KR102271949B1 - A medium composition containing phosphatidylcholine for culturing nematode and culturing method by the same - Google Patents
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Abstract
본 발명의 선충 배양용 플레이트 및 선충의 생산방법은, 선충의 산화스트레스에 대한 저항성을 향상시키고, 노화에 따른 기능장애 발생을 지연시키며 Aβ 유도 독성의 억제 효과가 있어서 선충의 건강수명(health span)을 증가시키는 선충 배양용 플레이트와 이를 이용한 선충의 생산 방법을 제공할 수 있다.The nematode culture plate and nematode production method of the present invention improve the resistance of nematodes to oxidative stress, delay the occurrence of dysfunction due to aging, and have an inhibitory effect on Aβ-induced toxicity, thereby improving the health span of nematodes. It is possible to provide a plate for nematode culture that increases the number of nematodes and a method for producing nematodes using the same.
Description
본 발명은 포스파티딜콜린를 함유하는 선충 배양용 조성물 및 이를 이용한 선충의 배양방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for culturing nematodes containing phosphatidylcholine and a method for culturing nematodes using the same.
노화는 조직의 기능 장애와 개인의 종국적인 사망을 초래하는 보편적이고 점진적이며 되돌릴 수 없는 세포의 생리학적 변화로, 가장 복잡한 생물학적 경로 중 하나이다. 노화 과정을 설명하고 노화의 원인을 정의하기 위해 많은 이론이 제시되었다. 그 중 유망한 이론은 Herman 박사가 처음 제안한 자유 라디칼 이론이다(Harman, 1956). 이는 세포 자유 라디칼에 의한 산화적 손상이 노화와 관련되어 축적되는 것이 노화의 주요 원인임을 시사한다(Beckman and Ames 1998; Harman, 1956). 가장 일반적인 세포 자유 라디칼은 주로 미토콘드리아에서 전자 수송 연쇄 반응으로 생성되는 반응성 산소종(ROS)이다(Beckman and Ames 1998). 그러나, 세포 항산화 방어 메커니즘이 존재하여 유해한 ROS를 제거한다. 이들은 카탈라아제(CAT), 초과산화물 불균등화 효소(SOD), 글루타티온 과산화효소를 포함하는 항산화 효소를 포함하므로, ROS를 무해한 분자로 변형시키는 반응을 촉진한다 (Sohal and others 1995). 세포 ROS는 비타민 E와 글루타티온 등 항산화 분자에 의해 제거될 수 있다(Miquel 2001). 이러한 세포 항산화 방어 메카니즘에 의해 다루어질 수 없는 ROS는 DNA, 단백질, 지질을 포함한 세포 거대 분자에 산화성 손상을 유도하여 노화 과정을 촉진할 수 있다. Aging is one of the most complex biological pathways, a universal, gradual and irreversible physiological change of cells that leads to tissue dysfunction and eventual death of individuals. Many theories have been put forward to explain the aging process and define the causes of aging. Among them, a promising theory is the free radical theory first proposed by Dr. Herman (Harman, 1956). This suggests that the accumulation of oxidative damage caused by cellular free radicals is a major cause of aging (Beckman and Ames 1998; Harman, 1956). The most common cellular free radicals are reactive oxygen species (ROS), which are produced mainly by electron transport chain reactions in mitochondria (Beckman and Ames 1998). However, cellular antioxidant defense mechanisms exist to eliminate harmful ROS. They contain antioxidant enzymes including catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), and glutathione peroxidase, thus catalyzing reactions that transform ROS into harmless molecules (Sohal and others 1995). Cellular ROS can be eliminated by antioxidant molecules such as vitamin E and glutathione (Miquel 2001). ROS, which cannot be addressed by these cellular antioxidant defense mechanisms, can accelerate the aging process by inducing oxidative damage to cellular macromolecules, including DNA, proteins, and lipids.
스트레스 반응과 노화에 대한 세포 항산화 방어 메카니즘에 미치는 유전 또는 영양적 개입(nutritional interventions)의 영향은 다양한 모델 생물체에 대하여 기록되어 왔다. 이전 연구에 따르면 CAT 또는 Mn SOD의 녹아웃 (knockout)은 산화 스트레스에 대한 내성을 감소시키고 노랑 초파리(Drosophila melanogaster)의 수명을 감소시키는 것으로 나타났다(Mockett and others 1999; Orr and Sohal 1992). 또한, 운동 뉴런(motor neurons)에서의 인간 SOD1의 과다 발현 또는 CAT 및 Cu/Zn SOD의 동시 유도는 노랑 초파리(Drosophila)의 수명을 크게 연장하였다(Orr and Sohal 1994; Parkes and others 1998). 생쥐에서 SOD1의 동형 접합체 녹 아웃(knockout)은 수명을 단축시키고 SOD2의 이형 접합체 녹아웃은 종양 발병률을 감소시키지만 수명에는 영향을 미치지 않는다 (Elchuri and others 2005; Van Remmen and others 2003). 그러나 항산화 효소를 과다 발현하는 형질 전환 마우스는 장수 표현형을 나타내지 못했다(Mele and others 2006; Ran and others 2004). 적포도주에서 발견되는 폴리페놀 화합물인 레스베라트롤의 영양적 개입(nutritional interventions)은 맥주 효모균(Saccharomyces cerevisiae), 예쁜꼬마선충(C. elegans), 노랑 초파리 (Drosophila melanogaster)를 비롯한 다양한 모델 유기체의 수명 연장 효과를 나타냈다(Howitz and others 2003; Wood and others 2004). N-아세틸-L-시스테인의 식이 보충은 C. elegans의 산화 스트레스 내성과 장수 표현형을 증가시켰다(Oh and others 2015). 제 2형 당뇨병 치료제인 메트포민(metformin)은 C. elegans의 산화 스트레스에 대한 반응과 건강 수명을 조절하였다(Onken and Driscoll 2010). 마우스에서, 비타민 E 보충은 뇌와 근육 조직의 노화 관련 전사 변화를 지연시키고 수명을 연장시켰다(Navarro and others 2005; Park and others 2008). 그러나 항산화제인 코엔자임 Q10 (Coenzyme Q10) 및 라이코펜(lycopene)의 영양적 개입(nutritional interventions)은 생쥐의 수명에 영향을 미치지 않았다(Lee and others 2004). 그러므로 노화에 대한 항산화 방어 메카니즘에 대한 다양한 개입(interventions)의 효과는 여전히 논란의 여지가 있다. The effects of genetic or nutritional interventions on cellular antioxidant defense mechanisms against stress response and aging have been documented in a variety of model organisms. Previous studies have shown that knockout of CAT or Mn SOD reduces resistance to oxidative stress and reduces the lifespan of Drosophila melanogaster (Mockett and others 1999; Orr and Sohal 1992). In addition, overexpression of human SOD1 or simultaneous induction of CAT and Cu/Zn SOD in motor neurons significantly extended the lifespan of Drosophila yellow (Orr and Sohal 1994; Parkes and others 1998). In mice, homozygous knockout of SOD1 shortens lifespan, and heterozygous knockout of SOD2 reduces tumor incidence but does not affect lifespan (Elchuri and others 2005; Van Remmen and others 2003). However, transgenic mice overexpressing antioxidant enzymes did not show a longevity phenotype (Mele and others 2006; Ran and others 2004). Nutritional interventions of resveratrol, a polyphenol compound found in red wine, have been shown to extend the lifespan of a variety of model organisms, including Saccharomyces cerevisiae , C. elegans , and Drosophila melanogaster. shown (Howitz and others 2003; Wood and others 2004). Dietary supplementation of N-acetyl-L-cysteine increased oxidative stress tolerance and longevity phenotype in C. elegans (Oh and others 2015). Metformin, a treatment for
예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans, C. elegans)은 비교적 짧은 수명과 많은 수의 자손 번식, 그리고 가장 중요하게는 인간 유전자와 높은 상동성을 갖는다는 특징으로 인하여 노화 연구 동물모델로 널리 사용되어 왔다. 그러나 예쁜꼬마선충은 실험을 수행하는 중에 다양한 환경 스트레스에 노출되면 수명이 짧아진다. 따라서 최대한 환경 스트레스에 노출되지 않도록 조심해야 하지만 실험 중에 환경 스트레스에 노출되지 않도록 조심하는 것은 불가능하다. 이에, 다양한 환경 스트레스에 노출되는 선충의 내성 및 수명을 증가시키는 방법이 요구되고 있다. Caenorhabditis elegans ( C. elegans ) has been widely used as an animal model for aging research due to its relatively short lifespan, large number of offspring reproduction, and, most importantly, high homology with human genes. However, the lifespan of C. elegans is shortened when exposed to various environmental stresses during the experiment. Therefore, it is necessary to be careful not to be exposed to environmental stress as much as possible, but it is impossible to be careful not to be exposed to environmental stress during the experiment. Accordingly, there is a need for a method for increasing the resistance and lifespan of nematodes exposed to various environmental stresses.
본 발명의 하나의 목적은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)을 포함하는 선충배양용 조성물을 제공하는 것이다. One object of the present invention is to provide a composition for nematode culture comprising phosphatidylcholine.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 선충 배양용 플레이트를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a plate for nematode culture comprising the composition.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조성물 또는 상기 플레이트를 적용하여 선충을 배양하는 단계를 포함하는, 선충의 생산방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a method for producing nematodes, comprising the step of culturing the nematode by applying the composition or the plate.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)을 포함하는 선충배양용 조성물을 제공한다.As one aspect for achieving the above object, the present invention provides a composition for nematode culture comprising phosphatidylcholine.
본 발명에서는, C. elegans를 모델 시스템으로 사용하여 스트레스 반응과 노화에 대한 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)의 영향을 조사하였다. 포스파티딜콜린이 산화 스트레스에 대한 저항성을 가지고, C. elegans의 노화에서 운동성 저하를 지연시켜 운동성을 개선함을 확인하였으며, Aβ 유도 독성을 완화시키고, 수명을 연장시킬 수 있음을 확인하여, 상기 포스파티딜콜린을 선충 배양에 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. In the present invention, the effect of phosphatidylcholine on stress response and aging was investigated using C. elegans as a model system. It was confirmed that phosphatidylcholine has resistance to oxidative stress and improves motility by delaying motility decline in the aging of C. elegans , alleviating Aβ-induced toxicity, and confirming that it can extend lifespan, and the phosphatidylcholine in nematodes It was confirmed that it can be used for culture, and the present invention was completed.
본 발명에서 "선충"은 몸이 실과 같이 원통형으로서 지렁이와 비슷한 모양을 가지는, 해수, 담수, 그리고 토양에 서식하는 선형동물이다. 상기 선충의 일종인 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 흙에서 박테리아를 먹고 사는 선충류로서, 다리나 날개가 없고 눈이나 체절이 없으며 머리나 꼬리에 있는 감각기관을 통해서 주변의 온도와 촉감 및 냄새 등을 감지한다. 성체의 크기는 1mm 정도이고 비교적 단순한 형태를 지닌 다세포 생물이며, 몸이 투명하며 자웅동체이지만 웅체도 존재한다.In the present invention, a "nematode" is a linear animal that inhabits seawater, freshwater, and soil, having a thread-like cylindrical body and a shape similar to an earthworm. Caenorhabditis elegans , a kind of nematode, is a nematode that feeds on bacteria in the soil, has no legs or wings, no eyes or somite, and senses ambient temperature, touch, and smell through sensory organs located on the head or tail. do. The size of an adult is about 1mm, and it is a multicellular organism with a relatively simple shape. The body is transparent and hermaphrodite, but males also exist.
본 발명에서, 상기 선충은 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)일 수 있다. In the present invention, the nematode may be Caenorhabditis elegans.
상기 예쁜꼬마선충은, 70년대에 실험모델로 이용되기 시작한 이래, 그 조작의 편리함으로 인하여 널리 이용되고 있으며, 99년 게놈 프로젝트로 6개의 염색체 지도가 완료되어 유전자 지도와 염기서열로의 접근이 용이하다는 장점이 있다. 또한 예쁜꼬마선충은 알에서 부화된 뒤 알시기(egg stage)와 L1 내지 L4의 유충시기를 거치는 등 4단계의 탈피과정을 거쳐 선충이 되며, 그 기간이 3일 정도로 소요되고, 평균수명이 2-3주 정도로서 평균수명이 비교적 짧은 편이어서, 수명연장 연구에 매우 유용하게 사용될 수 있다.The C. elegans has been widely used due to the convenience of its manipulation since it began to be used as an experimental model in the 1970s, and the genome project in 1999 completed a six-chromosome map, making it easy to access genetic maps and nucleotide sequences. There is an advantage that In addition, after hatching from an egg, C. elegans becomes a nematode through four stages of moulting, including the egg stage and the larval stage of L1 to L4, which takes about 3 days and has an average lifespan of 2 The average lifespan is relatively short at about 3 weeks, so it can be very usefully used for life extension studies.
본 발명에서 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)은 동물, 식물, 효모, 곰팡이류에 널리 존재하는 인지질(燐脂質)로 레시틴이라고도 하며 1,2-디아실-L-3-글리세릴포스포릴콜린에 해당한다. 포유동물의 막구성 인지질로서 주로 뇌수, 신경, 혈구, 난황 등에 들어 있다. 식물에서는 대두, 해바라기씨, 밀배아 등에 함유되어 있으며 박테리아에서는 거의 찾아볼 수 없다. 일반적으로 글리세롤의 1번 위치에는 포화지방산, 2번 위치에는 불포화지방산이 결합되어 있는 것이 많고 아실기는 C12 내지 C22(탄소수 12개 내지 22개)가 대부분이다. 구성성분인 콜린의 pK가 약 13이므로 이 인지질은 모든 pH 영역에서 양쪽성이온으로 존재하여 계면활성을 가진다.In the present invention, phosphatidylcholine is a phospholipid widely present in animals, plants, yeast, and fungi, also called lecithin, and corresponds to 1,2-diacyl-L-3-glycerylphosphorylcholine. Mammalian membranous phospholipids are mainly contained in the brain, nerves, blood cells, and egg yolk. In plants, it is found in soybeans, sunflower seeds, wheat germ, etc., and is rarely found in bacteria. In general, glycerol has a saturated fatty acid at the 1st position and an unsaturated fatty acid at the 2nd position, and the acyl group is mostly C 12 to C 22 (12 to 22 carbon atoms). Since the pK of choline, a component, is about 13, this phospholipid exists as a zwitterion in all pH ranges and has surface activity.
본 발명에서 용어 "배양"은 생물체나 생물체의 일부(기관 ·조직 ·세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.In the present invention, the term "cultivation" means growing an organism or a part of an organism (organs, tissues, cells, etc.) in an appropriately artificially controlled environmental condition.
본 발명에서, 상기 "선충 배양용 조성물"은, NaCl, 아가, 펩톤, 콜레스테롤, CaCl2, MgSO4, 및 KH2PO4를 함유하며, 예쁜꼬마선충의 성장을 위해 적용되는 배지 조성이라면 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 상기 선충 배양용 조성물은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)을 10 내지 100mg/L를 함유할 수 있다. In the present invention, the "composition for nematode culture" contains NaCl, agar, peptone, cholesterol, CaCl 2 , MgSO 4 , and KH 2 PO 4 If it is a medium composition applied for growth of C. elegans, it is not limited. does not In addition, the composition for nematode culture of the present invention may contain 10 to 100 mg/L of phosphatidylcholine.
본 발명의 일실시예에서는 상기 선충 배양용 조성물에 포스파티딜콜린을 10 내지 100mg/L 포함하는 경우, 산화적 스트레스에 대한 생존력이 증가되고, 노화에 의한 운동성 저하를 개선시켜 운동성을 증가시키며, 베타 아밀로이드(Beta Amyloid, Aβ) 유도 독성을 억제하고, C. elegans의 수명을 연장시킬 수 있는 것을 확인하였다. In one embodiment of the present invention, when 10 to 100 mg/L of phosphatidylcholine is included in the composition for nematode culture, viability against oxidative stress is increased, and motility is improved by improving motility due to aging, beta amyloid ( Beta Amyloid, Aβ) was confirmed to be able to inhibit induced toxicity and extend the lifespan of C. elegans.
또한, 본 발명의 일실시예에서는 상기 선충 배양용 조성물을 이용하여 배양한 선충에서, 수명 연장에 관여한다고 알려진 hsp-16.2(heat shock protein-16.2)과 sod-3(superoxide dismutase-3)의 발현이 증가되는 것을 확인하였고, 베타 아밀로이드(Beta Amyloid, Aβ) 독성 유도에서 DAF-16를 핵에 위치시켜 독성을 완화시킴을 확인하였다. In addition, in one embodiment of the present invention, the expression of hsp-16.2 (heat shock protein-16.2) and sod-3 (superoxide dismutase-3), which are known to be involved in lifespan extension, in nematodes cultured using the nematode culture composition. It was confirmed that this increased, and it was confirmed that the toxicity was alleviated by positioning DAF-16 in the nucleus in the induction of beta amyloid (Aβ) toxicity.
본 발명에서, 상기 조성물은 산화적 스트레스에 대한 선충의 저항성을 증진시킬 수 있다. In the present invention, the composition can enhance the resistance of nematodes to oxidative stress.
또한, 상기 조성물은 베타 아밀로이드(Beta Amyloid, Aβ) 유도 독성을 억제할 수 있다. In addition, the composition may inhibit beta amyloid (Aβ) induced toxicity.
상기 조성물은 선충의 수명을 증가시키는 것 일수 있다. The composition may increase the lifespan of the nematode.
상기 조성물은 선충의 운동성을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 운동성의 증가는 구체적으로 노화에 의한 운동능력 저하를 지연시키거나 또는 운동성을 유지 또는 개선시키는 것을 의미한다. The composition may increase nematode motility. The increase in mobility specifically means to delay the decline in athletic ability due to aging or to maintain or improve mobility.
본 발명은 다른 하나의 양태로서, 상기 선충 배양용 조성물을 포함하는 선충 배양용 플레이트를 제공한다. In another aspect, the present invention provides a nematode culture plate comprising the composition for nematode culture.
본 발명에서, 선충, 배양, 조성물에 대한 설명은 전술한 바와 같다. In the present invention, the description of the nematode, culture, and composition is the same as described above.
본 발명의 상기 선충 배양용 플레이트는 선충 배양을 위한 용기로, 전술한 선충 배양용 조성물을 포함할 수 있으며, NaCl, 아가, 펩톤, 콜레스테롤, CaCl2, MgSO4, 및 KH2PO4를 함유하며, 예쁜꼬마선충의 성장을 위해 적용되는 배지 조성이라면 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 상기 선충 배양용 조성물은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC)을 10 내지 100mg/L, 구체적으로 100mg/L 함유할 수 있다.The plate for nematode culture of the present invention is a container for nematode culture, and may include the above-described composition for nematode culture, and contains NaCl, agar, peptone, cholesterol, CaCl 2 , MgSO 4 , and KH 2 PO 4 , the composition of the medium applied for the growth of C. elegans is not limited. In addition, the composition for nematode culture of the present invention may contain 10 to 100 mg/L, specifically 100 mg/L of phosphatidylcholine (PC).
본 발명은 또 다른 하나의 양태로, 상기 선충 배양용 조성물 또는 상기 선충 배양용 플레이트를 적용하여 선충을 배양하는 단계를 포함하는, 선충의 생산방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method for producing nematodes, comprising the step of culturing the nematode by applying the nematode culture composition or the nematode culture plate.
본 발명의 선충의 생산 방법은 위에서 설명한 선충 배양용 조성물 또는 이를 포함하는 플레이트를 이용하여 선충을 배양하는 단계를 포함한다. 상기 산충 배양용 조성물과 이를 포함하는 플레이트에 대한 구체적인 설명은 위와 중복되므로 그 기재를 생략한다.The method for producing nematodes of the present invention includes culturing the nematodes using the above-described composition for culturing nematodes or a plate containing the same. Since the detailed description of the composition for culturing the live worms and the plate including the same overlaps with the above, the description thereof will be omitted.
상기 선충의 생산 방법은, 상기 배양용 조성물을 적용하여 선충을 배양하는 경우, 산화 스트레스에 대한 내성(저항성)을 증가시킬 수 있으며, C. elegans의 수명을 증가(연장)시킬 수 있다. In the production method of the nematode, when the nematode is cultured by applying the culture composition, resistance (resistance) to oxidative stress can be increased, and the lifespan of C. elegans can be increased (extended).
또한, 노화에 의한 운동성 저하를 개선하여 운동성을 증가시키며, 베타 아밀로이드(Beta Amyloid, Aβ) 유도 독성을 억제하는 것일 수 있다. In addition, it may be to improve motility due to aging to increase motility, and to inhibit beta amyloid (Aβ)-induced toxicity.
본 발명의 선충 배양용 플레이트 및 선충의 생산방법은, 선충의 산화스트레스에 대한 저항성을 향상시키고, 노화에 따른 기능장애 발생을 지연시키며 Aβ 유도 독성의 억제 효과가 있어서 선충의 건강수명(health span)을 증가시키는 선충 배양용 플레이트와 이를 이용한 선충의 생산 방법을 제공할 수 있다.The nematode culture plate and nematode production method of the present invention improve the resistance of nematodes to oxidative stress, delay the occurrence of dysfunction due to aging, and have an inhibitory effect on Aβ-induced toxicity, thereby improving the health span of nematodes. It is possible to provide a plate for nematode culture that increases the number of nematodes and a method for producing nematodes using the same.
도 1은 포스파티딜콜린의 산화 스트레스 저항성에 대한 효과를 측정한 결과이다. 60마리의 웜을 24시간 동안 각기 다른 농도의 포스파티딜콜린으로 전처리한 후 2mM H2O2를 함유하는 S-basal 완충액으로 옮겨 산화스트레스를 유도한 후 4, 6, 8시간의 웜의 생존을 관찰하였다.
도 2는 열스트레스에 대한 포스파티딜콜린의 효과를 측정한 결과이다. 60마리의 웜을 24시간동안 각기 다른 포스파티딜콜린으로 전처리한 다음 35℃에서 7시간동안 배양하였다. 웜의 생존율은 매일 기록하였다. 에러바(Error bar)는 세 번 반복 실험의 표준 오류를 나타낸다.
도 3은 포스파티딜콜린에 자외선 조사 후 생존에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 24시간동안 각기 다른 농도의 포스파티딜콜린으로 전처리하고, 20 J/cm2/분으로 1분간 UV를 조사하였다. 죽은 웜의 수는 매일 측정하였다. 에러바(Error bar)는 3번의 반복 실험의 표준 오류를 나타낸다.
도 4는 포스파티딜콜린의 수명 연장효과를 분석한 결과이다. 60마리의 웜을 각기 다른 포스파티딜콜린을 포함하는 NGM 플레이트에 옮긴 후, 모든 웜이 죽을 때까지 매일 살아있는 웜과 죽은 웜의 수를 측정하였다.
도 5는 포스파티딜콜린이 생식에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 생육기관동안 생산된 총 자손수를 대조군과 비교하였다. 데이터는 10개의 개별 웜의 평균을 나타낸다. 에러바(Error bar)는 3번의 반복 실험의 표준 오류를 나타낸다. *는 통계적으로 유의함을 나타낸다. (p <0.05).
도 6은 생육기간 동안 생산된 자손의 시간 경과 분포를 나타낸 것이다. 자손의 수는 생산된 자손이 없을 때까지 매일 기록하였다. 데이터는 10개의 개별 웜의 평균을 나타낸다.
도 7은 포스파티딜콜린이 노화에 의한 운동성 감소에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 웜의 운동성에 따라 단계별로 분류하고 각 단계별 웜의 상대적 분포를 매일 측정하였다. 기계적 자극 없이 움직이는 웜을 1단계, 기계적 자극에 반응하여 움직이는 웜을 2 단계, 기계적 자극으로 머리 부분만 움직일 수 있는 웜을 3 단계로 분류하였다. 어떤 기계적인 자극에도 움직이지 않는 경우 죽은 웜으로 분류하였다.
도 8은 CL2070의 공초점 현미경 이미지이다. 포스파티딜콜린에 의한 hsp-16.2의 발현변화를 확인하고자, 3일차 웜(CL2070)에 포스파티딜콜린을 농도별로 7일간 처리하였다. 그 후 공초점 현미경으로 웜(CL2070)을 관찰하였다.
도 9는 hsp-16.2 프로모터에 의해 유도된 GFP의 발현을 정량한 결과이다. 형광 multi-reader를 이용하여 hsp-16.2 발현 수준 변화를 측정하였다. 데이터는 20개의 개별 웜에서 측정된 형광세기의 평균을 나타낸다.
도 10은 CF1553의 공초점 현미경 이미지이다. 포스파티딜콜린에 의한 sod-3의 발현변화를 확인하고자, 3일차 웜(CF1553)에 포스파티딜콜린을 농도별로 7일간 처리하였다. 그 후 공초점 현미경으로 웜(CF1553)을 관찰하였다.
도 11은 sod-3 프로모터에 의해 유도된 GFP의 발현을 정량한 결과이다. 형광 multi-reader를 이용하여 hsp-16.2 발현 수준 변화를 측정하였다. 데이터는 20개의 개별 웜에서 측정된 형광세기의 평균을 나타낸다.
도 12는 CL4176을 이용하여 마비를 분석한 결과이다. 근육 특이적으로 형질도입된 인간 베타아밀로이드는 CL4176에서 마비를 일으킨다. 마비된 웜 수는 베타아밀로이드 유도 후 1시간 마다 계수하였으며, 13시간동안 분석하였다.
도 13은 포스파티딜콜린에 의한 DAF-16의 세포내 분포 변화를 분석한 결과이다. DFA-16의 세포내 위치는 DAF-16과 융합된 형광단백질(GFP)을 포함하는 균주(TJ356)를 이용하여 측정하였다. (A) DAF-16의 세포내의 위치는 세가지 범주로 분류하였다. 형광이 세포질에 퍼져있는 세포질, 형광이 세포질과 핵 모두에서 검출되는 중간 및 GFP가 핵에 명확하게 위치하는 핵으로 분류하였다. (B) DAF-16의 상대적 분포는 대조군과 포스파티딜콜린 처리군(100 mg/L)을 비교하여 분석하였다.
도 14는 야생형(N2)에서 포스파티딜콜린의 수명연장 효과를 나타낸다. 생존곡선은 포스파티딜콜린 처리군(PC, 100 mg/L)과 비처리군을 비교하였다.
도 15는 age-1 (hx546) 돌연변이에서 포스파티딜콜린의 수명연장 효과를 나타낸다. age-1 (hx546) 돌연변이는 야생형(N2)보다 insuliln/IGF-1-유사 신호가 감소하여 수명이 긴 모델이다. 생존곡선은 포스파티딜콜린 처리군(PC, 100 mg/L)과 비처리군을 비교하였다.
도 16은 clk-1 (e2519) 돌연변이에서 포스파티딜콜린의 수명연장 효과를 나타낸다. clclk-1 (e2519) 돌연변이는 야생형(N2)보다 미토콘드리아 전자전달 체인 반응이 저하된 장수표현형이다. 생존곡선은 포스파티딜콜린 처리군(PC, 100 mg/L)과 비처리군을 비교하였다.
도 17은 eat-2 (ad465) 돌연변이에서 포스파티딜콜린의 수명연장 효과를 나타낸다. eat-2 (ad465) 돌연변이는 잘 알려진 식이제한 모델이다. 생존곡선은 포스파티딜콜린 처리군(PC, 100 mg/L)과 비처리군을 비교하였다.
도 18은 포스파티딜콜린의 수명연장에서 DAF-16의 역할에 관한 것으로, 공벡터 대조군과 daf-16 RNAi를 투여한 웜에서 포스파티딜콜린(PC, 100 mg/L)의 수명 연장 효과를 비교하였다. 1 is a result of measuring the effect of phosphatidylcholine on oxidative stress resistance. 60 worms were pretreated with different concentrations of phosphatidylcholine for 24 hours, and then transferred to S-basal buffer containing 2mM H 2 O 2 to induce oxidative stress, and then the survival of the worms was observed at 4, 6, and 8 hours. .
2 is a result of measuring the effect of phosphatidylcholine on heat stress. 60 worms were pretreated with different phosphatidylcholines for 24 hours and then incubated at 35° C. for 7 hours. The survival rate of worms was recorded daily. Error bars represent the standard error of three replicates.
3 is a result of analyzing the effect of phosphatidylcholine on survival after UV irradiation. It was pretreated with phosphatidylcholine at different concentrations for 24 hours, and UV irradiated for 1 minute at 20 J/cm 2 /min. The number of dead worms was measured daily. Error bars represent the standard error of three replicates.
4 is a result of analyzing the lifespan extension effect of phosphatidylcholine. After transferring 60 worms to NGM plates containing different phosphatidylcholine, the number of live and dead worms was counted every day until all worms died.
5 is a result of analyzing the effect of phosphatidylcholine on reproduction. The total number of offspring produced during the incubation period was compared with the control group. Data represent the average of 10 individual worms. Error bars represent the standard error of three replicates. * indicates statistical significance. (p <0.05).
Figure 6 shows the time course distribution of the progeny produced during the growth period. The number of offspring was recorded daily until no offspring were produced. Data represent the average of 10 individual worms.
7 is a result of analyzing the effect of phosphatidylcholine on the decrease in mobility due to aging. The worms were classified into stages according to their motility, and the relative distribution of worms in each stage was measured daily. Worm moving without mechanical stimulation was classified into
8 is a confocal microscope image of CL2070. In order to confirm the expression change of hsp-16.2 by phosphatidylcholine, phosphatidylcholine was treated for 7 days in 3rd day worms (CL2070) by concentration. Thereafter, the worms (CL2070) were observed under a confocal microscope.
9 is a result of quantifying the expression of GFP induced by the hsp-16.2 promoter. Changes in hsp-16.2 expression level were measured using a fluorescent multi-reader. Data represent the average of fluorescence intensities measured in 20 individual worms.
10 is a confocal microscopy image of CF1553. In order to confirm the expression change of sod-3 by phosphatidylcholine, phosphatidylcholine was treated for 7 days by concentration in the 3rd day worm (CF1553). Thereafter, the worms (CF1553) were observed under a confocal microscope.
11 is a result of quantifying the expression of GFP induced by the sod-3 promoter. Changes in hsp-16.2 expression level were measured using a fluorescent multi-reader. Data represent the average of fluorescence intensities measured in 20 individual worms.
12 is a result of analysis of paralysis using CL4176. Muscle-specifically transduced human beta-amyloid causes paralysis in CL4176. Paralyzed worms were counted every 1 hour after beta-amyloid induction, and analyzed for 13 hours.
13 is a result of analyzing the intracellular distribution change of DAF-16 by phosphatidylcholine. The intracellular localization of DFA-16 was measured using a strain (TJ356) containing a fluorescent protein (GFP) fused with DAF-16. (A) The intracellular localization of DAF-16 was classified into three categories. The cytoplasm, where fluorescence is diffused into the cytoplasm, the intermediate, where fluorescence is detected in both the cytoplasm and the nucleus, and the nucleus, where GFP is clearly located in the nucleus. (B) The relative distribution of DAF-16 was analyzed by comparing the control group and the phosphatidylcholine treatment group (100 mg/L).
14 shows the lifespan extension effect of phosphatidylcholine in wild-type (N2). The survival curve was compared between the phosphatidylcholine treated group (PC, 100 mg/L) and the untreated group.
15 shows the lifespan extension effect of phosphatidylcholine in the age-1 (hx546) mutant. The age-1 (hx546) mutant is a longer-lived model with reduced insuliln/IGF-1-like signals than the wild-type (N2). The survival curve was compared between the phosphatidylcholine treated group (PC, 100 mg/L) and the untreated group.
16 shows the lifespan extension effect of phosphatidylcholine in clk-1 (e2519) mutant. The clclk-1 (e2519) mutant is a longevity phenotype with a lower mitochondrial electron transport chain response than the wild-type (N2). The survival curve was compared between the phosphatidylcholine treated group (PC, 100 mg/L) and the untreated group.
17 shows the lifespan extension effect of phosphatidylcholine in the eat-2 (ad465) mutant. The eat-2 (ad465) mutation is a well-known dietary restriction model. The survival curve was compared between the phosphatidylcholine treated group (PC, 100 mg/L) and the untreated group.
Figure 18 relates to the role of DAF-16 in extending the lifespan of phosphatidylcholine, and compared the lifespan extension effect of phosphatidylcholine (PC, 100 mg/L) in the empty vector control group and worms administered with daf-16 RNAi.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of Examples. However, the following examples are only illustrative of the present invention, and the content of the present invention is not limited to the following examples.
실험 재료 및 방법Experimental materials and methods
<실시예1> 웜(worms) 및 배양 조건<Example 1> Worm (worms) and culture conditions
N2 strain은 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 모든 실험에서 야생형 대조군으로 사용하였다. 수명연장에 관여하는 세포 경로를 확인하기 위해 수명이 긴 돌연변이(age-1 (hx546), clk-1 (e2519), 및 eat-2)(ad465)을 사용하였다.The N2 strain was used as a wild-type control in all experiments of C. elegans. Long-lived mutations (age-1 (hx546), clk-1 (e2519), and eat-2) (ad465) were used to identify cellular pathways involved in lifespan extension.
hsp-16.2, sod-3, 및 daf-1의 발현 변화를 연구하기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하는 strain(CL2070 (dvIs70 [Phsp-16.2::GFP, rol-6]), CF1553 (muIs84 [Psod-3::GFP, rol-6]), 및 TJ356 (zls356 IV [daf-16p::daf-16a/b::GFP, rol-6])를 사용하였다. To study the expression changes of hsp-16.2, sod-3, and daf-1, strain expressing green fluorescent protein (GFP) (CL2070 (dvIs70 [Phsp-16.2::GFP, rol-6]), CF1553 (muIs84) [Psod-3::GFP, rol-6]), and TJ356 (zls356 IV [daf-16p::daf-16a/b::GFP, rol-6]) were used.
알츠하이머 병에 대한 효과를 조사하고자, 근육 특이적 인간 아밀로이드 베타(muscle-specific human amyloid beta (Aβ)1-42 (dvls27 [myo-3/Aβ1-42/let UTR, rol-6]) 유전자가 삽입된(transgenic) CL4176 strain을 사용하여 Aβ유도된 독성 분석을 수행하였다. To investigate the effect on Alzheimer's disease, the muscle-specific human amyloid beta (Aβ)1-42 (dvls27 [myo-3/Aβ1-42/let UTR, rol-6]) gene was inserted Aβ-induced toxicity assay was performed using the transgenic CL4176 strain.
모든 예쁜꼬마선충(C. elegans) strain은 CGC(Caenorhabditis Genetics Center)로부터 구입하였다.All C. elegans strains were purchased from CGC (Caenorhabditis Genetics Center).
웜(worms)은 대장균(Escherichia coli OP50)를 도말한 선충 성장 배지 (NGM) 플레이트(25 mM NaCl, 1.7% 아가, 2.5 mg/mL 펩톤, 5 μg/ml 콜레스테롤, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 및 50 mM KH2PO4 (pH 6.0))에서 20℃로 배양하였다. The worms were nematode growth medium (NGM) plates (25 mM NaCl, 1.7% agarose, 2.5 mg/mL peptone, 5 μg/ml cholesterol, 1 mM CaCl 2 , 1 mM MgSO plated with Escherichia coli OP50). 4 and 50 mM KH 2 PO 4 (pH 6.0)) at 20°C.
<실시예2> 산화 스트레스에 대한 내성(Resistance to oxidative stress)<Example 2> Resistance to oxidative stress
5마리의 L4/young adult 단계의 웜(worms)을 신선한 NGM 플레이트에 옮기고 20℃에서 6시간 동안 산란하게 하였다. 플레이트에서 성충(adult worms) 다섯 마리를 제거한 후 자손은 20℃에서 3일 동안 성장시켰다. 동일 연령의 웜 (n = 30)을 다양한 농도 (0, 1, 10 또는 100 mg/L)의 포스파티딜콜린 (phosphatidylcholine)을 포함하는 신선한 NGM 플레이트로 옮기고 24시간 동안 적응시켰다. 그 후, 웜을 6시간 동안 콜레스테롤이 없는 S-기저(basal) 배지(1L 멸균 증류수에 대하여, 염화나트륨 5.85 g, 제 2 인산칼륨 1 g, 제 1 인산칼륨 6 g)에서 2 mM H2O2 에 노출시켰으며 4시간, 6시간 및 8시간에 웜의 생존율을 기록하였다. 기계적 자극에 반응하지 않는 웜은 죽은 것으로 간주하였다. 3회의 독립적인 반복 실험이 수행되었으며 표준 양측 스튜던트 t-검정 (the standard two-tailed Student’s t-test)을 통계 분석에 사용하였다.Five L4/young adult stage worms were transferred to fresh NGM plates and allowed to spawn at 20°C for 6 hours. After removing five adult worms from the plate, the offspring were grown at 20°C for 3 days. Worms of the same age (n = 30) were transferred to fresh NGM plates containing various concentrations (0, 1, 10 or 100 mg/L) of phosphatidylcholine and allowed to acclimatize for 24 hours. The worms were then incubated in cholesterol-free S-basal medium (for 1 L sterile distilled water, 5.85 g sodium chloride, 1 g potassium dibasic, 6 g monobasic phosphate) in 2 mM H 2 O 2 for 6 hours. , and the survival rates of the worms were recorded at 4, 6, and 8 hours. Worms that did not respond to mechanical stimuli were considered dead. Three independent replicate experiments were performed and the standard two-tailed Student's t-test was used for statistical analysis.
<실시예3> 열 스트레스 분석(Thermotolerance assay)<Example 3> Thermal stress assay (Thermotolerance assay)
NGM 플레이트에서 동일 연령의 웜 60 마리를 무작위로 선택하여 포스파티딜콜린 1, 10 또는 100mg/L를 함유하는 신선한 NGM 플레이트로 옮겼다. 20℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 그 후 웜을 35℃ 배양기로 옮겨 열 스트레스를 유도하였다. 열 스트레스 7시간 후, 웜을 다시 20℃ 배양기로 옮겼다. 다음날, 모든 웜이 죽을 때까지 매시간 마다 웜의 생존을 관찰하였다.60 worms of the same age were randomly selected from NGM plates and transferred to fresh NGM plates containing 1, 10 or 100 mg/L of phosphatidylcholine. Incubated at 20 °C for 24 hours. Then, the worms were transferred to a 35°C incubator to induce heat stress. After 7 hours of heat stress, the worms were transferred back to the 20°C incubator. The next day, the survival of the worms was observed every hour until all worms died.
<실시예4> 자외선(UV) 조사에 대한 생존(Survival after ultraviolet(UV) irradiation)<Example 4> Survival after ultraviolet (UV) irradiation
동일 연령의 웜 (n = 60)을 포스파티딜콜린 1, 10, 100 mg/L를 함유하는 신선한 NGM 플레이트에서 20℃에서 24시간 동안 배양하고 254 nm-UV crosslinker (BLX-254, VILBER Lourmat Co., Torcy, France)를 이용하여 UV 20 J/cm2/분을 1분간 노출하였다. UV 조사 후, 플레이트를 각기 다른 농도의 포스파티딜콜린을 포함하는 신선한 배지로 옮기고 모든 웜이 죽을 때까지 매일 생존수를 기록하였다. Worms of the same age (n = 60) were cultured for 24 h at 20 °C in fresh NGM plates containing 1, 10, and 100 mg/L of phosphatidylcholine and 254 nm-UV crosslinker (BLX-254, VILBER Lourmat Co., Torcy). , France) was exposed to UV 20 J/cm 2 /min for 1 minute. After UV irradiation, the plates were transferred to fresh medium containing different concentrations of phosphatidylcholine and the number of viability was recorded daily until all worms died.
<실시예5> 수명 분석 <Example 5> Lifetime analysis
분석 동안 내부 부화를 억제하기 위해 5-플루오로-2'-데옥시루리딘 (5-fluoro-2’-deoxyruridine) (12.5 mg/L)를 첨가하였다. 동일 연령의 웜 60 마리를 모든 웜이 죽을 때까지 살아있는 웜과 죽은 웜의 수를 매일 측정하였다. 이때 내부 부화, 분실(lose), 살해(killed)된 웜은 분석에서 제외하였다. 통계 분석을 위해 로그 순위법(log-rank test)를 사용하였다.5-fluoro-2'-deoxyruridine (12.5 mg/L) was added to inhibit internal hatching during the assay. The number of live and dead worms was counted daily for 60 worms of the same age until all worms died. In this case, internally hatched, lost, and killed worms were excluded from the analysis. A log-rank test was used for statistical analysis.
<실시예6> 생식력 분석(Fertility assay)<Example 6> Fertility assay
5마리의 L4/young adult 단계의 웜(worms)을 농도가 다른 포스파티딜콜린 10, 100 mg/L를 포함하는 신선한 NGM 플레이트에 옮기고 5시간 동안 산란하게 하였다. 알은 2일간 20℃에서 유지되었다. 2일된 웜 10마리를 매일 각 농도의 포스파티딜콜린이 함유된 10개의 신선한 NGM 플레이트에 옮겼다. 개별 웜이 매일 산란한 알을 48시간 동안 20℃에서 배양하고 자손의 수를 측정하였고, 생산된 자손 수는 웜에 더 이상 알을 낳지 않을 때까지 측정하였다. Five L4/young adult stage worms were transferred to fresh NGM plates containing 10 and 100 mg/L phosphatidylcholine at different concentrations and allowed to spawn for 5 hours. Eggs were kept at 20°C for 2 days. Ten 2-day-old worms were transferred daily to ten fresh NGM plates containing each concentration of phosphatidylcholine. Eggs laid daily by individual worms were incubated at 20° C. for 48 hours and the number of offspring was counted, and the number of offspring produced was measured until the worm no longer lays eggs.
<실시예7> 운동성 분석(Motility assay)<Example 7> Motility assay
연령에 따른 young adult 단계의 웜을 각기 다른 농도의 포스파티딜콜린(10, 100 mg /L)이 포함된 NGM plate에서 20 ℃로 배양하였다. 부화 5, 10, 15, 20, 25 일에 웜은 운동성에 따라 분류하였다. Young adult stage worms according to age were cultured at 20 °C in NGM plates containing different concentrations of phosphatidylcholine (10, 100 mg/L). At 5, 10, 15, 20, and 25 days of hatching, worms were classified according to their motility.
1 단계: 기계적 자극없이 움직이는 웜,Stage 1: worms moving without mechanical stimulation;
2 단계: 기계적 자극에 반응하여 움직이는 웜, Stage 2: worms that move in response to mechanical stimuli;
3 단계: 기계적 자극으로 머리 부분만 움직일 수 있는 웜Stage 3: Worm that can move only its head by mechanical stimulation
비처리 대조군과 포스파티딜톨린 투여군에서 동일 연령의 100마리의 웜 중 각 단계의 웜 또는 죽은 웜의 상대적 분포를 비교하였다. The relative distribution of worms or dead worms at each stage among 100 worms of the same age in the untreated control group and the phosphatidyltoline-administered group were compared.
<실시예8> 장수 유전자의 발현(Expression of longevity-assurance genes)<Example 8> Expression of longevity-assurance genes
동일 연령의 CL2070과 CF 1553 웜을 20℃에서 7일간 포스파티딜콜린 10 또는 100 mg/L이 첨가된 NGM 플레이트에서 7일간 배양하였다. 그 다음 웜은 2% 아가로오스로 코딩한 슬라이드 글래스에 올린 후 1M 아지드화 나트륨(sodium azide)로 마취시킨 후 커버 슬라이드 글라스를 덮었다. GFP 발현은 공초점 현미경 (Olympus FV10i, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였고, 형광 다중 리더 (Infinite F200, Tecan, Grodig, Austria) (n = 20)를 이용해 GFP의 발현을 정량화했다.CL2070 and CF 1553 worms of the same age were cultured at 20°C for 7 days in NGM plates supplemented with
<실시예9> Aβ 유도 독성 분석(Aβ-induced toxicity assay)<Example 9> Aβ-induced toxicity assay
15℃에서 자란 어른 30 마리의 CL4176 웜을 10 또는 100mg/L의 포스파티딜콜린으로 전처리한 NGM 플레이트에 옮기고 15℃에서 2 시간 동안 산란시켰다. 그 후 모든 어른 웜를 제거하고 자손을 15 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 그 후 무작위로 선택된 60 웜을 25℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양하여 인간 Aβ 발현을 유도한 후, 마비된 웜의 수는 1 시간마다 측정하였다.Thirty adult CL4176 worms grown at 15°C were transferred to NGM plates pretreated with 10 or 100 mg/L of phosphatidylcholine and spawned at 15°C for 2 hours. After that, all adult worms were removed and the progeny were incubated at 15°C for 24 hours. Thereafter, 60 randomly selected worms were cultured in an incubator at 25° C. for 24 hours to induce human Aβ expression, and then the number of paralyzed worms was measured every hour.
<실시예10> DAF-16의 위치 분석(Subcellular localization of DAF-16)<Example 10> Analysis of the location of DAF-16 (Subcellular localization of DAF-16)
60마리의 동일 연령의 TJ356 웜을 100mg/L의 포스파티딜콜린이 포함된 또는 없는 NGM 플레이트에 옮긴 후 5일, 7일 및 9일 후 웜을 슬라이드 글래스에 올리고, 1M sodium azide로 마취시킨 후 DAF-16의 세포 내 분포를 형광 현미경으로 관찰하였다. After transferring 60 TJ356 worms of the same age to NGM plates with or without 100 mg/L phosphatidylcholine, 5, 7 and 9 days later, the worms were placed on a slide glass, anesthetized with 1M sodium azide, and then DAF-16 was observed with a fluorescence microscope.
<실시예11> RNA 간섭(RNA interference , RNAi)<Example 11> RNA interference (RNAi)
DAF-16 유전자를 넛아웃 시키기 위해, Ahringer RNAi 라이브러리에서 RNAi를 위한 daf-16 유전자를 가진 대장균 클론을 얻었다. 공벡터로 형질 전환 된 대장균 클론을 RNAi의 음성 대조군으로 사용 하였다. OD 600이 0.4에 도달 한 후 4 시간 동안 0.4 mM isopropyl-β-D-thio-galactoside (IPTG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 의해 이중 가닥 RNA의 발현을 유도하였다. 그런 다음 배양 된 박테리아를 RNAi 실험을 위해 기주(food source)로 배양 플레이트에 사용하였다. To knock out the DAF-16 gene, an E. coli clone with the daf-16 gene for RNAi was obtained from the Ahringer RNAi library. An E. coli clone transformed with an empty vector was used as a negative control for RNAi. Expression of double-stranded RNA was induced by 0.4 mM isopropyl-β-D-thio-galactoside (IPTG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for 4 h after the OD 600 reached 0.4. Then, the cultured bacteria were used on the culture plate as a food source for RNAi experiments.
<실험결과><Experiment result>
<실험예1> 꼬마선충(C. elegans)에서 포스파티딜콜린에 의한 환경 스트레스 저항성 평가<Experimental Example 1> Evaluation of environmental stress resistance by phosphatidylcholine in C. elegans
포스파티딜콜린이 환경 스트레스에 미치는 영향을 분석하고자, 산화 스트레스, 열충격 및 자외선 조사에 대한 저항성을 분석하였다. 도 1은 포스파티딜콜린의 산화 스트레스 저항을 4시간, 6시간, 8시간 후에 측정한 결과이다. In order to analyze the effect of phosphatidylcholine on environmental stress, resistance to oxidative stress, thermal shock and UV irradiation was analyzed. 1 is a result of measuring the oxidative stress resistance of phosphatidylcholine after 4 hours, 6 hours, and 8 hours.
꼬마선충에 H2O2를 처리하여 산화 스트레스를 유도하였다. 4시간 산화 스트레스 유도 후, 비처리 대조군에서는 80.0 ± 8.39 % (평균 ± SEM)가 생존하였으나, 포스파티딜콜린을 처리한 경우 거의 모든 웜이 생존하였다. 구체적으로 1 또는 10mg/L 의 포스파티딜콜린을 처리한 경우 100%가 생존하였으며, 100mg/L을 처리한 경우 98.9±1.11%가 생존하였다.C. elegans was treated with H 2 O2 to induce oxidative stress. After 4 hours of oxidative stress induction, 80.0 ± 8.39% (mean ± SEM) survived in the untreated control group, but almost all worms survived when treated with phosphatidylcholine. Specifically, when treated with 1 or 10 mg/L of phosphatidylcholine, 100% survived, and when treated with 100 mg/L, 98.9±1.11% survived.
산화 스트레스 유도 6시간 후, 포스파티틸콜린을 처리한 웜의 생존율이 유의하게 중가하였다. 구체적으로 비처리 대조군의 경우, 52.2±2.94%가 생존하였으나, 포스파티딜콜린을 1, 10 또는 100mg/L 처리한 군에서 생존율이 88.9 ± 4.84 (p = 0.003), 98.9 ± 1.11 (p <0.001) 및 90.0 ± 8.39 % (p = 0.013)으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 산화 스트레스 유도 8시간 후에도 이와 동일한 양상을 나타냈다.After 6 hours of oxidative stress induction, the survival rate of worms treated with phosphatethylcholine was significantly increased. Specifically, in the case of the untreated control group, 52.2±2.94% survived, but in the group treated with 1, 10 or 100 mg/L phosphatidylcholine, the survival rates were 88.9 ± 4.84 (p = 0.003), 98.9 ± 1.11 (p <0.001) and 90.0. It was confirmed that the increase was ± 8.39 % (p = 0.013). In addition, the same pattern was exhibited even after 8 hours of oxidative stress induction.
다음으로 포스파티딜콜린이 다른 환경스트레스(열 충격, 자외선 조사)에 미치는 영향을 분석하였다. Next, the effect of phosphatidylcholine on other environmental stresses (heat shock, UV irradiation) was analyzed.
도 2는 열 충격에 대한 꼬마선충의 생존율을 측정한 결과이다. 열 충격 후 생존율을 측정한 결과, 1, 10, 100mg/L의 농도로 포스파딜콜린을 처리한 군에서 대조군과 생존율의 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 2 is a result of measuring the survival rate of C. elegans to heat shock. As a result of measuring the survival rate after heat shock, it was confirmed that there was no significant difference in the survival rate between the control group and the control group in the group treated with phosphadylcholine at concentrations of 1, 10, and 100 mg/L.
도 3은 자외선 조사에 대한 꼬마선충의 생존율을 측정한 결과이다. 자외선에 대한 생존율 역시 열충격과 유사하게 대조군과 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 즉, 포스파티딜콜린은 산화스트레스 저항성은 증진시키나, 열충격 및 자외선 조사에 대한 저항성에는 영향을 미치지 않음을 확인하였다.3 is a result of measuring the survival rate of C. elegans to ultraviolet irradiation. It was also confirmed that there was no significant difference in the survival rate against UV light from the control group, similar to the heat shock. That is, it was confirmed that phosphatidylcholine enhances resistance to oxidative stress, but does not affect resistance to thermal shock and UV irradiation.
<실험예2> 포스파티딜콜린의 꼬마선충 수명연장 효과<Experimental Example 2> C. elegans life extension effect of phosphatidylcholine
도 4 및 표 1은 꼬마선충의 수명연장 효과를 측정한 결과이다. 도 4 및 표1에서 꼬마선충의 수명은 포스파티딜콜린에 의해 유의하게 증가하였다. 4 and Table 1 are results of measuring the effect of extending the lifespan of C. elegans. 4 and Table 1, the lifespan of C. elegans was significantly increased by phosphatidylcholine.
비처리군의 경우 평균 수명은 13.8일이었으며, 10mg/L을 처리한 경우 평균수명이 17.7일로 28.8% 증가하였으며, 100mg/L을 처리한 경우에도 16.8일로 22.2% 증가하였다.In the case of the untreated group, the average lifespan was 13.8 days, the 10 mg/L treatment increased 28.8% to 17.7 days, and the 100 mg/L treatment increased 22.2% to 16.8 days.
표 1과 같이 독립적인 반복실험에서도 포스파티딜콜린이 수명을 크게 증가시킴을 확인하였다. 이러한 결과는 포스파티딜콜린이 항산화 활성을 통해 수명을 연장시키는 효과가 있음을 시사한다. As shown in Table 1, it was confirmed that phosphatidylcholine significantly increased lifespan even in independent repeated experiments. These results suggest that phosphatidylcholine has the effect of prolonging lifespan through antioxidant activity.
(PC, mg/L)(PC, mg/L)
(Mean lifespan, 일)(Mean lifespan, work)
1) p-value는 비처리군(0 mg/L 포스파티딜콜린)과 포스파티딜콜린 처리군(10 또는 100 mg/L 포스파티딜콜린)의 생존율을 비교하여, log-rank test를 이용하여 계산하였다.1) The p-value was calculated using the log-rank test by comparing the survival rates of the untreated group (0 mg/L phosphatidylcholine) and the phosphatidylcholine treated group (10 or 100 mg/L phosphatidylcholine).
2) % effects 는 (C-P)/C × 100으로 계산하였다. 여기서 P 는 포스파티딜콜린(PC) 처리군의 평균수명이고, C는 비처리의 평균수명이다. 2) % effects was calculated as (C-P)/C × 100. Here, P is the average lifespan of the phosphatidylcholine (PC) treated group, and C is the average lifespan of the untreated group.
<실험예3> 포스파티딜콜린의 생식력에 미치는 효과<Experimental Example 3> Effect of phosphatidylcholine on fertility
수명을 연장하는 유전자 또는 식이 조절(interventions)은 생식저하와 상반관계(trade-off)를 보인다. 따라서 본 발명의 포스파티딜콜린의 수명연장이 꼬마선충 생식에 미치는 영향을 확인하였다. 임신기간 동안 생산된 총 자손수는 포스파티딜콜린 처리에 의해 유의하게 감소하였다(도 5). 비처리군(wild type N2)에서는 243.0 ± 8.41의 자손이 생산되었다. 그러나 10mg/L의 포스파티딜콜린 처리군에서는 총 208.4 ± 9.43 (p = 0.012), 100mg/L의 포스파티딜콜린 처리군에서는 195.3 ± 12.25 (p = 0.005)로 감소했다. 생육 기간 동안 생산된 자손의 시간 경과 분포는 부화 후 3 일째와 4 일째에 자손의 수가 감소한 것으로 나타났다(그림 6). 독립적인 반복 실험결과에서 이와 동일하게 포스파티딜콜린에 의해 생식저하가 나타났다. 따라서 포스파티딜콜린이 장수에 대한 상반관계로 생식력을 감소시킴을 확인하였다. Genes or dietary interventions that prolong lifespan have a trade-off with fertility. Therefore, it was confirmed that the effect of life extension of the phosphatidylcholine of the present invention on the reproduction of C. elegans. The total number of offspring produced during pregnancy was significantly reduced by phosphatidylcholine treatment (FIG. 5). In the untreated group (wild type N2), offspring of 243.0 ± 8.41 were produced. However, in the group treated with 10 mg/L phosphatidylcholine, a total of 208.4 ± 9.43 (p = 0.012), and in the group treated with 100 mg/L phosphatidylcholine, it decreased to 195.3 ± 12.25 (p = 0.005). The time course distribution of offspring produced during the growing season showed a decrease in the number of offspring on the 3rd and 4th days after hatching (Figure 6). In the same independent repeated experiment results, phosphatidylcholine showed fertility reduction. Therefore, it was confirmed that phosphatidylcholine decreases fertility as a trade-off for longevity.
<실험예4> 포스파티딜콜린이 노화에 의한 운동성 저하에 미치는 효과<Experimental Example 4> Effect of phosphatidylcholine on decreased mobility due to aging
거의 모든 유기체에서 노화와 동반하는 생리적 변화로 근육 위축과 운동성 감소가 나타난다. 꼬마선충의 로커모티브 행동(locomotive behavior)은 노화와 함께 감소한다. 이에 꼬마선충에서 노화와 연관된 운동성 저하에 포스파티딜콜린이 미치는 영향을 분석하였다. 포스파티딜콜린을 처리한 웜에서 노화에 의한 운동성 저하가 지연되는 것을 확인하였다(도 7).In almost all organisms, the physiological changes that accompany aging show muscle atrophy and reduced mobility. The locomotive behavior of C. elegans decreases with aging. Accordingly, the effect of phosphatidylcholine on aging-related motility decline in C. elegans was analyzed. It was confirmed that the decrease in motility due to aging was delayed in the worms treated with phosphatidylcholine (FIG. 7).
5일 및 10일의 어린 웜은 대조군과 포스파티딜콜린 처리군에서 뚜렷한 운동성 차이가 없었다. 포스파티딜콜린 처리군에서 15일차의 웜에 기계적인 자극없이 움직이는 1단계 및 기계적 자극 후 움직이는 2단계의 웜 수가 대조군에 비해 약간 증가하였다. 이와 대조적으로 대조군에서 자극 후 머리 부분만 움직이는 3단계의 웜 수가 증가하였다. 이러한 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(p > 0.05).There was no significant difference in motility between the control group and the phosphatidylcholine-treated group of
그러나 20일과 25일 된 웜에서는 대조군과 포스파티딜콜린 처리군에서 상당한 차이가 나타났다. 20일차에 대조군의 1단계 웜 7.5 ± 1.13%에서 10mg/L의 포스파티딜콜린 처리군의 1단계 웜의 분포가 24.0 ± 3.46% (p = 0.011)로 증가하였으며, 100mg/L의 포스파티딜콜린 처리군 역시 1단계 웜의 분포가 22.3 ± 4.91% (p = 0.043)로 증가하였다. 대조군의 2단계 웜 6.1 ± 0.55%에서, 10mg/L 또는 100mg/L의 포스파티딜콜린 처리군의 2단계 웜이 23.3 ± 3.84 (p = 0.011), 20.6 ± 3.71% (p = 0.018)로 증가하였다(도 7). 25일차 웜에서도 유의하게 운동성 감소가 지연됨을 확인하였다(표 2).However, in the 20-day and 25-day-old worms, there was a significant difference between the control group and the phosphatidylcholine-treated group. On the 20th day, the distribution of
PC, 포스파티딜코린; *, 대조군과 비교하여 통계적으로 유의함 (p < 0.05).PC, phosphatidylcholine; *, statistically significant compared to control group (p < 0.05).
<실험예5> 포스파티딜콜린의 장수 연관 유전자 발현 유도<Experimental Example 5> Longevity-related gene expression induction of phosphatidylcholine
hsp-16.2와 sod-3의 발현이 꼬마선충(Rea, Wu 등, 2005) (Sanchez-Blanco and Kim 2011)에서 수명과 양의 상관관계가 있음이 알려져 있다. 상기 실험결과를 통해 포스파티딜콜린의 항노화 효과를 확인하였다. 다음으로 포스파티딜콜린이 장수 연관 유전자 hsp-16.2와 sod-3의 발현에 미치는 영향을 확인하였다. It is known that the expression of hsp-16.2 and sod-3 has a positive correlation with lifespan in C. elegans (Rea, Wu et al., 2005) (Sanchez-Blanco and Kim 2011). The anti-aging effect of phosphatidylcholine was confirmed through the experimental results. Next, the effect of phosphatidylcholine on the expression of longevity-related genes hsp-16.2 and sod-3 was confirmed.
도 8에서 포스파티딜콜린 처리군의 웜에서 hsp-16.2에 의한 밝은 형광체를 검출하였다. multi-reader를 이용하여 정량한 결과, 대조군에 비해 포스파티딜콜린 처리군에서 형광이 상대히 증가하였다(도 9). hsp-16.2의 상대적 발현은 대조군에서 100.0 ± 5.01이었고, 포스파티딜콜린 10mg/L 처리군에서 148.2 ± 5.74, 포스파티딜콜린 100mg/L 처리군에서 192.0 ± 10.49로 나타났다. In FIG. 8 , a bright phosphor by hsp-16.2 was detected in the worms of the phosphatidylcholine treated group. As a result of quantification using a multi-reader, fluorescence was relatively increased in the phosphatidylcholine-treated group compared to the control group (FIG. 9). The relative expression of hsp-16.2 was 100.0 ± 5.01 in the control group, 148.2 ± 5.74 in the
sod-3의 발현 역시 포스파티딜콜린에 의해 유의하게 상향조절 되었다(도 10). sod-3 상대적 발현은 포스파티딜콜린 10mg/L 처리군에서 55.3 ± 7.99%로 증가하였으며, 100mg/L 처리군에서 105.1 ± 8.97%로 증가하였다(도 11). The expression of sod-3 was also significantly upregulated by phosphatidylcholine (FIG. 10). The relative expression of sod-3 increased to 55.3 ± 7.99% in the
즉, 포스파티딜콜린이 수명유전자의 유도를 통해 꼬마선충의 수명을 연장시킴을 확인하였다.That is, it was confirmed that phosphatidylcholine prolongs the lifespan of C. elegans through the induction of lifespan genes.
<실험예6> 포스파티딜콜린의 Aβ에 의해 유도되는 독성을 약화 및 DAF-16의 핵 위치 강화 <Experimental Example 6> Weakening the toxicity induced by Aβ of phosphatidylcholine and strengthening the nuclear localization of DAF-16
다음으로 포스파티딜콜린이 노화에 의한 퇴행성 신경질환인 알츠하이머(AD)에 미치는 영향을 분석하였다. 인간 베타아밀로이드(Aβ) 유전자가 근육조직에서 유도되는 알츠하이머 유전자 모델 꼬마선충을 사용하여 근육에서 베타아밀로이드(Aβ) 축적에 의한 마비 비율을 측정하였다. Next, the effect of phosphatidylcholine on Alzheimer's (AD), a neurodegenerative disease caused by aging, was analyzed. The rate of paralysis due to accumulation of beta-amyloid (Aβ) in muscle was measured using C. elegans, an Alzheimer's gene model in which human beta-amyloid (Aβ) gene is induced in muscle tissue.
포스파티딜콜린을 처리하는 경우, 마비가 현저하게 감소하였다(도 12) 대조군 웜에서 50%가 마비되는데 4.1시간이 걸렸으나, 포스파티딜콜린을 10mg/L 또는 100mg/L을 처리한 웜은 50%가 마비되는데 각 6.3시간, 7.1시간으로 연장되었으며, 베타아밀로이드에 의한 마비에 대한 보호효과는 각 55.7% 및 71.3%였다(표 3). 독립적인 반복실험에서도 베타아밀로이드 유도 독성에 대한 포스파티딜콜린의 유의한 보호효과가 나타났다. When treated with phosphatidylcholine, paralysis was significantly reduced (FIG. 12). It took 4.1 hours for 50% paralysis in control worms, but 50% paralysis for worms treated with
1) p-값은 log-rank 테스트를 사용하여, 대조군과 포스파티딜콜린 처리군의 마비 비율을 비교하여 계산하였다. 1) The p-value was calculated by comparing the paralysis rate of the control group and the phosphatidylcholine-treated group using the log-rank test.
2) % 효과는 (C-P)/C*100로 계산하였다. 여기에서 P는 포스파티딜콜린 처리한 웜 중 50%가 마비된 시간이고, C 는 비처리 대조군 웜 중 50%가 마비된 시간이다. 2) % effect was calculated as (C-P)/C*100. where P is the time at which 50% of the phosphatidylcholine-treated worms are paralyzed, and C is the time at which 50% of the untreated control worms are paralyzed.
DAF-16는 인슐린/IGF-1-유사 신호전달에 관여하는 FOXO 전사인자로, 베타 아밀로이드에 의해 유도되는 독성의 시작(onset)을 지연시킨다고 보고되어 있다(Cohen and Dillin 2008). DAF-16은 다양한 스트레스에 반응하여 핵에 위치하며, 스트레스 반응 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다.DAF-16 is a FOXO transcription factor involved in insulin/IGF-1-like signaling and has been reported to delay the onset of beta-amyloid-induced toxicity (Cohen and Dillin 2008). DAF-16 is located in the nucleus in response to various stresses and is known to regulate the expression of stress response genes.
이에 포스파티딜콜린이 DAF-16의 세포내 분포에 미치는 영향을 분석하였다. 도 13을 참고하면 포스파티딜콜린을 처리한 웜에서 DAF-16이 핵으로 신속하게 위치하였다. 7일차 대조군에서 DAF-16가 중간 위치인 웜은 19.4 ± 10.56%였고, 포스파티딜콜린을 처리한 군에서 DAF-16가 중간 위치인 웜은 32.8 ± 11.07%였다. 또한, 포스파티딜콜린을 처리한 웜은 DAF-16가 핵에 위치한 웜이 2.8 ± 2.78 %로 나타났으나, 대조군에서는 DAF-16의 핵 편재가 나타나지 않았다. 7일째에 관찰된 차이는 통계적으로 유의하지 않았다(p <0.05).Accordingly, the effect of phosphatidylcholine on the intracellular distribution of DAF-16 was analyzed. Referring to FIG. 13 , in worms treated with phosphatidylcholine, DAF-16 was rapidly located in the nucleus. In the control group on
그러나 9일차에는 대조군과 포스파티딜콜린 처리군에서 DAF-16의 세포내 분포에 유의한 차이가 나타났다. 포스파티딜콜린 처리군에서는 DAF-16가 세포질 분포가 나타나지 않았으나, 대조군 웜의 5.0 ± 2.55%는 DAF-16가 여전히 세포질에 분포함을 확인하였다. DAF-16가 중간에 위치한 웜의 분포는 대조군 35.0 ± 2.55%에서 포스파티딜콜린 처리군 13.3 ± 5.09%으로 감소하였다. 이와 대조적으로 포스파티딜콜린콜린 처리에 의해 더 많은 웜에서 DAF-16이 핵으로 편재되었다. 대조군은 DAF-16가 핵에 위치한 웜의 분포가 60.0 ± 5.00%로 나타났고, 포스파티딜콜린 처리군에서 86.7 ± 5.09%으로 나타났다. However, on the 9th day, there was a significant difference in the intracellular distribution of DAF-16 in the control group and the phosphatidylcholine-treated group. In the phosphatidylcholine-treated group, DAF-16 did not show cytoplasmic distribution, but 5.0 ± 2.55% of control worms confirmed that DAF-16 was still distributed in the cytoplasm. The distribution of worms located in the middle of DAF-16 was reduced from 35.0 ± 2.55% in the control group to 13.3 ± 5.09% in the phosphatidylcholine treated group. In contrast, DAF-16 was localized to the nucleus in more worms by phosphatidylcholine treatment. In the control group, the distribution of worms with DAF-16 located in the nucleus was 60.0 ± 5.00%, and in the phosphatidylcholine treated group, 86.7 ± 5.09%.
이러한 결과는 포스파티딜콜린이 베타아밀로이드에 의해 유도된 독성에 대해 보호효과를 가지며, 이는 DAF-16의 핵 편재로 인한 것임을 보여준다. These results show that phosphatidylcholine has a protective effect against beta-amyloid-induced toxicity, which is due to the nuclear localization of DAF-16.
<실험예7> 수명연장 돌연변이체에서 포스파티딜콜린의 수명연장 효과<Experimental Example 7> Life extension effect of phosphatidylcholine in lifespan extension mutants
포스파티딜콜린에 의한 수명 연장과 관련된 세포기전을 확인하기 위해 수명이 연장된 돌연변이체에서 포스파티딜콜린의 수명연장 효과를 확인하였다. To confirm the cellular mechanism related to lifespan extension by phosphatidylcholine, the lifespan extension effect of phosphatidylcholine was confirmed in a mutant with extended lifespan.
전술한 실험예에서 비처리 대조군(야생형 N2)의 수명이 포스파티딜콜린에 의해 크게 연장되었다(도 14) 평균 수명은 포스파티딜콜린의 처리에 의해 17.5일에서 20.6일로 17.6% 증가하였다. 그러나 인슐린/IGF-1 유사 신호의 감소로 수명이 연장된 Age-1(hx546)의 수명은 포스파티딜콜린의 처리에 의해 변화하지 않았다(도 15). 흥미롭게도 포스파티딜콜린을 처리한 경우 clk-1 및 eat-2 돌연변이체의 수명을 유의하게 증가시켰다(도 16 및 도 17). In the above-described experimental example, the lifespan of the untreated control group (wild-type N2) was significantly extended by phosphatidylcholine (FIG. 14). The average lifespan was increased by 17.6% from 17.5 days to 20.6 days by the treatment of phosphatidylcholine. However, the lifespan of Age-1 (hx546), whose lifespan was extended due to a decrease in insulin/IGF-1-like signals, was not changed by treatment with phosphatidylcholine ( FIG. 15 ). Interestingly, treatment with phosphatidylcholine significantly increased the lifespan of clk-1 and eat-2 mutants ( FIGS. 16 and 17 ).
상기 clk-1 (e2519) 돌연변이는 미토콘드리아 전자 전달계에 필요한 유비퀴논의 생합성에 결함을 가지고 있으며 결과적으로 활성산소종(ROS) 생성이 적다.The clk-1 (e2519) mutation has a defect in the biosynthesis of ubiquinone required for the mitochondrial electron transport system, and as a result, the generation of reactive oxygen species (ROS) is small.
상기 eat-2 (ad465) 돌연변이는 푸드펌핑 비율(food pumping rate)의 감소를 유발하여 결과적으로 식이 제한을 초래한다. The eat-2 (ad465) mutation causes a decrease in food pumping rate, resulting in dietary restriction.
포스파티딜콜린은 clk-1 (e2519) 돌연변이의 평균수명을 비처리 대조군(clk-1 (e2519)) 22.2일에서 25.4일로 14.7% 증가시켰다. Phosphatidylcholine increased the average lifespan of the clk-1 (e2519) mutant by 14.7% from 22.2 days to 25.4 days in the untreated control group (clk-1 (e2519)).
또한, 식이제한 장수 유전자 모델인 eat-2 (ad465)의 수명이 포스파티딜콜린의 처리에 의해 21일에서 25.8일로 18.3% 증가되었다(도 17). 반복적인 실험에서도 이와 장수 유전자 돌연변이체에서 이와 동일한 효과가 나타났다(표 4).In addition, the lifespan of eat-2 (ad465), a dietary restriction longevity gene model, was increased by 18.3% from 21 days to 25.8 days by treatment with phosphatidylcholine ( FIG. 17 ). Repeated experiments also showed the same effect in this longevity gene mutant (Table 4).
즉, 포스파티딜콜린의 수명연장 효과는 Age-1와 겹치지만, clk-1 또는 eat-2 돌연변이의 효과와 중복되지 않음을 확인하였다.That is, it was confirmed that the lifespan extension effect of phosphatidylcholine overlaps with Age-1, but does not overlap with the effect of clk-1 or eat-2 mutations.
1) p-값은 log-rank test를 이용하여 비처리 대조군과 포스파티딜콜린 처리군의 수명을 비교하여 계산하였다. 1) p-value was calculated by comparing the lifespan of the untreated control group and the phosphatidylcholine treated group using the log-rank test.
2) % 효과는 (C-P)/C*100으로 계산하였다. 상기 P는 포스파티딜콜린 처리군의 평균수명이고 상기 C는 비처리군의 평균수명이다. 2) % effect was calculated as (C-P)/C*100. Wherein P is the average lifespan of the phosphatidylcholine treated group and C is the average lifespan of the untreated group.
<실험예8> 포스파티딜콜린의 수명연장 효과에서 DAF-16의 역할<Experimental Example 8> The role of DAF-16 in the lifespan extension effect of phosphatidylcholine
age-1 및 daf-2를 포함하며 인슐린/IGF-1-유사 신호에 관여하는 유전자의 변이는 장수 표현형을 나타내며, 수명연장을 위해 DAF-16가 요구된다고 보고되어 있다(Johnson 1990). 이전 실험결과에서 포스파티딜콜린의 수명연장 효과가 age-1과 중복된다는 사실을 바탕으로, daf-16 녹다운(knockdown)이 포스파티딜콜린의 수명 연장에 미치는 영향을 분석하였다. 공벡터를 처리한 웜에서 관찰된 결과와 달리 daf-16의 발현을 RNAi로 억제하였을 때, 포스파티딜콜린 처리시 수명이 증가하지 않았다(도 18). 평균수명은 공벡터 RNAi로 처리한 웜에서 포스파티딜콜린의 처리에 의해 17.9일에서 21.1일로 증가하였다. 그러나 daf-16 RNAi를 처리한 웜은 비처리 대조군과 포스파티딜콜린 처리군에서 각각 15.5일과 15.6일로 나타나 평균수명에 유의한 차이가 없음을 확인하였다. 개별 반복실험결과에서도 이와 동일한 결과가 나타났다(표 5). It has been reported that mutations in genes including age-1 and daf-2 involved in insulin/IGF-1-like signals indicate a longevity phenotype, and DAF-16 is required for lifespan extension (Johnson 1990). Based on the fact that the lifespan extension effect of phosphatidylcholine overlaps with age-1 in the previous experimental results, the effect of daf-16 knockdown on the lifespan extension of phosphatidylcholine was analyzed. Contrary to the results observed in the worms treated with the empty vector, when the expression of daf-16 was inhibited by RNAi, the lifespan did not increase when treated with phosphatidylcholine ( FIG. 18 ). The average lifespan was increased from 17.9 days to 21.1 days by treatment with phosphatidylcholine in worms treated with empty vector RNAi. However, daf-16 RNAi-treated worms were 15.5 days and 15.6 days in the untreated control group and the phosphatidylcholine treated group, respectively, confirming that there was no significant difference in the average lifespan. The same results were also found in the results of individual repeated experiments (Table 5).
이러한 결과는 daf-16이 포스파티딜콜린의 수명연장 효과에 필요함을 나타낸다. 또한, 포스포티딜콜린에 의해 나타나는 수명연장이 인슐린/IGF-1-유사 신호의 감소에 의해 매개됨을 뒷받침한다.These results indicate that daf-16 is required for the life-extending effect of phosphatidylcholine. Furthermore, we support that lifespan extension exhibited by phosphotidylcholine is mediated by a decrease in insulin/IGF-1-like signaling.
1) p-값은 log-rank test를 이용하여 비처리 대조군과 포스파티딜콜린 처리군의 수명을 비교하여 계산하였다. 1) p-value was calculated by comparing the lifespan of the untreated control group and the phosphatidylcholine treated group using the log-rank test.
결론적으로, 본 발명에서는 포스파티딜콜린의 식이 보충은 산화 스트레스, 내성을 증가시킬 수 있으며, 노화에 의한 운동성 저하를 지연시키고, Aβ 유도 독성을 억제하며, C. elegans의 수명을 연장시킬 수 있음을 확인하였다. In conclusion, in the present invention, it was confirmed that dietary supplementation of phosphatidylcholine can increase oxidative stress and tolerance, delay motility decline due to aging, suppress Aβ-induced toxicity, and extend the lifespan of C. elegans. .
Claims (9)
상기 조성물은 선충의 수명 또는 운동성을 증가시키고,
상기 선충은 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)이고,
상기 조성물은 포스파티딜콜린(phosphatidylcholin)을 10 내지 100mg/L 포함하는 것인, 조성물.As a composition for nematode culture comprising phosphatidylcholine,
The composition increases the lifespan or motility of nematodes,
The nematode is Caenorhabditis elegans ,
The composition is a composition comprising 10 to 100 mg/L of phosphatidylcholine.
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