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KR102210455B1 - 자연살해세포 활성 검출용 미세입자 및 이를 이용한 검출 방법 - Google Patents

자연살해세포 활성 검출용 미세입자 및 이를 이용한 검출 방법 Download PDF

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KR102210455B1
KR102210455B1 KR1020190024386A KR20190024386A KR102210455B1 KR 102210455 B1 KR102210455 B1 KR 102210455B1 KR 1020190024386 A KR1020190024386 A KR 1020190024386A KR 20190024386 A KR20190024386 A KR 20190024386A KR 102210455 B1 KR102210455 B1 KR 102210455B1
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신예린
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Abstract

미세입자 복합체, 이를 포함하는 NK 세포 활성 진단용 키트, 이를 포함하는 NK 세포 활성 검출용 조성물, 및 이를 이용한 NK 세포 활성 측정 방법을 제공한다.

Description

자연살해세포 활성 검출용 미세입자 및 이를 이용한 검출 방법{Micro particle for measuring NK cell activity and method of using same}
NK 세포의 활성 검출용 미세입자 및 이를 이용한 NK 세포의 활성도를 검사하는 방법에 관한 것이다.
NK 세포(natural killer cell)는 선천적 면역 및 후천적(adaptive) 면역계에 중요한 세포독성 림프구의 한 종류이다. NK 세포는 바이러스 감염된 세포나 암세포에 반응하는데, 전형적으로 세포 표면에 MHC(major histocompatibility complex)의 이상 현상을 감지한다. 이러한 NK 세포는 퍼포린(perforin)을 분비해 감염 세포나 암세포의 세포막에 구멍을 내고, 여기에 그랜자임(granzyme)을 내어 이 세포들을 사멸시키는 세포독성을 갖는다. B 세포 림프종 및 많은 암환자의 경우 NK 세포의 수나 항암활성에 결함이 발견되고 있으며 NK 세포의 기능 이상은 이러한 암의 발생과 밀접한 관련을 가지고 있음이 알려져 있다(Annu. Rev. Immunol. 2013; 31:227-258).
NK 세포의 활성에는 다양한 활성화 및 저해성 수용체가 관여한다. 지배적이라 간주되는 수용체 중에는 면역 수용체 티로신-기반 활성 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM)-관련 신호전달 분자(예를 들어, FcR γ 사슬 또는 TCRζ 사슬)와 관련된 NKp46 및 신호전달 분자 DAP10와 관련된 수용체 NKG2D(EMBO J. 2004; 23:255.-9, Annu. Rev. Immunol. 2005; 23:225-74)에 관련한 것들이 있다. 공동자극성이라 간주되는 수용체로는, 2B4(CD244)와 같은 신호전달 림프구 활성 분자(signaling lymphocytic activation molecule: SLAM) 패밀리의 구성원들 뿐만아니라, DNAM-1(CD226), CD2, 및 NKp80(KLRF1 유전자 산물)과 같이 다양한 수용체를 포함한다.
상기 NK 세포 활성도를 측정하는 기존의 기술은 방사성 동위원소, 또는 형광표지 탐침(probe)을 이용한 등록특허 10-1926166 것으로서, 비용이나 시간면에서 임상적으로 적용하기에 부적합하므로, NK 세포의 활성도를 간편하고 신속하면서도 유의적으로 측정할 수 있는 방법이 다양한 면역 관련 질환의 조기 진단 및 예후 판단에 중요하게 인식되고 있다.
일 양상은 미세입자; 및 NK(Natural killer) 세포가 분비하는 세포독성 효소에 의해 절단되는 펩티드를 포함하는 미세입자 복합체를 제공하는 것이다.
다른 양상은 일 양상에 따른 복합체를 포함하는 NK 세포 활성 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일 양상에 따른 복합체를 포함하는 NK 세포 활성 관련 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
다른 양상은 일 양상에 따른 복합체를 포함하는, NK 세포 활성 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일 양상의 복합체를 개체의 혈액 샘플에 처리하는 단계를 포함하는 NK 세포 활성도를 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 일 양상의 복합체를 개체의 혈액 샘플에 처리하는 단계를 포함하는 NK 세포 활성 관련 질환에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 미세입자; 및 NK(Natural killer) 세포가 분비하는 세포독성 효소에 의해 절단되는 펩티드를 포함하는 미세입자 복합체를 제공한다.
일 구체예는 미세입자; NK 세포가 분비하는 세포독성 효소에 의해 절단되는 펩티드; 상기 펩티드에 연결된 제1 형광 모이어티; NK 세포를 활성화하는 물질; NK 세포가 분비하는 사이토카인과 결합하는 물질; 및 상기 펩티드, NK 세포를 활성화하는 물질, 또는 사이토카인과 결합하는 물질을 상기 미세입자와 연결하는 링커를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 미세입자는 비드(bead)인 것일 수 있다. 비드는 마이크로비드(microbead) 또는 나노비드(nanobead)일 수 있다. 구체적으로, 비드는 직경이 5 내지 500 nm, 바람직하게는 직경이 200 내지 500 nm의 범위에서 크기를 갖을 수 있다. 상기 비드는 라텍스 비드, 중합체 플라스틱 비드, 생체 적합성 중합체로 구성된 비드, 유리 비드, 실리카 비드 및 자성 비드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 자성 비드는 공지된 방법을 통해서 제조해서 사용하는 것도 가능하며, 상업적으로 구입해서 사용할 수 있으며, 일 예로 자성 비드는 자력에 반응하는 자성을 띤 입자로 이해될 수 있다. 상기 자성 입자의 직경은 특별히 제한되지 않으나, 직경이 작은 자성 나노 입자일 수 있고, 1 nm 내지 200 nm 일 수 있으며, 상기 자성 입자의 자성 물질은 자성 금속 또는 자성 금속 산화물인 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 자성 비드는 철족금속 원소, 희토류 원소, 화폐금속 원소, 아연족 원소, 알루미늄족원소, 알칼리토금속 원소 및 백금족 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 자성 금속은 철족금속 원소(Fe, Ni, Co), 희토류 원소(La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb, Lu), 화폐금속 원소(Cu, Ag, Au), 아연족 원소(Zn, Cd, Hg), 알루미늄족원소(Al, Ga, In, Tl), 알칼리토금속 원소(Ca, Sr, Ba, Ra) 및 백금족 원소(Pt, Pd 등)에서 하나 이상 선택된 금속 또는 이들의 합금으로 이루어지는 것일 수 있다. 일 구체예의 상기 자성 입자로의 종류는 예를 들면, Co, Mn, Fe, Ni, Gd, Mo, MM'2O4 및 MpOq로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 자성 입자가 알지네이트의 카르복실기와 상호작용하는 것을 방지하기 위해, 상기 자성 입자는 부동태화 된 것일 수 있으며, 예를 들면, 구연산염 이온에 의해 부동태화 된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "NK 세포" 또는 "자연살해세포(Natural Killer cells)"는 선천성 면역계의 주요 성분을 구성하는 세포독성 림프구로서, 대형과립림프구(large granular lymphocyte, LGL)로 정의되고 림프계 전구세포(common lymphoid progenitor, CLP) 생성 B 및 T 림프구로부터 분화된 제3의 세포를 구성한다. 상기 "자연살해세포" 또는 "NK 세포"는 임의의 조직 공급원(source)으로부터 유래된 추가적인 변형이 없는 자연살해세포를 포함하고, 성숙한 자연살해세포뿐 아니라, 자연살해 전구세포를 포함할 수 있다. 상기 자연살해세포는 인터페론 또는 대식세포-유래 사이토카인에 대한 반응으로 활성화되고, 자연살해 세포는 "활성화 수용체" 및 "억제성 수용체"로 표지되는, 세포의 세포 독성 활성을 제어하는 2가지 유형의 표면 수용체를 포함한다. 자연살해세포는 임의의 공급원, 예를 들어 태반 조직, 태반 관류액, 제대혈, 태반혈, 말초혈, 지라, 간 등으로부터의 조혈 세포, 예를 들어 조혈 줄기 또는 전구체로부터 생성될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "NK 세포를 활성화하는 물질"은 생체 내에 투여되어 자연살해세포의 활성, 예를 들면, 세포독성 활성을 증가시키거나, 활성화된 자연살해세포를 생성, 증가, 또는 증식시킬 수 있는 임의의 물질을 의미할 수 있다. 일 구체예에서 상기 NK 세포를 활성화하는 물질은 NK 세포의 활성과 관련한 인자 내지 물질을 자극하는 물질일 수 있다.
상기 용어 "인자"는 NK 세포의 활성화를 일으키는 모든 분자적 요소를 의미한다. 구체적으로, 상기 인자는 세포 내외의 수용체, 채널(channel), 및 특이적인 리간드와 결합할 수 있는 세포 내외의 어답터(adaptor), 단백질, 당단백질, 펩티드, 및 모티프를 포함할 수 있다.
상기 용어 "자극"은 인자에 작용하여 NK 세포 내외의 특정 신호전달을 일으키는 것을 의미한다. 상기 자극을 일으키는 방법은 상기 인자의 하나 이상에 대해 특이적인 항체, 그 단편, 또는 펩티드, 특이적으로 유도 또는 억제하는 조성물, 및 가역적 또는 비가역적인 작용제(agonist) 또는 길항제(antagonist)를 이용할 수도 있고, NK 세포를 자극할 수 있는 다양한 표적세포(예를 들어, K562, 721.221, 또는 특정 수용체자극 항체로 코팅된 P815)를 포함하는 배양물과 배양하는 것을 포함할 수 있다. 보다 상세하게, NK의 세포를 활성화하는 물질은 면역 사이토카인, NK 세포 활성화 수용체의 작용제, 또는 NK 세포 억제성 수용체의 길항제를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "사이토카인(Cytokine)"은 신체 내 방어 체계를 제어하고, 생체를 자극하는 신호 물질로서, 생리활성 조절 단백질을 의미할 수 있다. 사이토카인은 자가분비(autocrine), 파라크라인(paracrine) 작용을 통하여 다양한 세포에서 세포 활성화, 분화, 세포 이동, 노화, 사멸 유도 등 다양한 생물학적 활성을 조절한다. 상기 사이토카인은 예를 들어, INF(Interferon) 패밀리, IL(Interleukin) 패밀리, TNF(Tumor necrosis factors) 패밀리, 또는 이들의 조합일 수 있다. 더욱 상세하게는, 상기 사이토카인은 IL-2, IL-5, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다. 더욱 상세하게는, 상기 인터페론은 1형 인터페론(예를 들면, 인터페론-αa, 인터페론-β, 인터페론-κ, 인터페론-ω), 2형 인터페론(예를 들면, 인터페론-γ), 3형 인터페론 또는 이들의 조합일 수 있다. 또한, 상기 TNF는 TNF-α, TNF-β 또는 TNF-γ 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 면역 사이토카인은 사이토카인-항체 복합체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 인터루킨(예를 들면, IL-2)-항-인터루킨(예를 들면, anti-IL-2) 항체 복합체를 포함할 수 있다.
상기 NK 세포 활성화 수용체의 작용제는, 활성화 수용체에 결합하는 항체 또는 앱타머, BiKEs(Bispecific Killer Engagers) 또는 TriKEs(Trispecific Killer Engagers)를 포함할 수 있다.
상기 활성화 수용체에 결합하는 항체 또는 앱타머의 예시는, GITR에 대한 항체, OX40에 대한 항체, CD137에 대한 항체, CD27에 대한 항체, OX40 작용성 앱타머(angoistic aptamer), CD137 작용성 앱타머, NKG2D 리간드(예를 들면, 마우스에서의 MULT-1(murine UL16-binding protein-like-1) 또는 H60, 또는 사람에서의 MICA(MHC I-related chain A), MICB(MHC I-related chain B) 또는 ULBPs(unique long 16-binding proteins)), 또는 CD226 작용제를 포함할 수 있다.
상기 BiKE 또는 TriKEs는 2개의 단일쇄 가변 단편(scFvs)을 함유하고, 표적 세포 사멸을 중재하기 위해 표적 세포(예를 들어, 손상된 신경세포, 종양 세포 또는 감염된 세포) 및 자연살해세포 둘 다에 특이적으로 결합하는 시약이다(TriKES의 경우, 자연살해세포의 두 개의 표면 항원 또는 수용체에 결합한다).
이들은 자연살해세포를 이용하여 표적 세포(예를 들어, 손상된 신경세포, 종양 세포 또는 감염된 세포)를 공동 중재시키고, 이에 따라 자연살해세포 중재 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 유발하는데 사용된다. BiKE는 당업계에 공지된, 예를 들어 Gleanson, M. K., et al., Mol Cancer Ther, 11: 2674-2684(2012); Vallera, D. A., et al., Cancer Biother Radiopharm, 28: 274-282(2013); Wiernik, A., et al., Clin Cancer Res, 19: 3844-3855(2013); Reiners, K. S., et al., Mol Ther, 21: 895-903(2013); Singer, H., et al., J Immunother, 33: 599-608(2010); 또는 Gleason, M. K., et al., Blood, 123: 3016-3026(2014)에 기재된 바와 같은 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. BiKE의 1종의 scFv는 표적 세포(예를 들어, 손상된 신경세포, 종양 세포 또는 감염된 세포)의 표면 상의 항원에 특이적으로 결합하고, 다른 scFv는 자연살해세포 상의 수용체(예를 들어, CD16과 같은 Fc 수용체)에 특이적으로 결합한다. 일 구체예에 있어서, BiKE는 TAA 또는 RAE1(Retinoic Acid Early 1)에 특이적으로 결합하는 제1 scFv와 활성화 수용체, 예를 들면, CD16에 특이적으로 결합하는 제2 scFv를 포함한다.
상기 NK 세포 억제성 수용체의 길항제는, 억제성 수용체에 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함할 수 있다. NK 세포 억제성 수용체의 예시는, CTLA-4, PD-1, PD-L1, Tim-3, CD96, KIR, NKG2A, 또는 TIGIT(T-cell immunoglobulin and ITIM domain)를 포함할 수 있다. 따라서, NK 세포 활성화 물질은 상기 열거된 수용체에 대한 항체를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 NK 세포를 활성화하는 물질은 NKG2D, 2B4(CD244), DNAM-1(CD226), CD2, CD16, NKp30, NKp44, NKp46 및 NKp80으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인자 내지 물질을 자극하는 것일 수 있다. NK 세포의 활성에는 상기한 바와 같이, 다양한 활성화 및 저해성 수용체가 관여할 수 있는데, 주된 수용체 중에는 면역 수용체 티로신-기반 활성 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif : ITAM)-관련 신호전달 분자와 관련된 NKp46 및 신호전달 분자 DAP10와 관련된 수용체 NKG2D(EMBO J. 2004; 23:255.-9, Annu. Rev. Immunol. 2005; 23:225-74)에 관련한 것들이 있다. 공동자극성이라 간주되는 수용체로는, 2B4(CD244)와 같은 신호전달 림프구 활성 분자(signaling lymphocytic activation molecule: SLAM) 패밀리의 구성원들 뿐만아니라, DNAM-1(CD226), CD2, 및 NKp80(KLRF1 유전자 산물)과 같이 다양한 수용체를 포함할 수 있다. 즉, 상기 NK 세포를 활성화하는 물질은 ITAM-함유하는 신호전달 분자 분자(예를 들어, CD16, NKp46, NKp30 또는 NKp44 등), NKG2D, 2B4(CD244), DNAM-1(CD226), CD2 및 NKp80 중 선택된 하나 이상의 물질을 자극하는 것일 수 있다. Bryceson Y 등(Blood 2006;107:159-166) 및 Kim HS 등(Immunity 2010;32:175-186)에 의하면 NK 세포 활성화는 상기 나열된 물질의 다양한 조합에 대한 자극에 의해 가능할 수 있으며, 상기 물질의 조합의 예로는 2B4 및 DNAM-1, DNAM-1 및 NKG2D, 2B4 및 NKG2D, 또는 2B4, DNAM-1 및 NKG2D가 있을 수 있다.
일 구체예에서, 상기 NK 세포가 분비하는 세포독성 효소는 퍼포린(perforin), 그랜자임 A(granzyme A), 그랜자임 B, 그랜자임 H, 그랜자임 K 및 그랜자임 M으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있다. NK 세포의 활성도을 측정하는 것은 탈과립화(degranulation) 및 세포독성(cytotoxicity) 활성, 및 NK 세포 자극에 의해 분비된 사이토카인의 측정 중 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 탈과립화 활성 및 세포독성 활성은 예를 들어, 퍼포린(perforin) 또는 그랜자임(granzyme) 분비로 표적 세포의 용해를 유도하는 것을 의미할 수 있고, 이를 유세포법를 이용해 분석할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 절단되는 펩티드는 2 내지 20개의 아미노산으로 이루어져 있고, '아이소류신-글라이신-아스파라진-아르기닌(IGNR, 서열번호 1)', '아이소류신-글루탐산-프롤린-아스파르산(IEPD, 서열번호 2)', '프롤린-트레오닌-세린-티로신(PTSY, 서열번호 3)', '티로신-아르기닌-페닐알라닌-라이신(YRFK, 서열번호 4)', '라이신-발린-프롤린-류신(KVPL, 서열번호 5)', '발린-글라이신(VG, 서열번호 6), '페닐알라닌-글라이신-아르기닌(FGR, 서열번호 7)', '글라이신-프롤린-아스파르산(GPD, 서열번호 8)', ‘글라이신-글루탐산(GE, 서열번호 9)’, '프롤린-아스파르산-페닐알라닌-글라이신(PDFG, 서열번호 10)' 또는 ‘발린-글라이신-프롤린-아스파르산-페닐알라닌-글라이신-아르기닌(VGPDFGR, 서열번호 11)을 포함하는 펩타이드일 수 있다.
따라서, 일 실시예에 따르면, 일 양상에 따른 미세입자 복합체는 개체의 혈액 또는 시료 중 NK 세포를 활성화시키고, 이에 따라 NK 세포로부터 효소 및 사이토카인들을 분비시킬 수 있다. 이에 따라 분비된 효소들의 활성에 의해 미세입자 복합체 내부에 포함되어 있는 펩티드가 절단됨에 따라, NK 세포의 활성 및 이의 검출이 가능할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "형광성 모이어티(fluorescent moiety)"는 상기 절단가능한 펩티드로부터 분리됨에 따라 특정 주파수의 광(예컨대, UV 광)을 흡수하여 형광 시그널을 발생시키는 형광 분자 또는 이의 유도체 또는 컨쥬게이트를 의미할 수 있다. 예를 들면, 상기 형광성 모이어티는 쿠마린 및 이와 관련된 염료; 플루오레세인, 로돌, 및 로다민 같은 크산텐(xanthene) 염료; 레소루핀; 시아닌 염료; 바이메인 염료(bimanes); 아크리딘; 이소인돌; 단실(dansyl) 염료; 루미놀 및 이소루미놀 유도체 같은 아미노프탈성 히드라지드(aminophthalic hydrazides); 아미노프탈 이미드; 아미노나프탈이미드; 아미노벤조퓨란; 아미노퀴놀린; 디시아노히드로퀴논; BODIPY; 및 유로퓸 및 터븀 복합체 및 이와 관련된 화합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 형광성 모이어티는 자유 카르복실기, 에스테르(예컨대, N-하이드로숙신이미드(NHS) 에스테르) 또는 말레이미드 유도체를 추가적으로 포함할 수 있으며, 또한 스트렙타비딘, 바이오틴, 팔로이딘, 아민, 아자이드 또는 이오도아세트아미드 컨쥬게이트를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 제1 형광 모이어티는 플루오레신(fluorescein), 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민 6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민 110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6- 카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린(Oregon Green) 500, 오레곤 그린(Oregon Green) 514, 알렉사 플로어(Alexa Fluor) 350, 알렉사 플로어 430, 알렉사 플로어 488, 알렉사 플로어 532, 알렉사 플로어 546, 알렉사 플로어 568, 알렉사 플로어 594, 알렉사 플로어 633, 알렉사 플로어 647, 알렉사 플로어 660, 알렉사 플로어 680, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY) FL, 보디피 FL-Br2, 보디피 530/550, 보디피 558/568, 보디피 564/570, 보디피 576/589, 보디피 581/591, 보디피 630/650, 보디피 650/665, 보디피 R6G, 보디피 TMR 및 보디피 TR로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 제1 형광 모이어티 부분 이외에도, 미세입자의 표면 자체에 상기 형광 모이어티의 물질이 코팅될 수 있다. 이는 일 양상에 따른 상기 미세입자 복합체를 통해 NK 세포의 활성을 보다 확실하게 구별하기 위한 목적에서 코팅되는 것일 수 있다. 형광 모이어티가 부착된 펩티드가 NK 세포로부터 분비된 효소에 의해 절단되면, 형광 강도가 변하게 됨에 따라 처리전 미세입자와의 비교를 통해 NK 세포의 활성도를 육안으로도 검출할 수 있다.
상기 NK 세포가 분비하는 사이토카인과 결합하는 물질은 IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, TNF-β RANTES, IL-8 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것과 결합하는 항체, 펩티드 또는 앱타머(aptamer)인 것일 수 있다. 상기와 같은 NK 세포로부터 분비 내지 발현된 사이토카인에 대한 분석은 FACS, 세포 내 사이토카인 염색 또는 ELISA 등을 이용하여 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 용어 "링커"는, 미세입자에 NK 세포를 활성화하는 물질이나, 상기 절단되는 펩티트 및 사이토카인과 같은 물질을 부착시키기 위한, 또는 상기 각각의 물질들을 연결시키기 위한 물질을 의미할 수 있다. 상기 링커는 고정화 화합물일 수 있다. 상기 고정화 화합물은 상기 물질에 부착될 수 있는 관능기를 포함할 수 있다. 상기 관능기는 예를 들면, 티올기 또는 술프히드릴기를 포함하는 황-함유기일 수 있다. 상기 관능기는 알코올 및/또는 페놀의 유도체로서 산소 자리에 황이 포함된 RSH의 식을 가지는 화합물일 수 있다. 또한, 상기 관능기는 각각 RSSR' 또는 RSR'의 식을 가지는 티올 에스테르(thiol ester) 또는 다이티올 에스테르(dithiol ester)일 수 있다. 또한, 상기 관능기는 아미노기(-NH2)일 수 있다. 구체적으로, 일 구체예에 있어서 상기 링커는 비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 탄수화물, 폴리 L-리신, 티올기, 아민기, 알코올기, 카르복실기, 아미노기, 설퍼기, 알데히드기, 카르보닐기, 숙신이미드기, 말레이미드기, 에폭시기, 이소티오시아네이트기를 갖는 화합물 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나인 것일 수 있다. 아미노기를 갖는 화합물의 예에는, 3-아미노프로필트리메톡시실란, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란(EDA), 트리메톡시실릴프로필디에틸렌트리아민(DETA), 3-(2-아미노에틸아미노프로필) 트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란가 포함될 수 있고, 알데히드기를 갖는 화합물에는 글루타르알데히드가 포함될 수 있다. 티올기를 갖는 화합물의 예에는 4-메르캅토프로필트리메톡시실란(MPTS)가 포함될 수 있다. 또한, 에폭시기를 갖는 화합물의 예에는, 3-글리시드옥시프로필트리메톡시실란, 이소티오시아네이트기를 갖는 화합물의 예에는, 4-페닐렌디이소티오시아네이트(PDITC), 숙신이미드 및 말레이미드기를 갖는 화합물의 예에는, 디숙신이미딜 카르보네이트(DSC) 또는 숙신이미딜 4-(말레이미드페닐) 부틸레이트(SMPB)가 포함될 수 있다.
상기 링커는 각 물질의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 연결될 수 있다. 상기 링커를 통한 결합 방법은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 상기 링커는 펩티드 링커일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 당업계에 공지된 다양한 링커를 이용할 수 있으며, 예를 들어, 복수의 아미노산으로 이루어진 링커일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 링커는 예를 들어, 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 상기 펩티드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩티드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다.
또한, 일 구체예에서 상기 링커는 고분자 화합물을 더 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 고분자 화합물은 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리프로필렌옥사이드(PPO), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)(polyNIPAM), 폴리푸마레이트, 폴리오르가노포스파젠, 폴리아크릴산(polyAAc), 폴리아크릴설포네이트, 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PolyHEMA) 및 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 복합체의 절단되는 펩티드 N- 말단에는 고분자 화합물, C- 말단에는 제1 형광 모이어티가 결합된 것일 수 있다.
다른 양상은 일 양상에 따른 복합체를 포함하는 NK 세포 활성 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 NK 세포가 분비하는 사이토카인을 검출하는 물질을 더 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 사이토카인을 검출하는 물질은 제2 형광 모이어티가 추가적으로 결합된 것일 수 있다. 사이토카인을 검출하는 물질은 상기 NK 세포가 분비하는 사이토카인을 추적하는 물질로서, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, TNF-β RANTES, IL-8 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것과 결합하는 항체, 펩티드 또는 앱타머(aptamer)인 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 키트는 NK 세포의 세포독성과 사이토카인의 분비를 동시에 검출하는 것일 수 있다. 상기 키트에 포함된 미세입자 복합체는 NK 세포를 활성시킬 수 있고, 이에 따라 NK 세포는 그랜자임과 같은 효소와 인터페론 감마(IFN-γ)와 같은 사이토카인을 분비하게 된다. 이 경우, 미세입자 복합체에 포함된 상기 펩티드는 상기 효소의 활성에 의해 절단되어 제1 형광 모이어티의 분리에 따른 형광 감도의 감소가 나타날 수 있다. 반면, 미세입자 복합체가 포함하고 있는 IFN-γ과 같은 사이토카인에 대한 항체는 IFN-γ를 포획할 수 있고, 포획된 IFN-γ는 키트 내에 포함된 IFN-γ를 검출하는 항체를 밀집화 시켜 제2 형광 모이어티의 형광 강도가 더욱 강해질 수 있다. 따라서, 상기 키트는 NK 세포의 세포독성 활성과 사이토카인 분비 활성을 동시에 측정할 수 있는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 제2 형광 모이어티는 상기 제1 형광 모이어티에서 정의된 것과 같다. 다만, 제2 형광 모이어티는 제1 형광 모이어티와 육안으로 구별될 수 있는 모이어티일 수 있다.
상기 일 양상의 미세입자 복합체에서 언급된 용어 또는 요소 중 이를 포함한 NK 세포 활성 진단용 키트에서 언급된 용어 또는 요소와 같은 것은 동일한 것으로 이해된다.
또 다른 양상은 일 양상에 따른 복합체를 포함하는 NK 세포 활성 관련 질환 진단용 키트를 제공한다.
일 구체예에서, NK 세포의 활성과 관련한 질환은 과민성 면역질환, 자가면역질환, 면역거부반응, 면역결핍질환, 조직구증, 암, 2형 당뇨병, 기생충 감염 질환 및 바이러스 질환일 수 있다. 상기 과민성 면역질환은 천식 및 축농증 중 선택된 하나 이상의 것이거나, 상기 자가면역질환은 루푸스, 다발성 경화증(multiple sclerosis), 1형 당뇨병 및 류마티스 관절염 중 선택된 하나 이상의 것이거나, 또는 상기 조직구증은 HLH, XLP1, 및 XLP2에서 선택된 어느 하나 이상의 것일 수 있다. 혈구탐식성 림프조직구증(HLH)은 제 2군 랑게르한스 세포 조직구증, 적혈구탐식성 림프조직구증식증(가족성, 산발성), 감염연관성 혈구탐식증후군, 바이러스 연관성 혈구탐식증후군, 거대한 림프절병증을 동반한 조직구증, 또는 망상조직구증의 의미를 포함할 수 있다. 상기 "암"은 종양, 혈액암 또는 고형암을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 암은 폐암, 간암, 식도암, 위암, 대장암, 소장암, 췌장암, 흑색종, 유방암, 구강암, 뇌종양, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 자궁경부암, 육종, 전립선암, 요도암, 방광암, 고환암, 혈액암, 림프종, 피부암, 건선 및 섬유선종으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 암은 췌장암 또는 B 세포 림프종(B cell lymphoma)일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 바이러스 질환은 B형 간염일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 면역결핍질환은 디조지증후군(DiGeorge synderome) 또는 체디악히가시증후군(Chedial-Higashi syndrome)일 수 있다.
상기 일 양상의 미세입자 복합체에서 언급된 용어 또는 요소 중 이를 포함한 NK 세포 관련 질환 진단용 키트에서 언급된 용어 또는 요소와 같은 것은 동일한 것으로 이해된다.
다른 양상은 일 양상의 복합체를 포함하는, NK 세포 활성 검출용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 NK 세포가 분비하는 사이토카인을 검출하는 물질을 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 사이토카인을 검출하는 물질은 제2 형광 모이어티가 추가적으로 결합된 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 NK 세포의 세포독성과 사이토카인를 동시에 검출하는 것일 수 있다.
상기 일 양상의 미세입자 복합체에서 언급된 용어 또는 요소 중 이를 포함한 NK 세포 활성 검출용 조성물에서 언급된 용어 또는 요소와 같은 것은 동일한 것으로 이해된다.
또 다른 양상은 일 양상의 복합체를 개체의 혈액 샘플에 처리하는 단계를 포함하는 NK 세포 활성도를 측정하는 방법을 제공한다. 또한, 상기 복합체로부터 절단된 펩티드를 검출하는 단계; 및 상기 절단된 펩티드가 상기 복합체를 첨가하기 이전 보다 증가한 경우, 상기 혈액 샘플 중 NK 세포의 활성이 증가한 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 절단된 펩티드의 검출은 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 의해 수행되는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서 유세포법으로 수행하면 상기 복합체를 첨가하기 이전 보다 형광 광도가 감소한 경우, 상기 혈액 샘플 중 NK 세포의 활성이 증가한 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 NK 세포가 분비하는 사이토카인을 검출하는 물질을 개체의 혈액 샘플에 처리하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 또한 추가적으로, 상기 NK 세포가 분비하는 사이토카인을 검출하는 단계; 및 상기 사이토카인이 상기 복합체를 첨가하기 이전 보다 증가한 경우, 상기 혈액 샘플 중 NK 세포의 활성이 증가한 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 복합체를 첨가하기 이전 보다 형광광도가 증가한 경우, 상기 혈액 샘플 중 NK 세포의 활성이 증가한 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 이는 미세입자 복합체가 포함하고 있는 사이토카인에 대한 항체는 사이토카인을 포획할 수 있고, 포획된 사이토카인에 의해 사이토카인을 검출하는 물질을 밀집시킬 수 있기 때문이다. 따라서, 상기 복합체로부터 절단된 펩티드를 검출하는 단계와 상기 NK 세포가 분비하는 사이토카인을 검출하는 단계는 동시에 수행되는 것일 수 있다.
상기 일 양상의 미세입자 복합체에서 언급된 용어 또는 요소 중 이를 포함한 NK 세포 활성 측정 방법에서 언급된 용어 또는 요소와 같은 것은 동일한 것으로 이해된다.
또 다른 양상은 일 양상의 복합체를 개체의 혈액 샘플에 처리하는 단계를 포함하는 NK 세포 활성 관련 질환에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 NK 세포 활성 관련 질환에 대한 정보는, 정상 NK 세포 대비 실험군 NK 세포의 활성화가 검출되지 않는 경우 비정상적인 NK 세포로 판단할 수 있고, 또는 특정 수용체에 대해 활성을 상실한 NK 세포가 표적 세포에 대해 비정상적으로 활성을 일으키거나 일으키지 않는 경우 상기 표적 세포가 특정한 질병과 관련이 있음을 판단할 수 있다.
상기 일 양상의 미세입자 복합체에서 언급된 용어 또는 요소 중 이를 포함한 NK 세포 활성 관련 질환에 대한 정보를 제공하는 방법에서 언급된 용어 또는 요소와 같은 것은 동일한 것으로 이해된다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
일 양상에 따른 미세입자 복합체, 이를 포함하는 NK 세포 활성 진다용 키트, 이를 포함하는 NK 세포 활성 검출용 조성물, 및 이를 이용한 NK 세포 활성 측정 방법은 NK 세포의 활성에 따른 효소의 분비와 사이토카인의 발현을 동시에 쉽게 측정할 수 있어 다른 물질 또는 방법과 달리 저비용으로 정밀한 측정 결과를 나타냄으로써, NK 세포의 활성을 효과적으로 검출할 수 있다.
도 1은 미세입자 복합체의 모형을 나타낸 도면이다.
도 2a는 Granzyme B와 미세입자 복합체를 반응시켰을 때 나타난 형광 감도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2b는 IFN-γ와 미세입자 복합체를 반응시켰을 때 나타난 형광 감도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3a는 미세입자 복합체의 NK 세포의 활성 효과에 따른 Granzyme B의 분비를 측정한 그래프이다.
도 3b는 미세입자 복합체의 NK 세포의 활성 효과에 따른 IFN-γ의 분비를 측정한 그래프이다.
도 4는 미세입자 복합체를 통하여 NK 세포의 활성 및 분비된 Granzyme B 및 IFN-γ의 동시 측정을 영상화한 이미지이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 미세입자 복합체의 제조
1.1. 그랜자임 B(Granzyme B) 펩타이드 센서의 제조
Granzyme b 펩타이드 센서는 아미노산 서열 VGPDFGR을 갖는 그랜자임 B 절단가능 펩티드(Peptron, inc. A)를 이용해 공지된 방법(Choi, P.J. and T.J. Mitchison, 2013. 110(16): p.6488-6493.)으로 합성하였고, N- 및 C- 말단 펩티드의 잔기 각각은 NHS-PEG4-Biotin(Thermo Fisher scientific)와 Alexa FluorTM 488 NHS Ester(InvitrogenTM)으로 각각 개질하였다.
1.2. 미세입자 복합체의 제조
4.0Х108 beads/ml의 다이나비드(Dynabeads) M-450 에폭시 1㎖(Thermo Fisher scientific)를 탈이온화된 물로 세척하였고, 0.1 M 인산 나트륨과 0.1 M의 pH 7.4와 1 M의 암모니움 설페이트를 포함하는 완충액 1 ml에서 재현탁하였다. 그런 다음, 5mg/ml의 스트렙타비딘(streptavidin, Invitrogen) 40L를 상기 Dynabead 현탁액에 첨가하고, 비드의 침강을 방지하기 위해 부드러운 회전으로 실온에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 Dynabeads에서 미반응 에폭시 기(group)를 제거하기 위해, 1 ml의 트리스 완충액(100mM의 트리스, pH 7.9)을 상기 반응 혼합물에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 스트렙타비딘으로 코팅된 Dynabeads들을 PBS에서 3회 세척하고, 중탄산 완충액(100 ml 중탄산 나트륨; pH 8.3)에서 재현탁한 후, 1 mg/ml의 Alexa FluorTM 647 NHS Ester(Invitrogen) 0.2 ml을 첨가하여 Alexa FluorTM 647로 표지화시켰다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 후, 표지된 Dynabeads를 PBS로 세척하여 미반응 염료를 제거하였다. 그리고 streptavidin으로 코팅되고, Alexa 647-표지화된 dynabeads 1ml를 비오틴(biotin)화된 0.5mg/ml의 인간 NKG2D/CD314 항체(R&D system; clone : 149,810) 10ml; 비오틴화된 0.5mg/ml의 2B4/CD244 NTI 항체(Invitrogen, clone : eBio C1.7) 10ml; 0.5mg/㎖의 상기 Granzyme B 펩티드 센서 10ml; 및 비오틴화된 1mg/㎖의 항 IFN-γ 항체(Abcam, clone : MD-1) 10ml 를 실온에서 10분 동안 서로 섞어 미세입자 복합체를 제조한 후, PBS로 세척하였다. 상기 실시예를 통해 제조한 미세입자 복합체의 모형도는 도 1에 나타내었다.
실험예 1. 유세포 분석
본 실험예에서는 상기 실시예에서 제조된 미세입자 복합체가 정상적으로 기능하는지 알아보기 위해, 하기와 같이 유세포 분석을 수행하였다. 우선, Granzyme B 센서의 기능을 확인하기 위하여, 미세입자 복합체를 2시간 동안 150U/ml, 450U/ml 및 600U/ml로 구성되는 다양한 농도의 인간 Granzyme B(Abcam)로 처리하였다. 그리고 동시에, IFN-γ에 대한 포획 기능을 확인하기 위하여 PE 항-인간 IFN-γ 항체(BioLegend, clone : 4S.B3) 2μg에 1, 10, 100 및 1000ng/ml로 구성되는 다양한 농도의 재조합 인간 IFN-γ(Gibco)을 첨가하고, 각각에 미세입자 복합체를 혼합하였다. 형광도 측정은 LSR Fortessa 분석기(BD Biosciences)를 사용하여 미세입자 복합체의 형광 강도를 측정하고 측정 데이터를 FlowJo로 분석하여 각 검출 여부를 확인하였다. 각각의 결과는 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, Granzyme B를 처리할 경우 형광도가 감소하는 결과가 나타났다. 이는 미세입자 복합체 내 Granzyme B 효소에 의해 펩티드가 절단된 것을 의미한다. 또한, 도 2b에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 처리 농도가 높을 경우엔 형광도가 상승하였는데, 이는 미세입자 복합체내 IFN-γ 항체가 항 PE 항-인간 IFN-γ 항체가 추적한 IFN-γ를 포획하였음을 나타낸다. 상기 결과는 상기 실시예에서 제조한 미세입자 복합체가 정상적으로 기능함을 의미한다.
실험예 2. NK 세포 활성 측정
본 실험예에서는 자연살해(natural killer : NK) 세포의 활성에 따라 분비된 Granzyme B와 IFN-γ에 대한 미세입자 복합체의 NK 세포 활성 및 이의 측정 여부를 실험하고자 하였다. 우선, 인간 BD Fc 블록(BD Bioscience)으로 미세입자 복합체를 처리한 후, 확장된 NK 세포(eNK)를 사용하였다. 5μg/ml의 PE 항-인간IFN-γ 항체 50ml를 IMDM 배지에서 37 ℃에서 4시간 동안 동일한 수의 미세입자 복합체와 eNK 세포 4.0x106를 인큐베이션하였다. PBS로 3회 상기 eNK/미세입자 혼합물을 세척한 후, LSR Fortessa 분석기(BD Biosciences)로 유동 세포 계측법을 수행하였다. 검출된 데이터를 FlowJo로 분석하였다. 대조군은 아무것도 처리되지 않은 비드(bead), 비오틴화된 NKG2D/2B4 항체를 비오틴화된 0.5mg/ml의 마우스 iso 항체인 IgG 20ml로 대체한 미세입자를 사용하였다. 그 결과는 도 3a 및 3b에 각 나타내었다.
도 3a에 나타낸 바와 같이, iso 항체로 대체한 미세입자의 경우, NK 세포에 대한 활성이 없어 Granzyme B의 분비가 일어나지 않고 이에 따라 펩티드 센서의 절단이 발생하지 않아 미세입자 복합체에 비해 높은 형광도를 나타내었다. 또한, 도 3b의 경우엔, iso 항체로 대체한 미세입자의 NK 세포 활성이 없어 IFN-γ의 분비가 일어나지 않았고, 이에 따라 추적에 따른 형광도가 낮았다. 이는 미세입자 복합체에 포함된 항체인 NKG2D/2B4 항체에 의해 NK 세포의 활성이 증가는데 반해, 대조군인 iso 항체의 경우, NK세포를 자극하지 못하였기 때문이다. 본 실험예를 통해, 미세입자 복합체가 NK 세포의 Granzyme B 및 IFN-γ의 분비를 활성화 시키는 효과가 있음을 나타낸다.
실험예 3. 미세입자 복합체의 라이브 셀 이미징 분석
본 실험예에서는 미세입자 복합체를 통하여 NK 세포의 활성 및 활성에 따른 Granzyme B 및 IFN-γ의 동시 측정을 영상화하고자 하였다. 미세입자 복합체를 고정시키기 위해, 낮은 표면 범위로 비오틴 커버슬립에 추가하였다. eNK 세포 및 형광 모이어티가 부착된 IFN-γ 항체를 첨가한 후, 15분 간격으로 4시간 동안의 경과를 영상화하였다. 영상화 과정은 구체적으로, 40X(UPlanFLN, NA = 1.30) 대물렌즈와 카메라(Roper Scientific Cascade)로 개조된 현미경(Olympus IX 81 epifluorescence)을 사용하였다. LAMBDA LS 크세논 램프(175W, Sutter 장비) 및 필터 세트, FITC(Chroma S492 / 18x 및 62002bs), Texas Red(Chroma S572 / 23x 및 62002bs) 및 Cy5(Chroma ET620 / 60x, T660LPXR 및 ET700 / 75m) 형광 이미징에 사용되었습니다. 현미경 및 전동 스테이지(MS-2000, Applied Scientific Instrumentation, Inc)는 Micromanager에 의해 제어하였다. 라이브 셀 이미징 동안, Chamlide TC 인큐베이터 시스템(Live Cell Instrument)에서 세포 배양 조건인 37℃ 및 5 % CO2로 유지하였다. 상기의 방법으로 획득된 이미지는 Image J.를 사용하여 분석하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다. 또한, 동시에 LSR Fortessa 분석기(BD Biosciences)로 유동 세포 계측법을 수행하였고, 검출된 데이터를 FlowJo로 분석하여 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, eNK가 첨가된 bead에서만 형광의 감소가 육안으로 확인되었다. 또한, Granzyme B 센서의 경우 eNK와 서로 접촉되었을 경우, 시간이 지날수록 미세입자 복합체의 절단 펩티드에 부착된 형광모이어티의 초록색 형광도가 낮아졌고, 추가로 첨가된 IFN-γ 항체에 부착된 붉은 색 형광모이어티에 의한 형광도는 높아지는 결과가 나타났다. 두 결과를 오버레이하였을 경우, 초록색의 형광도를 보이는 미세입자가 붉은 색의 미세입자로 변화하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 미세입자 복합체가 NK 세포의 활성 및 이에 따른 Granzyme B와 IFN-γ 분비의 측정을 동시에 수행할 수 있음을 나타낸다.
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Claims (32)

  1. 미세입자;
    NK 세포를 활성화하는 물질;
    상기 물질에 의해 활성화된 NK 세포가 분비하는 세포독성 효소에 의해 절단되는 펩티드;
    상기 펩티드에 연결된 제1 형광 모이어티;
    상기 물질에 의해 활성화된 NK 세포가 분비하는 사이토카인과 결합하는 물질; 및
    상기 펩티드, NK 세포를 활성화하는 물질, 또는 사이토카인과 결합하는 물질을 상기 미세입자와 연결하는 링커를 포함하는 NK 세포 활성 진단용 미세입자 복합체.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 미세입자는 비드(bead)인 것인 미세입자 복합체.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 비드는 라텍스 비드, 중합체 플라스틱 비드, 생체 적합성 중합체로 구성된 비드, 유리 비드, 실리카 비드 및 자성 비드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 미세입자 복합체.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 자성 비드는 철족금속 원소, 희토류 원소, 화폐금속 원소, 아연족 원소, 알루미늄족원소, 알칼리토금속 원소 및 백금족 원소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 미세입자 복합체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 NK 세포가 분비하는 세포독성 효소는 퍼포린(perforin), 그랜자임 A(granzyme A), 그랜자임 B, 그랜자임 H, 그랜자임 K 및 그랜자임 M으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 미세입자 복합체.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 펩티드는 2 내지 20개의 아미노산으로 이루어져 있고, , 'IGNR', 'IEPD', 'PTSY', 'YRFK', 'KVPL', 'VG', 'FGR', 'GPD', ‘GE’, 'PDFG' 또는 ‘VGPDFGR’을 포함하는 펩타이드인 것인 미세입자 복합체.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 제1 형광 모이어티는 플루오레신(fluorescein), 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민 6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민 110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6- 카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린(Oregon Green) 500, 오레곤 그린(Oregon Green) 514, 알렉사 플로어(Alexa Fluor) 350, 알렉사 플로어 430, 알렉사 플로어 488, 알렉사 플로어 532, 알렉사 플로어 546, 알렉사 플로어 568, 알렉사 플로어 594, 알렉사 플로어 633, 알렉사 플로어 647, 알렉사 플로어 660, 알렉사 플로어 680, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY) FL, 보디피 FL-Br2, 보디피 530/550, 보디피 558/568, 보디피 564/570, 보디피 576/589, 보디피 581/591, 보디피 630/650, 보디피 650/665, 보디피 R6G, 보디피 TMR 및 보디피 TR로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것인 미세입자 복합체.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 NK 세포를 활성화하는 물질은 NKG2D, 2B4(CD244), DNAM-1(CD226), CD2, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, 및 NKp80으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 자극하는 것인 미세입자 복합체.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 NK 세포가 분비하는 사이토카인과 결합하는 물질은 IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, TNF-β RANTES, IL-8 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것과 결합하는 항체, 펩티드 또는 앱타머(aptamer)인 것인 미세입자 복합체.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 링커는 비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 탄수화물, 폴리 L-리신, 티올기, 아민기, 알코올기, 카르복실기, 아미노기, 설퍼기, 알데히드기, 카르보닐기, 숙신이미드기, 말레이미드기, 에폭시기, 이소티오시아네이트기를 갖는 화합물 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나인 것인 미세입자 복합체.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 링커는 고분자 화합물을 더 포함하는 것인 미세입자 복합체.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 고분자 화합물은 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리프로필렌옥사이드(PPO), 폴리비닐알코올(PVA), 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드)(polyNIPAM), 폴리푸마레이트, 폴리오르가노포스파젠, 폴리아크릴산(polyAAc), 폴리아크릴설포네이트, 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트(PolyHEMA) 및 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택된 것인 미세입자 복합체.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 절단되는 펩티드의 N- 말단에는 고분자 화합물, C- 말단에는 제1 형광 모이어티가 결합된 것인 미세입자 복합체.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 NK 세포 활성 진단용 키트.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 키트는 NK 세포가 분비하는 사이토카인을 검출하는 물질을 더 포함하는 것인 키트.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 사이토카인을 검출하는 물질은 제2 형광 모이어티가 추가적으로 결합된 것인 키트.
  17. 청구항 14에 있어서, 상기 키트는 NK 세포의 세포독성과 사이토카인를 동시에 검출하는 것인 키트.
  18. 청구항 16에 있어서 상기 제2 형광 모이어티는 모이어티는 플루오레신(fluorescein), 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민 6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민 110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6- 카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린(Oregon Green) 500, 오레곤 그린(Oregon Green) 514, 알렉사 플로어(Alexa Fluor, 상표명) 350, 알렉사 플로어 430, 알렉사 플로어 488, 알렉사 플로어 532, 알렉사 플로어 546, 알렉사 플로어 568, 알렉사 플로어 594, 알렉사 플로어 633, 알렉사 플로어 647, 알렉사 플로어 660, 알렉사 플로어 680, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY, 상표명) FL, 보디피 FL-Br2, 보디피 530/550, 보디피 558/568, 보디피 564/570, 보디피 576/589, 보디피 581/591, 보디피 630/650, 보디피 650/665, 보디피 R6G, 보디피 TMR 및 보디피 TR로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것인 키트.
  19. 청구항 15에 있어서, 상기 NK 세포가 분비하는 사이토카인을 검출하는 물질은 IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TNF-α, TNF-β, RANTES, IL-8 및 IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 것과 결합하는 항체, 펩티드 또는 앱타머인 것인 키트.
  20. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는 NK 세포 활성 관련 질환 진단용 키트.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 NK 세포 활성 관련 질환은 과민성 면역질환, 자가면역질환, 면역결핍질환, 조직구증, 혈액암 및 고형암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, NK 세포 활성 관련 질환 진단용 키트.
  22. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항의 복합체를 포함하는, NK 세포 활성 검출용 조성물.
  23. 청구항 1의 복합체를 개체의 혈액 샘플에 처리하는 단계를 포함하는 NK 세포 활성도를 측정하는 방법.
  24. 청구항 23에 있어서,
    상기 복합체로부터 절단된 펩티드를 검출하는 단계; 및
    상기 절단된 펩티드가 상기 복합체를 첨가하기 이전 보다 증가한 경우, 상기 혈액 샘플 중 NK 세포의 활성이 증가한 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것인, NK 세포 활성도를 측정하는 방법.
  25. 청구항 24에 있어서,
    상기 복합체를 첨가하기 이전 보다 형광 광도가 감소한 경우, 상기 혈액 샘플 중 NK 세포의 활성이 증가한 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것인, NK 세포 활성도를 측정하는 방법.
  26. 청구항 24에 있어서, 상기 절단된 펩티드의 검출은 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상에 의해 수행되는 것인, NK 세포 활성도를 측정하는 방법.
  27. 청구항 23에 있어서, NK 세포가 분비하는 사이토카인을 검출하는 물질을 개체의 혈액 샘플에 처리하는 단계를 더 포함하는 것인, NK 세포 활성도를 측정하는 방법.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 NK 세포가 분비하는 사이토카인을 검출하는 단계; 및
    상기 사이토카인이 상기 복합체를 첨가하기 이전 보다 증가한 경우, 상기 혈액 샘플 중 NK 세포의 활성이 증가한 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것인, NK 세포 활성도를 측정하는 방법.
  29. 청구항 28에 있어서,
    상기 복합체를 첨가하기 이전 보다 형광광도가 증가한 경우, 상기 혈액 샘플 중 NK 세포의 활성이 증가한 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것인, NK 세포 활성도를 측정하는 방법.
  30. 청구항 29에 있어서, 상기 복합체로부터 절단된 펩티드를 검출하는 단계와 상기 NK 세포가 분비하는 사이토카인을 검출하는 단계는 동시에 수행되는 것인, NK 세포 활성도를 측정하는 방법.
  31. 청구항 1의 복합체를 개체의 혈액 샘플에 처리하는 단계를 포함하는 NK 세포 활성 관련 질환에 대한 정보를 제공하는 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 NK 세포와 관련 질환은 과민성 면역질환, 자가면역질환, 면역결핍질환, 조직구증, 혈액암 및 고형암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, NK 세포 활성 관련 질환에 대한 정보를 제공하는 방법.

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