KR102247364B1

KR102247364B1 - 화살나무 추출물을 이용한 호흡기 질환 개선용 조성물

Info

Publication number: KR102247364B1
Application number: KR1020190109803A
Authority: KR
Inventors: 신희순; 김승용; 신동욱; 엄지은; 이소영; 정선영; 최대운; 남영도; 박소림
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2018-09-04
Filing date: 2019-09-04
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2039-09-04
Also published as: KR20200027456A; KR20200027451A; KR102304263B1; KR102247367B1; KR20200027455A

Abstract

본 발명은 화살나무 추출물을 이용한 만성폐쇄성폐질환 등의 폐질환 개선용 조성물을 개시한다. 화살나무 추출물은 PMA(phorbol myristate acetate)에 의해 유도된 호중구 세포외 트랩(Neutrophil extracellular traps)의 네토시스(Netosis) 활성화를 억제하고, 점액질을 생성하는 기관지 상피세포주인 NCI-H292 세포의 CSE에 의한 염증성 사이토카인인 IL-8의 발현을 억제하며, CES와 LPS(lipopolysaccaride)에 의해 활성된 폐포 대식세포인 MH-S 세포의 염증성 사이토카인인 MIP-2의 발현을 억제하는 활성을 가진다. 또한, CSE와 PPE로 유도된 호흡기 질환 마우스 모델에서 폐 조직 손상을 억제하고, BALF 내에 총 세포(Total cell), 대식세포(macrophages), 림프구(Lymphocytes), 호산구(Eosinophil), 호중구(Neutrophil) 등의 면역세포 침윤을 억제하며, BALF 및 폐 조직에서 염증성 사이토카인과 케모카인 분비를 억제하는 활성을 가진다.

Description

화살나무 추출물을 이용한 호흡기 질환 개선용 조성물 {Composition for improving respiratory diseases using the extract of Euonymus alatus}

본 발명은 화살나무 추출물을 이용한 만성폐쇄성 폐질환 개선용 조성물에 관한 것이다.

만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)은 기침, 객담, 호흡 곤란, 호기 유속의 감소, 가스 교환의 장애 등을 보이는 만성 기도 질환으로서, 해마다 전세계적으로 그 발병 인구가 증가하고 있으며, 2020년에는 인류의 사망원인 중 3번째 원인이 될 것으로 예측되고 있다(Am J Respir Crit Care Med, 2013, 187:347-365; Am J Respir Crit Care Med, 2009, 180:396-406).

COPD는 흡연, 대기오염, 화학물질, 직업성 인자, 유전적 소인 등 다양한 원인에 의해서 발병하는데, 이중 흡연이 주요한 원인으로 지목되고 있으며, 실제 COPD 환자의 80% 이상이 흡연자로 밝혀진 바 있다(Biol Pharm Bull, 2012, 35:1752-1760). COPD의 발병 기전에는 염증, 폐에서의 단백분해효소 활성화, 산화적 스트레스(oxidative stress) 등이 관여하며, 염증에 관여하는 세포는 주로 호중구와 대식세포, T 림프구 등이다. 이러한 염증세포들은 활성산소종(reactive oxygen species), 다양한 염증성 사이토카인, 조직 손상을 야기하는 여러 단백분해 효소들을 생성한다(대한결핵 및 호흡기학회 호흡기학 서울: 군자출판사; 2007, p 301-5;Am J Respir Crit Care Med, 1997 155, 1441-1447; Am J Physiol Lung CellMol Physiol, 2010, 298:L262-L269). 특히, 호중구는 세포 외로 엘라스타아제, 콜라게나아제, MPO(myeloperoxidase)와 같은 단백분해효소(proteases), 아라키돈산대사물(arachidonate), 활성산소종(reactive oxygen free radical) 등의 물질을 분비하여 폐손상을 야기함으로써 COPD가 발병하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 따라서 COPD 치료제의 개발에 있어 중요한 표적이 되고 있다(Am J Respir Cell Mol Biol, 2013, 48:531-539; Eur Respir J, 1998, 12:1200-1208).

최근 호중구 세포외 트랩(Neutrophil extracellular traps)의 네토시스(Netosis) 활성화가 COPD를 비롯한 만성 폐/호흡기 질환의 발병 기전에 관여하는 것으로 보고되어 있다(PLoS One. 2014 May 15;9(5):e97784.; Respir Res. 2015 May 22;16:59.; J Immunol Res. 2017;2017:6710278; Respirology. 2016 Apr; 21(3):467-75).

이제까지 COPD 등을 직접적으로 개선시키는 약물은 보고된 바 없으며, 현재의 COPD 치료제로는 증상과 합병증을 감소시키기 위한 것으로 기관지확장제(β2-작용제, 항콜린제, methylxanthines)와 스테로이드제(흡입, 경구) 등이 주로 사용되고 있다.

본 발명의 목적은 화살나무 추출물을 이용한 호흡기 기능 강화 및 호흡기 질환 개선용 식품조성물, 상기 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품 및 화살나무 추출물을 이용한 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 화살나무 추출물이 PMA(phorbol myristate acetate)에 의해 유도된 호중구 세포외 트랩(Neutrophil extracellular traps)의 네토시스(Netosis) 활성화를 억제하고, 기관지 상피세포주인 NCI-H292 세포의 CSE에 의한 염증성 사이토카인인 IL-8의 발현을 억제하며, CES와 LPS(lipopolysaccharide) 의해 활성된 폐포 대식세포인 MH-S 세포에서도 염증성 사이토카인인 MIP-2의 발현을 억제함을 확인할 수 있었다.

전술한 바를 고려할 때, 본 발명은, 일 측면에 있어서, 화살나무(Euonymus alatus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 COPD 개선용 조성물로 파악될 수 있으며, 또 다른 측면에 있어서는 화살나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 기능 강화 및 호흡기 질환 개선용 조성물로도 파악할 수 있으며, 또한 본 발명은 화살나무 추출물을 유효성분으로 포함하는, 기침, 객담, 호흡 곤란, 기도 과민성, 기도 폐쇄, 점액 과분비, 호기 유속의 감소 및/또는 가스 교환의 장애 증상을 수반하는 폐질환 개선용 조성물로도 파악할 수 있다. 이러한 폐질환은 앞서 언급한 COPD 뿐 아니라 미만성 간질성 폐질환, 급성호흡곤란증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 급성 폐손상 등을 포함하며, 발생 원인을 불문하고 앞서 언급한 흡연, 대기오염, 유전적 소인 등에 의한 폐질환 이외에 특히, 최근 문제가 되고 있는 미세먼지에 의한 폐질환을 포함한다. 검댕, 생물체 유기탄소 등 탄소성분과 염소, 질산, 암모늄, 나트륨, 칼슘 등의 이온성분, 납, 비소, 수은과 같은 금속성분, 벤조피렌 등과 같은 다환방향족 탄화수소 등 다양한 성분을 포함하고 있는 미세먼지는 상기도, 기관지, 소기도, 폐포 등에 침착하여 천식, COPD 등 다양한 폐질환을 일으키는 것으로 알려져 있다(J Korean Med Assoc, 2014; 57: 763-768).

본 명세서에서, "추출물"이란 추출 대상인 식물의 줄기, 잎, 열매, 꽃, 뿌리, 이들의 혼합물 등을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다. 분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합·정치시켜 얻은 분획물, 상기 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다. 또한 상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고형상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 에탄올 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물, 더 바람직하게는 추출용매로서 물과 에탄올의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물을 의미한다.

또 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명에서 용어 "호흡기 기능 강화"는 비강, 인두, 후두, 기관, 기관지 및 폐 등 호흡 기관의 본래 기능을 건강한 상태로 유지시키거나, 흡연, 미세먼지, 호중구 네토시스 활성화 또는 기타 호흡기 질환 등에 따른 증상으로 인해 저하된 호흡 기관의 기능을 본래 건강한 상태로 개선시키는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명에서 상기 "호흡기 질환"은 비강, 인두, 후두, 기관, 기관지 및 폐 등 개체의 호흡 기관에 발생하는 질환을 의미하는 것으로, 구체적으로 상기 호흡기 질환은 흡연 또는 미세먼지에 의한 호흡기 질환; 또는 네토시스(Netosis)를 수반하는 폐질환을 의미할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 상기 호흡기 질환은 객담, 호흡 곤란, 기도 과민성, 기도 폐쇄, 점액 과분비, 호기 유속의 감소 및/또는 가스 교환의 장애 증상을 수반하는 폐질환을 의미할 수 있고, 보다 더 구체적으로 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 기관염(tracheitis), 기관지염(bronchitis), 미만성 간질성 폐질환, 급성 호흡곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 급성 폐손상, 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 모세기관지염(bronchiolitis), 인플루엔자 바이러스 감염증(influenza virus infection), 폐렴(pneumonia), 결핵(tuberculosis) 및 수혈관련급성폐장애(transfusion-related acute lung injury)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 의미할 수 있으며, 가장 구체적으로는 COPD를 의미할 수 있다. 한편, 최근 호중구 세포 외 트랩(Neutrophil extracellular traps)의 네토시스(Netosis) 활성화가 COPD를 비롯한 만성 호흡기 질환의 발병 기전에 관여하는 것으로 보고되어 있다.

본 발명의 조성물에서 그 유효성분은 COPD 개선 활성, 기타 폐질환 개선 활성, 호흡기 기능 강화 및 호흡기 질환 개선 활성을 나타낼 수 있는 한, 그 구체적 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 20.0 중량 % 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 그 적용 대상인 포유동물 바람직하게는 사람에게 의료 전문가 등의 제언에 의한 투여 기간 동안 본 발명의 조성물이 투여될 때, COPD 개선 효과 등 의도한 기능적·약리학적 효과를 나타낼 수 있는, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다.

본 발명의 조성물은 유효성분 이외에, 항염증 활성, 항알러지 활성 등 유사활성의 부가를 통한 복용이나 섭취의 편리성을 증진시키기 위하여, 당업계에서 이미 안전성이 검증되고 해당 활성을 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.

이러한 화합물 또는 추출물에는 각국 약전(한국에서는 "대한민국약전"), 각국 건강기능식품공전(한국에서는 식약처 고시인 "건강기능식품 기준 및 규격"임) 등의 공정서에 실려 있는 화합물 또는 추출물, 의약품의 제조·판매를 규율하는 각국의 법률(한국에서는 "약사법"임)에 따라 품목 허가를 받은 화합물 또는 추출물, 건강기능식품의 제조·판매를 규율하는 각국 법률(한국에서는 「건강기능식품에관한법률」임)에 따라 기능성이 인정된 화합물 또는 추출물이 포함될 수 있다.

예컨대, 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따라, 항염증("관절염 개선") 기능성이 인정된 MSM(dimethylsulfonylmethane), N-아세틸글루코사민 등과, 항알러지("과민 면역반응 완화") 기능성이 인정된 Enterococcus faecalis 가열 처리 건조 분말, 구아바 잎 추출물 등의 복합물, 다래 추출물, 소엽 추출물, 피카오프레토 분말 등의 복합물, PLAG(1-palmitoyl-2-linoleoyl-3-acetyl-rac-glycerol) 등이 이러한 화합물 또는 추출물에 해당할 것이며, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

이러한 화합물 또는 천연 추출물은 본 발명의 조성물에 그 유효성분과 함께 하나 이상 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서, 식품 조성물로서 파악할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품에는 건강기능(성)식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어 "건강기능식품"이란, 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 COPD 개선 효과, 나아가 호흡기 기능 강화 및 호흡기 질환 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

본 발명의 식품 조성물은 어떠한 형태로도 제조될 수 있으며, 예컨대 차, 쥬스, 탄산음료, 이온음료 등의 음료류, 우유, 요구루트 등의 가공 유류(乳類), 껌류, 떡, 한과, 빵, 과자, 면 등의 식품류, 정제, 캡슐, 환, 과립, 액상, 분말, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리, 바 등의 건강기능식품 제제류 등으로 제조될 수 있다.

또 본 발명의 식품 조성물은 법률상·기능상의 구분에 있어서 제조·유통 시점의 시행 법규에 부합하는 한 임의의 제품 구분을 띨 수 있다. 예컨대 한국 「건강기능식품에관한법률」에 따른 건강기능식품이거나, 한국 「식품위생법」의 식품공전(식약처 고시 「식품의 기준 및 규격」)상 각 식품유형에 따른 과자류, 두류, 다류, 음료류, 특수용도식품 등일 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 그 유효성분 이외에 식품첨가물이 포함될 수 있다. 식품첨가물은 일반적으로 식품을 제조, 가공 또는 보존함에 있어 식품에 첨가되어 혼합되거나 침윤되는 물질로서 이해될 수 있는데, 식품과 함께 매일 그리고 장기간 섭취되므로 그 안전성이 보장되어야 한다. 식품의 제조·유통을 규율하는 각국 법률(한국에서는 「식품위생법」임)에 따른 식품첨가물공전에는 안전성이 보장된 식품첨가물이 성분 면에서 또는 기능 면에서 한정적으로 규정되어 있다. 한국 식품첨가물공전(식약처 고시 「식품첨가물 기준 및 규격」)에서는 식품첨가물이 성분 면에서 화학적 합성품, 천연 첨가물 및 혼합 제제류로 구분되어 규정되어 있는데, 이러한 식품첨가물은 기능 면에 있어서는 감미제, 풍미제, 보존제, 유화제, 산미료, 점증제 등으로 구분된다.

감미제는 식품에 적당한 단맛을 부여하기 위하여 사용되는 것으로, 천연의 것이거나 합성된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는 천연 감미제를 사용하는 경우인데, 천연 감미제로서는 옥수수 시럽 고형물, 꿀, 수크로오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스 등의 당 감미제를 들 수 있다.

풍미제는 맛이나 향을 좋게 하기 위하여 사용될 수 있는데, 천연의 것과 합성된 것 모두 사용될 수 있다. 바람직하게는 천연의 것을 사용하는 경우이다. 천연의 것을 사용할 경우에 풍미 이외에 영양 강화의 목적도 병행할 수 있다. 천연 풍미제로서는 사과, 레몬, 감귤, 포도, 딸기, 복숭아 등에서 얻어진 것이거나 녹차잎, 둥굴레, 대잎, 계피, 국화 잎, 자스민 등에서 얻어진 것일 수 있다. 또 인삼(홍삼), 죽순, 알로에 베라, 은행 등에서 얻어진 것을 사용할 수 있다. 천연 풍미제는 액상의 농축액이나 고형상의 추출물일 수 있다. 경우에 따라서 합성 풍미제가 사용될 수 있는데, 합성 풍미제로서는 에스테르, 알콜, 알데하이드, 테르펜 등이 이용될 수 있다.

보존제로서는 소르브산칼슘, 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산칼슘, 벤조산나트륨, 벤조산칼륨, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) 등이 사용될 수 있고, 또 유화제로서는 아카시아검, 카르복시메틸셀룰로스, 잔탄검, 펙틴 등이 사용될 수 있으며, 산미료로서는 연산, 말산, 푸마르산, 아디프산, 인산, 글루콘산, 타르타르산, 아스코르브산, 아세트산, 인산 등이 사용될 수 있다. 산미료는 맛을 증진시키는 목적 이외에 미생물의 증식을 억제할 목적으로 식품 조성물이 적정 산도로 되도록 첨가될 수 있다.

점증제로서는 현탁화 구현제, 침강제, 겔형성제, 팽화제 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 전술한 바의 식품첨가물 이외에, 기능성과 영양성을 보충, 보강할 목적으로 당업계에 공지되고 식품첨가물로서 안정성이 보장된 생리활성 물질이나 미네랄류를 포함할 수 있다.

그러한 생리활성 물질로서는 녹차 등에 포함된 카테킨류, 비타민 B1, 비타민 C, 비타민 E, 비타민 B12 등의 비타민류, 토코페롤, 디벤조일티아민 등을 들 수 있으며, 미네랄류로서는 구연산칼슘 등의 칼슘 제제, 스테아린산마그네슘 등의 마그네슘 제제, 구연산철 등의 철 제제, 염화크롬, 요오드칼륨, 셀레늄, 게르마늄, 바나듐, 아연 등을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에는 전술한 바의 식품첨가물이 제품 유형에 따라 그 첨가 목적을 달성할 수 있는 적량으로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물에 포함될 수 있는 기타의 식품첨가물과 관련하여서는 각국 식품공전이나 식품첨가물 공전을 참조할 수 있다.

본 발명의 조성물은 다른 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로 파악될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 투여 경로는 국소 경로, 경구 경로, 정맥 내 경로, 근육 내 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하는 임의의 적절한 경로일 수 있으며, 두 가지 이상의 경로를 조합하여 사용할 수도 있다. 두 가지 이상 경로의 조합의 예는 투여 경로에 따른 두 가지 이상의 제형의 약물이 조합된 경우로서 예컨대 1차로 어느 한 약물은 정맥 내 경로로 투여하고 2차로 다른 약물은 국소 경로로 투여하는 경우이다.

약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 "대한민국약전"을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유, 에탄올, 그리세롤 등을 들 수 있다. 제제화활 경우 필요에 따라적절한 결합제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 희석제 등을 포함시킬 수 있다. 적절한 결합제로서는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페리스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 글루코스, 옥수수 감미제, 소듐 알지네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 들 수 있고, 윤활제로서는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 초산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈쿰, 스테아르산, 그것의 마그네슘염과 칼슘염, 폴리데틸렌글리콜 등을 들 수 있으며, 붕해제로서는 전분, 메틸 셀룰로스, 아가(agar), 벤토나이트, 잔탄 검, 전분, 알긴산 또는 그것의 소듐 염 등을 들 수 있다. 또 희석제로서는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 소비톨, 셀룰로스, 글라이신 등을 들 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 수성 등장 용액 또는 현탁액을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화할 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화할 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 담체로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등을 사용할 수 있다.

약제학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.001mg/kg ~ 10g/kg 범위, 바람직하게는 0.001mg/kg ~ 1g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 화살나무 추출물을 이용한 COPD 개선용 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 식품, 특히 건강기능식품 또는 약품으로 제품화되어, COPD 개선 효과를 위하여, 나아가 호흡기 기능 강화 및 호흡기 질환 개선 효과를 위하여 유용하게 사용될 수 있으며, 기침, 객담, 호흡 곤란, 기도 과민성, 기도 폐쇄, 점액 과분비 등의 증상을 수반하는 기타 폐질환 예컨대 미만성 간질성 폐질환, 급성호흡곤란증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 급성 폐손상 등의 개선 효과를 위하여서도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 HL-60 세포에 대해 화살나무 추출물의 농도별 처리 시 Netosis 수준(%)을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 2 및 도 3은 H292 세포에 대해 각각 화살나무 잎 또는 가지 추출물의 처리 시 IL-8 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 MH-S 세포에 대해 화살나무 추출물의 농도별 처리 시 MIP-2 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 PPE/CSE로 유도된 만성폐쇄성폐질환(또는 호흡기 질환)마우스 모델에 대해 화살나무 추출물을 투여한 후 기관지폐포세척액(BALF)로부터 계수된 총 세포수를 나타낸 것이다.
도 6 및 도 7은 Diff-Quick 염색을 통한 BALF 내 면역세포(Macrophage, Lympocyte, Neutrophils 및 Eosinophil)를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 마우스 모델로부터 적출된 폐 조직을 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 BALF 내 Cytokine(TNF-alpha, MIP-2, IL-1beta, IL-6)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 폐 조직으로부터 Cytokine(KC, MCP-1, MDC, TARC, GM-CSF, MIP-2, IL-6, TNF-alpha, IL-1beta, INF-gamma, IL-10 및 IL-17)을 분석한 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예] 시료 준비

화살나무(추출 부위: 잎, 가지)의 추출물을 제조하여 폐질환 개선 활성을 확인하였다. 추출물은 각 추출 대상 천연물의 건조 분말에 10배 중량의 70% 에탄올을 가하여 50℃에서 6시간씩 2회 반복 추출하여 여과한 후 감압농축 및 동결건조하여 분말상으로 얻었다.

[실험예] 폐질환 개선 활성

실험예 1: 호중구 세포의 Netosis 억제 활성

HL-60 세포를 1% DMSO가 처리된 RPMI (10% FBS, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin) 배지에 2×10⁵ cell/mL로 seeding하고 세포배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 5일간 배양하여 mature neutrophil phenotype으로 분화시켰다. 5일후 1,300 rpm에서 5분간 원심분리 한 후, HBSS (with Mg^+, Ca⁺)를 10 mL 처리하고 1,300 rpm에서 5분간 원심분리하여 세척하였다. 회수한 세포는 HBSS에 1×10⁶ cell/mL 농도로 희석하여 96 well plate에 100 μL씩 분주하고 각각의 농도로 준비된 시료를 50 μL씩 처리하였다. 그 후 400 nM로 준비된 PMA 또는 CSE를 50 μL씩 각각의 well에 처리한 후 3시간 배양하였다. 3시간 후 Cytox green (500 nM)을 처리하고 형광 plate reader기를 이용하여 excitation/emission maxima: 485/520 nm에서 형광도를 측정하였다.

그 결과, Netosis 수준(%)은 처리된 화살나무 잎 추출물의 농도(12.5 ㎍/ml, 25 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 100 ㎍/ml) 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 1).

실험예 2: H292 세포를 이용한 염증성 사이토카인(IL-8) 억제활성 평가

24 well plate에 2×10⁵ cells/mL 농도로 준비한 H292 세포를 500 μL/well로 계대하여 배양한 후 세포가 80% 이상 confluent 되었을 때, serum-free RPMI1640 배지로 교환하여 24시간 starvation 하였다. 그 후 Serum-free RPMI1640 배지를 이용하여 자극물질 (CSE; 최종 2% 또는 PPE; 최종 0.01U/mL 또는 PM2.5; 최종 10 μg/mL)과 화살나무 추출물(최종; 6.25, 12.5, 25 μg/mL)을 원하는 최종농도를 반영하여 희석한 후, well당 500 uL씩 처리하였다. 하룻밤 배양 후 상징액을 회수하여 IL-8 측정에 사용하였다. Human IL-8은 ELISA법으로 측정하였으며, 제조사(BD社)의 프로토콜에 따라 진행하였다.

그 결과, IL-8 농도는 처리된 화살나무 잎 추출물의 농도(6.25 ㎍/ml, 12.5 ㎍/ml, 25 ㎍/ml) 의존적으로 억제되며, 화살나무 가지 추출물을 처리(6.25 ㎍/ml)한 경우에도 IL-8이 억제되는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3).

실험예 3: MH-S 세포를 이용한 MIP-2 억제활성 평가

MH-S cell line은 ATCC 사에서 구매하였으며, 배양에 사용한 배지 조성은 RMPI-1640 (WELGENE, cat. LM 011-01), 10% FBS (WELGENE, cat. S 001-07), 1% Penicillin-Streptomycin (WELGENE, cat. LS 202-02), 14.3 mM 2-Mercptoethanol (SIGMA)였다. MH-S 세포를 5x10⁴/well 농도로 cell culture 96 well plate (SPL, cat. 30096)에 seeding 하여 24시간 배양 하였다. 그 후 MH-S 세포 배양 배지로 자극물질 (CSE; 최종 1% 및 LPS; 최종 10 ng/mL )과 화살나무 잎 추출물(최종; 25 μg/mL)을 원하는 최종농도를 반영하여 희석하고 well당 250 uL씩 처리하였다. 24 시간 배양 후, 상징액을 회수하여 MIP-2 측정에 사용하였다. MIP-2는 ELISA법으로 측정하였으며, 제조사(R&D, DY452)의 프로토콜에 따라 진행하였다

그 결과, 화살나무 잎 추출물 처리(25 ㎍/ml) 시 MIP-2 억제 활성을 나타내는 것을 확인하였다(도 4).

실험예 4: 동물 모델에서 BALF 세포 수 측정

4-1: PPE+CSE-유도된 호흡기 질환 마우스 모델

오리엔트 바이오사에서 BALB/C 마우스(male, 5주령)를 구입하여 1주일간 순화하였으며, n=10로 group화 하였다. 샘플 처리군은 COPD 유도 시작 일주일 전부터 해부전까지 24일간 200 mg/kg의 샘플(화살나무 추출물)을 경구투여하였으며, Naive와 COPD 군은 동량의 PBS를 투여하였다. 이 때 Positive control인 Roflumilast 군은 유도 시작 후 매일 10 mg/kg 농로 경구투여 하였다. COPD 유도에는 Porcine Pancreatic Elastase (PPE) 1.2 unit과 100% Cigarette Smoke Extraction (CSE)를 사용하였다. PPE 1.2 unit은 7일에 한번씩 intra nasal을 통해 총 3회 투입하였으며, CSE는 PPE 처리 다음날부터 3일간 intra nasal을 통해 20 ㎕ 처리하되, 마지막 PPE 처리 후에는 CSE를 처리하지 않고 다음 날 해부를 진행하였다. 해부는 흡입 마취기를 이용하여 isoflurane으로 마취시킨 후 진행하였다. 실험기간 동안 사료와 음용수는 자율급식 형태로 제공하였으며, 24 ℃, 습도 60% 환경에서 사육하였다.

4-2: BALF 내 침투된 총 세포수

마우스의 기도를 통해 PBS 1 mL을 주입한 후 가볍게 마사지하여 700 μL의 기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage fluid; BALF)을 회수하였다. 회수한 BALF액 10 uL를 Accustain T solution과 동량 혼합하여 Accuchip channel에 12 uL 주입 한 후 cell counter (ADAM-MC, NANOENTEK. INC, Korea)로 total cell을 자동 계수하였다(도 5).

4-3: Diff-Quick 염색을 통한 BALF 내 면역세포 분석

회수한 BALF는 300×g, 5분 조건에서 원심분리를 통해 상층액과 세포 pellet으로 분리하였다. cell pellet은 PBS 700 μL를 첨가하여 재현탁하였으며, 이 BALF 현탁액 150 μL를 Cytospin device(Centrifuge 5403, Eppendorf, Hamburg, Germany)로 1000 rpm, 10 min, 4℃ 조건에서 원심분리하여 slide에 BALF 세포를 부착시켰다. 이 후 Diff-Quick staining reagent를 사용하여 제조사 (1-5-1 Wakinohamakaigandori, chuo-ku, Kobe, Japan)의 프로토콜에 준하여 세포를 염색한 후 현미경 관찰을 통해 Macrophages, Lympocytes, Neutrophils, Eosinophils의 수를 계수하였다(도 6, 도 7).

4-4: 조직 분석 (Histological examination)

해부한 마우스로부터 폐 조직을 적출하여 폐의 중간엽을 제거한 후 10% neutral buffered formalin에 3일간 고정하였다. 고정한 조직을 ethyl alcohol과 xylene으로 탈수 시킨 후 파라핀으로 포매 한 후 삭정하고 5 um 두께로 박절하였다. 준비한 절편을 슬라이드에 부착시킨 후, 일반적인 형태를 확인하기 위해 H&E로 염색한 후 현미경으로 관찰하였다(도 8).

4-5: BALF 내 Cytokines 분석

마우스의 기도를 통해 PBS 1 mL을 주입한 후 가볍게 마사지하여 700 μL의 기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage fluid; BALF)을 회수하였다. 회수한 BALF는 300×g, 5분 조건에서 원심분리하여 상층액을 분리 한 후 cytokines 및 chemokines 분석(TARC, KC, MCP-1, MDC, GM-CSF, MIP-2, TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-17, IL-10, IFN-γ)에 사용하였다. cytokines 및 chemokines 분석을 위해 상층액 30 uL를 취한 후 Q-plex ELISA array kit의 제조사(Quansis biosciences 社) 프로토콜에 따라 실험을 진행하였다. 그 결과는 도 9에 각각의 cytokine 별로 나타내었다.

4-6: 폐 조직의 Cytokines 분석

폐 조직 무게의 10배에 해당하는 PBS를 첨가하고 homogenizer로 분쇄한 후 12,000 rpm, 20 min 조건에서 원심분리하였다. 회수한 상등액은 cytokines 및 chemokines 분석 (TARC, KC, MCP-1, MDC, GM-CSF, MIP-2, TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-17, IL-10, IFN-γ)에 사용하였다. cytokines 및 chemokines 분석을 위해 상층액 30 uL를 취한 후 Q-plex ELISA array kit의 제조사(Quansis biosciences 社) 프로토콜에 따라 실험을 진행하였다. 그 결과는 도 10에 각각 나타내었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

화살나무 추출물을 유효성분으로 포함하는, COPD 개선용 식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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제1항 또는 제2항의 식품 조성물을 포함하는, COPD 개선용 건강기능식품.
화살나무 추출물을 유효성분으로 포함하는, COPD 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 추출물은 물, 에탄올 또는 이들의 혼합용매 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
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