KR102206745B1

KR102206745B1 - 안토시아닌 및 gabab 수용체 작용제를 유효성분으로 포함하는 신경질환 치료제

Info

Publication number: KR102206745B1
Application number: KR1020130082429A
Authority: KR
Inventors: 김명옥
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2013-07-12
Filing date: 2013-07-12
Publication date: 2021-02-03
Also published as: WO2015005562A1; KR20150007860A

Abstract

본 발명은 신경세포 사멸에 의하여 유발되는 신경질환의 예방 및 치료효과를 제공하기 위하여, 안토사이닌(anthocyanin)과 GABAB1R 작용제를 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이를 이용한 신경질환 예방 및 치료방법을 제공한다.

Description

안토시아닌 및 GABAB 수용체 작용제를 유효성분으로 포함하는 신경질환 치료제{Therapeutic agent for treating neurological disorders comprising anthocyanin and GABAB receptor agonist}

본 발명은 신경보호용 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 안토시아닌 및 GABAB 수용체 작용제를 유효성분으로 포함하는 신경질환 치료제에 관한 것이다.

GABA(gamma-aminobutyric acid) B 수용체는 중추신경계 내에 폭 넓게 분포하면서 신경 활동을 조절하며, 특히 퇴행성 뇌 질환 및 병태생리학적 장애와 밀접한 관련이 있다. 예를 들어, GABA B 수용체의 과발현은 다운 증후군(Tyler K. et al., J. Neurophysiol., 97:892-900, 2007), 비정형 결신발작(Stewart LS, et al., Epilepsy Behav., 14(4):577-81, 2009), 알츠하이머(Palop JJ, et al., Neuron, 55: 697??711, 2007; Williams C., et al., PLoS One., 4(3):e4936, 2009), 우울증(Slattery DA., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 312(1):290-6, 2004) 등에 관련된다는 것이 알려져 있다.

안토시안닌의 신경 보호효과에 대해서는 다양한 문헌을 통하여 공개된 바 있으나(Tarozzi et al., Neurosci Lett. 424(1):36-40, 2007; Chen et al., Neurotox Res. 17(1):91-101, 2010), 이의 구체적인 보호기작에 대해서 규명된 바가 없는 실정이다.

종래의 안토시아닌의 신경보호효과에 대해서 다양한 문헌을 통해서 입증된 바 있으나, 이의 구체적인 신호전달 기작과 관련되어서는 규명되지 않았으며, 더욱이 이러한 신경보호효과와 GABAB 수용체와의 관련성에 대해서는 규명된 바 없다.

본 발명은 구체적인 신호기작을 규명함으로써, 안토시아닌의 신경보호효과를 현저하게 상승시킴으로써 우수한 신경질환 치료제, 이를 포함하는 건강기능성 조성물 및 신경보호 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 안토시아닌(anthocyanin) 및 GABA(gamma-aminobutyric acid) B 수용체 작용제(agonist)를 유효성분으로 포함하는, 신경질환의 예방 및 치료용 조성물이 제공된다.

상기 조성물에 있어서, 상기 GABA B 수용체 작용제는 바클로펜(baclofen), 1,4-부탄다이올(1,4-Butanediol ), GBL(γ-Butyrolactone), GHB(γ-Hydroxybutyric acid), GHV(γ-Hydroxyvaleric acid), GVL(γ-Valerolactone), 레소가베란(lesogaberan), 페니부트(phenibut)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상일 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, HIV 치매, 간질, 정신분열증, 우울증, 조울증, 신경발생장애, 자폐증, 뇌졸중, 루게릭, 헌팅턴병 및 다발성경화증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상일 수 있다.

상기 조성물에 있어서, 상기 안토시아닌은 식물로부터 분리 추출된 것 또는 화학적으로 합성된 것일 수 있고, 상기 식물은 안토시아닌을 생성하는 그 어떠한 식물일 수 있으며, 예를 들어 검은콩(black bean), 블랙커런트(black currant), 초크베리(chokeberry), 블랙 초크베리(black chokeberry), 크랜베리(cranberry), 오디, 체리, 산딸기, 블루베리, 블랙베리, 가지, 아사이(acai), 머루 또는 포도일 수 있다.

이때, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 바람직하게는 안토시아닌(anthocyanin) 및 GABA(gamma-aminobutyric acid) B 수용체 작용제(agonist)를 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

또한, 추가로 GABA B 수용체 작용제(agonist)와 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있으나, 상기 유효성분의 함량을 초과하지 않는 것이 바람직하다.

상기 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 비경구 투여시 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 조사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 각각의 경구용 조성물은 제약상 허용되는 담체를 비롯한 불활성 성분을 추가로 포함한다.

실제 사용에 있어서, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물은 통상적인 제약 조제 기술에 따른 제약 담체와 조합될 수 있다. 담체는, 예를 들어 경구 또는 (정맥내 투여를 비롯한) 비경구 투여에 바람직한 제조에 따라 광범위하게 다양한 형태를 지닐 수 있다.

아울러, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 신경보호용 조성물을 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 안토시아닌의 신경세포 보호효과가 GABA1R을 매개로 일어남을 입증한 결과로서, 도 1a는 세포사멸성 단백질의 발현수준을 웨스턴 블랏 분석을 이용하여 분석한 결과이며, 도 1b는 상기 도 1a의 결과 가운데 Bax 단백질의 발현을 Bcl-2 발현수준에 대비하여 정량적으로 나타낸 그래프이며, 도 1c는 상기 도 1a의 결과에서 beta-actin 발현 수준 대비 Bax, Bcl-2, caspase-3 및 PARP-1 의 발현 수준을 정량적으로 나타난 그래프이다.
도 2는 세포사멸 분석 방법을 이용한 본 발명의 일 실시예에 따른 안토시아닌의 신경세포 보호효과를 입증한 결과로서, 도 2a는 FACS 분석 결과를 나타내며, 도 2b는 상기 도 2a의 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 3은 세포 형태학적 분석방법을 이용한 안토시아닌의 보호 효과 분석 사진이다.
도 4는 에탄올 유도의 세포사멸 시, GABAB1R 및 이의 하위 신호전달 기작을 분석한 결과로서, 도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 GABAB1R siRNA 처리에 의한 GABA1R 발현 수준 감소를 웨스턴 블랏을 이용하여 분석한 결과이며, 도 4b는 GABAB1R siRNA와 함께 GABAB1R의 작용제(agonist) 또는 억제제(antagonist) 병용 처리에 의한 GABAB1R 발현 수준의 변화를 웨스턴 블랏 분석 방법을 이용하여 분석한 결과이다.
도 5는 안토시아닌의 신경세포 보호 기작에 있어서, GABAB1R 하위 신호 변화를 분석한 결과로서, 도 5a는 웨스턴 블랏 분석을 이용하여 하위 신호물질의 발현 수준을 확인한 결과이며, 도 5b는 상기 도 5a의 결과를 정량적으로 나타낸 그래프이다.
도 6은 에탄올 유도의 Ca²⁺ 항상성 변화에 대한 안토시아닌의 보호기작 분석한 결과이다.
도 7은 에탄올 유도의 미토콘드리아 막 전위(ΔΨM) 이상에 대한 안토시아닌의 보호기작 분석한 결과로서, 도 7a는 유세포 분석기를 이용하여 분석한 결과이며, 도 7b는 상기 도 7a 결과를 정량화한 그래프이다.

본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.

본 명세서에서 사용된 "제약상 허용된 담체"란 조성물, 구체적으로 의약 조성물의 활성 물질을 제외한 성분을 지칭하는 용어이다. 제약상 허용되는 담체의 예로는 결합제, 붕해제, 희석제, 충진제, 활택제, 가용화제 또는 유화제 및 염이 포함된다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 동물사육

암컷(n=10) 스프래그 다우리(Sparague-Dawley) 랫트 (250 g, 경상대학교, 신경생물학 실험실)는 온도가 조절되며, 명주기(8:00-20:00), 자유식이 조건에서 사육하였다. 수정된 날을 임신 0.5일로 계산하고, 임신 후 17.5일(GD 17.5일)째에 정맥으로 펜토바르비탈 나트륨(pentobarbital sodium)을 3 mg/100 g 체중의 비율로 투여한 후, 머리를 절단(decapitation)하여 희생시켰다. 모든 실험과정은 경상대학교 생물학과의 응용 생물 과학부 동물 윤리 위원회(IACUC, animal ethics committee)로부터 승인을 받았다.

실시예 2: 1차 해마 세포의 배양(primary cell culture)

상기 실시예 1에서 희생시킨 임신 암컷 스프래그 다우리 랫트로부터 얻은 GD 17.5일 된 배아의 해마 조직을 분리하였다. 상기 분리된 해마 조직은 0.25% 트립신 EDTA를 20분 동안 처리하고, 차가운 칼슘과 마그네슘이 포함되지 않은 pH 7.4의 행크 버퍼(Hank's buffer)에서 물리적으로 조직을 세포 단위로 분리시킨 후, 원심분리를 수행하였다. 그 후, 10% 가열 비활성화한 우 태아 혈청, 1 mM 피루베이트(pyruvate), 4.2 mM 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate), 20 mM HEPES, 0.3 g/L 소 혈청 알부민(bovine serum albumin), 50 U/mL 페니실린(penicillin), 및 50 mg/L 스트렙토마이신(streptomycin)을 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 배지에서 재현탁하였고, 0.02 g/L 폴리라이신(poly-lysine)으로 코팅된 세포 배양 플레이트 또는 챔버(chamber) 슬라이드에 1x10⁶ 세포/ml의 비율로 심었다. 세포는 5% CO₂ 조건의 습기가 있는 37℃ 조건에서 배양되었다. 신경아교세포(Neuroglia)가 배양되지 못하도록, 100 μM 시토신 β-D-아라비노 퓨라노사이드 (cytosine β-D-Arabino Furanoside, Sigma, USA)를 첨가한 배지에 12시간 동안 배양하였다. 12시간이 경과한 후, 상술한 배지로 교환하였다.

실시예 3: GABAB1R siRNA 합성

GABAB1R cDNA 플라스미드(Novartis Pharma, Basel, Switzerland)를 XbaI 및EcoRI을 이용하여 절단한 후, pCI 벡터로부터 인서트(insert)를 분리하였다. GABAB1R cDNA 증폭에 사용된 PCR 프라이머는 하기와 같으며, T7 프로모터 서열을 5'말단에 위치하도록 제작하였다:

서열번호 1: 5'-CGGTAATACGACTCACTATAGGGAGACGCTACCATCCAACAGACCA-3'; 및

서열번호 2: 5'-GCGTAATACGACTCACTATAGGGAGATCCTGTGAGCTCATGTTGGAA-3'.

상기 PCR 반응은 1,096 bp 내지 1,516 bp 크기의 GABAB1R cDNA로부터 가장 휴지 활성(silencing activity)이 높은 420 bp의 단편을 증폭하였다. 상기 PCR 산물을 dsDNS 합성을 위한 주형으로 삼았으며, MEGA script^® RNAi 키트(Ambion, Austin, TX, USA)를 이용하여 합성하였다. 그 후, 형질도입을 위한 짧은 길이의 단편을 ShortCut RNAi 키트(New England Biolabs, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 처리하였다.

상기 과정을 통하여 제조된 siRNA는 리포좀(Liposome) 용액 (DMEM containing Lipofectamine2000^TM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 동량의 dsRNAs(21 bp)을 각각 상온에서 5분 동안 방치한 후, 혼합하여 20분 동안 반응시켰다. 상기 혼합물을 세포(1×10⁶ cells/ml)에 첨가하였으며, 이때 상기 세포는 24시간 동안 항생제 및 혈청이 미포함된 DMEM 배지에서 결핍(starving)시켰으며, 이때 최종적으로 40 nM siRNA 농도가 되도록 DMEM 배지를 첨가하였다. 이에 대한 음성 대조군으로 이용한 siRNA는 Qiagen에서 구매하였다. 또한 음성 대조군 siRNA를 Qiagen으로부터 구매하였다.

실시예 4: 안토시아닌의 추출

본 발명의 일 실시예에 사용되는 안토시아닌(anthocyanin)은 경상대학교 노업연구소에서 제공한 한국 검은 콩으로부터 추출하였다.

안토시아닌을 추출하기 위하여, 우선 검은콩 1,500 g을 95% 메탄올/1% HCl 1,500 ml에서 암조건, 상온에서 72시간 동안 교반하는 과정을 3회 반복하며 추출하였다. 상기 메탄올 추출물은 회전증발기(rotary evaporator)를 이용하여 농축하여 150 mL로 만든 후, XAD-7 컬럼에 로딩하였다. 그 후, 상기 용출액이 은은한 붉은색이 될 때까지 증류수를 이용하여 세척하였다. 그 후, 상기 컬럼의 최하단 1cm 층을 제외한 부분이 보라색으로 변할 때까지 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 이용하여 세척하였다. 그 후, 전체 컬럼의 색이 붉은색이 될 때까지, 95% 메탄올/1% HCL을 상기 컬럼에 넣어 안토시아닌을 용출시켰다. 안토시아닌을 포함하는 상기 용출액을 회전증발기(rotary evaporator)를 이용하여 100 ml로 만든 후, 0.45 μm 필터를 이용하여 미세물질을 제거하였다. 상기 안토시아닌 농축액을 세파덱스(Sephadex) 컬럼에 로딩하고, 50% 메탄올/50% 증류수/1% HCl 용액을 이용하여 붉은색 용출액 800~1,000 ml을 수득할 때까지 용출하였다. 상기 붉은색 안토시아닌 용출액을 회전증발기를 이용하여 증발시켜 건조시킨 후, 수득된 안토시아닌 파우더를 하기 실험에 이용하기 직전까지 -20℃에 보관하였다.

실험예 1: 에탄올 유도의 세포사멸에 대한 안토시아닌의 보호기작 분석

1-1: 에탄올 유도의 세포사멸 수준 분석

본 발명의 일 실시예에 따른 안토시아닌이 에탄올에 의하여 유도되는 세포사멸 억제 효과를 분석하기 위하여, 상기 실시예 2의 1차 해마 세포에 실험군에 따른 처리 이후, 세포사멸 마커 단백질 수준을 웨스턴 블랏을 이용하여 측정하였다(대조군(C); 100 mM 에탄올(E); 0.1 mg/mL 안토시아닌(An); 100 mM 에탄올 + 0.1 mg/mL 안토시아닌(E+An); 100 mM 에탄올 + 40 nM GABAB1R siRNA(E+siRNA); 및 100 mM 에탄올 + 0.1 mg/mL 안토시아닌 + 40 nM GABAB1R siRNA(E+siRNA+An)). 상기 실험군에 있어서, 처리 순서는 siRNA를 세포에 형질도입하고, 48시간이 경과한 후, 정상배지로 교환하고 에탄올 및/또는 안토시아닌을 상기 기재된 순서대로 각각 20분 동안 반응시켰다.

그 후, 상기 세포를 세포 용해 버퍼(Cell Signaling no. 9803, Danvers, MA, USA)를 이용하여 용해시킨 후, 세포 용해물을 4℃, 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리를 2회 수행하여 상층액을 분리하였다. 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 분석 키트를 이용하여 측정하였다. 전체 단백질 30 μg을 12% SDS-폴리아클리아마이드 젤에 로딩하여 분리한 후, PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인에 이동시킨 후, 1차 항체를 이용하여 반응시켰다(Ullah N, et al., Neuropharmacology 61:1248-1255, 2011). 사용한 1차 항체는 하기와 같다: 기니아-피그 항-랫 GABAB1R (1:500 dilution, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), 토끼 항-랫 PKA-α(1:500 dilution, Santa Cruz Biotechnology), 토끼 항-랫 CaMKII(1:500 dilution, Cell Signaling). 토끼 항-랫 p-CREB(1:500 dilution, Cell Signaling). Bax 및 Bcl-2 토끼 항-랫(1:500 dilution, Santa Cruz Biotechnology), PARP-1(1:500 dilution, Santa Cruz Biotechnology), 토끼 항-랫 케스페이즈(caspase)-3(1:500 dilution, Cell signaling) 또는 항-액틴(actin)(1:1000 dilution, Sigma-Aldrich, Jerusalem, Israel; used as loading control). 1차 항체는 4℃에서 24시간 동안 반응시켰으며, 그 후 상기 블랏을 세척하고, 염소 항-마우스, 마우스 항-염소 또는 염소 항-래빗 IgG HRP를 2차 항체로 이용하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰으며, 그 후 항원을 ECL(enhanced chemiluminescence)(Western blotting detection reagents, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)을 이용하여 검출하였다.

또한, 동일한 멤브레인을 재사용하는 경우에는, 상기 블랏을 스트리핑(stripping)한 후, 새로운 1차 항체를 이용하여 반응시켰다. 이를 위해서, 구체적으로 0.1%(v/v) Tween-20을 포함하는 TBS(Tris-buffered saline) 용액인 TBST를 이용하여 멤브레인을 세척한 후, 상기 멤브레인을 ReBlot Plus Strong Antibody stripping solution(Millipore, Temecula, CA, USA)을 이용하여 스트리핑(stripping)하였다. 그 후, TBST를 이용하여 5분 동안 4회 세척하고, 새로운 항체를 이용하여 반응시켰다. 웨스턴 블랏 분석은 컴퓨터 기반의 Sigma Gel system(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 밴드의 진하기를 분석하였다. 상기 밴드의 진하기는 평균 ± SEM으로 나타냈다.

그 결과, 세포 내 세포 사멸성 단백질인 Bax의 수준은 에탄올에 노출된지 20분 만에 현저하게 증가하였으며, 반면 항-세포사멸성 단백질인 Bcl-2 단백질 수준이 현저하게 감소하였으며, 이러한 감소 수준은 Bax/Bcl-2 수준을 통계학적으로 유의하게 증가시키며(*p<0.05), 현저한 차이를 보였다(도 1 참조).

활성화된 케스페이즈 3에 의하여 PARP-1가 분리되어 결과적으로 세포사멸 및 괴저성 세포 사멸을 유도한다고 알려져 있다(Sairanen T, et al., Acta Neuropathol. 118:541-552, 2009). 이에, 본 발명자는 활성화된 케스페이즈-3(caspase-3) 및 분리된 PARP-1의 수준을 웨스턴 블랏을 이용하여 측정하였다.

그 결과, 활성화된 케스페이즈-3 수준 및 분리된 PARP-1 수준이 에탄올 처리된 세포에서 관찰되었다(도 1 참조). 상기의 결과는 에탄올에 의하여 세포사멸성 마커 수준 증가, 즉 세포 사멸이 증가한다는 것을 의미한다.

반면, 에탄올 처리 이후, 안토시아닌을 20분 동안 처리하였을 때, 에탄올 처리에 의하여 증가된 Bax 수준 및 감소된 Bcl-2 수준이 회복되며, 보호 효과를 나타냈다. 또한, Bax/Bcl-2 수준을 감소시켰으며, 이는 활성화된 케스페이즈-3 및 분리된 PARP-1 수준의 감소에 의한 것다(도 1 참조). 이러한 결과는 안토시아닌이 에탄올에 의한 세포사멸에 대한 보호효과가 있음을 입증하는 것이다.

1-2: 세포사멸 분석방법을 이용한 안토시아닌의 보호 효과 분석

이어, 본 발명자는 안토시아닌이 에탄올 유도의 세포사멸에 대하여 보호효과를 나타내는지의 여부를 세포사멸 분석 방법을 이용하여 확인하였다.

실시예 2의 1차 해마 세포를 하기 실험군에 따른 약물을 처리한 후, 세포사멸 분석을 수행하였다(대조군(C); 100 mM 에탄올(E); 50 μM 바클로펜(baclofen, Ba); 0.1 mg/mL 안토시아닌(anthocyanins, An); 100 mM 에탄올 + 0.1 mg/mL 안토시아닌(E+An); 100 mM 에탄올 + 40 nM GABAB1R siRNA(E+siRNA); 및 100 mM 에탄올 + 0.1 mg/mL 안토시아닌 + 40 nM GABAB1R siRNA(E+siRNA+An)). 상기 실험군 가운데, siRNA를 형질도입하지 않은 C, E, Ba, An, 및 E+An 군은 siRNA를 전달하는데 이용한 비히클(vehicle)을 처리하였다. 상기 실험군에 따른 처리는 siRNA 형질감염 48시간 이후 수행하였다. 각 실험군에 있어서 처리 순서는 에탄올 처리 20분 후, 37℃에서 안토시아닌을 20분 동안 처리하였다. 막대 그래프는 각 실험군에 있어서 사멸된 세포의 비율을 나타낸다. 데이터는 3개의 각각의 플레이트에서 수행한 3회의 반복된 실험 결과의 평균으로 나타냈다. M1은 유사분열 과정에서 세포 주기 정지 시기(cell cycle arrest phase)를 의미한다. *는 대조군 대비 p< 0.05인 것을 의미하며, #은 에탄올 처리군 대비 p< 0.05인 것을 의미한다.

상기 세포를 수득한 후, 100 μl PBS에서 재현탁한 후, 1 mL 70% 에탄올(-20℃)에서 고정하고, PBS로 세척하였다. 각각의 펠렛을 1 mg/mL RNase를 포함하는 250 μl PBS에서 재현탁하고, 아이스 위에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후, 상온에서 250 μl PI(Propidium iodide) 용액과 30분 동안 반응시킨 후, 상기 세포를 FACS 분석에 이용하였다.

그 결과, 에탄올 처리된 군의 사멸된 세포의 비율을 대조군 및 형질감겸왼 군에 비하여 비-형질감염된 군에서 현저하게 높게 나타났다(도 2 참조). 에탄올 처리에 이어 안토시아닌을 20분을 처리하였을 때, 비-형질감염된 군에서 세포사멸된 세포의 비율이 현저하게 감소하였다. 그러나 GABAB1R siRNA가 형질도입된 군에서는 이와 같은 효과가 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 안토시아닌의 세포 보호 효과에 있어서 GABAB1R이 필수적으로 요구된다는 것을 의미한다.

1-3: 세포 형태학적 분석방법을 이용한 안토시아닌의 보호 효과 분석

세포사멸 수준을 측정하기 위하여, 형태학적인 분석을 수행하였다. 본 발명자는 FJB(Fluoro-Jade-B) 및 PI(Propidium iodide)를 이용하여 세포를 분석하였다. FJB(Flouro-Jade B) 염색은 하기 문헌에 기재된 바에 따라 수행하였다(Ullah, I. et al., BMC Neuroscience 13:11, 2012). GABAB1R siRNA를 형질도입 또는 미도입한 상기 실시예 1의 해마 신경 세포를 폴리-D-라이신(lysine)이 코팅된 챔버(chamber)에서 48시간 동안 반응시켰다. 그 후, 상기 배양된 세포를 각 실험군(대조군(C); 100 mM 에탄올(E); 0.1 mg/mL 안토시아닌(An); 100 mM 에탄올 + 0.1 mg/mL 안토시아닌(E+An); 100 mM 에탄올 + 40 nM GABAB1R siRNA(E+siRNA); 100 mM 에탄올 + 0.1 mg/mL 안토시아닌 + 40 nM GABAB1R siRNA(E+siRNA+An) 및 100 mM 에탄올 + 0.1 mg/mL 안토시아닌 + 50 μM 바클로펜(baclofen, Ba)(E+An+Ba))에 따라 약물을 처리하고, 37℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 상기 실험군 가운데, siRNA를 형질도입하지 않은 C, E, 및 E+An 군은 siRNA를 전달하는데 이용한 비히클(vehicle)을 처리하였다. 상기 E+An+Ba 군에서는 에탄올을 20분 동안 처리한 후, 안토시아닌과 바클로펜을 함께 처리하고 20분 동안 처리하였다.

그 후, 상기 세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에서 5분 동안 고정시킨 후, -70℃에서 실험에 이용되기 전까지 보관하였다. 슬라이드는 공기 중에서 3시간 동안 말렸으며, 그 후, 0.06% 과망간산칼륨(potassium permanganate) 용액에서 10분 반응, 증류수로 세척, 0.0004% FJB(Calbiochem, San Diego, California, USA)를 포함하는 0.1% 아세트산 용액에서 20분 동안 반응한 후, 증류수로 3회 세척하였다. 상기 슬라이드는 55℃에서 10분 동안 건조시켰으며, 그 후, 공초점 현미경의 FITC 필터(Olympus Fluoview FV1000, Japan)를 이용하여 관찰하였다. PI(propidium iodide) 염색을 위해서, 슬라이드를 천천히 PI 용액(1 μg/mL in PBS)에 담궈서 상온 조건에서 20분 동안 반응시키고, PBS에서 10분씩 2회 세척하였다. 유리 커버 슬립(cover slip)을 상기 슬라이드 위에 올려놓고, 공초점 현미경으로 관찰하기 직전에 마운팅 용액(mounting medium)을 올려놓았다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 2의 세포 가운데, 비-형질감염된 세포에서는 에탄올 처리에 의하여 사멸된 세포의 수가 대조군에 비하여 현저하게 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 반면, 에탄올 처리 이후, 20분 동안 안토시아닌을 처리한 세포의 경우, 에탄올만을 단독으로 처리한 세포군에 비하여 현저하게 세포 사멸이 감소되었으며, 이러한 안토시아닌의 세포 보호효과는 바클로펜과 병용처리시(E+An+Ba) 현저하게 나타났다. 이는 안토시아닌의 에탄올 유도의 세포사멸에 대한 보호효과를 재입증함과 동시에, GABAB 작용제와 안토시아닌의 병용처리가 세포 보호효과를 현저하게 증가시킬 수 있음을 입증한 것이다. 반면, 에탄올 처리 후, 안토시아닌 처리 및 GABAB1R siRNA를 형질도입한 세포에서는 세포사멸이 전혀 관찰되지 않았다. 도면상의 하얀색 화살표는 신경세포의 핵을 의미한다. 40배의 배율을 의미하며, 스케일 바(scale bar)는 20 μm을 의미한다.

상기 결과를 요약하면, 에탄올 처리에 의하여 세포사멸 수준이 증가하며, 이는 세포사멸성 단백질의 발현 수준 및 형태학적 분석을 통하여 확인할 수 있었으며, 이에 대하여 안토시아닌이 세포 보호 효과를 나타내고 있으며, 이러한 보호 기작이 GABAB1R을 통하여 수행될 수 있음을 GABAB1R siRNA 또는 GABAB1R 작용제를 안토시아닌과 함께 처리함으로써 입증하였다. 즉, GABAB1R이 안토시아닌의 세포 보호 기작에 필수적으로 요구되며, 안토시아닌과 GABAB1R 작용제의 병용처리가 보호효과를 현저하게 증가시킬 수 있음을 최초로 입증한 결과이다.

실험예 2: 에탄올 유도의 세포사멸시 GABAB1R 및 이의 하위 신호전달 기작 분석

2-1: GABAB1R 발현 수준의 분석

에탄올 유도의 세포사멸 기작을 규명하기 위하여, 본 발명자는 GABAB1R 단백질의 발현 수준이 및 이의 하위 신호전달 분자의 발현을 분석하였다.

우선, 실시예 2의 1차 해마 세포에 GABAB1R siRNA를 처리한 후, GABAB1R 단백질의 발현 수준을 확인하였다. 이에 대한 대조군으로는 대조군 siRNA를 처리하였다. 그 결과, 도 2에 나탄나 바와 같이, 상기 실시예 2의 1차 해마 세포에 GABAB1R siRNA를 형질도입시킨 후, 웨스턴 블랏을 통하여 GABAB1R의 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이에 대한 대조군 siRNA를 도입한 세포에서는 GABAB1R의 수준에 변과가 관찰되지 않았다(도 4a 참조).

이어, 본 발명자는 GABAB1R siRNA를 해마 세포에 형질도입하고 48시간 경과 후, GABAB1R 작용제(agonist) 또는 억제제(antagonist)를 처리하고 GABAB1R의 발현 수준변화를 관찰하였다. GABAB1R 작용제인 바클로펜(baclofen, Ba) 50 μM, 억제제인 파클로펜(phaclofen) 100 μM을 37℃, 20분 동안 처리한 후, GABAB1R의 발현 수준을 웨스턴 블랏을 통하여 확인하였다.

그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, GABAB1R siRNA 처리에 의하여 감소된 GABAB1R 수준이 바클로펜(baclofen)에 의하여 GABAB1R의 발현 수준이 다소 증가하였으며, 파클로펜 처리에 의하여 GABAB1R의 발현 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 4b 참조).

2-2: GABAB1R 하위 신호전달 분석

안토시아닌에 의하여 에탄올 처리에 의한 GABAB1R 및 GABAB1R 하위 신호단계에 미치는 효과를 상쇄시키는 것을 상기 실시예 2의 1차 해마세포로부터 추출한 단백질을 이용하여 확인하였다. 이때, 실험군은 하기와 같다(대조군(C); 100 mM 에탄올(E); 50 μM 바클로펜(baclofen, Ba); 0.1 mg/mL 안토시아닌(anthocyanins, An); 100 mM 에탄올 + 0.1 mg/mL 안토시아닌(E+An); 100 mM 에탄올 + 40 nM GABAB1R siRNA(E+siRNA); 및 100 mM 에탄올 + 0.1 mg/mL 안토시아닌 + 40 nM GABAB1R siRNA(E+siRNA+An)).

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 2의 1차 해마 세포는 에탄올 처리는 GABAB1R의 수준을 증가시켰으며, 이의 하위 신호전달 분자인 CaMKII 및 p-CREB의 발현 수준을 현저하게 증가시켰으나, PKA-α는 그 발현을 증가시켰다. 또한, 에탄올+안토시아닌 처리군에서는 에탄올 처리 군에 비하여 GABAB1R, CaMKII 및 p-CREB 수준이 낮았으나, PKA-α 수준은 높게 나타났다. 이러한 결과는 안토시아닌이 에탄올 유도의 신호전달을 과정을 방해하는 것을 의미한다. 이때, GABAB1R에 대한 작용제로 바클로펜(baclofen)을 비교를 위하여 처리하였다(도 5 참조).

실험예 3: 에탄올 유도의 Ca2+ 항상성 변화에 대한 안토시아닌의 보호기작 분석

Ca²⁺ 항상성은 신경전달물질의 방출 및 신경세포의 발달에 있어서 중요한 역할을 수행하며, 항상성이 유지되지 않을 시에는 신경세포의 사멸이 유도된다고 알려져 있다. 에탄올에 의하여 유도된 신경독성은 세포 내 Ca²⁺ 농도 조절의 이상과 관련되어 있다고 알려져 있다(Naseer MI, et al., Synapse, 64:181-190, 2010).

세포 내 자유 Ca²⁺ 농도를 약물 처리 또는 미처리 조건 하에서 형광 Ca2+ 검출기인, Fura-2AM(fura-2 acetoxymethyl ester)를 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 1×10⁶ 세포에 각 실험군에 따른 약물 및 siRNA를 처리하였으며, 3회 반복 실험하였다(대조군(C); 100 mM 에탄올 (E); 50 μM 바클로펜(baclofen, Ba); 0.1 mg/mL 안토시아닌(anthocyanins, An); 100 mM 에탄올 + 0.1 mg/mL 안토시아닌(E+An); 100 mM 에탄올 + 40 nM GABAB1R siRNA(E+siRNA); 및 100 mM 에탄올 + 0.1 mg/mL 안토시아닌 + 40 nM GABAB1R siRNA(E+siRNA+An)). 상기 실험군 가운데, siRNA를 형질도입하지 않은 C, E, Ba, An, 및 E+An 군은 siRNA를 전달하는데 이용한 비히클(vehicle)을 처리하였다. 상기 실험군에 있어서, 처리 순서는 siRNA를 세포에 형질도입하고, 48시간이 경과한 후, 정상배지로 교환하고 에탄올 및/또는 안토시아닌 순서로 각각 20분 동안 반응시켰다. 실험군에 따른 처리 이후, 세포를 크렙(Krebs) 버퍼를 이용하여 2회 세척하고, 습기가 있는, 37℃, 5% 이산화탄소를 포함하고 있는 배양기에서 5 μM Fura-2AM를 포함하는 DMEM 배지에서 60분 동안 배양하였다. 그 후, 상기 세포는 Locke's 용액(pH 7.8)을 이용하여 2회 세척하고, Ca²⁺의 Fura-2AM 형광 신호를 340 nm ~ 380 nm 여기 파장 및 510 nm의 방출 파장의 발광 광도계(LS50B, Perkin Elmer, Boston, MA)를 이용하여 측정하였다. 상기 340 nm/380 nm 형광 비율을 2초 시간 간격을 기준으로 평균화하여 관찰하였다. 수득된 형광 신호를 일반적인 이미징 소프트웨어를 구비한 컴퓨터 또는 origin 7 소프트웨어를 구비한 MicroVAX II 컴퓨터를 이용하여 분석하였다. 세포 내 칼슘 농도는 하기 수학식 1의 Grynkiewicz 식을 이용하여 계산하였다(Grynkyewicz G, et al., J. Biol. Chem., 260:3440-3450, 1985).

상기 수학식 1에서 Kd는 Fura-2AM Ca²⁺ 결합의 해리 상수로서, 세포질 내 환경에서 225 nM 로 산출되었으며, R은 340 nm/380 nm 형광비율을 의미하며; Rmin은 Ca²⁺의 세포질내 농도가 0일 때의 R 값을 의미하고, Rmax는 Ca²⁺이 포화상태일 때(염화칼슘 이용)의 R 값을 의미하며, Sf2는 Ca²⁺의 세포질내 농도가 0일 때 380 nm에서의 파장을 의미하며; Sb2는 포화된 Ca²⁺에 대한 380 nm에서의 파장을 의미한다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 비-형질감염 군에서 20분 동안 에탄올 처리에 의하여 Ca²⁺ 농도가 대조군에 비하여 현저하게 증가하였다. 비-형질감염 군에 있어서, 에탄올에 의한 Ca²⁺ 농도의 증가가 에탄올 처리 이후, 안토시아닌을 20분 동안 처리하였을 때, 전혀 관찰되지 않았다(도 6 참조). 이러한 안토시아닌의 에탄올 유도의 Ca²⁺ 증가에 대한 보호 효과는 GABAB1R siRNA를 처리한 군에서는 나타나지 않았으며, 이러한 결과는 안토시아닌의 신경세포 보호효과에 있어서, GABAB1R이 필수적으로 요구된다는 것을 의미한다.

또한, GABAB1R 작용제인 바클로펜(baclofen)은 세포 내 Ca²⁺의 농도를 감소시켰다. 이러한 결과는 에탄올이 세포 내 Ca²⁺ 농도를 증가시키는 반면, 안토시아닌은 이러한 증가효과를 저해하며, 이는 GABAB1R을 통하여 나타난다는 것을 입증하는 것이며, 종합하면 안토시아닌이 에탄올 유도의 세포 사멸에 대하여 보호효과를 제공할 수 있음을 시사하는 것이다.

실험예 4: 에탄올 유도의 미토콘드리아 막 전위( Δ ΨM) 이상에 대한 안토시아닌의 보호기작 분석

에탄올에 의한 세포 내 Ca²⁺ 수준의 비정상적인 증가는 미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential, ΔΨM)를 손상시켰으며, 이러한 손상은 사이토크롬 c(cytochrome-c)를 방출시켜, 결과적으로 세포사멸 신호기작을 활성화시킨다고 알려져 있다(Simasko MS, et al., Brain Res., 824:89-96, 1999).

실시예 2의 1차 해마세포를 하기 실험군에 따른 약물을 처리한 후, 세포사멸 분석을 수행하였다(대조군(C); 100 mM 에탄올(E); 0.1 mg/mL 안토시아닌(anthocyanins, An); 100 mM 에탄올 + 0.1 mg/mL 안토시아닌(E+An); 100 mM 에탄올 + 40 nM GABAB1R siRNA(E+siRNA); 및 100 mM 에탄올 + 0.1 mg/mL 안토시아닌 + 40 nM GABAB1R siRNA(E+siRNA+An)). 상기 실험군 가운데, siRNA를 형질도입하지 않은 C, E, An 및 E+An 군은 siRNA를 전달하는데 이용한 비히클(vehicle)을 처리하였다. 상기 실험군에 따른 처리는 siRNA 형질감염 48시간 이후 수행하였다. 각 실험군에 있어서 처리 순서는 에탄올 처리 20분 후, 37℃에서 안토시아닌을 20분 동안 처리하였다. 데이터는 3개의 각각의 플레이트에서 수행한 3회의 반복된 실험 결과의 평균으로 나타냈다. M1은 유사분열 과정에서 세포 주기 정지 시기(cell cycle arrest phase)를 의미한다. *는 대조군 대비 p < 0.05인 것을 의미하며, #은 에탄올 처리군 대비 p < 0.05인 것을 의미한다.

미토콘드리아 막 전위(ΔΨm)는 JC-1 미토콘드리아 막 전위 검출 키트(Biotium Inc., Hayward, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 상기 실시예 1의 GD 17.5 해마 세포에 siGABAB1R RNA를 형질도입 또는 미도입한 후, 실험군에 따라 약물을 처리하였다. 그 후, 상기 세포를 수득하고 JC-1 약물을 이용하여 37℃에서 15분 동안 세포를 염색하고, 1×분석 버퍼를 이용하여 2회 세척하고, FACS 분석(FACSCalibur Flow Cytometer; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)을 위해 0.5 ml에서 재현탁하였다. 분석은 3회 반복하였으며, JC-1은 정상의 분극화된(polarized) 미토콘드리아 내에서 응집화되며, 590 nm 파장에서 적색 형광을 방출한다는 것이 알려져 있다. 탈분극화된 미토콘드리아로부터 빠져나온 JC-1 단일체는 530 nm에서 녹색 형광을 방출한다. 상기 적색 및 녹색 형광은 유세포 분석기에서 각각 FL-1(녹색) 및 FL-2(적색) 채널에서 측정하였다. 그 후, 상기 세포는 형광 및 로다민(rhodamine) 염료를 동시에 검출할 수 있도록 고안된 형광 현미경에서 "이중 밴드 패스" 필터를 이용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 에탄올 처리된 비-형질감염된 군에서는 낮은 미토콘드리아 막 전위를 가진 세포의 비율(24.04%)이 대조군(11.56%)에 비하여 높았다. 에탄올 처리에 이어 안토시아닌을 20분 동안 더 처리한 군은 미토콘드리아 막전위가 낮은 세포의 비율이 에탄올만을 처리한 군에 비하여 매우 낮았다(15.86%). 이러한 결과는 안토시아닌이 에탄올의 독성을 억제시킨다는 것을 의미한다. 반면, GABAB1R siRNA가 형질도입된 세포에 있어서, 안토시아닌은 미토콘드리아 막 전위를 정상으로 회복시키는 효과를 나타내지 못하였다(도 4 참조). 즉, 안토시아닌의 미토콘드리아 막 전위 회복 효과는 GABAB1R을 통하여 나타난다는 것을 시사한다.

본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Therapeutic agent for treating neuropsychiatric disorders comprising anthocyanin and GABAB receptor agonist <130> PD13-0777 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 1 cggtaatacg actcactata gggagacgct accatccaac agacca 46 <210> 2 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 2 gcgtaatacg actcactata gggagatcct gtgagctcat gttggaa 47

Claims

검은콩으로부터 추출된 안토시아닌(anthocyanin); 및 바클로펜(baclofen)를 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, HIV 치매, 간질, 정신분열증, 우울증, 조울증, 신경발생장애, 자폐증, 뇌졸중, 루게릭, 헌팅턴병 및 다발성경화증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 신경질환의 예방 및 치료용 조성물에서,
상기 검은콩으로부터 추출된 안토시아닌(anthocyanin)은 검은콩을 95% 메탄올/1% HCl에서 암조건, 상온에서 72시간 동안 교반하는 과정을 3회 반복하며 추출하는 1단계;
상기 검은콩 추출물을 회전증발기(rotary evaporator)를 이용하여 농축하며, 컬럼에 로딩하는 2단계;
상기 2단계의 용출액이 붉은색이 될 때까지 증류수를 이용하여 세척한 후, 상기 컬럼의 최하단 1cm 층을 제외한 부분이 보라색으로 변할 때까지 에틸 아세테이트(ethyl acetate)를 이용하여 세척하는 3단계;
그 후, 전체 컬럼의 색이 붉은색이 될 때까지, 95% 메탄올/1% HCL을 상기 컬럼에 넣어 안토시아닌을 용출시키는 4단계;
안토시아닌을 포함하는 상기 용출액을 회전증발기(rotary evaporator) 및 0.45 μm 필터를 이용하여 미세물질을 제거하는 5단계;
상기 안토시아닌 농축액을 컬럼에 로딩하고, 50% 메탄올/50% 증류수/1% HCl 용액을 이용하여 붉은색 용출액 800 내지 1,000 ml을 수득할 때까지 용출하는 6단계;
및 상기 붉은색 안토시아닌 용출액을 회전증발기를 이용하여 증발시켜서 건조된 안토시아닌 파우더를 수득하는 7단계를 통해 얻어진 안토시아닌이며,
상기 조성물은 에탄올에 의한 신경세포 손상을 보호하는 것을 특징으로 하는, 신경질환의 예방 및 치료용 조성물.
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