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KR102202694B1 - ftfL 유전자가 과발현된 메탄올자화균 변이주 및 이를 이용한 PHB 생산방법 - Google Patents

ftfL 유전자가 과발현된 메탄올자화균 변이주 및 이를 이용한 PHB 생산방법 Download PDF

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KR102202694B1
KR102202694B1 KR1020190002086A KR20190002086A KR102202694B1 KR 102202694 B1 KR102202694 B1 KR 102202694B1 KR 1020190002086 A KR1020190002086 A KR 1020190002086A KR 20190002086 A KR20190002086 A KR 20190002086A KR 102202694 B1 KR102202694 B1 KR 102202694B1
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KR
South Korea
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methanol
phb
ftfl
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bacteria
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오민규
김용환
윤지희
김승진
Original Assignee
고려대학교 산학협력단
울산과학기술원
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Abstract

본 발명은 ftfL(formate-tetrahydrofolate ligase) 유전자가 과발현된 메탄올자화균 변이주 및 이를 이용한 PHB 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 ftfL 유전자가 과발현된 메탄올자화균 변이주, 또는 메탄올자화균 배양 시 pH 조절을 통해 PHB를 생산하는 방법을 이용하면, 세포 생장 능력과 PHB의 생산성이 현저히 향상되는바, PHB를 이용한 다양한 제품의 개발에 널리 활용될 수 있다.

Description

ftfL 유전자가 과발현된 메탄올자화균 변이주 및 이를 이용한 PHB 생산방법{Novel methylotrophic bacteria variant with overexpression of ftfL gene and method for producing PHB using the same}
본 발명은 ftfL(formate-tetrahydrofolate ligase) 유전자가 과발현된 메탄올자화균 변이주 및 이를 이용한 PHB 생산방법에 관한 것이다.
온실가스 급증 및 셰일가스 에너지 혁명으로 인해서 C1 가스를 이용한 생물학적 전환 기술이 빠른 속도로 발전하고 있다. 하지만 C1 가스는 용해도가 낮다는 단점이 있어 생물학적 전환 기술에 장애가 되고 있는데, 개미산(포름산, 화학식 HCOOH)의 경우 바이오촉매를 이용하여 이산화탄소를 전기화학적으로 환원시켜 합성될 수 있는 친환경적인 물질로서, 생물체에 미치는 독성이 적고 용해도가 높기 때문에 C1 가스의 종래 문제점을 해결할 수 있는 물질로 주목을 받고 있다.
개미산을 활용할 수 있는 미생물로는 Calvin-Benson-Bassham cycle을 가지고 있는 독립 영양세균 (autotrophic bacteria)이 있으나, 에너지 효율이 좋지 않으며 생장 속도가 매우 느리고 생산 수율이 낮다는 점에서 산업에서 사용하기에 한계가 있다. Wood-Ljungdahl pathway를 가지고 있는 아세토젠 (acetogen)과 reductive acetyl-CoA pathway를 가지고 있는 메타노젠 (methanogen) 또한, 개미산을 활용할 수 있지만, 배양 조건이 까다로우며 유전자 조작이 어렵고 산소에 예민한 효소가 있어 연구 및 산업화에 적합하지 않다는 단점이 있다. 이에 반해, Serine cycle을 가지고 있는 메탄/메탄올자화균은 개미산을 직접적으로 동화시키며 다른 미생물보다 상대적으로 빠르게 자랄 뿐만 아니라 유전자 조작 방법이 구축되어 있어 잠재적인 산업 균주로 많은 관심을 받고 있다.
한편, 생분해성 플라스틱의 일종인 PHB(poly-3-hydroxybutyrate)는 미생물의 에너지 저장물질로서 세포내에서 만들어지고 분해되어지기 때문에 생분해성이 우수하여 토양 내에서도 탄산가스와 물로 완전히 분해되고, 독성이 없어 의료용 및 의약용 고분자로서 이용될 수 있으며, 기존의 합성고분자인 폴리프로필렌과 폴리에스터와도 고분자적 물성이 유사하여 농업용, 식품용, 일회용품, 의료용 소재 등 기존 플라스틱의 사용분야에 유용하게 활용이 가능하다.
전술한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 PHB 생산성을 향상시키는 기술을 개발하고자 예의 노력한 결과, PHB를 생산하는 메탄올자화균의 최적 배양 조건을 확립함과 동시에, 메탄올자화균의 ftfL 유전자를 과발현시킨 신규 메탄올자화균 변이주를 개발하고, 상기 최적 배양 조건하에서 메탄올자화균 또는 신규 메탄올자화균 변이주를 배양할 경우 PHB 생산성이 현저히 향상됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 메탄올자화균의 ftfL(formate-tetrahydrofolate ligase) 유전자가 과발현된, PHB(poly-3-hydroxybutyrate) 생산능이 향상된 신규 메탄올자화균 변이주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 메탄올자화균 변이주 또는 이의 배양산물을 유효성분으로 포함하는 PHB 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 메탄올자화균 또는 상기 메탄올자화균 변이주를 개미산을 포함하는 pH 6.8 이하의 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 PHB 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,
메탄올자화균의 ftfL(formate-tetrahydrofolate ligase) 유전자가 과발현된, PHB(poly-3-hydroxybutyrate) 생산능이 향상된 메탄올자화균 변이주를 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 메탄올자화균은 메틸로박테리움(Methylobacterium) 속 균주일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 메탄올자화균은 Methylobacterium extorquens AM1, Methylobacterium suomiense, Methylobacterium platani, Methylobacterium adhaesivum, Methylobacterium soli 및 Methylobacterium chloromethanicum으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 ftfL 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 적어도 50% 서열 유사성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 메탄올자화균 변이주는 개미산의 존재하에서 생장이 증진될 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 메탄올자화균 변이주는 수탁번호 KCTC13716BP로 기탁된 Methylobacterium extorquens MZO2일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 메탄올자화균 변이주 또는 이의 배양산물을 유효성분으로 포함하는 PHB 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 배양산물은 균주의 배양물, 배양상등액, 파쇄물 및 이들의 분획물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 메탄올자화균 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 메탄올자화균 변이주를 개미산을 포함하는 pH 6.8 이하의 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 PHB 생산방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 메탄올자화균은 Methylobacterium extorquens AM1, Methylobacterium suomiense, Methylobacterium platani, Methylobacterium adhaesivum, Methylobacterium soli 및 Methylobacterium chloromethanicum으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 ftfL 유전자가 과발현된 메탄올자화균 변이주, 또는 메탄올자화균 배양 시 pH 조절을 통해 PHB를 생산하는 방법을 이용하면, 세포 생장 능력과 PHB의 생산성이 현저히 향상되는바, PHB를 이용한 다양한 제품의 개발에 널리 활용될 수 있다.
도 1은 메탄올자화균 Methylobacterium extorquens의 주요 대사 및 개미산으로부터 PHB를 합성하는 경로를 도시한 도면이다.
도 2는 M. extorquens wild type(Methylobacterium extorquens AM1)과, 본 발명에 따른 메탄올자화균 변이주(Methylobacterium extorquens MZO2)의 배양 pH에 따른 cell mass(A), 개미산 유입속도(B) 및 세포당 개미산 유입속도(C)를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 M. extorquens wild type(Methylobacterium extorquens AM1)과, 본 발명에 따른 메탄올자화균 변이주(Methylobacterium extorquens MZO2)의 배양 pH에 따른 생산된 PHB 농도(A) 및 세포 내 PHB 함량(B)를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 M. extorquens wild type(Methylobacterium extorquens AM1)과, 본 발명에 따른 메탄올자화균 변이주(Methylobacterium extorquens MZO2)의 배양 후 TEM 이미지를 나타낸 것(A, B는 wild type(각각 6500배, 21000배 확대 이미지), C, D는 MZO2(각각 6500배, 21000배 확대 이미지)의 TEM 이미지임)이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
메탄올자화균 중 예를 들어 Methylobacterium extorquens 균주는 PHB를 선천적으로 세포 내에 합성하는 미생물로, serine cycle과 ethylmalonyl-CoA pathway (EMCP)를 거쳐 개미산으로부터 중간 대사산물인 3-hydroxybutyryl-CoA를 거쳐 PHB를 합성한다.
상기 균주에서 개미산을 활용하여 PHB를 합성하는 과정에 관여하는 유전자 중 개미산 수송 단백질(formate transporter, focA) 유전자는 개미산을 세포 내외로 이동시키는 역할을 하는데, FocA 단백질을 pH에 따라 구조가 변하는 특성을 가지고 있다. 또한, 개미산-테트라하이드로폴레이트 리가아제(formate-tetrahydrofolate ligase, ftfL) 유전자는 개미산을 동화시키는 역할을 하는데, 구체적으로 개미산은 FtfL 단백질에 의해 테트라하이드로폴레이트 (tetrahydrofolate, H4F)와 결합하여 주요 대사과정에 사용된다(도 1).
본 발명자들은 전술한 특징을 가지는 메탄올자화균의 생장 능력을 유지하면서 PHB를 생산하는 방법에 대해 연구하던 중, 메탄올자화균 배양시 FocA 단백질의 pH 변화에 의한 구조 변화에 따른 개미산 유입 속도를 증가시키면서도 생장 저해를 일으키지 않고, PHB 생산성을 향상시킬 수 있는 최적 pH 범위를 확인함과 동시에, 메탄올 자화균의 ftfL(formate-tetrahydrofolate ligase) 유전자를 과발현시킨 신규 균주의 제조 및 상기 균주의 우수한 PHB 생산능을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 메탄올자화균의 ftfL(formate-tetrahydrofolate ligase) 유전자가 과발현된, PHB(poly-3-hydroxybutyrate) 생산능이 향상된 메탄올자화균 변이주를 제공한다.
이때, 상기 메탄올자화균은 focA 유전자와 ftfL 유전자를 보유하고, 개미산으로부터 PHB를 합성하는 대사경로를 가진 균주라면 모두 가능하나, 바람직하게는 메틸로박테리움(Methylobacterium) 속 균주일 수 있으며, 예를 들어 Methylobacterium extorquens AM1, Methylobacterium suomiense, Methylobacterium platani, Methylobacterium adhaesivum, Methylobacterium soli 및 Methylobacterium chloromethanicum으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 상기 ftfL 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 적어도 50% 서열 유사성을 갖는 유전자인 것이 바람직하며, 서열번호 1로 표시되는 유전자인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 메탄올자화균 변이주는 개미산의 존재하에서 생장이 증진되는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 메탄올자화균 변이주는 수탁번호 KCTC13716BP로 기탁된 Methylobacterium extorquens MZO2일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 메탄올자화균 변이주 또는 이의 배양산물을 유효성분으로 포함하는 PHB 생산용 조성물을 제공한다.
전술한 바와 같이, 메탄올자화균에서 ftfL 유전자를 과발현시킬 경우 PHB의 생산성이 증가하게 되므로, ftfL 유전자가 과발현된 상기 메탄올자화균 변이주 또는 이의 배양물을 이용하면 야생형 메탄올자화균 또는 이의 변이주보다 PHB를 높은 수율로 생산할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 메탄올자화균 변이주의 배양산물은 PHB를 높은 수율로 생산하는데 사용될 수 있는한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 상기 메탄올자화균 변이주의 배양물, 배양상등액, 파쇄물, 이들의 분획물 등이 될 수 있고, 다른 예로서, 메탄자화균 변이주의 배양물을 원심분리하여 수득한 배양상등액, 메탄올자화균 변이주를 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득한 파쇄물, 상기 배양물, 배양상등액, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득한 분획물 등이 될 수 있다.
또한, 본 발명은 메탄올자화균 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 메탄올자화균 변이주를 개미산을 포함하는 pH 6.8 이하의 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 PHB 생산방법을 제공한다.
이때, 상기 개미산을 포함하는 배지의 pH가 낮을수록 개미산 수송 단백질에 의한 개미산 유입이 촉진되지만, pH가 급격하게 낮아질 경우 다량의 개미산의 세포로 유입되어 세포질 (cytoplasm)을 산성화시켜 proton motive force를 감소시키게 되고 이에 따라 호흡 연쇄 (respiratory chain)를 방해하여 생장 저해를 일으킬 수 있는 문제점이 있는바, 상기 개미산을 포함하는 배지의 pH는 6.4 내지 6.8의 범위에서 조절되는 것이 바람직하며, 6.6 내지 6.8의 범위에서 조절되는 것이 가장 바람직하다.
또한, 상기 pH 조절에 의한 PHB 생산성 향상은 ftfL 유전자가 과발현된 메탄올자화균 변이주 뿐만 아니라, PHB를 생산할 수 있는 메탄올자화균에도 모두 적용이 가능하며, 이때 상기 메탄올자화균은 메틸로박테리움(Methylobacterium) 속 균주일 수 있으며, 예를 들어 Methylobacterium extorquens AM1, Methylobacterium suomiense, Methylobacterium platani, Methylobacterium adhaesivum, Methylobacterium soli 및 Methylobacterium chloromethanicum으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 메탄올자화균 또는 메탄올자화균 변이주를 배양하는 방법은 당업계에서 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 상기 메탄올자화균 또는 메탄올자화균 변이주로부터 PHB를 생산할 수 있는한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 개미산을 함유하며, 이외에 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유할 수 있으며, 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다.
사용될 수 있는 탄소원으로는 메탄올자화균의 특성상 주로 메탄올을 사용하지만, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산 등을 부가적으로 사용할 수 있는데, 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 위하여 구체적인 실시예를 통하여 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기의 실시예에 의해서 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. ftfL 유전자가 과발현된 메탄올자화균 변이주의 제조
서열번호 1로 표시되는 ftfL 유전자가 과발현된 메탄올자화균 변이주를 하기의 방법에 따라 제조하였다. 먼저, M. extorquens에서 발현용 플라스미드로 pCM66 플라스미드를 사용하였으며, 우선, 유전자를 강력하게 발현시키기 위해 pCM66에 M. extorquens가 가지고 있는 강력한 프로모터인 mxaF promoter를 클로닝하였다. 이를 위해서 올리고머 PmxaF_for와 PmxaF_rev를 이용하여 mxaF promoter를 PCR하여 증폭하였다(사용된 올리고머의 서열은 [표 1]에 나타내었다.) 그리고 제한효소 XbaI, BamHI로 PCR product와 pCM66을 잘라 Mighty mix (Takara, Shiga, Japan)으로 ligation하였으며, mxaF promoter가 클로닝된 플라스미드를 pCM661이라 명명하였다.
다음으로, pCM661에 ftfL(서열번호 1)을 클로닝하기 위해, 우선 올리고머 ftfL_for, ftfL_rev을 이용하여 유전자를 증폭시킨 후 제한효소 KpnI, EcoRI으로 잘라 Mighty Mix (Takara, Shiga, Japan)으로 ligagion하였으며, pCM661에 ftfL이 클로닝되어 최종적으로 완성된 플라스미드를 pCM02으로 명명하였다.
올리고머 명칭 서열 (5‘ - 3’) 용도
PmxaF_for ATATATTCTAGACGCATCGTCTCCAAGTGC mxaF promoter 증폭
PmxaF_rev ATATATGGATCCAAGGCCGAGACTGATGTCAC
ftfL_for ATATATggtaccAGGAGGGAGAAATGCCCTCAGATATC ftfL 유전자 증폭
ftfL_rev ATATATgaattcCTAGAACAGCCCGTCGATCT
플라스미드 pCM02를 전기천공법(electroporation)(2 mm 큐벳을 이용하였으며, 2500 V의 전기 충격을 가함)을 이용하여 M. extorquens AM1 세포 내로 도입하여 형질전환 시킴으로써, 본 발명에 따른 ftfL 유전자가 과발현된 메탄올자화균 변이주를 제조하였다.
상기 제조된 메탄올자화균 변이주를 Methylobacterium extorquens MZO2로 명명하고, 부다페스트 조약에 따른 미생물 기탁기관인 한국생명공학연구원 생명자원센터에 2018년 11월 14일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC13716BP를 부여받았다.
실시예 2. 메탄올자화균 또는 메탄올자화균 변이주의 배양
M. extorquens AM1 균주와 Methylobacterium extorquens MZO2를 다양한 pH 조건하에서 유가배양(fed-batch fermentation)하였다. 이때, 배지의 초기 개미산 농도는 1 g/L였고 pH 조절을 위해 10 M 개미산 용액을 이용하였으며, 모든 배양은 3 L 발효기에서 이루어졌다.
배양에 사용된 배지의 구체적인 조성은 하기 표 2에 나타내었으며, 28 ℃의 온도 조건에서 108 시간 동안 상기 균주들을 배양하였다.
성분 함량
(NH4)2SO4 1.0 g/L
KH2PO4 1.305 g/L
Na2HPO4·7H2O 4.02 g/L
MgSO4·7H2O 0.45 g/L
CaCl2·2H2O 3.3 mg/L
FeSO4·7H2O 1.3 mg/L
MnSO4·H2O 100 μg/L
ZnSO4·7H2O 130 μg/L
CuSO4·5H2O 40 μg/L
Na2MoO4·2H2O 40 μg/L
CoCl2·6H2O 40 μg/L
H3BO3 30 μg/L
실시예 2-1. 배양 pH에 따른 세포량 , 개미산 유입속도 및 세포당 개미산 유입속도 비교 분석
도 2는 M. extorquens wild type(Methylobacterium extorquens AM1)과, 본 발명에 따른 메탄올자화균 변이주(Methylobacterium extorquens MZO2)의 배양 pH에 따른 세포량(cell mass)(A), 개미산 유입속도(B) 및 세포당 개미산 유입속도(C)를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
측정 결과, Wild type의 경우 pH를 6.6 이하로 유지시켰을 때 개미산 유입 속도가 급격이 증가하였으며(도 2의 (B)), pH가 낮을수록 세포(dry cell weight, DCW) 당 개미산 유입속도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 2의 (C)). 다만, 세포량(cell mass)의 경우 pH 6.4 내지 6.8에서 배양 시 통상의 메탄올자화균 배양 조건인 중성 pH에서 배양 시 보다 높게 측정됨을 확인하였으며, 그 중에서도 pH 6.8에서 배양 시 세포량이 중성 pH에서 배양할 때보다 27% 이상 증가함을 확인하였다(도 2의 (A)). 이처럼, 개미산 유입 속도의 증가가 세포량(cell mass)의 증가로는 이어지지 않았으며, 이는 급격한 개미산 유입이 세포질의 산성화를 일으켜 호흡 연쇄(respiratory chain)을 방해하여 생장 저해를 일으킨 것으로 추론할 수 있으며, 이를 통해 원활한 세포 생장을 위해서는 배양 배지의 pH를 6.4 내지 6.8로 조절하여 개미산 유입을 적절하게 유지시켜야 함을 확인하였다.
본 발명에 따른 메탄올자화균 변이주(Methylobacterium extorquens MZO2)의 경우 pH 6.4 내지 6.8에서 배양 시 중성 pH에서 배양 시 보다 세포량이 높게 측정되었으며, 특히 pH 6.6에서 배양 시에는 동일 조건에서 배양된 wild type에 비해 30% 증가한 세포량(중성 pH에서 배양된 wild type 대비 50% 이상 증가)을 나타냄을 확인하였다(도 2의 (A)). 또한, 개미산 유입속도의 경우 pH 6.4 이하에서는 MZ02가 wild type보다 개미산 유입속도가 빠르지만 pH 6.6에서는 개미산 유입속도가 더 느린 것으로 확인되었다(도 2의 (B), (C)). 이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 메탄올자화균 변이주가 pH 6.6의 배양조건에서 개미산을 효율적으로 이용하여 세포량이 향상된다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2-2. 배양 pH에 따른 PHB 생산성 비교 분석
도 3은 M. extorquens wild type(Methylobacterium extorquens AM1)과, 본 발명에 따른 메탄올자화균 변이주(Methylobacterium extorquens MZO2)의 배양 pH에 따른 생산된 PHB 농도(A) 및 세포 내 PHB 함량(B)를 비교한 결과를 나타낸 것이고, 도 4는 M. extorquens wild type(Methylobacterium extorquens AM1)과, 본 발명에 따른 메탄올자화균 변이주(Methylobacterium extorquens MZO2)의 배양 후 TEM 이미지를 나타낸 것(A, B는 wild type, C, D는 MZO2의 TEM 이미지임)이다.
먼저 도 3에 기재된 상기 균주들의 PHB 생산량을 비교한 결과, pH 6.4 내지 6.8의 조건에서 배양 시 중성 조건에서 배양할 때 보다 wild type과 메탄올자화균 변이주(Methylobacterium extorquens MZO2)의 PHB 생산량이 모두 증가하는 것으로 확인되었으며, 특히 본 발명에 따른 메탄올자화균 변이주(Methylobacterium extorquens MZO2)의 경우 pH 6.4 내지 6.8의 조건에서 배양 시 동일 조건에서 배양된 wild type 보다 PHB 생산량이 현저히 향상되며, 특히 pH 6.6의 조건에서 wild type에 비해 메탄올자화균 변이주(Methylobacterium extorquens MZO2)의 PHB 농도가 87% 증가하며, 세포 내 PHB 함량은 45% 이상 증가한다는 것을 확인하였다(도 3). 이러한 결과는 도 4의 TEM 이미지를 통해서도 명확하게 관찰되었다.
이를 통해 메탄올자화균 또는 메탄올자화균 변이주 배양 시 배양 배지의 pH는 6.4 내지 6.8의 범위에서 조절하는 것이 바람직한 것으로 확인되었으며, 특히 본 발명에 따른 메탄올자화균 변이주는 FtfL 과발현에 의해 pH 6.4 내지 6.8의 배양 조건에서(특히 pH 6.6) 세포 생장성과 PHB 생산성이 현저히 향상된다는 것을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC13716BP 20181114
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Claims (10)

  1. 메탄올자화균 변이주를 개미산을 포함하는 pH 6.4 내지 6.8의 배지에서 배양하는 단계;를 포함하고,
    상기 메탄올자화균 변이주는 메탄올자화균의 ftfL(formate-tetrahydrofolate ligase) 유전자가 과발현되고, 수탁번호 KCTC13716BP로 기탁된 Methylobacterium extorquens MZ02인 것을 특징으로 하는 PHB(poly-3-hydroxybutyrate) 생산방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 ftfL 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 적어도 50% 서열 유사성을 갖는 것을 특징으로 하는 PHB(poly-3-hydroxybutyrate) 생산방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 메탄올자화균 변이주는 개미산의 존재하에서 생장이 증진되는 것을 특징으로 하는 PHB(poly-3-hydroxybutyrate) 생산방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
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