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KR102248420B1 - miR-142-3p의 표적 서열을 포함하는 재조합 벡터 - Google Patents

miR-142-3p의 표적 서열을 포함하는 재조합 벡터 Download PDF

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KR102248420B1
KR102248420B1 KR1020190030126A KR20190030126A KR102248420B1 KR 102248420 B1 KR102248420 B1 KR 102248420B1 KR 1020190030126 A KR1020190030126 A KR 1020190030126A KR 20190030126 A KR20190030126 A KR 20190030126A KR 102248420 B1 KR102248420 B1 KR 102248420B1
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Abstract

본 발명은 miR-142-3p를 표적 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이의 다양한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 벡터는 AIMP2 변이체의 말단에 miR-142-3p를 표적하는 서열을 삽입하여, AIMP2 변이체가 종양에서 과발현되는 부작용을 제어하고, CD45 유래 세포, 특히, 림프구 계열 및 백혈구 계열 세포에서는 발현이 억제되도록 조절하는 효과가 있다. 따라서, 상기 AIMP2 변이체가 신경세포에서만 특이적으로 발현할 수 있고, 여러 조직 중 뇌 조직에서만 선택적으로 발현될 수 있는 바, 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

miR-142-3p의 표적 서열을 포함하는 재조합 벡터{Recombinant vector containing target sequence for miR-142-3p}
본 발명은 miR-142-3p의 표적 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이의 다양한 용도에 관한 것이다.
포유동물의 뇌는 신경줄기세포(neuronal stem cell)의 분열과 분화 및 생존과 사멸, 시냅스 형성 등 일련의 과정을 거쳐 체계적인 신경회로망(neural network)을 발생함으로서 복잡한 기능을 수행할 수 있게 된다. 성체시기에도 동물의 뇌신경세포에서는 신경성장에 필요한 많은 물질을 생산하여 축색돌기(axon)과 수상돌기(dendrite)가 성장하게 되고 새로운 학습과 기억을 할 때마다 시냅스 연결과 신경회로망을 끊임없이 재구성(synaptic remodeling)하므로 분화가 계속된다고 할 수 있다. 신경세포는 세포분화하고 시냅스를 형성하는 과정에서 신경성장인자와 같은 표적유래 생존인자(target-derived survival factor)를 받지 못하면 세포사멸하며 스트레스와 세포독성물질(cytotoxic agent)에 의한 세포사멸은 퇴행성 뇌질환의 주요원인이 된다. 동물의 말초신경계는 손상되었을 때는 중추신경계와 달리 축색이 오랜 시간에 걸쳐 재생한다. 신경 상해 부위의 뒤쪽 축색은 월러변성(Wallerian degeneration)으로 알려진 과정에 의해 퇴화되고 신경의 세포체는 축색의 성장(axonal regrowth)을 다시 시작하며 슈반세포는 분열한 후 생존과 사멸에 의해 표적신경을 결정하고 다시 분화하는 등, 발생과정을 다시 거쳐 재생하게 된다.
전세계적으로 고령화 인구가 급증함에 따라 퇴행성 뇌질환의 발병 추세도 매년 증가하는 추세에 있으며, 아직까지 그 예방법과 치료법이 명확하지 않아, 이러한 질환을 치료하기 위한 효능이 뛰어난 약제를 발견하지 못하고 있는 실정이다. 또한 이러한 질환에 사용되고 있는 치료제와 치료법은 장기 복용에 따른 부작용 및 독성을 나타내는 경우가 많으며, 완벽한 질환 치료보다는 증상의 경과를 늦추거나 증상의 정도를 일시적으로 경감시키는 효과만 있기 때문에 부작용 및 독성을 감소시키고 결정적인 치료효과가 있는 소재의 발굴 및 개발이 시급한 실정이다.
유전자치료법은 인간을 대상으로 1990년 처음 임상시험이 시작된 이래 2002년까지 약 600여건의 임상시험이 3500명의 환자를 대상으로 진행 중이다. 2003년 인간 유전체서열 분석의 완료를 계기로 다양한 유전자 발굴에 따른 새로운 유전자 치료법의 개발은 가속화 될 것이다. 그러나 지금까지 승인된 유전자치료법 중 75%가 암이나 낭포성 섬유증 등의 단일유전 질환의 치료를 목표로 하고 있고 신경질환이나 신경재생을 위한 유전자치료제의 개발은 활발하지 않다 (미국 NIH 재조합 DNA 자문보고서(2002); Gene therapy clinical trials (2002) J Gene Med. www. wiley.co.uk/genmed). 그러나 이미 파킨슨 병의 치료, 감각신경의 재생등에 NT-3, GDNF(glial derived neuronal factor)등의 신경성장인자를 이용한 유전자치료법의 개발이 시도되고 있다(GDNF family ligands activate multiple events during axonal growth in mature sensory neurons (2004) Mol. cell. Neurosci. 25, 4453-4459). 신경 계통의 질환은 뇌기능 연구에 대한 신경과학의 전반적인 연구가 아직 부진한 상태이므로 각종 만성 신경계 질환의 치료 약제개발 또한 난관에 처해 있다.
한편 AIMP2-DX2는 세포 사멸에 다방면으로 관련된 종양억제인자 AIMP2의 얼터너티브 스플라이싱 변이체(alternative splicing variant)로서 AIMP2의 기능을 저해함으로써 세포사멸을 억제하는 것으로 알려져 있다. 이는 AIMP2/p38가 TRAF2를 유비퀴틴화 하는 것을 촉진하여 TNF-α에 의해 유도되는 세포 사멸을 조절하며, AIMP2/p38의 스플라이싱 변이체인 AIMP2-DX2가 AIMP2와 경쟁적 저해제로 작용하여 TRAF2의 유비퀴틴을 억제하여 TNF-α에 의한 세포 사멸을 억제함으로서 종양생성을 촉진하는 점 및 염증 마커인 Cox-2의 발현을 저해한다. 또한 AIMP2-DX2는 기존에 폐암 유발인자로 확인되어 보고된 바 있고, 상기 종래 연구에서는 AIMP2의 변이체인 AIMP2-DX2가 암세포에서 많이 발생하고, AIMP2의 암억제 기능을 방해하여 암을 유발한다는 사실을 확인하였으며, AIMP2-DX2를 정상세포에서 발현시키면 세포의 암화가 진행되고 반대로 AIMP2-DX2의 발생을 억제하면 암의 성장이 억제되어 치료 효과가 나타난다는 사실을 발견한 바 있다.
이에 본 발명자들은 miR-142-3p를 표적하는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제작하였고, 상기 miR-142-3p를 표적하는 서열은 AIMP2 변이체의 발현을 신경 세포 및 뇌 조직에서만 선택적으로 발현할 수 있도록 조절함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 miR-142-3p를 표적하는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 miR-142-3p를 표적하는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 유전자 전달체를 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 상기 재조합 벡터를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 이종 유전자를 신경세포에 전달 및 발현시키는 방법을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 1) 프로모터; 2) 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 염기서열; 및 3) 상기 염기서열의 3`UTR에 삽입된 miR-142-3p를 표적화하는 염기서열을 포함하는 발현 카세트를 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 엑손 2가 결실된 AIMP-2 변이체를 코딩하는 염기서열 및 상기 염기서열의 3`UTR에 연결된 miR-142-3p를 표적화하는 염기서열을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 miR-142-3p를 표적하는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 miR-142-3p를 표적하는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 유전자 전달체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 이종 유전자를 신경세포에 전달 및 발현시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 프로모터; 2) 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 염기서열; 및 3) 상기 염기서열의 3`UTR에 삽입된 miR-142-3p를 표적화하는 염기서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다.
또한 본 발명은 엑손 2가 결실된 AIMP-2 변이체를 코딩하는 염기서열 및 상기 염기서열의 3`UTR에 연결된 miR-142-3p를 표적화하는 염기서열을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 재조합 벡터는 AIMP2 변이체의 말단에 miR-142-3p를 표적하는 서열을 삽입하여, AIMP2 변이체가 종양에서 과발현되는 부작용을 제어하고, CD45 유래 세포, 특히, 림프구 계열 및 백혈구 계열 세포에서는 발현이 억제되도록 조절하는 효과가 있다. 따라서, 상기 AIMP2 변이체가 신경세포에서만 특이적으로 발현할 수 있고, 여러 조직 중 뇌 조직에서만 선택적으로 발현될 수 있는 바, 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 재조합 벡터의 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 재조합 벡터의 신경세포 특이적 발현 효과를 in vitro 상에서 확인한 도이다.
도 3은 본 발명의 재조합 벡터의 신경세포 특이적 발현 효과를 in vivo 상에서 확인한 도이다.
본 발명은 miR-142-3p를 표적하는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어, "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에서 용어, "마이크로 RNA(miRNA)"는 MicroRNA(약칭 miRNA)는 약 22개 nucleotide로 이루어진 noncoding RNA로 유전자 발현을 조절하는 역할을 한다. 상기 microRNA는 유전자의 전사 후 post-transcription 단계에서 작용하며, 포유류의 경우 유전자의 60% 정도가 microRNA에 의해 발현이 조절되는 것으로 알려져 있다. MicroRNA는 다양한 생체 내 프로세스에서 중요한 역할을 하며 암, 심장 질환, 신경 관련 질병에 연관이 있는 것으로 밝혀져 있다. miRNA 는 1 개 사슬 RNA 이지만, premature 의 2 개 사슬 RNA 중 목적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 한, 어느 측의 1 개 사슬 RNA 의 표적 배열을 사용할 수 있다. 예컨대, miR-142에는 miR-142-3p 및 miR-142-5p가 존재하며, 본 발명에 있어서는 어느 표적 배열을 사용해도 되며, miR-142에는 miR-142-3p 및 miR-142-5p의 양자가 포함되고, 바람직하게는 miR-142-3p일 수 있다.
본 발명에서 용어, "miR-142-3p"는 이의 유전자가 B 세포 백혈병(aggressive B cell leukemia)에 있어서 전좌가 일어나는 부위에 존재하고 있으며, 조혈 조직(골수, 비장, 흉선 등)에서 발현하고 있다고 알려져 있다. 또한, miR-142-3p 는 마우스 태아 간장(태아의 조혈 조직)에 있어서 발현이 확인되어, 조혈계의 분화에 관여하고 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 miR-142-3p는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, miR-142-3p를 표적하는 서열은 miR-142-3p 서열과 상보적으로 결합하는 서열번호 4의 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 상보적인 서열을 포함하는 본 발명의 miR-142-3p 표적 서열은 서열번호 5로 표시되는 염기서열이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 재조합 벡터는 이종 프로모터, 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종 유전자를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "이종 유전자"는 생물학적으로 활성이 적당한 단백질 또는 폴리펩티드, 면역원 또는 항원 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 치료 활성 단백질 또는 폴리펩티드와 같은 목적하는 생성물의 암호화 서열을 포함할 수 있다.
폴리펩티드는 숙주 세포에서 내인성 단백질의 결핍 또는 부재 발현을 보충할 수 있다. 상기 유전자 서열은 DNA, cDNA, 합성 DNA, RNA 또는 그의 조합을 포함하여 다양한 공급원으로부터 유도될 수 있다. 상기 유전자 서열은 천연 인트론을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 또한, 상기 게놈 DNA는 프로모터 서열 또는 폴리아데닐화 서열과 함께 수득될 수 있다. 게놈 DNA 또는 cDNA는 많은 방법으로 수득될 수 있다. 게놈 DNA는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 적당한 세포로부터 추출되고 정제될 수 있다. 또는, mRNA는 세포로부터 분리되어 역전사 또는 다른 방법에 의해 cDNA를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 또는, 폴리뉴클레오티드 서열은 RNA 서열에 상보성인 서열, 예를 들면, 안티센스 RNA 서열을 포함할 수 있으며, 상기 안티센스 서열은 개개인의 세포에서 상보성 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하기 위해 개개인에 투여될 수 있다.
본 발명의 목적 상, 상기 이종 유전자는 엑손 2가 결실된 AIMP-2 변이체이고, 상기 이종 유전자의 3` UTR에 본 발명의 miR-142-3p 표적 서열이 결합될 수 있다. 상기 AIMP2 단백질의 서열(312aa version:AAC50391.1 또는 GI:1215669; 320aa version: AAH13630.1, GI:15489023, BC013630.1)은 문헌(312aa version: Nicolaides,N.C., Kinzler,K.W. and Vogelstein,B. Analysis of the 5' region of PMS2 reveals heterogeneous transcripts and a novel overlapping gene, Genomics 29 (2), 329-334 (1995)/ 320 aa version: Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human and mouse Cdna sequences, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002))에 기술되어 있다.
본 발명에서 용어, "AIMP2 변이체"는 엑손 1 내지 4 중 엑손 2의 영역이 부분적으로나 전체적으로 상실되어 생긴 변이체로서, 상기 변이체는 AIMP2 단백질과 헤테로다이머를 형성하여 AIMP2의 정상적인 기능을 방해하는 것을 의미한다. 또한, 상기 AIMP2 변이체가 세포 또는 조직에서 과발현되는 경우, 암이 유발될 수 있다. 따라서, 암의 유발을 억제하기 위하여 조직 특이적으로 발현을 유도할 필요가 있다.
상기 이종 유전자인 AIMP-2 변이체와 본 발명의 miR-142-3p 표적 서열이 결합된 것은 서열번호 6으로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있으며, 본 발명의 재조합 벡터는 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 서열번호 4 내지 7을 구성하는 염기서열의 작용성 등가물, 예를 들어, 본 발명의 서열번호 4 내지 7의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 서열번호 4 내지 7의 염기서열과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 서열번호 4 내지 7의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 염기 서열에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 염기 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질의 범위는 서열번호 4 내지 7의 염기서열로 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 4 내지 7의 염기서열로 코딩되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 상기 서열번호 4 내지 7의 염기서열로 코딩되는 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.
본 발명의 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 단백질의 변이체란 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
상기 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).
상기 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al.(2001), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ 프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli(예컨대, HB101, BL21, DH5α 등)가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C.(1984), J. Bacteriol., 158:1018-1024) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D.(1980), Ann. Rev. Genet., 14:399-445)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 바이러스 벡터, 선형 DNA 및 플라즈미드 DNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에서 용어, "바이러스 벡터"는 원하는 세포, 조직 및/또는 기관으로 치료 유전자 또는 유전물질을 전달할 수 있는 바이러스벡터이다.
상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 조력 바이러스(Adeno-associated virus), 렌티바이러스, 레트로바이러스, HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murine leukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
레트로바이러스(Retrovirus)는 숙주세포의 게놈에 통합기능이 있으며, 인체에 해가 없지만 통합 시 정상세포의 기능을 억제할 수 있고, 다양한 세포에 감염되고, 증식이 쉬우며, 1~7 kb 정도의 외부 유전자를 수용할 수 있고, 복제결핍 바이러스를 생성할 수 있는 능력이 있다는 특징을 갖는다. 그러나 레트로바이러스는 유사분열 이후의 세포에 감염되기 힘들며, in vivo 상태에서 유전자 전달이 어렵고, 체세포 조직을 항시 in vitro에서 증식하여야만 한다는 단점도 지니고 있다. 또한, 레트로바이러스는 원형암유전자(proto-oncogene)에 통합될 수 있어 돌연변이의 위험성이 있고 세포를 괴사시킬 수도 있다.
한편, 아데노바이러스(Adenovirus)는 클로닝 벡터(cloning vector)로 여러 가지 장점을 가지는데, 중간정도의 크기로 세포 핵 속에서 복제될 수 있으며, 임상적으로 무독성이고, 외부 유전자를 삽입하여도 안정적이며, 유전자의 재배열이나 손실이 일어나지 않고, 진핵생물을 형질전환시킬 수 있으며, 숙주세포 염색체에 통합되어도 안정적이면서도 높은 수준으로 발현된다. 아데노바이러스의 좋은 숙주세포는 인간의 조혈, 림프, 골수종의 원인이 되는 세포이다. 그러나 선상 DNA라서 증식이 어렵고, 감염된 바이러스를 회복시키는 것이 쉽지 않으며, 바이러스의 감염율이 낮다. 또한 전달된 유전자의 발현이 1~2주 후에 가장 많이 되고, 일부 세포에서는 3~4주 정도만 발현이 유지된다. 또한, 문제가 되는 것은 높은 면역 항원성을 갖는다는 것이다.
아데노-조력 바이러스(Adeno-associated virus, AAV)는 상기와 같은 문제점들을 보완할 수 있으면서, 유전자 치료제로의 많은 장점을 가지고 있어 최근에 선호되고 있다. 아는 아데노위성 바이러스(adeno-satellitovirus)라고도 불린다. 아데노-조력 바이러스 입자의 직경은 20 nm이며, 인체에 해가 거의 없는 것으로 알려져 유럽에서 유전자치료제로 판매가 승인되기도 하였다.
상기 AAV는 단일가닥의 원바이러스(Provirus)로서, 복제하기 위하여 보조바이러스를 필요로 하고, AAV 게놈(genome)은 4,680 bp로서 감염세포의 염색체 19번 특정부위에 삽입이 가능하다. 트랜스 유전자(trans-gene)는 각각 145bp의 두 개의 역위말단반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열부분과 시그날 서열(signal sequence)부분에 의해 연결된 플라즈미드 DNA(plasmid DNA)에 삽입된다. AAV rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 다른 플라즈미드 DNA와 함께 트랜스펙션(transfection)시키고 아데노바이러스는 보조바이러스로서 첨가한다. AAV는 유전자를 전달하는 숙주세포의 범위가 넓고, 반복투여 시 면역 부작용이 적으며, 유전자 발현 기간이 긴 장점을 지니고 있다. 더구나, AAV 게놈이 숙주세포의 염색체에 통합되어도 안전하고, 숙주의 유전자발현을 변형시키거나 재배열시키지 않는다.
상기 아데노조력 바이러스는 4종의 혈청형이 있는 것으로 알려져 있다. 목적유전자의 전달에 사용될 수 있는 많은 아데노조력 바이러스의 혈청형들 중에서, 가장 널리 연구된 벡터는 아데노-부속 바이러스 혈청형 2(Adeno-associated virus serotype 2)로, 낭포성섬유증, 혈우병 및 카나반 병의 임상적 유전자 전달에 현재 사용되고 있다. 또한, 최근에는 암 유전자 치료 분야 (cancer gene therapy)에서 rAAV(recombinant adeno-associated virus)의 잠재성이 증가하고 있다[4]. 본 발명에서 사용한 것 역시 아데노조력 바이러스 혈청형 2이며, 적절한 바이러스벡터를 선택하여 적용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 유전체로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 사 프로모터)가 이용될 수 있으며, 구체적으로, 레트로바이러스의 LTR, 사이토메갈로바이러스(CMV)프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 필요에 따라 다른 서열과 융합될 수도 있으며, 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
또한 본 발명은 miR-142-3p를 표적하는 서열을 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 유전자 전달체를 제공한다.
본 발명에서 용어, "유전자 전달"은 통상적으로 전사 및 발현을 위해 세포로 유전 물질을 전달하는 것을 포함한다. 그 방법은 단백질 발현 및 치료 목적에 이상적이다. DNA 형질감염(transfection) 및 바이러스 형질도입(transduction)과 같은 다양한 전달 방법이 공지되어 있다. 전달 효율 및 높은 수준의 전달된 유전자 발현, 및 필요한 경우 천연 친화도 또는 슈도타이핑(pseudotyping)을 통해 특정 수용체 및/또는 세포 유형을 표적화할 가능성으로 인해 바이러스-매개 유전자 전달을 의미한다.
상기 유전자 전달체는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체일 수 있으며, 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
상기 유전자 전달체는 신경세포에서 이종 유전자를 발현시키기 위한 것이고, CD45 유래 세포에서는 상기 이종 유전자의 발현을 억제시키며, 뇌 조직에서 이종 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 상기 CD45는 대부분 조혈모세포(hematopoietic cell)에 위치한 막 관통성 단백질 트로신 인산 가수분해 효소(transmembrane protein tyrosine phosphatase)로서, 이는 세포의 표면에 있는 분자에 따라 세포를 정의할 수 있으며, 상기 CD45는 모든 백혈구 무리 및 B 림프구의 세포 표지자이다. 본 발명의 유전자 전달체는 CD45 유래 세포, 특히, 림프구(lymphoid) 및 백혈구(leukocyte) 계열 세포에서는 발현되지 않을 수 있다.
상기 유전자 전달체는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터를 개체에 투여하는 단계;를 포함하는 이종 유전자를 신경세포에 전달 및 발현시키는 방법을 제공한다.
상기 방법은, 뇌조직에서는 이종 유전자의 발현이 증가하고, 다른 조직에서는 이종 유전자 발현이 제어시킬 수 있다.
또한 본 발명은 1) 프로모터; 2) 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 염기서열; 및 3) 상기 염기서열의 3`UTR에 연결된 miR-142-3p를 표적화하는 염기서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다.
본 발명에서 용어 "발현 카세트"란, 프로모터와 시그널 펩타이드를 코딩하는 염기 서열 및 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고 있어서, 시그널 펩타이드의 하류에 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 분비 생산을 위해 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미한다. 본 발명에서 분비용 발현 카세트는 분비 시스템과 혼용될 수 있다. 이와 같은 발현 카세트의 내부 또는 외부에는 상기 목적 단백질의 효율적인 생산을 도울 수 있는 다양한 인자가 포함될 수 있다.
또한 본 발명은 엑손 2가 결실된 AIMP-2 변이체를 코딩하는 염기서열 및 상기 염기서열의 3`UTR에 연결된 miR-142-3p를 표적화하는 염기서열을 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 퇴행성 뇌질환은 상기 퇴행성 뇌질환은 알츠하이머 질환(alzheimer's disease), 파킨슨 병(Parkinson’s disease), 루게릭 병(amyotrophic lateral sclerosis), 망막 변성증(retinal degeneration), 경도인지 장애(mild cognitive impairment), 다발-경색성 치매((Multi-infarct dementia), 전두측두치매(frontotemporal dementia), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies), 헌팅턴 질환(Huntington's disease), 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 우울증, 간질, 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 피질기저퇴행증(corticobasal degeneration), 다계통위축병(multiple system atrophy), 진행성핵상마비(progressive supranuclear palsy), 치상핵적핵담창구시상하핵위축증(dentatorubropallidoluysian atrophy), 척수소뇌실조병(spinocerebella ataxia), 원발성 측삭 경화증(primary lateral sclerosis), 척수근육위축병(spinal muscular atrophy) 및 뇌졸중(stroke) 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 퇴행성 뇌질환을 갖는 개체에 적용한 결과로서 퇴행성 뇌질환의 완치는 물론 퇴행성 뇌질환에 따른 제증상의 부분적 완치, 호전 및 경감을 포함한다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 퇴행성 뇌질환을 갖는 개체에 적용하여 인지장애, 행동장애, 뇌신경 파괴 등의 증세 내지 현상을 억제 또는 차단함으로써, 퇴행성 뇌질환에 따른 제증상이 사전에 발생되지 않도록 하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 치료용 조성물의 바람직한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
그러나 치료효과를 위해서, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들어 상기 치료제는 혈관주사, 피하지방, 근육주사 및 미세주사기를 이용한 뇌실 또는 척수에 직접주사를 포함한다. 이때 multiple injection 및 반복 투여가 가능하다. 혈관주사의 경우, 유효 용량은 체중 1 kg당 벡터의 경우에는 0.05 내지 15 mg/kg, 재조합 바이러스의 경우에는 5 Х 1011 내지 3.3 Х 1014 바이러스 입자(2.5 Х 1012 내지 1.5 Х 1016 IU)/kg, 세포의 경우에는 5 Х 102 내지 5 Х 107세포/kg이고, 바람직하게는 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 mg/kg, 재조합 바이러스의 경우에는 5 Х 1012 내지 3.3 Х 1013 입자(2.5 Х 1013 내지 1.5 Х1015 IU)/kg, 세포의 경우에는 5 Х103 내지 5 Х 106 세포/kg이며, 일주일에 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 신경 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다. 기타 피하지방, 근육주사, 환부 직접 투여에 대한 유효 용량은 10cm 의 간격으로 9 Х 1010 내지 3.3 Х 1014의 재조합 바이러스 입자가 투여되며, 일주일에 2 ~ 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 신경 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 약학 조성물은 1 Х 1010 내지 1 Х 1012 vg(virus genome)/mL의 재조합 아데노조력 바이러스를 포함하며, 통상적으로 1 Х 1012 vg를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 본 발명의 재조합 벡터 제작
CD45는 대부분 조혈모세포(hematopoietic cell)에 위치한 막 관통성 단백질 트로신 인산 가수분해 효소(transmembrane protein tyrosine phosphatase)로서, 이는 세포의 표면에 있는 분자에 따라 세포를 정의할 수 있으며, 상기 CD45는 모든 백혈구 무리 및 B 림프구의 세포 표지자이다. 본 발명자들은 CD45 유래 세포, 특히, 림프구(lymphoid) 및 백혈구(leukocyte) 계열 세포에서는 발현되지 않으면서, 신경 세포에만 특이적으로 발현되는 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 재조합 벡터는 AIMP2(Aminoacyl TRNA Synthetase Complex Interacting Multifunctional Protein 2)의 엑손 2(exon 2)가 결실된 스플라이싱 변이체(splicing variant)를 포함하고, 상기 AIMP2 변이체 발현을 조절할 수 있는 miRNA를 삽입하여 제작하였다.
상기 AIMP2 변이체는 AIMP2가 스플라이싱 변이되어, 종양의 신호전달과 관련있는 TRAF2(TNF receptor-associated factor 2)를 분해하는 기능이 상실되어, TRAF2과 결합에 AIMP2와 경쟁함으로써 AIMP2의 기능을 저해하는 바, AIMP2의 종양 억제 작용을 방해하여 종양에서 과발현됨을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 재조합 벡터는 상기 AIMP2 변이체의 종양 과발현을 억제하고 신경 세포에서만 특이적으로 발현을 유도하기 위하여 상기와 같이 제작하였다.
1-1. AIMP2 변이체 제작
AIMP2는 아미노아실-tRNA 합성효소 복합체(Aminoacyl-tRNA synthetase: ARSs)의 형성에 관련된 단백질 중의 하나로, 종양 억제제(tumor suppressor)로서 작용한다. 상기 AIMP2의 엑손 2가 결실된 변이체를 발현하는 플라스미드를 구축하기 위하여, AIMP2 변이체의 cDNA를 pcDNA3.1-myc으로 클로닝하였다. 이는 AIMP2 변이체를 H322 cDNA에서 EcoR1 및 Xho I linker가 달린 primer를 이용하여 증폭시킨 후 EcoR1 과 Xho1을 이용하여 pcDNA3.1-myc에 클로닝하였다.
본 발명의 AIMP2 변이체는 서열번호 1의 염기서열로 표시되고, 서열번호 2의 아미노산으로 표시된다.
1-2. miRNA 선별 및 이의 타겟 서열 선발
상기한 바와 같이, 본 발명의 AIMP2 변이체는 종양에서 과발현되는 것이 확인되었는 바, 이를 목적하는 세포인 신경 세포에서 안전하게 발현되면서도 백혈구 관련 세포 및 림프구 관련 세포에서는 상기 AIMP2 변이체의 발현을 억제하기 위하여, 상기 AIMP2 변이체 발현을 조절할 수 있는 miRNA 및 이의 타겟을 선발하였다.
이를 위하여, 백혈구 관련 세포 및 림프구 관련 세포를 만들어 내는 조혈모세포(hematopoietic cell)에서만 특이적으로 발현하는 miR-142-3p를 타겟으로 선발하였다. 상기 miR-142-3p를 타겟하는 서열을 제작하기 위하여, 마우스 B 세포의 마이크로어레이 데이터와 miR-142-3p에 의해 타겟되는 유전자의 Computer programing (mirSVR score)를 이용하였다. 상기 miR-142-3p는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로, miR-142-3p를 표적하는 서열은 miR-142-3p 서열과 상보적으로 결합하는 서열번호 4의 염기서열로 나타내었다. 본 발명의 miR-142-3p 표적 서열은 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 나타내었다.
상기 본 발명의 miR-142-3p 표적 서열은, 클로닝을 위한 제한효소(NheⅠ, Hind Ⅲ, BmtⅠ) 사이트 서열(ccagaagcttgctagc), 제한효소(Hind Ⅲ) 사이트 서열(aagcttgtag)을 포함한다. 서열번호 4가 4번 반복된 서열을 포함하며, 이를 연결시켜주는 링커(tcac, gatatc)를 포함한다.
1-3. 본 발명의 재조합 벡터 제작
본 발명의 재조합 벡터를 제작하기 위하여, 상기 본 발명의 AIMP2 변이체(서열번호 1)의 3'UTR에 miR-142-3p 타겟 서열(서열번호 5)을 삽입하였다. AIMP-2 변이체와 miR-142-3p 표적 서열이 결합된 것은 서열번호 6의 염기서열로 나타내었으며, 구체적으로, NheI 및 Hind Ⅲ 사이트를 이용하여 잘라넣었다. 본 발명의 재조합 벡터는 서열번호 7로 나타내었다.
<실시예 2> 본 발명의 재조합 벡터의 신경세포 특이적 발현 확인
2-1. in vitro 상에서 신경세포 특이적 발현 효과 확인
miR142-3p은 조혈모세포에만 특이적으로 발현되는 바, 본 발명의 재조합 벡터의 miR142-3p 타겟 서열의 발현에 따라, 본 발명의 AIMP2 변이체 낙다운(knockdown)에 따른 특정 세포에서의 AIMP2 변이체 발현 정도를 확인하였다.
구체적으로, 본 발명의 재조합 벡터를 처리하지 않은 군(SHAM), 공벡터 처리군(NC vector), AIMP2 변이체 단독 벡터 처리군(pscAAV-DX2), 본 발명의 재조합 벡터 처리군(pscAAV-DX2-miR142-3pT)을 두었다. 모든 벡터의 농도는 ug/ul이고 각각 2.5 ul(2.5 ug)를 처리하였다. 상기 각 처리군은 THP-1 세포주(인간 혈액 단핵구(human leukemic monocyte cells)), SH-SY5Y 세포주(신경모세포종 (neuroblastoma))에 처리하였고, AIMP2 변이체의 낙다운(knockdown)을 확인하였다. 이는 qPCR는 하기 표 1의 프라이머를 이용하여(변성　15초, 어닐링 및 연장 온도 60도에서　30초 조건으로 40 cycle)을 수행하였다.
그 결과, AIMP2 변이체는 본 발명의 재조합 벡터를 처리하지 않은 군(SHAM), 공벡터 처리군(NC vector)에서는 발현되지 않음을 확인하였다. 또한, AIMP2 변이체 단독 벡터 처리군(pscAAV-DX2)에서는 THP-1 세포주 및 SH-SY5Y 세포주에서 모두 발현됨을 확인하여, 신경세포와 관련하여 특이적으로 발현이 유도되지 않음을 확인하였다. 반면, 본 발명의 재조합 벡터 처리군에서는 AIMP2 변이체가 SH-SY5Y 세포주에서만 특이적으로 발현됨을 확인하였다(도 2).
AIMP2 변이체 프라이머 서열번호
Forward CTGGCCACGTGCAGGATTACGGGG (only　human) 8
Reverse AAGTGAATCCCAGCTGATAG (only human) 9
2-2. in vivo 상에서 신경세포 특이적 발현 효과 확인
구체적으로, 공벡터 처리군(NC vector), AIMP2 변이체 단독 벡터 처리군(pscAAV-DX2), 본 발명의 재조합 벡터 처리군(pscAAV-DX2-miR142-3pT)을 두었다. 뇌실질(Intraparenchymal)에 108 vg/ul농도의 각 바이러스를 10 ul(109 vg) 처리하였다. 상기 각 처리군을 마우스에 두개 내 투여(intracranial injection)한 후, 1주일 후 대장 조직, 폐 조직, 뇌 조직, 간 조직, 신장 조직, 흉선(thymus) 조직, 비장(spleen) 조직 및 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서 AIMP2 변이체의 발현을 확인하였다. 이는 qPCR는 하기 표 1의 프라이머를 이용하여(변성 15초, 어닐링 및 연장 온도 60도에서 30초 조건으로 40 cycle)을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 재조합 벡터를 처리한 군에서, AIMP2 변이체는 신경세포가 집중적으로 분포된 뇌 조직에서만 특이적으로 발현이 증가됨을 확인하였다. 반면, 뇌 조직 이외의 다른 조직에서는 AIMP2 변이체의 발현이 저해됨을 확인하였다(도 3).
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Recombinant vector containing target sequence for miR-142-3p <130> PN1902-073 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2 variant of nucleic acid <400> 1 atgccgatgt accaggtaaa gccctatcac gggggcggcg cgcctctccg tgtggagctt 60 cccacctgca tgtaccggct ccccaacgtg cacggcagga gctacggccc agcgccgggc 120 gctggccacg tgcaggatta cggggcgctg aaagacatcg tgatcaacgc aaacccggcc 180 tcccctcccc tctccctgct tgtgctgcac aggctgctct gtgagcactt cagggtcctg 240 tccacggtgc acacgcactc ctcggtcaag agcgtgcctg aaaaccttct caagtgcttt 300 ggagaacaga ataaaaaaca gccccgccaa gactatcagc tgggattcac tttaatttgg 360 aagaatgtgc cgaagacgca gatgaaattc agcatccaga cgatgtgccc catcgaaggc 420 gaagggaaca ttgcacgttt cttgttctct ctgtttggcc agaagcataa tgctgtcaac 480 gcaaccctta tagatagctg ggtagatatt gcgatttttc agttaaaaga gggaagcagt 540 aaagaaaaag ccgctgtttt ccgctccatg aactctgctc ttgggaagag cccttggctc 600 gctgggaatg 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Val Asn 145 150 155 160 Ala Thr Leu Ile Asp Ser Trp Val Asp Ile Ala Ile Phe Gln Leu Lys 165 170 175 Glu Gly Ser Ser Lys Glu Lys Ala Ala Val Phe Arg Ser Met Asn Ser 180 185 190 Ala Leu Gly Lys Ser Pro Trp Leu Ala Gly Asn Glu Leu Thr Val Ala 195 200 205 Asp Val Val Leu Trp Ser Val Leu Gln Gln Ile Gly Gly Cys Ser Val 210 215 220 Thr Val Pro Ala Asn Val Gln Arg Trp Met Arg Ser Cys Glu Asn Leu 225 230 235 240 Ala Pro Phe Asn Thr Ala Leu Lys Leu Leu Lys 245 250 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-142-3p <400> 3 uguaguguuu ccuacuuuau gga 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-142-3p complementary sequence <400> 4 tccataaagt aggaaacact aca 23 <210> 5 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-142-3p target sequence <400> 5 ccagaagctt gctagctcca taaagtagga aacactacat cactccataa agtaggaaac 60 actacagata tctccataaa gtaggaaaca ctacatcact ccataaagta ggaaacacta 120 caaagcttgt ag 132 <210> 6 <211> 888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AIMP2 variant and miR-142-3p target sequence <400> 6 atgccgatgt accaggtaaa gccctatcac gggggcggcg cgcctctccg tgtggagctt 60 cccacctgca tgtaccggct ccccaacgtg cacggcagga gctacggccc agcgccgggc 120 gctggccacg tgcaggatta cggggcgctg aaagacatcg tgatcaacgc aaacccggcc 180 tcccctcccc tctccctgct tgtgctgcac aggctgctct gtgagcactt cagggtcctg 240 tccacggtgc acacgcactc ctcggtcaag agcgtgcctg aaaaccttct caagtgcttt 300 ggagaacaga ataaaaaaca gccccgccaa gactatcagc tgggattcac tttaatttgg 360 aagaatgtgc cgaagacgca gatgaaattc agcatccaga cgatgtgccc catcgaaggc 420 gaagggaaca ttgcacgttt cttgttctct ctgtttggcc agaagcataa tgctgtcaac 480 gcaaccctta tagatagctg ggtagatatt gcgatttttc agttaaaaga gggaagcagt 540 aaagaaaaag ccgctgtttt ccgctccatg aactctgctc ttgggaagag cccttggctc 600 gctgggaatg aactcaccgt agcagacgtg gtgctgtggt ctgtactcca gcagatcgga 660 ggctgcagtg tgacagtgcc agccaatgtg cagaggtgga tgaggtcttg tgaaaacctg 720 gctcctttta acacggccct caagctcctt aagtgaccag aagcttgcta gctccataaa 780 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acatcactcc ataaagtagg aaacactaca aagcttgtag ggatccgaga 1560 tatccctcta gaccatcgat gcggccgcta ggcctcacct gcgatctcga tgctttattt 1620 gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta 1680 acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt 1740 aaactagtcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt 1800 cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg 1860 acagatccgg gcccgcatgc gtcgacctta aggcgtaaat tgtaagcgtt aatattttgt 1920 taaaattcgc gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg 1980 gcaaaatccc ttataaatca aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt 2040 ggaacaagag tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct 2100 atcagggcga tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt 2160 gccgtaaagc actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa 2220 agccggcgaa cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc 2280 tggcaagtgt agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc 2340 tacagggcgc gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 2400 ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 2460 aataatattg aaaaaggaag agtcctgagg cggaaagaac cagctgtgga atgtgtgtca 2520 gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct 2580 caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca 2640 aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc ccatcccgcc 2700 cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt tttttattta 2760 tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag gaggcttttt 2820 tggaggccta ggcttttgca aagatcgatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga 2880 ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct 2940 atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc 3000 aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcaag 3060 acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg 3120 acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc 3180 tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc 3240 ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg 3300 agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc 3360 atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgagcatg cccgacggcg 3420 aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc 3480 gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag 3540 cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg 3600 tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg 3660 agttcttctg agcgggactc tggggttcga aatgaccgac caagcgacgc ccaacctgcc 3720 atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg ttgggcttcg gaatcgtttt 3780 ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca 3840 ccctaggggg aggctaactg aaacacggaa ggagacaata ccggaaggaa cccgcgctat 3900 gacggcaata aaaagacaga ataaaacgca cggtgttggg tcgtttgttc ataaacgcgg 3960 ggttcggtcc cagggctggc actctgtcga taccccaccg agaccccatt ggggccaata 4020 cgcccgcgtt tcttcctttt ccccacccca ccccccaagt tcgggtgaag gcccagggct 4080 cgcagccaac gtcggggcgg caggccctgc catagcctca ggttactcat atatacttta 4140 gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa 4200 tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga 4260 aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac 4320 aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt 4380 tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc 4440 gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat 4500 cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag 4560 acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc 4620 cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag 4680 cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac 4740 aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg 4800 gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct 4860 atggaaaaag atctag 4876 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of AIMP2 variant <400> 8 ctggccacgt gcaggattac gggg 24 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of AIMP2 variant <400> 9 aagtgaatcc cagctgatag 20

Claims (24)

  1. mir-142-3p를 표적화하는 서열 및 상기 mir-142-3p를 표적화하는 서열과 작동가능하게 연결된 외래 유전자를 포함하는, 신경세포에 특이적으로 외래유전자의 발현을 증가시키기 위한 조성물로서,
    상기 조성물을 개체에 투여하는 경우, 외래 유전자를 뇌조직에서 발현을 증가시키고, 대장조직, 폐조직, 간조직, 신장조직, 흉선조직, 비장조직 및 말초 혈액 단핵세포에서 발현을 감소시키므로서, 외래유전자를 신경세포에 특이적으로 발현을 증가시키는 것인, 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 miR-142-3p는 서열번호 3으로 표시되는 염기 서열인 것인, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 miR-142-3p를 표적하는 서열은 miR-142-3p 서열과 상보적으로 결합하는 서열인 것인, 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 miR-142-3p를 표적하는 서열은 서열번호 4로 표시되는 염기 서열인 것인, 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 miR-142-3p를 표적하는 서열은 서열번호 5로 표시되는 염기 서열인 것인 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 외래유전자와 작동가능하게 연결된 프로모터를 더 포함하는 것인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 외래 유전자의 3` UTR에 miR-142-3p를 표적하는 서열이 삽입된 것인, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 외래 유전자는 엑손 2가 결실된 AIMP2 변이체인 것인, 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 프로모터는 레트로바이러스(LTR) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV)프로모터, 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, MMT 프로모터, EF-1 알파 프로모터, UB6 프로모터, 치킨 베타-액틴 프로모터, CAG 프로모터, RPE65 프로모터 및 옵신 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터인 것인, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 표적화하는 서열 및 외래유전자는 바이러스 벡터, 선형 DNA 및 플라즈미드 DNA로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 포함된 것인, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 조력 바이러스(Adeno-associated virus), 렌티바이러스, 레트로바이러스, HIV(Human immunodeficiency virus) MLV(Murine leukemia virus) ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), MMTV(Mouse mammary tumor virus) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus)로 이루어진 군 중에서 선택된 1종으로부터 유래한 벡터인 것인, 조성물.

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  18. 삭제
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