KR102142479B1

KR102142479B1 - 세포 압출기 및 세포 압출방법

Info

Publication number: KR102142479B1
Application number: KR1020200003134A
Authority: KR
Inventors: 김세희; 이지은; 배신규; 이지혜; 박진희
Original assignee: 주식회사 엠디뮨
Priority date: 2020-01-09
Filing date: 2020-01-09
Publication date: 2020-08-07
Also published as: EP4089160A1; EP4089160A4; US20230033198A1; WO2021141207A1

Abstract

본 발명의 세포 압출기는, 시료가 분주되는 압력용기; 상기 압력용기로 주입되는 질소가스의 설정압력을 조정 후 정압을 유지하는 레귤레이터; 상기 압력용기로의 질소가스의 주입을 개폐하는 입력밸브; 상기 압력용기의 내부 압력을 제거하는 배기밸브; 시약이 적셔진 멤브레인 필터를 구비하여 상기 압력용기의 시료가 질소가스에 의해 압송되어 통과하며 시료를 미세소포체 사이즈로 잘게 부수는 필터홀더; 및 압출된 시료가 보관되는 수집용기를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 레귤레이터에 의해 압력 조절이 자유로운 효과가 있다. 즉, 압력에 따른 membrane의 flow rate을 조절할 수 있어 세포외소포체 압출기의 바이오제약 생산방법의 벨리데이션 (validation)이 가능하다. 또한, 세포 압출시 신터디스크를 제거하고 멤브레인 (membrane) 만으로 압출하고 신터디스크가 필요없는 미세압력 조절 범위 내에서 (멤브레인 (membrane)이 찢어지지 않은 미세한 저 압력) 베지클 생산이 가능하다.

Description

세포 압출기 및 세포 압출방법 {Cell extruder and Cell extrusion method}

본 발명은 세포 압출기 및 세포 압출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포로부터 미세소포체를 압출 할 수 있는 세포 압출기 및 세포 압출방법에 관한 것이다.

미세소포체 (Extracellular Vesicle, EV)는 일반적으로 세포에서 분비되는 이중 지질막 구조의 물질을 의미한다. 일반적으로 EV(Extracellular Vesicle,　미세소포체)는 크게 3가지 종류가 있으며, mircrovesicle, exosome, apoptic bodies로 구성되어 있으며, 각각 생겨나는 origin 및 biogenesis, 효능 및 역할에 따라 나뉜다.

이러한 미세소포체는 최근 진단 및 치료 분야에서 활발히 기술개발이 이루어지고 있는 상황이다.

그러나, 세포가 분비하는 미세소포체는 그 양이 상당히 적어, 임상사용을 위한 개발 및 상용화, 사업화에 많은 제한이 존재하는 바 최근에는 이러한 미세소포체를 미믹(mimicking)하는 연구가 활발히 진행 중이다.

본 발명의 출원인은 세포로부터 미세소포체를 인공적으로 제조 하는 기술 (등록특허 제1314868호 "포유류의 유핵세포에서 유래된 마이크로베시클 및 이의 용도")을 보유하고 있으며, 줄기세포 및 면역세포유래 인공엑소좀을 이용한 치료제를 개발하고 있다.

그러나, 종래에는 세포 전용의 압출기가 존재하지 않으며, 종래 존재하는 리피솜 압출기를 이용하는 경우에는 다음과 같은 문제점이 있다.

첫째, 미세압력 조절이 용이하지 않은 문제점 있다.

즉, 미세 압력이 조절되지 않으면 미세소포체를 제조하는 경우 소포체 형성이 잘 되지 않고 세포로부터 유래된 소포체의 토폴로지 (topology)가 유지 되지 않아 미세소포체로부터 발휘되는 치료효과를 기대하기가 어렵다.

둘째, 압출되는 부분의 필터 사이즈가 가지고 있는 세포 수용력 (cell capacity)이 불안정하다.

즉, 미세소포체를 제조시 베지클과 세포 잔재물 (cell debris)이 섞여있어 세포수에 따른 멤브레인 (membrane) 수용면적이 정해져 있는데, 종래 기술의 압출기는 멤브레인 (membrane) 수용면적이 베지클 생산에 적합하지 않아 베지클 제조시 멤브레인 (membrane)막히는 현상이 발생하여 제조공정이 용이하지 않다.

셋째, 압출기의 세척이 용이하지 않아 오염이 발생한다.

즉, 종래기술의 압출기는 screw type으로 제조생산되어 GMP 적합기준에 맞지 않다.

넷째, 세포를 잘게 부스는 과정에서 신터 디스크 및 압출기의 구조적인 문제로 인해 압출 경로가 막히는 현상이 발생하였다.

즉, 멤브레인을 서포팅 하는 신터디크스의 경우 세포를 압출시 세포수용 면적에 영향을 미쳐 막히는 현상이 발생하여 베지클 제조시 용이하지 않은 단점이 있다.

다섯째, 식약처 고시에 따라 세포 사용시 생물안전작업대 (BSC; Biological Safety Cabinet)의 내부(100존)에서 핸들링해야하나 종래기술의 압출기의 크기로 인해 사용상 불편함이 따랐다.

따라서, 개선된 형태의 세포 압출기 및 세포 압출방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

한국등록특허 제0293572호(2001.04.04. 등록)

본 발명은 전술한 종래의 제반 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 압력 조절이 자유로운 세포 압출기 및 세포 압출방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 세포 수용력 (cell capacity)를 안정화하는 세포 압출기 및 세포 압출방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 세척이 용이한 세포 압출기 및 세포 압출방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 압출 경로의 막힘 현상을 방지하는 세포 압출기 및 세포 압출방법을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 생물안전작업대에서 취급이 용이한 세포 압출기 및 세포 압출방법을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 세포 압출기는, 시료가 분주되는 압력용기;

상기 압력용기로 주입되는 가스의 설정압력을 조정 후 정압을 유지하는 레귤레이터;

상기 압력용기로의 가스의 주입을 개폐하는 입력밸브;

상기 압력용기의 내부 압력을 제거하는 배기밸브;

멤브레인 필터를 구비하여 상기 압력용기의 시료가 가스에 의해 압송되어 통과하며 시료를 잘게 부수는 필터홀더; 및

압출된 시료가 보관되는 수집용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 압출기를 제공한다.

상기 세포 압출기는 바람직하게는 상기 압력용기의 압력을 측정하는 압력계가 더 구비된 것일 수 있다.

또한, 상기 세포 압출기는 가스의 압력이 다이어프램에 작용하여 설정압력에 도달한 경우에만 필터홀더로의 유로를 개방하는 다이어프램 밸브가 더 구비된 것일 수 있다.

또한, 상기 세포 압출기는 상기 압력용기, 레귤레이터, 입력밸브, 배기밸브, 필터홀더, 수집용기, 압력계 및 다이어프램 밸브는 인접하는 구성과 클램프에 의해 분해 및 조립 가능하게 구성된 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 세포 압출기에서 상기 멤브레인 필터는 공극의 크기가 작아지는 순서로 구비된 것일 수 있다.

상기 멤브레인 필터는 복수개로 공극의 크기가 작아지는 순서로 세포 압출기 내에 동시에 구비될 수 있으며, 크기가 작아지는 순서로 순차적으로 교체하여 구비되는 것일 수 있다.

또한, 상기 압력용기와 필터홀더는 노즐을 구비한 파이프에 의하여 연결되는 것일 수 있으며, 노즐과 필터홀더의 직경의 비율이 중요할 수 있으며, 바람직하게 상기 노즐과 필터홀더의 직경은 1:3 내지 1:30일 수 있다.

상기 가스는 그 종류를 제한하지 않으나, 일 예로서 질소가스, 압축공기, 이산화탄소 및 불활기체로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택된 것일 수 있다.

또한, 상기 세포 압출기는 세포를 포함한 시료에 적용될 수 있으며, 또한, 세포 유래의 미세소포체를 더 작게 압출하는데에 이용될 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기한 세포 압출기를 세포에 적용하는 단계를 포함하는 세포 유래의 미세소포체 제조 방법을 제공한다.

상기 방법은 1) 상기한 세포 압출기에 세포를 포함하는 시료를 제공하는 단계;

2) 상기 1) 단계의 세포 압출기를 구동하여 상기 시료를 압출하는 단계; 및

3) 상기 2) 단계의 압출된 시료를 수득하는 단계를 포함하는 것이다.

상기 2) 단계는

i) 압력 용기로 시료를 분주하는 단계;

ii) 입력 밸브를 개방하여 가스가 압력 용기로 공급되게 하는 단계; 및

iii) 시료가 파이프 내 노즐을 통하여 압력 용기로부터 필터홀더 내에 구비된 멤브레인 필터를 통과하는 단계;

를 포함할 수 있다.

상기 가스는 20 내지 100 psi의 압력으로 공급될 수 있다.

상기 iii) 단계는 시료가 공극 크기가 순차적으로 작아지는 멤브레인 필터를 통과할 수 있으며, 상기 멤브레인 필터는 필터홀더에 동시에 구비되거나, 순차적으로 교체되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기한 방법에 의하여 제조된, 세포 유래 미세 소포체를 제공한다.

상기 세포 유래 미세 소포체는 의약품, 식품 조성물 등에 이용될 수 있으며, 약물 전달을 위한 시스템 (Drug Delivery System, DDS)에 이용될 수도 있다.

본 발명에 따른 세포 압출기에 따르면, 레귤레이터에 의해 압력 조절이 자유로운 효과가 있다. 즉, 압력에 따른 멤브레인 (membrane)의 유량 (flow rate)을 조절할 수 있어 세포외소포체 압출기의 바이오제약 생산방법의 벨리데이션 (validation)이 가능하다.

또한, 세포 압출시 세포 수용력 (cell capacity)를 안정화하여 베지클 형성이 용이하여 베지클 생산량이 증가되고 베지클의 토포로지가 유지되는 장점이 있다.

또한, 본 발명의 구성품의 사이에 클램프를 통해 분리가 가능하여 세척이 용이하다.

또한, 종래와 달리 신터 디스크를 제거한 후 세포수, 미세압력, 멤브레인 (membrane) 수용범위 range를 확립하여 압출 경로의 막힘 현상을 방지한다.

즉, 세포 압출시 신터디스크를 제거하고 멤브레인 (membrane) 만으로 압출하고 신터디스크가 필요없는 미세압력 조절 범위 내에서 (멤브레인 (membrane)이 찢어지지 않은 미세한 저 압력) 베지클 생산이 가능하다.

또한, 본 발명의 세포 압출기는 그 크기를 콤팩트하게 구현하여 한정된 공간인 생물안전작업대에서 취급이 용이하다.

도 1은 본 발명에 따른 세포 압출기를 분해 도시한 부품도이다.
도 2는 도 1의 결합상태를 도시한 구성도이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시 예를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.

도 1은 본 발명에 따른 세포 압출기를 분해 도시한 부품도이고, 도 2는 도 1의 결합상태를 도시한 구성도이다.

도 1 내지 도 2에 도시한 바와 같이, 본 발명에 따른 세포 압출기(A)는, 시료가 분주되는 압력용기(100)와, 상기 압력용기(100)로 주입되는 가스를 설정압력으로 조정 후 정압을 유지하는 레귤레이터(200)와, 상기 압력용기(100)로의 가스의 주입을 개폐하는 입력밸브(300)와, 상기 압력용기의 내부 압력을 제거하는 배기밸브(400)와, 시약이 적셔진 멤브레인 필터를 구비하여 상기 압력용기(100)의 시료가 가스에 의해 압송되어 통과하며 시료를 미세소포체 사이즈로 잘게 부수는 필터홀더(500) 및 압출된 시료가 보관되는 수집용기(600)로 구성된다.

상기 압력용기(100)는 스탠드(150)에 클램핑 후 직립형태로 유지하며, 가스가 입력되는 입력라인(110), 상기 압력용기(100)의 내부 압력을 배출하기 위한 배기라인(120), 시료를 상기 압력용기(100)의 내부로 주입하는 주입라인(130), 상기 압력용기(100)의 내부 압력을 측정하는 압력측정라인(140)이 구비된다.

상기 레귤레이터(200)는 입력압력을 설정압력으로 조정 후 정압을 유지하는 것으로서, 구체적으로 설정압력 이상인 가스를 설정압력으로 조정한 후 정압을 유지한 채로 압력용기(100)에 주입하여 균일한 압력을 시료에 가하여 균일한 품질의 압출물을 얻기 위한 구성이다.

상기 입력밸브(300)는 상기 입력라인(110)에 연결되며, 상기 배기밸브(300)는 배기라인(120)에 연결되어 유로를 개폐하는 공지의 개폐밸브이므로 그 구조에 대한 상세한 설명은 생략하고 동작과 관련해선 후술하는 동작 설명에서 설명한다.

상기 필터홀더(500)는 개폐 구조로 구성되어 있어 내부로 멤브레인 필터를 수용하도록 형성된다. 이때, 상기 멤브레인 필터는 압력용기(100)에서 가스를 통해 압송된 시료를 미세소포체 상태로 잘게 부수게 된다.

상기 가스는 노즐(511)이 구비된 파이프 (510)을 통하여 필터홀더로 공급되며, 상기 노즐과 필터홀더의 직경의 비율은 1:3 내지 1:30이다.

상기 멤브레인 필터는 공극의 크기가 작아지는 순서로 구비될 수 있으며, 세포 압출기 내에 동시에 구비되거나, 순차적으로 교체될 수 있다.

상기 수집용기(600)는 일부가 개구된 용기 형태를 가지며 압출된 시료가 보관된다.

또한, 상기 압력용기(100)의 압력을 측정하는 압력계(700)가 더 구비되어 있어 압력용기의 내부 압력이 설정압력을 유지하는지를 시각적으로 표시해주게 된다. 이때, 상기 압력계(700)는 설정압력 이상이나 이하일 때 알람을 발생하는 기능이 부가될 수도 있다.

그리고, 가스의 압력이 다이어프램에 작용하여 설정압력에 도달한 경우에만 필터홀더(500)로의 유로를 개방하는 다이어프램 밸브(800)가 더 구비된다. 즉, 시료를 압송하는 가스의 압력이 설정압력에 도달하지 않는 경우 시료는 필터홀더(500)로의 이동을 제한하게 된다.

상기 가스는 질소가스, 압축공기, 이산화탄소 및 불활기체로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택된 것일 수 있다.

또한, 상기 배기밸브(400)에 배출단에는 배기필터(900)가 구비된다.

한편, 상기 압력용기(100), 레귤레이터(200), 입력밸브(300), 배기밸브(400), 필터홀더(500), 수집용기(600), 압력계(700), 다이어프램 밸브(800) 및 배기필터(900)는 인접하는 구성과 클램프(101)에 의해 분해 및 조립 가능하여 세척이 용이하다.

더불어, 클램프(101)에 의해 본 발명의 세포 압출기(A)의 전체 크기 및 부피를 적절하게 조절하여 조립이 가능하여 한정된 공간을 가지는 생물안전작업대에서 취급이 용이하다.

또한, 상기 필터홀더(500)에 내장된 멤브레인 필터는 공극의 크기가 작아지는 순서로 필터홀더(500)에 구비되며, 멤브레인 필터는 세포 압출기 내에 동시에 구비되거나, 순차적으로 교체될 수 있다. 일 예로, 상기 멤브레인 필터의 공극 크기는 10㎛, 8㎛, 5㎛인 것이 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 세포 압축기의 동작을 도 1과 도 2를 기준으로 준비, 세팅, 동작 및 세척으로 나눠 설명한다.

준비

1) 47㎜ 디스크홀더가 구비된 본 발명의 세포 압출기

2) 시료(sample) : Adipose derived stem cell (5E+6 cells/㎖, total 20㎖)

3) 시약(reagent) : PBS(PHOSPHATE BUFFERED SALINE)

4) 필요소모품 : 멤브레인 필터(whatman PC membrane filter 10, 8, 5㎛), 파이펫, 페트리접시

세팅

1) 고압증기멸균기(Autoclave)로 멸균 처리된 도 1 내지 도 2의 본 발명의 세포 압출기(A)를 준비한다.

2) 페트리 접시에 시약을 약간 채워 10㎛ 공극 크기의 멤브레인 필터를 적신다.

3) 필터홀더(500)에 시약이 적셔진 멤브레인 필터를 삽입 후 잠근다.

4) 스탠드(150)에 본 발명의 세포 압출기(A)를 차례로 장착한다.

5) 필터홀더(500)의 말단에 샘플용기를 장착한다.

6) 압력계(700)의 전원을 켠다.

7) 레귤레이터(200)에 가스를 공급하는 튜브를 연결한다. 이때, 입력밸브(300)는 폐쇄된 상태이다.

8) 레귤레이터(200)로 가스를 공급하여 가스가 설정압력인 50psi로 유지한다.

동작

1) 압력용기(100)의 주입라인(130)을 개방하여 파이펫을 이용해 시약을 20㎖을 분주한다.

2) 주입라인(130)을 폐쇄하고, 배기밸브(400)를 폐쇄한다.

3) 입력밸브(300)를 열어 압력용기(100)로 가스를 공급한다.

4) 시약이 일정한 속도로 나오지는 확인(validation 방법 : PBS 20㎖ 기준 3초 소요)한다.

5) 상기 4)의 조건을 충족하면 입력밸브(300)를 폐쇄하고 배기밸브(400)를 개방하여 압력용기(100)를 포함하는 본 발명의 세포 압출기(A) 내부의 압력을 제거한다.

6) 압력용기(100)의 주입라인(130)을 개방한다.

7) 파이펫을 이용해 5E+6/㎖ 농도로 total 20㎖가 준비된 시료를 resuspension 후 주입라인(130)을 통해 압력용기(100)에 분주한다.

8) 주입라인(130)을 폐쇄하고 배기밸브(400)를 폐쇄한다.

9) 입력밸브(300)를 개방하여 가스를 압력용기(100)로 공급한다.

10) 시료가 압출되어 나오는지를 확인한다.

11) 입력밸브(130)를 폐쇄하고, 배기밸브(400)를 개방하여 압력용기(100)를 포함하는 본 발명의 세포 압출기(A) 내부의 압력을 제거한다.

12) 압력용기(100)의 주입라인(130)을 다시 개방한다.

13) 파이펫을 이용해 압출된 시료 샘플을 주입라인(130)을 통해 다시 압력용기(100)에 분주한다.

14) 상기 6)~13) 단계를 2회 반복하여, 한 사이즈의 멤브레인 필터당 3회 압출을 실시한다.

15) 필터홀더(500)를 분리한다.

16) 필터홀더(500) 내부의 기존 설치된 10㎛의 멤브레인 필터를 제거한다.

17) 페트리 접시의 시약에 그 다음 size인 8㎛ 멤브레인 필터를 담궈 적신다.

18) 필터홀더(500)에 8㎛ 멤브레인 필터를 삽입 후 잠근다.

19) 본 발명의 세포 압출기에 필터홀더(500)를 다시 연결한다.

20) 상기 6)-14) 단계를 반복한다.

21) 페트리 접시의 시약에 그 다음 size인 5㎛ 멤브레인 필터를 담궈 적신다.

22) 상기 6)~14)번 단계 반복한다.

23) 압출이 모두 끝난 시료 sample은 0.2㎛ steri-cup을 이용해 filtering 해준다.

24) 50㎖ conical tube에 모인 filtered CDV sample은 그 다음 단계 (purification or gUC)를 위해 4℃(단기보관) 또는 -80℃(장기보관)에 보관한다.

세척

1) 스탠드(150)에 본 발명의 세포 압출기(A)를 분리한 뒤 모든 클램프(101)를 해체하여 전체 구성을 0.2M NaOH에 30분 동안 담가 두고 물로 세척한다. 이때, 배기필터(900)는 세척하지 않는다.

2) 세척된 본 발명의 세포 압출기(A)는 클램프(101)를 통해 다시 연결하여 조립한다.

3) 본 발명의 세포 압출기(A)의 전체에 알루미늄 호일로 감싼다.

4) 고압증기멸균기를 통해 멸균한다.

5) 멸균이 끝난 압출기는 bench에 넣어 UV 멸균한다.

이상, 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 상세히 설명하였으나, 본 발명의 기술적 범위는 전술한 실시 예에 한정되지 않고 특허청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 이때, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 고려해야 할 것이다.

A - 세포 압출기
100 - 압력용기 200 - 레귤레이터
300 - 입력밸브 400 - 배기밸브
500 - 필터홀더 510 - 파이프
511 - 노즐 600 - 수집용기
700 - 압력계 800 - 다이어프램 밸브
900 - 배기필터

Claims

시료가 분주되는 압력용기;
상기 압력용기로 주입되는 가스의 설정압력을 조정 후 정압을 유지하는 레귤레이터;
상기 압력용기로의 가스의 주입을 개폐하는 입력밸브;
상기 압력용기의 내부 압력을 제거하는 배기밸브;
멤브레인 필터를 구비하여 상기 압력용기의 시료가 가스에 의해 압송되어 통과하며 시료를 잘게 부수는 필터홀더;
압출된 시료가 보관되는 수집용기; 및
가스의 압력이 다이어프램에 작용하여 설정압력에 도달한 경우에만 상기 필터홀더로의 유로를 개방하는 다이어프램 밸브를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 압출기.
제 1항에 있어서,
상기 압력용기의 압력을 측정하는 압력계가 더 구비된 것을 특징으로 하는 세포 압출기.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 압력용기, 레귤레이터, 입력밸브, 배기밸브, 필터홀더, 수집용기, 압력계 및 다이어프램 밸브는 인접하는 구성과 클램프에 의해 분해 및 조립 가능하게 구성된 것을 특징으로 하는 세포 압출기.
제 1항에 있어서,
상기 멤브레인 필터는 공극의 크기가 작아지는 순서로 구비되는 것을 특징으로 하는 세포 압출기.
제 5항에 있어서,
상기 멤브레인 필터는 동시에 구비되거나, 크기가 작아지는 순서로 순차적으로 교체하여 구비되는 것을 특징으로 하는 세포 압출기.
제 1항에 있어서,
상기 압력용기와 필터홀더는 노즐을 구비한 파이프에 의하여 연결되는 것을 특징으로 하는 세포 압출기.
제 7항에 있어서,
상기 노즐과 필터홀더의 직경은 1:3 내지 1:30인 것을 특징으로 하는 세포 압출기.
제 1항에 있어서,
상기 가스는 질소가스, 압축공기, 이산화탄소 및 불활기체로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택된 것인, 세포 압출기.
삭제
1) 청구항 제1항, 제2항, 제4항, 제5항, 제6항, 제7항, 제8항 및 제9항 중 어느 한 항의 세포 압출기에 세포를 포함하는 시료를 제공하는 단계;
2) 상기 1) 단계의 세포 압출기를 구동하여 상기 시료를 압출하는 단계; 및
3) 상기 2) 단계의 압출된 시료를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 미세소포체 제조 방법.
제11항에 있어서,
상기 2) 단계는
i) 압력 용기로 시료를 분주하는 단계;
ii) 입력 밸브를 개방하여 가스가 압력 용기로 공급되게 하는 단계; 및
iii) 시료가 파이프 내 노즐을 통하여 압력 용기로부터 필터홀더 내에 구비된 멤브레인 필터를 통과하는 단계;
를 포함하는 것인, 미세소포체 제조 방법.
제12항에 있어서, 상기 가스는 20 내지 100 psi의 압력으로 공급되는 것을 특징으로 하는, 미세 소포체 제조 방법.
제12항에 있어서, 상기 iii) 단계는 시료가 공극 크기가 순차적으로 작아지는 멤브레인 필터를 통과하는 단계를 포함하는 것인, 미세소포체 제조 방법.
제14항에 있어서, 상기 멤브레인 필터는 동시에 구비되거나, 크기가 작아지는 순서로 순차적으로 교체하여 구비되는 것인, 미세소포체 제조 방법.
삭제