lys Trp Tyr 340 345 350 Gln Tyr Asp Pro Thr Lys Val Ile Ile Tyr Leu Thr Ser Leu Val Gly 355 360 365 Leu Ala Tyr Asp Leu Lys Lys Phe Ser Gln Asn Ala Ile Glu Glu Ala 370 375 380 Leu Ile Gln Gln Glu Gln Lys Lys Ile Asn Lys Lys Lys Ala Lys Ile 385 390 395 400 Asn Trp Gly Pro Val Leu Thr Asp Leu Pro Met Trp Asp Lys Gln Thr 405 410 415 Phe Leu Ala Lys Ser Lys Glu Asn Lys Gly Leu Val Ile Ile Ser Gly 420 425 430 Ile Val His Asp Val Ser Gly Tyr Ile Ser Glu His Pro Gly Gly Glu 435 440 445 Thr Leu Ile Lys Thr Ala Leu Gly Lys Asp Ala Thr Lys Ala Phe Ser 450 455 460 Gly Gly Val Tyr Arg His Ser Asn Ala Ala Gln Asn 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tctatggtac 660 tcccacatgg gatggatgct tttgaagcca aatccaaaat acaaggctag agctgatatt 720 accgatatga ctgatgattg gaccattaga ttccaacaca gacactacat cttgttgatg 780 ttattaaccg ctttcgtcat tccaactctt atctgtggtt actttttcaa cgactatatg 840 ggtggtttga tctatgccgg ttttattcgt gtctttgtca ttcaacaagc taccttttgc 900 attaactcca tggctcatta catcggtacc caaccattcg atgacagaag aacccctcgt 960 gacaactgga ttactgccat tgttactttc ggtgaaggtt accataactt ccaccacgaa 1020 ttcccaactg attacagaaa cgctattaag tggtaccaat acgacccaac taaggttatc 1080 atctatttga cttctttagt tggtctagca tacgacttga agaaattctc tcaaaatgct 1140 attgaagaag ccttgattca acaagaacaa aagaagatca ataaaaagaa ggctaagatt 1200 aactggggtc cagttttgac tgatttgcca atgtgggaca aacaaacctt cttggctaag 1260 tctaaggaaa acaagggttt ggttatcatt tctggtattg ttcacgacgt atctggttat 1320 atctctgaac atccaggtgg tgaaacttta attaaaactg cattaggtaa ggacgctacc 1380 aaggctttca gtggtggtgt ctaccgtcac tcaaatgccg ctcaaaatgt cttggctgat 1440 atgagagtgg ctgttatcaa ggaaagtaag aactctgcta ttagaatggc tagtaagaga 1500 ggtgaaatct acgaaactgg taagttcttt taa 1533 <210> 5 <211> 594 <212> PRT <213> Pichia kudriavzevii : OLE1 amino acid <400> 5 Met Asp Ser Val Asp Ile Thr Gln Ala Asn Ala Val Ala Ala Gly Thr 1 5 10 15 Asn Lys Pro Val Lys Arg Ile Val Ala Ser Gly Ile Gly Gly Arg Leu 20 25 30 Met Gly Thr Lys Ala Met Thr Thr Val Thr Ala Glu Glu Leu Ala Arg 35 40 45 Asp Ser Val Ala Glu Val Leu Lys Arg Asp Ser Glu Leu Arg Val Lys 50 55 60 Tyr Glu Lys Glu Gln His Ile Ser Glu Lys Asp Trp Ser Phe Asp Thr 65 70 75 80 Phe Phe Gln Lys Ile Asn Trp Leu Asn Leu Tyr Leu Val Val Ala Phe 85 90 95 Pro Leu Phe Ala Ile Ala Gly Phe Ile Met Asp Ser Val Asp Ile Thr 100 105 110 Gln Ala Asn Ala Val Ala Ala Gly Thr Asn Lys Pro Val Lys Arg Ile 115 120 125 Val Ala Ser Gly Ile Gly Gly Arg Leu Met Gly Thr Lys Ala Met Thr 130 135 140 Thr Val Thr Ala Glu Glu Leu Ala Arg Asp Ser Val Ala Glu Val Leu 145 150 155 160 Lys Arg Asp Ser Glu Leu Arg Val Lys Tyr Glu Lys Glu Gln His Ile 165 170 175 Ser Glu Lys Asp Trp Ser Phe Asp Thr Phe Phe Gln Lys Ile Asn Trp 180 185 190 Leu Asn Leu Tyr Leu Val Val Ala Phe Pro Leu Phe Ala Ile Ala Gly 195 200 205 Ala Ile Tyr Phe Gln Ile Lys Pro Thr Ile Gln Thr Val Thr Leu Gly 210 215 220 Val Ile Leu Phe Ser Leu Ser Gly Leu Ser Ile Thr Ala Gly Tyr His 225 230 235 240 Arg Leu Trp Ser His Arg Ala Tyr Asp Ala Lys Asp Pro Leu Lys Ile 245 250 255 Val Phe Ala Leu Phe Gly Ala Ala Ala Ile Glu Gly Ser Ile Lys Trp 260 265 270 Trp Gly His Ser His Arg Ile His His Arg Tyr Thr Asp Thr Asp Arg 275 280 285 Asp Pro Tyr Asp Ala Arg Lys Gly Phe Trp Tyr Ser His Ile Gly Trp 290 295 300 Met Leu Leu Val Pro Asn Pro Lys Tyr Lys Ala Arg Ala Asp Ile Ser 305 310 315 320 Asp Leu Val Asp Asp Trp Ile Val Arg Val Gln His Arg His Tyr Leu 325 330 335 Ser Ile Met Leu Ile Met Gly Leu Val Val Pro Ala Leu Leu Ser His 340 345 350 Tyr Leu Trp Asn Asp Phe Trp Gly Gly Leu Ile Tyr Ala Gly Leu Leu 355 360 365 Lys Ser Ser Ala Ile Gln Gln Ala Thr Phe Cys Val Asn Ser Leu Ala 370 375 380 His Trp Ile Gly Glu Gln Pro Phe Asp Asp Arg Arg Thr 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kudriavzevii: OLE1 gene <400> 6 atggacagtg ttgatatcac acaggctaat gccgttgcag ccggcacaaa taaaccggtc 60 aagagaattg tcgcctcagg tattggaggc cgtctgatgg gtacaaaggc tatgactact 120 gtgacagcag aagaattggc tcgggattcg gttgccgaag ttttgaaaag ggactctgaa 180 ctaagggtca agtatgagaa ggaacaacac atctcggaga aagattggtc ctttgatact 240 tttttccaaa aaatcaactg gctgaacttg taccttgttg ttgcatttcc tttatttgca 300 attgcaggtt ttataatgga cagtgttgat atcacacagg ctaatgccgt tgcagccggc 360 acaaataaac cggtcaagag aattgtcgcc tcaggtattg gaggccgtct gatgggtaca 420 aaggctatga ctactgtgac agcagaagaa ttggctcggg attcggttgc cgaagttttg 480 aaaagggact ctgaactaag ggtcaagtat gagaaggaac aacacatctc ggagaaagat 540 tggtcctttg atactttttt ccaaaaaatc aactggctga acttgtacct tgttgttgca 600 tttcctttat ttgcaattgc aggtgcaatt tatttccaaa ttaagccaac tattcaaaca 660 gtcactttag gtgttattct cttttcattg agtgggttgt ccatcactgc tggttaccac 720 agactatggt ctcatcgtgc ttatgatgca aaggatccat taaagattgt ctttgctctc 780 tttggtgccg ctgctattga aggttccatc aaatggtggg gtcattctca tcggatccat 840 catagatata ccgataccga ccgtgatcca tacgatgcaa gaaagggatt ctggtattcc 900 catattggat ggatgttgtt ggttcctaat cctaaatata aggcaagagc agacatttcc 960 gatttagttg acgactggat tgtcagagtc caacatagac actacttatc tatcatgttg 1020 attatgggtc tggtggtccc tgctttatta tcccactatt tatggaacga tttctggggg 1080 ggcttgattt atgcaggtct cttaaaatct tctgctattc aacaagctac attttgtgtg 1140 aactctctag cccactggat tggtgagcaa ccatttgatg acagaagaac cccaagagac 1200 catttcttga cggctttggt cacttttggt gaaggttatc ataactttca tcatgagttt 1260 ccttcggatt atagaaatgc ccttaaatgg taccaatacg atccaaccaa gattttgatt 1320 tggtgtgcat ccaaggttgg acttgcgtac aatttgaaga agttttctca aaatgccatt 1380 gatcaaggaa tacttcaaca gaagcagaag aaacttgacg aaatgagatc caaattaaac 1440 tggggtcctc aaattgcaga cttgccaatt tggacaaagg aagaatttaa ggaaaaggct 1500 gcacaaaaga agggttacat tattatctct ggcattgtcc atgactgttc ctcttttatt 1560 actgaacatc caggtggtca ggcattagtt cgtacctcct atggtaaaga tgctacggtg 1620 gcattcaatg gaggtgttta tgcccattcc aacgctgccc ataacttgtt atcgacgttg 1680 agagtcgccg ttattaagga ttcgggcgcc aatggtaata cctactcgag acaactggaa 1740 tacttggcta aaaccgaaaa ggaacagatg tccaaatcca actaa 1785 <210> 7 <211> 418 <212> PRT <213> S.cerevisiae: DGA1 amino acid <400> 7 Met Ser Gly Thr Phe Asn Asp Ile Arg Arg Arg Lys Lys Glu Glu Gly 1 5 10 15 Ser Pro Thr Ala Gly Ile Thr Glu Arg His Glu Asn Lys Ser Leu Ser 20 25 30 Ser Ile Asp Lys Arg Glu Gln Thr Leu Lys Pro Gln Leu Glu Ser Cys 35 40 45 Cys Pro Leu Ala Thr Pro Phe Glu Arg Arg Leu Gln Thr Leu Ala Val 50 55 60 Ala Trp His Thr Ser Ser Phe Val Leu Phe Ser Ile Phe Thr Leu Phe 65 70 75 80 Ala Ile Ser Thr Pro Ala Leu Trp Val Leu Ala Ile Pro Tyr Met Ile 85 90 95 Tyr Phe Phe Phe Asp Arg Ser Pro Ala Thr Gly Glu Val Val Asn Arg 100 105 110 Tyr Ser Leu Arg Phe Arg Ser Leu Pro Ile Trp Lys Trp Tyr Cys Asp 115 120 125 Tyr Phe Pro Ile Ser Leu Ile Lys Thr Val Asn Leu Lys Pro Thr Phe 130 135 140 Thr Leu Ser Lys Asn Lys Arg Val Asn Glu Lys Asn Tyr Lys Ile Arg 145 150 155 160 Leu Trp Pro Thr Lys Tyr Ser Ile Asn 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tgtaactatt ccaagatttt cccaggtatt 660 cctatttctc tgatgacact ggtcacacaa tttcatatcc cattgtatag agactactta 720 ttggcgttag gtatttcttc agtatctcgg aaaaacgctt taaggactct aagcaaaaat 780 cagtcgatct gcattgttgt tggtggcgct agggaatctt tattaagttc aacaaatggt 840 acacaactga ttttaaacaa aagaaagggt tttattaaac tggccattca aacggggaat 900 attaacctag tgcctgtgtt tgcatttgga gaggtggact gttataatgt tctgagcaca 960 aaaaaagatt cagtcctggg taaaatgcaa ctatggttca aagaaaactt tggttttacc 1020 attcccattt tctacgcaag aggattattc aattacgatt tcggtttgtt gccatttaga 1080 gcgcctatca atgttgttgt tggaaggcct atatacgttg aaaagaaaat aacaaatccg 1140 ccagatgatg ttgttaatca tttccatgat ttgtatattg cggagttgaa aagactatat 1200 tacgaaaata gagaaaaata tggggtaccg gatgcagaat tgaagatagt tgggtaa 1257 <210> 9 <211> 661 <212> PRT <213> S.cerevisiae: LRO1 amino acid <400> 9 Met Gly Thr Leu Phe Arg Arg Asn Val Gln Asn Gln Lys Ser Asp Ser 1 5 10 15 Asp Glu Asn Asn Lys Gly Gly Ser Val His Asn Lys Arg Glu Ser Arg 20 25 30 Asn His Ile His His Gln Gln Gly Leu Gly 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<213> S.cerevisiae : LRO1 gene <400> 10 atgggcacac tgtttcgaag aaatgtccag aaccaaaaga gtgattctga tgaaaacaat 60 aaagggggtt ctgttcataa caagcgagag agcagaaacc acattcatca tcaacaggga 120 ttaggccata agagaagaag gggtattagt ggcagtgcaa aaagaaatga gcgtggcaaa 180 gatttcgaca ggaaaagaga cgggaacggt agaaaacgtt ggagagattc cagaagactg 240 attttcattc ttggtgcatt cttaggtgta cttttgccgt ttagctttgg cgcttatcat 300 gttcataata gcgatagcga cttgtttgac aactttgtaa attttgattc acttaaagtg 360 tatttggatg attggaaaga tgttctccca caaggtataa gttcgtttat tgatgatatt 420 caggctggta actactccac atcttcttta gatgatctca gtgaaaattt tgccgttggt 480 aaacaactct tacgtgatta taatatcgag gccaaacatc ctgttgtaat ggttcctggt 540 gtcatttcta cgggaattga aagctgggga gttattggag acgatgagtg cgatagttct 600 gcgcattttc gtaaacggct gtggggaagt ttttacatgc tgagaacaat ggttatggat 660 aaagtttgtt ggttgaaaca tgtaatgtta gatcctgaaa caggtctgga cccaccgaac 720 tttacgctac gtgcagcaca gggcttcgaa tcaactgatt atttcatcgc agggtattgg 780 atttggaaca aagttttcca aaatctggga gtaattggct atgaacccaa taaaatgacg 840 agtgctgcgt atgattggag gcttgcatat ttagatctag aaagacgcga taggtacttt 900 acgaagctaa aggaacaaat cgaactgttt catcaattga gtggtgaaaa agtttgttta 960 attggacatt ctatgggttc tcagattatc ttttacttta tgaaatgggt cgaggctgaa 1020 ggccctcttt acggtaatgg tggtcgtggc tgggttaacg aacacataga ttcattcatt 1080 aatgcagcag ggacgcttct gggcgctcca aaggcagttc cagctctaat tagtggtgaa 1140 atgaaagata ccattcaatt aaatacgtta gccatgtatg gtttggaaaa gttcttctca 1200 agaattgaga gagtaaaaat gttacaaacg tggggtggta taccatcaat gctaccaaag 1260 ggagaagagg tcatttgggg ggatatgaag tcatcttcag aggatgcatt gaataacaac 1320 actgacacat acggcaattt cattcgattt gaaaggaata cgagcgatgc tttcaacaaa 1380 aatttgacaa tgaaagacgc cattaacatg acattatcga tatcacctga atggctccaa 1440 agaagagtac atgagcagta ctcgttcggc tattccaaga atgaagaaga gttaagaaaa 1500 aatgagctac accacaagca ctggtcgaat ccaatggaag taccacttcc agaagctccc 1560 cacatgaaaa tctattgtat atacggggtg aacaacccaa ctgaaagggc atatgtatat 1620 aaggaagagg atgactcctc tgctctgaat ttgaccatcg actacgaaag caagcaacct 1680 gtattcctca ccgaggggga cggaaccgtt ccgctcgtgg cgcattcaat gtgtcacaaa 1740 tgggcccagg gtgcttcacc gtacaaccct gccggaatta acgttactat tgtggaaatg 1800 aaacaccagc cagatcgatt tgatatacgt ggtggagcaa aaagcgccga acacgtagac 1860 atcctcggca gcgcggagtt gaacgattac atcttgaaaa ttgcaagcgg taatggcgat 1920 ctcgtcgagc cacgccaatt gtctaatttg agccagtggg tttctcagat gcccttccca 1980 atgtaa 1986 <210> 11 <211> 324 <212> PRT <213> Sordaria macrospora <400> 11 Met Ser Val Pro Ser Thr Glu Ile Ser Ser His Ala Lys Ser Ile Lys 1 5 10 15 Val Val Ile Val Gly Ala Gly Ser Val Gly Val Thr Thr Ala Tyr Ala 20 25 30 Leu Leu Leu Ser His Leu Ala Pro Glu Ile Val Leu Ile Asp Ile Asp 35 40 45 Lys Asn Arg Ala Leu Gly Glu Ala Met Asp Leu Ser His Ala Ala His 50 55 60 Tyr Ala His Ala Lys Val Ser Val Gly Asn Tyr Glu Asp Cys Ala Gly 65 70 75 80 Ala Thr Ala Val Ile Ile Thr Ala Gly Val Asn Gln Lys Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Arg Met Asp Leu Val Lys Thr Asn Phe Gly Leu Phe Glu Lys Ile 100 105 110 Val Pro Gln Ile Ala Lys 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tacgccggtg tagaaggcgt ggctttaagt 840 atgccatgca aattgaacag tctaggtgcg catcaggacg ttgaattgtt gcttaacgac 900 aaggaaaaag aagccctacg taaatcagcc acgtccatta aagaatgttt tgattctgtt 960 gcaaagaagg aataa 975 <210> 13 <211> 332 <212> PRT <213> Pelodiscus sinensis japonicus <400> 13 Met Ser Val Lys Glu Leu Leu Ile Gln Asn Val His Lys Glu Glu His 1 5 10 15 Ser His Ala His Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Arg Gly Glu Met Leu Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala His Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asp Cys Met Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys His Arg Val 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aataagataa cagttgtagg agtaggtgca gtaggtatgg catgtgctat ttcgatatta 120 atgaaagact tggctgatga actagccttg gttgatgtga ttgaggataa gttacgtgga 180 gaaatgttag atttgcaaca tggttcattg ttcttgagaa cccccaaaat tgtctcgggt 240 aaggattatt cagtcactgc tcattctaaa ctggttatca ttacagcagg tgcaagacag 300 caagaagggg agagcagact aaatctggtt caacgtaatg tcaacatctt caagtttatc 360 atcccgaacg tagtaaaata cagtccagac tgcatgttgc ttgttgtgag taatccagtt 420 gacatcttaa cctatgttgc gtggaaaatc agtgggtttc caaaacatag ggtgattggc 480 tcaggatgca accttgatag cgccaggttt aggtatctaa tgggagaaaa attaggtatt 540 cactccttat cttgtcatgg ctggataata ggcgaacatg gtgattcttc ggtacctgtt 600 tggtccgggg ttaatgtggc tggtgttagt ttaaaagcat tatatcctga cctgggtact 660 gatgccgata aagaacattg gaaagaagtg cacaaacaag tggttgattc tgcttacgaa 720 gttattaaac ttaagggcta cacttcttgg gctataggtc tatcagtagc tgatttggca 780 gaaaccgtta tgaaaaattt aagaagagtc cacccaattt ccacgatggt caagggtatg 840 tacggtgtta gctctgacgt cttcttatct gttccttgtg ttttgggata tgcgggaatt 900 acagacgtcg 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agaacattgt cgaattccac tccgaccaca tgaagatcag aaacgccact 960 ttcccaggtg tccaaatgaa attcgttttg caaaagttgt tgaccaatat tgctgacgcc 1020 gctaagggtt acaagccagt tgctgtccca gctagaactc cagctaacgc tgctgtccca 1080 gcttctaccc cattgaagca agaatggatg tggaaccaat tgggtaactt cttgcaagaa 1140 ggtgatgttg tcattgctga aaccggtacc tccgctttcg gtatcaacca aaccactttc 1200 ccaaacaaca cctacggtat ctctcaagtc ttatggggtt ccattggttt caccactggt 1260 gctaccttgg gtgctgcttt cgctgctgaa gaaattgatc caaagaagag agttatctta 1320 ttcattggtg acggttcttt gcaattgact gttcaagaaa tctccaccat gatcagatgg 1380 ggcttgaagc catacttgtt cgtcttgaac aacgatggtt acaccattga aaagttgatt 1440 cacggtccaa aggctcaata caacgaaatt caaggttggg accacctatc cttgttgcca 1500 actttcggtg ctaaggacta cgaaacccac agagtcgcta ccaccggtga atgggacaag 1560 ttgacccaag acaagtcttt caacgacaac tctaagatca gaatgattga ggttatgttg 1620 ccagtcttcg atgctccaca aaacttggtt gaacaagcta agttgactgc tgctaccaac 1680 gctaagcaat aa 1692 <210> 17 <211> 591 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 17 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gcgtacggtt ctaccgttcc aaaatccaag 120 tcgttcgaac aagactcaag aaaacgcaca cagtcatgga ctgccttgag agtcggtgca 180 attctagccg ctactagttc cgtggcgtat ctaaactggc ataatggcca aatagacaac 240 gagccgaaac tggatatgaa taaacaaaag atttcgcccg ctgaagttgc caagcataac 300 aagcccgatg attgttgggt tgtgatcaat ggttacgtat acgacttaac gcgattccta 360 ccaaatcatc caggtgggca ggatgttatc aagtttaacg ccgggaaaga tgtcactgct 420 atttttgaac cactacatgc tcctaatgtc atcgataagt atatagctcc cgagaaaaaa 480 ttgggtcccc ttcaaggatc catgcctcct gaacttgtct gtcctcctta tgctcctggt 540 gaaactaagg aagatatcgc tagaaaagaa caactaaaat cgctgctacc tcctctagat 600 aatattatta acctttacga ctttgaatac ttggcctctc aaactttgac taaacaagcg 660 tgggcctact attcctccgg tgctaacgac gaagttactc acagagaaaa ccataatgct 720 tatcatagga tttttttcaa accaaagatc cttgtagatg tacgcaaagt agacatttca 780 actgacatgt tgggttctca tgtggatgtt cccttctacg tgtctgctac agctttgtgt 840 aaactgggaa accccttaga aggtgaaaaa gatgtcgcca gaggttgtgg ccaaggtgtg 900 acaaaagtcc cacaaatgat atctactttg gcttcatgtt 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Claims (20)

  1. 포스파티딜이노시톨(PI)과 세라미드를 이노시톨 포스포릴세라미드(inositol phosphorylceramide:IPC)와 디아실글리세롤(DG)로의 전환을 촉매하는 효소의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification), 지방 아실(fatty acyl)-CoA의 지방 아실 부위에 이중결합의 도입을 촉매하는 효소의 활성을 증가시키는 유전적 변형, 또는 그 조합 및/또는 디아실글리세롤(DG)로부터 트리아실글리세롤(TG)의 형성을 촉매하는 효소의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 포함하는 것인, 내산성을 갖는 효모 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 IPC의 형성을 촉매하는 효소는 IPC 신타제이고, 상기 지방 아실-CoA의 지방 아실 부위에 이중결합의 도입을 촉매하는 효소는 효소코드(EC) 1.14.19.1에 속하는 효소이고, 디아실글리세롤(DG)로부터 트리아실글리세롤(TG)의 형성을 촉매하는 효소는 효소코드(EC) 2.3.1.22 및 2.3.1.158에 속하는 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 효모 세포.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 IPC 신타제는 AUR1이고, 상기 지방 아실-CoA의 지방 아실 부위에 이중결합의 도입을 촉매하는 효소는 OLE1이고, 디아실글리세롤(DG)로부터 트리아실글리세롤(TG)의 형성을 촉매하는 효소는 DGA1 또는 LRO1인 것인 효모 세포.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 AUR1, OLE1, DGA1 및 LRO1은 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열과 각각 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것인 효모 세포.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 유전적 변형은 IPC의 형성을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자, 상기 지방 아실-CoA의 지방 아실 부위에 이중결합의 도입을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합의 발현을 증가시키는 것이거나, 디아실글리세롤(DG)로부터 트리아실글리세롤(TG)의 형성을 촉매하는 효소를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것인 효모 세포.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 유전적 변형은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 카피 수를 증가시키는 것, 또는 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것인 효모 세포.
  7. 청구항 1에 있어서, 사카로미세스 (Saccharomyces), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces), 칸디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오미세스 (Debaryomyces), 지고사카로미세스 (Zygosaccharomyces), 스키조사카로미세스 (Schizosaccharomyces) 또는 사카로미콥시스 (Saccharomycopsis) 속인 것인 효모 세포.
  8. 청구항 1에 있어서, 사카로미세스 세레비지애인 것인 효모 세포.
  9. 청구항 1에 있어서, 내산성은 C1-C20의 유기산에 대한 내성인 것인 효모 세포.
  10. 청구항 1에 있어서, C1-C20의 유기산의 형성을 촉매하는 효소를 포함하는 효모 세포.
  11. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성을 갖는 것인 효모 세포.
  12. 청구항 1에 있어서, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 효모세포.
  13. 청구항 11에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 효모 세포.
  14. 청구항 1에 있어서, 추가로 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (external mitochondral NADH dehydrogenase), 또는 그 조합의 활성을 감소시키는 유전적 변형을 포함하는 것인 효모 세포.
  15. 청구항 1에 있어서, 추가로 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (external mitochondral NADH dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 제거 또는 파괴된 것인 효모 세포.
  16. 청구항 15에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (external mitochondral NADH dehydrogenase)는 각각 서열번호 8, 10, 12, 14 또는 16의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 효모 세포.
  17. 청구항 16에 있어서, 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (external mitochondral NADH dehydrogenase)를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 8, 10, 12, 14 또는 16의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 9, 11, 13, 15 또는 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 효모 세포.
  18. 청구항 1의 효모 세포를 배지 중에서 배양하여 배양물을 생성하는 단계; 및
    상기 배양물로부터 유기산을 회수하는 단계를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법으로서, 상기 효모 세포는 상기 유기산의 형성을 촉매하는 효소의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 갖는 것인 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 유전적 변형은 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 18에 있어서, 상기 배양은 배양의 전부 또는 그 일부의 기간 동안 산성 조건에서 수행되는 것인 방법.
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