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KR102279680B1 - 방법 - Google Patents

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KR102279680B1
KR102279680B1 KR1020197023147A KR20197023147A KR102279680B1 KR 102279680 B1 KR102279680 B1 KR 102279680B1 KR 1020197023147 A KR1020197023147 A KR 1020197023147A KR 20197023147 A KR20197023147 A KR 20197023147A KR 102279680 B1 KR102279680 B1 KR 102279680B1
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안토아네타 보리소바 마하일로바-크로우모바
길리앙 탕
어밍 왕
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Abstract

본 발명은 담배 식물 또는 담배 세포 배양물의 수크로스 에스테르 함량을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제함으로써 상기 담배 식물 또는 담배 세포 배양물을 변형시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 담배 식물 또는 담배 세포 배양물의 수크로스 에스테르 함량을 증가시키기 위한 디테르펜 합성 유전자의 용도 뿐만 아니라 본 발명에 따라 수득될 수 있는 담배 세포, 담배 식물, 담배 식물 번식 물질, 수확된 잎, 가공된 담배, 또는 담배 제품을 제공한다.

Description

방법
발명의 분야
본 발명은 담배의 향미를 개선시키는 것에 관한 것이고 특히 담배 식물에서의 수크로스 에스테르 함량에 관한 것이다. 특히 본 발명은 담배 식물에서 수크로스 에스테르 함량을 증가시키는 것에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 방법 및 용도, 및 담배 식물 및 이들의 하류 생성물(예를 들어, 번식 물질, 수확된 잎, 가공된 담배, 담배 제품)에 관한 것이다.
배경
식물 트리콤은 많은 식물의 아리엘(ariel) 표면에서 발견될 수 있는 표피 증식물을 포함하는 특수한 구조이다. 이들의 형태학은 식물 기관 상의 위치, 이들의 크기 및 밀도를 포함하여, 종을 가로질러 및 심지어 종 내에서 다양하다. 이들은 곤충, 병원성 미생물 및 초식동물에 대한 첫 번째 방어선을 제공하고 싸늘하고 바람이 많이 부는 조건과 같은 환경에 대한 보호를 제공하는 것으로 생각된다. 트리콤은 샘 및 분비 생성물일 수 있고 이의 주요 기능은 식물 표면에서 저장되거나 휘발되는 해충- 또는 꽃가루매개자-상호작용 화학물질을 생산하는 것일 수 있다. 그러한 식물의 트리콤은 경제적이고 상업적인 중요성을 지닌 자연 생성물을 생산하는 공장으로 기능할 수 있었다. 유리하게는, 분비된 화합물은 트리콤 샘에서만 생산되고 주변 각피 아래의 샘 세포 외부에 축적된다. 따라서, 삼출성 물질은 본질적으로 식물 외부에 축적되기 때문에 비침습성 용매에 식물을 담그면 삼출물이 간단하고 깨끗하게 회수될 수 있다. 식물 트리콤 2차 삼출물 조성물의 조작을 사용하여 곤충 내성을 향상시켰고(Wang et al. Nature Biotechnology 19, 371-374 (2001), 본원에 참조로서 포함됨) 샘 트리콤의 대사 공학처리를 사용하여 에센셜 오일의 품질을 향상시켰다(Mahmoud and Croteau Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Jul 17;98(15):8915-20. Epub 2001 Jun 26, 본원에 참조로서 포함됨).
다수의 담배 품종은 높은 바이오매스 및 높은 삼출물 축적 가능성 둘 모두를 갖는다. 예를 들어, 실험용 담배주 T.I. 1068은 잎 건조 중량의 최대 17%를 샘-트리콤 삼출물로서 생산할 수 있다(Wagner, G.J 1991 Plant Physiology 96, 675-679 본원에 참조로서 포함됨). 트리콤 샘 삼출물의 약 72%는 디테르페노이드이고 약 24%는 수크로스 에스테르이다.
수크로스 에스테르의 가장 풍요로운 천연 공급원은 담배 식물인 것으로 보인다. 당류 에스테르는 많은 가능한 아실기 및 당류(수크로스 또는 글루코스)로 에스테르화될 수 있는 아실기의 조합물로 인해 화합물의 복잡한 혼합물이다. 이들 화합물은 담배 잎을 생산하는 담배 잎의 끈적한 질감을 주로 담당한다(Kandra, L. and G.J. Wagner, Archives Biochem. Biophys. 265 (1988) 425-432, 본원에 참조로서 포함됨). 수크로스 에스테르는 터키 담배 연기의 중요한 향미 성분인 3-메틸발레르산 및 3-메틸부티르산의 전구체(Kandra, L., et al. Eur. J. Biochem. 188 (1990) 385-391, 본원에 참조로서 포함됨)이고, 또한 3-메틸 발레르산은 담배에 "터키 노트(Turkish note)"를 제공한다고 알려져 있다.
T.I. 1068 트리콤 삼출물은 주로 셈브레노이드(cembrenoid) 및 라브다노이드 디테르페노이드(labdanoid diterpenoid)를 함유한다. CBT디올(α 및 β 위치 이성질체), 시스-아비에놀, 및 라브데네디올은 각각 삼출물 중량의 약 60, 10 및 0.6%를 차지한다. T.I. 1068 트리콤 삼출물 디테르펜 및 CBT-디올의 주요 디테르펜 성분의 합성을 위한 일반적인 경로는 도 2에 도시되어 있다. 엽록체의 메틸-에리트리톨-포스페이트(MEP) 경로는 디테르펜 합성을 위해 게라닐게라닐 피로포스페이트(GGPP)를 공급한다.
다양한 담배 유형의 관능적 또는 감각적 특성은 상당히 다양하며 유전적 차이를 포함하는 복잡한 요인에 의해 영향을 받는다. 담배의 항진균 및 관능 특성은 수크로스 에스테르 함량과 관련이 있는 것으로 생각된다. 담배의 독특한 방향 및 향미 프로파일은 큐어링된(cured) 잎에 일정 수준으로 존재하고 수크로스 에스테르 내용물을 포함할 수 있는 이들 화합물의 전구체 또는 독특한 향미 및 방향 화합물의 결과이다.
터키 담배(때로 오리엔탈 담배로 지칭됨)는 바람직한 관능적 특성을 갖는다; 이것은 온화한 향미와 함께 매우 향기롭고 작은 잎이 많은 품종의 담배이며 다른 담배 품종보다 적은 니코틴을 함유한다. 측정 가능한 양의 수크로스 에스테르가 담배 큐어링/에이징 과정에서 살아남아 상업용 터키(또는 오리엔탈) 담배의 필수 성분으로 나타난다는 것이 확인되었다(M. Ashraf-Khorassani,et al. Contributions to Tobacco Research Vol 21: 7;October 2005, 본원에 참조로서 포함됨). 또한, 수크로스 에스테르는 터키 담배 연기의 방향족 카르복실산의 전구체이므로 터키 담배의 중요한 향미 성분이다(Arrendale, R.F., et al., J. Agric. Food Chem. 38 (1990) 75-85, 본원에 참조로서 포함됨).
자연 발생 수크로스 에스테르는 에스테르화의 정도 및 분자 내 에스테르 작용기의 분포로 인해 분석 문제에 있어 과제를 제공한다. 수크로스 분자에서, 잠재적인 아실기에 대한 4개 부위(예를 들어, 1차 1개, 2차 3개)가 글루코스(GLU) 고리 상에 존재하고; 또 다른 4개 부위(예를 들어, 1차 2개, 2차 2개)가 프룩토스(FRU) 고리 상에서 발견될 수 있다. 현재까지, 에스테르 산 모이어티의 확인은 수크로스 메틸/부틸 에스테르 또는 수크로스 트리메틸실릴(TMS) 유도체의 GC-MS(가스 크로마토그래피 - 질량 분석법) 및 LC-MS(액체 크로마토그래피 - 질량 분석법)(Slocombe et al. Plant Physiol. 148, 1830-1846 참조, 본원에 참조로서 포함됨)를 통해 이루어졌다. 고 분자량 탄수화물 유도체를 포함시키기 위한 노력의 약간의 성공으로 고온 GC(기체 크로마토그래피)가 연구되었다(Karrer, R., et al., J. High Resolu. Chromatogr. 15 (1992) 585-589, 본원에 참조로서 포함됨). 에스테르의 산 가수분해 및 방출된 카르복실산의 재유도체화에 의해 수득된 데이터로부터 수크로스 에스테르 상의 아실 치환 패턴에 관한 추론이 보고되었지만, 이 접근법은 상이하게 해석될 수 있다.
발명의 개요
놀랍게도, 본원에 교시된 대로 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제함으로써 증가된 수크로스 에스테르 함량을 갖는 담배를 생산하도록 담배를 변형시킴에 의해 상업적으로 바람직한 특성을 갖는 담배 식물에 의해 터키 담배에서 발견되는 것과 같은 독특한 향미(및/또는 방향 및/또는 맛) 특성이 생성될 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서 담배 제품의 소비자가 추구하는 우수한 향미(및/또는 방향 및/또는 맛) 특성을 가진 담배 제품을 생산할 수 있다.
본 발명자들은 특정 2차 화합물을 생산하는 특수한 트리콤 샘 세포에서 탄소 흐름의 조절 및 경로를 조사하였다. 본 발명자들의 한 가지 목적은 변경된 디테르펜 함량을 제공하기 위해 트리콤 삼출물 화학을 변형시키도록 트리콤 샘 디테르펜 대사를 최적화하는 것이었다. 동일한 조건 하에 성장한 야생형 식물 대응체과 비교하여 삼출물에서 예상외로 증가된 수크로스 에스테르 함량을 나타낸 식물계 세포주가 생성되었다. 상기 식물주는 CBTol(신타제) 및 테르펜 신타제 3-8의 형성을 촉매화하는 효소를 표적으로 하였다. 일부 구체예에서 테르펜 신타제 3-8은 시스-아비에놀 신타제로 지칭될 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제함으로써 담배 식물의 수크로스 에스테르 함량을 증가시키는 방법을 알아내었다. 본 발명 이전에, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현의 억제가, 특히 수율 및 다른 상업적으로 바람직한 특성을 개선시키면서, 수크로스 에스테르 함량을 증가시키는데 사용될 수 있다는 것은 알려져 있지 않았다.
한 양태에 따르면, 본 발명은 담배 식물 또는 이의 일부 또는 담배 세포 배양물의 수크로스 에스테르 함량을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제함으로써 상기 담배 식물 또는 담배 세포 배양물을 변형시키는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 담배 식물 또는 이의 일부 또는 담배 세포 배양물의 수크로스 에스테르 함량을 증가시키기 위한 디테르펜 합성 유전자의 용도가 제공된다.
본 발명은 또 다른 양태에서 증가된 수크로스 에스테르 함량을 갖는 담배 식물 또는 이의 일부, 담배 식물 번식 물질, 담배 잎, 절단하여 수확된 담배 잎, 가공된 담배 잎 또는 절단하여 가공된 담배 잎 또는 담배 세포 배양물을 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하도록 상기 담배를 변형시키는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 수크로스 에스테르 함량이 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하도록 변형되지 않은 담배 식물 또는 담배 세포 배양물과 비교하여 증가된 본 발명에 따른 방법 또는 용도가 제공된다.
또 다른 양태에서, 변형되지 않은 식물 또는 변형되지 않은 담배 세포 배양물과 비교하여 수크로스 에스테르 함량의 증가를 달성하도록 변형된 담배 식물 또는 이의 일부 또는 담배 세포 배양물이 제공되고, 상기 변형은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현의 억제이다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 담배 식물 또는 담배 세포 배양물로부터 수득될 수 있는 담배 식물 번식 물질(예를 들어, 식물 종자)이 제공된다.
본 발명은 또 다른 양태에서 디테르펜 합성 유전자가 사이클라제 2 유전자(CYC2), CBTol 사이클라제 또는 테르펜 신타제 3-8인 방법 또는 용도, 담배 식물 또는 담배 식물 번식 물질, 또는 담배 세포 배양물을 제공한다.
본 발명은 한 양태에서 디테르펜 합성 유전자가 사이클라제 2 유전자(CYC2)인 방법 또는 용도, 담배 식물 또는 담배 식물 번식 물질을 제공한다.
본 발명은 한 양태에서 디테르펜 합성 유전자가 CBTol 사이클라제인 방법 또는 용도, 담배 식물 또는 담배 식물 번식 물질을 제공한다.
본 발명은 한 양태에서 디테르펜 합성 유전자가 테르펜 신타제 3-8인 방법 또는 용도, 담배 식물 또는 담배 식물 번식 물질을 제공한다.
본 발명은 또 다른 양태에서 디테르펜 합성 유전자의 발현이 RNA 간섭(RNAi)을 사용하여 억제되는 방법 또는 용도, 담배 식물 또는 이의 일부 또는 담배 식물 번식 물질 또는 담배 세포 배양물을 제공한다.
한 양태에서, 사이클라제 2 유전자(CYC2) 발현이 사이클라제 2 유전자(CYC2) 유전자의 엑손 1의 적어도 일부, 엑손 2의 적어도 일부 및 엑손 3의 적어도 일부를 포함하는 ddRNAi DNA 작제물을 사용하여 억제되는 방법, 용도, 담배 식물 또는 담배 식물 번식 물질, 또는 담배 세포 배양물이 제공된다.
한 양태에서, 사이클라제 2 유전자(CYC2) 발현이 내인성 경로에 의해 세포에서 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 엑손 1의 적어도 일부, 엑손 2의 적어도 일부 및 엑손 3의 적어도 일부에 상응하는 mRNA에 결합하는 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)를 유도하는 단일 가닥 짧은 간섭 RNA(siRNA)로 처리되는 dsRNA를 사용하여 억제되는 방법, 용도, 담배 식물 또는 담배 식물 번식 물질, 또는 담배 세포 배양물이 제공된다. 한 양태에서, 단일 가닥 siRNA는 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 엑손 1의 적어도 일부, 엑손 2의 적어도 일부 및 엑손 3의 적어도 일부에 상응하는 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스(또는 가이드) 가닥을 생성한다.
한 양태에서, CBTol 사이클라제 유전자 발현이 CBTol 사이클라제 유전자의 엑손 4의 적어도 일부, 인트론 4, 엑손 5, 인트로 5, 엑손 6, 인트론 6 및 엑손 7의 적어도 일부를 포함하는 ddRNAi DNA 작제물을 사용하여 억제되는 방법, 용도, 담배 식물 또는 담배 식물 번식 물질 또는 담배 세포 배양물이 제공된다.
또 다른 양태에서, CBTol 사이클라제 유전자 발현이 내인성 경로에 의해 세포에서 CBTol 사이클라제의 엑손 4의 적어도 일부, 인트론 4, 엑손 5, 인트론 5, 엑손 6, 인트론 6 및 엑손 7의 적어도 일부에 상응하는 mRNA에 결합하는 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)를 유도하는 단일 가닥 siRNA로 처리되는 dsRNA를 사용하여 억제되는 방법, 용도, 담배 식물 또는 담배 식물 번식 물질, 또는 담배 세포 배양물이 제공된다. 한 양태에서, 단일 가닥 siRNA는 CBTol 사이클라제 유전자의 엑손 4의 적어도 일부, 엑손 5, 엑손 6 및 엑손 7의 적어도 일부에 상응하는 mRNA에 상보적인 서열을 갖는 안티센스(또는 가이드) 가닥을 생성한다.
한 양태에서, 테르펜 신타제 3-8 유전자 발현이 SEQ ID No. 3의 적어도 뉴클레오티드 1497 내지 1517에 상응하는 서열을 포함하는 ddRNAi DNA 작제물을 사용하여 억제되는 본 발명에 따른 방법, 용도, 담배 식물 또는 담배 식물 번식 물질 또는 담배 세포 배양물이 제공된다.
또 다른 양태에서, 테르펜 신타제 3-8 유전자 발현이 SEQ ID No. 3의 적어도 뉴클레오티드 1497 내지 1517에 상응하는 서열을 포함하는 인공 마이크로 RNAi(amiRNAi)를 사용하여 억제되는 본 발명에 따른 방법, 용도, 담배 식물 또는 담배 식물 번식 물질 또는 담배 세포 배양물이 제공된다.
한 양태에서, 테르펜 신타제 3-8 유전자 발현이 SEQ ID No. 3의 적어도 뉴클레오티드 884 내지 904에 상응하는 서열을 포함하는 ddRNAi DNA 작제물을 사용하여 억제되는 본 발명에 따른 방법, 용도, 담배 식물 또는 담배 식물 번식 물질 또는 담배 세포 배양물이 제공된다.
또 다른 양태에서, 테르펜 신타제 3-8 유전자 발현이 SEQ ID No. 3의 적어도 뉴클레오티드 884 내지 904에 상응하는 서열을 포함하는 인공 마이크로 RNAi(amiRNAi)를 사용하여 억제되는 본 발명에 따른 방법, 용도, 담배 식물 또는 담배 식물 번식 물질 또는 담배 세포 배양물이 제공된다.
한 양태에서, 담배 식물의 수크로스 에스테르 함량이 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하도록 변형되지 않은 담배 식물 또는 담배 세포 배양물과 비교하여 변형된 담배 식물 또는 담배 세포 배양물에서 적어도 2배(적합하게는 적어도 3배) 더 높은 본 발명의 방법 또는 용도, 본 발명의 담배 식물 또는 이의 일부, 또는 본 발명의 담배 식물 번식 물질 또는 담배 세포 배양물이 제공된다.
한 양태에서, 담배 식물의 재배를 위한 본 발명의 담배 식물 또는 이의 일부의 용도가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 담배 산업 제품의 제조를 위한 본 발명의 담배 식물 또는 이의 일부 또는 담배 세포 배양물의 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 작물을 성장시키기 위한 본 발명의 담배 식물 또는 이의 일부의 용도가 제공된다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 식물 또는 이의 일부 또는 이들의 추출물 또는 본 발명에 따른 담배 세포 배양물로부터 제조된 큐어링된 담배 물질을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 상기 큐어링된 담배 물질을 포함하는 담배 블렌드가 제공된다.
한 양태에서, 담배 잎(예를 들어, 가공된(바람직하게는 큐어링된) 담배 잎)을 생산하기 위한 본 발명의 담배 식물 또는 이의 일부의 용도가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 담배 식물의 수확된 잎 또는 본 발명의 번식 물질로부터 번식된 담배 식물로부터 수득될 수 있거나 본 발명의 용도에 의해 수득된 담배 식물로부터 수득될 수 있는 수확된 잎이 제공된다.
한 양태에서, 담배 식물의 수확된 잎이 절단하여 수확된 잎인 본 발명의 담배 식물의 수확된 잎이 제공된다.
본 발명은 또 다른 양태에서,
i) 본 발명의 용도로부터 수득될 수 있는 담배 식물로부터 수득될 수 있거나;
ii) 본 발명의 담배 식물을 가공함으로써 수득될 수 있거나;
iii) 본 발명의 담배 식물 번식 물질로부터 번식된 담배 식물로부터 수득될 수 있거나;
iv) 본 발명의 담배 식물의 수확된 잎을 가공함으로써 수득될 수 있는 가공된 담배 잎(바람직하게는 비생육성 가공된 담배 잎)을 제공한다.
한 양태에서, 담배가 큐어링, 발효, 저온살균 또는 이들의 조합에 의해 가공되는 본 발명의 가공된 담배 잎이 제공된다.
한 양태에서, 가공된 담배 잎이 절단하여 가공된 담배 잎인 본 발명의 가공된 담배 잎이 제공된다.
본 발명은 또 다른 양태에서 다음으로부터 제조된 담배 산업 제품을 제공한다:
i) 본 발명의 담배 식물 또는 이의 일부 또는 본 발명의 담배 세포 배양물;
ii) 본 발명의 담배 식물 번식 물질로부터 번식된 담배 식물 또는 이의 일부;
iii) 본 발명의 담배 식물의 수확된 잎;
iv) 본 발명의 가공된 담배 잎.
한 양태에서, 담배 제품이 흡연 물품인 본 발명의 담배 산업 제품이 제공된다.
또 다른 양태에서, 담배 제품이 무연 담배 제품인 본 발명의 담배 산업 제품이 제공된다.
한 양태에서, 담배 제품이 에어로졸 발생-장치와 같은 담배 가열 장치인 본 발명의 담배 산업 제품이 제공된다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 식물 또는 이의 일부 또는 이들의 추출물(예를 들어, 담배 추출물) 또는 본 발명에 따른 담배 세포 배양물; 또는 본 발명에 따른 큐어링된 담배 물질; 또는 본 발명에 따른 담배 블렌드를 포함하는 흡연 물품, 무연 담배 제품 또는 담배 가열 장치가 제공된다.
한 양태에서, 설명 및 도면을 참조하여 실질적으로 본원에 기술된 바와 같은 방법, 담배 잎, 담배 식물, 담배 식물 번식 물질, 수확된 잎, 가공된 담배, 담배 제품, 용도 또는 이들의 조합물이 제공된다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 구체예는 이제 하기 기재되는 도면을 참조하여 단지 예시로서 기재될 것이다.
도 1. 수크로스 에스테르의 일반적인 구조를 도시한다.
도 2. 색소체에서 디테르펜 합성 경로의 개략도를 도시한다.
도 3. 필드 재배된 대조군 대 트랜스제닉 계통의 녹색 잎 분석을 나타내는 그래프를 도시한다. 개별 식물 화학물질은 양의 오름차순으로 정렬된다.
도 4. 대조군 대 트랜스제닉 계통에서 총 수크로스 에스테르 함량을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 5. 대조군에 비해 주 GW-3에서 수크로스 에스테르 농축을 나타내는 그래프를 도시한다. 수크로스 에스테르 함량은 총 주요 삼출물 화합물의 백분율로 표시된다.
도 6. 대조군에 비해 주 GW-3에서 시스-아비에놀 농축을 나타내는 그래프를 도시한다. 시스-아비에놀 함량은 총 주요 삼출물 화합물의 백분율로 표시된다.
도 7. 하기 기술된 바와 같은 SEQ ID No. 1을 도시한다.
도 8. 하기 기술된 바와 같은 SEQ ID No. 2를 도시한다.
도 9. 하기 기술된 바와 같은 SEQ ID No. 3을 도시한다.
도 10. 하기 기술된 바와 같은 SEQ ID No. 4를 도시한다.
도 11. 하기 기술된 바와 같은 SEQ ID No. 5를 도시한다.
도 12. 하기 기술된 바와 같은 SEQ ID No. 6을 도시한다.
도 13. 하기 기술된 바와 같은 SEQ ID No. 7을 도시한다.
도 14. 하기 기술된 바와 같은 SEQ ID No. 8을 도시한다.
도 15. 하기 기술된 바와 같은 SEQ ID No. 9를 도시한다.
도 16. 하기 기술된 바와 같은 SEQ ID No. 10을 도시한다.
도 17. 하기 기술된 바와 같은 SEQ ID No. 11을 도시한다.
서열 목록
본 명세서 및 상응하는 서열 목록을 통틀어 사용된 서열 식별자의 개요가 제공된다:
SEQ ID No. 1은 CBTol 사이클라제 유전자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 상응한다. 이 뉴클레오티드 서열은 Genbank: AY049090으로 주석을 달았다.
SEQ ID No. 2는 폴리펩티드 CBTol 사이클라제의 아미노산 서열에 상응한다.
SEQ ID No. 3은 cDNA 유전자 서열, 즉, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)으로부터의 테르펜 신타제 3-8 유전자의 코딩 서열에 상응한다. 전장 cDNA 유전자 서열은 Genbank: AY528645로 주석을 달았다.
SEQ ID No. 4는 니코티아나 타바쿰으로부터의 폴리펩티드 테르펜 신타제 3-8의 아미노산 서열에 상응한다.
SEQ ID No. 5는 순서대로 5'-서열 AF401234(CYC2 mRNA의 완전한 코딩 서열이며 SEQ ID No. 9의 뉴클레오티드 넘버링에 상응한다)로부터의 54번째 내지 716번째 뉴클레오티드로부터의 센스 단편; 헤어핀 루프로서 부분적인 GUS A 단편(787번째 내지 1812번째 뉴클레오티드); 및 센스 단편의 역 보체-3'를 포함한다. 도면에서, 밑줄친 서열은 787번째 내지 1812번째 뉴클레오티드로부터의 GUS A 단편(AF502128)에 해당한다. 센스 배향으로 CYC2 mRNA(SEQ ID No. 9에 상응하는 AF401234)로부터 54 내지 716 뉴클레오티드 서열은 AY495694(AY495694는 CYC2 유전자의 유전체 서열이고 SEQ ID No. 8에 상응한다)로부터의 하기 유전체 서열에 상응한다: 뉴클레오티드 1 내지 25, 제1 엑손(뉴클레오티드 26 내지 271), 제2 엑손(뉴클레오티드 1253 내지 1529) 및 제3 엑손의 처음 115개 뉴클레오티드(뉴클레오티드 2366 내지 2480), 이 때 뉴클레오티드 넘버링은 SEQ ID No. 8의 넘버링에 상응한다. SEQ ID No. 5는 dsRNA를 인코딩하고 ddRNAi DNA 작제물(때로는 본원에서 GW1로 지칭됨)에 사용되어 dsRNA를 생산한다.
SEQ ID No. 6은 GUS 스페이서에 의해 분리된, 엑손 4의 부분적인 서열, 인트론 4, 엑손 5, 인트론 5, 엑손 6, 인트론 6 및 부분적인 엑손 7 센스 및 안티센스 배향을 포함하는 CBTol 사이클라제 유전자 니코티아나 타바쿰으로부터의 서열을 포함한다. 부분적인 유전자의 요소는 다음 순서로 도면에 도시된다: N. 타바쿰 사이클라제 유전자(AY049090), 부분적인 엑손 4 - 뉴클레오티드 2854 내지 뉴클레오티드 4175, 정방향 배향, 부분적인 엑손 4, 인트론 4(볼드체), 엑손 5, 인트론 5(볼드체), 엑손 6, 인트론 6(볼드체), 부분적인 엑손 7(SEQ ID No. 1의 뉴클레오티드 2854 내지 4175에 상응함); 이어서 GUS 루프 - 부분적인 GUS A 유전자(Genbank accession no. AF502128) - 786 내지 1816(밑줄침); 이어서 N. 타바쿰 사이클라제 유전자(AY049090)의 동일하지만 역 보체(역 보체는 음영으로 표시됨) 서열이 뒤따른다. 이 서열은 dsRNA를 인코딩하고 ddRNAi DNA 작제물(때로는 본원에서 GW3로 지칭됨)에 사용되어 dsRNA를 생산한다.
SEQ ID No. 7은 니코티아나 타바쿰으로부터 테르펜 신타제 3-8 유전자로부터의 21개 뉴클레오티드 서열 및 아라비돕시스(Arabidopsis) miRNA168 서열과 일치하는 서열을 포함한다. 상기 서열은 아라비돕시스 miRNA168a에 상응하고, 첫 번째 및 두 번째 이탤릭체 서열은 테르펜 신타제 3-8 유전자 AY528645로부터의 21개 뉴클레오티드 서열(1497에서 1517nt까지)에 상응한다. 첫 번째 이탤릭체 서열(강조 표시됨)는 역 보체 배향이다. 두 번째 이탤릭체 서열(밑줄침)는 정방향 배향이고, 3개의 변형을 갖는다(볼드체). 이 서열은 amiRNAi를 인코딩하고 ddRNAi DNA 작제물(때로는 본원에서 GW2로 지칭됨)에 사용되어 amiRNAi를 생산한다.
SEQ ID No. 8은 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 유전체 서열에 상응한다. 이 뉴클레오티드 서열은 Genbank: AY495694로 주석을 달았다.
SEQ ID No. 9는 Genbank: (AF401234)로 주석을 단 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 mRNA의 완전한 코딩 서열에 상응한다.
SEQ ID No. 10은 사이클라제 2 유전자(CYC2) SEQ ID No. 9에 의해 인코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 상응한다.
SEQ ID No. 11은 니코티아나 타바쿰으로부터 테르펜 신타제 3-8 유전자로부터의 21개 뉴클레오티드 서열 및 아라비돕시스 miRNA168a 서열과 일치하는 서열을 포함한다. 상기 서열은 아라비돕시스 miRNA168a에 상응하고, 첫 번째 및 두 번째 이탤릭체 서열은 역 보체에서 테르펜 신타제 3-8 유전자 AY528645로부터의 21개 뉴클레오티드 서열(884에서 904nt까지)에 상응한다. 첫 번째 이탤릭체 서열(강조 표시됨)는 역 보체 배향이다. 두 번째 이탤릭체 서열(밑줄침)는 정방향 배향이고, 변형을 갖는다(볼드체). 이 서열은 amiRNAi를 인코딩하고 ddRNAi DNA 작제물(때로는 본원에서 GW5로 지칭됨)에 사용되어 amiRNAi를 생산한다.
상세한 설명
본 발명자들은 담배에서 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제함으로써, 담배 식물의 수크로스 에스테르 함량을 증가시킬 수 있음을 최초로 보여 주었다. 이론에 구속되기를 바라지 않으며, 디테르펜 합성 유전자의 억제는 디테르펜을 만드는 탄소 이용을 감소시켜 수크로스 에스테르 생산을 향상시키는 것으로 여겨진다.
한 구체예에서, 본 발명은 담배 식물의 수크로스 에스테르 함량을 증가시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제함으로써 상기 담배 식물을 변형시키는 것을 포함한다.
적합하게는, 본 발명에 사용되는 디테르펜 합성 유전자는 사이클라제 2 유전자(CYC2)일 수 있다. 적합하게는, 본 발명에 사용되는 디테르펜 합성 유전자는 CBTol 사이클라제 유전자일 수 있다. 적합하게는, 본 발명에 사용되는 디테르펜 합성 유전자는 테르펜 신타제 3-8 유전자일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "증가하는"은 본 발명의 생성물(예를 들어, 식물, 이의 일부(예를 들어, 잎), 가공된 잎 또는 담배 제품) 중 수크로스 에스테르의 농도 및/또는 총 함량이 본 발명에 따라 변형되지 않은 비슷한 생성물과 비교하여 더 높다는 것을 의미한다.
본원에서 정의된 용어 "비슷한 생성물"은 본 발명에 따라 변형되지 않았지만 다른 모든 관련 특징들(예를 들어, 식물 종, 성장 조건, 담배 가공 방법 등)이 동일한 담배 식물로부터 유래된 생성물일 것이다. 본 발명에 따른 비슷한 생성물은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하도록 변형되지 않은 담배 식물로부터 수득될 수 있거나 수득된 담배 식물 또는 이의 일부, 예를 들어, 담배 잎, 수확된 잎, 절단하여 수확된 잎, 가공된 담배 잎 또는 담배 식물 번식 물질, 또는 담배 제품 또는 이들의 조합물을 의미할 수 있다. 비슷한 생성물을 대조군이라고도 할 수 있다. 한 구체예에서, 비슷한 생성물은 활성 또는 발현이 억제된 디테르펜 합성 유전자를 포함하지 않는 생성물이다.
본원에서 정의되는 용어 "변형되지 않은 식물"은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하도록 본 발명에 따라 변형되지 않았고 모든 다른 관련 특징들(예를 들어, 식물 종, 성장 조건, 담배 가공 방법 등)은 동일한 담배 식물일 것이다. 한 구체예에서, 변형되지 않은 식물은 활성 또는 발현이 억제된 디테르펜 합성 유전자를 포함하지 않는 식물이다.
추가 양태에서, 수크로스 에스테르 함량은 녹색 잎으로부터 측정된다. 추가 양태에서, 수크로스 에스테르 함량은 큐어링된 잎, 예를 들어, 풍건(air-cured), 열건(flue-cured), 화건(fire-cured) 또는 양건(sun-cured)된 잎으로부터 측정된다. 추가 양태에서, 수크로스 에스테르 함량은 열건된 잎으로부터 측정된다. 추가 양태에서, 수크로스 에스테르 함량은 풍건된 잎으로부터 측정된다.
용어 "수크로스 에스테르 함량"은 수크로스 에스테르로 분류된 전체 화합물 그룹의 농도 및/또는 총 함량을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 담배에 전형적으로 존재하는 수크로스 에스테르는 도 1에 도시된 화학식으로 표시될 수 있다.
수크로스 에스테르의 농도 및/또는 총 함량을 결정하기 위한 당 분야에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 수크로스 에스테르(SE)를 분석하기 위한 한 바람직한 방법은 비누화에 의해 수크로스로부터 방출된 아실기를 분석한 다음, GC-MS에 의해 이들의 부틸-에스테르를 분석하는 것을 포함한다. 이 방법에 의한 분석은 수크로스 에스테르 양의 확실한 정량을 제공한다. 대안적인 방법은 각 μg/잎 표면 cm2에 대해 수크로스를 측정함에 의한 수크로스 에스테르의 분석을 포함한다. 수크로스 에스테르 함량의 결정은 담배 잎에서 평가될 수 있다. 수크로스 에스테르 함량을 분석하기 위한 적합한 방법은 비누화, 예를 들어, 검 샘플을 80% 메탄올에서 밤새 22℃에 두어 비누화하는 단계를 포함할 수 있다. 이후 샘플을 헥산 및 물 사이에서 분배시킬 수 있다. 샘플을 분배하기 위해, 샘플을 먼저, 예를 들어, N2 하에 건조시킨 후 n-BuOH 및 H2SO4를 첨가할 수 있다. 샘플을 110˚로 1시간 동안 가열시킨 다음 펄스 볼텍싱할 수 있다. 추출을 수행하고 건조된 샘플을 다른 튜브로 옮기기 위해 CHCl3에 용해시키고 N2 하에 건조시킬 수 있다. 상기 샘플을 디메틸 포름아미드(DMF) 및 비스(트리메틸실릴) 트리플루오로아세트아미드에 용해시킬 수 있다. 샘플을, 예를 들어, 70˚에서 유도체화한 후 실온으로 냉각시킬 수 있다. 이후 유도체화된 샘플을 GC-MS에 의해 분석할 수 있다. 용리된 화합물을 이들의 체류 시간에 의해 그리고 MS 프로파일을 표준과 비교하여 확인할 수 있다.
한 구체예에서, 증가된 수크로스 에스테르 함량을 갖는 본 발명의 담배 식물에 의해 수득될 수 있거나 수득된 담배 식물, 담배 식물 번식 물질, 담배 잎, 수확된 잎, 절단하여 수확된 잎, 가공된 담배 잎, 절단하여 가공된 담배 잎, 담배 제품 또는 이들의 조합물을 생산하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하도록 상기 담배를 변형시키는 것을 포함한다. 증가된 수크로스 에스테르 함량은 담배 식물, 담배 식물 번식 물질, 담배 잎, 수확된 잎, 절단하여 수확된 잎, 가공된 담배 잎, 절단하여 가공된 담배 잎, 담배 제품 또는 이들의 조합물 중 수크로스 에스테르 함량을 비슷한 생성물과 비교함으로써 결정될 수 있다.
적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 담배 식물, 예를 들어, 변형된 담배 식물에서 증가될 수 있다. 적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 담배 잎(예를 들어, 변형된 담배 식물로부터의 담배 잎)에서 증가될 수 있다. 적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 수확된 잎(예를 들어, 변형된 담배 식물로부터의 수확된 담배 잎)에서 증가될 수 있다. 적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 절단하여 수확된 잎(예를 들어, 변형된 담배 식물로부터 절단하여 수확된 담배 잎)에서 증가될 수 있다. 적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 가공된 담배 잎(예를 들어, 변형된 담배 식물로부터의 가공된 담배 잎)에서 증가될 수 있다. 적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 절단하여 가공된 담배 잎(예를 들어, 변형된 담배 식물로부터 절단하여 가공된 담배 잎)에서 증가될 수 있다. 적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 큐어링된 담배 잎(예를 들어, 변형된 담배 식물로부터의 담배 잎)의 트리콤 삼출물에서 증가될 수 있다. 적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 녹색 담배 잎(예를 들어, 변형된 담배 식물로부터의 담배 잎)의 추출물에서 증가될 수 있다. 적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 담배 제품(예를 들어, 변형된 담배 식물 또는 이의 일부로부터 생산된 담배 제품)에서 증가될 수 있다. 적합하게는 수크로스 에스테르 함량은 상기 생성물 또는 이들의 조합물 중 어느 하나에서 증가된다.
한 구체예에서, 수크로스 에스테르 함량은 큐어링된 담배 잎(예를 들어, 변형된 담배 식물로부터의 담배 잎)의 트리콤 삼출물에서 증가된다.
한 구체예에서, 수크로스 에스테르 함량은 녹색 담배 잎(예를 들어, 변형된 담배 식물로부터의 담배 잎)의 추출물에서 증가될 수 있다.
한 구체예에서, 담배 식물 또는 이의 일부의 수크로스 에스테르 함량은 유사한 성장 조건 하에 성장된 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하도록 변형되지 않은 담배 식물 또는 이의 일부의 수크로스 에스테르 함량과 각각 비교하여 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배 만큼 증가될 수 있다. 적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 약 2배 내지 약 10배, 바람직하게는 약 3배 내지 약 10배, 적합하게는 약 3배 내지 약 5배 만큼 증가될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 방법 또는 용도는 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하도록 변형되지 않은 담배 식물 또는 이의 일부와 비교하여 그리고 보다 특히 도입된 억제의 부재 하에 담배 식물에 의한 발현과 비교하여, 또는 이에 비해 수크로스 에스테르 함량을 증가시킨다.
구체예에서, 담배 식물 또는 이의 일부는 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하도록 변형되지 않은 담배 식물 또는 이의 일부와 각각 비교하여 수크로스 에스테르 함량의 증가를 달성하도록 변형되었다.
본원에서 사용되는 용어 "변형시키는" 또는 "변형된"은 변경되거나 변화된 담배 식물을 의미한다. 본 발명은 식물의 유전자 변형 기술 또는 식물의 비-유전자 변형 기술을 사용하여 식물을 변형시키는 것을 포함한다. 그러한 방법은 당 분야에 잘 공지되어 있고 유전자 변형 기술의 예는 형질전환, 트랜스제닉, 시스제닉, 및 유전자 편집 방법을 포함한다. 비-유전자 변형 기술의 예는 고속-중성자 돌연변이유발, 화학 돌연변이유발 및 현대 집단 분석 접근법을 포함한다. 한 구체예에서, 용어 "변형시키는"은 억제된 디테르펜 합성 유전자를 지닌 천연 변이체를 선택하고 그 형질 또는 유전자를 상업적으로 바람직한 형질을 지닌 두 번째 식물로 번식시키는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "억제하는"(예를 들어, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는)은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현이 비슷한 생성물의 유전자 활성 또는 유전자의 발현에 비해 낮거나 감소되거나 또는 디테르펜 합성 유전자에 의해 생산된 단백질의 양 또는 활성이 낮은 것을 의미한다.
한 구체예에서, 본원에서 사용되는 용어 "억제하는"(예를 들어, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는)은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현이 비슷한 생성물의 유전자 활성 또는 유전자의 발현에 비해 낮은 것을 의미한다.
디테르펜 합성 유전자의 "활성" 또는 "기능"은 디테르펜의 생합성에서 기능하는 이의 능력과 관련이 있다. 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 기능은 디테르펜 합성의 직접 생성물을 측정함으로써, 즉, 디테르펜의 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 삼출물 성분은 잎 또는 잎 디스크를 아세토니트릴로 세척함으로써 측정될 수 있다. 세척물을 로터 증발기를 통해 농축하여 유성 잔류물을 생성한다. 이후 잔류물을 유도체화하여 트리-메틸 실릴(TMS) 에스테르를 형성할 수 있다(본원에 참조로서 포함된 문헌[Severson et al. 1985. J. Agric. Food Chem. 33, 870-875]에 기재된 바와 같음). 이후 TMS 유도체를 분리하고 질량 분석기와 커플링된 가스 크로마토그래피(GC-MS)로 분석할 수 있다. 용리된 화합물을 문헌[Wang et al. 2001(상술함, 본원에 참조로서 포함됨)]에 기재된 대로 이들의 체류 시간에 의해 그리고 MS 프로파일을 표준과 비교하여 확인할 수 있다. 한 구체예에서, 디테르펜 합성 유전자의 직접 생성물은 시스-아비에놀, α-CBT-올, β-CBT-올, α-CBT-디올, β-CBT-디올 또는 라브데네디올(Labdenediol)일 수 있다.
특정 디테르펜 합성 유전자의 활성은 유전자의 전사를 측정함으로써 측정될 수 있다. 전사를 측정하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 특히 노던 블롯(northern blot), RNA-Seq, 인 시튜 하이브리드화(in situ hybridization), DNA 마이크로어레이(DNA microarrays) 및 RT-PCR을 포함한다. 대안적으로, 유전자의 활성은 유전자 생성물, 예를 들어, 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 수준을 측정함으로써 간접적으로 측정될 수 있다.
유전자의 활성 또는 발현은 전사, 번역, 즉, 단백질 발현의 수준, 또는 디테르펜 합성 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 활성을 지칭할 수 있다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 유전자 발현은 전사 및/또는 번역을 억제함으로써 억제될 수 있다. 한 구체예에서, 유전자의 활성 또는 발현은, 전사 수준, 즉, 생산된 mRNA의 양, 또는 번역 수준, 즉, 생산된 단백질의 수준 또는 양을 지칭할 수 있다.
발현 및/또는 기능의 억제, 감소 또는 방지
디테르펜 합성 유전자의 발현 또는 기능을 억제 또는 감소 또는 방지하기 위한 당 분야에 공지된 임의의 방법이 본 방법에 사용될 수 있다.
예로서, 본 방법은:
· SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 11로 도시된 아미노산 서열 또는 이들과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에서의 돌연변이를 제공하고;
· SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 11로 도시된 아미노산 서열 또는 이들과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 발현을 제어하는데 기여하는 조절 영역(예를 들어, 프로모터 및 인핸서)에서의 돌연변이를 제공하고;
· SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 11로 도시된 아미노산 서열 또는 이들과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 수준을 감소시키는 안티센스 RNA, siRNA 또는 miRNA를 제공하는 것을 포함한다.
상기 접근법 각각은 SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 11로 도시된 아미노산 서열 또는 이들과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 발현 또는 기능의 감소 또는 방지를 발생시킨다.
본원에서 사용되는 용어 "돌연변이"는 천연 유전자 변이체 또는 공학처리된 변이체를 포함한다. 특히, 용어 "돌연변이"는 SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 11로 도시된 서열 또는 이들과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열과 비교하여 단백질의 발현 또는 기능을 감소시키는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열에서의 변이를 지칭한다.
바람직한 구체예에서, 식물에 존재하는 SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 11로 도시된 서열 또는 이들과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열의 각각의 카피는 본원에 정의된 대로 돌연변이된다(예를 들어, 식물에서 상기 단백질을 인코딩하는 유전자의 각각의 유전자 카피는 돌연변이된다). 예를 들어, N. 타바쿰의 이질사배체 유전체 중 유전자의 각각의 카피는 돌연변이될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 식물 또는 식물 세포는 돌연변이에 대해 동형접합체이다.
한 구체예에서, 바람직하게는 본 발명에 따른 식물 또는 식물 세포는 돌연변이된 핵산만을 발현시킨다. 다시 말해, 일부 구체예에서, 내인성(또는 내인성 및 기능성 단백질)은 본 발명에 따른 식물에 존재하지 않는다. 다시 말해, 임의의 내인성 단백질이 존재하는 경우, 이는 바람직하게는 비활성 및/또는 트렁케이션된 형태이다.
한 구체예에서, 본 방법은 SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 또는 SEQ ID No. 8로 도시된 서열 또는 이들과 적어도 70% 동일성을 갖는 핵산 서열에서 돌연변이를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
상기 돌연변이는 SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 11로 도시된 아미노산 서열 또는 이들과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 완전히 또는 부분적으로 결실되거나 달리 비-기능성이 되도록 식물 유전체를 변경시킬 수 있다.
상기 돌연변이는 SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 11로 도시된 아미노산 서열 또는 이들과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 방해할 수 있다.
상기 방해는 핵산 서열이 전사 및/또는 번역되지 않도록 할 수 있다.
핵산 서열은 단백질의 번역이 감소 또는 방지되도록, 예를 들어, 핵산 서열의 ATG 개시 코돈을 결실시키거나 달리 변형시킴으로써 방해될 수 있다.
핵산 서열은 단백질의 발현을 감소 또는 방지하거나 단백질 트래피킹(trafficking)에 영향을 주는 하나 이상의 뉴클레오티드 변화(들)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질의 발현은 하나 이상의 조기 정지 코돈의 도입, 틀 이동, 스플라이스 돌연변이체 또는 열린 해독틀 내 비-허용 아미노산 치환에 의해 감소되거나 방지될 수 있다.
조기 정지 코돈은 열린 해독틀에 정지 코돈을 도입하여 전체 아미노산 서열의 번역을 방지하는 돌연변이를 지칭한다. 조기 정지 코돈은 TAG("amber"), TAA("ochre"), 또는 TGA("opal" 또는 "umber") 코돈일 수 있다.
틀-이동 돌연변이(프레이밍 오류 또는 해독틀 이동이라고도 함)는 3으로 나눌 수 없는 핵산 서열의 다수의 뉴클레오티드의 인델(indels)(삽입 또는 결실)에 의해 야기된 돌연변이이다. 코돈에 의한 유전자 발현의 삼중항 성질로 인해, 삽입 또는 결실은 해독틀을 변화시켜, 원래와 완전히 다른 번역을 초래할 수 있다. 틀이동 돌연변이는 종종 다른 아미노산을 코딩하는 돌연변이 후 코돈의 해독을 일으킬 것이다. 틀이동 돌연변이는 일반적으로 조기 정지 코돈의 도입을 야기할 것이다.
스플라이스 돌연변이체는 성숙한 메신저 RNA로의 전구체 메신저 RNA의 처리 중에 스플라이싱(splicing)이 일어나는 특정 부위에서 다수의 뉴클레오티드를 삽입, 결실 또는 변화시킨다. 스플라이싱 부위의 결실은 성숙한 mRNA에 남아있는 하나 이상의 인트론을 발생시키고 이는 비정상적인 단백질의 생산으로 이어질 수 있다.
비-허용 아미노산 치환은 단백질의 감소되거나 제거된 기능을 초래하는 단백질의 비-동의 아미노산 치환을 일으키는 돌연변이를 지칭한다.
핵산 서열에 돌연변이를 제공하는 당 분야에 공지된 임의의 방법이 본 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상동성 재조합이 사용될 수 있는데, 여기서 관련 핵산 서열(들)을 돌연변이시키는 벡터가 생성되고 이를 사용하여 식물 또는 식물 세포를 형질전환한다. 이후 돌연변이된 서열을 발현하는 재조합 식물 또는 식물 세포를 선택할 수 있다.
한 구체예에서, 돌연변이는 SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 11로 도시된 아미노산 서열 또는 이들과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단백질에서 비-허용 아미노산 치환을 도입한다.
한 구체예에서, 돌연변이는 SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 11로 도시된 단백질 또는 이들과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열과 관련하여 단백질의 활성을 감소시킨다.
한 구체예에서, 돌연변이는 SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4 또는 SEQ ID No. 11로 도시된 단백질 또는 이들과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 서열과 관련하여 단백질의 수준 또는 발현은 변경시키지 않지만 활성을 감소시킨다.
핵산 서열은 전체적으로 또는 부분적으로 결실될 수 있다. 결실은 연속적일 수 있거나, 서열의 복수의 섹션을 포함할 수 있다. 결실은 바람직하게는 핵산 서열이 더 이상 기능성 단백질을 인코딩하지 않도록 충분한 양의 뉴클레오티드 서열을 제거한다. 결실은, 예를 들어, 핵산 서열의 코딩 부분의 적어도 50, 60, 70, 80 또는 90%를 제거할 수 있다.
결실은 디테르펜 합성 유전자의 하나 이상의 도메인을 제거할 수 있다. 결실은 전체일 수 있고, 이 경우 상응하는 유전체 비변형된 유사한 식물과 비교할 때, 핵산 서열의 코딩 부분의 100%가 부재한다.
식물에서 핵산 서열의 결실을 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 상동성 재조합이 사용될 수 있는데, 여기서 관련 핵산 서열(들)이 누락된 벡터가 생성되고 이를 사용하여 식물 또는 식물 세포를 형질전환한다. 이후 서열의 새로운 부분을 발현하는 재조합 식물 또는 식물 세포를 선택할 수 있다.
일부 구체예에서, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현은 본 발명에 따란 변형되지 않은 담배 식물에서의 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현과 비교하여 적어도 약 10% 20% 30%, 또는 40%, 적합하게는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 보다 적합하게는 적어도 약 80%, 90%, 95% 또는 100%만큼 억제되거나 감소될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 디테르펜 합성 유전자는 실질적으로 활성 또는 발현을 갖지 않을 수 있는데, 이는 식물이, 바람직하게는 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하도록 변형되지 않은 식물과 비교하여, 약 1% 미만(적합하게는, 약 0.1% 미만)의 활성 또는 발현을 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 디테르펜 합성 유전자는 디테르펜의 생산에 관여하는 임의의 유전자를 지칭한다. 적합하게는, 디테르펜 합성 유전자는 식물 디테르펜 합성 유전자이다. 그러한 유전자는 직접적으로 디테르펜을 생산하는 생합성 경로의 일부일 수 있거나, 예를 들어, 대사 전구체를 제공함에 의해 간접적으로 생합성 경로로 공급될 수 있다. 디테르펜 합성 유전자는 특수한(2차) 대사 또는 일반적인(1차) 대사에 관여할 수 있다. 한 구체예에서, 본원에서 사용되는 디테르펜 합성 유전자는 특수한(2차) 대사에 관여하는 유전자를 지칭한다. 적합하게는, 본 발명에서 사용되는 디테르펜 합성 유전자는 사이클라제 2 유전자(CYC2), CBTol 사이클라제 및 테르펜 신타제 3-8 또는 사이클라제 2 유전자(CYC2), CBTol 사이클라제, 또는 테르펜 신타제 3-8 중 어느 하나에 대한 상동체로 구성된 디테르펜 합성 유전자의 군으로부터 선택될 수 있다. 적합하게는, 본 발명에서 사용되는 디테르펜 합성 유전자는 사이클라제 2 유전자(CYC2), CBTol 사이클라제 및 테르펜 신타제 3-8로 구성된 디테르펜 합성 유전자의 군으로부터 선택될 수 있다.
적합하게는, 본 발명에서 사용되는 디테르펜 합성 유전자는 사이클라제 2 유전자(CYC2)이다. 적합하게는, 본 발명에서 사용되는 디테르펜 합성 유전자는 CBTol 사이클라제이다. 적합하게는, 본 발명에서 사용되는 디테르펜 합성 유전자는 테르펜 신타제 3-8이다.
한 구체예에서, 본원에서 지칭되는 디테르펜 합성 유전자는 사이클라제 2 유전자(CYC2)이고 하기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다:
i) SEQ ID No. 8 또는 SEQ ID No. 9로 본원에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는
ii) 기능성 단편이 디테르펜 합성 유전자를 인코딩하는 i)에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열의 기능성 단편, 또는
iii) SEQ ID No. 10으로 본원에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는
iv) 높은 엄격성 조건 하에 상기 i), ii) 또는 iii)에 교시된 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는
v) 상기 i), ii) 또는 iii)에 도시된 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%(바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%) 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는
vi) 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 i), ii) 또는 iii)에 도시된 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리뉴클레오티드 서열.
한 구체예에서, 본원에서 지칭되는 디테르펜 합성 유전자는 CBTol 사이클라제이고 하기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다:
i) SEQ ID No. 1으로 본원에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는
ii) 기능성 단편이 디테르펜 합성 유전자를 인코딩하는 i)에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열의 기능성 단편, 또는
iii) SEQ ID No. 2로 본원에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는
iv) 높은 엄격성 조건 하에 상기 i), ii) 또는 iii)에 교시된 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는
v) 상기 i), ii) 또는 iii)에 도시된 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%(바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%) 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는
vi) 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 i), ii) 또는 iii)에 도시된 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리뉴클레오티드 서열.
한 구체예에서, 본원에서 지칭되는 디테르펜 합성 유전자는 테르펜 신타제 3-8이고 하기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다:
i) SEQ ID No. 3으로 본원에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는
ii) 기능성 단편이 디테르펜 합성 유전자를 인코딩하는 i)에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열의 기능성 단편, 또는
iii) SEQ ID No. 4로 본원에 도시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는
iv) 높은 엄격성 조건 하에 상기 i), ii) 또는 iii)에 교시된 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는
v) 상기 i), ii) 또는 iii)에 도시된 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%(바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%) 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는
vi) 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 i), ii) 또는 iii)에 도시된 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리뉴클레오티드 서열.
한 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 디테르펜 합성 유전자는 담배 식물에 내인성일 수 있다.
본원에서 "내인성" 유전자에 대한 언급은 이의 자연 형태로 식물에서 발견되는(즉, 어떤 인간 개입 없이) 해당 유전자를 지칭할 뿐만 아니라, 후속하여 식물에 (재)도입된 분리된 형태의 동일한 유전자(또는 실질적으로 상동성 핵산/유전자)(트랜스진)도 지칭한다. 예를 들어, 그러한 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 식물은 트랜스진 발현의 실질적 감소 및/또는 내인성 유전자 발현의 실질적 감소를 겪을 수 있다. 분리된 유전자는 유기체로부터 분리되거나, 예를 들어, 화학 합성에 의한 인공적인 것일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 디테르펜 합성 유전자는 담배 식물에 외인성일 수 있다.
유전자가 본 발명에 따라 사용하기 위한 디테르펜 합성 유전자인지를 결정하기 위해, 당업자는 유전자가 디테르펜을 생산할 수 있는지 여부를 결정할 수 있다. 당업자는 본원에 상기 기술된 대로 디테르펜의 함량을 측정할 수 있다. 간단히 말해 디테르펜 함량을 측정하는 방법은 잎 또는 잎 디스크를 아세토니트릴로 세척하여 잎 또는 잎들로부터 삼출물을 수집하는 것을 포함할 수 있다. 이후 세척물로부터의 잔류물을 유도체화하여 트리-메틸 실릴(TMS) 에스테르를 형성할 수 있다(본원에 참조로서 포함되는 문헌[Severson et al. 1985 상술함]에 기술됨). 이후 TMS 유도체를 분리하고 질량 분석기와 커플링된 가스 크로마토그래피(GC-MS)로 분석할 수 있다. 용리된 화합물을 이들의 체류 시간에 의해 그리고 MS 프로파일을 표준과 비교하여 확인할 수 있다.
본 발명은 또한 식물의 수크로스 에스테르 함량을 증가시키기 위한 디테르펜 합성 유전자의 용도를 제공한다.
유전자 또는 유전자 생성물의 발현을 감소시키는 방법은 당 분야에 잘 기재되어 있다.
한 구체예에서, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 억제될 수 있다. 적합하게는, 사이클라제 2 유전자(CYC2), CBTol 사이클라제 및 테르펜 신타제 3-8로 구성된 디테르펜 합성 유전자의 군으로부터 선택된 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 억제될 수 있다. 적합하게는, 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 활성 또는 발현은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 억제될 수 있다. 적합하게는, CBTol 사이클라제의 활성 또는 발현은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 억제될 수 있다. 적합하게는, 테르펜 신타제 3-8의 활성 또는 발현은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 억제될 수 있다.
디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 방법은 RNA 간섭, 안티센스 또는 센스 공동-억제(본원에 참조로서 포함되는 문헌[Wang and Wagner 2003, Planta Volume 216, Issue 4, pp 686-691] 참조), 유전자 편집 또는 표적화 돌연변이유발을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현의 억제는 유전자-편집의 사용에 의해 달성될 수 있다. 유전자-편집은 당 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 몇 가지 비제한적인 예가 본원에 제시된다.
한 구체예에서, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현의 억제는 CRISPR-Cas9 시스템의 사용을 포함하여, CRISPR을 포함하는 유전자 편집 방법을 사용하여 달성될 수 있다. CRISPR/Cas9 유전체 편집 도구는 Clontech(Avenue du President Kennedy 78100 Saint-Germain-en-Laye, France)의 "가이드-잇(Guide-it)"과 같이 상업적으로 이용 가능하다.
유전자-편집의 또 다른 방법은 상업적으로 이용 가능한 키트(예를 들어, Addgene으로부터, 1Kendall Sq. Ste. B7102, Cambridge, MA 02139, USA)와 함께 사용되는 TALEN(전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제) 기술의 사용을 포함한다. 한 구체예에서, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현의 억제는 TALEN을 사용하여 달성될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 방법은 Sigma-Aldrich로부터 이용 가능한 CompoZr® 아연 핑거 뉴클레아제 기술과 같은 아연 핑거 뉴클레아제의 사용을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예는 문헌[Silva et al. Curr Gene Ther. Feb 2011; 11(1): 11-27(이의 교시는 본원에 참조로서 포함됨)]에 기술된 메가뉴클레아제의 사용(또는 추가 방법)을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 방법은 표적화 돌연변이유발일 수 있다. 표적화 돌연변이유발의 임의의 방법이 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 방법은 Keygene(Agro Business Park 90, 6708 PW Wageningen, The Netherlands)으로부터 이용 가능한 KeyBase®와 같은 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이유발(ODM)일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현의 억제는 작제물 또는 벡터(예를 들어, 플라스미드)의 사용에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 유전자 작제물은 숙주 세포에서 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하기에 적합할 수 있는 발현 카세트의 형태일 수 있다. 유전자 작제물은 벡터에 혼입되지 않고 숙주 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자일 수 있는 유전자 작제물은 리포솜 또는 바이러스 입자 내에 혼입될 수 있다. 대안적으로, 정제된 핵산 분자(예를 들어, 히스톤-비함유 DNA 또는 네이키드 DNA)를 적합한 수단, 예를 들어, 직접 세포내이입 흡수에 의해 숙주 세포에 직접 삽입할 수 있다. 유전자 작제물은 트랜스펙션, 감염, 미세주사, 세포 융합, 원형질체 융합 또는 탄도 충격(ballistic bombardment)에 의해 숙주 대상체(예를 들어, 식물)의 세포에 직접 도입될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 유전자 작제물은 입자 총을 사용하여 숙주 세포에 직접 도입될 수 있다.
대안적으로, 유전자 작제물은 적합한 숙주 세포에서의 발현을 위해 재조합 벡터를 포함하거나 재조합 벡터 내에 포함될 수 있다. 재조합 벡터는 플라스미드, 코스미드 또는 파지일 수 있다. 그러한 재조합 벡터는 숙주 세포를 본 발명의 유전자 작제물로 형질전환시키고, 그 안에서 발현 카세트를 복제하는데 매우 유용하다. 당업자는 본 발명의 유전자 작제물이 발현을 위해 많은 유형의 백본 벡터와 조합될 수 있음을 이해할 것이다. 백본 벡터는 이원 벡터, 예를 들어, E. 콜리(E. coli) 및 애그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 둘 모두에서 복제될 수 있는 벡터일 수 있다. 예를 들어, 적합한 벡터는 pBIN 플라스미드, 예를 들어, pBIN19(Bevan M., 1984, Nucleic Acids Research 12:8711-21)일 수 있다.
재조합 벡터는 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 서열 이외에 다양한 다른 기능적 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터를 포함할 수 있다. 또한, 재조합 벡터는 숙주 세포의 세포질에서 자율적으로 복제되도록 설계될 수 있다. 이 경우, DNA 복제를 유도하거나 조절하는 요소가 재조합 벡터에서 필요할 수 있다. 대안적으로, 재조합 벡터는 숙주 세포의 유전체에 통합되도록 설계될 수 있다. 이 경우, 표적화 통합(예를 들어, 상동성 재조합에 의한)을 선호하는 DNA 서열이 구상된다.
재조합 벡터는 또한 클로닝 과정에서 선택 가능한 마커로서 사용될 수 있는 유전자를 코딩하는 DNA를 포함할 수 있는데, 즉, 트랜스펙션되거나 형질전환된 세포의 선택을 가능하게 하고, 이종성 DNA가 혼입된 벡터를 보유하는 세포의 선택을 가능하게 하기 위해서이다. 상기 벡터는 코딩 서열의 발현 조절과 관련되거나, 숙주 세포의 특정 부분, 예를 들어, 트리콤 또는 샘 트리콤에 발현된 폴리펩티드를 표적화하기 위한 DNA를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 벡터는 선택 가능한 마커 유전자(예를 들어, 항생제 내성 유전자); 폴리펩티드 종결 신호; 및 단백질 표적화 서열(예를 들어, 수송 펩티드)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 방법 또는 용도는 RNAi를 사용하여 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 것을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, RNAi 방법은 miRNA, 예를 들어, 인공 마이크로-RNA(amiRNA)를 사용한다. 한 구체예에서, RNAi 방법은 siRNA를 사용한다. 한 구체예에서, RNAi 방법은 dsRNA를 사용한다.
한 구체예에서, 상기 방법 또는 용도는 간섭 올리고뉴클레오티드를 사용하여 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 것을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA 기반이다. 한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA 간섭(RNAi), 예를 들어, dsRNAi이다. 한 구체예에서, 상기 방법은 담배 식물의 세포를 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 RNAi 분자, 예를 들어, dsRNAi로 형질전환시키는 것을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 디테르펜 합성 유전자의 발현이 RNAi(예를 들어, dsRNAi)를 사용하여 억제되는 담배 식물 및 담배 식물 번식 물질이 제공된다. 상기 방법은 형질전환된 세포로부터 담배 식물을 재생시키는 것을 포함할 수 있다.
RNAi(예를 들어, dsRNAi) 분자는, 형질전환된 식물에서, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 RNAi 분자로 형질전환되지 않은 야생형 식물에서의 폴리펩티드의 농도와 비교하여 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상만큼, 또는 100%만큼 감소시킬 수 있다.
한 구체예에서, RNAi 분자는, 형질전환된 식물에서, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 30% 내지 100%, 바람직하게는 40% 내지 100%, 보다 바람직하게는 90% 내지 100%만큼 감소시킬 수 있다.
디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 억제될 수 있다. 적합하게는, 사이클라제 2 유전자(CYC2), CBTol 사이클라제 및 테르펜 신타제 3-8로 구성된 디테르펜 합성 유전자의 군으로부터 선택된 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 억제될 수 있다.
적합하게는, 상기 방법은 담배 식물의 세포를 세포의 내인성 경로에 의해 작거나 짧은 간섭 RNA(siRNA)로 처리되는 헤어핀 구조를 형성하는 RNA를 인코딩하는 ddRNAi DNA 작제물로 형질전환시키는 것을 포함할 수 있다.
적합하게는, 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 활성 또는 발현은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 억제될 수 있다. 한 구체예에서, 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 서열은 SEQ ID No. 8에 개시된다. 한 구체예에서, 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 서열은 SEQ ID No. 10에 개시된다. 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 발현은 CRISPR-Cas9 시스템을 포함하는 CRISPR을 포함하는 유전자 편집 방법, RNA 간섭(RNAi), 안티센스 또는 센스 공동-억제, 유전자 편집 또는 표적화 돌연변이유발을 포함하는 임의의 방법에 의해 억제될 수 있다. 한 구체예에서, 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 활성 또는 발현은 RNAi에 의해 억제될 수 있다. 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 활성 또는 발현은 miRNA, siRNA, dsRNA 또는 shRNA를 사용하여 RNAi에 의해 억제될 수 있다.
한 구체예에서, 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 활성 또는 발현을 억제하는 방법은 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 엑손 1의 적어도 일부, 엑손 2의 적어도 일부 및 엑손 3의 적어도 일부를 표적으로 한다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 엑손 1의 적어도 일부, 엑손 2의 적어도 일부 및 엑손 3의 적어도 일부를 표적으로 한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 엑손 1의 적어도 일부, 엑손 2의 적어도 일부 및 세 번째 엑손의 처음 115개 뉴클레오티드를 표적으로 한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 뉴클레오티드 1-25, 뉴클레오티드 26-271(엑손 1), 뉴클레오티드 1253-1529(엑손 2) 및 세 번째 엑손의 처음 115개 뉴클레오티드(뉴클레오티드 2366-2480)를 표적으로 하고, 이 때 넘버링은 SEQ ID No. 8과의 정렬에 의해 결정된다.
전술한 임의의 구체예에서, 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 활성 또는 발현은 CRISPR-Cas9 시스템의 사용을 포함하여, CRISPR를 포함하는 유전자 편집 방법을 사용하여 억제될 수 있다. 전술한 임의의 구체예에서, 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 활성 또는 발현은 RNAi 방법을 사용하여 억제될 수 있다.
적합하게는, CBTol 사이클라제 유전자의 활성 또는 발현은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 억제될 수 있다. 한 구체예에서, CBTol 사이클라제 유전자의 서열은 SEQ ID No. 1에 개시된다. 한 구체예에서, CBTol 사이클라제의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 2에 개시된다. CBTol 사이클라제 유전자의 발현은 CRISPR-Cas9 시스템을 포함하는 CRISPR을 포함하는 유전자 편집 방법, RNA 간섭(RNAi), 안티센스 또는 센스 공동-억제, 유전자 편집 또는 표적화 돌연변이유발을 포함하는 임의의 방법에 의해 억제될 수 있다. 한 구체예에서, CBTol 사이클라제 유전자의 활성 또는 발현은 RNAi에 의해 억제될 수 있다. CBTol 사이클라제 유전자의 활성 또는 발현은 miRNA, siRNA, dsRNA 또는 shRNA를 사용하여 RNAi에 의해 억제될 수 있다.
또 다른 구체예에서, CBTol 사이클라제 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 방법은 CBTol 사이클라제의 엑손 4의 적어도 일부, 인트론 4, 엑손 5, 인트론 5, 엑손 6, 인트론 6 및 엑손 7의 적어도 일부를 표적으로 한다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 CBTol 사이클라제 유전자의 엑손 4의 적어도 일부, 인트론 4, 엑손 5, 인트론 5, 엑손 6, 인트론 6 및 엑손 7의 적어도 일부를 표적으로 한다. 한 구체예에서, 상기 방법은 CBTol 사이클라제 유전자의 뉴클레오티드 5'-2854-4175-3'을 표적으로 하고, 이 때 넘버링은 SEQ ID No. 1과의 정렬에 의해 결정된다.
전술한 임의의 구체예에서, CBTol 사이클라제 유전자의 활성 또는 발현은 CRISPR-Cas9 시스템의 사용을 포함하여, CRISPR을 포함하는 유전자 편집 방법을 사용하여 억제될 수 있다. 전술한 임의의 구체예에서, CBTol 사이클라제 유전자의 활성 또는 발현은 RNAi 방법을 사용하여 억제될 수 있다.
적합하게는, 테르펜 신타제 3-8 유전자의 활성 또는 발현은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 억제될 수 있다. 한 구체예에서, 테르펜 신타제 3-8 유전자의 서열은 SEQ ID No. 3에 개시된다. 한 구체예에서, 테르펜 신타제 3-8의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 4에 개시된다. 테르펜 신타제 3-8 유전자의 발현은 CRISPR-Cas9 시스템을 포함하는 CRISPR을 포함하는 유전자 편집 방법, RNA 간섭(RNAi), 안티센스 또는 센스 공동-억제, 유전자 편집 또는 표적화 돌연변이유발을 포함하는 임의의 방법에 의해 억제될 수 있다. 한 구체예에서, 테르펜 신타제 3-8 유전자의 활성 또는 발현은 RNAi에 의해 억제될 수 있다. 테르펜 신타제 3-8 유전자의 활성 또는 발현은 miRNA, siRNA, dsRNA 또는 shRNA를 사용하여 RNAi에 의해 억제될 수 있다. 한 구체예에서, 테르펜 신타제 3-8 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 방법은 테르펜 신타제 3-8 유전자의 적어도 뉴클레오티드 1497 내지 1517을 표적으로 하고, 이 때 넘버링은 SEQ ID No. 3와의 정렬에 의해 결정된다. 한 구체예에서, 테르펜 신타제 3-8 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 방법은 테르펜 신타제 3-8 유전자의 적어도 뉴클레오티드 884 내지 904를 표적으로 하고, 이 때 넘버링은 SEQ ID No. 3와의 정렬에 의해 결정된다. 바람직한 구체예에서, RNAi 방법은 테르펜 신타제 3-8 유전자의 뉴클레오티드 884 내지 904를 표적으로 하고, 이 때 넘버링은 SEQ ID No. 3와의 정렬에 의해 결정된다.
전술한 임의의 구체예에서, 테르펜 신타제 3-8 유전자의 활성 또는 발현은 CRISPR-Cas9 시스템의 사용을 포함하여, CRISPR을 포함하는 유전자 편집 방법을 사용하여 억제될 수 있다. 전술한 임의의 구체예에서, 테르펜 신타제 3-8 유전자의 활성 또는 발현은 RNAi 방법을 사용하여 억제될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 방법은 담배 식물의 세포를 전달 벡터 내로 패키징된, dsRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 amiRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA-유도 RNA 간섭(ddRNAi) 작제물로 형질전환시키는 것을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, RNAi 분자는 ddRNAi DNA 작제물에 의해 인코딩된 dsRNA이다.
한 구체예에서, RNAi 분자는 ddRNAi DNA 작제물에 의해 인코딩된 amiRNA이다. 한 구체예에서, 본 발명은 디테르펜 합성 유전자의 발현을 억제하는 dsRNA를 인코딩하도록 설계된 ddRNAi DNA 서열을 포함하는 작제물을 제공한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 디테르펜 합성 유전자의 발현을 억제하는 amiRNA를 인코딩하도록 설계된 ddRNAi DNA 서열을 포함하는 작제물을 제공한다.
작제물은 벡터 내에 포함될 수 있다. 적합하게는, 벡터는 플라스미드일 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 사용하기 위한 벡터는 애그로박테리움-기반 플라스미드 pKYLX71:35S2이다. 이 플라스미드는 An 등이 기술한 pGA471 플라스미드에 기반한다(본원에 참조로서 포함되는 An, G. et al. 1985 EMBO J. 4, 277-284). 또 다른 구체예에서, 본 발명에 사용하기 위한 벡터는 pCAMBIA2300이다. pCAMBIA 벡터 백본은 pPZP 벡터로부터 유래된다.
본원에서 사용되는 용어 "DNA-유도 RNA 간섭(ddRNAi)"은 세포의 내인성 RNA 간섭(RNAi) 경로를 활성화시키는데 사용되는 DNA 작제물을 의미한다. 적합하게는, 이들 작제물은 일단 처리되면 표적 유전자 또는 유전자들의 침묵을 유발하는 자가-보완적 RNA, 예를 들어, 이중 가닥 RNA(dsRNA) 또는 단일 가닥 RNA(ssRNA) 또는 짧은-헤어핀 RNA(shRNA) 또는 마이크로 RNA(예를 들어, 인공 마이크로 RNA - amiRNA)를 발현하도록 설계된다. 유리하게는 ddRNAi의 사용은 발현된 RNA(예를 들어, dsRNA 또는 amiRNA)가 지속적으로 생산됨으로써 표적화된 유전자의 장기간 침묵을 제공할 수 있음을 의미한다. 대조적으로, 세포에 직접 투여되는 작은 간섭 RNA(예를 들어, 본 발명에 따라 ddRNAi DNA 작제물로부터 연속적으로 발현되지 않음)는 세포 내에서 회전하여(turn over) 유전자를 단지 일시적으로 침묵시킨다.
한 구체예에서, 상기 방법 또는 용도는 ddRNAi DNA 작제물로부터 발현되는 dsRNA를 사용하여 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 방법 또는 용도는 ddRNAi DNA 작제물로부터 발현되는 amiRNA를 사용하여 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 것을 포함할 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 디테르펜 합성 유전자의 발현이 ddRNAi DNA 작제물을 사용하여 억제된 담배 식물 및 담배 식물 번식 물질, 담배 잎, 절단하여 수확된 잎, 가공된 담배 잎 또는 절단하여 가공된 담배 잎이 제공된다. 적합하게는, ddRNAi DNA 작제물은 식물의 유전체 DNA 내에 혼입될 수 있다. 담배 식물, 담배 식물 번식 물질, 담배 잎, 절단하여 수확된 잎, 가공된 담배 잎 또는 절단하여 가공된 담배 잎은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 dsRNA 또는 amiRNA를 발현하는 ddRNAi DNA 작제물을 포함할 수 있다. 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 dsRNA 또는 amiRNA를 발현하는 ddRNAi DNA 작제물을 포함하는 담배 식물, 담배 식물 번식 물질, 담배 잎, 절단하여 수확된 잎, 가공된 담배 잎 또는 절단하여 가공된 담배 잎은 ddRNAi DNA 작제물을 포함하지 않는 담배 식물, 담배 식물 번식 물질, 담배 잎, 절단하여 수확된 잎, 가공된 담배 잎 또는 절단하여 가공된 담배 잎과 비교하여 증가된 수크로스 에스테르 함량을 가질 수 있다.
ddRNAi DNA 작제물은 디테르펜 합성 유전자의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 상기 작제물은 디테르펜 합성 유전자의 엑손 및/또는 인트론을 포함할 수 있다. ddRNAi DNA 작제물은 전사될 때 헤어핀 RNA 구조를 생산하는 부분적인 유전자 서열을 포함할 수 있다. ddRNAi DNA 작제물에 의해 인코딩된 RNA는 인트론-헤어핀 또는 GUS-헤어핀 구조를 가질 수 있거나, 단일 전장 RNA일 수 있다. 본원에 기재된 대로, 본 발명자들은 담배 식물에서 수크로스 에스테르 함량을 증가시키는데 사용하기 위한 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 RNAi 분자의 놀라운 효능을 입증하였다.
본원에서 사용되는 용어 "엑손"은 인트론이 RNA 스플라이싱에 의해 제거된 후에 유전자에 의해 생산된 최종 성숙 RNA를 인코딩하는 유전자의 일부를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "인트론"은 최종 RNA 생성물의 성숙 중에 RNA 스플라이싱에 의해 제거되는 유전자 내의 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "~의 적어도 일부" 또는 "부분적인 서열"은 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 400 또는 적어도 500개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 의미한다. 예를 들어, ddRNAi DNA 작제물은 엑손의 적어도 일부를 포함할 수 있고, 이 때 상기 작제물은 상기 엑손으로부터의 100개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "~에 상응하는 mRNA"는 RNA가 DNA와 동일한 서열을 갖는 것을 의미하고, 즉, 뉴클레오티드의 서열은 RNA에서, 티민(T)이 우라실(U)로 대체되고, 데옥시리보스가 리보스로 치환되는 것을 제외하면 mRNA 및 DNA 서열 둘 모두에서 동일하다.
ddRNAi DNA 작제물은 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 서열은 SEQ ID No. 8에 개시된다. 한 구체예에서, 사이클라제 2 유전자(CYC2)에 인코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 10에 개시된다. 적합하게는, ddRNAi DNA 작제물은 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, ddRNAi DNA 작제물은 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 엑손 1의 적어도 일부, 엑손 2의 적어도 일부 및 엑손 3의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 적합하게는, ddRNAi DNA 작제물은 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 엑손 1의 적어도 일부, 엑손 2의 적어도 일부 및 세 번째 엑손의 처음 115개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 적합하게는, ddRNAi DNA 작제물은 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 뉴클레오티드 1-25, 뉴클레오티드 26-271(엑손 1), 뉴클레오티드 1253-1529(엑손 2) 및 세 번째 엑손의 처음 115개 뉴클레오티드(뉴클레오티드 2366-2480)를 포함할 수 있고, 이 때 넘버링은 SEQ ID No. 8과의 정렬에 의해 결정된다. 적합하게는, ddRNAi DNA 작제물은 SEQ ID No. 5에 개시된 서열을 포함할 수 있다.
ddRNAi DNA 작제물은 CBTol 사이클라제 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다. 한 구체예에서, CBTol 사이클라제 유전자의 서열은 SEQ ID No. 1에 개시된다. 한 구체예에서, CBTol 사이클라제의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 2에 개시된다. 적합하게는, ddRNAi DNA 작제물은 CBTol 사이클라제 유전자의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, ddRNAi DNA 작제물은 CBTol 사이클라제 유전자의 엑손 4의 적어도 일부, 인트론 4, 엑손 5, 인트론 5, 엑손 6, 인트론 6 및 엑손 7의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 적합하게는, ddRNAi DNA 작제물은 CBTol 사이클라제 유전자의 뉴클레오티드 5'-2854-4175-3'을 포함할 수 있고, 이 때 넘버링은 SEQ ID No. 1과의 정렬에 의해 결정된다. 적합하게는, ddRNAi DNA 작제물은 SEQ ID No. 6에 개시된 서열을 포함할 수 있다.
ddRNAi DNA 작제물은 테르펜 신타제 3-8 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다. 적합하게는, ddRNAi DNA 작제물은 테르펜 신타제 3-8 유전자의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 적합하게는, ddRNAi DNA 작제물은 테르펜 신타제 3-8 유전자의 적어도 뉴클레오티드 1497 내지 1517을 포함할 수 있고, 이 때 넘버링은 SEQ ID No. 3과의 정렬에 의해 결정된다. 한 구체예에서, 테르펜 신타제 3-8 유전자의 서열은 SEQ ID No. 3에 개시된다. 한 구체예에서, 테르펜 신타제 3-8의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 4에 개시된다. 적합하게는, ddRNAi DNA 작제물은 SEQ ID No. 7에 개시된 서열을 포함할 수 있다. 적합하게는, ddRNAi DNA 작제물은 테르펜 신타제 3-8 유전자의 적어도 뉴클레오티드 884 내지 904를 포함할 수 있고, 이 때 넘버링은 SEQ ID No. 3과의 정렬에 의해 결정된다. 적합하게는, ddRNAi DNA 작제물은 SEQ ID No. 11에 개시된 서열을 포함할 수 있다.
dsRNA를 인코딩하는 ddRNAi DNA 작제물의 서열은 한 구체예에서 SEQ ID No.7에 개시된 서열을 포함할 수 있다. SEQ ID No.7을 포함하는 ddRNAi DNA 작제물로부터 발현된 dsRNA는 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하거나 디테르펜 합성 유전자를 하향조절하는데 사용될 수 있고, 이 때 디테르펜 합성 유전자는 사이클라제 2 유전자(CYC2)이다.
dsRNA를 인코딩하는 ddRNAi DNA 작제물의 서열은 또 다른 구체예에서 SEQ ID No.8에 개시된 서열을 포함할 수 있다. SEQ ID No.8을 포함하는 ddRNAi DNA 작제물로부터 발현된 dsRNA는 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하거나 디테르펜 합성 유전자를 하향조절하는데 사용될 수 있고, 이 때 디테르펜 합성 유전자는 CBTol 사이클라제 유전자이다.
amiRNA를 인코딩하는 ddRNAi DNA 작제물의 서열은 한 구체예에서 SEQ ID No.9에 개시된 서열을 포함할 수 있다. SEQ ID No.9을 포함하는 ddRNAi DNA 작제물로부터 발현된 amiRNA는 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하거나 디테르펜 합성 유전자를 하향조절하는데 사용될 수 있고, 이 때 디테르펜 합성 유전자는 테르펜 신타제 3-8 유전자이다.
본원에서 사용되는 "GW1" 또는 "GW-1"은 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 엑손 1의 적어도 일부, 엑손 2의 적어도 일부 및 세 번째 엑손의 처음 115개 뉴클레오티드를 포함하는 ddRNAi DNA 작제물을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "GW2" 또는 "GW-2"는 테르펜 신타제 3-8 유전자의 적어도 뉴클레오티드 1497 내지 1517을 포함하는 ddRNAi DNA 작제물을 의미할 수 있고, 이 때 넘버링은 SEQ ID No. 3와의 정렬에 의해 결정된다.
본원에서 사용되는 용어 "GW3" 또는 "GW-3"는 CBTol 사이클라제 유전자의 엑손 4의 적어도 일부, 인트론 4, 엑손 5, 인트론 5, 엑손 6, 인트론 6 및 엑손 7의 적어도 일부를 포함하는 ddRNAi DNA 작제물을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "GW5" 또는 "GW-5"는 테르펜 신타제 3-8 유전자의 적어도 뉴클레오티드 884 내지 904를 포함하는 ddRNAi DNA 작제물을 의미할 수 있고, 이 때 넘버링은 SEQ ID No. 3와의 정렬에 의해 결정된다.
따라서, 본 발명의 ddRNAi DNA 작제물은 dsRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 상기 dsRNA 인코딩 서열은 실질적으로 SEQ ID No. 5 또는 8에 개시된 뉴클레오티드 서열 또는 기능성 변이체, 또는 이의 단편이다.
적합하게는, 본 발명의 ddRNAi DNA 작제물은 dsRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 상기 dsRNA 인코딩 서열은 실질적으로 SEQ ID No. 5에 개시된 뉴클레오티드 서열 또는 기능성 변이체, 또는 이의 단편이다.
적합하게는, 본 발명의 ddRNAi DNA 작제물은 dsRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 상기 dsRNA 인코딩 서열은 실질적으로 SEQ ID No. 6에 개시된 뉴클레오티드 서열 또는 기능성 변이체, 또는 이의 단편이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 ddRNAi DNA 작제물은 amiRNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 상기 amiRNA 인코딩 서열은 실질적으로 SEQ ID No.9에 개시된 뉴클레오티드 서열이다.
디테르펜 합성 유전자의 발현을 억제하거나 하향-조절하도록 여전히 기능하여, 담배 식물의 수크로스 함량을 증가시킬 ddRNAi DNA 작제물의 변이체 또는 단편을 생성하기 위해 당업자가 dsRNA(예를 들어, SEQ ID No.7) 또는 amiRNA(예를 들어, SEQ ID No.9)를 인코딩하는 서열을 변형시키는 것은 비교적 간단할 것임이 이해될 것이다. ddRNAi DNA 작제물의 기능성 변이체 및 단편은, 표준 실험 기술을 사용하여 디테르펜 합성 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 수준이 동일한 조건 하에 성장한 상응하는 야생형 식물 세포에서의 동일한 디테르펜 합성 유전자 mRNA의 수준 이하로 감소되었는지 여부를 결정함으로써 용이하게 확인될 수 있다. 그러한 기술의 예는 중합효소 연쇄 반응(PCR)이다. 당업자는 디테르펜 합성 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 농도가 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 형광-활성화 세포 분류, 웨스턴 블롯팅 또는 염색질 면역침전(ChIP)과 같은 표준 기술을 사용하여 야생형 및 트랜스제닉 식물에서 직접 측정될 수 있음을 이해할 것이다.
또 다른 구체예에서, 담배 세포, 담배 식물 또는 이의 일부, 및/또는 식물 번식 물질은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 작제물을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 작제물은 ddRNAi DNA 작제물이고, 보다 바람직하게는 ddRNAi DNA 작제물은 사이클라제 2 유전자(CYC2), CBTol 사이클라제 유전자 또는 테르펜 신타제 3-8 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 RNAi 모듈을 포함한다.
추가 구체예에서, 담배 세포, 담배 식물 또는 이의 일부 및/또는 식물 번식 물질을 하기를 포함할 수 있다:
i) SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 또는 SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 11로 본원에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열 또는
ii) 기능성 단편이 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 i)에 도시된 폴리뉴클레오티드 서열의 단편, 또는
iii) 상기 i), 또는 ii)에 도시된 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%(바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 90%) 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열.
한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 또는 SEQ ID No. 7, 또는 SEQ ID No. 11와 적어도 80% 동일성을 가질 수 있다. 적합하게는, 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 또는 SEQ ID No. 7, 또는 SEQ ID No. 11와 적어도 90% 동일성을 가질 수 있다. 적합하게는, 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 또는 SEQ ID No. 7, 또는 SEQ ID No. 11와 적어도 95% 동일성(보다 적합하게는 적어도 99% 동일성)을 가질 수 있다.
유리한 구체예에서, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현의 억제는 담배 식물의 수크로스 에스테르 함량을 증가시키는 동시에 담배 식물의 하나 이상의 다른 향미 성분을 변경시킬 수 있다. 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현의 억제는 수크로스 에스테르 함량을 증가시키고 디테르펜 함량을 변경시킬 수 있다. 수크로스 에스테르 함량의 증가는 시스-아비에놀, 라브데네디올 및 CBT-올 함량으로 구성된 군으로부터 선택되는 향미 화합물 중 하나 이상의 증가를 동반할 수 있다.
수크로스 에스테르 함량의 증가는 시스-아비에놀 함량의 증가 및 라브데네디올 함량의 증가를 동반할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 수크로스 에스테르 함량의 증가는 라브데네디올 함량의 증가를 동반할 수 있다. 수크로스 에스테르 함량의 증가는 CBT-올 및 높은 시스-아비에놀 함량의 증가를 동반할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 방법은 터키-유사 삼출물 화학을 갖는 벌리(Burley) 또는 열건된 잎을 생성한다. 바람직하게는 벌리 또는 열건된 잎은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현이 억제되지 않은 비교되는 벌리 또는 열건된 식물보다 터키-유사 담배와 더욱 유사한 화학을 갖는다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부는 본 발명에 따라 변형된 벌리 또는 열건된 식물이다. 한 구체예에서, 본 발명은 터키-유사 삼출물 화학을 갖도록 본 발명에 따라 변형된 벌리 또는 열건된 식물에 관한 것이다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 담배 식물(예를 들어, 변형된 담배 식물)은 오리엔탈 또는 터키 담배 식물이 아니다.
한 구체예에서, 담배 식물 또는 이의 일부는 큐어링된다. 한 구체예에서, 담배 식물 또는 이의 일부는 큐어링되며, 예를 들어, 풍건, 열건, 화건 또는 양건된다. 추가 양태에서, 담배 식물 또는 이의 일부는 열건된다. 추가 양태에서, 담배 식물 또는 이의 일부는 풍건된다.
열건은 당 분야에 잘 알려져 있고 화이어 박스 또는 가스 연료 시스템에 의해 공급된 굴뚝으로 담배를 큐어링하는 공정을 지칭한다. 이 공정은 담배를 연기에 노출시키지 않고, 큐어링 과정 동안 온도를 천천히 올리면서 담배를 열-큐어링한다. 이 방법은 당이 높고 중간 내지 높은 수준의 니코틴을 갖는 담배를 생산한다. 스미스 담배 헛간은 전통적인 열건 담배 헛간의 예이다.
풍건된 담배는 벌리, 메릴랜드, 및 다크 담배를 포함한다. 공통 인자는 큐어링에 주로 열 및 습도의 인위적 공급원이 없다는 것이다. 벌리 담배는 색이 옅거나 진한 갈색이고, 기름이 많고, 당이 적다. 벌리 담배는 헛간에서 풍건된다. 주요 벌리 생산 국가는 아르헨티나, 브라질, 이탈리아, 말라위, 및 미국이다. 벌리 담배 식물은, 예를 들어, Clay 402, Clay 403, Clay 502, Ky 14, Ky 907, Ky 910, Ky 8959, NC 2, NC 3, NC 4, NC 5, NC 2000, TN 86, TN 90, TN 97, R 610, R 630, R711, R 712, NCBH 129, Bu 21xKy 10, HB04P, Ky 14xL 8, Kt 200, Newton 98, Pedigo 561, Pf561 및 Va 509를 포함한다.
메릴랜드 담배는 매우 푹신하고, 좋은 연소 성질, 낮은 니코틴 및 중성 방향을 갖는다. 주요 메릴랜드 생산 국가는 미국 및 이탈리아를 포함한다. 다크 풍건된 담배는 주로 발효 과정에 의해 다른 유형과 구별되는데, 이 과정은 다크 풍건된 담배에 중간- 내지 어두운-갈색 및 뚜렷한 방향을 제공한다. 이들의 잎은 낮은 당 함량과 높은 니코틴 함량을 갖는다. 다크 풍건된 담배는 주로 씹는 담배와 스누프(snuff)의 생산에 사용된다. 다크 풍건된 담배의 주요 재배 지역은 테네시, 켄터키, 및 버지니아(미국)이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 담배는 적어도 터키-유사 담배만큼 많은 3-메틸 발레레이트 아세틸화된 수크로스 에스테르를 함유한다.
"터키-유사 삼출물 화학"은 본 발명의 식물에 의해 생산되는 삼출물이 터키 담배에서 관찰되는 것과 유사한 삼출물 화학을 갖는다는 것을 의미한다. 터키(또는 오리엔탈) 담배, 예를 들어, N. 타바쿰 변이체 삼순(N. tabacum var. Samsun)의 화학은 문헌[R. Severson et al. 1985(상술함, 본원에 참조로서 포함됨)에 의해 특성화되었다. 터키 담배는 낮은 수준의 CBT-디올, 높은 수준의 CBT 산화 생성물 및 높은 수준의 3-메틸발레르산 함유 수크로스 에스테르를 함유하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명은 유리하게는 터키 담배-유사 트리콤 삼출물을 갖는 보다 높은 바이오매스 담배 식물을 제공한다.
한 구체예에서, 증가된 3-메틸 발레레이트 수크로스 에스테르를 포함하는 담배 식물이 제공된다. 상기 담배 식물은 본 발명에 따라 변형되지 않은 담배 식물, 즉, 디테르펜 합성 유전자의 억제가 도입되지 않은 식물과 비교하여 증가된 3-메틸 발레레이트 수크로스 에스테르를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 담배 계통은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하도록 변형되지 않은 대조군 담배 식물보다 적어도 2배 많은 3-메틸 발레레이트 수크로스 에스테르를 함유한다. 추가 양태에서, 본 발명의 담배 식물은 적어도 터키 타입 담배만큼 많은 3-메틸 발레레이트를 함유한다.
유리하게는, 본 발명의 담배 식물은 필드에서 정상적인 성장을 한다. 한 구체예에서, CBTol 신타제 녹다운 식물은 유리하게는 터키 담배만큼 낮은 CBT디올, 높은 시스-아비에놀, 높은 3-메틸 발레르산 함유 수크로스 에스테르를 갖지만, 터키 타입과 달리, 본 발명의 CBTol 신타제 녹다운 식물은 터키 담배 식물보다 높은 바이오매스를 생산할 수 있다. 터키 담배 타입의 경우, 수확량은 전형적으로 600 내지 1100 lbs/에이커의 범위이다.
본원에서 사용되는 용어 "기능성 단편"은 폴리뉴클레오티드와 동일한 방식으로 기능할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 일부를 지칭한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드가 디테르펜 합성 유전자인 경우, 기능성 단편은 디테르펜 합성 유전자로서 기능할 수 있어야 하고, 예를 들어, 기능성 단편은 디테르펜 합성 유전자의 활성을 유지한다. 기능성 단편은 전장 폴리뉴클레오티드의 활성 수준과 동등하거나 보다 큰 활성 수준을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 dsRNA 또는 amiRNA를 인코딩하는 경우, 기능성 단편은 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제할 수 있어야 한다.
한 구체예에서, 기능성 단편은 적어도 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 본원에 논의된 디테르펜 합성 유전자의 부분일 수 있다. 일부 구체예에서, 기능성 단편은 본원에 논의된 디테르펜 합성 유전자의 적어도 150개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 기능성 단편이 ddRNAi DNA 작제물의 기능성 단편인 경우, 기능성 단편은 적어도 50, 75, 100, 150, 200 또는 250개 인접 뉴클레오티드를 포함하는 본원에 논의된 RNAi의 부분일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "유전자 코드의 축퇴성"은 아미노산을 특정하는 3개-코돈 조합의 다양성으로서 나타나는 폴리펩티드 서열을 인코딩하는 코돈의 중복성을 지칭한다. 예를 들어, 이소류신 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 mRNA 분자에서, 이소류신은 AUU, AUC 또는 AUA에 의해 인코딩될 수 있다. 이는 RNA를 인코딩하는 DNA 분자가 다중 서열을 가질 수 있지만 생성된 폴리펩티드는 동일한 서열을 가질 것임을 의미한다. 즉, 다형성 뉴클레오티드 서열이 동일한 폴리펩티드 생성물을 인코딩할 수 있다. 이는 하나의 핵산 서열이 동일한 폴리펩티드 서열을 인코딩하면서 제2 서열에 대해 매우 낮은 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 방법 및 용도는 적어도 하나의 디테르펜 합성 유전자의 억제를 포함한다. 상기 억제는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 프로모터가 제공될 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 프로모터는 항시적 프로모터, 노화-특이적 프로모터, 조직-특이적 프로모터, 발달-조절 프로모터 및 유도성 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 한 구체예에서, 프로모터는 항시적 프로모터일 수 있다.
유전자가 모든 세포 유형에서 동일한 수준으로 발현되지 않을 수 있지만, 항시적 프로모터는 식물 발달 동안 식물의 여러 부분에 걸쳐 지속적으로 유전자의 발현을 지시한다. 공지된 항시적 프로모터의 예는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 전사체(Odell JT, Nagy F, Chua NH. (1985). Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter, Nature. 313 810-2) 및 쌀 액틴 1 유전자(Zhang W, McElroy D, Wu R. (1991), 본원에 참조로서 포함됨. Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants. (Plant Cell 3 1155-65, 본원에 참조로서 포함됨.) 및 옥수수 유비퀴틴 1 유전자(Cornejo MJ, Luth D, Blankenship KM, Anderson OD, Blechl AE. (1993). Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice. Plant Molec. Biol. 23 567-81(본원에 참조로서 포함됨))와 관련된 것들을 포함한다. 카네이션 윤문 바이러스(CERV) 프로모터와 같은 항시적 프로모터(Hull R, Sadler J, LongstaffM (1986 본원에 참조로서 포함됨). The sequence of carnation etched ring virus DNA: comparison with cauliflower mosaic virus and retroviruses. EMBO Journal, 5(2):3083-3090) 본원에 참조로서 포함됨).
항시적 프로모터는 카네이션 윤문 바이러스(CERV) 프로모터, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV 35S 프로모터), 쌀 액틴 1 유전자 또는 옥수수 유비퀴틴 1유전자로부터의 프로모터로부터 선택될 수 있다. 적합하게는, 프로모터는 CERV 프로모터일 수 있다.
대안적으로, 일부 구체예에서, 프로모터는 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV 35S 프로모터)가 아닐 수 있다. 한 구체예에서, 프로모터는 노화-특이적 프로모터일 수 있다. "노화-특이적 프로모터"(SAG)는 노화-관련 유전자의 발현을 조절하는 것과 관련된 프로모터일 수 있다. 따라서, 상기 프로모터는 실질적으로 오직 노화 조직에서만 작동 가능하게 연결된 코딩 서열(즉, 유전자)의 발현을 제한할 수 있다. 따라서, 노화-특이적 프로모터는 식물 조직이 노화를 겪는 경우에만 실질적으로 3' 단백질-코딩 영역의 발현이 일어나도록 하는 발달-조절 방식으로 식물 조직에서 유전자 발현을 우선적으로 촉진할 수 있는 프로모터일 수 있다. 노화는 오래된 잎과 같이 식물의 더 오래된 부분에서 발생하는 경향이 있고, 종자와 같은 식물의 어린 부분에서는 발생하지 않는 것이 이해될 것이다.
수많은 노화-관련 유전자를 발현하는 것으로 알려진 식물의 한 예는 아라비돕시스이다. 따라서, 프로모터는 아라비돕시스의 노화-관련 유전자로부터 분리될 수 있다. 본원에 참조로서 포함된 Gepstein 등(The Plant Journal, 2003, 36, 629-642)은 아라비돕시스를 모델로 사용하여 SAG 및 이들의 프로모터에 대한 상세한 연구를 수행하였다. 유전자 작제물은 이 문서에 기술된 임의의 SAG로부터의 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 프로모터는 SAG12, SAG13, SAG101, SAG21 및 SAG18, 또는 이의 기능성 변이체 또는 기능성 단편으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
한 구체예에서, 상기 프로모터는 SAG12 또는 SAG13 프로모터일 수 있다. 한 구체예에서, 프로모터는 당업자에게 공지된 SAG12 프로모터, 또는 이의 기능성 변이체 또는 단편일 수 있다(Gan & Amasino, 1997, Plant Physiology, 113: 313-319, 본원에 참조로서 포함됨). 적합한 프로모터 및 이의 서열은 WO2010/097623호에서 찾아볼 수 있다(본원에 참조로서 포함됨).
또 다른 구체예에서, 상기 프로모터는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. 조직-특이적 프로모터는 식물의 한(또는 몇 개) 부분에서, 일반적으로 그러한 식물 부분의 수명을 통틀어, 유전자의 발현을 지시하는 프로모터이다. 조직-특이적 프로모터의 카테고리는 또한 일반적으로 특이성이 절대적이지 않은 프로모터를 포함하고, 즉, 이들은 또한 선호되는 조직 이외의 조직에서 보다 낮은 수준의 발현을 유도할 수 있다. 다수의 조직-특이적 프로모터가 당 분야에 공지되어 있고 감자 괴경에서 발현되는 파타틴 유전자 및 밀, 보리 또는 옥수수 배유에서 발현되는 고 분자량 글루테닌 유전자와 관련된 것들을 포함한다. 이들 프로모터 중 임의의 프로모터가 본 발명에서 이용될 수 있다.
적합하게는, 조직-특이적 프로모터는 잎-특이적 프로모터일 수 있다. 적합하게는, 잎-특이적 프로모터는 ASYMMETRIC LEAVES 1(AS1)을 포함할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 조직-특이적 프로모터는 뿌리-특이적 프로모터가 아니다.
또 다른 구체예에서, 상기 프로모터는 발달-조절된 프로모터일 수 있다. 발달-조절된 프로모터는 식물 발달 중 특정 시간에 식물의 하나 이상의 부분에서 유전자 발현의 변화를 지시한다. 상기 유전자는 그 식물 부분에서 다른 시간에 상이한(보통 더 낮은) 수준으로 발현될 수 있고, 다른 식물 부분에서도 발현될 수 있다.
한 구체예에서, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터는 유도제에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 유도제의 부재 하에 유전자는 발현되지 않을 것이다. 유도제는 프로모터 서열에 직접 작용할 수 있거나, 리프레서 분자의 효과에 대응함으로써 작용할 수 있다. 유도제는 대사산물, 단백질, 성장 조절제, 또는 독성 원소와 같은 화학 제제, 열, 상처, 또는 삼투압과 같은 생리학적 스트레스, 또는 병원체 또는 해충의 작용의 간접적인 결과일 수 있다. 발달-조절된 프로모터는 식물에 의해 생산된 내인성 유도제 또는 식물의 생명 주기의 특정 시점에서의 환경 자극에 반응하는 특수한 유형의 유도성 프로모터로서 기술될 수 있다. 공지된 유도성 프로모터의 예는 본원에 참조로서 포함된 문헌[Warner SA, Scott R, Draper J. (1993) (Isolation of an asparagus intracellular PR gene (AoPR1) wound-responsive promoter by the inverse polymerase chain reaction and its characterization in transgenic tobacco. Plant J. 3 191-201.)]에 기술된 바와 같이 상처 반응과 관련된 것들, 본원에 참조로서 포함된 문헌[Benfey & Chua (1989) (Benfey, P.N., and Chua, N-H. (1989) Regulated genes in transgenic plants. Science 244 174-181)]에 기술된 바와 같이 온도 반응과 관련된 것들, 및 본원에 참조로서 포함된 문헌[Gatz (1995) (Gatz, C. (1995) Novel inducible/repressible gene expression systems. Methods in Cell Biol. 50 411-424)]에 기술된 바와 같이 화학적으로 유도되는 것들을 포함할 수 있다.
따라서, 한 구체예에서, 프로모터는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다: CERV 프로모터, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터(전체 또는 트렁케이션됨), 루비스코 프로모터, 완두 플라스토시아닌 프로모터, 노팔린 신타제 프로모터, 클로로필 r/b 결합 프로모터, 고 분자량 글루테닌 프로모터, α,β-글리아딘 프로모터, 호르데인 프로모터 및 파타틴 프로모터.
한 구체예에서, 프로모터는 CaMV 35S 프로모터 또는 중복 인핸서 영역 또는 이중 인핸서 영역을 갖는 변형된 35S 프로모터일 수 있다(R. Kay et al. Science. 1987 Jun 5;236(4806):1299-302, 본원에 참조로서 포함됨).
재조합 벡터는 또한 클로닝 과정에서 선택 가능한 마커로서 사용될 수 있는 유전자를 코딩하는 DNA를 포함할 수 있는데, 즉, 트랜스펙션되거나 형질전환된 세포의 선택을 가능하게 하고, 이종성 DNA가 혼입된 벡터를 보유하는 세포의 선택을 가능하게 하기 위해서이다. 상기 벡터는 또한 코딩 서열의 발현 조절과 관련되거나, 숙주 세포의 특정 부분, 예를 들어, 엽록체에 발현된 폴리펩티드를 표적화하기 위한 DNA를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 벡터는 선택 가능한 마커 유전자(예를 들어, 항생제 내성 유전자); 폴리펩티드 종결 신호; 및 단백질 표적화 서열(예를 들어, 엽록체 수송 펩티드)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 요소를 포함할 수 있다.
적합한 마커 유전자의 예는 카나마이신, 제네티신(G418) 및 하이그로마이신에 내성을 부여하는 것들과 같은 항생제 내성 유전자(npt-II, hyg-B); 포스피노트리신 및 설폰아미드 기반 제초제에 내성을 부여하는 것들과 같은 제초제 내성 유전자(각각 bar 및 suI; EP-A-242246, EP-A-0249637); β-글루쿠로니다제(GB2197653), 루시페라제 및 그린 형광 단백질(GFP)과 같은 스크리닝 가능한 마커를 포함한다. 마커 유전자는 제2 프로모터에 의해 조절될 수 있는데, 이 프로모터는 종자 내에 있거나 없을 수 있는 세포에서의 발현을 가능하게 하여, 식물 발달의 임의의 단계에서 마커를 함유하는 세포 또는 조직의 선택을 허용한다. 적합한 제2 프로모터는 애그로박테리움의 노팔린 신타제 유전자의 프로모터 및 35S 콜리 플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 전사체를 인코딩하는 유전자로부터 유래된 프로모터이다. 그러나, 임의의 다른 적합한 제2 프로모터가 사용될 수 있다.
상업적으로 바람직한 특성
용어 "상업적으로 바람직한 특성"은 수확량, 성숙한 식물의 높이, 수확 가능한 잎의 수, 평균 마디 길이, 커터 잎의 길이, 커터 잎의 폭, 품질, 비생물학적(예를 들어, 가뭄) 스트레스 내성, 제초제 내성 및/또는 생물학적(예를 들어, 곤충, 박테리아 또는 진균) 스트레스 내성과 같은 특성을 포함할 것이다.
본원에서 교시된 용어 "상업적으로 바람직한 특성"은 유사한 필드 조건에서 성장한 비슷한 식물의 열건된 부모에서의 특성과 유사한 가뭄 내성, 내충성, 성숙한 식물의 높이, 수확 가능한 잎의 수, 평균 마디 길이, 커터 잎의 길이, 커터 잎의 폭, 및 수확량으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 특성을 의미한다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 담배 수확량은 표준 작물학 및 큐어링 실시에 따라 표준 필드 조건에서 에이커 당 큐어링된 담배 잎의 무게에 기반하여 계산된 큐어링된 잎 수확량을 지칭한다.
한 양태에서, 본 발명의 담배 식물은 유사한 필드 조건에서 성장한 비슷한 식물의 수확량의 50% 내지 150%, 55% 내지 145%, 60% 내지 140%, 65% 내지 135%, 70% 내지 130%, 75% 내지 125%, 80% 내지 120%, 85% 내지 115%, 90% 내지 110%, 95% 내지 105%, 50% 내지 100%, 55% 내지 100%, 60% 내지 100%, 65% 내지 100%, 70% 내지 100%, 75% 내지 100%, 80% 내지 100%, 85% 내지 100%, 90% 내지 100%, 95% 내지 100%, 100% 내지 150%, 105% 내지 150%, 110% 내지 150%, 115% 내지 150%, 120% 내지 150%, 125% 내지 150%, 130% 내지 150%, 135% 내지 150%, 140% 내지 150%, 또는 145% 내지 150%의 수확량을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 담배 식물 수확량은 유사한 필드 조건에서 성장한 비슷한 식물의 수확량의 약 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 3.0배이다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 담배 식물의 수확량은 유사한 필드 조건에서 성장한 열건된 비슷한 식물의 수확량과 유사하다.
한 양태에서, 본 발명의 담배 식물은 약 1200 내지 3500, 1300 내지 3400, 1400 내지 3300, 1500 내지 3200, 1600 내지 3100, 1700 내지 3000, 1800 내지 2900, 1900 내지 2800, 2000 내지 2700, 2100 내지 2600, 2200 내지 2500, 및 2300 내지 2400 lbs/에이커로 구성된 군으로부터 선택된 수확량을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 담배 식물은 약 1200 내지 3500, 1300 내지 3500, 1400 내지 3500, 1500 내지 3500, 1600 내지 3500, 1700 내지 3500, 1800 내지 3500, 1900 내지 3500, 2000 내지 3500, 2100 내지 3500, 2200 내지 3500, 2300 내지 3500, 2400 내지 3500, 2500 내지 3500, 2600 내지 3500, 2700 내지 3500, 2800 내지 3500, 2900 내지 3500, 3000 내지 3500, 및 3100 내지 3500 lbs/에이커로 구성된 군으로부터 선택된 수확량을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명의 담배 식물은 약 1200 내지 3500, 1200 내지 3400, 1200 내지 3300, 1200 내지 3200, 1200 내지 3100, 1200 내지 3000, 1200 내지 2900, 1200 내지 2800, 1200 내지 2700, 1200 내지 2600, 1200 내지 2500, 1200 내지 2400, 1200 내지 2300, 1200 내지 2200, 1200 내지 2100, 1200 내지 2000, 1200 내지 1900, 1200 내지 1800, 1200 내지 1700, 1200 내지 1600, 1200 내지 1500, 및 1200 내지 1400 lbs/에이커로 구성된 군으로부터 선택된 수확량을 제공한다.
담배 식물
본 발명은 담배 세포, 담배 식물 및 식물 번식 물질 뿐만 아니라 담배 식물에 관한 방법, 용도를 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "담배"는 담배 제품의 생산에 사용되는 니코티아나 속 식물을 지칭한다. 적합한 "담배" 식물의 비제한적 예는 N. 타바쿰 및 N.루스티카(N. rustica)(예를 들어, N. 타바쿰 L., LA B21, LN KY171, Tl 1406, Basma, Galpao, Perique, Beinhart 1000-1, 및 Petico)를 포함한다.
한 구체예에서, 적합한 담배 식물은 임의의 N. 타바쿰 종일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 적합한 담배 식물은 비-타바쿰 종일 수 있다.
담배 물질은 벌리 품종, 플루(flue) 또는 브라이트(bright) 품종 및 다크(dark) 품종으로 일반적으로 알려진 다양한 니코티아나 타바쿰 종으로부터 유래되거나 수득될 수 있다. 일부 구체예에서, 담배 물질은 벌리, 버지니아(Virginia) 또는 다크 담배 식물로부터 유래된다. 담배 식물은 벌리 담배, 희귀 담배(rare tobacco), 특화 담배(speciality tobacco), 팽화 담배(expanded tobacco) 등으로부터 선택될 수 있다.
담배 품종 및 엘리트 담배 품종의 사용도 본원에서 고려된다. 따라서, 본원에서 사용되는 담배 식물은 담배 품종 또는 엘리트 담배 품종일 수 있다. 특히 유용한 니코티아나 타바쿰 품종은 벌리 타입, 다크 타입 및 열건된 타입 담배를 포함한다.
일부 구체예에서, 담배 식물은, 예를 들어, 다음 품종 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다: N. 타바쿰 L. 품종 T.I. 1068, N. 타바쿰 AA 37-1, N. 타바쿰 B 13P, N. 타바쿰 잔티(Xanthi)(Mitchell-Mor), N. 타바쿰 KT D#3 하이브리드(Hybrid) 107, N. 타바쿰 Bel-W3, N. 타바쿰 79-615, N. 타바쿰 삼순 홀름스(Samsun Holmes) NN, 이종교배 N. 타바쿰 BU21 x N. 타바쿰 호야 파라도(Hoja Parado)로부터의 F4, 계통 97, N. 타바쿰 KTRDC#2 하이브리드 49, N. 타바쿰 KTRDC#4 하이브리드 1 10, N. 타바쿰 벌리 21, N. 타바쿰 PM016, N. 타바쿰 KTRDC#5 KY 160 SI, N. 타바쿰 KTRDC#7 FCA, N. 타바쿰 KTRDC#6 TN 86 SI, N. 타바쿰 PM021, N. 타바쿰 K 149, N. 타바쿰 K 326, N. 타바쿰 K 346, N. 타바쿰 K 358, N. 타바쿰 K 394, N. 타바쿰 K 399, N. 타바쿰 K 730, N. 타바쿰 KY 10, N. 타바쿰 KY 14, N. 타바쿰 KY 160, N. 타바쿰 KY 17, N. 타바쿰 KY 8959, N. 타바쿰 KY 9, N. 타바쿰 KY 907, N. 타바쿰 MD 609, N. 타바쿰 맥네어(McNair) 373, N. 타바쿰 NC 2000, N. 타바쿰 PG 01, N. 타바쿰 PG 04, N. 타바쿰 P01, N. 타바쿰 P02, N. 타바쿰 P03, N. 타바쿰 RG 1 1, N. 타바쿰 RG 17, N. 타바쿰 RG 8, N. 타바쿰 스페이트(Speight) G-28, N. 타바쿰 TN 86, N. 타바쿰 TN 90, N. 타바쿰 VA 509, N. 타바쿰 AS44, N. 타바쿰 반켓(Banket) A1, N. 타바쿰 바스마 드라마(Basma Drama) B84/31, N. 타바쿰 바스마 I 지츠나(Zichna) ZP4/B, N. 타바쿰 바스마 잔티 BX 2A, N. 타바쿰 바텍(Batek), N. 타바쿰 베수키 젬버(Besuki Jember), N. 타바쿰 C104, N. 타바쿰 코커(Coker) 319, N. 타바쿰 코커 347, N. 타바쿰 크리올로 미시오네로(Criollo Misionero), N. 타바쿰 PM092, N. 타바쿰 델크레스트(Delcrest), N. 타바쿰 드제벨(Djebel) 81, N. 타바쿰 DVH 405, N. 타바쿰 갈파오 코뭄(Galpao Comum), N. 타바쿰 HB04P, N. 타바쿰 힉스 브로드리프(Hicks Broadleaf), N. 타바쿰 카바쿨락 엘라소나(Kabakulak Elassona), N. 타바쿰 PM102, N. 타바쿰 쿠트세이지(Kutsage) E1, N. 타바쿰 KY 14xL8, N. 타바쿰 KY 171, N. 타바쿰 LA BU 21, N. 타바쿰 맥네어 944, N. 타바쿰 NC 2326, N. 타바쿰 NC 71, N. 타바쿰 NC 297, N. 타바쿰 NC 3, N. 타바쿰 PVH 03, N. 타바쿰 PVH 09, N. 타바쿰 PVH 19, N. 타바쿰 PVH 21 10, N. 타바쿰 레드 러시안(Red Russian), N. 타바쿰 삼순, N. 타바쿰 사플락(Saplak), N. 타바쿰 심마바(Simmaba), N. 타바쿰 탈가(Talgar) 28, N. 타바쿰 PM132, N. 타바쿰 위슬리카(Wislica), N. 타바쿰 야얄다그(Yayaldag), N. 타바쿰 NC 4, N. 타바쿰 TR 마돌(Madole), N. 타바쿰 프릴렙(Prilep) HC-72, N. 타바쿰 프릴렙 P23, N. 타바쿰 프릴렙 PB 156/1, N. 타바쿰 프릴렙 P12-2/1, N. 타바쿰 야카(Yaka) JK-48, N. 타바쿰 야카 JB 125/3, N. 타바쿰 TI-1068, N. 타바쿰 KDH-960, N. 타바쿰 TI-1070, N. 타바쿰 TW136, N. 타바쿰 PM204, N. 타바쿰 PM205, N. 타바쿰 바스마, N. 타바쿰 TKF 4028, N. 타바쿰 L8, N. 타바쿰 TKF 2002, N. 타바쿰 TN90, N. 타바쿰 GR141, N. 타바쿰 바스마 잔티, N. 타바쿰 GR149, N. 타바쿰 GR153, 및 N. 타바쿰 프티 하바나(Petit Havana).
품종의 비제한적인 예는 BD 64, CC 101, CC 200, CC 27, CC 301, CC 400, CC 500, CC 600, CC 700, CC 800, CC 900, 코커 176, 코커 319, 코커 371 골드(Gold), 코커 48, CD 263, DF91 1, DT 538 LC 갈파오 토바코, GL 26H, GL 350, GL 600, GL 737, GL 939, GL 973, HB 04P, HB 04P LC, HB3307PLC, 하이브리드 403LC, 하이브리드 404LC, 하이브리드 501 LC, K 149, K 326, K 346, K 358, K394, K 399, K 730, KDH 959, KT 200, KT204LC, KY10, KY14, KY 160, KY 17, KY 171, KY 907, KY907LC, KTY14xL8 LC, 리틀 크릿텐덴(Little Crittenden), 맥네어 373, 맥네어 944, msKY 14xL8, 내로우 리프 마돌(Narrow Leaf Madole), 내로우 리프 마돌 LC, NBH 98, N-126, N-777LC, N-7371 LC, NC 100, NC 102, NC 2000, NC 291, NC 297, NC 299, NC 3, NC 4, NC 5, NC 6, NC7, NC 606, NC 71, NC 72, NC 810, NC BH 129, NC 2002, 닐 스미스 마돌(Neal Smith Madole), OXFORD 207, PD 7302 LC, PD 7309 LC, PD 7312 LC 'Periq'e' 토바코, PVH03, PVH09, PVH19, PVH50, PVH51, R 610, R 630, R 7-1 1, R 7-12, RG 17, RG 81, RG H51, RGH 4, RGH 51, RS 1410, 스페이트 168, 스페이트 172, 스페이트 179, 스페이트 210, 스페이트 220, 스페이트 225, 스페이트 227, 스페이트 234, 스페이트 G-28, 스페이트 G-70, 스페이트 H-6, 스페이트 H20, 스페이트 NF3, Tl 1406, Tl 1269, TN 86, TN86LC, TN 90, TN 97, TN97LC, TN D94, TN D950, TR(Tom Rosson) 마돌, VA 309, VA359, AA 37-1, B 13P, 잔티(Mitchell-Mor), Bel-W3, 79-615, 삼순 홀름스 NN, KTRDC 넘버 2 하이브리드 49, 벌리 21, KY 8959, KY 9, MD 609, PG 01, PG 04, P01, P02, P03, RG 1 1, RG 8, VA 509, AS44, 반켓 A1, 바스마 드라마 B84/31, 바스마 I 지츠나 ZP4/B, 바스마 잔티 BX 2A, 바텍, 베수키 젬버, C104, 코커 347, 크리올로 미시오네로, 델크레스트, 드제벨 81, DVH 405, 갈파오 코뭄, HB04P, 힉스 브로드리프, 카바쿨락 엘라소나, 쿠트세이지 E1, LA BU 21, NC 2326, NC 297, PVH 21 10, 레드 러시안, 삼순, 사플락, 심마바, 탈가 28, 위슬리카, 야얄다그, 프릴렙 HC-72, 프릴렙 P23, 프릴렙 PB 156/1, 프릴렙 P12-2/1, 야카 JK-48, 야카 JB 125/3, TI-1068, KDH-960, Tl-1070, TW136, 바스마, TKF 4028, L8, TKF 2002, GR141, 바스마 잔티, GR149, GR153, 프티 하바나이다. 상기의 낮은 컨버터 하위품종도, 본원에서 구체적으로 확인되지 않더라도, 고려된다.
담배 식물은 벌리일 수 있다.
한 구체예에서, 담배 식물은 N. 타바쿰 L.이고 가장 바람직한 구체예에서, 담배 식물은 N. 타바쿰 L 품종 T.I. 1068이다.
한 구체예에서, 식물 번식 물질은 본 발명의 담배 식물로부터 수득될 수 있다. 본원에서 사용되는 "식물 번식 물질"은 추가 식물이 생산될 수 있는 식물로부터 취해진 임의의 식물 물질을 지칭한다. 적합하게는, 식물 번식 물질은 종자일 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 담배 세포, 담배 식물 및/또는 식물 번식 물질은 억제되거나 하향-조절된 디테르펜 합성 유전자를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 담배 세포, 담배 식물 및/또는 식물 번식 물질은 본 발명에 따른 작제물 또는 벡터를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 담배 세포, 담배 식물 및/또는 식물 번식 물질은 본 발명에 따른 방법에 의해 얻어질(예를 들어, 수득될) 수 있다.
적합하게는, 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부는 디테르펜 합성 유전자의 발현을 억제하도록 변형되지 않은 담배 식물 또는 이의 일부와 비교하여 적어도 하나의 디테르펜 합성 유전자의 감소된 발현을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부는 본 발명의 담배 세포를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 식물 번식 물질은 본 발명의 담배 식물로부터 얻어질(예를 들어, 수득될) 수 있다.
한 구체예에서, 담배 제품의 생산을 위해 상기 구체예에 제공된 바와 같은 담배 세포의 용도가 제공된다. 또한, 담배 식물을 번식시키기 위한 본원에 기재된 바와 같은 담배 식물의 용도가 제공된다.
본 발명은 또한 또 다른 구체예에서 담배 제품의 생산을 위한 상기 구체예의 담배 식물의 용도를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 작물을 성장시키기 위한 본 발명의 담배 식물의 용도가 제공된다. 한 구체예에서, 본 발명에 따른 디테르펜 합성 유전자의 사용은 담배 식물의 삼출물 화학에서의 변동을 초래할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 따른 디테르펜 합성 유전자의 사용은 담배 식물의 수크로스 에스테르 함량에서의 증가를 초래할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 디테르펜 합성 유전자의 사용(예를 들어, 이의 억제)은 수크로스 에스테르의 트리콤 삼출물 농도에서의 증가 및 CBT-올, 시스-아비에놀 및 라브데네디올 중 하나 이상의 함량에서의 증가를 초래할 수 있다. 적합하게는, 이는 식물이 야생형 식물과 비교하여 감소된 디테르펜 합성 유전자 발현을 나타낼 때 관찰될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 담배 세포 배양물(예를 들어, 시험관내 배양물)을 제공한다. 담배 세포 배양물은 담배 세포 현탁 배양물일 수 있다. 시험관내 배양된 이들 담배 세포는, 예를 들어, 통상적인 담배 입자, 파쇄물, 미세 절단 또는 긴 절단 담배 라미나(tobacco lamina)에 대한 대용물로서, 첨가제 성분으로서 또는 대용물 및 첨가제 둘 모두로서, 담배 제품에 혼입될 수 있다.
한 구체예에서, 담배 제품의 생산을 위한 본 발명에 따른 담배 세포 배양물, 예를 들어, 수확 및/또는 가공된 세포 배양물, 또는 그로부터의 추출물의 용도가 제공된다.
시험관내 배양물로부터 수확된 담배 세포는, 예를 들어, 분말을 생성하기 위해, 건조될 수 있고, 예를 들어, 동결-건조될 수 있다.
당업자는 담배 세포의 시험관내 배양물을 확립하기 위한 공지된 방법을 알고 있을 것이다. 단지 예로서 다음 방법을 사용할 수 있다: 관심 담배 식물로부터 종자를 수집하고 그 외부를 살균하여 원하지 않는 유기체를 제거하고, 상기 종자를 재배하여 관심 담배 식물로 성장시키고, 외식편으로 사용하기 위해 담배 식물로부터(예를 들어, 담배 줄기로부터) 조직을 제거하고, 담배 외식편으로부터 세포 배양물을 확립하고, 캘러스 배양물로부터 세포 현탁 배양물을 확립하고, 배양 물질(예를 들어, 담배 세포 포함)을 수확하여 담배 세포 배양물을 생산한다.
담배 세포는 여과, 예를 들어, 진공 여과를 포함하는 다양한 방법에 의해 수확될 수 있다. 샘플에 물을 첨가하여 필터에서 세척하고, 남아있는 액체를 여과, 예를 들어, 진공 여과에 의해 제거할 수 있다.
수확된 담배 세포 배양물을 추가 가공, 예를 들어, 건조, 예를 들어, 공기-건조 및/또는 동결-건조시킬 수 있다. 수확된 담배 세포 배양물 또는 건조된 수확된 담배 세포 배양물 또는 그로부터의 추출물을 본 발명에 따른 담배 제품에 혼입시킬 수 있다.
제품
본 발명은 또한 본 발명에 따라 수득될 수 있거나 수득되는 제품을 제공한다. 디테르펜 합성 유전자 활성 또는 발현이 억제되고 증가된 수크로스 에스테르 함량을 포함하는 담배 식물로부터 수득될 수 있거나 수득된 제품이 제공된다.
본원에서 사용되는 용어 "담배 산업 제품"은 가연성 흡연 물품, 예를 들어, 시거렛, 시거릴로, 시거, 파이프용 담배 또는 손으로 만 담배, (담배, 담배 유도체, 팽화 담배, 재구성된 담배, 담배 대용물 또는 다른 흡연 물질에 기반하든지 무관함), 불연성 에어로졸 공급 시스템, 예를 들어, 전자 담배와 같이 연소 없이 기재 물질로부터 화합물을 방출하는 가열 제품, 담배 가열 제품, 및 기재 물질의 연소로부터 에어로졸을 생성하는 하이브리드 시스템, 예를 들어, 액체 또는 겔 또는 고체 기재를 함유하는 하이브리드 시스템, 뿐만 아니라 이들 에어로졸 공급 시스템 내에 사용된 에어로졸화 가능한 기재 물질; 및 에어로졸-비함유 전달 물품, 예를 들어, 로젠지, 검, 패치, 통기성 분말을 포함하는 물품 및 스누스(snus) 및 스누프(snuff)와 같은 무연 담배 제품을 포함하도록 의도되고, 에어로졸-비함유 전달 물품은 니코틴을 전달하거나 전달하지 않을 수 있다.
적합하게는, 담배 산업 제품은 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부로부터 제조될 수 있다(예를 들어, 포함할 수 있다).
적합하게는, 담배 산업 제품은 본 발명에 따른 담배 세포 배양물로부터 제조될 수 있다.
적합하게는, 담배 산업 제품은 본 발명에 따른 담배 식물 번식 물질로부터 번식된 담배 식물 또는 이의 일부로부터 제조될 수 있다(예를 들어, 포함할 수 있다).
적합하게는, 담배 산업 제품은 본 발명에 따른 담배 식물의 수확된 잎으로부터 제조될 수 있다(예를 들어, 포함할 수 있다).
적합하게는, 담배 산업 제품은 본 발명에 따른 가공된 담배 잎으로부터 제조될 수 있다(예를 들어, 포함할 수 있다).
적합하게는, 담배 산업 제품은 본 발명에 따른 큐어링된 담배 물질로부터 제조될 수 있다(예를 들어, 포함할 수 있다).
적합하게는, 담배 산업 제품은 본 발명에 따른 담배 블렌드로부터 제조될 수 있다(예를 들어, 포함할 수 있다).
한 구체예에서, 담배 산업 제품은 시거렛, 시거릴로 및 시거로 구성된 군으로부터 선택되는 가연성 흡연 물품이다.
한 구체예에서, 담배 산업 제품은 필터, 필터 로드, 필터 로드 세그먼트, 담배, 담배 로드, 담배 로드 세그먼트, 스필(spill), 첨가제 방출 성분, 예를 들어, 캡슐, 스레드, 비드, 페이퍼, 예를 들어, 플러그 랩(plug wrap), 티핑 페이퍼(tipping paper) 또는 시거렛 페이퍼(cigarette paper)와 같은 가연성 흡연 물품의 하나 이상의 성분을 포함한다.
한 구체예에서, 담배 산업 제품은 불연성 에어로졸 공급 시스템이다.
한 구체예에서, 담배 산업 제품은 가열기 및 에어로졸화 가능한 기재와 같은 불연성 에어로졸 공급 시스템의 하나 이상의 성분을 포함한다.
한 구체예에서, 에어로졸 공급 시스템은 베이핑 장치(vaping device)로도 알려진 전자 담배이다.
한 구체예에서, 전자 담배는 가열기, 가열기에 전력을 공급할 수 있는 전원 공급기, 액체 또는 겔과 같은 에어로졸화 가능한 기재, 하우징 및 선택적으로 마우스피스를 포함한다.
한 구체예에서, 에어로졸화 가능한 기재는 기재 용기에 함유되어 있다. 한 구체예에서, 기재 용기는 가열기와 조합되거나 가열기를 포함한다.
한 구체예에서, 담배 산업 제품은 기재 물질을 태우지 않고 가열시킴으로써 하나 이상의 화합물을 방출하는 가열 제품이다. 기재 물질은 니코틴을 함유하거나 함유하지 않을 수 있는, 예를 들어, 담배 또는 다른 비-담배 생성물일 수 있는 에어로졸화 가능한 물질이다. 한 구체예에서, 가열 제품은 담배 가열 제품이다.
한 구체예에서, 가열 제품은 전자 장치이다.
한 구체예에서, 담배 가열 제품은 가열기, 가열기에 전력을 공급할 수 있는 전원 공급기, 고체 또는 겔 물질과 같은 에어로졸화 가능한 기재를 포함한다.
한 구체예에서, 가열 제품은 비-전자 물품이다.
한 구체예에서, 가열 제품은 고체 또는 겔 물질과 같은 에어로졸화 가능한 기재 및 임의의 전자 수단 없이, 예를 들어, 목탄과 같은 연소 물질을 태움으로써, 에어로졸화 가능한 기재에 열 에너지를 공급할 수 있는 열원을 포함한다.
한 구체예에서, 가열 제품은 또한 에어로졸화 가능한 기재를 가열함으로써 생성된 에어로졸을 여과할 수 있는 필터를 포함한다.
일부 구체예에서, 에어로졸화 가능한 기재 물질은 증기 또는 에어로졸 발생제 또는 습윤제, 예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 트리아세틴 또는 디에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 담배 산업 제품은 기재 물질의 조합물을 태우지 않고 가열시킴으로써 에어로졸을 발생시키는 하이브리드 시스템이다. 기재 물질은, 예를 들어, 니코틴을 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 고체, 액체 또는 겔을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 하이브리드 시스템은 액체 또는 겔 기재 및 고체 기재를 포함한다. 고체 물질은, 예를 들어, 니코틴을 함유하거나 함유하지 않을 수 있는 담배 또는 다른 비-담배 생성물일 수 있다. 한 구체예에서, 하이브리드 시스템은 액체 또는 겔 기재 및 담배를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 상기 제품은 디테르펜 합성 유전자 활성 또는 발현을 억제하고 수크로스 에스테르 함량을 증가시키는 본 발명의 ddRNAi DNA 작제물을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 담배 잎을 생산하기 위한 본 발명의 담배 식물의 용도가 제공된다. 적합하게는, 담배 잎은 가공과 같은 하류 적용을 받을 수 있다. 따라서, 한 구체예에서, 전술한 구체예의 용도는 가공된 담배 잎을 제공할 수 있다. 적합하게는, 담배 잎은 큐어링, 발효, 저온살균 또는 이들의 조합으로 처리될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 담배 잎은 절단될 수 있다. 일부 구체예에서, 담배 잎은 큐어링, 발효, 저온살균 또는 이들의 조합으로 처리되기 전 또는 후에 절단될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 담배 식물의 수확된 잎을 제공한다. 한 구체예에서, 수확된 잎은 디테르펜 합성 유전자 활성 또는 발현을 억제하고 수크로스 에스테르 함량을 증가시킨 담배 식물로부터 수득될 수 있다. 추가 구체예에서, 수확된 잎은 본 발명의 번식 물질로부터 번식된 담배 식물로부터 얻어질(예를 들어, 수득될) 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법 또는 용도로부터 수득될 수 있는 수확된 잎이 제공된다. 적합하게는, 수확된 잎은 절단하여 수확된 잎일 수 있다. 일부 구체예에서, 수확된 잎은 생육성 담배 세포를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 수확된 잎은 생육성 담배 세포를 포함하지 않는다. 다른 구체예에서, 수확된 잎은 추가 공정을 거칠 수 있다.
일부 담배 식물은 줄기를 자르고 모든 잎을 동시에 수확함으로써 수확될 수 있다(예를 들어, 벌리 담배와 같이). 다른 담배 식물(예를 들어, 열건된 담배)은 프라이밍과 같은 공정에서 단계적으로 수확될 수 있고, 여기서 개별 잎들은 익었을 때 줄기로부터 제거된다.
또한 가공된 담배 잎이 제공된다. 가공된 담배 잎은 본 발명의 담배 식물로부터 수득될 수 있다. 적합하게는, 가공된 담배 잎은 본 발명의 방법 및/또는 용도 중 어느 하나에 따라 수득된 담배 식물로부터 수득될 수 있다. 한 구체예에서, 가공된 담배 잎은 바람직하게는 대조군 잎, 즉, 본 발명에 따라 변형되지 않은 담배 식물로부터의 잎과 비교하여 디테르펜 합성 유전자 활성 또는 발현을 억제하고 수크로스 에스테르 함량을 증가시킨 담배 식물로부터 수득될 수 있다. 가공된 담배 잎은 디테르펜 합성 유전자 활성 또는 발현의 감소 및 증가된 수크로스 에스테르 함량을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 가공된 담배 잎은 본 발명에 따른 담배 식물 번식 물질로부터 번식된 담배 식물로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 가공된 담배 잎은 본 발명의 수확된 잎을 가공함으로써 수득될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "가공된 담배 잎"은 당 분야에서 담배에 가해지는 하나 이상의 가공 단계를 거친 담배 잎을 지칭한다. "가공된 담배 잎"은 생육성 세포를 포함하지 않거나 실질적으로 포함하지 않는다.
용어 "생육성 세포"는 성장할 수 있고/거나 대사적으로 활성인 세포를 지칭한다. 따라서, "비-생육성"으로도 지칭되는, 세포가 생육할 수 없다고 한다면, 세포는 생육성 세포의 특성을 나타내지 않는다.
용어 "생육성 세포가 실질적으로 없다"는 전체 세포의 약 5% 미만이 생육성이라는 것을 의미한다. 바람직하게는, 전체 세포의 약 3% 미만, 보다 바람직하게는 약 1% 미만, 심지어 더욱 바람직하게는 약 0.1% 미만이 생육성이다.
한 구체예에서, 가공된 담배 잎은 큐어링, 발효 및/또는 저온살균 중 하나 이상에 의해 가공될 수 있다. 적합하게는, 가공된 담배 잎은 큐어링에 의해 가공될 수 있다. 담배 잎은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 큐어링될 수 있다. 한 구체예에서, 담배 잎은 풍건, 화건, 열건 및 양건으로 구성된 군으로부터 선택되는 큐어링 방법 중 하나 이상에 의해 큐어링될 수 있다. 적합하게는, 담배 잎은 풍건될 수 있다. 적합하게는, 담배 잎은 열건될 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명에 따라 가공된 잎은 본 발명에 따라 변형되지 않은 비슷한 생성물(예를 들어, 가공된 잎)과 비교하여 증가된 수크로스 에스테르 함량을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명에 따라 풍건된 잎은 본 발명에 따라 변형되지 않은 비슷한 생성물(예를 들어, 풍건된 잎)과 비교하여 증가된 수크로스 에스테르 함량을 포함한다.
적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 절단된 풍건된 식물 줄기의 하부 1/3 잎에서 측정될 수 있다. 적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 절단된 풍건된 식물 줄기의 중간 1/3 잎에서 측정될 수 있다. 적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 절단된 풍건된 식물 줄기의 상부 1/3 잎에서 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 "하부 잎"은 식물의 하부 1/3의 잎(예를 들어, 식물의 기저에 가장 가까운 잎)을 지칭한다. "상부 잎"은 식물의 상부 1/3의 잎(예를 들어, 식물의 기저에서 가장 멀리 떨어진 잎)을 지칭한다. 본원에서 사용되는 "중간 잎"은 하부와 상부 위치 사이의 식물의 중앙 1/3을 지칭한다(예를 들어, 하부와 상부 잎 사이의 중간에 있는 잎).
적합하게는, 본 발명에 따른 절단된 풍건된 식물 줄기의 하부 1/3의 잎은 본 발명에 따라 변형되지 않은 비슷한 생성물(예를 들어, 절단된 풍건된 식물 줄기의 하부 1/3의 잎)과 비교하여 증가된 수크로스 에스테르 함량을 포함할 수 있다. 적합하게는, 본 발명에 따른 절단된 풍건된 식물 줄기의 중간 1/3의 잎은 본 발명에 따라 변형되지 않은 비슷한 생성물(예를 들어, 절단된 풍건된 식물 줄기의 중간 1/3의 잎)과 비교하여 증가된 수크로스 에스테르 함량을 포함할 수 있다. 적합하게는, 본 발명에 따른 절단된 풍건된 식물 줄기의 상부 1/3의 잎은 본 발명에 따라 변형되지 않은 비슷한 생성물(예를 들어, 절단된 풍건된 식물 줄기의 상부 1/3의 잎)과 비교하여 증가된 수크로스 에스테르 함량을 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명에 따라 열건된 잎은 본 발명에 따라 변형되지 않은 비슷한 생성물(예를 들어, 열건된 잎)과 비교하여 증가된 수크로스 에스테르 함량을 포함한다.
적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 열건된 식물의 첫 번째 프라이밍에서 측정될 수 있다. 적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 열건된 식물의 두 번째(또는 대안적으로 중간) 프라이밍에서 측정될 수 있다. 적합하게는, 수크로스 에스테르 함량은 열건된 식물의 세 번째(또는 대안적으로 마지막) 프라이밍에서 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 "프라이밍"은 담배 식물로부터 잎의 제거를 지칭한다. 이는 열건된 식물의 성숙하거나 익은 잎의 제거를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 "첫 번째 프라이밍"은 담배 식물에서 먼저 수확되는 잎을 지칭한다(예를 들어, 담배 식물의 가장 낮은 부분의 잎). 본원에서 사용된 "두 번째(또는 중간 프라이밍) 프라이밍"은 초기 프라이밍 후에 담배 식물로부터 수확되는 잎을 지칭한다(예를 들어, 담배 식물의 중간 부분의 잎). 본원에서 사용되는 "세 번째(또는 마지막) 프라이밍"은 담배 식물에서 마지막으로 수확되는 잎을 지칭한다(예를 들어, 담배 식물의 상부의 잎).
적합하게는, 본 발명에 따른 열건된 식물의 잎의 첫 번째 프라이밍은 본 발명에 따라 변형되지 않은 비슷한 생성물(예를 들어, 열건된 식물의 잎의 첫 번째 프라이밍)과 비교하여 증가된 수크로스 에스테르 함량을 포함할 수 있다. 적합하게는, 본 발명에 따른 열건된 식물의 잎의 두 번째(또는 중간) 프라이밍은 본 발명에 따라 변형되지 않은 비슷한 생성물(예를 들어, 열건된 식물의 잎의 두 번째(또는 중간) 프라이밍)과 비교하여 증가된 수크로스 에스테르 함량을 포함할 수 있다. 적합하게는, 본 발명에 따른 열건된 식물의 잎의 세 번째(또는 마지막) 프라이밍은 본 발명에 따라 변형되지 않은 비슷한 생성물(예를 들어, 열건된 식물의 잎의 세 번째(또는 마지막) 프라이밍)과 비교하여 증가된 수크로스 에스테르 함량을 포함할 수 있다.
전형적으로, 풍건은 환기가 잘되는 헛간에 담배 잎을 매달아 건조되게 함으로써 달성된다. 이것은 대개 4 내지 8주의 기간에 걸쳐 수행된다. 풍건은 벌리 담배에 특히 적합하다.
적합하게는, 담배 잎은 화건될 수 있다. 화건은 담배 잎을 활엽수의 불길이 지속적 또는 간헐적인 낮은 연기로 계속되는 큰 헛간에 매달아서 전형적으로 달성되고, 공정 및 담배에 따라, 대개 3일 내지 10주가 소요된다.
또 다른 구체예에서, 담배 잎은 열건될 수 있다. 열건은 담배 막대에 담배 잎을 끈으로 묶고 이들을 큐어링 헛간에서 티어-폴(tier-pole)에 매달아 두는 것을 포함할 수 있다. 헛간에는 대개 외부에서 공급되는 화이어 박스로부터 이어지는 굴뚝이 있다. 전형적으로, 이는 연기에 노출되지 않고 열건된 담배를 생산한다. 일반적으로, 온도는 큐어링 과정 동안 천천하 상승할 것이고 전체 공정은 약 1주일 소요된다.
적합하게는, 담배 잎은 양건될 수 있다. 상기 방법은 전형적으로 아무것도 덮지 않은 담배를 햇볕에 노출시키는 것을 포함하다.
적합하게는, 가공된 담배 잎은 발효에 의해 처리될 수 있다. 발효는 당 분야에 공지된 임의의 방식으로 수행될 수 있다. 전형적으로 발효 중에, 담배 잎은 수분을 유지하기 위해, 예를 들어, 버랩(burlap)으로 덮인 큐어링된 담배의 더미(벌크)로 쌓인다. 잎 내부에 남아있는 물과 담배 무게의 결합은 담배를 익히는 자연 열을 생성한다. 벌크 중앙의 온도는 매일 모니터링된다. 일부 방법에서 매주, 전체 벌크가 개방된다. 그 다음 잎을 떼어서 털어 내고 축축하게 하고 벌크를 돌려서 안쪽 잎이 바깥 쪽을 향하도록 하고 바닥 잎을 벌크의 상부에 놓는다. 이것은 벌크 전체에 걸쳐 고른 발효를 보장한다. 잎의 추가 수분과 잎 자체의 실제 로테이션은 열을 발생시켜, 담배의 자연 암모니아를 방출하고 니코틴을 줄이면서, 또한 색을 깊게 하고 담배의 방향을 개선한다. 전형적으로, 발효 공정은 담배의 품종, 잎의 줄기 위치, 잎의 두께와 의도된 용도에 따라 최대 6개월 동안 계속된다.
적합하게는, 가공된 담배 잎은 저온살균에 의해 가공될 수 있다. 저온살균은 담배 잎이 무연 담배 제품, 가장 바람직하게는 스누스를 만드는데 사용될 때 특히 선호될 수 있다. 담배 잎 저온살균은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 저온살균은 문헌[J Foulds, L Ramstrom, M Burke, K Fagerstrom. Effect of smokeless tobacco (snus) on smoking and public health in Sweden. Tobacco Control (2003) 12: 349-359, 이의 교시는 본원에 참조로서 포함됨]에 상세하게 기술된 대로 수행될 수 있다.
스누스의 생산 중에 저온살균은 전형적으로 담배가 24-36시간 동안 증기로 열 처리(약 100℃의 온도에 도달함)되는 공정에 의해 수행된다. 이는 거의 살균된 생성물을 생성하고 이론에 구속되길 원하지 않으며 이 결과 중 하나는 추가 TSNA 형성의 한계인 것으로 여겨진다.
한 구체예에서, 저온살균은 증기 저온살균일 수 있다.
일부 구체예에서, 가공된 담배 잎은 절단될 수 있다. 가공된 담배 잎은 가공 전 또는 후에 절단될 수 있다. 적합하게는, 가공된 담배 잎은 가공 후에 절단될 수 있다.
일부 구체예에서, 담배 식물, 담배 식물의 수확된 잎 및/또는 가공된 담배 잎은 니코틴을 추출하는데 사용될 수 있다. 니코틴의 추출은 당 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 담배로부터 니코틴을 추출하는 방법은 본원에 참조로서 포함된 US 2,162,738호에 교시되어 있다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부, 또는 본 발명에 따른 담배 세포 배양물로부터 제조된 큐어링된 담배 물질을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부, 또는 본 발명에 따른 담배 세포 배양물로부터 제조된 담배 물질을 포함하는 담배 블렌드를 제공한다. 한 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 큐어링된 담배 물질을 포함하는 담배 블렌드를 제공한다.
적합하게는, 본 발명에 따른 담배 블렌드는 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부, 또는 본 발명에 따른 담배 세포 배양물로부터의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 담배를 포함할 수 있다. 적합하게는, 담배 블렌드는 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부, 또는 본 발명에 따른 담배 세포 배양물로부터의 약 10%의 담배를 포함할 수 있다. 적합하게는, 담배 블렌드는 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부, 또는 본 발명에 따른 담배 세포 배양물로부터의 약 20%의 담배를 포함할 수 있다. 적합하게는, 담배 블렌드는 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부, 또는 본 발명에 따른 담배 세포 배양물로부터의 약 30%의 담배를 포함할 수 있다. 적합하게는, 담배 블렌드는 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부, 또는 본 발명에 따른 담배 세포 배양물로부터의 약 40%의 담배를 포함할 수 있다. 적합하게는, 담배 블렌드는 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부, 또는 본 발명에 따른 담배 세포 배양물로부터의 약 50%의 담배를 포함할 수 있다. 적합하게는, 담배 블렌드는 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부, 또는 본 발명에 따른 담배 세포 배양물로부터의 약 60%의 담배를 포함할 수 있다. 적합하게는, 담배 블렌드는 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부, 또는 본 발명에 따른 담배 세포 배양물로부터의 약 70%의 담배를 포함할 수 있다. 적합하게는, 담배 블렌드는 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부, 또는 본 발명에 따른 담배 세포 배양물로부터의 약 80%의 담배를 포함할 수 있다. 적합하게는, 담배 블렌드는 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부, 또는 본 발명에 따른 담배 세포 배양물로부터의 약 90%의 담배를 포함할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 담배 블렌드 생성물은 본 발명에 따른 담배 식물 또는 이의 일부, 또는 본 발명에 따른 담배 세포 배양물로부터 큐어링된 담배를 건조 중량으로 적어도 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 95% 포함한다.
적합하게는, 큐어링된 담배 물질은 풍건될 수 있다. 적합하게는, 큐어링된 담배 물질은 열건된 수 있다. 적합하게는, 큐어링된 담배 물질은 양건될 수 있다.
본 발명에 따른 담배 제품 또는 흡연 물품은 본 발명에 따른 담배 물질(예를 들어, 큐어링된 담배 물질)을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 담배 제품을 제공한다. 본 발명에 따른 담배 제품은 블렌딩된 담배 제품일 수 있다. 한 구체예에서, 담배 제품은 본 발명의 담배 식물 또는 이의 일부로부터 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 담배 제품은 디테르펜 합성 유전자 활성 또는 발현을 억제하고 수크로스 에스테르 함량을 증가시킨 담배 식물로부터 제조될 수 있다. 담배 제품은 디테르펜 합성 유전자 활성 또는 발현의 감소 및 증가된 수크로스 에스테르 함량을 포함할 수 있다. 적합하게는, 담배 식물 또는 이의 일부는 본 발명에 따른 담배 식물 번식 물질로부터 번식될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "이의 일부"는 담배 식물의 맥락에서 담배 식물의 부분을 지칭한다. 바람직하게는 "이의 일부"는 담배 식물의 잎이다.
또 다른 구체예에서, 담배 제품은 본 발명의 수확된 잎으로부터 제조될 수 있다. 추가 구체예에서, 담배 제품은 본 발명의 가공된 담배 잎으로부터 제조될 수 있다. 적합하게는, 담배 제품은 큐어링, 발효 및/또는 저온살균 중 하나 이상에 의해 가공된 담배 잎으로부터 제조될 수 있다. 적합하게는, 담배 제품은 전술한 구체예에 따라 임의로 가공된 절단된 담배 잎을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 담배 제품은 흡연 물품일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "흡연 물품"은 담배, 담배 유도체, 팽화 담배, 재구성된 담배 또는 담배 대용물에 기반하든지 간에 롤링 토바코, 시거렛, 시거 및 시거릴로와 같은 흡연에 적당한 제품을 포함할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 담배 제품은 무연 담배 제품일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "무연 담배 제품"은 훈제가 의도되지 않고/거나 연소 처리되지 않은 담배 제품을 지칭한다. 한 구체예에서, 무연 담배 제품은 스누스, 스누프, 씹는 담배 등을 포함할 수 있다.
추가 구체예에서, 담배 제품은 담배 가열 장치 또는 하이브리드 장치 또는 전자 담배 등일 수 있다. 전형적으로, 가열 장치 또는 하이브리드 장치에서, 에어로졸은 열원에서 열원의 내부, 주변 또는 하류에 위치할 수 있는 물리적으로 분리된 에어로졸-형성 기재 또는 물질로의 열의 전달에 의해 생성된다. 흡연 중, 휘발성 화합물은 열원으로부터의 열 전달에 의해 에어로졸-형성 기재로부터 방출되고 흡연 물품을 통해 당겨진 공기 중에 동반된다. 방출된 화합물이 냉각됨에 따라, 이들은 응축되어 사용자에 의해 흡입되는 에어로졸을 형성한다.
담배 가열 장치를 소비 또는 흡연하기 위한 에어로졸-발생 물품 및 장치는 당 분야에 공지되어 있다. 이들은, 예를 들어, 에어로졸-발생 장치의 하나 이상의 전기 가열 요소로부터 담배 가열 장치의 에어로졸-형성 기재로 열을 전달함으로써 에어로졸을 생성하는 전기 가열식 에어로졸-발생 장치를 포함할 수 있다. 적합하게는, 담배 가열 장치는 에어로졸-발생 장치일 수 있다.
바람직하게는, 담배 가열 장치는 가열 비연소(heat-not-burn) 장치일 수 있다. 가열 비연소 장치는 당 분야에 공지되어 있고 담배를 태우지 않고 가열시킴으로써 화합물을 방출한다. 적합한 가열 비연소 장치의 예는 본원에 참조로서 포함된 WO2013/034459호 또는 GB2515502호에 교시된 것일 수 있다.
한 구체예에서, 담배 가열 장치의 에어로졸-형성 기재는 본 발명에 따른 담배 제품일 수 있다.
한 구체예에서, 담배 가열 장치는 하이브리드 장치일 수 있다.
폴리뉴클레오티드/폴리펩티드/작제물
본 발명의 특정 구체예에서, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 작제물은 프로모터의 유도 하에 식물 세포로 형질전환될 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 dsRNA 또는 amiRNA를 발현하는 ddRNAi DNA 작제물은 프로모터의 유도 하에 식물 세포로 형질전환될 수 있다.
작제물은 적합한 벡터, 예를 들어, 식물 형질전환 벡터에 의해 본 발명에 따른 식물에 도입될 수 있다. 식물 형질전환 벡터는 5'-3' 전사 방향으로, 프로모터 서열, 디테르펜 합성 유전자, 바람직하게는 사이클라제 2 유전자(CYC2), CBTol 사이클라제 또는 테르펜 신타제 3-8을 표적화하고, 선택적으로 인트론을 포함하는 ddRNAi DNA 작제물 서열, 및 선택적으로 RNA 중합효소에 대한 정지 신호 및 폴리아데닐라제에 대한 폴리아데닐화 신호를 포함하는 3' 비번역된 종료자 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 프로모터 서열은 하나 이상의 카피로 존재할 수 있고, 그러한 카피는 전술한 바와 같이 프로모터 서열과 동일하거나 이의 변이체일 수 있다. 종료자 서열은 식물, 박테리아 또는 바이러스 유전자로부터 수득될 수 있다. 적합한 종료자 서열은, 예를 들어, 완두 rbcS E9 종료자 서열, 애그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타제 유전자로부터 유래된 nos 종료자 서열 및 콜리플라워 모자이크 바이러스로부터의 35S 종료자 서열이다. 당업자는 다른 적합한 종료자 서열을 쉽게 알 수 있을 것이다.
본 발명의 작제물은 또한 프로모터의 강도를 증가시키는 유전자 발현 증진 메커니즘을 포함할 수 있다. 그러한 인핸서 요소의 예는 완두 플라스토시아닌 유전자의 프로모터의 일부로부터 유래되고 본원에 참조로서 포함된 국제 특허 출원 WO 97/20056호의 요지인 요소이다. 적합한 인핸서 요소는, 예를 들어, 애그로박테리움 투메파시엔스의 노팔린 신타제 유전자로부터 유래된 nos 인핸서 요소 및 콜리플라워 모자이크 바이러스로부터의 35S 인핸서 요소일 수 있다.
이들 조절 영역은 프로모터 DNA 서열과 동일한 유전자로부터 유래될 수 있거나 니코티아나 타바쿰 또는 다른 유기체, 예를 들어, 솔라나세와(Solanaceae) 과 또는 세트로이데와(Cetroideae) 아과의 식물로부터 유래될 수 있다. 모든 조절 영역은 형질전환되는 조직의 세포에서 작동할 수 있어야 한다.
프로모터 DNA 서열은 본 발명에서 사용되는 관심(예를 들어, 프로모터가 유도하려는 유전자, 예를 들어, 본 발명의 탈조절된 니트레이트 환원효소를 인코딩하는 유전자) 코딩 서열의 유전자와 동일한 유전자로부터 유래될 수 있거나 니코티아나 타바쿰 또는 다른 유기체, 예를 들어, 솔라나세와 과 또는 세트로이데와 아과의 식물로부터 유래될 수 있다.
발현 카세트는 pBIN 19 Plus, pBI 101, pKYLX71:35S2, pCAMBIA2300 또는 당 분야에 공지된 다른 적합한 식물 형질전환 벡터와 같은 기본 식물 형질전환 벡터에 혼입될 수 있다. 발현 카세트 외에도, 식물 형질전환 벡터는 형질전환 과정에 필요한 서열을 포함할 것이다. 이들은 애그로박테리움 vir 유전자, 하나 이상의 T-DNA 경계 서열, 및 선택 가능한 마커 또는 트랜스제닉 식물 세포를 확인하는 다른 수단을 포함할 수 있다.
용어 "식물 형질전환 벡터"는 생체내 또는 시험관내 발현이 가능한 작제물을 의미한다. 바람직하게는, 발현 벡터는 유기체의 유전체에 혼입된다. 용어 "혼입된"은 바람직하게는 유전체 내로의 안정한 혼입을 포함한다.
식물을 형질전환시키는 기술은 당 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 애그로박테리움-매개 형질전환을 포함한다. 유전적으로 변형된 식물의 작제에서의 기본 원칙은 삽입된 유전 물질의 안정한 유지를 획득하기 위해 유전 정보를 식물 유전체에 삽입하는 것이다. 일반적인 기술의 검토는 문헌[Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) and Christon (AgroFood-Industry Hi-Tech March/April1994 17-27), 본원에 참조로서 포함됨]에서 찾아볼 수 있다.
전형적으로, 애그로박테리움-매개 형질전환에서 관심 외래 DNA, 즉, ddRNAi DNA 작제물을 지니는 이원 벡터는 표적 식물로부터의 외식편과 애그로박테리움의 공동-배양에 의해 적절한 애그로박테리움 균주에서 표적 식물로 옮겨진다. 이후 형질전환된 식물 조직을 선택 배지 상에서 재생시키며, 선택 배지는 선택 가능한 마커 및 식물 성장 호르몬을 포함한다. 대안으로는, 무손상 식물의 꽃봉오리를 키메라 유전자를 함유하는 애그로박테리움 균주의 현탁액과 접촉시키고, 종자 세팅 후, 형질전환된 개체를 발아시키고 선택 배지 상에서 성장시킴으로써 확인하는 화아침지법(floral dip method)(Clough & Bent, 1998 Plant J. 1998 Dec;16(6):735-43, 본원에 참조로서 포함됨)이 있다. 애그로박테리움에 의한 식물 조직의 직접 감염은 널리 사용되어 왔고 본원에 참조로서 포함된 문헌[Butcher D. N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208]에 기재되어 있는 단순한 기술이다.
추가의 적합한 형질전환 방법은, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 또는 전기천공 기술, 입자 충격, 마이크로-주사 및 실리콘 카바이드 섬유의 사용을 이용한 원형질체로의 직접 유전자 전달을 포함한다. 실리콘 카바이드 위스커 기술을 포함하는 탄도 형질전환을 사용한 형질전환 식물은 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Frame B R, Drayton P R, Bagnaall S V, Lewnau C J, Bullock W P, Wilson H M, Dunwell J M, Thompson J A & Wang K (1994)]에 교시되어 있다. 실리콘 카바이드 위스커-매개 형질전환에 의한 다산성 트랜스제닉 옥수수 식물의 생산은 문헌[The Plant Journal 6: 941-948, 본원에 참조로서 포함됨)]에 교시되어 있고 바이러스 형질전환 기술은, 예를 들어, 문헌[Meyer P, Heidmmm I & Niedenhof I (1992)]에 교시되어 있다. 식물에 대한 벡터 시스템으로서 카사바 모자이크 바이러스의 사용은 본원에 참조로서 포함된 문헌[Gene 110: 213-217]에 교시되어 있다. 식물 형질전환에 대한 추가의 교시는 본원에 참조로서 포함된 EP-A-0449375호에서 찾아볼 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 ddRNAi DNA 작제물을 지니고 이를 식물과 같은 유기체의 유전체에 도입시키는 벡터 시스템에 관한 것이다. 벡터 시스템은 1개의 벡터를 포함할 수 있지만, 2개의 벡터도 포함할 수 있다. 2개 벡터의 경우, 벡터 시스템은 일반적으로 이원 벡터 시스템으로 지칭된다. 이원 벡터 시스템은 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Gynheung Anetal, (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19]에 더 상세하게 기재되어 있다.
식물 세포의 형질전환을 위해 광범위하게 사용되는 한 시스템은 애그로박테리움 투메파시엔스로부터의 Ti 플라스미드 또는 애그로박테리움 리조게네스로부터의 Ri 플라스미드를 사용한다[Anetal., (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 and Butcher D. N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams and J.P. Helgeson, 203-208, 본원에 참조로서 포함됨]. 식물에서 본 발명에 따른 요망되는 외인성 유전자의 각 도입 방법 후에, 추가 DNA 서열의 존재 및/또는 삽입이 필요할 수 있다. 식물 세포의 형질전환을 위한 T-DNA의 사용은 집중적으로 연구되었고 문헌[EP-A-120516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B. B., Amsterdam, 1985, Chapter V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46; and Anetal., EMBO J (1985) 4:277-284, 본원에 참조로서 포함됨]에 기재되어 있다.
디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 dsRNA 또는 amiRNA를 발현하는 ddRNAi DNA 작제물로 형질전환된 식물 세포를 성장시키고, 예를 들어, 아미노산, 식물 호르몬, 비타민 등과 같은 필요한 성장 인자들이 공급된 적합한 배양 배지에서 세포를 배양함으로써 이를 잘 알려진 조직 배양 방법에 따라 유지할 수 있다.
본 발명과 관련하여 용어 "트랜스제닉 식물"은 본 발명에 따른 ddRNAi DNA 작제물을 포함하는 임의의 식물을 포함한다. 따라서, 트랜스제닉 식물은 본 발명에 따른 ddRNAi DNA 작제물로 형질전환된 식물이다. 바람직하게는, 트랜스제닉 식물은 본 발명에 따라 억제된 디테르펜 합성 유전자 활성 또는 발현 및 증가된 수크로스 에스테르 함량을 나타낸다. 용어 "트랜스제닉 식물"은 자연 환경에도 있는 이들의 천연 프로모터의 제어 하에 있을 때의 그 자연 환경에서의 천연 뉴클레오티드 코딩 서열을 포함하지 않는다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 ddRNAi DNA 작제물, 식물 형질전환 벡터 또는 식물 세포는 분리된 형태이다. 용어 "분리된"은 상기 서열과 본질상 자연적으로 관련되고 자연에서 발견되는 적어도 하나의 다른 성분을 적어도 실질적으로 갖지 않는다는 것을 의미한다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 ddRNAi DNA 작제물, 식물 형질전환 벡터 또는 식물 세포는 정제된 형태이다. 용어 "정제된"은 비교적 순수한 상태, 예를 들어, 적어도 약 90%의 순도, 또는 적어도 약 95%의 순도 또는 적어도 약 98%의 순도를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레오티드 서열"은 올리고뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이의 변이체, 동족체, 단편 및 유도체(예를 들어, 이의 일부)를 지칭한다. 뉴클레오티드 서열은 유전체 또는 합성 또는 재조합 기원일 수 있고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타내든지 간에 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다.
본 발명과 관련된 용어 "뉴클레오티드 서열"은 유전체 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 RNA를 포함한다. 바람직하게는 이는 본 발명을 코딩하는 DNA, 더욱 바람직하게는 cDNA 서열을 의미한다.
바람직한 구체예에서, 그 자체가 본 발명의 범위와 관련되고 포함될 때 뉴클레오티드 서열, 즉, 디테르펜 합성 유전자는 자연 환경에 존재할 때 및 이의/이들의 자연 환경에도 존재하는 자연적으로 관련된 서열(들)에 연결될 때의 천연 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 용이한 참조를 위해, 이러한 바람직한 구체예를 "천연 뉴클레오티드 서열"이라 칭할 것이다. 이와 관련하여, 용어 "천연 뉴클레오티드 서열"은 천연 환경에 존재하고 자연적으로 결합된 전체 프로모터(프로모터도 천연 환경에 존재함)에 작동 가능하게 연결될 때의 전체 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
전형적으로, 본 발명의 범위에 포함되는 RNAi 분자는 재조합 DNA 기술(즉, 재조합 DNA)을 사용하여 제조된다. 그러나, 본 발명의 대안적인 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 당 분야에 널리 공지된 화학적 방법을 사용하여 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다(본원에 참조로서 포함되는 Caruthers MH et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T et al., (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232 참조).
본원에 정의된 디테르펜 합성 유전자로서 특수한 성질을 갖는 단백질 또는 변형에 적합한 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 상기 단백질을 생산하는임의의 세포 또는 유기체로부터 확인 및/또는 분리 및/또는 정제될 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 확인 및/또는 분리 및/또는 정제를 위한 다양한 방법이 당 분야에 널리 공지되어 있다. 예로서, 적합한 서열이 확인 및/또는 분리 및/또는 정제되면, 더 많은 서열을 제조하기 위해 PCR 증폭 기술을 사용할 수 있다.
추가의 예로서, 효소를 생산하는 유기체로부터의 염색체 DNA 또는 메신저 RNA를 사용하여 유전체 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리를 작제할 수 있다. 효소의 아미노산 서열이 알려져 있다면, 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하여 유기체로부터 제조된 유전체 라이브러리로부터 효소-인코딩 클론을 확인하는데 사용할 수 있다. 대안적으로, 다른 공지된 효소 유전자에 상동인 서열을 함유하는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 효소-인코딩 클론을 확인할 수 있었다. 후자의 경우, 낮은 엄격성의 하이브리드화 및 세척 조건이 사용된다.
또 다른 추가 대안에서, 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 확립된 표준 방법, 예를 들어, 문헌[Beucage S.L. et al., (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869, 본원에 참조로서 포함됨]에 기재된 포스포로아미다이트 방법, 또는 문헌[Matthes et al., (1984) EMBO J. 3, p 801-805, 본원에 참조로서 포함됨]에 기재된 방법에 의해 합성에 의해 제조될 수 있다. 포스포로아미다이트 방법에서, 올리고뉴클레오티드를, 예를 들어, 자동 DNA 합성기에서 합성하고, 정제하고, 어닐링하고, 라이게이션하고, 적절한 벡터에서 클로닝한다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산 서열"은 용어 "폴리펩티드" 및/또는 용어 "단백질"과 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열"은 용어 "펩티드"와 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열"은 용어 "효소"와 동의어이다.
본 발명은 또한 본원에 정의된 특수한 성질을 갖는 폴리펩티드 또는 임의의 뉴클레오티드 서열, 즉, 그러한 폴리펩티드를 인코딩하는 디테르펜 합성 유전자의 아미노산 서열(들)과 서열 동일성 또는 서열 상동성 정도를 갖는 서열의 사용을 포함한다(이하, "상동성 서열(들)"로 지칭됨). 여기서, 용어 "동족체"는 대상 아미노산 서열 및 대상 뉴클레오티드 서열과 일정한 상동성을 갖는 존재물을 의미한다. 여기서, 용어 "상동성"은 "동일성"과 같을 수 있다.
상동성 아미노산 서열 및/또는 뉴클레오티드 서열 및/또는 단편은 기능적 활성을 보유하고/거나 디테르펜 합성 유전자의 활성을 향상시키는 폴리펩티드를 제공 및/또는 인코딩하여야 한다. 전형적으로, 상동성 서열은, 예를 들어, 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함하거나 동일한 활성 부위를 인코딩할 것이다. 상동성은 또한 유사성(즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기)과 관련하여 고려될 수 있으나, 본 발명의 상황에서, 서열 동일성과 관련하여 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
한 구체예에서, 상동성 서열은 대상 서열과 비교하여 하나 또는 수 개의 첨가, 결실 및/또는 치환을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 취해진다.
상동성 또는 동일성 비교는 육안, 또는 더욱 일반적으로는 용이하게 이용 가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행될 수 있다. 이들 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 사이의 상동성 %를 계산할 수 있다. 상동성 % 또는 동일성 %는 인접 서열에 대해 계산될 수 있으며, 즉, 한 서열을 다른 서열과 정렬하고, 한 서열 내의 각각의 아미노산을 한번에 하나의 잔기씩 다른 서열 내의 상응하는 아미노산과 직접 비교한다. 이는 "갭이 없는" 정렬로 언급된다. 통상적으로, 그러한 갭이 없는 정렬은 비교적 짧은 수의 잔기에 대해서만 수행된다.
이는 매우 간단하고 일관된 방법이지만, 예를 들어, 서열의 달리 동일한 쌍에서, 하나의 삽입 또는 결실이 다음 아미노산 잔기로 하여금 정렬에서 벗어나게 하여, 잠재적으로는 전체적인 정렬이 수행될 때 상동성 %에서의 큰 감소를 발생시킬 것임을 고려하지 않는다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 스코어에 과도한 페널티 없이 가능한 삽입 및 결실을 고려한 최적 정렬을 발생시키도록 설계된다. 이는 국소 상동성을 최대화시키기 위해 서열 정렬 내에 "갭"을 삽입함으로써 달성된다.
그러나, 이러한 더욱 복잡한 방법은 정렬에서 발생하는 각각의 갭에 "갭 패널티"를 부과하여, 동일한 아미노산의 동일한 수에 대해, 가능한 한 적은 갭을 갖는 서열 정렬 - 2개의 비교된 서열 사이의 더 높은 관련성을 반영함 - 이 많은 갭을 갖는 서열 정렬보다 높은 스코어를 달성하도록 할 것이다. 갭의 존재에 대해 비교적 높은 코스트 및 갭 내의 각각의 후속 잔기에 대해 더 적은 페널티를 부과하는 "어파인 갭 코스트(Affine gap cost)"가 통상적으로 이용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 더 적은 갭을 갖는 최적화된 정렬을 발생시킬 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 페널티가 변형되는 것을 허용한다. 그러나, 서열 비교를 위해 그러한 소프트웨어를 이용하는 경우 디폴트 값을 이용하는 것이 바람직하다.
따라서, 최대 상동성 %의 계산은 먼저 갭 페널티를 고려한 최적 정렬의 생성을 필요로 한다. 그러한 정렬을 수행하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 Vector NTI(Invitrogen Corp.)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 소프트웨어의 예는, 예를 들어, BLAST 패키지(Ausubel et al. 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18 참조), BLAST 2(FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 and tatiana@ncbi.nlm.nih.gov 참조), FASTA(Altschul et al. 1990 J. Mol. Biol. 403-410) 및 AlignX를 비제한적으로 포함한다. 적어도 BLAST, BLAST 2 및 FASTA는 오프라인 및 온라인 검색에 이용 가능하다(Ausubel et al. 1999, pages 7-58 to 7-60 참조).
최종 상동성 %는 동일성과 관련하여 측정될 수 있으나, 정렬 과정 자체는 전형적으로 올-오어-낫씽(all-or-nothing) 쌍 비교를 기초로 하지 않는다. 대신, 화학적 유사성 또는 진화적 거리(evolutionary distance)를 기초로 하여 스코어를 각각의 페어와이즈 비교에 할당하는 스케일드 유사성 스코어 매트릭스(scaled similarity score matrix)가 일반적으로 이용된다. 일반적으로 사용되는 그러한 매트릭스의 예는 BLAST 스위트 프로그램에 대한 디폴트 매트릭스인 BLOSUM62 매트릭스이다. Vector NTI 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 값 또는 공급된 경우 맞춤 기호 비교 표를 이용한다(추가 세부사항에 대해서는 사용자 매뉴얼 참조). 일부 적용의 경우, Vector NTI 패키지의 디폴트 값을 사용하는 것이 바람직하다.
대안적으로, CLUSTAL(Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244)과 유사한 알고리즘에 기반하는 Vector NTI(Invitrogen Corp.)의 다중 정렬 기능을 사용하여 백분율 상동성을 계산할 수 있다. 소프트웨어가 최적 정렬을 생성한 후, 상동성 %, 바람직하게는 서열 동일성 %를 계산하는 것이 가능하다. 소프트웨어는 통상적으로 서열 비교의 일부로서 이를 수행하며, 수치적 결과를 발생시킨다.
서열 동일성을 결정할 때 갭 페널티를 사용해야 한다면, 페어와이즈 정렬에 다음의 파라미터를 사용하는 것이 바람직하다:
Figure 112019080561532-pct00001
한 구체예에서, CLUSTAL은 상기 정의된 갭 페널티 및 갭 연장 세트와 함께 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, BLAST 또는 CLUSTAL 정렬에 사용된 갭 페널티는 상기 상세히 설명한 것과 상이할 수 있다. 당업자는 BLAST 및 CLUSTAL 정렬을 수행하기 위한 표준 파라미터가 주기적으로 변할 수 있고, 그 때 BLAST 또는 CLUSTAL 정렬 알고리즘에 대해 상세히 설명된 표준 파라미터에 기반하여 적절한 파라미터를 선택할 수 있을 것임을 인지할 것이다.
적합하게는, 뉴클레오티드 서열에 관한 동일성 정도는 적어도 20개의 인접 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 30개의 인접 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 40개의 인접 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 50개의 인접 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 60개의 인접 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 100개의 인접 뉴클레오티드에 걸쳐 결정되고; 상기 뉴클레오타이드 서열은 ddRNAi DNA 작제물을 인코딩한다. 뉴클레오티드 서열에 관한 동일성 정도는 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드, 바람직하게는 20개의 인접 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 30개의 인접 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 40개의 인접 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 50개의 인접 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 60개의 인접 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 100개의 인접 뉴클레오티드에 걸쳐 결정된다.
적합하게는, 뉴클레오티드 서열에 관한 동일성 정도는 전체 서열에 대해 결정될 수 있다.
서열은 또한 침묵 변화를 생성하고 기능적으로 동등한 물질을 발생시키는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 물질의 이차 결합 활성이 보유되는 한 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 및/또는 양친매성 특성에서의 유사성을 기초로 하여 계획적인 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음성으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양성으로 하전된 아미노산은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 헤드 기를 갖는 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 및 티로신을 포함한다.
보존적 치환은, 예를 들어, 하기 표에 따라 이루어질 수 있다. 두 번째 컬럼 내의 동일 블록 및 바람직하게는 세 번째 컬럼 내의 동일 라인의 아미노산은 서로 치환될 수 있다:
Figure 112019080561532-pct00002
본 발명은 또한 상동성 치환(치환 및 대체 둘 모두는 기존의 아미노산 잔기와 대체 잔기의 상호교환을 의미하기 위해 본원에서 사용된다), 즉, 염기성은 염기성, 산성은 산성, 극성은 극성 등과 같은 유사한(like-for-like) 치환을 발생시킬 수 있는 상동성 치환을 포함한다. 비상동성 치환은 또한, 즉, 한 부류의 잔기에서 또 다른 것으로 발생할 수 있거나 대안적으로 비자연 아미노산, 예를 들어, 오르니틴(이하, Z로 지칭됨), 디아미노부티르산 오르니틴(이하, B로 지칭됨), 노르류신 오르니틴(이하, O로 지칭됨), 피리일알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신의 포함을 수반할 수 있다.
대체는 또한 하기를 포함하는 비자연 아미노산에 의해 이루어질 수 있다; 알파* 및 알파-이치환된* 아미노산, N-알킬 아미노산*, 락트산*, 자연 아미노산의 할라이드 유도체, 예를 들어, 트리플루오로티로신*, p-Cl-페닐알라닌*, p-Br-페닐알라닌*, p-I-페닐알라닌*, L-알릴-글리신*, β-알라닌*, L-α-아미노 부티르산*, L-γ-아미노 부티르산*, L-α-아미노 이소부티르산*, L-ε-아미노 카프로산#, 7-아미노 헵탄산*, L-메티오닌 설폰#*, L-노르류신*, L-노르발린*, p-니트로-L-페닐알라닌*, L-하이드록시프롤린#, L-티오프롤린*, 페닐알라닌(Phe)의 메틸 유도체, 예를 들어, 4-메틸-Phe*, 펜타메틸-Phe*, L-Phe(4-아미노)#, L-Tyr(메틸)*, L-Phe(4-이소프로필)*, L-Tic(1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카르복실산)*, L-디아미노프로피온산# 및 L-Phe(4-벤질)*. 표기법 *은 유도체의 소수성 특성을 나타내기 위해, (상동성 또는 비상동성 치환과 관련하여) 상기 논의의 목적을 위해 사용된 반면 #은 유도체의 친수성 특성을 나타내기 위해 사용되었고, #*는 양친매성 특성을 나타낸다.
변이체 아미노산 서열은 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서 외에도 메틸, 에틸 또는 프로필기와 같은 알킬기를 포함하는 서열의 임의의 2개 아미노산 잔기 사이에 삽입될 수 있는 적합한 스페이서 기를 포함할 수 있다. 추가의 변형 형태는 펩토이드 형태의 하나 이상의 아미노산 잔기의 존재를 포함하며, 이는 당업자에게 잘 이해될 것이다. 의심의 여지를 피하기 위해, "펩토이드 형태"는 α-탄소라기보다 α-탄소 치환기 그룹이 잔기의 질소 원자 상에 있는 변이체 아미노산 잔기를 지칭하기 위해 사용된다. 펩토이드 형태의 펩티드를 제조하는 방법은 당 분야, 예를 들어, 문헌[Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 and Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134]에 공지되어 있다.
본 발명에서 사용하기 위한 뉴클레오티드 서열은 그 안에 합성 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 다수의 상이한 유형의 변형이 당 분야에 공지되어 있다. 이들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 백본 및/또는 분자의 3' 및/또는 5' 말단에 아크리딘 또는 폴리리신 사슬의 첨가를 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 본원에 기재된 뉴클레오티드 서열은 당 분야에서 이용 가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 그러한 변형은 본 발명의 뉴클레오티드 서열의 생체내 활성 또는 수명을 향상시키기 위해 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 서열에 상보적인 서열 또는 본 발명의 서열 또는 이에 상보적인 서열에 하이브리드화될 수 있는 서열을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "하이브리드화"는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술에서 수행되는 증폭 과정 뿐만 아니라 "핵산 가닥이 염기 페어링을 통해 상보적인 가닥과 결합하는 과정"을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 뉴클레오티드 서열(본원에 제시된 것들의 상보적인 서열을 포함함)에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 바람직하게는, 하이브리드화는 엄격한 조건(예를 들어, 50℃ 및 0.2xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3시트레이트 pH 7.0}) 하에 결정된다. 보다 바람직하게는, 하이브리드화는 매우 엄격한 조건(예를 들어, 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3시트레이트 pH 7.0}) 하에 결정된다.
한 양태에서, 본 발명에서 사용하기 위한 서열은 합성 서열 - 즉, 시험관내 화학적 또는 효소적 합성에 의해 제조된 서열이다. 여기에는 숙주 유기체에 대한 최적의 코돈 사용으로 만들어진 서열이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "발현 벡터"는 생체내 또는 시험관내 발현이 가능한 작제물을 의미한다. 한 구체예에서, 본 발명의 벡터는 dsRNA를 발현한다. 한 구체예에서, 본 발명의 벡터는 amiRNA를 발현한다. 바람직하게는, 발현 벡터는 적합한 숙주 유기체의 유전체에 혼입된다. 용어 "혼입된"은 바람직하게는 유전체 내로의 안정한 혼입을 포함한다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열은 뉴클레오티드 서열이 적합한 숙주 유기체에 의해 뉴클레오티드 서열의 발현을 제공할 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 벡터에 존재할 수 있다. 본 발명에 사용하기 위한 ddRNAi DNA 작제물은 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 제공하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 적합한 숙주 세포로 형질전환될 수 있다. 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 또는 파지 벡터의 선택은 종종 이것이 도입될 숙주 세포에 의존할 것이다. 벡터는 시험관내에서, 예를 들어, RNA의 생산에 사용될 수 있거나 숙주 세포를 트랜스펙션, 형질전환, 형질도입 또는 감염시키는데 사용될 수 있다.
따라서, 추가 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 복제 가능한 벡터 내로 도입하고, 벡터를 양립 가능한 숙주 세포 내로 도입시키고, 벡터의 복제를 일으키는 조건 하에 숙주 세포를 성장시킴으로써 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 제조하는 방법을 제공한다. 벡터는 해당 숙주 세포에서 벡터가 복제될 수 있게 하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 그러한 서열의 예는 플라스미드 pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 및 pIJ702의 복제 기점이다.
일부 적용에서, 본 발명에 사용하기 위한 뉴클레오티드 서열은 선택된 숙주 세포에 의한 것과 같은, 뉴클레오티드 서열의 발현을 제공할 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 예로서, 본 발명은 상기 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하고, 즉, 벡터는 발현 벡터이다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 기재된 성분이 의도된 방식으로 기능할 수 있는 관계로 놓여 있는 병렬상태를 지칭한다. 코딩 서열에 "작동 가능하게 연결된" 조절 서열은 코딩 서열의 발현이 조절 서열과 양립 가능한 조건 하에 달성되는 방식으로 라이게이션된다.
용어 "조절 서열"은 프로모터 및 인핸서 및 다른 발현 조절 신호를 포함한다. 용어 "프로모터"는, 예를 들어, RNA 중합효소 결합 부위라는 당 분야의 통상적인 의미로 사용된다. dsRNA 또는 amiRNA를 인코딩하는 ddRNAi DNA 작제물 내의 뉴클레오티드 서열은 적어도 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
용어 "작제물" - "카세트" 또는 "벡터" 등의 용어와 동의어임 - 은 프로모터에 직접 또는 간접적으로 부착된 본 발명에 따른 사용을 위한 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
간접 부착의 예는 본 발명의 프로모터 및 뉴클레오티드 서열 중간에 인트론 서열, 예를 들어, Sh1-인트론 또는 ADH 인트론과 같은 적합한 스페이서 기의 제공이다. 직접 또는 간접 부착을 포함하는 본 발명과 관련된 용어 "융합된"에 대해서도 마찬가지이다. 일부 경우에, 상기 용어는 야생형 유전자 프로모터와 통상적으로 연관된 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 자연적 조합 및 이들 둘 모두가 자연 환경에 있을 때의 자연적 조합을 포함하지 않는다. ddRNAi DNA 작제물은 심지어 유전적 작제물의 선택을 허용하는 마커를 포함하거나 발현할 수 있다.
식물을 형질전환하는데 사용되는 일반적인 기술에 대한 검토는 본원에 참조로서 포함되는 Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) 및 Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)에 의한 논문에서 찾아볼 수 있다. 식물 형질전환에 대한 추가의 교시는 본원에 참조로서 포함된 EP-A-0449375호에서 찾아볼 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 문헌[Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994), and Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)]은 본 개시내용에서 사용된 많은 용어의 일반적인 사전을 당업자에게 제공한다.
본 개시내용은 본원에 개시된 예시적인 방법 및 물질에 의해 제한되지 않으며, 본원에 개시된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용의 구체예를 실시 또는 시험하는데 사용될 수 있다. 숫자 범위는 그 범위를 규정하는 수를 포함한다. 달리 지시하지 않는 한, 각각, 임의의 핵산 서열은 5'에서 3' 배향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여지고; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 배향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 쓰여진다.
본원에 제공된 제목은 본 개시내용의 다양한 양태 또는 구체예의 제한이 아니며, 전체로서 명세서에 대한 언급으로 해석될 수 있다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어는 전체로서 명세서를 참조하여 더욱 완전하게 정의된다.
아미노산은 본원에서 아미노산, 3문자 약어 또는 1문자 약어의 명칭을 사용하여 지칭된다. 본원에서 사용되는 용어 "단백질"은 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "아미노산 서열"은 용어 "폴리펩티드" 및/또는 용어 "단백질"과 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열"은 용어 "펩티드"와 동의어이다. 일부 예에서, 용어 "아미노산 서열"은 용어 "효소"와 동의어이다.
용어 "단백질"과 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 개시내용 및 청구 범위에서, 아미노산 잔기에 대한 통상적인 1문자 및 3문자 코드가 사용될 수 있다. IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature(JCBN)을 준수하여 정의된 아미노산에 대한 3-문자 코드. 폴리펩티드는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 하나 초과의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있음이 또한 이해된다.
용어의 다른 정의가 명세서 전체에 나타날 수 있다. 예시적인 구체예가 보다 상세하게 설명되기 전에, 본 개시내용은 기술된 특정 구체예예에 제한되지 않으며, 당연히 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하기 위한 것이며, 본 개시내용의 범위는 첨부된 청구 범위에 의해서만 제한될 것이므로, 제한하려는 의도가 아님이 또한 이해되어야 한다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이에 있는 각각의 개재된 값은, 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 하한 단위의 1/10까지 또한 구체적으로 개시된 것으로 이해된다. 임의의 언급된 값 또는 언급된 범위 내의 개재된 값 사이의 각각의 더 작은 범위 및 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 개재된 값은 본 개시내용에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 그 범위 내에 포함되거나 배제될 수 있으며, 어느 한쪽의 한계, 둘 다 아니거나 둘 모두의 한계가 더 작은 범위에 포함되는 경우 각 범위는 또한 언급된 범위에서 어떤 특정하게 배제된 한계를 조건으로 하여, 본 개시내용에 포함된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 본 개시내용에 포함된다.
본원 및 첨부된 청구 범위에서 사용된 단수 형태는 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수 대상물을 포함하는 것임에 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "효소" 또는 "니트레이트 환원효소"에 대한 언급은 복수의 그러한 후보 제제 및 당업자에게 공지된 이의 동등물 등을 포함한다.
본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 이들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원의 어떠한 내용도 그러한 간행물이 여기에 첨부된 청구 범위의 선행 기술을 구성한다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
장점
유리하게는, 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현의 억제는 담배 식물의 수크로스 에스테르 함량을 증가시킨다. 이론에 구속되길 원하지 않으며, 디테르펜을 만드는 탄소 이용을 줄임으로써 수크로스 에스테르 생산이 향상되는 것으로 여겨진다. 유리하게는, 본 발명의 방법은 높은 바이오매스 식물인 바람직한 "터키-유사" 화학을 갖는 담배 식물을 생산할 수 있다. 유리하게는, 본 발명은 가열 비연소 제품에 유용한 바람직한 연기 화학 및 화학작용을 제공한다. 본 발명은 이제 하기 도면 및 실시예를 참조하여 단지 예시로서 기재될 것이다.
실시예
실시예 1 트랜스제닉 작제물, GW1, GW2, GW3, GW5의 제조
본 발명자들은 식물 트리콤 이차 대사를 분석하고 전사후 유전자 침묵 전량(PTGS)을 이용하여 수크로스 에스테르 함량에 대한 트리콤-발현된 유전자의 영향을 평가하고자 하였다. RNAi를 이용하여 사이클라제 2 유전자(CYC2), CBTol 사이클라제 및 테르펜 신타제 3-8의 기능을 평가하였다. 작제물 제조 및 식물 재생을 위한 방법은 통상적인 분자 클로닝 기술(Sambrook et al. 1989 Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)과 함께 Wang 및 Wagner 2003(상기에 본원에 참조로서 포함됨)에서 상세하게 제공된다.
트랜스제닉 작제물 GW1 - 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 발현을 억제한다
이 ddRNAi DNA 작제물은 사이클라제 2 유전자(CYC2)에 기초하여 설계되었다. CYC2의 mRNA의 완전한 코딩 서열은 AF401234로 표시된다. 유전체 서열은 AY495694로 표시된다. GW1 식물을 생성하는데 사용된 작제물은 5'-서열 AF401234로부터의 54번째 내지 716번째 센스 단편; 헤어핀 루프로서 부분적인 GUS A 단편(787번째 내지 1812번째 뉴클레오티드) GUS A 표시는 AF502128이다; 및 CYC2 센스 단편의 역 보체-3'으로 구성된다. 작제물은 센스 배향으로 CYC2 mRNA(AF401234)로부터의 뉴클레오티드 54 내지 716을 포함한다. 이 서열은 유전체 서열(AY495694)로부터의 뉴클레오티드 위치에 상응한다: 뉴클레오티드 1 내지 25, 뉴클레오티드 26 내지 271(엑손 1), 뉴클레오티드 1253 내지 1529(엑손 2) 및 제3 엑손의 처음 115개 뉴클레오티드(뉴클레오티드 2366 내지 2480). 플라스미드 pKYLX71-35S2는 유전자 작제물에 사용된 이원 벡터이다((Wang et al. 2001 상기에 본원에 참조로서 포함됨). GW1 작제물 삽입체의 서열은 SEQ ID No. 5에 개시되어 있다.
트랜스제닉 작제물 GW2 - 테르펜 신타제 3-8 유전자의 발현을 억제한다
이 ddRNAi DNA 작제물은 miRNA168 1차 전사체(EU549055.1; GI: 171195398)(5'127-에서 535-3')를 기초로 하여 설계되었고, 여기서 196-216은 원래 서열(Genbank: AY528645, SEQ ID NO. 3에 도시된 뉴클레오티드 위치에 상응함)에 대한 역 보체에서 뉴클레오티드 1497로부터 21개 뉴클레오티드로 치환되었고, 뉴클레오티드 279-299는 정방향 배향에서 원래 사슬로부터 21개 뉴클레오티드로 치환되었지만, 영역 1497-1517이 사용되었을 때 3개의 염기가 변형되었다. 5'-HindIII, 및 3'-EcoRI 제한 부위 확장에 측접한 모듈을 2X35S 프로모터 및 35S 종료자 사이에 삽입하였다. 2X35S prom- miRNAi 3-8 및 35S 종료자를 함유한 확장된 모듈을 이원 벡터 pCAMBIA2300의 다중 클로닝 부위(MCS)에 도입하였다. 재조합 벡터(KmR)를 A. 투메파시엔스, GV3101(RifR, GmR)에 삽입하였다. 콜로니를 삼중 항생제(Km, Rif, Gen)에서 선택하였다. 애그로박테리움 형질전환을 플라스미드 PCR에 의해 확인하였다. GW2 작제물 삽입체의 서열은 SEQ ID No. 7에 개시되어 있다.
트랜스제닉 작제물 GW3 - CBTol 사이클라제 유전자의 발현을 억제한다
이 ddRNAi DNA 작제물은 N. 타바쿰 사이클라제 유전자(AY049090)를 기초로 하여 설계되었다. 이 이중 가닥 RNAi 모듈은 다음의 방식으로 어셈블링되었다:- N. 타바쿰 사이클라제 유전자(AY049090)로부터의 부분적인 서열, 정방향 및 역방향 배향에서 SEQ ID No. 1의 5' 2854에서 4175- 3', 부분적인 엑손 4, 완전한 인트론 4, 엑손 5, 인트론 5, 엑손 6, 인트론 6, 및 부분적인 엑손 7로 구성됨. 정방향 및 역방향 스트레치 사이의 스페이서는 부분적인 GUS A 유전자, 5'- 786-1816-3'이었다. 플라스미드 pCAMBIA2300은 이 유전자 작제물에 사용된 이원 벡터였다. GW3 작제물 삽입체의 서열은 SEQ ID No. 6에 개시되어 있다.
트랜스제닉 작제물 GW5 - 테르펜 신타제 3-8 유전자의 발현을 억제한다
이 ddRNAi DNA 작제물은 miRNA168 1차 전사체(EU549055.1; GI: 171195398)(5'127-에서 535-3')를 기초로 하여 설계되었고, 여기서 196-216은 원래 서열(Genbank: AY528645, SEQ ID NO. 3에 도시된 뉴클레오티드 위치에 상응함)에 대한 역 보체에서 뉴클레오티드 884로부터 21개 뉴클레오티드로 치환되었고, 뉴클레오티드 279-299는 정방향 배향에서 원래 사슬로부터 21개 뉴클레오티드로 치환되었지만, 영역 884-904가 사용되었을 때 센스 사슬의 4개의 염기가 변형되었다. 5'-HindIII, 및 3'-EcoRI 제한 부위 확장에 측접한 모듈을 2X35S 프로모터 및 35S 종료자 사이에 삽입하였다. 2X35S prom- miRNAi 3-8 및 35S 종료자를 함유한 확장된 모듈을 이원 벡터 pCAMBIA2300의 다중 클로닝 부위(MCS)에 도입하였다. 재조합 벡터(KmR)를 A. 투메파시엔스, GV3101(RifR, GmR)에 삽입하였다. 콜로니를 삼중 항생제(Km, Rif, Gen)에서 선택하였다. 애그로박테리움 형질전환을 플라스미드 PCR에 의해 확인하였다. GW5 작제물 삽입체의 서열은 SEQ ID No. 11에 개시되어 있다.
실시예 2 T.I. 1068의 애그로-형질전환 및 재생
N. 타바쿰 T.I. 1068 종자를 KTRDC 종자 수집소로부터 수득하고 70% EtOH로 1분, 이어서 5%(v/v) 클로록스(Chlorox)로 표면 살균한 다음, 살균 수로 3회 세척하였다. 식물을 PLANTCON® 용기(MP Biomedicals, LLC)에서 시험관내 성장시키고, 형질전환을 위한 외식편의 스톡으로서 사용하였다. 모든 작제물을 애그로박테리움-매개 형질전환에 의해 담배 품종 T.I. 1068에 도입하고 트랜스진의 존재를 PCR에 의해 확인하였다. A. 투메파시엔스 형질전환은 일부 변형과 함께 본원에 참조로서 포함되는 문헌[Horsch et al. in Horsch RB, Fry JE, Hoffmann NL, Eichholtz D, Rogers SG, Fraley RT (1985) Science 227:1229-1231]에 기술된 대로 본질적으로 수행되었다. 애그로박테리움을 50 mg/l Km, 50 mg/l Rif 및 35 mg/l Gm(GW1, GW2)을 함유하는 LB 배지에서 밤새 성장시켰다. GW3의 경우, Km은 Hyg(55mg/l)로 대체되었다.
살균-성장한 식물(45일됨)의 절단된 잎 조각(1 cm2)을 암실에서 2일 동안 박테리아(1x108 cfu/ml)로 접종한 다음, 블롯팅 건조시키고, 200 mg/l Km(또는 GW3의 경우 55 mg/l Hyg) 및 400 mg/l 세포탁심이 보충된 Gamborg B-5 비타민(Sigma-Aldrich Co. LTD, Irvine, UK), 3% 수크로스, 1 mg/l BAP 및 0.05 mg/l NAA을 보충한 MS 배지로 옮겼다. 약 1개월 후에, 작은 모?遲? 조각 모서리에서 형성되었고 같은 배지에서 1회 계대 후, 묘목을 동일한 배지로 옮겼지만, 호르몬을 제거하고 항생제는 반으로 감소시켰다. 뿌리를 내린 식물은 성장실에서 수정된 Pro-Mix(Premier Horticulture Inc., Canada)로 옮겨졌다. 개개의 형질전환체를 GC-MS를 통해 분석하였고, 바람직한 변화를 가진 것들을 T1 세대의 추가 분석을 위해 자체-시딩하였다.
실시예 3 필드 성장한 대조군 대 트랜스제닉 계통의 녹색 잎 분석
필드 시험을 위한 계통의 제조 및 필드 시험 설계
T3 또는 T2 식물의 자가-수분으로 생성된 계통 GW1 및 GW2로부터의 종자를 표면 살균하고 Gamborg B-5 비타민(Sigma-Aldrich Co. LTD, Irvine, UK), 3% 수크로스, 및 Km(200 mg/l)을 보충한 MS 배지에서 시험관내 발아시켰다. GW3 종자를 표면 살균하고 Hyg(55 mg/l)를 함유하는 배지에서 발아시켰다. 1개월 후, 묘목을 온실의 부유 트레이로 옮기고(수정된 Pro-Mix(Premier Horticulture Inc., Canada)) 필드에 옮겨 심기 전에 7-8주 동안 성장시켰다. 표준 필드 실습이 사용되었고 필요에 따라 관개가 사용되었다. 열건 및 풍건의 수확 및 수집(벌리에 대해)은 약 4 ½개월 후에 완료되었다. 열건은 다음을 포함하였다: 48시간 착색, 85 내지 100℉, 94% RH; 24시간 시듬(wilting), 100℉ 내지 120℉, 54% RH; 30시간 잎 건조, 120℉ 내지 135℉, 40% RH; 40시간 줄기 건조, 135 내지 168℉, 22% RH.
GC-MS에 의한 TMS 유도체로서 삼출물 성분의 측정
녹색 잎 측정을 위해, 각 식물의 중간 잎의 라미나의 중간으로부터 2개의 잎 디스크(직경 2 cm)를 절단하였다. 디스크를 아세토니트릴(5 ml)로 30초 동안 세척하였다. 세척물을 진공 로터 증발을 통해 농축하여 유성 잔류물을 생성하였다. 본질적으로 문헌[Severson et al. 1985(상기에 본원에 참조로서 포함됨)]에 기재된 대로, 다음과 같이 잔류물을 유도체화하여 트리-메틸 실릴(TMS) 에스테르를 형성하였다: 아세토니트릴 세척물을 증발 건조시키고, 1 ml의 CHCl3에 용해시키고, 1.5 ml의 GC 바이알로 옮기고, N2의 스트림 하에 40℃에서 건조시켰다. 유도체화된 샘플을 1 ml의 디메틸 포름아미드(DMF) 및 50 μl의 BSTFA[비스(트리메틸실릴) 트리플루오로아세트아미드]에 용해시키고, 내부 표준 셈브렌(cembrene)으로서 24 μg의 셈브렌을 각 바이알에 첨가하였다. 샘플을 70℃에서 45분 동안 유도체화하고, 실온으로 냉각하고, 분석하였다.
TMS 유도체를 분리하고 0.25 μm 필름 두께 및 0.25 mm 직경을 갖는 30.0 m Agilent 모세관 컬럼 19091J-413을 사용하여, GC-MS(HP5973 MS 및 자동 샘플러 주입기가 장착된 HP6890 GC)에 의해 분석하였다. 헬륨은 1.8 ml/min 일정 유량 및 250℃의 주입 온도를 갖는 담체 가스였다. TMS 에스테르 유도체를 진행시키기 위한 오븐 프로그램은 다음과 같았다: 2.0분 동안 초기 온도 180℃; 280℃까지 분 당 8℃ 속도, 9.5분 동안 유지. 총 진행 시간은 24.0분이었다. 용리된 화합물을 이들의 체류 시간에 의해 그리고 MS 프로파일을 표준과 비교하여 확인하였다. 디테르페노이드는 시스-아비에놀에서 βCBT-디올로 6 내지 8분에; 디테르페노이드 산화 생성물은 8 내지 13.5분에; 수크로스 에스테르는 17 내지 22.5분에 용리되었다. 열건 및 풍건된 조직의 성분 측정을 위해, 건조 조직으로부터 통상적인 잎의 6.14 x 6.14 cm 조각(녹색 조직의 12개 잎 디스크에 해당함)을 절단하여 아세토니트닐로 세척하였다. 녹색 잎 분석에 사용된 것과 동일한 잎을 사용하여 풍건 및 열건용 계통 및 대조군 당 10 내지 16개의 복제 샘플을 제조하였다(잎 펀치). TMS 유도체로서 화학 분석용 샘플의 제조는 상기 기술된 바와 같았고, 수크로스 에스테르의 아실기에 대해서는 다음과 같았다.
모든 화합물 및 내부 표준의 통합 피크 면적을 기록하고, 각각의 상대량을 총 %로 계산하였다. 수많은 수크로스 에스테르 타입의 피크를 합쳐 요약 피크 면적을 제공하였다.
식물 당 평균 잎의 수, 식물 당 녹색 잎의 중량 및 대조군 대 트랜스제닉 계통의 식물 당 총 삼출물 중량은 하기 표 1에 제시되어 있다. 데이터는 토핑 후 19일에 각 계통의 3개 식물의 평균이다. (토핑은 담배 꽃을 제거하는 것을 지칭한다)
작제물 GW2 및 GW5(T0), 및 이들의 T1 및 T2 세대에 대한 GC-MS 결과는 동일하였다; 둘 모두는 매우 높은 라브데네디올 및 낮은 CBT-디올 및 시스-아비에놀을 나타내었다. 중복을 피하기 위해, 필드 작업은 작제물 GW2만을 사용하여 수행되었다.
표 1.
Figure 112019080561532-pct00003
표 1은 식물 당 평균 잎의 수, 식물 당 녹색 잎의 무게가 시험된 트랜스제닉 계통 간에 유사했고 대조군 식물과 유사하였음을 보여준다.
필드 성장한 대조군 대 트랜스제닉 계통의 녹색 잎 분석
녹색 잎 삼출물 화학 분석은 토핑 직후에 수행되었고, 이는 각 계통에 대해 필드의 삼출물 화학이 온실의 식물에서 관찰된 것과 유사하였고, 화학에서의 식물-대-식물 가변성이 필드의 대조군 및 각 계통에 대해 약 25-30%였음을 나타내었다(도 3 참조). 그래프의 각 점은 한 식물로부터의 데이터를 나타낸다. 도 3에 제시된 데이터는 다음을 나타낸다:
· 계통 GW1 및 GW3은 시스-아비에놀이 풍부하다
· 계통 GW2는 라브덴-디올이 풍부하다.
수크로스 에스테르 아실 조성의 측정
사용된 방법은 문헌[Severson et al. 1985](상기에 본원에 참조로서 포함됨)으로부터 변형된다. 30 ml Corex 유리 튜브 중 5 내지 10 mg의 검 샘플에 80% MeOH 중 0.5 ml KOH(1M)를 첨가하고 22℃에서 밤새 정치시켜 비누화한다. 이후 샘플을 N2 하에 건조시킨 후, 1 ml의 n-BuOH 및 3방울의 농축된 H2SO4를 첨가하였다. 이후 샘플을 110℃에서 1시간 동안 가열한 후 성분을 펄스형 볼텍스 혼합기(10회 펄스, 각각 1.5초)를 사용하여 헥산과 물(각각 1.5 ml) 사이에서 분배시켰다. 6 내지 7회 추출하였다(수상이 리트머스 종이에 대해 중성이 될 때까지). 수상은 K2SO4, H2SO4 및 당류를 함유하고 헥산상은 부틸 에스테르의 아실기를 함유한다. 헥산을 1.5 ml GC 바이알로 옮기고 TMS와 동일한 컬럼을 사용하여 GC-MS에 의해 분석하였다. 헬륨은 1.8 ml/min 일정 유량 및 250℃의 주입 온도를 갖는 담체 가스였다. 부틸 에스테르 유도체를 진행시키기 위한 오븐 프로그램은 다음과 같았다: 3.0분 동안 초기 온도 90℃; 160℃까지 분 당 3℃ 속도, 2분 동안 유지, 250℃까지 분 당 15℃ 속도, 5분 유지. 총 진행 시간은 39.33분이었다.
도 4의 데이터는 계통 GW1 및 GW3(높은 시스-아비에놀을 포함함)가 또한 대조군과 비교하여 향상된 수크로스 에스테르 수율을 나타냄을 명백하게 보여준다. 그래프의 각 점은 한 식물로부터의 데이터를 나타낸다. 아실 조성은 변하지 않았으므로, 이들 계통은 높은 수준의 시스-아비에놀 및 높은 3-메틸 발레르산 전구체가 존재한다는 점에서 터키 또는 오리엔탈 담배와 유사하지만, 유리하게는 이들은 비교적 높은 바이오매스 식물에 의해 생산된다.
도 4는 다음을 보여준다:
· 높은 시스-아비에놀 계통(GW1 및 GW3)에서 수크로스 에스테르가 대조군에 비해 크게 풍부해졌다.
· GW2 계통(높은 라브데네디올)에서도 수크로스 에스테르가 상승하였다.
실시예 4 녹색 대 열건된 필드 담배 및 녹색 대 풍건된 담배의 삼출물 성분
안정한 특성의 RNAi 계통, T2 또는 T3를 필드에서 성장시켰다. 열건 및 풍건의 수확 및 수집(벌리에 대해)은 약 4 ½개월 후에 완료되었다. 열건은 다음을 포함하였다: 실시예 3에 기재된 대로, 48시간 착색, 85 내지 100℉, 94% RH; 24시간 시듬, 100℉ 내지 120℉, 54% RH; 30시간 잎 건조, 120℉ 내지 135℉, 40% RH; 40시간 줄기 건조, 135 내지 168℉, 22% RH.
도 3 및 4에 대해 생성된 것과 동일한 TMS 크로마토그램을 사용하여 표 2 및 3에서 μg/cm2로 표현되는, 표면적을 기초로 하여 삼출물 성분을 재계산하였다(녹색 대 열건 및 녹색 대 풍건). 피크 반응이 모든 화합물에 대해 동일하다는 가정 하에, 내부 표준 셈브렌의 알려진 양과의 비교에 기초하여 계산하였다. 표 2에 도시된 화합물의 양은 대조군용 식물인 20개 녹색의 평균, 및 계통 GW1-3에 대한 34 내지 36개 녹색 식물 및 10 내지 14개 큐어링된 식물의 평균, ± 이들의 개개 표준 편차를 나타낸다.
표 2. 녹색 대 열건된 2014년 필드 담배의 삼출물 성분
Figure 112019080561532-pct00004
*2개 잎 디스크 추출물로부터 시스-아비에놀의 풍부도는 낮았다. 숫자는 총 녹색 잎 추출물의 %로부터 계산된다. **2개 잎 디스크-녹색으로부터 a-및 b-CBT-디올의 풍부도는 낮았다. 여기서 숫자는 총 녹색 잎 추출물의 %로부터 계산된다.
표 2에 제시된 데이터는 열건이 대조군 식물의 수크로스 에스테르 삼출물 성분을 증가시키지 않지만 작제물 GW1, GW2 또는 GW3을 포함하는 트랜스제닉 식물의 수크로스 에스테르 함량을 증가시키는 것을 보여준다. 열건은 또한 작제물 GW1, GW2 또는 GW3을 포함하는 트랜스제닉 식물의 LD 함량을 증가시켰다. 열건은 모든 담배의 시스-아비에놀 함량을 증가시켰다.
상기 데이터는 열건이 녹색 담배와 비교하여 GW2 트랜스제닉 식물의 삼출물 성분의 α-CBT-디올 함량을 증가시키는 것을 보여준다. 대조군 식물의 α-CBT-디올 함량도 열건에 의해 증가하지만 보다 낮은 정도이다. 상기 데이터는 또한 열건이 녹색 담배와 비교하여 GW2 트랜스제닉 식물의 삼출물 성분의 β-CBT-디올 함량을 증가시키는 것을 보여준다. 대조군 식물의 β-CBT-디올 함량은 열건에 의해 영향을 받지 않는다.
산화 생성물은 트랜스제닉 계통에서 증가하였다.
표 3(아래)에 도시된 화합물의 양은 대조군용 식물인 20개 녹색의 평균, 및 계통 GW1-3에 대한 34 내지 36개 녹색 식물 및 8 내지 16개 큐어링된 식물의 평균, ± 이들이 개개 표준 편차를 나타낸다.
아래 표 3에 제시된 데이터는 풍건이 대조군 식물의 수크로스 에스테르 삼출물 성분을 증가시키지 않지만 작제물 GW1, GW2 또는 GW3을 포함하는 트랜스제닉 식물의 수크로스 에스테르 함량을 약간 증가시키는 것을 보여준다. 수크로스 에스테르 함량은 트랜스제닉 계통에서 풍건에 안정하다. 상기 데이터는 또한 열건이 녹색 담배와 비교하여 GW2 트랜스제닉 식물의 삼출물 성분의 α-CBT-디올 함량(트랜스제닉에서의 미량 성분임)을 증가시키는 것을 보여준다. 대조군 식물의 α-CBT-디올 함량은 열건에 의해 영향을 받지 않는다.
하기 데이터는 풍건이 녹색 담배와 비교하여 GW2 트랜스제닉 식물의 삼출물 성분의 β-CBT-디올 함량을 증가시키는 것을 보여준다. 대조군 식물의 β-CBT-디올 함량도 열건에 의해 증가하지만 보다 낮은 정도이다. 풍건은 또한 작제물 GW1, GW2 또는 GW3을 포함하는 트랜스제닉 식물의 LD 함량을 증가시켰다. 풍건은 대조군 및 GW1 또는 GW3을 포함하는 담배의 시스-아비에놀 함량을 증가시켰다.
산화 생성물은 트랜스제닉 계통에서 증가하였다.
표 3. 녹색 대 풍건된 2014년 필드 담배의 삼출물 성분
Figure 112019080561532-pct00005
*2개 잎 디스크 추출물로부터 시스-아비에놀의 풍부도는 낮았다. 숫자는 총 녹색 잎 추출물의 %로부터 계산된다. **2개 잎 디스크-녹색으로부터 a-및 b-CBT-디올의 풍부도는 낮았다. 숫자는 총 녹색 잎 추출물의 %로부터 계산된다.
실시예 5 디테르페노이드 조성 및 수크로스 에스테르의 아실 조성의 분석
디테르페노이드 조성 및 수크로스 에스테르 아실 조성을 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정하였다. 본 발명자들은 트랜스제닉 계통에서 디테르페노이드 및 수크로스 에스테르 조성을 대조군 T.I. 1068 및 양건된 터키 타입 상업용 담배와 비교하였다. 양건된 상업용 담배는 압축된 잎으로 본 발명자들에게 보내졌다. 트랜스제닉 담배 계통에 대해 제시된 데이터는 10 내지 14개 식물의 평균을 제공하지만 T.I. 1068 대조군은 16개 이상의 식물의 평균을 제공한다.
비교를 위해 다음 상업용 터키 타입을 분석하였다:
A = 오리엔탈, 공급처: Socotab EOOD, Crop 2013
B= 터키-삼순 작물 2013년, Grade SMAL
C= 터키-IXMIR, 작물 2013년, Grade YZAL
표 4 디테르페노이드 함량의 삼출물 조성물 분석 참조
표 4(아래)의 데이터는 열건된 트랜스제닉 계통 GW1, GW2 및 GW3이 시험된 대조군 및/또는 터키 식물과 비교하여 더 높은 수크로스 에스테르 함량을 갖는 것을 보여준다.
표 5 수크로스 에스테르 아실기 조성의 삼출물 조성물 분석 참조
트랜스제닉 담배 계통에 대해 제시된 데이터는 4 내지 8개 식물의 평균을 제공하지만 T.I. 1068 대조군은 10개 이상의 식물의 평균을 제공한다. 표 5(아래)의 데이터는 트랜스제닉 담배 계통 GW1, GW2 및 GW3의 수크로스 에스테르 아실 조성이 터키-타입 담배 조성물과 유사하고, 즉, 3-Me 발레르산 아실기가 풍부하다는 것을 보여준다.
Figure 112019080561532-pct00006
Figure 112019080561532-pct00007
실시예 6 GW3 표면 화학 분석
녹색 필드, 풍건 및 열건된 샘플의 분석을 수행하였다. 가능하다면, 녹색 필드 데이터를 얻기 위해 잎 펀치를 취했을 때 필드의 잎에 마킹하고 넘버링함으로써 모두는 같은 잎으로부터의 샘플에서 수행되었다. 풍건 또는 열건 후, 녹색/풍건 및 녹색/열건을 직접 비교할 수 있도록 동일하게 넘버링된 잎을 샘플링하였다. 하기 표는 녹색 대 열건 및 녹색 대 풍건된 샘플의 결과를 보여준다. 데이터는 마이크로그램/잎 cm2로 표준화되었다.
표 6. 녹색 필드, 풍건 및 열건된 샘플의 GW3 표면 화학 분석
Figure 112019080561532-pct00008
녹색 또는 열건 또는 풍건 옆에 있는 괄호 안의 숫자는 얼마나 많은 독립적인 샘플이 분석되어 평균을 내는데 사용되었는지를 나타낸다. 예를 들어, 대조군 녹색(20)은 20개의 독립적인 샘플을 의미한다. 이들의 평균 값은 아래 표준 편차와 함께 보여지며, 예를 들어, 대조군 녹색(2)에 대해, 6.695 ± 3.834이다.
녹색 대 열건에 대한 데이터는 계통에 대한 것이다: 대조군 및 GW3 - 높은 시스-아비에놀. 이 데이터는 시스-아비에놀이 녹색-대-열건에서 크게 감소하였고, 이 시스가 GW3 - 높은 시스-아비에놀 계통의 경우 가장 오른쪽 컬럼에서 특정 "산화 생성물"로 분해되었을 수 있음을 보여준다. 이 데이터는 또한 라브데네디올이 GW3의 녹색-대-열건에서 증가하였음을 보여준다. 상기 변화는 비레적이었고, 예를 들어, 시스가 녹색-대-열건에서 낮아졌을 때(μg/cm2), 라브데네디올은 비례적으로 증가하였다. 산화됨의 컬럼 값도 녹색-대-열건에서 GW3에 대해 실질적으로 증가하였음을 주목한다. 또한, CBT디올은 녹색-대-열건에서 크게 변화하지 않았고 수크로스 에스테르 양은 대조군에서 녹색-대-열건에서 크게 변화하지 않은 반면; GW3 계통에서는 상당히 증가하였다(+4.7). 별도의 분석(도시되지 않음)은 안정한 수크로스 에스테르에 대해 예상된 대로, 녹색-대-열건에서, 아실기 조성의 정성적 변화를 나타내지 않았다. 녹색 대 풍건에 대한 데이터는 녹색-대-열건에 대해 관찰된 것보다 녹색-대-풍건에서 변화가 더 작다는 것을 보여준다. 산화됨만이 실질적으로 증가하는 것으로 보였고, 이는 아마도 시스-아비에놀 분해 때문이다.
도 5는 수크로스 에스테르 함량이 대조군에 비해 트랜스제닉 계통 GW-3에서 풍부하였음을 입증한다. 수크로스 에스테르 함량은 총 주요 삼출물 화합물의 백분율로 표시된다. 도 6은 시스-아비에놀 함량이 대조군에 비해 트랜스제닉 계통 GW-3에서 풍부하였음을 입증한다. 시스-아비에놀 함량은 총 주요 삼출물 화합물의 백분율로 표시된다.
실시예 7 열건 및 풍건된 2016년 필드 담배의 삼출물 성분
안정한 특성의 RNAi 계통, T2 또는 T3를 필드에서 성장시키고 수확하였다. 열건된 식물을 2016년에 3회 프라이밍으로 수확하였다. 2016년 시험에서, 풍건된 식물은 분석 전에, 절단되고, 풍건되고, 1/3 하부 잎, 1/3 중간 잎, 및 1/3 상부 잎으로 분리된 줄기였다. 이것은 상업적 생산에 사용되는 일반적인 접근법을 모방한 것이었다.
표 7. 열건된 2016년 필드 담배의 삼출물 성분
Figure 112019080561532-pct00009
a) 2016년에는, 2014년과 달리, 열건을 위해, 3회 프라이밍을 취하여 별도로 분석하였다.
b) 각 프라이밍의 각 값은 평균 3회 반복의 평균이다. 각 반복은 20개 식물로부터의 평균이다.
c) 2016년에는, 2014년과 달리, 필드 식물의 녹색 조직을 모니터링하지 않았다.
결론
표 7의 데이터는 수크로스 에스테르가 2016년 열건된 필드 담배의 대조군에 비해 계통 GW1-3에서 풍부하였음을 보여준다.
표 8 풍건된 2016년 필드 담배의 삼출물 성분
Figure 112019080561532-pct00010
a) 2016년에는, 2014년과 달리, 절단된 풍건된 식물 줄기의 상부 1/3, 중간 1/3 및 하부 1/3 잎을 모아서, 따로 분석하였다.
b) 각 수준의 각 값은 20개의 독립적인 식물로부터의 20개 잎의 평균이다.
c) 2016년에는, 2014년과 달리, 필드 식물의 녹색 조직을 모니터링하지 않았다.
결론
표 8의 데이터는 수크로스 에스테르가 2016년 풍건된 필드 담배의 대조군에 비해 계통 GW1-3에서 풍부하였음을 보여준다.
상기 명세서에 언급된 모든 간행물은 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명에 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 사상으로부터 벗어남이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정한 바람직한 구체예와 관련하여 기재되었으나, 청구된 바와 같은 본 발명은 상기 특정 구체예로 부당하게 제한되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 또한, 생화학 및 생물공학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방식의 다양한 변형은 하기 청구 범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Kentucky Research Foundation <120> METHOD <130> P108191KR <140> EP 18706918.2 <141> 2018-02-06 <150> US 62/455850 <151> 2017-02-07 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4624 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 1 ccttatattt atccaccact tgagctactt tctataacca attaaagtaa gtccaattct 60 aacattgtat gctgtgctgc ccttattttt ggctacaaaa ctcgaaagca aaggaactag 120 aaaactcgtc tggcgagaga aagagagatg agtcaatcaa tttctccaat ctttcctcgc 180 tttgcaaaat ttcagtcgaa tatttggagg tgcagtactt ttgaactcag agttatacac 240 tcatcatatg cctctattgg agggaggaga aaagagagag aaagaagaat gaagcgagca 300 atgaatcctt cttcaagctc gcgtcatttg gcagattttc actcaaccat ttggggtgac 360 cattttctct cctacaattc tgaaataaca gtaggtcaca tacatatgta atcacatgct 420 tatattctat ttgaatttgt tatctaaatg tttaaaggaa taaagatgtt ataattttat 480 tagagacagg atcaagcatt taaacttgga aggtttaacc tttaagattg gtctttatcg 540 tacttttgaa attatgagtt tgaaatttaa tactccatcc gtctcaataa agaatgaata 600 ttttactatc tagggagtca aacaagattt 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gaatttaata 600 cttcctccgt ctcaaaaaag aatgaatctt ttactatatg gggtcaaata agattttctt 660 tggccatatt ttttgcaaat gcatttcaaa tattttgaat ttttaattgt gtgacttaca 720 atacctttta tgcagtttct aaatgtgtaa aatatatttc aaacttttaa agaatattat 780 gtcatcacat taaaaatatt gaacttgact ctcatgctcc gacaggttaa ataatgaaac 840 gaatggaata ttactatttt gtaaaaactt aggtaggttt tcactatata tttaataatg 900 tattcaaact cataaataat gatcaaaagg agctttgacg ggaggtcacg ggttcgagcc 960 gtggaaacaa cctcttgcaa aaatgtaagg taagactgca tacaatagac tcttgtggtc 1020 cgccccttct ccggaccccg cacatagcgg aagcttattg cactaggctg ccctttttag 1080 tgattaacat atgtggatct aggatttaaa ttttttgggt tcaaccttta aggatctgtt 1140 acaattttag tagaatgtta cacataaatt tgtgctccgt gaatgtattg agtcagatga 1200 acctggtatt atacatgcgg atacgctcct gatgctcaat ttctgcctgc aggaaattac 1260 tacccaagag aaaaatgaac atgaaatgct aaaagaaata gttcggaaaa tgttggtaga 1320 aactccagat aatagtacac aaaaactagt cttgattgac acaattcaaa gattgggatt 1380 agcatatcat ttcaatgatg agattgaaaa ctccattcaa aacatcttta atttgtctca 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tgtgtacgca gatcttaccc taccttatag aggtagaaat gttgttcccg atagaccctc 4020 gactcaaaaa aagcatttct cagtctgatt tcgagtctag gtggcacttt tgcatgataa 4080 aataaataga catgcttgat aaattacaac ttcaatgatc acatttactt aaactgaatt 4140 atggaacttt agaaacggct gattaaaatg gtaaaatatt gtataataat gaagaaattg 4200 aaatatatta tgttgtaggt tgaacaacaa agaggacatg ttgcttcatt tgttgagtgc 4260 tacatgaaag aatatggagt ttcaaagcaa gaaacatatg ttgagatgcg gaaaaaaatc 4320 acaaatgcgt ggaaagatat aaataaggaa ctcttgcgcc ctactgcagt accaatgttt 4380 atcctcgaac gatctttaaa tttttcaaga ttggccgata catttttgaa agatgatgat 4440 ggatacacaa atcccaaatc caaagttaaa gacttgattg cttcgttgtt tgtcgaatct 4500 gtcgacatat gattatatat aacaatgcag a 4531 <210> 9 <211> 2251 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 9 gctgcctttt ttttttttgg gctacaaaac tctaaagtaa aggaactaga aaactcgttt 60 ggcgagagaa agagagagat gagtcaatca atttctccat taatgttttc tcactttgca 120 aaatttcagt cgaatatttg gagatgcaat acttctcaac tcagagttat acactcatca 180 tatgcctctt ttggagggag aagaaaagag agagtaagaa 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tcaatatagt 1080 cgttcaagaa gtttggtaac aaaagtagtc aaaatgaact ccattattga tgacacttat 1140 gatgcttatg caacttttga tgagcttgtg cttttcacgg atgcgatcca aagatgggac 1200 gaaggtgcca tggatttatt accgacatat ctgagaccta tttatcaagg ccttctcgac 1260 gttttcaatg aaatggaaga agtattggcc aaagaaggta aagcagatca catttactat 1320 gcgaaaaaag agatgaaaaa ggtggcggaa gtctatttta aggaagctga atggttgaat 1380 gctaactaca ttccaaaatg cgaggagtat atgaaacatg gacttgtaag ctctaccggt 1440 ccgatgtatg gaataatttc tttggttgtt atggaggaaa ttataacaaa agaggctttt 1500 gaatggttga caaatgaacc tttgattctt cgacctgcat caacaatttg tagattaatg 1560 gatgatatgg ctgatcatga agttgaacaa caaagaggac atgttgcttc atttgttgag 1620 tgctacatga aagaatatgg agtttcaaag caagaagcat atgttgagat gcggaaaaaa 1680 atcacaaatg cgtggaaaga tataaataag gaactcttgc gccctactgc agtaccaatg 1740 tttatcctcg aacgatcttt aaatttttca agattggccg atacattttt gaaagatgat 1800 gatggataca caaatcccaa atccaaagtt aaagacttga ttgcttcgtt gtttgtcgaa 1860 tctgtcgaca tatgattata tataacaatg cagacacacc ttcaaagctg agtatttgga 1920 gcaaatatgg aagcattttg tattgtccat gtaaccctat aagtcacgtg tttgggcaat 1980 ggcaacattt actaatattt gcattatggt aggttgttta catcacacct attgggggcg 2040 acccttccta aaacctgaca tgaatgtgtg atgctttgtg cacctggcgg ctcattttta 2100 ctatttcact gttacaactt atttggacgg ttgttaacct attgaatcat gtagtattgt 2160 tacttaaata caatgtttat tttaattatt acttaaattt tattctatca tatcgttaaa 2220 tccatcatta cgtaacaaaa aaaaaaaaaa a 2251 <210> 10 <211> 598 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 10 Met Ser Gln Ser Ile Ser Pro Leu Met Phe Ser His Phe Ala Lys Phe 1 5 10 15 Gln Ser Asn Ile Trp Arg Cys Asn Thr Ser Gln Leu Arg Val Ile His 20 25 30 Ser Ser Tyr Ala Ser Phe Gly Gly Arg Arg Lys Glu Arg Val Arg Arg 35 40 45 Met Asn Arg Ala Met Asp Leu Ser Ser Ser Ser Arg His Leu Ala Asp 50 55 60 Phe Pro Ser Thr Ile Trp Gly Asp His Phe Leu Ser Tyr Asn Ser Glu 65 70 75 80 Ile Thr Glu Ile Thr Thr Gln Glu Lys Asn Glu His Glu Met Leu Lys 85 90 95 Glu Ile Val Arg Lys Met Leu Val Glu Thr Pro Asp Asn Ser Thr Gln 100 105 110 Lys Leu Val Leu Ile Asp Thr Ile Gln Arg Leu Gly Leu Ala Tyr His 115 120 125 Phe Asn Asp Glu Ile Glu Asn Ser Ile Gln Asn Ile Phe Asn Leu Ser 130 135 140 Gln Asn Ser Glu Asp Asp Asp Glu His Asn Leu Tyr Val Ala Ala Leu 145 150 155 160 Arg Phe Arg Leu Ala Arg Gln Gln Gly Tyr Tyr Met Ser Ser Asp Val 165 170 175 Phe Lys Gln Phe Thr Asn His Asp Gly Lys Phe Lys Glu Asn His Thr 180 185 190 Asn Asp Val Gln Gly Leu Leu Ser Leu Tyr Glu Ala Ala His Met Arg 195 200 205 Val His Asp Glu Glu Ile Leu Glu Glu Ala Leu Ile Phe Thr Thr Thr 210 215 220 His Leu Glu Ser Val Ile Pro Asn Leu Ser Asn Ser Leu Lys Val Gln 225 230 235 240 Val Thr Glu Ala Leu Ser His Pro Ile Arg Lys Ala Ile Pro Arg Val 245 250 255 Gly Ala Arg Lys Tyr Ile His Ile Tyr Glu Asn Ile Gly Thr His Asn 260 265 270 Asp Leu Leu Leu Lys Phe Ala Lys Leu Asp Phe Asn Met Leu Gln Lys 275 280 285 Leu His Arg Lys Glu Leu Asn Glu Leu Thr Ser Trp Trp Lys Asp Leu 290 295 300 Asp Arg Ala Asn Lys Phe Pro Tyr Ala Lys Asp Arg Leu Val Glu Ala 305 310 315 320 Tyr Phe Trp Thr Val Gly Ile Tyr Phe Glu Pro Gln Tyr Ser Arg Ser 325 330 335 Arg Ser Leu Val Thr Lys Val Val Lys Met Asn Ser Ile Ile Asp Asp 340 345 350 Thr Tyr Asp Ala Tyr Ala Thr Phe Asp Glu Leu Val Leu Phe Thr Asp 355 360 365 Ala Ile Gln Arg Trp Asp Glu Gly Ala Met Asp Leu Leu Pro Thr Tyr 370 375 380 Leu Arg Pro Ile Tyr Gln Gly Leu Leu Asp Val Phe Asn Glu Met Glu 385 390 395 400 Glu Val Leu Ala Lys Glu Gly Lys Ala Asp His Ile Tyr Tyr Ala Lys 405 410 415 Lys Glu Met Lys Lys Val Ala Glu Val Tyr Phe Lys Glu Ala Glu Trp 420 425 430 Leu Asn Ala Asn Tyr Ile Pro Lys Cys Glu Glu Tyr Met Lys His Gly 435 440 445 Leu Val Ser Ser Thr Gly Pro Met Tyr Gly Ile Ile Ser Leu Val Val 450 455 460 Met Glu Glu Ile Ile Thr Lys Glu Ala Phe Glu Trp Leu Thr Asn Glu 465 470 475 480 Pro Leu Ile Leu Arg Pro Ala Ser Thr Ile Cys Arg Leu Met Asp Asp 485 490 495 Met Ala Asp His Glu Val Glu Gln Gln Arg Gly His Val Ala Ser Phe 500 505 510 Val Glu Cys Tyr Met Lys Glu Tyr Gly Val Ser Lys Gln Glu Ala Tyr 515 520 525 Val Glu Met Arg Lys Lys Ile Thr Asn Ala Trp Lys Asp Ile Asn Lys 530 535 540 Glu Leu Leu Arg Pro Thr Ala Val Pro Met Phe Ile Leu Glu Arg Ser 545 550 555 560 Leu Asn Phe Ser Arg Leu Ala Asp Thr Phe Leu Lys Asp Asp Asp Gly 565 570 575 Tyr Thr Asn Pro Lys Ser Lys Val Lys Asp Leu Ile Ala Ser Leu Phe 580 585 590 Val Glu Ser Val Asp Ile 595 <210> 11 <211> 416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ddRNAi DNA construct (GW5) insert sequence <400> 11 cttccctctt ctctttcttc ataaccctgt ctaaagggat tattatgata gtagagtctc 60 accatcgggc tcggattcga agaaatcatc caccgctcca attcggctga cacagcctcg 120 tgacatttaa atctttattg gtttgtgagc agggattgga gcggtggagg atttcttagt 180 atcggatcct cgaggtgtaa aaaaactcgt aaatcctatc agatctggaa gatttctacg 240 cttctccttc tttatattcg ttttcttatg ctttttattt ttgatataac ctagaaaaag 300 gctttttata tctttgaatc cgaaattgtt tgttttagaa tattgtatat ctgattttta 360 tcccttttta tatttgaatg ttctttagtc tccttttgtt tgcccaaatg ttgaat 416

Claims (31)

  1. 담배 식물 또는 이의 일부, 또는 담배 세포 배양물의 수크로스 에스테르 함량을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법이 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제함으로써 상기 담배 식물 또는 담배 세포 배양물을 변형시키는 것을 포함하며,
    상기 디테르펜 합성 유전자가 사이클라제 2 유전자(CYC2), CBTol 사이클라제 유전자 또는 테르펜 신타제 3-8 유전자인, 방법.
  2. 담배 식물 또는 이의 일부 또는 담배 세포 배양물의 수크로스 에스테르 함량을 증가시키기 위한, 디테르펜 합성 유전자를 포함하는 조성물로서,
    상기 디테르펜 합성 유전자는 사이클라제 2 유전자(CYC2), CBTol 사이클라제 유전자 또는 테르펜 신타제 3-8 유전자인 조성물.
  3. 증가된 수크로스 에스테르 함량을 갖는 담배 식물 또는 이의 일부, 담배 식물 번식 물질, 담배 잎, 절단하여 수확된 담배 잎, 가공된 담배 잎 또는 절단하여 가공된 담배 잎 또는 담배 세포 배양물을 생산하는 방법으로서, 상기 방법이 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하도록 상기 담배를 변형시키는 것을 포함하며,
    상기 디테르펜 합성 유전자는 사이클라제 2 유전자(CYC2), CBTol 사이클라제 유전자 또는 테르펜 신타제 3-8 유전자인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 수크로스 에스테르 함량이 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하도록, 변형되지 않은 담배 식물 또는 담배 세포 배양물과 비교하여 증가되는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 디테르펜 합성 유전자의 발현이 RNA 간섭(RNAi)을 사용하여 억제되는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 사이클라제 2 유전자(CYC2) 발현이 사이클라제 2 유전자(CYC2)의 엑손 1의 적어도 일부, 엑손 2의 적어도 일부 및 엑손 3의 적어도 일부를 포함하는 ddRNAi DNA 작제물을 사용하여 억제되는 방법.
  7. 제5항에 있어서, CBTol 사이클라제 유전자 발현이 CBTol 사이클라제 유전자의 엑손 4의 적어도 일부, 인트론 4, 엑손 5, 인트론 5, 엑손 6, 인트론 6 및 엑손 7의 적어도 일부를 포함하는 ddRNAi DNA 작제물을 사용하여 억제되는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 테르펜 신타제 3-8 유전자 발현이 테르펜 신타제 3-8 유전자의 적어도 뉴클레오티드 1497 내지 1517을 포함하는 ddRNAi DNA 작제물을 사용하여 억제되고, 이 때 넘버링이 SEQ ID No. 3과의 정렬에 의해 결정되는 방법.
  9. 제5항에 있어서, 테르펜 신타제 3-8 유전자 발현이 테르펜 신타제 3-8 유전자의 적어도 뉴클레오티드 884 내지 904를 포함하는 ddRNAi DNA 작제물을 사용하여 억제되고, 이 때 넘버링이 SEQ ID No. 3과의 정렬에 의해 결정되는 방법.
  10. 변형되지 않은 식물과 비교하여 수크로스 에스테르 함량의 증가를 달성하도록 변형된 담배 식물 또는 이의 일부로서, 상기 변형이 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현의 억제이고, 상기 디테르펜 합성 유전자가 사이클라제 2 유전자(CYC2) 또는 테르펜 신타제 3-8 유전자인, 담배 식물 또는 이의 일부.
  11. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 ddRNAi 작제물을 포함하는 담배 식물 또는 이의 일부.
  12. 제10항에 따른 담배 식물로부터 수득될 수 있는 담배 식물 번식 물질.
  13. 담배 식물의 수크로스 에스테르 함량이 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현을 억제하도록, 변형되지 않은 담배 식물 또는 담배 세포 배양물과 비교하여, 변형된 담배 식물 또는 담배 세포 배양물에서 적어도 2배 더 높은 제1항에 따른 방법.
  14. 담배 식물의 재배를 위한 제10항에 따른 담배 식물 또는 이의 일부.
  15. 담배 산업 제품의 생산을 위한 제10항에 따른 담배 식물 또는 이의 일부.
  16. 작물을 성장시키기 위한 제10항에 따른 담배 식물 또는 이의 일부.
  17. 담배 잎 또는 가공된 담배 잎을 생산하기 위한 제10항에 따른 담배 식물 또는 이의 일부.
  18. 제10항에 따른 담배 식물의 수확된 잎 또는 제12항에 따른 번식 물질로부터 번식된 담배 식물로부터 수득될 수 있거나 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 담배 식물로부터 수득될 수 있는 수확된 잎.
  19. 제18항에 있어서, 담배 식물의 수확된 잎이 절단하여 수확된 잎인 담배 식물의 수확된 잎.
  20. i) 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 담배 식물로부터 수득될 수 있거나;
    ii) 제10항에 따른 담배 식물을 가공함으로써 수득될 수 있거나;
    iii) 제12항에 따른 담배 식물 번식 물질로부터 번식된 담배 식물로부터 수득될 수 있는 가공된 담배 잎.
  21. 제20항에 있어서, 담배가 큐어링, 발효, 저온살균 또는 이들의 조합에 의해 가공되는 가공된 담배 잎.
  22. 제20항에 있어서, 가공된 담배 잎이 절단하여 가공된 담배 잎인 가공된 담배 잎.
  23. 제10항에 따른 식물 또는 이의 일부 또는 이들의 추출물로부터 제조된 큐어링된 담배 물질.
  24. 제23항의 상기 큐어링된 담배 물질을 포함하는 담배 블렌드.
  25. i) 제10항에 따른 담배 식물 또는 이의 일부;
    ii) 제12항에 따른 담배 식물 번식 물질로부터 번식된 담배 식물 또는 이의 일부;
    iii) 상기 i) 또는 ii)에 따른 담배 식물의 수확된 잎;
    iv) 상기 iii)에 따른 수확된 잎을 가공함으로써 수득된 가공된 담배 잎;
    v) 제23항에 따른 큐어링된 담배 물질; 또는
    vi) 제24항에 따른 담배 블렌드로부터 제조된 담배 산업 제품.
  26. 제25항에 있어서, 담배 제품이 가연성 흡연 물품인 담배 산업 제품.
  27. 제25항에 있어서, 담배 제품이 무연 담배 제품인 담배 산업 제품.
  28. 제25항에 있어서, 담배 제품이 불연성 에어로졸 공급 시스템인 담배 산업 제품.
  29. 제10항에 따른 식물 또는 이의 일부 또는 이들의 추출물; 또는 제23항에 따른 큐어링된 담배 물질; 또는 제24항에 따른 담배 블렌드를 포함하는 가연성 흡연 물품, 불연성 에어로졸 공급 시스템, 무연 담배 제품 및 담배 가열 장치로 이루어진 군에서 선택되는 담배 산업 제품.
  30. 변형되지 않은 담배 세포 배양물과 비교하여 수크로스 에스테르 함량의 증가를 달성하도록 변형된 담배 세포 배양물로서, 상기 변형이 디테르펜 합성 유전자의 활성 또는 발현의 억제이고, 상기 디테르펜 합성 유전자가 사이클라제 2 유전자(CYC2) 또는 테르펜 신타제 3-8 유전자인, 담배 세포 배양물.
  31. (a) 제10항에 따른 담배 식물 또는 제10항에 따른 담배 식물 일부 또는 제30항에 따른 담배 세포 배양물을 제공하는 단계; 및
    (b) (a)의 담배 식물, 담배 식물 일부 또는 담배 세포 배양물로부터 담배 추출물을 제조하는 단계를 포함하는, 담배 추출물의 제조 방법.
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