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KR102227975B1 - 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된, 내산성을 갖는 효모 세포 및 그를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법 - Google Patents

방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된, 내산성을 갖는 효모 세포 및 그를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법 Download PDF

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KR102227975B1 KR1020140094159A KR20140094159A KR102227975B1 KR 102227975 B1 KR102227975 B1 KR 102227975B1 KR 1020140094159 A KR1020140094159 A KR 1020140094159A KR 20140094159 A KR20140094159 A KR 20140094159A KR 102227975 B1 KR102227975 B1 KR 102227975B1
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Abstract

방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된, 내산성을 갖는 효모 세포 및 그를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다.

Description

방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된, 내산성을 갖는 효모 세포 및 그를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법{Genetically engineered and acid resistant yeast cell with ehanced radiation sensitivity complementing kinase activity and method for producing lactate using the same}
방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된, 내산성을 갖는 효모 세포 및 그를 이용한 락테이트를 생산하는 방법에 관한 것이다.
유기산은 산업적으로 널리 이용된다. 예를 들면, 락테이트는 식품, 제약, 화학, 전자 등 다양한 산업 분야에서 폭넓게 사용되는 유기산이다. 락테이트는 무색, 무취이고 물에 잘 용해되는 저휘발성 물질이다. 락테이트는 인체에 독성이 없어 향미제, 산미제, 보존제 등으로 활용되고 있고, 또한 환경친화적으로 대체 고분자 물질이고, 생분해성 플라스틱인 폴리락틱산 (polylactic acid: PLA)의 원료이다.
유기산은 그의 pKa 값보다 높은 산도, 예를 들면, 중성 조건에서 수소 이온과 유기산의 음이온으로 분리된다. 그러나, 유기산, 예를 들면, 젖산은 pKa 값보다 낮은 산성 조건에서는 전자기력을 가지지 않는 유리산 (free acid) 형태로 존재한다. 음이온 형태는 세포막을 투과하지 못하나, 유리산 형태는 세포막을 투과할 수 있으므로, 유기산의 농도가 높은 환경에서 세포막 외부의 유기산이 세포 내부로 유입되어 세포 내 pH가 떨어지는 현상이 일어날 수 있다. 또한, 음이온 형태의 유기산은 분리시에 염을 첨가하여 염의 형태로 분리하여야 하는 단점이 있다. 그 결과, 내산성 (acid resistance)이 결여된 세포는 젖산이 포함된 산성 조건에서 세포의 활성을 잃고 사멸할 수 있다.
따라서, 이러한 산성에 대하여 내성을 갖는 미생물이 요구되고 있다.
일 양상은 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된, 내산성을 갖는 효모 세포를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 효모 세포를 이용하여 락테이트를 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 효소 또는 폴리펩티드 또는 단백질의 "활성 증가" 또는 "증가된 활성"은 효소 또는 폴리펩티드 또는 단백질이 활성을 나타낼 수 있도록 충분한 정도로 증가된 것일 수 있으며, 세포 또는 단리된 폴리펩티드가 비교 가능한 동일 종의 세포, 모세포, 또는 그의 본래 폴리펩티드에서 측정된 활성 수준과 비교하여 높은 활성 수준을 나타냄을 의미한다. 즉 해당 폴리펩티드의 활성이 본래 조작되지 않은 세포의 폴리펩티드, 모세포의 폴리펩티드, 또는 야생형 폴리펩티드에 의한 동일한 생화학적 활성보다 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 또는 약 100% 이상 증가된 것일 수 있다. 증가된 활성을 갖는 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다.
폴리펩티드의 활성 증가는 폴리펩티드의 발현 증가 또는 비활성 (specific activity)의 증가에 의하여 얻어진 것일 수 있다. 상기 비활성 증가는 상기 효소 또는 폴리펩티드 중 활성 도메인 (active domain)의 특정 아미노산의 변이 또는 임의 돌연변이유발 (random mutagenesis)에 의한 효소 공학 (enzyme engineering)에 의한 것일 수 있다. 상기 발현 증가는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포에 도입되거나 세포 내 카피 수가 증가되거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이에 의한 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 조절 영역의 변이는 유전자의 발현 조절 서열의 변형을 갖는 것일 수 있다. 상기 조절 서열은 상기 유전자 발현을 위한 프로모터 서열 또는 전사 종결자 서열일 수 있다. 또한, 상기 조절 서열은 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 모티프를 코딩하는 서열일 수 있다. 상기 모티프는 예를 들면, 이차 구조-안정화 모티프, RNA 불안정화 모티프, 스플라이스-활성화 모티프, 폴리아데닐화 모티프, 아데닌-풍부 서열 (adenine-rich sequence), 또는 엔도뉴클레아제 인식 부위일 수 있다.
외부에서 도입되거나 또는 카피 수가 증가되는 폴리뉴클레오티드는 내인성 (endogenous) 또는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 내인성 유전자는 미생물 내부에 포함된 유전물질 상에 존재하던 유전자를 말한다. 외인성 유전자는 숙주 세포 게놈으로 도입 (integration)되는 등의 숙주 세포 내로 유전자가 도입되는 것을 의미하며, 도입되는 유전자는 도입되는 숙주세포에 대해 동종 (homologous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. "이종성 (heterologous)"은 천연 (native)이 아닌 외인성 (foreign)을 의미할 수 있다.
용어 "카피 수 증가 (copy number increase)"는 상기 유전자의 도입 또는 증폭에 의한 것일 수 있으며, 조작되지 않은 세포에 존재하지 않는 유전자를 유전적 조작에 의해 갖게 되는 경우도 포함한다. 상기 유전자의 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입이거나 게놈에 삽입되는 것일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 폴리뉴클레오티드가 게놈으로 통합됨으로써 이루어질 수 있다.
용어 "유전자"는 전사 및 번역 중 하나 이상에 의하여 발현 산물, 예를 들면, mRNA 또는 단백질을 생성할 수 있는 핵산 단편을 의미하며, 코딩영역 또는 코딩영역 외 5'-비코딩 서열 (5'-non coding sequence)과 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence) 등의 조절 (regulatory) 서열을 포함할 수 있다.
"세포 (cell)", "균주 (strain)", 또는 "미생물 (microorganism)"은 교체 사용이 가능한 것으로서, 효모, 박테리아, 또는 곰팡이 등을 포함할 수 있다.
효소 또는 폴리펩티드의 "활성의 감소" 또는 "감소된 활성"은 세포 또는 단리된 효소 또는 폴리펩티드가 비교 가능한 동일 종의 세포, 모세포, 또는 그의 본래 폴리펩티드에서 측정된 활성 수준과 비교하여 낮은 활성 수준을 나타내거나 활성을 나타내지 않는 것을 의미한다. 즉 해당 폴리펩티드의 활성이 본래 조작되지 않은 폴리펩티드, 본래 조작되지 않은 세포의 폴리펩티드, 또는 모세포의 폴리펩티드 또는 야생형(wild-type) 폴리펩티드에 의한 동일한 생화학적 활성보다 약 10%이상, 약 20%이상, 약 30%이상, 약 40%이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다. 감소된 효소 활성은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 상기 활성의 감소는 효소가 발현되더라도 효소의 활성이 없거나 감소된 경우 또는 효소를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나 발현되더라도 본래 조작이 되지 않은 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 아생형 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 비하여 발현량이 감소된 경우를 포함한다.
상기 효소의 활성이 감소되는 것은 상기 효소를 코딩하는 유전자의 제거 또는 파괴에 의한 것일 수 있다. 유전자의 "제거 (deletion)" 또는 "파괴 (disruption)"는 유전자가 발현되지 않거나 발현량이 감소되거나 발현되어도 효소 활성을 나타내지 않거나 활성이 감소되도록, 유전자의 일부 또는 전부가, 또는 그 프로모터, 그 터미네이터 영역 등의 조절 인자의 일부 또는 전부가 변이, 치환, 삭제되거나 유전자에 하나 이상의 염기가 삽입되는 것을 말한다. 상기 유전자의 제거 또는 파괴는 상동 재조합과 같은 유전자 조작, 돌연변이 유발, 분자 진화를 통해 달성될 수 있다. 세포가 복수 개의 같은 유전자를 포함하거나 2개 이상의 다른 폴리펩티드 동종상동유전자 (paralog)를 포함하는 경우, 하나 또는 그 이상의 유전자가 제거 또는 파괴될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 아미노산 잔기 또는 염기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가, 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 핵산이 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
용어 “모세포(parent cell)”는 유전적으로 조작된 세포를 수득할 수 있게 하는 특정 유전적 변형을 갖지 않는 세포를 지칭할 수 있다. 용어 “야생형(wild-type)” 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 수득할 수 있게 하는 특정 유전적 변형을 갖지 않는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 모세포는 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되도록, 유전적으로 조작되지 않은 것일 수 있다. 상기 모세포는 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작하는데 사용된 모균주 (parent strain)일 수 있다. 상기 모세포는 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되도록 하는 유전적 변형을 갖지 않는 세포일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 락테이트(lactate)는 젖산(lactic acid) 자체뿐만 아니라, 음이온 형태, 그의 염, 용매화물, 다형체 또는 그 조합을 포함하는 것으로 해석된다. 상기 염은 예를 들면 무기산염, 유기산염 또는 금속염일 수 있다. 무기산염은 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염 또는 이황산염일 수 있다. 유기산염은 포름산염, 초산염, 아세트산염, 프로피온산염, 젖산염, 옥살산염, 주석산염, 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염, 에디실염, 트리플루오로아세트산염, 벤조산염, 글루콘산염, 메탄술폰산염, 글리콜산염, 숙신산염, 4-톨루엔술폰산염, 갈룩투론산염, 엠본산염, 글루탐산염 또는 아스파르트산염일 수 있다. 금속염은 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염 또는 칼륨염일 수 있다.
일 양상은 모세포에 비하여 방사선 감수성 보완 키나아제(Radiation sensitivity Complementing Kinase)의 활성이 증가된, 내산성을 갖는 효모 세포를 제공한다.
방사선 감수성 보완 키나아제는 세린/트레오닌-프로테인 키나아제 (Serine/threonine-protein kinase)일 수 있다. 상기 키나아제는 EC 2.7.11.1에 속하는 효소일 수 있다. 방사선 감수성 보완 키나아제는 RCK1 또는 RCK2일 수 있다. 방사선 감수성 보완 키나아제는 서열번호 1 또는 2와 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 아미노산 서열 동일성 (identity)을 가진 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 일례로, RCK1 및 RCK2는 각각 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 방사선 감수성 보완 키나아제는 서열번호 1 또는 2와 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 3 및 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 일례로 rck1 및 rck2 유전자는 각각 서열번호 3 및 4의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포에 있어서, 내산성 (acid resistance)은 모세포에 비하여, 산성 조건에서 더 좋은 성장을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.5, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 생장할 수 있는 것일 수 있다.
또는 내산성은 모세포에 비하여, 산성 조건에서 더 높은 생존을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.5, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 생존할 수 있는 것일 수 있다.
또는 내산성은 모세포에 비하여, 산성 조건에서 더 좋은 대사 과정을 보이는 것일 수 있다. 상기 산성 조건은 유기산, 무기산 또는 그 조합을 포함하는 산성 조건일 수 있다. 상기 유기산은 C1 내지 C20을 갖는 유기산일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산, 젖산, 프로피온산, 3-히드록시프로피온산, 부티르산, 4-히드록시부티르산, 숙신산, 푸마르산, 말산, 옥살산, 아디프산, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 효모 세포는 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되지 않은 효모 세포에 비하여, pH 2.0 내지 7.0, 예를 들면, pH 2.0 내지 5.0, pH 2.0 내지 4.5, pH 2.0 내지 4.0, pH 2.0 내지 3.8, pH 2.5 내지 3.8, pH 3.0 내지 3.8, pH 2.0 내지 3.0, pH 2.0 내지 2.7, pH 2.0 내지 2.5, 또는 pH 2.5 내지 3.0의 범위에서 더 잘 대사할 수 있는 것일 수 있다. 이 때 "대사할 수 있는 (metabolizable)"의 정도는 세포당 영양분 흡수율, 예를 들면, 세포당 포도당 흡수율을 통해 측정될 수 있다. 또는 "대사할 수 있는 (metabolizable)"의 정도는 세포당 산물 배출율, 예를 들면 세포당 이산화탄소 배출율을 통해 측정될 수 있다.
상기 효모 세포는 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 쉬조사카로마이스세 (Shizosaccharomyces), 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속에 속하는 것일 수 있다. 사카로마이세스 속은 예를 들면, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae), 사카로마이세스 바야누스 (S. bayanus), 사카로마이세스 보울라디 (S. boulardii), 사카로마이세스 불데리 (S. bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스 (S. cariocanus), 사카로마이세스 카리오쿠스 (S. cariocus), 사카로마이세스 체발리에리 (S. chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스 (S. dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이데우스 (S. ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야뉴스 (S. eubayanus), 사카로마이세스 엑시거스 (S. exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스 (S. florentinus), 사카로마이세스 클루이베리 (S. kluyveri), 사카로마이세스 마티니에 (S. martiniae), 사카로마이세스 모나센시스 (S. monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스 (S. norbensis), 사카로마이세스 파라독서스 (S. paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누스 (S. pastorianus), 사카로마이세스 스펜서로룸 (S. spencerorum), 사카로마이세스 투리센시스 (S. turicensis), 사카로마이세스 우니스포루스 (S. unisporus), 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum), 또는 사카로마이세스 조나투스 (S. zonatus)일 수 있다.
상기 RCK1의 활성이 증가되는 것은, 상기 하나 이상을 코딩하는 유전자의 카피 수 증가 또는 상기 유전자의 발현 조절 서열의 변형에 의한 것일 수 있다. 상기 카피 수 증가는 상기 유전자의 세포 외부로부터 내부로의 도입 또는 내재적 유전자의 증폭에 의한 것일 수 있다.
상기 도입은 벡터와 같은 비히클을 매개하여 이루어질 수 있다. 상기 도입은 상기 유전자가 게놈에 통합되지 않은 임시적 (transient) 도입 또는 게놈에 삽입된 도입일 수 있다. 상기 도입은 예를 들면, 상기 유전자가 삽입된 벡터를 상기 세포로 도입한 후, 상기 벡터가 세포 내에서 복제되거나 상기 유전자가 게놈 내로 통합됨으로써 이루어질 수 있다. 상기 유전자는 그의 발현을 조절에 관련된 조절 서열과 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 조절 서열은 프로모터, 5'-비코딩 서열, 3'-비코딩 서열, 전자 종결자 서열, 인핸서, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 유전자는 내재적 유전자 또는 외인성 유전자일 수 있다. 또한, 상기 조절 서열은 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 모티프를 코딩하는 서열일 수 있다. 상기 모티프는 예를 들면, 이차 구조-안정화 모티프, RNA 불안정화 모티프, 스플라이스-활성화 모티프, 폴리아데닐화 모티프, 아데닌-풍부 서열(adenine-rich sequence), 또는 엔도뉴클레아제 인식 부위일 수 있다.
상기 RCK1의 활성이 증가되는 것은, 상기 하나 이상을 코딩하는 유전자의 돌연변이에 의한 것일 수 있다. 돌연변이는 하나 이상의 염기의 치환, 삽입, 부가, 또는 전환을 야기하는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 데히드로게나제 (LDH)일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제는 NAD(P)-의존성 효소일 수 있다. 또한 상기 락테이트 데히드로게나제는 스테레오-특이적 (specific)일 수 있으며, L-락테이트만 또는 D-락테이트만, 또는 L-락테이트와 D-락테이트 모두를 생산할 수 있다. 상기 NAD(P)-의존성 효소는 L-락테이트로 전환시키는 것인 EC 1.1.1.27, 또는 D-락테이트로 전환시키는 것인 EC 1.1.1.28로 분류되는 효소일 수 있다.
상기 락테이트 생산능을 갖는 효모 세포는 락테이트 데히드로게나제의 활성이 증가되어 있는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 적어도 하나의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 유전자는 외인성 (exogenous)일 수 있다. 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 박테리아, 효모, 진균, 포유동물 또는 파충류로부터 유래한 것을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 락토바실루스 헬베티쿠스 (Lactobacillus helveticus), L. 불가리쿠스 (L. bulgaricus), L. 존소니 (L. johnsonii), L. 플란타룸(L. plantarum), 일본자라 (Pelodiscus sinensis japonicus), 오리너구리 (Ornithorhynchus anatinus), 병코돌고래 (Tursiops truncatus), 노르웨이산집쥐 (Rattus norvegicus), 개구리 (Xenopus laevis), 및 보스 타우루스 (Bos taurus)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 LDH를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일본자라로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 오리너구리로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 병코돌고래로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 노르웨이산집쥐로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제, 및 보스 타우루스로부터 유래한 락테이트 데히드로게나제는 각각 서열번호 5, 6, 7, 8, 및 9의 아미노산 서열과 60% 이상, 또는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일례로, 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5, 6, 7, 8, 및 9의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또는 상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5, 6, 7, 8의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 서열번호 10 의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 11의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 벡터 내 포함될 수 있다. 상기 벡터는 복제개시점, 프로모터, 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 복제 개시점은 효모 자가복제 서열 (autonomous replication sequence, ARS)을 포함할 수 있다. 상기 효모 자가복제서열은 효모 동원체 서열 (centrometric sequence, CEN)에 의해 안정화될 수 있다. 상기 프로모터는 CYC (cytochrome c), TEF (transcription elongation factor), GPD, ADH, CCW12, 및 PGK 유전자의 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 있다. 상기 CYC (cytochrome c), TEF (transcription elongation factor), GPD, ADH, CCW12, 및 PGK 유전자의 프로모터는 각각 서열번호 38, 39, 40, 41, 42, 및 43의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 터미네이터는 PGK1 (phosphoglycerate kinase 1), CYC1 (cytochrome c 1), 및 GAL1 (galactokinase 1) 유전자의 터미네이터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. CYC1 터미네이터는 서열번호 44의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 벡터는 선별 마커를 더 포함할 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 효모 세포의 특정 위치에 게놈에 포함될 수 있다. 상기 특정 위치는 PDC, CYB2와 같이 제거 또는 파괴하고자 하는 유전자의 유전자좌 (locus)를 포함할 수 있다. 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 활성 단백질을 생산하기 위해 기능하는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 "기능성 (functional)"인 것으로 고려된다.
상기 효모 세포는 단일의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 2 내지 10 카피수의 복수의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포는 예를 들면 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3 카피의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 효모 세포가 복수의 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 각각의 폴리뉴클레오티드는 동일하거나 둘 이상의 상이한 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 조합일 수 있다. 외인성 락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 복수의 카피는 숙주 세포의 게놈 내에 동일한 유전자좌 (locus) 또는 여러 유전자좌에 포함될 수 있고, 각 카피의 프로모터나 터미네이터가 동일하거나 상이할 수 있다.
또한, 상기 효모 세포는 락테이트 생산능을 갖는 것일 수 있다. 상기 효모 세포는 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 방해하는 경로의 활성이 불활성화 또는 감소된 것일 수 있다. 또한 상기 효모 세포는 락테이트로의 대사 산물의 흐름을 촉진하거나 도와주는 경로의 활성이 증가된 것일 수 있다.
피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 미토콘드리아 피루베이트 전달체 (MPC), 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드, Fps1, 또는 그의 조합의 활성이 감소된 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 EC 4.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 예를 들면, 피루베이트 데카르복실라제 (pyruvate decarboxylase)일 수 있으며, PDC1일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 12의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 피루베이트로부터 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 12의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 13의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 pdc1일 수 있다.
상기 효모 세포는 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토크롬 c-의존성 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 D-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.4, 또는 L-락테이트에 작용하는 것인 EC 1.1.2.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 락테이트 시토크롬-c 옥시도리덕타제일 수 있고, CYB2 (CAA86721.1), CYB2A, CYB2B, 또는 DLD1 등일 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 12의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 14의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 15의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드는 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제일 수 있으며, NADH 또는 NADP의 NAD+ 또는 NADP+로의 산화를 이용하여 디히록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로의 환원을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC 1.1.1.8에 속하는 것일 수 있다. 상기 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제는 GPD1일 수 있다. 상기 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제는 서열번호 16의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 시토졸성 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 16의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 EC. 1.6.5.9 또는 EC. 1.6.5.3으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 유형 Ⅱ NADH:유비퀴논 옥시도리덕타제 (type Ⅱ NADH:ubiquinone oxidoreductase)일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 세포질 (cytoplasm)을 향하는 내부 (inner) 미토콘드리아막의 외부면에 위치한 것일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 시토졸 NADH (cytosolic NADH)의 NAD+로의 산화를 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 해당과정에 의해 형성된 시토졸 NADH의 재산화시키는 것일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 시토졸 NADH를 미토콘드리아 호흡 사슬 (mitochondrial respiratory chain)에 제공하는 것일 수 있다. 상기 NADH 데히드로게나제는 NDE1, NDE2, 또는 그의 조합일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제는 미토콘드리아 내부에 위치하여 작용하는 인터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 (internal mitochondral NADH dehydrogenase) NDI1과 구별되는 것일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제 서열번호 18 또는 19의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 일례로 NDE1 및 NDE2는 각각 서열번호 18 및 19의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 18 또는 19의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 20 또는 21의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 일례로, 상기 nde1 유전자는 서열번호 20, nde2 유전자는 서열번호 21의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 효모 세포는 미토콘드리아 피루베이트 전달체 (MPC)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 미토콘드리아 피루베이트 전달체 (MPC)는 미토콘드리아 내부 막에 존재하면서 세포질 내 피루베이트를 미토콘드리아로 이동시키는 역할을 하는 폴리펩티드일 수 있다. 미토콘드리아 피루베이트 전달체는 MPC 1, MPC2, MPC3, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일례로, 미토콘드리아 피루베이트 전달체는 서열번호 22, 23, 또는 24와 약 60% 이상, 또는 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 아미노산 서열 동일성 (identity)을 가진 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로 미토콘드리아 피루베이트 전달체는 서열번호 22, 23, 및 24와 95% 이상의 아미노산 서열 동일성 (identity)을 가진 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. MPC 1, MPC2, 및 MPC3는 각각 서열번호 22, 23, 및 24의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 미토콘드리아 피루베이트 전달체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 22, 23, 또는 24와 95% 이상의 아미노산 서열 동일성 (identity)을 가진 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일례로, 서열번호 25, 26, 또는 27의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 25, 26, 및 27은 각각 MPC1, MPC2, 및 MPC3를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 효모 세포는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드의 활성이 감소된 것일 수 있다. 상기 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드는 피루베이트의 옥살로아세테이트로의 마그네슘-ATP 의존성 카르복실화 및 비오틴(biotin) 의존성 카르복실화 반응을 촉매할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 하나의 ATP 소비에 의해 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC 6.4.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 사카로마이세스 속에서 2 개의 피루베이트 카르복실라제 동종효소 (pyruvate carboxylase isoenzyme)로, 예를들면 PYC1 및/또는 PYC2일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드는 서열번호 28 (GenBank ID: NP_011453.1) 및/또는 서열번호 29(GenBank ID: NP_009777.1)의 아미노산 서열과 약 50% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99%이상, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 2 개의 피루베이트 카르복실라제는 별개의 유전자에 의해 코딩될 수 있다. 상기 유전자는 각각 서열번호 30 (GI Number: 6321376) 및/또는 서열번호 31(GI Number: 63196950)의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 카르복실라제 (pyruvate carboxylase: PYC)를 코딩하는 pyc1 또는 pyc2일 수 있다. 상기 효모 세포는 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열이 변형 또는 변이를 갖는 것일 수 있다. 예를 들면, PYC1, PYC2, 또는 그의 조합의 유전자의 발현 조절 서열의 변형 또는 변이는 모균주의 프로모터인 PPYC1 및 PPYC2에 비하여 발현 수준이 낮은 프로모터로 교체하는 것일 수 있다. 상기 발현 수준이 낮은 프로모터는 예를 들면 LEUM 프로모터 (Pleum) 또는 cyc1 프로모터 (Pcyc1), 또는 그의 변이체일 수 있다. 반면에, 모균주의 프로모터인 PPYC1 및 PPYC2에 비하여 발현 수준이 낮은 프로모터는 예를 들면 TEF1, GPC 프로모터, 또는 GAL 프로모터일 수 있다.
상기 효모 세포는 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 아세트알데히드에서 에탄올로 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 EC. 1.1.1.1에 속하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 NADH로부터 NAD+로의 전환을 이용하여, 아세트알데히드에서 에탄올로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 알코올 데히드로게나제 (alcohol dehydrogenase; Adh)일 수 있으며, Adh4일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 32의 아미노산 서열과 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 서열번호 32의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 33의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 일례로 adh4일 수 있다.
상기 효모 세포는 Fps1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제거 또는 파괴된 것일 수 있다. 상기 Fps1은 아쿠아글리세로포린 (aquaglyceroporin)일 수 있다. 상기 Fps1은 글리세롤 채널 단백질(glycerol channel protein), 글리세롤 트랜스포트 폴리펩티드 (glycerol transport polypeptide), 글리세롤 촉진자 채널 (glycerol facilitator channel), 또는 글리세롤 흡수/유출 촉진자 단백질 (Glycerol uptake/efflux facilitator protein으로 지칭될 수 있다. 상기 Fps1을 통하여 글리세롤이 세포 외부로 분비될 수 있다. 상기 Fps1은 Transport Classification Database (M. Saier; U of CA, San Diego)에 의해 제공된 transporter classification system에서 TCDB 1.A.8.5.1로 분류될 수 있다. Fps1 단백질 (Fps1p)은 서열번호 34의 아미노산 서열과 60%이상, 또는 70%이상, 80%이상, 90%이상, 95%이상, 96%이상, 97%이상, 98%이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열을 가질 수 있다. Fps1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 34의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 35의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다
상기 효모 세포는 세포막 트랜스포터(plasma membrane transporter)의 활성이 증가된 것일 수 있다. 상기 세포막 트랜스포터는 세포막을 가로질러 유기 산물(organic product)의 이동을 촉진하는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 이러한 폴리펩티드의 일례는 카르복실산 트랜스포터를 포함할 수 있다. 상기 카르복실산 트랜스포터는 모노카복실레이트 퍼미아제(monocarboxylate permease)일 수 있다. 상기 카르복실산 트랜스포터는 일례로 Jen1일 수 있다. Jen1은 서열번호 36과 약 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 Jen1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 36의 아미노산 서열과 95%이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 37의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한 일례로 효모 세포는 모세포에 비하여 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되어 있고; 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 제거 또는 파괴되어 있고; 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 포함 또는 추가 도입되어 있는 효모 세포일 수 있다. 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다. 상기 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 또는 그 조합이 제거 또는 파괴되어 있고; 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 포함 또는 추가 도입되어 있는 효모 세포는 KCTC 12415 BP의 수탁번호를 갖는 것일 수 있다.
또한 일례로 효모 세포는 모세포에 비하여 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되어 있고; 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 미토콘드리아 피루베이트 전달체 (MPC), 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합이 제거 또는 파괴되어 있고; 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 포함 또는 추가 도입되어 있는 효모 세포일 수 있다. 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다.
또한 일례로 효모 세포는 모세포에 비하여 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되어 있고; 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 미토콘드리아 피루베이트 전달체 (MPC), 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드, Fps1, 또는 그 조합이 제거 또는 파괴되어 있고; 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 포함 또는 추가 도입되어 있는 효모 세포일 수 있다. 상기 효모 세포는 사카로마이세스 세레비지애일 수 있다.
다른 양상은 상기한 효모 세포를 포함하는, 락테이트를 생산하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 효모 세포에 관해서는 상술한 바와 같다.
다른 양상은 상기한 효모 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 락테이트를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 효모 세포에 관해서는 상술한 바와 같다.
상기 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 통상의 기술자라면 선택되는 미생물에 따라 배지 및 배양조건을 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 배양 방법은 예를 들면, 회분식, 연속식 및 유가식 배양을 포함할 수 있다. 상기 박테리아 세포는 상기한 바와 같다.
상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다.
상기 탄소원은, 예를 들면, 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배양은 예를 들면, 글루코스를 탄소원으로 하여 수행될 수 있다. 상기 질소원은, 예를 들면, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 (CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원, 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 배지는 인의 공급원으로서, 예를 들면, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 상응하는 소듐-함유 염, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 배지에 포함될 수 있다. 상기 배지 또는 개별 성분은 배양액에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 미생물 배양액에 적절한 방식으로 첨가하여 배양액의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다.
상기 세포는 호기, 미호기, 또는 혐기 조건에서 배양될 수 있다. 상기 미호기 조건은 대기 중 산소의 수준보다 낮은 수준의 산소가 배지 중으로 용해되는 배양 조건을 의미한다. 상기 낮은 수준의 산소는 예를 들면, 대기에 대한 포화 용존 산소 농도의 0.1% 내지 10%, 1% 내지 9%, 2% 내지 8%, 3% 내지 7%, 또는 4 내지 6%일 수 있다. 또한, 미호기 조건은 예를 들면, 배지 중의 용존 산소 농도가 0.9 ppm에서 3.6 ppm인 것일 수 있다. 배양 온도는 예를 들면, 20℃ 내지 45℃ 또는 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양 기간은 원하는 목적 락테이트가 원하는 만큼 얻어질 때까지 지속될 수 있다. 상기 락테이트를 생산하는 방법은 배양물로부터 락테이트를 회수 또는 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
배양물로부터의 락테이트의 회수는, 통상적으로 알려진 분리 및 정제방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 회수는 원심분리, 이온교환 크로마토그래피, 여과, 침전, 추출, 증류, 또 조합에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면 배양물을 원심분리하여 바이오매스를 제거하고, 얻어진 상등액을 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.
일 양상에 따른 효모 세포에 의하면, 내산성을 갖는 세포일 수 있다. 또한, 상기 효모 세포는 락테이트를 고농도 및 높은 수율로 생산할 수 있다.
일 양상에 따른 락테이트를 생산하는 방법에 의하면, 락테이트를 고농도 및 높은 수율로 생산할 수 있다.
도 1은 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다.
도 2는 pUC19-HIS3 벡터를 나타낸 도면이다.
도 3은 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3 벡터를 나타낸 도면이다.
도 4는 pUC19-Trp1-Pcyc1 벡터를 나타내는 도면이다.
도 5는 모균주 사카로마이세스 세레비지애에서 RCK1 프로모터 치환용 벡터가 삽입된 균주의 제작 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 P57 벡터를 나타내는 도면이다.
도 7은 p57-PTPI1 벡터를 나타내는 도면이다.
도 8은 p416-PGK-RCK1 벡터를 나타낸 도면이다.
도 9는 대조군 1과 실험군 1의 배양에 따른 젖산 및 글루코스의 농도를 나타낸 도면이다.
도 10은 대조군 2와 실험군 2의 배양에 따른 젖산 및 글루코스의 농도를 나타낸 도면이다.
도 11은 대조군 3과 실험군 3의 배양에 따른 젖산 및 글루코스의 농도를 나타낸 도면이다.
도 12는 대조군 1과 실험군 1의 배양에 따른 젖산 및 글루코스의 농도를 나타낸 도면이다.
도 13은 젖산 45 g/L가 포함되고 pH가 3.5로 조절된 YPD 산성 배지 위에서 대조군 3 및 실험군 3의 효모 세포를 배양한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 락테이트의 생산능이 향상된 효모 세포의 제작
(1) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh )의 제작
(1.1) pdc1 를 결실시키며 ldh 를 도입하기 위한 벡터의 제작
사카로마이세스 세레비지애 CEN . PK2 -1D에서 피루베이트로부터 아세트알데히드를 거쳐 에탄올로 가는 경로를 차단하기 위하여 피루베이트 데카르복실라제 1 (pyruvate decarboxylase1: pdc1)을 코딩하는 유전자를 제거하였다. pdc1 유전자를 제거하는 동시에 일본 자라 유래 Ldh를 발현시키기 위하여 pdc1 유전자를 'ldh 카세트'로 치환하여 pdc1 유전자를 결손시켰다. "카세트"란 달리 언급이 없으면, 프로모터, 코딩 서열, 및 터미네이터가 작동가능하게 연결된 단백질이 발현될 수 있는 단위 서열을 나타낸다.
구체적으로, 'ldh 카세트'를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 45 및 46의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 얻어진 CCW12 프로모터 서열 (서열번호 42)과 'ldh 유전자 (서열번호 10)'를 각각 SacI/XbaI과 BamHI/SalI로 소화하고, 동일 효소로 소화된 pRS416 vector (ATCC87521)에 연결하였다. pRS416 vector는 T7 프로모터, 박테리아에서 암피실린 저항성, 효모에서 URA3 카세트 (선택마커), 및 제한효소 클로닝 부위를 갖는 효모 센트로미어 셔틀 플라스미드 (yeast centromere shuttle plasmid)이다.
다음으로, 얻어진 벡터에 pCEP4 plasmid (invitrogen, Cat. no. V044-50)를 주형으로 하고 서열번호 47 및 48의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한 PCR하여 얻어진 증폭 산물 즉, 'HPH 카세트' 서열 (서열번호 49)을 SacI로 소화시키고, 동일한 효소로 소화된 상기 얻어진 벡터에 연결하여 'ldh 카세트'를 포함하는 벡터 p416-ldh-HPH를 제조하였다. pCEP4 plasmid는 다중클로닝 부위 (multiple cloning site)에 삽입된 재조합 유전자의 높은 수준의 전사를 위한 cytomegalovirus (CMV) immediate early enhance/promoter를 사용하는 에피좀성 포유동물 발현 벡터 (episomal mammalian expression vector)이다. pCEP4는 트란스펙션된 세포 (transfected cell)에서 안정된 선택을 위한 히그로마이신 B 저항성 유전자 (hygromycin B resistance gene)을 갖는다. 여기서 'ldh 카세트'는 ldh 유전자 및 그 조절 영역을 포함하고 있어, ldh 유전자가 발현될 수 있도록 하는 영역을 나타낸다. 상기 ldh 유전자는 CCW12 프로모터 하에서 전사되도록 하였다. 또한, 'HPH (hygromycin B phosphotransferase) 카세트'는 히그로마이신 B 저항성 유전자 (hygromycin B resistance gene) 및 그 조절 영역을 포함하고 있어, 히그로마이신 B 저항성 유전자가 발현될 수 있도록 하는 영역을 나타낸다.
pdc1의 결실용 벡터는 p416-ldh-HPH를 주형으로 하고 서열번호 50 및 51의 프라이머 세트를 프라이머로 한 PCR에 의하여 ldh 유전자 절편과 pUC57-Ura3HA 벡터 (DNA2.0 Inc.; 서열번호 52)를 각각 SacI로 소화시킨 후 서로 연결하여 pUC-uraHA-ldh를 제조하였다. 이 벡터로부터 pdc1의 결실용 카세트는 pdc1 유전자와 상동 서열을 갖는 서열번호 53 및 54의 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 증폭하였다. 상기 서열번호 53의 1 내지 41 및 서열번호 54의 1 내지 44는 사카로마이세스 세레비지애의 염색체의 상동 서열과 상동 재조합되어 pdc1 유전자와 치환될 부분을 의미한다.
(1.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ) 제조
(1.1)에서 제작한 pdc1 deletion용 카세트를 사카로마이세스 세레비지애 (CEN.PK2-1D, EUROSCARF accession number: 30000B)에 도입하였다. 상기 pdc1 결실용 카세트의 도입은 일반적인 열충격 형질전환(heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 pdc1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 세포에 대하여, pdc1의 결실을 확인하기 위하여 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 55 및 56의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 pdc1 유전자 결실 및 ldh 유전자 도입이 이루어진 것을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh)를 제조하였다.
(2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh )의 제작
(2.1) cyb2 를 결실시키기 위한 벡터의 제작
(1)에서 얻어진 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh)에서, 락테이트에서 피루베이트로 가는 경로를 차단하기 위하여 cyb2 유전자를 제거하였다.
구체적으로, (1.1)에서 제조된 pUC-uraHA-ldh를 주형으로 하고, 서열번호 57 및 58의 cyb2 상동 재조합 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 cyb2 결실용 카세트를 얻었다. 서열번호 57의 프라이머 중 1 내지 45 및 서열번호 58의 프라이머 중 1 내지 45는 사카로마이세스 세레비지애의 염색체에 상동 재조합되어 cyb2와 치환될 부분을 의미한다.
(2.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh )의 제조
(2.1)에서 제작한 cyb2 결실용 카세트를 상기 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 cyb2 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 cyb2의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 59 및 60의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 cyb2 유전자 결실된 것을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh)를 제조하였다.
(3) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh )의 제조
(3.1) gpd1 를 결실시키기 위한 벡터의 제작
(2)에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿcyb2::ldh)에서 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)에서 글리세롤-3-포스페이트로 가는 경로를 차단하기 위하여 글리세롤-3-포스페이트 데히드로게나제(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1, gpd1)을 코딩하는 유전자를 제거하였다.
구체적으로, (1.1)에서 제조된 pUC-uraHA-ldh를 주형으로 하고, 서열번호 61 및 62의 gpd1 상동 재조합 서열을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 gpd1 결실용 카세트를 얻었다. 서열번호 61의 프라이머 중 1 내지 50 및 서열번호 62의 프라이머 중 1 내지 50는 사카로마이세스 세레비지애의 염색체에 상동 재조합되어 gpd1과 치환될 부분을 의미한다.
(3.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh )의 제조
(3.1)에서 제작한 gpd1 결실용 카세트를 (2)에서 제조한 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 gdp1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 gpd1의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 63 및 64의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 gpd1 유전자 결실을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh)를 제조하였다.
S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh)는 2013.5.30일자로 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 KCTC (Korean Collection for Type Cultures)에 수탁번호 KCTC12415BP로 기탁하였다.
(4) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh , ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿnde1, ㅿ nde2 )의 제조
(4.1) nde1 을 결실시키기 위한 벡터의 제작
Nde1 유전자 결실용 카세트를 제작하기 위하여, 실시예 1.1에서 제작된 pUC-uraHA-ldh를 주형으로 하고 서열번호 65및 66의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 nde1 유전자 결실용 카세트를 제작하였다.
(4.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh ,ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿnde1) 균주의 제조
(4.1)에서 제작한 nde1 유전자 결실용 카세트를 (3)에서 제조한 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 nde1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다. 그 결과 얻어진 균주에 대하여 nde1의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 67 및 68의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 nde1 유전자 결실을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1)를 제조하였다.
(4.3) nde2 를 결실시키기 위한 벡터의 제작
nde2 유전자 결실용 카세트를 제작하기 위하여, 실시예 1.1에서 제작된 pUC-uraHA-ldh를 주형으로 하고 서열번호 69 및 70의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 nde2 유전자 결실용 카세트를 제작하였다.
(4.4) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh ,ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿnde1, ㅿ nde2 ) 균주의 제조
(4.3)에서 제작한 nde2 유전자 결실용 카세트를 (4.2)에서 제조한 S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh,ㅿnde1)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 nde2 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 nde1의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 71 및 72의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 nde2 유전자 결실을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh, ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1, ㅿnde2)를 제조하였다.
(5) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿnde1,ㅿ nde2 , ㅿ mpc1 ,ㅿ mpc2 )의 제조
(5.1) mpc1 을 결실시키기 위한 벡터의 제작
mpc1 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실시키기 위하여 실시예 1.1의 pUC57-Ura3HA를 주형으로 하고, 서열번호 73 및 74의 프라이머 (mpc1_del_F, mpc1_del_R)를 사용하여 PCR을 수행하여 mpc1 유전자 결실용 카세트를 제작하였다.
(5.2) mpc1 이 결실된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제조
(5.1)에서 제작한 mpc1 결실용 카세트를 상기 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh, ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1, ㅿnde2)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 mpc1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 mpc1의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 75 및 76의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 mpc1 유전자 결실을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh,ㅿnde1,ㅿnde2,ㅿmpc1)를 제조하였다.
(5.3) mpc2 를 결실시키기 위한 벡터의 제작
mpc2 유전자를 상동성 재조합 방법으로 결실시키기 위하여 실시예 1.1의 pUC57-Ura3HA를 주형으로 하고, 서열번호 77 및 78의 프라이머 (mpc2_del_F, mpc2_del_R)를 사용하여 PCR을 수행하여 mpc2 유전자 결실용 카세트를 제작하였다.
(5.4) mpc1 및 mpc2 가 결실된 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제조
(5.3)에서 제작한 mpc2 결실용 카세트를 상기 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh, ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1, ㅿnde2, ㅿmpc1)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 mpc2 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 mpc2의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 79 및 80의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 mpc2 유전자 결실을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh,ㅿnde1,ㅿnde2,ㅿmpc1,ㅿmpc2)를 제조하였다.
(6) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿnde1,ㅿ nde2 , ㅿ mpc1 ,ㅿ mpc2 , ldh +)의 제조
(6.1) 보스 타우루스 유래의 LDH 과발현 벡터 제조
보스 타우루스 유래의 L-ldh 과발현을 위해, 실시예 1.1에서 얻어진 CCW12 프로모터 서열(서열번호 42)을 SacI과 XbaI으로 절단하고 이를 SacI과 XbaI으로 GPD 프로모터를 절단한 p416-GPD (ATCC® 87360™)에 도입하여 p416-CCW12p을 제작하였다.
그 후, 보스 타우루스 (Bos taurus) 유래의 L-ldh (서열번호 10)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 81 및 82의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 제작된 p416-CCW12p를 BamHI 과 SalI으로 절단하고 이를 리게이션하여 p416-CCW12p-LDH을 제작하였다. 도 1은 p416-CCW12p-LDH 벡터를 나타낸 도면이다.
이를 위하여 제작된 상기의 p416-CCW12p-LDH를 주형으로 하고, 서열번호 83 및 84의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 다음, 얻어진 PCR 절편과 기 제작된 pUC19-HIS3 (Appl Environ Microbiol. 2002 May;68(5):2095-100, 도 2) 벡터를 SacI으로 절단하고 이를 라이게이션하여 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3 (도 3)를 제작하였다. 상기 pUC19-CCW12p-LDH-HIS3를 주형으로 하고 하기 서열번호 85 및 86의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 TRP1 위치에 삽입하기 위한 카세트를 제작하였다. 상기 보스 타우루스 유래의 L-ldh를 포함하는 발현 카세트는 TRP1의 유전좌에 삽입될 수 있고, 이 경우 TRP1 유전자가 결실되면서 L-ldh가 삽입될 수 있다.
(6.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿn d e1,ㅿ nde2 , ㅿ mpc1 ,ㅿ mpc2 , ldh +)의 제조
(6.1)에서 제작한 보스 타우루스 유래의 L-ldh를 포함하는 발현 카세트를 (5)에서 제조한 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1,ㅿnde2, ㅿmpc1,ㅿmpc2)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 히스티딘 (his) 무첨가 최소 고체배지 (YSD, 6.7 g/L yeast nitrogen base without amino acids, 1.4 g/L Amino acid dropout mix (-his)) 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 trp1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 trp1의 결실 및 L-ldh의 도입을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 87 및 88의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 trp1의 결실 및 L-ldh의 도입을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1,ㅿnde2, ㅿmpc1, ㅿmpc2, ldh+)를 제조하였다.
(7) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿnde1ㅿ nde2 , ㅿ mpc1 ㅿ mpc2 , ldh +, P cyc1 PYC1 )의 제조
pyc1의 활성이 감소된 균주를 제조하기 위해 pyc1의 프로모터(Ppyc1)를 상기 프로모터에 비하여 발현 수준이 낮은 프로모터로 교체하기 위해 다음과 같이 실시하였다. 프로모터에 비하여 발현 수준이 낮은 프로모터의 일 예로 CYC1 프로모터 (Pcyc1), LEUM 프로모터 (Pleum), 또는 그의 조합을 이용하였다.
(7.1) P cyc1 단편의 준비 및 재조합 벡터의 제작
CYC1 프로모터(Pcyc1) (서열번호 89)를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해, Qiagen(사)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 사카로마이세스 세레비지애 야생주인 CEN.PK2-1D의 염색체 DNA(gDNA)를 추출하고, 상기 gDNA를 주형으로 PCR HL premix kit(BIONEER사 제품, 이하 동일함)를 사용하여 "PCR을 수행하였다. Pcyc1를 증폭시키기 위한 PCR은 서열번호 90 및 91의 프라이머를 사용하여 얻어진 PCR 결과물을 EcoRI으로 절단하여 DNA 단편(이하, "Pcyc1 카세트"이라 명명)을 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 용리(鎔離)하여 수득하였다. pUC19-Trp1 벡터 (Appl Environ Microbiol. 2002 May;68(5):2095-100) 플라스미드 및 수득한 Pcyc1 카세트를 제한효소 EcoRI으로 처리하고 라이게이션(ligation)시켜서 pUC19-Trp1-Pcyc1 벡터를 제작하였다. 도 4는 pUC19-Trp1-Pcyc1 벡터를 나타내는 도면이다. pyc1 프로모터(Ppyc1)를 상동성 재조합 방법으로 cyc1 프로모터(Pcyc1)로 교체시키기 위하여 상기 pUC19-TRP1-Pcyc1을 이용하였다. 상기 pUC19-TRP1-Pcyc1를 주형으로 하고 서열번호 92 및 93의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 Ppyc1을 Pcyc1로 교체할 카세트를 제작하였다.
(7.2) Ppyc1 을 Pcyc1 로 교체한 균주의 제작
(7.1)에서 제작한 Pcyc1 삽입용 카세트를 (6)에서 제조한 S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1,ㅿnde2, ㅿmpc1, ㅿmpc2, ldh+)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 pyc1 프로모터(Ppyc1) ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 pyc1 프로모터(Ppyc1)의 결실 및 cyc1 프로모터(Pcyc1)의 도입을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 94 및 95의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 pyc1 프로모터(Ppyc1)의 결실 및 cyc1 프로모터(Pcyc1)의 도입을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh, ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1,ㅿnde2, ㅿmpc1, ㅿmpc2, ldh+, Pcyc1PYC1)를 제조하였다.
(8) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿnde1,ㅿ nde2 , ㅿ mpc1 ,ㅿ mpc2 , ldh +, P cyc1 PYC1 ,ㅿ adh4 :: P ccw12 JEN1 )의 제조
(8.1) Jen1 의 과발현을 위한 벡터의 제작
Jen1 유전자의 과발현을 위해서, 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D 균주의 게놈 DNA로부터 Jen1의 코딩 부위를 BamHI과 XhoI로 소화시킨 후, BamHI과 XhoI로 소화된 p416-CCW12p 벡터에 연결하여 pRS416-Jen1-CCW12p 벡터를 제조하였다. 상기 벡터에서 Jen1 유전자는 CCW12 프로모터 하에서 전사된다. pRS416-Jen1-CCW12p를 주형으로 한 PCR에 의하여 얻은 Jen1 유전자 절편과 pUC57-Ura3HA 벡터 (서열번호 35)를 각각 SacI로 소화시킨 후 서로 연결하여 pUC-uraHA-Jen1를 제조하였다. 상기 pUC-uraHA-Jen1를 주형으로 한 PCR에 의하여 Jen1 삽입용 카세트를 얻었다.
(8.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿn d e1,ㅿ nde2 , ㅿ mpc1 ,ㅿ mpc2 , ldh +, P cyc1 PYC1 ,ㅿ adh4 :: P ccw12 JEN1 )의 제조
(8.1)에서 제작한 Jen1 삽입용 카세트를 (7)에서 제조한 S. cerevisiae CEN.PK2-1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1,ㅿnde2, ㅿmpc1,ㅿmpc2, ldh+, Pcyc1PYC1)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 adh4 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다. 그 결과, 형질전환된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿnde1,ㅿnde2,, ㅿmpc1,ㅿmpc2, ldh+, Pcyc1PYC1, ㅿadh4::Pccw12JEN1)를 제조하였다.
(9) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿnde1,ㅿ nde2 , ㅿ mpc1 ,ㅿ mpc2 , ldh +, P cyc1 PYC1 ,ㅿ adh4 :: P ccw12 JEN1 ,ㅿ FPS1 )의 제조
(9.1) FPS1 를 결실하기 위한 벡터의 제작
fps1 유전자를 상동성 재조합 방법으로 제거시키기 위하여, 도면 5의 pUC57-ura3HA를 주형으로 하고 하기 서열번호 96 및 97의 프라이머 (fps1_del_F, fps1_del_R)를 사용하여 PCR을 수행하여 fps1 유전자 제거카세트를 제작하였다.
(9.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿn d e1,ㅿ nde2 , ㅿ mpc1 ,ㅿ mpc2 , ldh +, P cyc1 PYC1 ,ㅿ adh4 :: P ccw12 JEN1 ,ㅿ FPS1 )의 제조
(9.1)에서 제작한 fps1 결실용 카세트를 상기 S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1,ㅿnde2, ㅿmpc1,ㅿmpc2, ldh+, Pcyc1PYC1,ㅿadh4::Pccw12JEN1)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 fps1 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여 fps1의 결실을 확인하기 위하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 98 및 99의 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 cyb2 유전자 결실된 것을 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1,ㅿnde2, ㅿmpc1,ㅿmpc2, ldh+, Pcyc1PYC1,ㅿadh4::Pccw12JEN1,ㅿFPS1)를 제조하였다.
실시예 2: RCK1 유전자가 과발현된 사카로마이에스 세레비지애의 제조
(1) RCK1 의 과발현을 위한 벡터의 제작
(1.1) RCK1 의 프로모터를 교체하기 위한 벡터의 제작
RCK1 유전자의 과발현을 위해서 사카로마이세스 세레비지애 CEN.PK2-1D Δpdc1::ldh Δcyb2::ldhΔgpd1::ldh (KCTC 12415BP)의 RCK1 유전자 프로모터(PRCK11)를 발현 수준이 높은 TPI1 유전자 프로모터(PTPI1)로 교체하기 위해 다음과 같이 실시하였다. 도 5는 모균주 사카로마이세스 세레비지애에서 RCK1 프로모터 치환용 벡터가 삽입된 균주의 제작 과정을 나타낸 것이다.
TPI1 유전자 프로모터(PTPI1) (서열번호 100)를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위해, Qiagen(사)의 Genomic-tip 시스템을 이용하여 사카로마이세스 세레비지애 야생주인 CEN.PK2-1D의 염색체 DNA(gDNA)를 추출하고, 상기 gDNA를 주형으로 PCR HL premix kit(BIONEER사 제품, 이하 동일함)를 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 약칭함)을 수행하였다.
PTPI1을 증폭시키기 위한 PCR은 서열번호 101 및 102의 프라이머를 사용하여 94℃에서 30초의 변성(denaturation), 52℃에서 30초의 어닐링(annealing), 및 72℃에서 30초의 신장(elongation)으로 이루어진 사이클을 30회 반복 수행하였다. 상기 PCR 결과물을 EcoRI으로 절단하여 DNA 단편(이하, "PTPI1 카세트"라 명명)을 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후 용리(鎔離)하여 수득하였다. P57 벡터(GenScript)(서열번호 103) 및 수득한 PTPI1 카세트를 제한효소 EcoRI로 처리하고 라이게이션(ligation)시켜서 p57-PTPI1 벡터(서열번호 104)를 제작하였다. 도 6은 P57 벡터를 나타내는 도면이다. 도 7은 p57-PTPI1 벡터를 나타내는 도면이다.
RCK1 프로모터(PRCK11)를 상동성 재조합 방법으로 PTPI1 프로모터(PTPI1)로 교체시키기 위하여 상기 p57-PTPI1 벡터를 이용하였다. 상기 p57-PTPI1 벡터를 주형으로 하고 서열번호 105 및 106의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여 PRCK1을 PTPI1으로 교체할 카세트를 제작하였다.
(1.2) RCK1 유전자를 도입하기 벡터의 제작
RCK1 카세트를 포함하는 벡터를 제조하기 위하여, 사카로마이세스 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 107 및 108의 프라이머쌍을 프라이머로 사용한 PCR에 의하여 얻어진 RCK1 ORF 서열과 PGK 프로모터(서열번호 43)를 각각 SacI/XbaI과 BamHI/SalI로 소화하고, 동일 효소로 소화된 pRS416 vector (ATCC87521)에 연결하여, p416-PGK-RCK1 벡터를 수득하였다. 도 8은 p416-PGK-RCK1 벡터를 나타낸 도면이다.
(2) RCK1 의 과발현을 위한 균주의 제조
(2.1) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ P RCK1 :: P TPI1 )의 제조
실시예 2.1.1에서 제작된 교체 카세트를 실시예 1의 (3.2)에서 제조한 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 RCK1의 프로모터 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 109 및 110의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 PRCK1의 PTPI1로의 교체를 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh, ㅿPRCK1::PTPI1)를 수득하였다.
(2.2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿn d e1,ㅿ nde2 , ㅿ mpc1 ,ㅿ mpc2 , ldh +, P cyc1 PYC1 ,ㅿ adh4 :: P ccw12 JEN1 , RCK1 +)의 제조
실시예 2.1.2에서 제작된 p416-PGK-RCK1 벡터를 실시예 1의 (8)에서 제조한 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh,ㅿnde1,ㅿnde2,, ㅿmpc1,ㅿmpc2,ldh+, Pcyc1PYC1,ㅿadh4::Pccw12JEN1)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양 하였다. 그 결과, 형질 전환된 CEN . PK2 -1D(ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1,ㅿnde2, ㅿmpc1,ㅿmpc2, ldh+, Pcyc1PYC1, ㅿadh4::Pccw12JEN1, RCK1+)를 수득하였다.
(2.3) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿn d e1,ㅿ nde2 , ㅿ mpc1 ,ㅿ mpc2 , ldh +, P cyc1 PYC1 ,ㅿ adh4 :: P ccw12 JEN1 ,ㅿ P RCK1 :: P TPI1 , ㅿFPS1, ㅿ P RCK1 :: P TPI1 )의 제조
실시예 2.1.1에서 제작된 교체 카세트를 실시예 1의 (9)에서 제조한 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1,ㅿnde2, ㅿmpc1,ㅿmpc2, ldh+, Pcyc1PYC1,ㅿadh4::Pccw12JEN1, ㅿFPS1)에 도입하였다. 도입은 일반적인 열충격 형질전환 (heat shock transformation)에 의하여 수행되었으며, 형질도입 후 uracil drop out 배지에서 세포를 배양하여 염색체 (chromosome) 상의 RCK1의 프로모터 ORF가 상기 카세트로 치환되도록 하였다.
그 결과 얻어진 균주에 대하여, 상기 세포의 게놈을 주형으로 하고 서열번호 109 및 110의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 수득된 PCR 산물을 전기영동을 실시하여 PRCK1의 PTPI1로의 교체를 확인하였다. 그 결과, S. cerevisiae CEN.PK2-1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1,ㅿnde2, ㅿmpc1,ㅿmpc2, ldh+, Pcyc1PYC1, ㅿadh4::Pccw12JEN1, ㅿFPS1, ㅿPRCK1::PTPI1)를 수득하였다.
실시예 3. RCK1 유전자가 과발현된 균주를 이용한 락테이트 생산
(1) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh ,ㅿ gpd1 :: ldh ) 균주와 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh ,ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ P RCK1 :: P TPI1 ) 균주의 락테이트 생산 평가
실시예 1의 (3)에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh) 균주 (이하 '대조군 1'이라 함) 실시예 2의 (2.1)에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh, ㅿPRCK1::PTPI1) 균주 (이하 '실험군 1'이라 함)를 9% 글루코스, 1% 효모 추출물, 2% Bacto-peptone을 포함한 25 ml YPD 액체 배지에 접종하여 혐기 조건으로 30℃에서 약 90 rpm으로 교반하면서 40시간 동안 배양하였다. 배양 초기에 세포의 OD600에서 측정한 OD값은 1이었다. 배양 도중 플라스크로부터 주기적으로 배양물을 채취하여, OD600 값, 젖산, 글루코스, 및 에탄올의 농도를 측정하였다. 배양 중 세포 성장은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 OD600 값을 측정하였다. 글루코스 및 젖산 농도는 HPLC (High performance liquid chromatography)를 이용하여 분석하였다.
도 9는 대조군 1과 실험군 1의 배양에 따른 젖산 및 글루코스의 농도를 나타낸 도면이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, RCK1이 과발현된 실험군 1의 균주가 대조군 1의 균주에 비하여 젖산 생산량이 더 높음을 알 수 있다.
또한 표 1은 대조군 1과 실험군 1의 40 시간 동안 배양 후 젖산 및 소비된 글루코스의 농도를 나타낸 것이다. RCK1이 과발현된 실험군 1의 균주가 대조군 1의 균주에 비하여 젖산 생산 및 수율이 높음을 알 수 있다.
균주명 OD 600 글루코스
소비 (g/L) 		LA
(g/L) 		에탄올
(g/L) 		수율
(%)
대조군 1 10.5 84.52±4.90 34.14±1.95 23.28±1. 58 40.39
실험군 1 9.6 84.15±4.70 36.61±2.04 23.10±1.17 43.50
(2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ nde1 ,ㅿnde2, ㅿ mpc1 ,ㅿ mpc2 , ldh +, P cyc1 PYC1 ,ㅿ adh4 :: P ccw12 JEN1 ) 균주와 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ nde1 ,ㅿ nde2 , ㅿm p c1,ㅿ mpc2 , ldh +, P cyc1 PYC1 ,ㅿ adh4 :: P ccw12 JEN1 , RCK1 +) 균주의 락테이트 생산능 평가
실시예 1의 (8)에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1,ㅿnde2, ㅿmpc1,ㅿmpc2, ldh+, Pcyc1PYC1,ㅿadh4::Pccw12JEN1) 균주 (이하 '대조군 2'라 함) 및 실시예 2의 (2.2)에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1,ㅿnde2, ㅿmpc1,ㅿmpc2, ldh+, Pcyc1PYC1,ㅿadh4::Pccw12JEN1, RCK1+) 균주 (이하 '실험군 2'라 함) 각각을 8% 글루코스, Yeast Nitrogen Base 13.4 g/L, Yeast Synthetic Dropour without Uracil 을 포함한 25 ml의 2 X YSD/NB 액체 배지에 접종하여 혐기 조건으로 30℃에서 약 90 rpm으로 교반하면서 40시간 동안 배양하였다. 배양 초기에 세포의 OD600에서 측정한 OD값은 1이었다. 배양 도중 플라스크로부터 주기적으로 배양물을 채취하여, OD600 값, 젖산, 글루코스, 및 에탄올의 농도를 측정하였다. 배양 중 세포 성장은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 OD600 값을 측정하였다. 글루코스 및 젖산 농도는 HPLC를 이용하여 분석하였다.
도 10은 대조군 2와 실험군 2의 배양에 따른 젖산 및 글루코스의 농도를 나타낸 도면이다. 도 10에 나타낸 바와 같이, RCK1이 과발현된 실험군 2의 균주가 대조군 2의 균주에 비하여 젖산 생산량 및 글루코스 소비가 더 높음을 알 수 있다.
또한 표 2는 대조군 2와 실험군 2의 40 시간 동안 배양 후 젖산 및 소비된 글루코스의 농도를 나타낸 것이다. RCK1이 과발현된 실험군 2의 균주가 대조군 2의 균주에 비하여 세포 성장, 글루코스 소비, 및 젖산 생산이 높음을 알 수 있다.
균주명 OD 600 글루코스
소비 (g/L) 		LA
(g/L) 		에탄올
(g/L) 		수율
(%)
대조군 2 7.65 65.8±1.5 33.9±0.6 13.2±0.48 51.52
실험군 2 8.18 72.5±0.5 37±0.35 16.1±0.31 50.97
(3) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿnde1,ㅿ nde2 , ㅿ mpc1 ,ㅿ mpc2 , ldh +, P cyc1 PYC1 ,ㅿ adh4 :: P ccw12 JEN1 ,ㅿ FPS1 ) 균주와 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ nde1 ,ㅿ nde2 , ㅿm p c1,ㅿ mpc2 , ldh +, P cyc1 PYC1 ,ㅿ adh4 :: P ccw12 JEN1 ,ㅿ FPS1 ,ㅿ P RCK1 :: P TPI1 ) 균주의 락테이트 생산능 평가
실시예 1의 (9)에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh, ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1,ㅿnde2, ㅿmpc1,ㅿmpc2, ldh+, Pcyc1PYC1, ㅿadh4::Pccw12JEN1, ㅿFPS1) 균주 (이하 '대조군 3'이라 함) 및 실시예 2의 (2.3)에서 제조된 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿpdc1::ldh,ㅿcyb2::ldh,ㅿgpd1::ldh, ㅿnde1,ㅿnde2, ㅿmpc1,ㅿmpc2, ldh+, Pcyc1PYC1, ㅿadh4::Pccw12JEN1, ㅿFPS1, ㅿPRCK1::PTPI1) 균주 (이하 '실험군 3'이라 함) 각각을 12% 글루코스, 1% 효모 추출물, 2% Bacto-peptone을 포함한 25 ml YPD 액체 배지에 접종하여 혐기 조건으로 30℃에서 약 90 rpm으로 교반하면서 40시간 동안 배양하였다. 배양 초기에 세포의 OD600에서 측정한 OD값은 1이었다. 배양 후 24시간에 3%의 글루코스를 더 첨가하였다. 배양 도중 플라스크로부터 주기적으로 배양물을 채취하여, OD600 값, 젖산, 글루코스, 및 에탄올의 농도를 측정하였다. 배양 중 세포 성장은 분광계 (spectrophotometer)를 이용하여 OD600 값을 측정하였다. 글루코스 및 젖산 농도는 HPLC를 이용하여 분석하였다.
도 11은 대조군 3과 실험군 3의 배양에 따른 젖산 및 글루코스의 농도를 나타낸 도면이다. 도 11에 나타낸 바와 같이, RCK1이 과발현된 실험군 3의 균주가 대조군 3의 균주에 비하여 젖산 생산량이 더 높음을 알 수 있다.
또한 표 3은 대조군 3과 실험군 3의 48 시간 동안 배양 후 젖산 및 글루코스의 농도를 나타낸 것이다. RCK1이 과발현된 실험군 3의 균주가 대조군 3의 균주에 비하여 글루코스 소비, 젖산 생산 및 수율이 높음을 알 수 있다. RCK1이 과발현된 실험군 3의 균주는 RCK1이 과발현되지 않은 대조군 3에 비하여, 젖산 생산량이 약 16.9% 향상되었다.
균주명 OD 600 글루코스
소비 (g/L) 		LA
(g/L) 		에탄올
(g/L) 		수율
(%)
대조군 3 10.0 90.7±1.50 33.6±0.90 19.3±0.09 37.05
실험군 3 9.4 93.9±1.50 39.3±1.00 22.4±0.65 41.80
실시예 4. RCK1 유전자가 과발현된 균주를 이용한 내산성 측정
본 실시예에서는 효모 세포에 RCK1 유전자를 과발현시키고, 그 과발현이 효모 세포의 내산성에 미치는 영향을 확인하였다.
(1) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh ,ㅿ gpd1 :: ldh ) 균주와 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh ,ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ P RCK1 :: P TPI1 ) 균주의 내산성 평가
상술한 대조군 1의 균주 및 상술한 실험군 2의 균주 각각을 8% 글루코스, 1% 효모 추출물, 2% Bacto-peptone을 포함한 YPD 배지에 접종하고, 혐기 조건으로 30℃에서 약 90 rpm으로 교반하면서 총 40시간 동안 배양하였다. 이때, 상기 YPD 배지에 pH 2.95의 2.5 % 젖산을 첨가하였다. 배양 초기에 세포의 OD600 nm에서 측정한 OD값은 1 이었다. 배양 도중 플라스크로부터 주기적으로 배양물을 채취하여, OD값, 젖산 및 글루코스의 농도를 측정하였다.
도 12는 대조군 1과 실험군 1의 배양에 따른 젖산 및 글루코스의 농도를 나타낸 도면이다. 도 12에 나타낸 바와 같이, RCK1이 과발현된 균주가 대조군인 KCTC 12415BP 균주에 비하여 젖산 생산량이 더 높음을 알 수 있다. 이는 pH 2.95의 젖산이 포함된 경우 대조군에 비하여 더욱 젖산 생산량이 높은 것으로 보아, RCK1이 과발현된 균주가 약 pH 2.95의 산 및 젖산에 대한 내성이 있는 것을 알 수 있다.
또한 표 4는 대조군 1과 실험군 1의 균주의 40 시간 배양 후 젖산 및 글루코스의 농도를 나타낸 것이다. RCK1이 과발현된 실험군 1의 균주가 대조군1의 균주에 비하여 젖산 생산 및 수율이 높음을 알 수 있다.
균주명 OD 600 글루코스
소비 (g/L) 		LA
(g/L) 		수율
(%)
대조군 1 5.2±0.0 41.0±1.0 7.7±0.5 18.68
실험군 1 5.1±0.0 40.3±0.2 9.8±0.4 23.34
(2) S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿnde1,ㅿ nde2 , ㅿ mpc1 ,ㅿ mpc2 , ldh +, P cyc1 PYC1 ,ㅿ adh4 :: P ccw12 JEN1 ,ㅿ FPS1 ) 균주와 S. cerevisiae CEN . PK2 -1D (ㅿ pdc1 :: ldh ,ㅿ cyb2 :: ldh , ㅿ gpd1 :: ldh , ㅿ nde1 ,ㅿ nde2 , ㅿm p c1,ㅿ mpc2 , ldh +, P cyc1 PYC1 ,ㅿ adh4 :: P ccw12 JEN1 ,ㅿ FPS1 ) 균주의 내산성 평가
실시예 1에서 제조된 대조군 3, 및 실시예 2에서 제조된 실험군 3의 균주 각각을 YPD 고체배지에 도말하여 30℃에서 48시간 이상 배양한 후 20 g/L 포도당을 포함한 2 ml YPD 액체 배지에 접종하고, 호기 조건으로 30℃에서 약 230 rpm으로 교반하면서 총 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포 농도를 600 nm에서의 흡광도를 이용하여 측정한 후, 희석을 통해 각 10 마리, 102 마리, 103 마리, 및 104 마리가 포함된 멸균수 10 uL를 젖산이 함유된 배지에 접정하여 효모 세포의 생존 및 성장을 확인하였다.
도 13은 젖산 45 g/L가 포함되고 pH가 3.5로 조절된 YPD 산성 배지 위에서 대조군 3 및 실험군 3의 효모 세포를 배양한 결과이다. 도 13에 나타낸 바와 같이, RCK1이 과발현된 실험군 3의 균주의 경우, 젖산을 함유하는 pH 3.5의 산성 배지에서 대조군 3보다 잘 성장하였다.
따라서, RCK1 유전자가 과발현된 효모 균주는 산성이 강하게 되면 될수록 대조군에 비하여 더 많이 성장하는 특성, 즉 산성에 대한 내성을 예기치 않게 가지고 있는 것이다. 또한, 내산성의 효과는 효모가 생산하는 유기산과 무관하게 산성에 대한 내성이 있음을 알 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC12415BP 20130530
<110> Samsung Electronics Co. Ltd. <120> Genetically engineered and acid resistant yeast cell with ehanced radiation sensitivity complementing kinase activity and method for producing lactate using the same <130> PN105502 <160> 110 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 512 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 Met Ser Val Asn Pro Glu Phe Ile Ala Asp Gly Ile Asp Phe Tyr Pro 1 5 10 15 Thr Thr Pro Asp Ala Ala Tyr Phe Asn Ala Ala Asp Gly Lys Asn Lys 20 25 30 Val Asn Arg Ile Asn Gly Asn Ser Glu Asn Leu His His Ser Phe Ala 35 40 45 Ser Gly Cys Arg Arg Ser Ser Leu Ser Val Asp Phe Asn Val Thr Ser 50 55 60 Ser Asp Ser Glu Lys Ser Glu Gln Ser Cys Leu Glu Asn Asn Ser Gln 65 70 75 80 Glu Asp Glu Tyr Phe Cys Asp Ile Phe Ser Thr Glu Leu Lys Leu Asp 85 90 95 Glu Thr Ser Asn Lys Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Ser Asn His Gln Tyr 100 105 110 Pro Glu Gln Leu Glu Leu His Asn Tyr Lys Leu Leu Asn Lys Ile Gly 115 120 125 Glu Gly Ala Phe Ser Arg Val Phe Lys Ala Val Gly Ile Asn Thr Asp 130 135 140 Asp Gln Ala Pro Val Ala Ile Lys Ala Ile Ile Lys Lys Gly Ile Ser 145 150 155 160 Ser Asp Ala Ile Leu Lys Gly Asn Asp Arg Ile Gln Gly Ser Ser Arg 165 170 175 Lys Lys Val Leu Asn Glu Val Ala Ile His Lys Leu Val Ser Lys Asn 180 185 190 Asn Pro His Cys Thr Lys Phe Ile Ala Phe Gln Glu Ser Ala Asn Tyr 195 200 205 Tyr Tyr Leu Val Thr Glu Leu Val Thr Gly Gly Glu Ile Phe Asp Arg 210 215 220 Ile Val Gln Leu Thr Cys Phe Ser Glu Asp Leu Ala Arg His Val Ile 225 230 235 240 Thr Gln Val Ala Ile Ala Ile Lys His Met His Tyr Met Gly Ile Val 245 250 255 His Arg Asp Val Lys Pro Glu Asn Leu Leu Phe Glu Pro Ile Pro Phe 260 265 270 Tyr Gly Leu Asp Gly Asp Met Gln Lys Glu Asp Glu Phe Thr Leu Gly 275 280 285 Val Gly Gly Gly Gly Ile Gly Leu Val Lys Leu Met Asp Phe Gly Leu 290 295 300 Ala Lys Lys Leu Arg Asn Asn Thr Ala Lys Thr Pro Cys Gly Thr Ile 305 310 315 320 Glu Tyr Val Ala Ser Glu Val Phe Thr Ser Lys Arg Tyr Ser Met Lys 325 330 335 Val Asp Met Trp Ser Ile Gly Cys Val Leu Phe Thr Leu Leu Cys Gly 340 345 350 Tyr Pro Pro Phe Tyr Glu Lys Asn Glu Lys Thr Leu Leu Lys Lys Ile 355 360 365 Ser Arg Gly Asp Tyr Glu Phe Leu Ala Pro Trp Trp Asp Asn Ile Ser 370 375 380 Ser Gly Ala Lys Asn Ala Val Thr His Leu Leu Glu Val Asp Pro Asn 385 390 395 400 Lys Arg Tyr Asp Ile Asp Asp Phe Leu Asn Asp Pro Trp Leu Asn Ser 405 410 415 Tyr Asp Cys Leu Lys Asp Ser Asn Ser Asn Ser Tyr Ala Ser Val Gln 420 425 430 Ser Ile Leu Asn Asp Ser Phe Asp Glu Arg Ala Glu Thr Leu His Cys 435 440 445 Ala Leu Ser Cys Gln Ser Glu Lys Gln Asp Asp Thr Glu Phe Ser Arg 450 455 460 Ser Glu Ser Ser Glu Tyr Ile Phe Met Thr Glu Glu Asp Arg Asn Leu 465 470 475 480 Arg Gly Ser Trp Ile Gly Glu Pro Lys Glu Cys Phe Thr Leu Asp Leu 485 490 495 Ala Thr Ser Ser Ile Tyr Arg Arg Arg Lys Asn Lys Ile Phe Phe Trp 500 505 510 <210> 2 <211> 610 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Leu Lys Ile Lys Ala Leu Phe Ser Lys Lys Lys Pro Asp Gln Ala 1 5 10 15 Asp Leu Ser Gln Glu Ser Lys Lys Pro Phe Lys Gly Lys Thr Arg Ser 20 25 30 Ser Gly Thr Asn Asn Lys Asp Val Ser Gln Ile Thr Ser Ser Pro Lys 35 40 45 Lys Ser Phe Gln Asp Lys Asn Ile Val Gln Tyr Pro Ser Val Val Ala 50 55 60 Asp Asp His His Met Lys Ser Leu Thr Asp Glu Leu Val Thr Thr Ile 65 70 75 80 Asp Ser Asp Ser Ser Pro Ser Asp Asn Ile Thr Thr Glu Asn Val Glu 85 90 95 Thr Val Thr Ser Val Pro Ala Ile Asp Val His Glu Ser Ser Glu Gly 100 105 110 Gln Leu Ser Ser Asp Pro Leu Ile Ser Asp Glu Ser Leu Ser Glu Gln 115 120 125 Ser Glu Ile Ile Ser Asp Ile Gln Asp Asp Ser Thr Asp Asp Asp Asn 130 135 140 Met Glu Asp Glu Ile Pro Glu Lys Ser Phe Leu Glu Gln Lys Glu Leu 145 150 155 160 Ile Gly Tyr Lys Leu Ile Asn Lys Ile Gly Glu Gly Ala Phe Ser Lys 165 170 175 Val Phe Arg Ala Ile Pro Ala Lys Asn Ser Ser Asn Glu Phe Leu Thr 180 185 190 Lys Asn Tyr Lys Ala Val Ala Ile Lys Val Ile Lys Lys Ala Asp Leu 195 200 205 Ser Ser Ile Asn Gly Asp His Arg Lys Lys Asp Lys Gly Lys Asp Ser 210 215 220 Thr Lys Thr Ser Ser Arg Asp Gln Val Leu Lys Glu Val Ala Leu His 225 230 235 240 Lys Thr Val Ser Ala Gly Cys Ser Gln Ile Val Ala Phe Ile Asp Phe 245 250 255 Gln Glu Thr Asp Ser Tyr Tyr Tyr Ile Ile Gln Glu Leu Leu Thr Gly 260 265 270 Gly Glu Ile Phe Gly Glu Ile Val Arg Leu Thr Tyr Phe Ser Glu Asp 275 280 285 Leu Ser Arg His Val Ile Lys Gln Leu Ala Leu Ala Val Lys His Met 290 295 300 His Ser Leu Gly Val Val His Arg Asp Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu 305 310 315 320 Phe Glu Pro Ile Glu Phe Thr Arg Ser Ile Lys Pro Lys Leu Arg Lys 325 330 335 Ser Asp Asp Pro Gln Thr Lys Ala Asp Glu Gly Ile Phe Thr Pro Gly 340 345 350 Val Gly Gly Gly Gly Ile Gly Ile Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Leu 355 360 365 Ser Lys Gln Ile Phe Ser Lys Asn Thr Lys Thr Pro Cys Gly Thr Val 370 375 380 Gly Tyr Thr Ala Pro Glu Val Val Lys Asp Glu His Tyr Ser Met Lys 385 390 395 400 Val Asp Met Trp Gly Ile Gly Cys Val Leu Tyr Thr Met Leu Cys Gly 405 410 415 Phe Pro Pro Phe Tyr Asp Glu Lys Ile Asp Thr Leu Thr Glu Lys Ile 420 425 430 Ser Arg Gly Glu Tyr Thr Phe Leu Lys Pro Trp Trp Asp Glu Ile Ser 435 440 445 Ala Gly Ala Lys Asn Ala Val Ala Lys Leu Leu Glu Leu Glu Pro Ser 450 455 460 Lys Arg Tyr Asp Ile Asp Gln Phe Leu Asp Asp Pro Trp Leu Asn Thr 465 470 475 480 Phe Asp Cys Leu Pro Lys Glu Gly Glu Ser Ser Gln Lys Lys Ala Gly 485 490 495 Thr Ser Glu Arg Arg His Pro His Lys Lys Gln Phe Gln Leu Phe Gln 500 505 510 Arg Asp Ser Ser Leu Leu Phe Ser Pro Ala Ala Val Ala Met Arg Asp 515 520 525 Ala Phe Asp Ile Gly Asn Ala Val Lys Arg Thr Glu Glu Asp Arg Met 530 535 540 Gly Thr Arg Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Glu Asp Glu Glu Leu Glu 545 550 555 560 Asp Ser Tyr Ser Gly Ala Gln Gly Asp Glu Gln Leu Glu Gln Asn Met 565 570 575 Phe Gln Leu Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ile Leu Gln Arg Arg Lys Lys 580 585 590 Val Gln Glu Asn Asp Val Gly Pro Thr Ile Pro Ile Ser Ala Thr Ile 595 600 605 Arg Glu 610 <210> 3 <211> 1539 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 atgtcagtaa acccagaatt tatagccgat ggcatcgatt tttatccaac aacgcccgat 60 gccgcgtatt tcaatgccgc tgatggtaaa aataaagtta acaggataaa tggtaactca 120 gaaaatttac accactcctt tgcatcgggt tgccgtagat catctctttc agtcgacttt 180 aatgttacct 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cacgttattg tgtggatatc ctccgtttta cgaaaagaac 1080 gaaaaaacat tattgaagaa aatatcgaga ggagattacg aattcttggc gccatggtgg 1140 gacaacataa gttctggcgc taagaacgca gttacccatc ttttggaggt tgacccaaac 1200 aagagatacg atatcgatga cttcctaaat gatccttggt taaattcgta cgattgtttg 1260 aaggattcaa actcaaattc ttatgccagc gtgcaaagca tactaaatga ttcattcgat 1320 gagagagcag agaccctaca ttgtgcatta agctgccaat ctgaaaaaca agatgacacc 1380 gagttttcca gaagtgaaag ctcggaatac atatttatga cggaagaaga cagaaaccta 1440 cggggcagtt ggatcggtga gccaaaagag tgttttacct tagaccttgc aacatcttct 1500 atataccgaa gaaggaagaa caagatattc ttctggtaa 1539 <210> 4 <211> 1833 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 atgcttaaaa taaaggccct tttctcgaaa aagaaaccgg atcaggcaga tttgtctcag 60 gaatctaaaa aaccattcaa gggtaagacc aggtcaagcg gtacaaataa caaagatgtt 120 tcccagatta cttcttcccc taagaaaagc tttcaggaca aaaatatagt tcagtacccg 180 agtgttgtcg cagatgacca tcatatgaag tctttaaccg atgaattagt aaccacgata 240 gactcggact cttcaccgag tgataatatt accacggaaa atgtggaaac 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Val Val Gly Val Gly Ala Val Gly 20 25 30 Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Met Lys Asp Leu Ala Asp Glu Leu 35 40 45 Ala Leu Val Asp Val Ile Glu Asp Lys Leu Arg Gly Glu Met Leu Asp 50 55 60 Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Arg Thr Pro Lys Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala His Ser Lys Leu Val Ile Ile Thr Ala 85 90 95 Gly Ala Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln Arg 100 105 110 Asn Val Asn Ile Phe Lys Phe Ile Ile Pro Asn Val Val Lys Tyr Ser 115 120 125 Pro Asp Cys Met Leu Leu Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu Thr 130 135 140 Tyr Val Ala Trp Lys Ile Ser Gly Phe Pro Lys His Arg Val Ile Gly 145 150 155 160 Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Gly Glu 165 170 175 Lys Leu Gly Ile His Ser Leu Ser Cys His Gly Trp Ile Ile Gly Glu 180 185 190 His Gly Asp Ser Ser Val Pro Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala Gly 195 200 205 Val Ser Leu Lys Ala Leu Tyr Pro Asp Leu Gly Thr Asp Ala Asp Lys 210 215 220 Glu His Trp Lys Glu Val His Lys Gln Val Val Asp Ser 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tgtcttgaaa 1500 gcgttatgtc taggtgctaa aggtgttggt ttgggtagac cattcttgta tgcgaactca 1560 tgctatggtc gtaatggtgt tgaaaaagcc attgaaattt taagagatga aattgaaatg 1620 tctatgagac tattaggtgt tactagcatt gcggaattga agcctgatct tttagatcta 1680 tcaacactaa aggcaagaac agttggagta ccaaacgacg tgctgtataa tgaagtttat 1740 gagggaccta ctttaacaga atttgaggat gcatga 1776 <210> 16 <211> 391 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 16 Met Ser Ala Ala Ala Asp Arg Leu Asn Leu Thr Ser Gly His Leu Asn 1 5 10 15 Ala Gly Arg Lys Arg Ser Ser Ser Ser Val Ser Leu Lys Ala Ala Glu 20 25 30 Lys Pro Phe Lys Val Thr Val Ile Gly Ser Gly Asn Trp Gly Thr Thr 35 40 45 Ile Ala Lys Val Val Ala Glu Asn Cys Lys Gly Tyr Pro Glu Val Phe 50 55 60 Ala Pro Ile Val Gln Met Trp Val Phe Glu Glu Glu Ile Asn Gly Glu 65 70 75 80 Lys Leu Thr Glu Ile Ile Asn Thr Arg His Gln Asn Val Lys Tyr Leu 85 90 95 Pro Gly Ile Thr Leu Pro Asp Asn Leu Val Ala Asn Pro Asp Leu Ile 100 105 110 Asp Ser Val Lys Asp Val Asp Ile Ile Val Phe Asn Ile Pro His Gln 115 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ggttacgtat acgacttaac gcgattccta 360 ccaaatcatc caggtgggca ggatgttatc aagtttaacg ccgggaaaga tgtcactgct 420 atttttgaac cactacatgc tcctaatgtc atcgataagt atatagctcc cgagaaaaaa 480 ttgggtcccc ttcaaggatc catgcctcct gaacttgtct gtcctcctta tgctcctggt 540 gaaactaagg aagatatcgc tagaaaagaa caactaaaat cgctgctacc tcctctagat 600 aatattatta acctttacga ctttgaatac ttggcctctc aaactttgac taaacaagcg 660 tgggcctact attcctccgg tgctaacgac gaagttactc acagagaaaa ccataatgct 720 tatcatagga tttttttcaa accaaagatc cttgtagatg tacgcaaagt agacatttca 780 actgacatgt tgggttctca tgtggatgtt cccttctacg tgtctgctac agctttgtgt 840 aaactgggaa accccttaga aggtgaaaaa gatgtcgcca gaggttgtgg ccaaggtgtg 900 acaaaagtcc cacaaatgat atctactttg gcttcatgtt cccctgagga aattattgaa 960 gcagcaccct ctgataaaca aattcaatgg taccaactat atgttaactc tgatagaaag 1020 atcactgatg atttggttaa aaatgtagaa aagctgggtg taaaggcatt atttgtcact 1080 gtggatgctc caagtttagg tcaaagagaa aaagatatga agctgaaatt ttccaataca 1140 aaggctggtc caaaagcgat gaagaaaact aatgtagaag 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aattaaggtc 600 aaatcttccg ctaagaataa cgactacgac ttggacttga aatacgacta tctggttgtc 660 ggtgtgggtg ctcaaccaaa cacttttggt actccgggag tttatgaata ttcttctttc 720 ttgaaggaaa tatccgacgc tcaagagatc agattaaaaa ttatgtccag tattgagaaa 780 gctgcctccc tatctccaaa agatcctgag agagcaagat tgttgagctt tgttgtcgtt 840 ggtggtggtc ccaccggtgt cgaatttgcc gctgaattga gagattatgt tgaccaggac 900 ttgagaaaat ggatgcccga attgagtaaa gaaattaaag tcactttggt ggaggctttg 960 ccaaacattt tgaacatgtt tgacaagtat ctcgttgact atgctcaaga tttattcaaa 1020 gaggaaaaaa tcgatttaag attgaaaaca atggttaaga aagttgacgc taccactata 1080 actgccaaaa ctggcgatgg tgacattgaa aatataccgt atggtgtatt agtttgggct 1140 acaggtaatg cgccaagaga agtgtctaag aacctaatga ctaaattaga ggaacaggac 1200 tcaagacgtg gtttgttgat agataacaaa cttcaacttt tgggtgctaa gggatctatt 1260 tttgctatcg gcgattgtac cttccaccct ggcttgttcc ctaccgctca agttgcccac 1320 caagaaggtg aatacttggc tcagtatttc aagaaagctt ataaaatcga tcaattgaac 1380 tggaaaatga cccatgctaa agacgattca gaagtcgcta gattaaagaa ccaaatagtc 1440 aaaacgcaat cgcaaattga agacttcaag tacaaccata agggtgctct ggcttatatt 1500 ggttcagata aagccattgc tgatcttgcc gttggtgaag ccaaatatag gttagccggc 1560 tcattcacct tcctattctg gaaatctgct tatttggcaa tgtgtctatc ctttagaaac 1620 agagttcttg tcgctatgga ttgggctaaa gtttatttct tgggtagaga ttcatctatc 1680 tag 1683 <210> 26 <211> 1638 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 26 atgctgccca gacttggttt tgcgaggact gctaggtcca tacaccgttt caagatgacc 60 cagatctcta aacctttttt ccattccact gaagttggta agcccggacc acagcagaag 120 ctatcgaaat cttacactgc ggtattcaag aaatggtttg tcagaggttt aaagttaacc 180 ttttacacga cgttggccgg cacattgtat gtgtcatacg agctgtacaa agaatcgaac 240 ccacccaaac aggttcccca atcgaccgct tttgctaatg gtttgaaaaa gaaggagctg 300 gttattttgg gtacaggctg gggcgccata tctcttttga agaaattaga cacgtctttg 360 tataacgtga ccgtggtgtc gccaagaagc ttctttttgt tcacaccgtt attaccctca 420 acgcctgtgg gtacgataga gatgaagtct attgtcgaac cggttagatc gatcgctaga 480 agaacgcctg gagaagttca ctacattgag gcggaagcgt tggacgttga tccaaaggcc 540 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cggtgatcat taaggccgcc 540 tttggtggtg gtggtagagg tatgagagtc gttagagaag gtgacgacgt ggcagatgcc 600 tttcaacgtg ctacctccga agcccgtact gccttcggta atggtacctg ctttgtggaa 660 agattcttgg acaagccaaa gcatattgaa gttcaattgt tggccgataa ccacggaaac 720 gtggttcatc ttttcgaaag agactgttcc gtgcagagaa gacaccaaaa ggttgtcgaa 780 gtggccccag caaagacttt accccgtgaa gtccgtgacg ccattttgac agatgcagtt 840 aaattggcca aagagtgtgg ctacagaaat gcgggtactg ctgaattctt ggttgataac 900 caaaatagac actatttcat tgaaattaat ccaagaatcc aagtggaaca taccatcaca 960 gaagaaatta ccggtataga tattgtggcg gctcagatcc aaattgcggc aggtgcctct 1020 ctaccccagc tgggcctatt ccaggacaaa attacgactc gtggctttgc cattcagtgc 1080 cgtattacca cggaagaccc tgctaagaac ttccaaccag ataccggtag aatagaagtg 1140 taccgttctg caggtggtaa tggtgttaga ctggatggtg gtaacgccta tgcaggaaca 1200 ataatctcac ctcattacga ctcaatgctg gtcaaatgct catgctccgg ttccacctac 1260 gaaatcgttc gtagaaaaat gattcgtgca ttaatcgagt tcagaattag aggtgtcaag 1320 accaacattc ccttcctatt gactcttttg accaatccag tatttattga 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tggtgattta 3060 tctgtattgc caacaagaag ctttttgtct ccactagaga ctgacgaaga aattgaagtt 3120 gtaatcgaac aaggtaaaac gctaattatc aagctacagg ctgtgggtga tttgaacaaa 3180 aagaccggtg aaagagaagt ttactttgat ttgaatggtg aaatgagaaa aattcgtgtt 3240 gctgacagat cacaaaaagt ggaaactgtt actaaatcca aagcagacat gcatgatcca 3300 ttacacattg gtgcaccaat ggcaggtgtc attgttgaag ttaaagttca taaaggatca 3360 ctaataaaga agggccaacc tgtagccgta ttaagcgcca tgaaaatgga aatgattata 3420 tcttctccat ccgatggaca agttaaagaa gtgtttgtct ctgatggtga aaatgtggac 3480 tcttctgatt tattagttct attagaagac caagttcctg ttgaaactaa ggcatga 3537 <210> 31 <211> 3543 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 31 atgagcagta gcaagaaatt ggccggtctt agggacaatt tcagtttgct cggcgaaaag 60 aataagatct tggtcgccaa tagaggtgaa attccgatta gaatttttag atctgctcat 120 gagctgtcta tgagaaccat cgccatatac tcccatgagg accgtctttc aatgcacagg 180 ttgaaggcgg acgaagcgta tgttatcggg gaggagggcc agtatacacc tgtgggtgct 240 tacttggcaa tggacgagat catcgaaatt gcaaagaagc ataaggtgga tttcatccat 300 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cacagtgtcg gccaacgtgc ttaacattga agatttttac 480 aaaaatgcag acgatgcgca taccatcccg gagtcacatt tatcgagaag gagaagtagg 540 tcgagggcta cgagtaatgc tgggcacagt gccaatacag gcgccacgaa tggcaggact 600 actggtgccc aaactaatat ggaaagcaat gaatcaccac gtaacgtccc cattatggtg 660 aagccaaaga cattatacca gaaccctcaa acacctacag tcttgccctc cacataccat 720 ccaattaata aatggtcttc cgtcaaaaac acttatttga aggaattttt agccgagttt 780 atgggaacaa tggttatgat tattttcggt agtgctgttg tttgtcaggt caatgttgct 840 gggaaaatac agcaggacaa tttcaacgtg gctttggata accttaacgt taccgggtct 900 tctgcagaaa cgatagacgc tatgaagagt ttaacatcct tggtttcatc cgttgcgggc 960 ggtacctttg atgatgtggc attgggctgg gctgctgccg tggtgatggg ctatttctgc 1020 gctggtggta gtgccatctc aggtgctcat ttgaatccgt ctattacatt agccaatttg 1080 gtgtatagag gttttcccct gaagaaagtt ccttattact ttgctggaca attgatcggt 1140 gccttcacag gcgctttgat cttgtttatt tggtacaaaa gggtgttaca agaggcatat 1200 agcgattggt ggatgaatga aagtgttgcg ggaatgtttt gcgtttttcc aaagccttat 1260 ctaagttcag gacggcaatt tttttccgaa tttttatgtg gagctatgtt acaagcagga 1320 acatttgcgc tgaccgatcc ttatacgtgt ttgtcctctg atgttttccc attgatgatg 1380 tttattttga ttttcattat caatgcttcc atggcttatc agacaggtac agcaatgaat 1440 ttggctcgtg atctgggccc acgtcttgca ctatatgcag ttggatttga tcataaaatg 1500 ctttgggtgc atcatcatca tttcttttgg gttcccatgg taggcccatt tattggtgcg 1560 ttaatggggg ggttggttta cgatgtctgt atttatcagg gtcatgaatc tccagtcaac 1620 tggtctttac cagtttataa ggaaatgatt atgagagcct ggtttagaag gcctggttgg 1680 aagaagagaa atagagcaag aagaacatcg gacctgagtg acttctcata caataacgat 1740 gatgatgagg aatttggaga aagaatggct cttcaaaaga caaagaccaa gtcatctatt 1800 tcagacaacg aaaatgaagc aggagaaaag aaagtgcaat ttaaatctgt tcagcgcggc 1860 aaaagaacgt ttggtggtat accaacaatt cttgaagaag aagattccat tgaaactgct 1920 tcgctaggtg cgacgacgac tgattctatt gggttatccg acacatcatc agaagattcg 1980 cattatggta atgctaagaa ggtaacatga 2010 <210> 36 <211> 616 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 36 Met Ser Ser Ser Ile Thr Asp Glu Lys Ile Ser Gly Glu Gln Gln Gln 1 5 10 15 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1500 tattattgtt ggaagaggac tatttgcaaa gggaagggat gctaaggtag agggtgaacg 1560 ttacagaaaa gcaggctggg aagcatattt gagaagatgc ggccagcaaa actaaaaaac 1620 tgtattataa gtaaatgcat gtatactaaa ctcacaaatt agagcttcaa tttaattata 1680 tcagttatta ccctatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 1740 tcaggaaatt gtagcggccg cgaatttgag cttatctttt acccatacga tgttcctgac 1800 tatgcgggct atccctatga cgtcccggac tatgcaggat cctatccata tgacgttcca 1860 gattacgcta ctagcggggg gcccggtgac gggcccgtcg actgcagagg cctgcatgca 1920 agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 1980 ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 2040 taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 2100 cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 2160 tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 2220 gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 2280 atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 2340 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cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 4140 tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 4200 gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 4260 aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 4320 acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 4380 ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 4440 tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 4500 aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 4560 catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 4620 atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 4680 aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag 4740 gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggt 4777 <210> 105 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 105 attgcatctt ggcttctagt ttttttatat tcaaaagggt tcttaagtgt agctatgacc 60 atgattacgc 70 <210> 106 <211> 73 <212> DNA 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Claims (20)

  1. 모세포에 비하여, 방사선 감수성 보완 키나아제 (Radiation sensitivity Complementing Kinase)의 활성이 증가된, 내산성을 갖는 효모 세포로서,
    락테이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고,
    추가로 피루베이트를 아세트알데히드로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 락테이트를 피루베이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 디히드록시아세톤 포스페이트 (DHAP)를 글리세롤-3-포스페이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 익스터널 미토콘드리아 NADH 데히드로게나제를 코딩하는 유전자, 미토콘드리아 피루베이트 전달체 (MPC)를 코딩하는 유전자, 피루베이트를 옥살로아세테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 아세트알데히드를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 Fps1를 코딩하는 유전자가 제거 또는 파괴된 변이를 갖는 것이고,
    추가로 모세포에 비하여 세포막 트랜스포터(plasma membrane transporter)의 활성이 증가된 것인, 내산성을 갖는 효모 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 방사선 감수성 보완 키나아제는 EC 2.7.11.1에 속하는 것인 효모 세포.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 방사선 감수성 보완 키나아제는 RCK1 또는 RCK2인 것인 효모 세포.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 방사선 감수성 보완 키나아제는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 효모 세포.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 방사선 감수성 보완 키나아제는 서열번호 3 또는 4의 폴리뉴클레오티드 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 것에 의하여 코딩되는 것인 효모 세포.
  6. 청구항 1에 있어서, 방사선 감수성 보완 키나아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가되어 있는 것인 효모 세포.
  7. 청구항 1에 있어서, 방사선 감수성 보완 키나아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입되어 있는 것인 효모 세포.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 방사선 감수성 보완 키나아제의 활성이 증가되는 것은 상기 방사선 감수성 보완 키나아제를 코딩하는 유전자의 카피 수 증가 또는 상기 방사선 감수성 보완 키나아제를 코딩하는 유전자의 발현 조절 서열의 변형에 의한 것인 효모 세포.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 카피 수 증가는 상기 유전자의 세포 외부로부터 내부로의 도입 또는 내재적 유전자의 증폭에 의한 것인 효모 세포.
  10. 청구항 1에 있어서, 사카로마이세스 (Saccharomyces), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 캔디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 이사첸키아 (Issatchenkia), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 쉬조사카로마이스세 (Shizosaccharomyces) 또는 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis) 속인 것인 효모 세포.
  11. 청구항 1에 있어서, 혐기 또는 미호기 조건에서 락테이트 생산능을 갖는 것인 효모 세포.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 청구항 1의 효모 세포를 포함하는, 락테이트를 생산하는데 사용하기 위한 조성물.
  18. 청구항 1의 효모 세포를 배양하는 단계를 포함하는 락테이트를 생산하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 배양물로부터 락테이트를 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 18에 있어서, 상기 배양은 pH 2 내지 7의 범위에서 수행되는 것인 방법.
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