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KR102274119B1 - 담수, 해수 및 기수에서 오일생산성이 높은 클로렐라 신균주 - Google Patents

담수, 해수 및 기수에서 오일생산성이 높은 클로렐라 신균주 Download PDF

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KR102274119B1
KR102274119B1 KR1020160127794A KR20160127794A KR102274119B1 KR 102274119 B1 KR102274119 B1 KR 102274119B1 KR 1020160127794 A KR1020160127794 A KR 1020160127794A KR 20160127794 A KR20160127794 A KR 20160127794A KR 102274119 B1 KR102274119 B1 KR 102274119B1
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chlorella
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weight
microalgae
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조대현
장용근
허진아
오희목
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한국생명공학연구원
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Abstract

본 발명은 하천에서 분리되고 담수, 해수 및 기수에서 빠른 생장이 가능하고, 바이오매스, 색소 생산성 및 지질 생산성이 우수한 미세조류인 클로렐라 (Chlorella sp.) 세포주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서 새롭게 분리된 클로렐라 HS2는 기존의 다른 미세조류 및 미생물과는 다르게 담수, 해수 그리고 기수에서 매우 빠른 성장속도로 배양이 가능하여 배지 생산을 위한 물 사용이 자유로우며 높은 바이오매스 생산성을 보이고 세포 내 지질함량이 우수하여 미세조류오일 및 바이오디젤 시장에서 활용이 가능하다. 또한 색소 함량도 1.8%로 다른 미세조류와 유사하거나 조금 높은 수준이지만 빠른 생장속도로 인하여 색소 생산성은 기존 미세조류보다 높아 색소생산을 위한 자원으로서도 잠재력을 가지고 있어, 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

담수, 해수 및 기수에서 오일생산성이 높은 클로렐라 신균주{Novel Chlorella sp. strain having high oil productivity in fresh water, sea water and rackish water}
본 발명은 하천에서 분리되고 담수, 해수 및 기수에서 빠른 생장이 가능하고, 바이오매스, 색소 생산성 및 지질 생산성이 우수한 미세조류인 클로렐라 (Chlorella sp.) HS2 세포주 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 경유 대체연료로 바이오디젤이 많은 관심을 받고 있다. 바이오디젤은 식물성 기름 또는 동물성 유지로부터 생산된 지방산의 메틸 또는 에틸 에스테르 화합물로 정의된다. 바이오디젤은 기존 경유에 비해 일산화탄소, 미세먼지, 탄화수소, 독성물질 등 대기 오염물질 배출을 크게 줄일 수 있다는 점에서 친환경 자동차 연료로 적합하다. 또한 바이오디젤의 연소에서 나오는 이산화탄소는 다시 식물의 광합성 기작에 의해 흡수, 고정되므로 이산화탄소의 순 배출이 거의 없어 이산화탄소 중립 연료(CO2-neutral fuel)로 큰 주목을 받고 있다.
특히 생물연료(바이오에탄올, 바이오디젤) 생산이 주목을 받고 있지만, 작물을 이용한 생물연료의 생산은 경작지 확대에 따른 생태계 파괴, 식량부족 등의 문제를 야기한다. 그러나 광합성 미생물인 미세조류(microalgae)의 태양에너지 이용효율은 5% 정도로, 육상식물의 0.2%에 비해 약 25배 정도 높으며, 이산화탄소 고정화 속도는 소나무의 15배로 매우 효율적이다.
또한, 미세조류의 단위면적당 바이오디젤 생산(오일 함량이 30%인 경우)은 약 58,700 L/ha로 대두의 446 L/ha에 비해 130배에 달한다. 미세조류는 유휴 경작지를 이용한 배양, 균주개량의 용이성, 식량문제와 무관 등의 여러 가지 장점으로 인하여 장기적으로는 화석연료로부터 생산되는 디젤을 대체할 바이오디젤을 생산할 수 있는 유일한 자원으로 평가되고 있다. 또한 이산화탄소의 생물학적 전환 및 처리는 자연계 물질순환의 기본 원리인 광합성(photosynthesis)을 이용하는 것으로써 환경친화적 방법이며, 공정이 상온·상압에서 이루어지고, 생산된 바이오매스(biomass)를 유용물질로 활용한다는 장점이 있다.
한편, 한국등록특허 제1625074호에서는 '산화 스트레스를 이용하여 지질함량을 증가시킨 미세조류 및 그의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1424852호에서는 '바이오디젤을 생산하는 클로렐라 불가리스 ＣＶ-16 및 이를 이용한 바이오디젤의 생산방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, 하천에서 분리된 바이오매스, 색소 생산성 및 지질 생산성이 우수한 미세조류인 클로렐라 세포주 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 하천에서 분리된 신규한 미세조류인 클로렐라 (Chlorella sp.) HS2 세포주가 담수(BG11)에서 배양한 경우 바이오매스 및 색소 생산성이 우수하고, 해수(F/2)에서 배양한 경우 지질 생산성이 우수한 것을 확인하였다.
특히, 클로렐라 HS2는 성장속도가 전 기간을 평균으로 담수(BG11) 배지에서 가장 빠른 것을 확인하였고, 이는 다른 미세조류에 비해서 매우 빠른 것이며, 최고 세포수 및 최대 세포 건중량에서도 가장 높은 값을 나타내었다. 또한, 염 농도가 높은 배지에서 배양할수록, 총지질 함량과 FAME(fatty acid methyl esters)이 매우 높은 오일함량을 나타내었으며, 지방산 구성은 올레산과 리놀레산이 가장 높은 함량을 나타내었고, 루테인을 포함한 색소 함량 또한 가장 높은 것을 확인하였다.
이와 같이, 본 발명의 클로렐라 HS2 세포주의 담수, 해수 그리고 기수에서 모두 성장할 수 있는 특징은 다른 미세조류뿐만 아니라 박테리아에서도 드문 현상으로 본 발명을 통해 매우 특이한 현상임을 확인한 것이다.
따라서, 본 발명의 클로렐라 HS2 세포주는 물 활용성이 매우 높으며, 바이오매스 생산성이 높고 오일 함량이 높아 미세조류 오일 및 바이오디젤 생산 균주로 활용이 가능하며, 루테인 생산 균주로서도 잠재력을 가지고 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하천에서 분리되고 담수, 해수 및 기수에서 빠른 생장이 가능하고, 바이오매스, 색소 생산성 및 지질 생산성이 우수한 미세조류인 클로렐라 (Chlorella sp.) 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 지질 제조용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포주를 배양하고, 그 배양액으로부터 지질을 분리하는 것을 특징으로 하는 지질의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되며, 주요 지방산으로서 올레산(C18:1) 및 리놀레산(C18:2)을 포함하며, 올레산(C18:1) 및 리놀레산(C18:2)을 전체 지질 중량 기준으로 45~55% 함유하고, 다가 불포화지방산을 전체 지질 중량 기준으로 10% 이하로 함유하는 지질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포주를 배양하는 단계, 상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계 및 상기 지질을 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르 및 글리세롤을 생성하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 세포주를 배양하는 단계, 상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계 및 상기 지질을 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르 및 글리세롤을 생성하는 단계를 포함하는 글리세롤의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에서 새롭게 분리된 클로렐라 HS2는 기존의 다른 미세조류 및 미생물과는 다르게 담수, 해수 그리고 기수에서 매우 빠른 성장속도로 배양이 가능하여 배지 생산을 위한 물 사용이 자유로우며 높은 바이오매스 생산성을 보이고 세포 내 지질함량이 우수하여 미세조류오일 및 바이오디젤 시장에서 활용이 가능하다. 또한 색소 함량도 다른 미세조류와 유사하거나 조금 높은 수준이지만 빠른 생장속도로 인하여 색소 생산성은 기존 미세조류보다 높아 색소생산을 위한 자원으로서도 잠재력을 가지고 있어, 관련 산업에 매우 유용하다.
도 1은 본 발명에서 분리된 클로렐라 HS2의 계통도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 분리된 클로렐라 HS2가 담수, 기수 그리고 해수에서 성장 가능한 점을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 분리된 클로렐라 HS2와 다른 미세조류의 담수, 기수 그리고 해수에서 성장 가능 정도를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에서 분리된 클로렐라 HS2의 배양 최적 조건을 조사한 것이다.
도 5는 광생물반응기에서 담수, 해수 그리고 기수를 이용한 본 발명에서 분리된 클로렐라 HS2의 배양 결과이다. A) 세포 수(Cell Number), B) 건조세포 중량(Dry cell weight)
도 6은 담수, 기수 그리고 해수에서 본 발명에서 분리된 클로렐라 HS2 최고 비성장율 및 세대시간을 나타낸다.
도 7은 본 발명에서 분리된 클로렐라 HS2의 광학현미경(A), 형광현미경 분석(B) 및 바이오매스 색상(C)을 나타낸다.
도 8은 본 발명에서 분리된 클로렐라 HS2의 총지질 함량(A), 지방산 구성비(B) 및 지방산 함량비(C)를 분석한 결과이다.
도 9는 본 발명에서 분리된 클로렐라 HS2의 배지별 세포 구성물질 변화를 나타낸다.
도 10은 본 발명에서 분리된 클로렐라 HS2의 배지별 색소 함량의 변화를 나타낸다.
도 11은 본 발명에서 분리된 클로렐라 HS2의 색소 생산성(A) 및 루테인 생산성(B)을 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하천에서 분리되고 담수, 해수 및 기수에서 빠른 생장이 가능하고, 바이오매스, 색소 생산성 및 지질 생산성이 우수한 미세조류인 클로렐라 (Chlorella sp.) 세포주를 제공한다. 상기 세포주는 바람직하게는 기탁번호가 KCTC 13108BP인 클로렐라 HS2(Chlorella sp. HS2) 세포주이다.
상기 클로렐라 HS2 세포주는 하천에서 분리한 미세조류를 18S rDNA 서열분석을 통하여 동정되었으며, 담수, 해수 및 기수에서 빠른 생장이 가능하고, 바이오매스, 색소 생산성 및 지질 생산성이 우수한 클로렐라 HS2 세포주를 확인하였다. 상기 담수, 해수 및 기수에서 빠른 생장이 가능하고, 바이오매스, 색소 생산성 및 지질 생산성이 우수한 클로렐라 HS2 세포주를 한국생명공학연구원(KCTC)에 2016년 09월 13일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 13108BP).
본 발명의 상기 클로렐라 HS2 세포주는 물 활용성이 우수하며, 특히, 담수에서 배양한 경우, 바이오매스 및 색소 생산성이 우수하고, 해수에서 배양한 경우 지질 생산성이 우수하다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 세포주는 바람직하게는 담수에서 배양한 경우, 바이오매스 생산량이 600~700mg/L/day이고, 루테인 색소 생산량은 4~4.5mg/L/day일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 세포주는 바람직하게는 해수에서 배양한 경우, 전체 지질 함량을 세포 구성 성분 기준으로 60~70 중량% 함유하고, 지방산메틸에스테르(FAME)를 지방산 기준으로 60~70 중량% 함유하는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 전체 지질 함량을 세포 구성 성분 기준으로 60~65 중량% 함유하고, 지방산메틸에스테르(FAME)를 지방산 기준으로 60~65 중량% 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 클로렐라 세포주에서, 상기 세포주는 주요 지방산으로서 올레산(C18:1) 및 리놀레산(C18:2)을 포함하는 지질을 생산할 수 있으며, 바람직하게는 상기 올레산(C18:1) 및 리놀레산(C18:2)의 함량은 전체 지질 중량 기준으로 45~55%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 클로렐라 HS2 세포주는 담수 배지 이산화탄소 조건 하에서 온도 34~38℃, 광 300~600μmol·m-2·s-1이 최적 배양 조건이며, 해수배지 이산화탄소 조건 하에서 온도 34~36℃, 광 450~600μmol·m-2·s-1에서 최적 배양 조건이나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 세포주는 다가 불포화지방산(PUFA, Polyhydric unsaturated fatty acid)은 3개 이상의 이중결합을 가지는 것으로, 다가 불포화지방산의 함량이 전체 지질 중량 기준으로 10% 이하일 수 있으며, 가장 바람직하게는 전체 지질 중량 기준으로 6~7%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 세포주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 지질 제조용 미생물 제제를 제공한다. 상기 미생물 제제는 클로렐라 HS2 세포주를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 바이오오일의 대량 생산에 효과적으로 이용될 수 있다. 상기 대량 생산된 바이오오일은 트랜스에스테르화 과정을 통해 바이오디젤을 생산하는데 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 미생물 제제에서, 상기 지질은 올레산(C18:1) 및 리놀레산(C18:2)을 전체 지질 중량 기준으로 45~55% 함유하고, 다가 불포화지방산을 전체 지질 중량 기준으로 10% 이하로 함유할 수 있으며, 바람직하게는 올레산(C18:1) 및 리놀레산(C18:2)을 전체 지질 중량 기준으로 45~50% 함유하고, 다가 불포화지방산을 전체 지질 중량 기준으로 6~7%로 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 세포주를 배양하고, 그 배양액으로부터 지질을 분리하는 것을 특징으로 하는 지질의 제조 방법을 제공한다. 상기 세포주는 다양한 배양 온도에서 지질을 고농도로 축적할 수 있으며, 세포주 배양액으로부터 지질을 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 지질의 제조 방법에 의해 제조된 지질을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 지질은 주요 지방산으로서 올레산(C18:1) 및 리놀레산(C18:2)을 포함하며, 올레산(C18:1) 및 리놀레산(C18:2)을 전체 지질 중량 기준으로 45~55% 함유하고, 다가 불포화지방산을 전체 지질 중량 기준으로 10% 이하로 함유할 수 있고, 바람직하게는 올레산(C18:1) 및 리놀레산(C18:2)을 전체 지질 중량 기준으로 45~50% 함유하고, 다가 불포화지방산을 전체 지질 중량 기준으로 6~7%로 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 본 발명의 세포주를 배양하는 단계;
상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계; 및
상기 지질을 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르 및 글리세롤을 생성하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 세포주의 배양은 바람직하게는 34℃ 내지 38℃의 온도에서 수행할 수 있다. 세포주 배양 배지는 당업계에서 일반적으로 통용되는 배지를 이용할 수 있다. 상기 지방산 에스테르는 바람직하게는, 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 바이오디젤은 바이오매스에 포함된 지방산의 트랜스에스테르화 과정에 의해 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르 형태로 생산될 수 있으며, 상기 트랜스에스테르화 과정의 부산물로 글리세롤이 생성될 수 있다.
상기 트랜스에스테르화 과정은 바이오매스에 포함된 지방의 크고 가지를 낸 분자 구조를 정규 디젤 엔진이 요구하는 작고 직선 사슬의 분자로 변형시키는 방법을 말한다. 상기 트랜스에스테르화 과정의 유화제로서 Triton X-100 또는 Tween 60 등을 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 유화제는 바이오오일의 계면 안정을 도모하고 잘 혼합되도록 하여 반응 수율을 높여서 바이오디젤의 회수 비용을 절약할 수 있게 한다. 또한, 상기 트랜스에스테르화 과정의 반응 촉매제로서 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 바이오디젤은 바이오연료로서 하기의 장점을 가질 수 있다; (1) 바이오연료는 일반적인 바이오매스 자원으로부터 손쉽게 얻을 수 있다. (2) 바이오연료는 연소에 있어서 이산화탄소의 순환을 나타낸다. (3) 바이오연료는 환경 친화적인 잠재력을 갖는다. (4) 바이오연료를 사용함으로써 환경, 경제 및 소비자에게 많은 이익을 준다. (5) 바이오연료는 미생물에 의해 무해한 물질로 분해될 수 있고, 지속가능성에 기여한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 세포주를 배양하는 단계;
상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계; 및
상기 지질을 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르 및 글리세롤을 생성하는 단계를 포함하는 글리세롤의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 세포주의 배양 온도 및 배지 및 지질 분리 방법은 전술한 바와 같다.
상기 글리세롤은 윤활제, 연고나 좌약과 같은 약품의 제조, 관장제, 식품이나 화장품의 건조방지제 또는 정미제, 부동액, 냉각제, 도료, 안료, 인쇄 잉크, 투명비누의 제조, 실험실의 분석 시약, 용제, 셀로판, 접착제, 알키드 수지 또는 다이나마이트 등의 제조에 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 미세조류의 분리 및 동정
국내 하천에서 분리된 미세조류를 18S rDNA를 시퀀싱하여 NCBI 블라스트에서 검색한 결과, 분리된 HS2는 미크라티니움(Micratinium), 클로렐라(Chlorella)와 상동성이 높았으나(도 1) 미크라티니움과는 형태적으로 차이가 있었고, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) 혹은 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana)와는 달리 담수, 해수 그리고 기수에서 모두 성장 가능한 특성(도 2)이 이들과는 다른 종으로 판단하여 클로렐라 속(Chlorella sp.) HS2로 명명하였다. 실험실에서 널리 사용되는 박테리아인 대장균, 바실러스, 슈도모나스, 라이조비움 등이 본 발명을 통해 해수에서는 전혀 성장이 되지 않는 점을 다시 한번 확인하였으며(데이터 미제시), 일반적으로 다양성 분석을 통해 해수와 담수에서 성장 가능한 박테리아는 명확하게 나누어져 있다. 그러나 담수, 해수 그리고 기수에서 모두 성장할 수 있는 본 발명의 클로렐라 속 HS2 균주의 특징은 미세조류뿐만 아니라 박테리아에서도 드문 현상으로 매우 특이한 현상임을 확인하였다(도 3).
실시예 2. 클로렐라 HS2 의 최적 배양 조건 분석
최적 배양조건은 Photo-Biobox를 통해서 분석하였다(Heo et al. 2015 Biochemical Engineering Journal, 103, 193-197). Photo-Biobox는 High throughput photo bioreactor로서 한 배치에 96가지의 다른 환경을 구현하여 빠르게 온도, 광 그리고 이산화탄소 유무에 의한 미세조류 최적 조건을 찾는데 유용한 장비이다. 담수 배지로는 녹조류 배양배지로 널리 사용되고 있는 BG11 배지를 사용하였고, 해수 배지는 F/2 배지를 사용하였다. 기수 배지는 BG11과 F/2를 1:1로 혼합한 배지를 사용하였다. 이 장비를 사용하여 HS2의 배양 조건을 확인한 결과 클로렐라 HS2는 담수 배지 이산화탄소 조건 하에서 온도 34~38℃, 광 300~600 μmol·m-2·s-1의 최적 배양 조건이며, 해수에서는 온도 34~36℃, 광 450~600 μmol·m-2·s-1에서 최적 배양 조건으로 확인되었다(도 4).
실시예 3. 광생물반응기에서 최적조건으로 클로렐라 HS2 의 배양
1 L 광생물반응기에 600 ml의 배양 볼륨으로 담수(BG11), 해수(F/2) 그리고 기수(DHX) 배지를 각각 이용하여 클로렐라 HS를 배양하였다. 배양조건은 온도 34℃, 광도 450 μmol·m-2·s-1 그리고 5% CO2의 공기를 0.2 vvm으로 폭기하였다. 배양 6일 후에 BG11은 2.49 x 108 cell/ml, F/2는 5.04 x 107 cell/ml 그리고 DHX은 8.98 x 107 cell/ml이었고(도 5A) 세포 건조중량은 각각 4.25, 3.5 그리고 2.03 g/L에 도달하였다(도 5B).
배양을 통해 분석된 비성장율(μAve)은 전 기간을 평균으로 BG11 배지에서 가장 빠른 0.85이었으며 이때의 세대시간은 0.81day였다(도 6). 하지만 단기간 최대 비성장율(μExp)은 0~2일 사이에 DHX 배지에서 1.63으로 가장 빠르게 성장하였다(표 1). 클로렐라 HS2의 성장속도는 다른 미세조류에 비해서 매우 빨랐으며, 최고 세포수 및 최대 세포 건중량에서도 가장 높은 값을 나타내었다.
Figure 112016096058302-pat00001
실시예 4. 클로렐라 HS2 의 오일 축적
클로렐라 HS2를 PBR에서 배양한 미세조류를 나일레드(nile red)에 의해 중성지질을 염색하여 형광현미경으로 관찰한 결과 염농도가 높은 배지로 갈수록 세포 내 중성지질 함량이 증가하는 것을 형광현미경에 의한 나일레드 염색시약의 강도에 의해 확인하였다. 또한 오일 추출을 위해 획득한 바이오매스를 동결건조한 결과 염농도가 높은 배지로 갈수록 건조 세포의 색상이 녹색이 감소하고 노란색이 증가하는 것을 확인하였다(도 7). 오일 추출은 클로로포름 및 메탄올을 2:1로 혼합한 용매를 사용하여 추출 후, 감압증류기에서 용매를 제거하였으며, FAME 함량 및 구성 분석은 GC-FID(Shimazu, 일본)에 DB-Wax 컬럼을 활용하여 FAME 37 mix(Sigma, USA)를 표준폼으로 하여 정량 및 정성분석하였다. 그 결과 총지질의 함량은 BG11 26%, DHX 47% 그리고 F/2 62%로 분석되었으며, FAME 함량은 각각 23%, 44% 그리고 61%로 매우 높은 오일함량을 나타내었다(도 8A). 그리고 지방산 구성은 올레산과 리놀레산이 가장 높은 함량을 차지하였다(도 8B 및 도 8C). C18:1 및 C18:2 지방산은 BG11이 19% 및 29%, DHX는 27% 및 20% 그리고 F/2는 31% 및 19%로 매우 높았으며, 3개 이상의 이중결합을 가지는 다가 불포화지방산(PUFA, Polyhydric unsaturated fatty acid)의 함량은 BG11, DHX 및 F/2에서 모두 5~7%로 매우 낮았다(도 8B 및 도 8C). 이처럼 PUFA의 함량이 낮고, C18:1 및 C18:2 지방산의 함량이 높은 것은 바이오디젤 생산에 이용하기에 매우 우수함을 나타낸다.
실시예 5. 세포 구성성분 분석 및 색소 분석
담수, 해수 그리고 기수에서 배양된 바이오매스의 세포 구성성분을 총지질법, 총당측정법 그리고 바이오레드 총 단백질 분석 키트를 활용하여 측정하였다. 단백질의 함량은 크게 변화가 없던 반면 지방 함량이 낮은 담수(BG11)에서는 탄수화물 함량이 높았고, 지질이 증가할수록 탄수화물 함량이 감소하는 것을 확인하였다(도 9). 이것은 지질 축적을 위해 세포 내 탄수화물이 지방으로 전환되었다는 것을 의미한다.
실시예 6. 색소 함량 및 생산성
색소함량은 담수 배지에서 가장 높았고 염 농도가 높은 배지로 갈수록 색소함량이 감소하였다. 특히 클로로필a가 가장 큰 폭으로 감소하였다. 카로테노이드계 색소로는 루테인 함량이 전체 바이오매스의 0.6% 수준으로 가장 높았으며 루테인의 경우는 다른 색소에 비해 염 농도에 의해 감소된 정도가 낮았다(도 10). 각각의 배지에서 색소 생산성 및 우점 카로테노이드의 생산성을 확인한 결과 BG11 배지에서 색소 및 루테인의 생산성이 12.5 mg/L/day, 4.06 mg/L/day로 가장 높은 생산성을 보였다(도 11).
실시예 7. 혼합배양( Mixotrophic culture) 및 종속배양(Heterotrophic culture)의 배양 조건 확인
미세조류 클로렐라 속 HS2 균주는 미세조류의 일반적인 특성인 광합성뿐만 아니라 광과 유기탄소를 동시에 공급하는 혼합배양(Mixotorophic culture) 그리고 광을 공급하지 않고 유기탄소를 공급하는 종속배양(Heterotrophic culture)을 통해서도 배양이 가능하다. Photobiobox를 이용하여 글루코스 10,000 ppm이 함유된 BG11 배지를 이용하여 공기(air)와 이산화탄소를 공급하는 상황에서 최적 배양 온도 및 최적 광조건을 분석하였다. 분석결과 공기를 공급하는 조건에서는 최적온도 37℃, 광 200~250 μmol·m-2·s-1에서 최적 조건을 보였으며, 이산화탄소 공급 상태에서는 온도 35℃, 광 100~300 μmol·m-2·s-1에서 최적조건을 확인하였다. BG11과 비교하여 BG11에 글루코스를 넣어준 배지가 공기 및 이산화탄소 조건에서 모두 월등히 높은 흡광도 값을 나타내었다.
실시예 8. 혼합배양( Mixotrophic culture) 및 종속배양(Heterotrophic culture)의 배지 선정 및 최적 조건 배양
클로렐라 속 HS2 균주가 유기탄소(포도당)을 이용하여 배양 가능한 것을 확인하였고, BG11에 10,000 ppm의 포도당이 포함된 배지에서 포도당이 포함되지 않은 배지와 비교하여 배양농도(흡광도)가 월등히 증가된 것을 확인하였다. 종속배양 및 혼합배양의 효율 증가를 위해 기존에 종속배양에 사용되는 배지를 선정하여 35℃에서 배지별 미세조류 생장을 확인하였다. 사용된 배지는 LB(Difco), YM(Difco), TSB(Difco), Marine broth(Difco) 접종 48시간 후에 흡광도를 측정하여 확인한 결과 대조군으로 사용된 BG11에 포도당 10,000 ppm이 가장 높은 흡광도를 보였으며, 다음으로 TSB가 높은 성장을 보여주었다. MB(Marine broth)는 상대적으로 다른 배지보다 세포 밀도가 낮았지만 해수 배지인 것을 감안하면 높은 성장률을 보였다. 이 3가지 배지 BG11-10,000 ppm 글루코스, TSB-5,000 ppm 글루코스 그리고 MB-5,000 ppm 글루코스 (TSB와 MB는 포도당 함량이 낮음 약 2,500 ppm) 배지를 1 L 배플 플라스크(baffle flask)에 35℃ 현탁배양으로 암배양하였다.
그 결과, 배양 5일 후에 TSB의 세포수가 4.11×108 cell/ml로 가장 높았으며, BG11 및 MB 배지는 각각 2.78 ×108 cell/ml, 2.07 ×108 cell/ml이었다. 이러한 결과는 추가된 포도당의 농도와 바플 플라스크(baffle flask)에 의한 폭기(aeration) 효율 증가에 의한 것으로 판단된다. 또한 8 L 광배양기를 이용하여 혼합배양(mixotrophic culture) 방법으로 BG11-글루코스 배지를 이용하여 글루코스, 질소와 인의 사용량을 분석한 결과 세포수 2.79×108 cell/ml, 중량 6.8 g/L로 배양되는 동안 총 17,500 ppm의 포도당을 사용했으며, 질소와 인은 각각 350 ppm, 150 ppm을 사용하였다. 이러한 결과를 바탕으로 혼합배양과 종속배양의 비성장율, 발생시간, 세포수 및 세포 중량은 표 1에 정리하였다.
한국생명공학연구원 KCTC13108BP 20160913

Claims (12)

  1. 하천에서 분리되고 담수, 해수 및 기수에서 생장이 가능하고, 바이오매스, 색소 및 지질을 생산하는 미세조류인 기탁번호가 KCTC 13108BP인 클로렐라 HS2(Chlorella sp. HS2) 세포주.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 담수에서 배양한 경우, 바이오매스 생산량이 600~700mg/L/day이고, 루테인 색소 생산량은 4~4.5mg/L/day인 것을 특징으로 하는 클로렐라 HS2 세포주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 해수에서 배양한 경우, 전체 지질 함량을 세포 구성 성분 기준으로 60~70중량% 함유하고, 지방산메틸에스테르(FAME)를 지방산 기준으로 60~70중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 클로렐라 HS2 세포주.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 주요 지방산으로서 올레산(C18:1) 및 리놀레산(C18:2)을 포함하며, 올레산(C18:1) 및 리놀레산(C18:2)을 전체 지질 중량 기준으로 45~55% 함유하는 것을 특징으로 하는 클로렐라 HS2 세포주.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 다가 불포화지방산(PUFA)의 함량이 전체 지질 중량 기준으로 10% 이하인 것을 특징으로 하는 클로렐라 HS2 세포주.
  7. 제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 세포주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 지질 제조용 미생물 제제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 지질은 올레산(C18:1) 및 리놀레산(C18:2)을 전체 지질 중량 기준으로 45~55% 함유하고, 다가 불포화지방산을 전체 지질 중량 기준으로 10% 이하로 함유하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 지질 제조용 미생물 제제.
  9. 제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 세포주를 배양하고, 그 배양액으로부터 지질을 분리하는 것을 특징으로 하는 지질의 제조 방법.
  10. 제9항의 방법에 의해 제조되며, 주요 지방산으로서 올레산(C18:1) 및 리놀레산(C18:2)을 포함하며, 올레산(C18:1) 및 리놀레산(C18:2)을 전체 지질 중량 기준으로 45~55% 함유하고, 다가 불포화지방산을 전체 지질 중량 기준으로 10% 이하로 함유하는 것을 특징으로 하는 지질 조성물.
  11. 제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 세포주를 배양하여 배양액을 얻는 단계;
    상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계; 및
    상기 지질을 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르 및 글리세롤을 생성하는 단계를 포함하는 바이오디젤의 제조 방법.
  12. 제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 세포주를 배양하여 배양액을 얻는 단계;
    상기 배양액으로부터 지질을 분리하는 단계; 및
    상기 지질을 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르 및 글리세롤을 생성하는 단계를 포함하는 글리세롤의 제조 방법.
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