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KR102301000B1 - 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈을 포함하는 만성 폐쇄성폐질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈을 포함하는 만성 폐쇄성폐질환 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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KR102301000B1
KR102301000B1 KR1020190164106A KR20190164106A KR102301000B1 KR 102301000 B1 KR102301000 B1 KR 102301000B1 KR 1020190164106 A KR1020190164106 A KR 1020190164106A KR 20190164106 A KR20190164106 A KR 20190164106A KR 102301000 B1 KR102301000 B1 KR 102301000B1
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hydroxymethyl
acetal
formylfurfuryl
obstructive pulmonary
chronic obstructive
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KR1020190164106A
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박주동
이지혁
박현웅
최철수
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(의료)길의료재단
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Abstract

본 발명은 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈 을 유효성분으로 포함하는 만성폐쇄성 폐질환의 치료, 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 매실에서 분리된 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈이 담배연기에 의해 유발되는 기관지 상피세포의 세포자멸사를 억제하고, ALDH2, ALDH3A1 또는 WRN의 발현을 증가시켜, 세포를 보호하는 바, 만성폐쇄성 폐질환 치료제 또는 개선제 등의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈을 포함하는 만성 폐쇄성폐질환 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising 5-hydroxymethyl-2-furaldehyde bis(5-formylfurfuryl) acetal for Preventing and treating chronic obstructive pulmonary disease}
본 발명은 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈 을 유효성분으로 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환 치료, 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.
매실(Japanese apricot, 학명: Prunus mume)은 오랫동안 한국인, 일본인, 중국인들 사이에서 건강 식품으로 인기가 있어왔다. 매실 추출물(Japanese apricot extract, JAE)은 산화적 스트레스 및 염증 감소, 선천 면역강화와 같은 여러 유익한 생물학적 효과를 가지고 있다.
농축된 매실 추출물은 안지오텐신 II-유발 ROS 생성에 대한 항산화 효과로서 심혈관 질환을 예방할 수 있다. 또한 매실 추출물의 트리터페노이드에는 항종양 및 항염증 효과가 있다.
담배 연기는 만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)의 주요 위험 인자이다. 담배 연기는 DNA 손상 및 세포사멸을 유발하는 반응성 알데히드를 포함하는 풍부한 독성 화학물질을 함유하고 있다. 인간에서 19개의 NAD(P)+-의존적 동종효소로 구성된 알데히드 탈수소효소(ALDH) 수퍼패밀리의 구성원은 알데히드 산화를 촉진한다. ALDH 수퍼패밀리 중에서 가장 강력하게 유도된 동종효소인 ALDH3A1은 담배 연기 유발 DNA 손상 및 세포독성을 약화시킨다. ALDH2 및 ALDH3A1을 포함한 수 많은 ALDH 종은 4-하이드록시-2-노네날(4-HNE)을 포함하여 지방족, 방향족 및 지질 과산화(LPO)-유도 알데히드의 산화를 촉진한다. ALDH3A1은 또한 LPO-매개 성장억제, UV선-유발 세포독성, ROS-유발 단백질 변형, 및 유전자 독소-유발 DNA 손상 및 세포 자멸사를 약화시킨다.
담배 연기는 ATM(ataxia teleangiectasia mutated)를 포함하여 포스포이노시티드 3-키나제 관련 단백질 키나제(PIKK)에 의해 매개되는 DNA 손상반응(DDR)을 활성화시킨다. DNA 이중-스트랜드 파괴(DSBs)가 형성되면, ATM은 세린 1981 잔기에서 자가 인산화에 의해 활성화되고 염색질 인접 DSB 부위에서 H2AX 변이체의 세린 139 잔기(γH2AX)를 인산화한다. γH2AX는 후속 DDR 신호 및 DNA 복원을 릴레이할 필요가 있다.
그러나 담배 독성에 의해 유발되는 만성폐쇄성 폐질환 및 피부노화 질환에서 매실 추출물의 잠재적 유용성은 아직 평가되지 않았다.
대힌민국 등록특허 10-0785969호
본 발명의 목적은 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈을 유효성분으로 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈을 유효성분으로 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자는 농축된 매실 추출물(JAE)에서 담배연기 유도 독성에 대해 세포 보호 효과를 가지는 화합물을 분리하였으며, 분리된 화합물의 구조분석 결과, 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈(FA-1로 명명)의 신규 분자를 성공적으로 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈을 유효성분으로 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈"은 화학식 1의 구조를 가지는 화합물로 매실에서 분리될 수 있다.
Figure 112019127716008-pat00001
본 발명의 실시예에서 매실 추출물의 농축액에 에탄올로 다당류를 침전시켜 분리하고, 헥산 분획물을 분리한 뒤, 클로로포름 용매로 분획한 클로로포름 분획물을 CPC 크로마토그래피롤 수행하여 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈을 분리하였다.
따라서 상기 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈는 매실 추출물의 클로로포름 분획물에서 분리되는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 클로로포름 분획물을 CPC 크로마토그래피 수행하여 분리되는 것일 수 있다.
본 발명에서 "만성폐쇄성 폐질환"은 유해한 입자나 가스 흡입, 특히 담배로 인한 비정상적인 염증 반응으로 인해 기도(기관지) 내에 만성 염증성 변화가 생김으로써 기관지의 공기유통이 힘들어지는 질환이다. 가장 흔한 증상은 가래, 호흡곤란, 가래 등이 있다. 증상이 천식과 유사하지만 천식과 달리 폐 기류의 감소는 약물 투여에 의해 눈에 띄게 호전되지 않는다. 만성폐쇄성 폐질환의 가장 흔한 원인은 흡연이며, 대기오염과 유전과 같은 요소도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 상기 만성폐쇄성 폐질환은 폐기종 또는 만성기관지염일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서의 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 만성폐쇄성 폐질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 만성폐쇄성 폐질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 일실시예에서, 매실 추출물(JAE)에서 분리한 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈이 불멸화 인간 기관지 상피세포(HBEC2) 및 정상 인간표피 각질세포(NHEK)에서 알데히드 탈수소효소(ALDH)2, 알데히드 탈수소효소(ALDH)3A1 및 베르너 증후군 단백질(WRN) 발현수준 증가에 의해 수반되는 담배연기 추출물(CSE)-유도 세포독성 및 DNA 손상으로부터 보호한다는 것을 확인하였다.
즉, 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈이 담배로 인한 기관지 세포 손상을 억제하거나 보호함을 확인하였는바, 상기 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈은 만성폐쇄성 폐질환의 치료 또는 예방 치료용 조성물로 이용할 수 있다. 구체적으로 상기 만성폐쇄성 폐질환은 담배로 인해 유발되는 것일 수 있다.
본 발명에서 만성폐쇄성 폐질환의 치료 및 예방은 구체적으로 담배로 유도되는 세포사멸, DNA 손상을 억제하여 만성폐쇄성 폐질환의 증상 또는 발명은 지연 또는 억제시키는 것일 수 있다.
또한 본 발명의 실시예에서 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈이 인간 기관지상피세포에서 농도 의존적으로 ALDH2, AlDH3A1 및 WRN의 발현을 증가시킴을 확인하였으며, 담배연기 추출물에 의해 감소되는 WRN의 발현을 증가시킴을 확인하였다.
따라서 본 발명의 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈은 ALDH2, AlDH3A1 및 WRN의 발현을 증가시켜 담배로 인한 세포의 사멸 및 손상을 억제 또는 예방하는 것일 수 있다.
본 발명의 만성폐쇄성 폐질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함된 상기 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 0.1 내지 2,000 mg/체중 kg으로 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 만성폐쇄성 폐질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 만성폐쇄성 폐질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈에 대해서는 전술한 바와 같다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 상기 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈은 만성폐쇄성 폐질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있으므로, 상기 조성물은 만성폐쇄성 폐질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"란 만성폐쇄성 폐질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다.
본 발명의 만성폐쇄성 폐질환을 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈을 유효성분으로 포함하는 만성폐쇄성 폐질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈, 만성폐쇄성 폐질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 조성물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 상기 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 만성폐쇄성 폐질환 치료 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 아울러 본 발명의 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈를 유효성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다.
본 발명은 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈 을 유효성분으로 포함하는 만성폐쇄성 폐질환의 치료, 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 매실에서 분리된 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈이 담배연기에 의해 유발되는 기관지 상피세포의 세포자멸사를 억제하고, ALDH2, ALDH3A1 또는 WRN의 발현을 증가시켜, 세포를 보호하는 바, 만성폐쇄성 폐질환 치료제 또는 개선제 등의 개발에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 매실 추출물(JAE)이 불멸화 인간 기관지 상피세포에서 WRN 및 ALDH 단백질을 증가시키는 것을 나타내는 도면이다. (A) 24 시간 동안 JAE(0, 1, 2 및 4 mg/mL)로 처리 한 후 24 시간 동안 담배연기 추출물(CSE) 0, 2, 4 및 6%의 부재 또는 존재 하에 HBEC2 세포를 배양하였다. 세포 생존율은 MTT 분석을 수행하였다. (B) 불멸화 HBEC2 세포를 24 시간 동안 JAE(0, 1, 2 및 4 mg/mL)로 처리 한 후 24 시간 동안 1.5% CSE의 존재 또는 존재 하에 배양하였다. 면역 블롯 분석은 WRN, ALDH2 및 ALDH3A1 단백질에 대해 분석하였다. 3개의 3중 샘플을 사용하여 2개의 독립적인 실험에 대한 데이터는 평균 ±SEM으로 표현된다.
도 2는 매실 추출물(JAE)에서 FA-1 [5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈]의 정제하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 3은 FA-1 [5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴) 아세탈]의 구조 결정을 나타낸 도면이다. (A) FA-1의 ESI-TOFMS 데이터, (B) 1H NMR 데이터(화학적 이동, ppm; JH,H 값, Hz),(C) 13C NMR 데이터(화학적 이동, ppm) 및 (D) HMBC 상관관계이다.
도 4는 FA-1이 용량 의존적 방식으로 ALDH 및 WRN 단백질을 증가시키고 불멸화 인간 기관지 상피세포에서 담배연기-유발 세포독성(MTT 및 유세포 분석기)으로부터 보호함을 나타내는 도면이다. (A) ALDH2, ALDH3A1 및 WRN의 발현 분석한 결과로 FA-1 [DMSO(디메틸설폭사이드) 중 5, 25, 50, 75 및 150 nM] 또는 비히클(1.0% 부피의 DMSO에 해당)로 처리한 후 HBEC2 세포를 배양하였다. (B) MTT 분석결과로 HBEC2 세포를 24 시간 동안 0 및 6% CSE의 존재 또는 부재 하에 NAC(2 mM), FA-1(150 nM) 및 비히클과 함께 배양하고 생존력에 분석하였다. 데이터는 배양된 불멸화 인간 기관지 상피세포에서 평균 ±SEM(**p<0.01) 세포독성으로 표현된다. (C) 유세포 분석결과로 아넥신 V 및 프로피디움 요오드화물 (PI) 염색하고 을 세포사멸을 분석하였다.
도 5는 FA-1이 HBEC2 세포에서 담배연기-유발 산화적 손상과 DNA 손상을 약화시킴을 나타내는 도면이다. HBEC2 세포를 24 시간 동안 2% CSE의 존재 또는 부재 하에 FA-1(150 nM)과 함께 배양하고, 4-HNE 및 ATM의 인산화에 대해 면역 블롯 분석을 수행하였다.
도 6은 FA-1이 용량 의존적 방식으로 ALDH2 및 WRN 단백질을 증가시키고, 정상적인 인간 표피 각질세포에서 WRN 단백질의 담배연기-유도 하향 조절을 약화시킴을 나타낸 도면이다.
(A) ALDH2 및 WRN 면역블랏 결과이다. 다양한 농도의 FA-1 [DMSO(디메틸설폭사이드) 중 5, 25, 50, 75 및 150 nM) 또는 비히클(1.0% 부피의 DMSO에 해당)로 처리한 후 NHEK 세포를 배양하였다.
(B) 담배연기-유도 하향 조절을 약화를 면역블랏으로 분석한 결과이다. NHEK 세포를 24 시간 동안 2% CSE의 존재 또는 부재 하에 FA-1(150 nM) 및 비히클과 함께 배양하였다.
도 7은 FA-1이 정상적인 인간 표피 각질 세포에서 담배연기-유발 세포독성과 DNA 손상을 방지함을 나타내는 도면이다. (A) 0, 2, 4 및 6% CSE의 존재 또는 부재 하에 24 시간 동안 FA-1 [DMSO(디메틸설폭사이드) 중 150 nM)로 처리한 후 NHEK MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드)-계 세포 생존력을 나타낸 도면이다. 데이터는 배양된 NHEK에서 평균 ±SEM(**p<0.01) 세포독성으로 표현된다. (B) NHEK 세포를 2% CSE의 존재 또는 부재 하에 24 시간 동안 150 nM의 FA-1로 처리하였다. ATM 및 H2AX의 인산화를 위해 면역블롯 분석을 수행하였다.
도 8은 클로로포름 분획물을 재분획한 F1 내지 F4분획물의 담배연기 추출물 유도 세포독성에 대한 세포 생존율 분석결과이다.
도 9 내지 14는 분리된 활성 화합물 FA-1의 구조분석 결과이다. 구체적으로도 9는 1H NMR 스펙트럼이고, 도 10은 13C NMR 스펙트럼이고, 도 11은 COSY 스펙트럼, 도 12는 TOCSY 스펙트럼, 도 13는 HMBX 스펙트럼, 도 14는 HSQC 스펙트럼 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 방법>
1. 시약 및 항체의 준비
화학물질은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)로부터 구입하였고, 프로테이나아제(proteinase) 및 포스파타아제 억제제(phosphatase inhibitor)는 서모 사이언티픽(Thermo Scientific)으로부터 구입하였다. 인산화 ATM(세린 1981), ALDH2, ALDH3A1 항체는 Abcam, 인산화 H2AX 항체는 셀 시그널(Cell signaling), 4-HNE 항체는 R&D Systems, β액틴은 시그마-알드리치로부터 구매하였다.
2. FA-1의 분리 및 정제
농축된 매실(Prunus mume) 추출물은 한국의 파이시사(Fysee Inc.)에서 구매하였으며, -20℃ 이하에서 보관하였다.
FA-1은 도 2에 도시된 방법과 같이 분리하였다. 농축된 매실 추출물 250 g을 증류수 1 L에 용해시키고 에탄올 2 L를 첨가하여 다당류(Polysaccharide)를 침전시키고 제거하였다. 그 후, n-헥산을 첨가하여 헥산 분획물을 분리하고 난 후 클로로포름 첨가하여 클로로포름 분획물을 분리하여 클로로포름 분획물(9.26 g)을 얻었다. 다음르로 ODS 컬럼을 사용하여 상기 클로로포름 분획물로부터 4개의 하위 분획물(F1, F2, F3 및 F4)을 제조하였다. 이들 4개의 하위 분획물(F1 내지 F4)의 담배연기 추출물 유도 세포독성에 대한 세포보호 효과를 분석하였다. 분석결과 F2 분획물이 담배연기 추출물(CSE) 유도 세포독성에 대해 가장 높은 보호효과를 가짐을 확인하였다(도 8).
상기 클로로포름 분획물에서 활성 화합물을 분리하고자, n-헥산 : 에틸 아세테이트(EtOAc) : 메탄올(MeOH) : 물 = 3 : 7 : 5 : 6(v/v)로 구성된 2개의 상을 사용하여 원심분리 크로마토그래피(CPC)를 수행하였다. 활성 화합물을 정제하기 위해, CPC 용리액(F2, 815.25 mg)을 50% 및 60% 메탄올(MeOH) 용매를 사용하여 예비 ODS 박막 크로마토그래피(TLC)에 수행하고, UV(280 nm)에서 모니터링하여, F2 분획물에서 FA-1(18.53 mg)을 연속적으로 분리 및 정제하였다.
3. FA-1의 구조분석
FA-1은 담배연기 추출물(CSE) 유도 세포독성에 대해 효과적인 보호를 제공하므로, FA-1 화합물의 구조를 분석하였다. NMR 스펙트럼을 20 ℃에서 0.4 ml의 CD3OD 중 Agilent 600 MHz NMR 분광계(Agilent Technologies, Santa Clara, USA)에 기록하였다. 스펙트럼은 δH/C = 3.30/49.8 ppm(CD3OD)에서 공명을 갖는 잔류 용매 신호를 기준으로 하였다. 신호는 COSY, HSQC 및 HMBC 스펙트럼의 분석을 기본으로 할당되었다. MS 분석은 ESI-TOFMS(micrOTOF-Q II, Bruker, Billerica, MA, USA)에 기록되었다.
4. 담배연기 추출물 제조
켄터키대학교의 연구용 담배(3R4F)를 구입하여 담배연기 추출물(CSE) 용액을 제조하였다. CSE 용액은 Blue and Janoff 방법의 수정하여 제조하였다. 10 ml의 멸균 DMEM 배지를 50 ml 플라스틱 주사기에 넣은 후 40 ㎖의 담배연기를 주사기 내로 끌어 들여 격렬한 진탕하여 상기 배지와 혼합 하였다. 이 후 0.22 μm 필터로 여과하여 큰 입자를 제거하여 담배연기 추출물을 제조하였다. 상기의 담배연기 추출물을 100 % 농도로 지정하였으며 담배연기 추출물은 제조 직후 사용하였다.
5. 세포배양 및 세포 생존률 분석
불멸화된 인간 기관지인간상피(Immortalized human bronchial epithelial cells, HBEC2)는 텍사스 달라스에 있는 사우스웨스턴 메디컬 센터(Southwestern Medical Center)의 쉐이 및 민나(Shay and Minna) 박사에 의해 제공되었다.
정상 인간 표피 각질세포(normal human epidermal keratinocytes, NHEK)는 FNC 코팅 믹스(Athena ES)로 코팅된 플레이트에서 5 μg/L의 인간 재조합 표피 성장인자 및 50 mg/L의 소 뇌하수체 추출물(Invitrogen)이 보충된 케라티노사이트 세럼(keratinocyte serum) 무첨가 배지로 배양하였다.
모든 세포를 37℃에서 5% CO2의 표준 인큐베이터 조건 하에서 성장시켰다. 실험은 12-웰 및 6-웰 조직 배양 플레이트에서 초기 세포밀도(starting cell density) 10 x 103/cm2로 수행하였다.
세포생존율 분석은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT)의 측정하여 분석하였다. HBEC2 및 NHEK 세포를 12-웰 플레이트에서 24 시간 동안 배양하고, DMSO에 용해된 150 nM의 FA-1로 24 시간 동안 처리하였다. 24 시간 동안 처리한 후, 세포를 24시간 동안 2%, 4% 또는 6% 농도의 담배연기 추출물(Cigarette smoke extract, CSE)에 노출시켰다. 540nm에서 흡광도를 측정하고, 담배연기 추출물에 처리하지 않은 비히클 대조군 세포와 비교하여 담배연기 추출물 처리 세포의 상대적인 세포 생존율을 측정하였다.
6. 세포 자멸사 분석(Flow Cytometric analysis)
세포 자멸사는 유세포 분석기를 이용하여 분석하였다. FA-1(150 nM)로 처리하고 담배연기 추출물(CSE)에 노출시킨 후, 트립신 처리하여 세포를 회수하였다. 105 개의 세포는 1 x 결합 완충액(0.01M의 HEPES, pH 7.4; 0.14M의 NaCl; 0.25 mM의 CaCl2)에서 10 μL의 프로피디움 요오드화물(PI) 및 5 μL의 Annexin V-FITC를 사용하여 염색하였다.
세포를 실온에서 15분 동안 암실에서 배양하고 FITC- 및 PI-양성 세포의 백분율을 FACS Canto-II 유세포 분석기를 사용하여 정량화하고, Flowjo 소프트웨어(버전 7.6.3)를 이용하여 분석하였다.
7. 면역블롯 분석
FA-1(150 nM)로 처리하고 담배연기 추출물에 노출시킨 후, 프로테이나아제(proteinase) 및 포스파타아제 억제제(phosphatase inhibitor)를 포함하는 1X RIPA 완충액(Sigma-Aldrich)을 이용하여 세포 용해물을 수득하였다. BCA 단백질 분석시약으로 상기 세포 용해물의 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 샘플을 SDS-PAGE로 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드 멤브레인으로 트랜스퍼 하였다. 상기 멤브레인을 5% 탈지분유(0.5% Tween-20를 포함하는 TBS 용매)로 블로킹 하고, 1차 및 2차 항체로 인큐베이션 하였다. enhanced chemiluminescence 시약(Advansta)으로 시각화하였다. 블랏을 스트리핑(stripping)하고 β-액틴에 대한 항체로 리프로빙(reprobing)하여 각 단백질의 동등한 로딩을 확인하였다.
신호 강도의 상대적 정량은 이미지 랩(Lab) 소프트웨어(Bio-Rad, 미국 캘리포니아 허큘레스)를 사용하여 결정되었고 상대 농도로 표현하였다.
8. 통계 분석
다수의 처리군과 관련된 모든 비교를 위해, 일원(one-way) 분산 분석(ANOVA)을 이용하여 처리 효과를 확인하였다. 계산된 대비에 기초한 p-값을 이용하여 개별처리 효과를 평가하였다. 그 결과는 평균 ±SEM으로서 그래프로 표현되었고, p<0.05는 통계적으로 큰 의미가 있는 것으로 간주하였다.
<결과>
1. 매실 농축액의 담배연기 추출물 유발 세포독성에 대한 세포보호 효과
매실 추출물의 담배연기 추출물에 대한 세포독성 보호효과를 확인하고자, 세포 생존율과 WRN 및 ALDH2, ADLH3A1 단백질 발현 변화를 분석하였다.
도 1은 매실 추출물(Japanese apricot extract, JAE)의 인간 기관지 상피세포에서 WRN 및 ALDH2, ADLH3A1 단백질을 증가시키는 것을 나타내는 도면이다.
HBEC2 세포에 매실 추출물을 0, 1, 2 및 4 mg/mL의 농도로 24 시간 동안 처리 한 후 담배연기 추출물(CSE)의 0, 2, 4 및 6% 농도로 24 시간 동안 처리하고 배양하였다. 상기 세포를 MTT 분석하여 세포 생존율을 분석하였다. 분석결과, 모든 농도에서 매실 추출물이 담배연기 추출물에 의한 세포독성으로부터 세포를 보호함을 확인하였다(도 1A).
본 발명자는 이전 연구에서 담배연기가 베르너 증후군 단백질(WRN) 하향 조절을 통해 세포노화 및 세포 이동 장애를 유발한다고 보고한 바 있다. 따라서, 베르너 증후군 단백질(WRN) 의 보존은 흡연 관련 질병의 치료효과를 나타낼 수 있다.
HBEC2 세포는 JAE(1, 2 및 4 mg/mL) 또는 비히클(1.0% 부피의 멸균 H2O에 해당)과 함께 배양하였고, 또한, 시험관내 ALDH2, ALDH3A1 및 WRN 단백질에 대한 JAE의 효과를 측정하였다. 매실 추출물은 ALDH2, ADLH3A1 및 WRN 단백질 발현을 용량 의존적으로 증가하였다(도 1B).
즉, 매실 추출물(JAE)이 담배연기 추출물 유도 세포독성으로부터 HBEC2 세포를 보호하고 HBEC2 세포에서 ALDH2, ALDH3A1 및 WRN 단백질을 증가시킴을 확인하였다.
2. FA-1의 구조 결정.
FA-1은 담배연기 추출물(CSE) 유도 세포독성에 대해 효과적인 보호를 제공하므로, FA-1 화합물의 구조를 분석하였다. 도 3은 FA-1의 NMR 분석결과이다. 1H NMR, 13C NMR 스펙트럼 및 FA-1의 주요 HMBC 상관 관계는 도 3에 도시되어 있다. FA-1은 분자식 C18H16O8 (C18H20NO8 + 378.1183 ESI-TOFMS에 대해 계산된 [M + NH4]+ m/z 378.1188)을 갖는다(도 3A).
이 화합물의 구조는 그들의 NMR 스펙트럼(1H NMR, 13C NMR, COSY, HSQC 및 HMBC)에 기초한 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드의 삼량체로서 밝혀졌다(보조 도면 도 S2-9). 1H NMR 스펙트럼에서 적분값의 비율이 거의 2 : 1인 유사한 신호의 두 세트가 표시되었다. 이들 신호의 두 세트는 공액 알데히드 신호(δC 178.1, δH 9.54, s), J 값 3.2 및 3.5Hz 서로 결합하는 올레핀계 메틴 양성자 2 세트, 2 쌍의 올레핀계 4급 탄소(δC 151.8/157.4 및 155.1/160.2), 비등가(δH 4.67, 4.69) 및 등가(δH 4.47) 하이드록실메틸 양성자 신호에 기초하여 5-하이드록시-2-푸르알데하이드 골격으로서 분석되었다. 또한, 하나의 아세탈 신호(δC 98.1, δH 5.81)는 푸란 C2 및 동일하지 않은 하이드록시메틸 신호 둘 모두와 상호 관련된 HMBC이었다. 도 3d에 도시된 기타 주요 HMBC 상호관계와 함께, 이 활성 화합물의 구조는 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈인 것으로 확인하고 FA-1로 명명하였다. 1H 및 13C NMR 신호의 할당은 도 3B, C에 도시되어 있으며, NMR 스펙트럼은 도 8 및 도 9와 같다.
3. 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈 (FA-1)의 기관지 세포보호 효과 및 ALDH 및 WRN 단백질 증가 효과
다음으로 매실 추출물에서 분리된 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈(FA-1)의 담배연기 추출물 유도 독성에 대한 세포보호 효과를 분석하고자, 인간 기관지 상피세포(HBEC2)의 세포생존율과 ALDH 및 WRN 단백질 발현변화를 면역블랏으로 분석하였다.
5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈 [DMSO(디메틸설폭사이드 )중 5, 25, 50, 75 및 150 nM] 또는 비히클(1.0% 부피의 DMSO에 해당)의 다양한 농도로 처리한 후 HBEC2 세포를 배양하였다. FA-1은 용량 의존적 방식으로 ALDH2, ADLH3A1 및 WRN 단백질 발현을 증가시켰다(도 4A).
즉, 상기 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈 이 HBEC2 세포에서 ALDH2, ALDH3A1 및 WRN 단백질을 향상시켜 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈의 효과가 매실 추출물(JAE)과 동일함을 확인하였다.
따라서, 이 후 실험에서 150 nM 농도의 FA-1을 결정하고 사용하였다. 또한, 담배연기 추출물(CSE) 유도 세포독성에 대한 FA-1의 효과를 확인하고자, HBEC2 세포를 24 시간 동안 6% CSE의 존재 또는 부재 하에 비히클에서 2 mM의 N-아세틸-L-시스테인(NAC) 또는 150 nM의 FA-1과 함께 배양한 후 세포 생존율을 분석하였다. 분석결과 2 mM의 NAC는 HBEC2에서 6% 담배연기 추출물(CSE) 유도 세포독성으로부터의 보호효과가 없음을 확인하였다. 반면, FA-1은 6% 담배연기 추출물(CSE) 유도 세포독성에 대해 세포보호 효과를 나타냈다(도 4B).
다음으로, 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI) 및 아넥신 V(Annexin V) 염색하고 유세포 분석기(flow cytometry)을 수행하여 담배연기 추출물(CSE) 유도 세포자멸사에 대한 FA-1의 세포보호 효과를 분석하였다. 분석결과, 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈은 담배연기 추출물(CSE) 유도 세포자멸사를 감소시킴을 확인하였다(도 4C).
즉, 150 nM의 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈이 ALDH 및 WRN 단백질을 증가시키고 HBEC2 세포에서 담배연기 추출물(CSE) 유도 세포자멸사로부터 보호한다는 것을 알 수 있다.
4. 인간 기관지 상피세포에서 FA-1의 산화적 손상 및 DNA 손상을 약화효과
FA-1의 인간 기관지 상피세포에서 담배연기 추출물 유도 산화적 손상 및 DNA 손상 억제 효과를 확인하고자, 4-HNE 및 인산화 ATM 발현변화를 분석하였다.
담배연기(CS) 노출은 ATM의 인산화 증가에 의해 입증되는 바와 같이, 산화적 스트레스 및 DNA 손상의 마커인 4-HNE의 단백질을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 담배연기(CS)-유발 산화적 스트레스 및 DNA 손상에 대한 FA-1의 확인하고자, HBEC2 세포를 2% CSE의 존재 또는 부재 하에 150 nM FA-1의 처리하고, 24시간 배양한 후, 면역블랏을 수행하여 4-HNE 및 인산화 ATM의 발현을 분석하였다.
분석결과, FA-1이 4-HNE 단백질의 축적 및 CSE-노출 HBEC2 세포에서 ATM의 인산화를 약화시킨다는 것을 알아냈다(도 5). 즉, FA-1이 배양된 HBEC2 세포에서 담배연기 추출물(CSE) 유도 산화적 스트레스 및 DNA 손상으로부터 보호한다는 것을 알 수 있다.
5. 인간 표피 각질세포에서 FA-1의 ALDH2 및 WRN 단백질 발현 조절
ALDH2 및 WRN 단백질에 대한 FA-1의 효과를 결정하기 위해, 다양한 농도의 FA-1 [DMSO(디메틸설폭사이드) 중 5, 25, 50, 75 및 150 nM] 또는 비히클(1.0 부피%의 DMSO에 해당)으로 처리한 후 NHEK 세포를 배양하였다. FA-1은 NHEK 세포에서 용량 의존적 방식으로 ALDH2 및 WRN 단백질 발현을 향상시켰다(도 6A). NHEK 세포에서 낮은 ALDH3A1 단백질의 생성으로 인해, ALDH3A1은 검출되지 않았다. 즉, FA-1이 담배연기 추출물(CSE) 유도 세포독성으로부터 보호하고, HBEC2 세포에서 ALDH2 및 WRN 단백질을 향상시키며, FA-1의 효과는 매실 추출물(JAE)와 동일함을 확인하였다.
WRN 단백질의 담배연기 추출물(CSE) 유도 하향 조절에 대한 FA-1의 효과를 확인하고자, 1.5% CSE의 존재 또는 부재 하에 FA-1(150 nM) 또는 비히클과 함께 HBEC2 세포를 배양하였다. FA-1은 배양된 HBEC2 세포에서 WRN 단백질의 CS-유발 하향 조절을 약화시켰다(도 6B). 즉, FA-1이 WRN 단백질 발현을 보존하고 CS-유발 하향 조절에 대한 내성을 제공한다는 것을 확인하였다.
6. FA-1의 인간 표피 각질세포에서 담배연기 추출물(CSE) 유도 세포독성 및 DNA 손상 보호 효과.
담배연기 추출물(CSE) 유도 세포독성에 대한 FA-1의 효과를 확인하고자, NHEK 세포를 0, 2, 4 및 6% CSE의 존재 또는 부재 하에 24 시간 동안 FA-1 [DMSO(디메틸설폭사이드) 중 150 nM)로 처리한 후 MTT분석하여 세포 생존력을 분석하였다. 분석결과 FA-1은 담배연기 추출물(CSE) 유도 세포독성에 대해 농도의존적으로 세포 생존율을 증가시켜 보호효과를 가짐을 확인하였다(도 7A).
흡연은 모세관확장실조 변이(ataxia teleangiectasia mutated, ATM)를 포함하여 포스포이노시티드 3-키나제 관련 단백질 키나제(PIKK)에 의해 매개되는 DNA 손상반응(DDR)을 활성화시킨다. DNA 이중-스트랜드 파괴(DSBs)가 형성되면, ATM은 세린 1981 잔기에서 자가 인산화에 의해 활성화되고 염색질 인접 DSB 부위에서 H2AX 변이체의 세린 139 잔기(γH2AX)를 인산화된다.
따라서 담배연기 추출물(CSE)에 의해 유도되는 DNA 손상 억제 효과를 확인하고자, DNA 손상과 관련된 ATM 및 H2AX의 인산화 수준변화를 분석하였다. NHEK 세포를 2% CSE의 존재 또는 부재 하에 24 시간 동안 150 nM의 FA-1로 처리하였다. ATM 및 H2AX의 인산화를 위해 면역블롯 분석을 수행하였다 FA-1은 ATM 및 H2AX의 담배연기 추출물(CSE) 유도 인산화를 감소시켰다(도 7B). 즉, FA-1이 배양된 NHEK 세포에서 담배연기 추출물(CSE) 유도 세포독성 및 DNA 손상으로부터 보호함을 확인하였다.

Claims (5)

  1. 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈을 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈은 매실로부터 분리된 것인 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈은 ALDH2, ALDH3A1 또는 WRN의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈을 유효성분으로 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 식품 조성물은 건강기능성 식품인, 만성폐쇄성 폐질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
KR1020190164106A 2018-12-10 2019-12-10 5-하이드록시메틸-2-푸르알데히드 비스(5-포르밀푸르푸릴)아세탈을 포함하는 만성 폐쇄성폐질환 예방 및 치료용 조성물 KR102301000B1 (ko)

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