KR102316879B1

KR102316879B1 - 말뼈 나노세라믹 및 pcl을 포함하는 치주조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102316879B1
Application number: KR1020190092029A
Authority: KR
Inventors: 정종훈; 장경제; 박상배
Original assignee: 서울대학교 산학협력단
Priority date: 2018-07-27
Filing date: 2019-07-29
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2039-07-29
Also published as: WO2020022870A1; KR20200012815A

Abstract

본 발명은 말뼈 나노세라믹 및 PCL을 포함하는 치주조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법, 상기 지지체를 포함하는 이식용 치주조직 재생 유도재에 관한 것이다.
본 발명의 말뼈 나노세라믹을 함유하는 치주조직 재생용 PCL 3D 지지체는 골조직과의 유착을 증진시키고, 상기 지지체를 통해 연조직이 골손실 부위로 침투하는 것을 방지하고 골조직 재생을 촉진시킴으로써 치아 재생 등의 관련 산업에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

말뼈 나노세라믹 및 PCL을 포함하는 치주조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법 {Scaffold for regenerating periodontal tissue containing horse bone-derived nanoceramics and PCL and its manufacturing method}

본 발명은 말뼈 나노세라믹 및 PCL을 포함하는 치주조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법, 상기 지지체를 포함하는 이식용 치주조직 재생 유도재에 관한 것이다.

골유도재생술(Guided Bone Regeneration; GBR)은 조직유도재생술(Guided Tissue Regeneration; GTR)의 일종으로, 손상된 조직을 다른 조직과의 접촉을 막아줌으로써, 손상 조직의 재생을 촉진시키는 방법으로 알려진 기술이다. 특히 치주조직의 경우 치아뿌리에서 치조골 사이의 조직이 복잡하게 구성되어 있으므로, GBR 치료를 적용하는 대표적인 조직으로 알려져 있다. 흡수성 치주조직 재생 유도재는 얇은 막형태의 재료로써, 상처부위에 적용되어 상이한 조직이 서로 유착 되는 것을 방지한다.

현재 상용화된 멤브레인형 인공 지지체는 ePTFE(expanded polytetrafluoroethylene)이나 티타늄 계열의 금속 재료들이 사용되어, 생분해가 되지 않아 제거시에 추가 수술이 필요하다는 문제와 주변 골과의 유착이 어려운 단점이 있다. 또한 기존의 멤브레인은 공극이 없거나 공극의 크기가 제어되지 않은 스폰지 형태여서 물질의 교환이 어려운 형태이며, 추가적으로 두께의 조절이 어려워 공간 유지 기능이 떨어지는 단점이 존재한다(Laura T et al., 2010). 이에, 최근 3D 프린팅 기술을 통해 종래의 기술이 갖는 한계를 극복하려는 시도들이 보고되고 있다(Dawood N et al., 2015).

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 생분해성 고분자를 이용하여 공극의 크기를 유지하며 공간유지 능력이 우수한 GBR 치료를 위한 멤브레인을 개발하기 위해 연구하였고, 골조직 재생능력 및 골조직과의 유착의 증가를 위하여 이종골 이식재의 일종인 말뼈 유래 나노세라믹스를 혼합하여 기계적 강도를 유지한 멤브레인을 제작함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 말뼈 나노세라믹 및 폴리카프로락톤(PCL)을 포함하는 치주조직 재생용 지지체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 말뼈 나노세라믹 및 폴리카프로락톤(PCL)을 포함하는 지지체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 말뼈 나노세라믹 및 폴리카프로락톤(PCL)을 포함하는 치주조직 재생용 필라멘트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 지지체를 포함하는 이식용 치주조직 재생 유도재를 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 말뼈 나노세라믹 및 폴리카프로락톤(PCL)을 포함하는 치주조직 재생용 지지체를 제공한다.

본 발명의 치주조직 재생용 지지체는 치주 조직을 재생하고 치아 형성 및 치조골 세포의 분화, 및 혈관형성을 보조하는 것을 말한다. 상기 지지체는 말뼈 나노세라믹 및 폴리카프로락톤(polycarprolacton; PCL)을 포함하고, 상기 말뼈 나노세라믹이 함유된 폴리카프로락톤(PCL)을 3D 프린터로 인쇄한 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 "말뼈 나노세라믹"은 인체의 골무기질과 유사한 구조를 가지며, 인산칼슘계 재료 중에서 수산화인회석과 가장 유사한 화학조성 및 결정구조를 갖는다. 이는, 생체적합성 및 골 재생에 있어 우수한 이식재임을 나타낸다.

상기 말뼈 유래 세라믹은 이종골 이식재로서, 치조골의 부피가 부족할 때 사용될 수 있으며, 골의 빠른 성장 및 골 대체 효과가 있다.

본 발명의 말뼈 나노세라믹은 고온 열처리 방법을 통해 말뼈의 유기물을 완전히 제거하고 골 무기질만을 수득한 것을 말한다. 상기 열처리는 600 내지 1500℃의 온도에서 이루어질 수 있으며, 구체적으로 800 내지 1200℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 고온에서의 열처리는 추가 감염을 방지할 수 있다.

본 발명의 "폴리카프로락톤(polycarprolacton; PCL)"은 카프로락톤 (carprolacton; CL)으로부터 중합되는 폴리에스테르 계열의 생분해성 고분자를 말한다. 약 60℃의 낮은 융점과 약 -60℃의 유리 전이온도를 갖는다. 상기 PCL은 생체 조직 재생을 위한 세포 부착용 지지체 및 골조직 재생용 삽입물 등 다양한 의료용 분야에서 사용될 수 있다.

상기 폴리카프로락톤(PCL)은 생체적합성이 우수하고 분해 시 독성이 없다. 본 발명의 "생체적합성"은 생체에 투여되어서 바람직하지 않은 장기적인 효과를 유도하지 않는 것을 의미한다.

본 발명의 치주조직 재생용 지지체는 생체적합성 및 골재생에 우수한 말뼈 나노세라믹을 이용할 수 있고, 상기 말뼈 나노세라믹 입자의 불균일성을 극복하기 위해 생체적합성이 우수한 고분자인 PCL과 혼합하여 보다 적합한 3D 프린팅 소재로 사용한 것일 수 있다.

본 발명의 PCL/말뼈 나노세라믹 지지체는 말뼈:폴리카프로락톤의 질량비가 1:5, 1:7, 1:10, 1:15, 또는 1:20으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 "치주조직 재생"은 치주 인대에서 유래된 세포에 의해 생긴 신생 치주인대가 신생 백악질에 부착되는 것을 말한다. 본 발명의 지지체는 치주질환에 따라 손상된 치조골에서 골세포의 분화를 유도하여 치주조직을 재생시킬 수 있다. 상기 지지체는 치수유래 줄기세포의 증식을 촉진시킬 수 있으며, 치조골 분화를 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에서, 말뼈 세라믹의 함량이 높을수록, 즉 10%의 말뼈 함량을 가진 지지체에서 세포의 부착이 증가됨을 확인할 수 있었고 7 일 후 가장 활성화됨을 확인하였다(실시예 5).

본 발명의 다른 하나의 구체적인 구현예에서, 말뼈 세라믹의 함량이 높을수록 칼슘 미네랄 축적이 증가하고, 골분화 단백질 마커의 발현양이 증가함을 통해 조골세포로의 분화가 촉진됨을 확인하였다(실시예 6).

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 말뼈 나노세라믹 및 폴리카프로락톤(PCL)을 포함하는 지지체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 PCL/말뼈 나노세라믹 지지체의 제조방법은 (a) 고온 열처리를 통해 말뼈에서 무기물을 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 말뼈를 100 내지 1000 나노 크기로 분쇄하는 단계; (c) 상기 분쇄된 말뼈 나노세라믹에 에탄올을 첨가하고 초음파분쇄기로 분산시키는 단계; 및 (d) 상기 말뼈 나노세라믹 및 PCL을 포함하는 유기용매를 혼합하고 용매를 증발시키는 단계를 포함한다.

상기 (a) 단계에서의 열처리는 800 내지 1200℃에서 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 (c) 단계에서 사용된 에탄올은 80% 이상일 수 있으며, 구체적으로 90%, 보다 구체적으로 99%의 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 에탄올에 혼합된 말뼈 나노세라믹은 1 내지 10g/ml일 수 있고, 구체적으로 1 내지 5g/ml, 보다 구체적으로 1 내지 2g/ml일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 에탄올에 혼합된 말뼈 나노세라믹은 초음파 분쇄기를 이용하여 1분 내지 10분 동안, 구체적으로 3분 내지 5분 동안 분산시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 (d) 단계에서 사용된 유기용매는 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 또는 디메틸설폭사이드 (dimethylsulfoxide)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 (d) 단계에서 PCL 용액과 말뼈 나노세라믹을 혼합한 후, 상기 PCL/말뼈 나노세라믹 용액을 플레이트 위에 붓고 후드 안에서 3 내지 20시간 동안, 구체적으로 5 내지 10시간 동안 용매를 완전히 증발시킬 수 있다.

본 발명의 치주조직 재생용 지지체의 제조방법은 상기 (d) 단계 이후, (e) 상기 PCL/말뼈 나노세라믹을 80 내지 150℃로 열처리하는 단계; 및 (f) 상기 열처리된 PCL/말뼈 나노세라믹을 100 내지 500 kPa의 압력으로 10 내지 20g 노즐을 이용하여 3D 프린팅하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 3D 프린팅은 0.01 내지 20 mm/s의 헤드 속도로 인쇄될 수 있으며, 구체적으로 0.1 내지 10 mm/s 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 "3D 프린팅"은 세포를 원하는 형상 또는 패턴으로 적층조형하여 조직이나 장기를 제작하는 기술로서, 생체적합성 고분자, 천연고분자, 바이오분자, 세포, 또는 생체활성물질을 프린팅소재로 사용할 수 있다.

상기 3D 프린팅은 생체모방, 소형조직, 및 자율성 자가조립의 특성을 가진다. 상기 "생체모방"은 생물체의 특성을 산업 전반에 적용하여 인공장기 또는 세포를 복제하는 것을 의미하고, 상기 "소형조직"은 생체 내 작은 조직이 모여 큰 단위인 장기가 되는 조직의 발생특성을 3D 프린팅에 적용한 것을 말하며, 상기 "자율성 자가조립"은 발달 단계에 있는 조직의 초기세포를 구성하는 물질이 자율적으로 이상적인 구조조직을 형성할 수 있음을 의미한다.

본 발명의 3D 프린팅 소재로 사용된 "폴리카프로락톤(PCL)"은 생분해성 고분자로 생체 내 분해되며, 분해산물에 독성이 없고, 기계적 물성이 우수하여 원하는 구조 또는 형태로 물성 강도 확보가 용이한 특징이 있고, 인체 내 분해속도의 조절이 가능한 장점이 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 말뼈 나노세라믹 및 폴리카프로락톤(PCL)을 포함하는 치주조직 재생용 필라멘트를 제공한다.

본 발명의 "말뼈 나노세라믹", "폴리카프로락톤", 및 "치주조직 재생"은 상기 기재된 바와 같다.

본 발명의 "필라멘트"는 지지체의 구조적 기능성을 향상시키기 위해 미세표면을 구현하기 위한 나노급 형상구현 공정을 통해 나노 크기의 공극을 갖는 섬유를 말한다.

상기 필라멘트는 3차원 내외부 구조를 통해 물질대사가 원활하게 이루어질 수 있는 마이크로 사이즈의 공극을 확보할 수 있고, 세포의 활성을 구조적으로 향상시킬 수 있다.

본 발명의 말뼈 나노세라믹 및 폴리카프로락톤을 포함하는 치주조직 재생용 필라멘트는 말뼈:폴리카프로락톤의 질량비가 1:5, 1:7, 1:10, 1:15, 또는 1:20으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 필라멘트는 치수유래 줄기세포의 증식을 촉진시킬 수 있으며, 치조골 분화를 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 지지체를 포함하는 치주조직의 재생을 유도하기 위한 이식용 치주조직 재생 유도재를 제공한다.

본 발명의 "재생 유도재"는 Guided Bone Regeneration(GBR)을 위한 멤브레인형 의료기기로서, GBR의 원리를 사용하는 가장 대표적인 의료기기는 흡수성 치주조직 재생 유도재일 수 있다. 상기 재생 유도재는 골 이식 후 주변 치주 세포들이 자라나 치조골 재생을 방해하는 것을 방지하는 차폐막 역할을 하는 소재이다. 상기 막형태의 유도재를 치조골과 치주 인대사이에 적용해서 각각의 조직을 물리적으로 분리시키는 역할을 할 수 있다.

본 발명에서는 멤브레인형 지지체에 말에서 유래한 나노세라믹을 사용함으로써 골조직과의 유착을 증진시킬 수 있다. 상기 멤브레인을 통해 연조직이 골손실 부위로 침투하는 것을 방지하고 골조직 재생을 촉진시킴을 확인하였다(실시예 6).

구체적으로, 기존 골 조직과의 유착을 증가시키기 위해, 말뼈 유래 나노세라믹을 PCL에 섞은 재료를 3D 프린터를 이용하여 제작할 수 있다. 또한, 말뼈 유래 나노세라믹스 입자의 불균일성으로 인해 프린팅 능력이 떨어지는 단점을 극복하기 위해, 유기용매에 녹인 PCL/말뼈 혼합물을 프린팅 소재로 사용할 수 있다.

본 발명의 말뼈 나노세라믹과 PCL을 포함하는 치주조직 재생용 지지체는 손상된 치조골과 치주인대 사이에 삽입되어 치조골 조직의 수복을 촉진시키고 치주인대에 결체조직이 자라서 들어감을 방지함으로써, 삽입 주위 조직으로부터 유래한 중간엽 줄기세포의 부착, 치아 유래 줄기세포의 증식과 치조골 유래 줄기세포의 골분화를 유도하는 역할을 하므로, 치아 재생 등의 관련 산업에서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 말의 뼈를 열처리 후 수득한 분말에 X-ray 조사 후 결정상을 나타낸 도이다.
도 2는 열처리 온도에 따른 말뼈 특성 변화를 나타낸 것으로, 도 2a는 DSC-TGA (열중량분석기)를 이용하여 질량의 변화를 분석한 도이고, 도 2b는 FT-IR (적외선 분광기)를 이용하여 분말의 작용기를 분석한 도이며, 도 2c는 XRF (X-ray 형광분석기)를 이용하여 무기물의 질량비율을 분석한 도이다.
도 3은 PCL/말뼈 나노세라믹 필라멘트의 물성을 평가한 도이다.
도 4는 치수유래 줄기세포(dental pulp stem cells; DPSCs) 증식에 PCL/말뼈 나노세라믹 지지체가 미치는 영향을 세포 활성도를 측정한 도로서, 도 4a는 형광현미경으로 관찰한 도이고, 도 4b는 정량 실험결과를 나타낸 도이다.
도 5는 치조골 유래 줄기세포의 골분화에 PCL/말뼈 나노세라믹 지지체가 미치는 영향을 확인한 도로서, 도 5a는 말뼈 세라믹 함량에 따른 칼슘 축적을 확인한 도이고, 도 5b는 칼슘 침착을 나타낸 도이며, 도 5c는 골분화 관련 단백질 마커의 발현을 확인한 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 말뼈 나노세라믹을 함유하는 PCL 지지체 제작

고온 열처리 방법을 이용하여 조랑말의 뼈에서 무기물만을 추출하였고, 추출된 말뼈를 100 내지 1000 나노 사이즈로 분쇄한 후, 에탄올에 말뼈 나노세라믹을 초음파분쇄기를 이용하여 분산시켰다. 유기용매에 폴리카프로락톤(PCL)을 첨가한 후 교반하여 용액을 준비하여 상기 PCL용액과 에탄올에 분산된 말뼈 나노세라믹을 혼합한 뒤 용매를 증발시켜 PCL/말뼈 나노세라믹 지지체를 제조하였다.

상기 용액을 준비하는 단계에는 유기용매에 폴리카프로락톤을 첨가한 후 2 내지 3시간 동안 300 내지 500 rpm의 속도로 교반하였다.

상기 PCL에 첨가된 유기용매는 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄 (dichloromethane), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 디메틸포름아마이드 (dimethylformamide), 또는 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)를 사용할 수 있다.

본 발명의 말뼈 나노세라믹은 고온 열처리 방법을 이용하여 조랑말의 뼈의 유기물을 완전히 제거하여 골 무기질(말뼈 나노세라믹)만을 획득하였고, 추가 감염의 위험을 제거하기 위하여 800℃이상의 온도를 사용하였다.

상기 말뼈 나노세라믹이 분산된 에탄올을 준비하는 단계는 99%의 에탄올에 말뼈 나노세라믹을 1 내지 2 g/ml로 혼합한 뒤 초음파 분쇄기를 이용하여 60 와트(w)의 출력으로 3 내지 5분간 처리하였다.

이후, PCL 용액에 말뼈가 분산된 99%에탄올을 혼합하여 300 내지 500 rpm으로 1 내지 2시간 동안 교반하였다. 상기 PCL/말뼈 나노세라믹 용액을 제조할 때, PCL과 말뼈의 질량비가 20:1 내지 5:1 (PCL:말뼈)의 질량비를 갖도록 용액의 양을 조절하였다.

상기 PCL/말뼈 나노세라믹 용액을 혼합한 뒤, 사각 플레이트 위에 용액을 붓고 흄 후드(hume hood)에서 5 내지 10시간 동안 용매를 완전히 증발시켰다.

상기 PCL/말뼈 나노세라믹 용액은 고온용융시린지(hot melt syringe)에 넣은 후 80 내지 110℃의 온도로 열처리하여 1 내지 2시간 동안 재료를 충분히 가열하였다.

상기 열처리된 PCL/말뼈 나노세라믹은 100내지 500 kPa의 압력으로 18g 노즐을 통하여 0.1 내지 10 mm/s의 헤드 속도로 인쇄하여 말뼈 나노세라믹을 함유하는 PCL 지지체를 제조하였다.

실시예 2. 고온의 열처리가 말뼈 분말의 결정성에 미치는 영향 확인

살점이 제거된 말뼈를 600℃의 온도로 2시간 동안 열처리 하여 200 ㎛ 이하의 입도를 갖는 분말형태로 제조하였다.

상기 200 ㎛ 이하의 입도를 갖는 말뼈 세라믹 분말을 전기로에 넣고 각각 600, 900, 1100, 1200 ℃의 온도에서 4 시간 동안 열처리하였으며, 각각 5℃ /min의 상승 온도를 갖도록 전기로를 제작하였다.

열처리 이후의 말뼈 세라믹분말은 모두 유기물이 제거된 것을 확인하였고, 각각의 분말의 결정 구조를 확인하기 위하여 X-ray 회절분석기를 사용하여 분말을 분석하였다. 결정구조는 JCPDS에 공개된 자료를 통하여 분석하였으며, 추가로 합성을 통하여 제조된 수산화인회석의 결정구조를 동시에 분석하였다. 또한 시판된 골이식재인 Bio-OSS를 대조 물질로 사용하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 열처리된 말뼈 분말은 비교물질인 수산화인회석과 동일한 각도에서 보강간섭이 일어나는 특성 밴드를 보여 유사한 결정 구조를 갖는 재료임을 확인할 수 있었다. 열처리 온도가 높아질수록 특정 각도에서 얻는 피크(peak)가 좁아지는 확인하였고, 이는 결정의 크기가 커지는 현상에 의한 것임을 나타낸다.

이를 통해, 열처리에 의해 말뼈 분말의 결정 크기가 증가됨을 알 수 있었다.

실시예 3. 고온의 열처리가 말뼈 분말의 화학조성에 미치는 영향 확인

고온의 열처리가 말뼈 분말에 미치는 영향을 더 자세히 조사하기 위하여, 말뼈 조각을 열중량 분석(DSC-TGA) 장치를 이용하여 특성을 관찰하였다.

열중량 분석을 통하여 110℃근처에서는 결합수(bounded water)가, 340~360℃에서는 남아있는 유기물질이, 800℃에서는 탄산(CO₃ ^2-)기가, 그리고 1100℃이상에서는 인산기(PO₄ ^3-)의 분해로 인해 수산화인회석 구조가 분해되는 것으로 조사되었으며 그 결과는 도 2a와 같다.

도 2b에 나타낸 FT-IR의 결과를 분석하면, 900℃이후에는 탄산기가, 1300℃에서는 인산기가 분해되는 현상을 관찰할 수 있었으며, 도 2c의 XRF 분석 결과를 통해 Ca/P의 분자 비율이 1100℃까지 1.9 정도를 유지하다가 1300℃이후에 2.0을 상회하는 결과를 확인할 수 있다.

이를 통해, 고온의 열처리를 한 경우 수산화인회석의 구조가 분해되고, Ca/P의 분자 비율이 증가함을 확인하였다.

실시예 4. PCL/말뼈 지지체의 인장강도 및 표면에 미치는 영향 확인

말뼈 세라믹을 포함한 지지체의 강도를 측정하기 위해, 두 재료를 균일하게 블렌딩한 필라멘트를 제조하였다.

다이클로로메테인(dichloro-methane; DCM) 100 ㎖에 20 g의 폴리카프로락톤 (polycarprolacton; PCL)을 첨가한 용액을 제조하여, PCL이 DCM에 완전히 용해되도록 4 시간 동안 300 rpm의 속도로 교반시켜 용액을 준비하였다.

또한, 말뼈 세라믹을 고르게 분산시키기 위하여 100 내지 1000의 나노미터크기로 분쇄된 말뼈 세라믹 2 g을 40 ㎖의 에탄올 99%에 넣어준 뒤, 초음파 분쇄기를 이용하여 5분 동안 60 W의 출력으로 처리하였다.

상기 두 용액을 섞은 뒤 1 시간 동안 300 rpm의 속도로 교반하여 두 용액이 충분히 섞일 수 있도록 처리한 뒤, 사각 플레이트에 붓고 흄후드에서 용매가 완전히 증발 할 때까지 건조시켰다. 건조된 PCL/말뼈 세라믹은 필름형태의 모양을 가지며, 3D 프린팅용 소재로 사용하기 위해 2 ㎝이하의 크기를 갖도록 잘라 주었다.

PCL/말뼈 세라믹을 고온용융압출(hot melt extrusion; HME) 타입의 3D 프린터의 재료 담지용 시린지에 넣고 100℃로 1시간 동안 가열하였다. 필라멘트를 제조하기 위하여 압출기(extruder)에 14 게이지(gauge) 니들을 설치하고, 150 kPa의 압력으로 재료를 사출시켰다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 제작된 PCL/말뼈 세라믹 필라멘트의 두께는 모든 처리 군에서 1.6 정도를 갖는 것을 알 수 있었다. 인장강도는 말뼈 세라믹이 10% 함유됐을 때 감소하는 경향이 관찰되었다.

실시예 5. 치아 유래 줄기세포들의 증식에 PCL/말뼈 3D 지지체가 미치는 영향 확인

in vitro 검사를 위해 인간의 발치한 치아 조직에서 채취한 치수유래 줄기세포 계대 5(human dental pulp stem cell 2; DPSC 세포)를 사용하였다. 냉동되어 있던 DPSC 세포를 해동한 뒤 alpha MEM, 10% FBS(Fatal Bovine Serum), 1% 페니실린을 혼합하여 만든 배지에 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하였다. DPSC 세포의 배양밀도가 컨플루언트(confluent)해진 것을 확인한 뒤 트립신 EDTA를 이용해 배양 플레이트에서 분리하였다.

실험군은 실시예 1에 의해 제조된 말뼈 세라믹이 포함된 PCL을 이용하였고, 도 4에 나타난 바와 같이 말뼈 세라믹의 함유율이 1, 5, 10%로 혼합된 지지체와, PCL만으로 조성된 지지체를 사용하여 in vitro 검사를 수행하였다.

이후 96웰 플레이트에 상기 4 종류의 패치를 6 mm의 지름을 갖는 원형으로 제조하여 각각에 플레이트에 고정시켰다. 이후 96 웰 플레이트에 웰당 1 × 103개의 DPSC 세포를 각각 시딩(seeding)하였다.

이후 1일, 3일, 7일 간격으로 WST-1 시험법으로 세포의 활성을 측정하였다.

말뼈 세라믹이 세포의 부착에 어떠한 역할을 부여하는지 조사하기 위해 실시예 1에 따른 PCL/말뼈 세라믹 지지체에 대하여 DPSC 세포의 부착 모양을 형광현미경을 통해 분석하였다.

도 4a에 나타낸 바와 같이, 말뼈 세라믹의 함량이 높을수록 세포가 잘 부착된 것을 확인할 수 있었으며 이는 7일에서 두드러지게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 도 4b의 정량 실험결과도 형광현미경 관찰 결과와 동일한 양상을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 실시예 1에 따라 제조된 10%의 말뼈 함량을 가진 PCL/말뼈 세라믹 지지체에서의 세포 증식이 가장 활발해 짐을 관찰하였다.

이는, 말뼈 세라믹의 함량이 높은 PCL을 이용할 경우 세포가 잘 부착됨을 나타낸다.

실시예 6. 치조골 유래 줄기세포의 골분화에 PCL/말뼈 3D 지지체가 미치는 영향 확인

in vitro 검사를 위해 인간의 발치한 치아조직에서 채취한 DPSC 세포 계대5를 사용하였다. 냉동되어 있던 DPSC 세포를 해동한 뒤 alpha MEM, 10% FBS(Fatal Bovine Serum), 1% 페니실린을 혼합하여 만든 배지에 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하였다. DPSC 세포의 배양밀도가 컨플루언트(confluent)해진 것을 확인한 뒤 트립신 EDTA를 이용해 배양 플레이트에서 분리하였다.

실험군은 실시예 1에 의해 제조된 말뼈 세라믹이 포함된 PCL을 이용하였고, 도 4에 나타낸 바와 같이 말뼈 세라믹의 함유율이 1, 5, 10%로 혼합된 지지체와, PCL만으로 조성된 지지체를 사용하여 DPSC의 골분화 정도 검사를 수행하였다.

이후 형광현미경 관찰을 위하여 96웰 플레이트에 상기 4 종류의 패치를 6 mm의 지름을 갖는 원형으로 제조하여 각각에 플레이트에 고정 시켰다. 이후 96 웰 플레이트에 웰당 1 × 10³개의 DPSC 세포를 각각 시딩하였다

또한, 알리자린 레드 염색(Alizarin Red staining) 기법을 이용하여 칼슘 미네랄의 생성정도를 측정하기 위하여 24웰 플레이트에 상기 4종류의 패치를 10 mm의 지름을 갖는 원형으로 제조하여 각각의 플레이트에 고정 시켰다. 이후 48 웰 플레이트에 웰당 5 × 10³개의 DPSC 세포를 각각 시딩하였다.

추가로, 웨스턴 블롯 분석(Western blot assay) 기법을 이용하여 골 분화관련 단백질 마커의 발현 정도를 측정하기 위하여 150 pi TCPS 디쉬에 상기 4 종류의 패치를 130 mm의 지름을 갖는 원형으로 제조하여 각각의 디쉬에 고정시켰다. 이후 150 pi 디쉬에 플레이트당 1 × 10⁶개의 세포를 각각 시딩하였다.

이후 alpha MEM, 10% FBS(Fatal Bovine Serum), 1% 페니실린을 혼합하여 만든 배지에 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 72시간 동안 배양하였다. 이후 alpha MEM, 10% FBS(Fatal Bovine Serum), Dexamethasone (11mmol), 1% 페니실린을 혼합하여 만든 배지에 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1, 2, 3, 4 주 동안 배양하였다

말뼈 세라믹이 DPSC 세포의 조골세포로의 분화에 어떠한 역할을 부여하는지 조사하기 위해 실시예 1에 따른 PCL/말뼈 세라믹 지지체에 대하여 DPSC 세포의 골분화 관련 단백질 (Osteopontin, OPN, 초록색) 발현을 형광현미경을 통해 분석하였다.

도 5a에 나타낸 바와 같이, 말뼈 세라믹의 함량이 높을수록 골분화 관련 단백질 발현의 정도가 높은 것을 확인할 수 있었다. 이러한 경향은 도 5b의 ARS 실험을 통해서도 확인할 수 있었는데, 말뼈 세라믹의 함량이 높을수록 칼슘미네랄의 축적을 증가시키는 데에 영향을 주었음을 확인하였다.

또한, 도 5c에 나타낸 바와 같이, 1, 2, 3, 4 주에서의 골분화 관련 단백질 마커의 발현양을 확인한 결과, 말뼈 세라믹의 함유량이 높을수록 초기 골 분화 마커들의 발현이 1, 2주에서 활발하고 3주 이후에는 후기 마커들이 발현하여 줄기세포가 조골세포로의 분화가 촉진되었음을 확인하였다.

이를 통해, 실시예 1에 따라 제조된 10%의 말뼈 함량을 가진 PCL/말뼈 세라믹 지지체에서의 세포 분화가 가장 활발해 짐을 확인하였고, 말뼈 함량이 높을수록 조골세포로의 분화가 촉진됨을 시사한다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

말뼈 나노세라믹 및 폴리카프로락톤(polycarprolacton; PCL)을 포함하는, 치수유래 줄기세포의 증식을 촉진시키는, 치주조직 재생용 지지체.
제1항에 있어서, 상기 지지체는 말뼈:폴리카프로락톤(PCL)의 질량비가 1:5 내지 1:20인 것인, 치주조직 재생용 지지체.
제1항에 있어서, 상기 지지체는 치조골 분화를 추가로 촉진시키는 것인, 치주조직 재생용 지지체.
(a) 고온 열처리를 통해 말뼈에서 무기물을 추출하는 단계;
(b) 상기 추출된 말뼈를 100 내지 1000 나노 크기로 분쇄하는 단계;
(c) 상기 분쇄된 말뼈 나노세라믹에 에탄올을 첨가하고 초음파분쇄기로 분산시키는 단계; 및
(d) 상기 말뼈 나노세라믹 및 PCL을 포함하는 유기용매를 혼합하고 용매를 증발시키는 단계를 포함하는, 치주조직 재생용 지지체의 제조방법으로서, 상기 말뼈 나노세라믹 및 PCL을 포함하는 치주조직 재생용 지지체는 치수유래 줄기세포의 증식을 촉진시키는 것인, 치주조직 재생용 지지체의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 유기용매는 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄 (dichloromethane), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 디메틸포름아마이드 (dimethylformamide), 및 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인, 치주조직 재생용 지지체의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 (d) 단계 이후
(e) 상기 PCL/말뼈 나노세라믹을 80 내지 150℃로 열처리하는 단계; 및
(f) 상기 열처리된 PCL/말뼈 나노세라믹을 100 내지 500 kPa의 압력으로 10 내지 20g 노즐을 이용하여 3D 프린팅하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 치주조직 재생용 지지체의 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 3D 프린팅은 0.01 내지 20 mm/s 의 헤드 속도로 이루어지는 것인, 치주조직 재생용 지지체의 제조방법.
말뼈 나노세라믹 및 폴리카프로락톤(polycarprolacton; PCL)을 포함하는, 치수유래 줄기세포의 증식을 촉진시키는, 치주조직 재생용 필라멘트.
제8항에 있어서, 상기 필라멘트는 말뼈:폴리카프로락톤(PCL)의 질량비가 1:5 내지 1:20인 것인, 치주조직 재생용 필라멘트.
제8항에 있어서, 상기 필라멘트는 치조골 분화를 추가로 촉진시키는 것인, 치주조직 재생용 필라멘트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 지지체를 포함하는, 이식용 치주조직 재생 유도재.