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KR102128453B1 - 황열 바이러스 유래 ns1 단백질, 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도 - Google Patents

황열 바이러스 유래 ns1 단백질, 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도 Download PDF

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KR102128453B1
KR102128453B1 KR1020180034029A KR20180034029A KR102128453B1 KR 102128453 B1 KR102128453 B1 KR 102128453B1 KR 1020180034029 A KR1020180034029 A KR 1020180034029A KR 20180034029 A KR20180034029 A KR 20180034029A KR 102128453 B1 KR102128453 B1 KR 102128453B1
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Abstract

본 발명은 황열 바이러스 유래 재조합 NS1 단백질, 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 NS1 단백질은 이에 특이적인 시료 내 항체를 높은 민감도 및 정확도로 측정할 수 있다. 또한, 상기 단백질 및 이에 특이적으로 결합하는 항체 등을 포함하는 본 발명의 키트는 시료 내 황열 바이러스에 대한 항체를 IgM 또는 IgG로 구분하여 신속하고 간편하게 검출할 수 있으므로, 황열 바이러스의 감염 시기, 백신 접종에 대한 성공 여부 등의 확인에 널리 활용될 수 있다.

Description

황열 바이러스 유래 NS1 단백질, 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도 {NS1 protein of yellow fever virus, monoclonal antibody specifically binding thereto, and uses thereof}
본 발명은 황열 바이러스(yellow fever virus) 유래 재조합 NS1(non-structural protein 1) 단백질, 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 황열 바이러스 유래의 NS1 단백질; 상기 NS1 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 상기 벡터를 포함하는 형질전환체; 상기 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체; 상기 단일클론항체를 생산하는 융합 세포주; 상기 단일클론항체를 포함하는 황열 바이러스에 대한 항체 검출용 조성물; 상기 단일클론항체를 포함하는 황열 바이러스에 대한 항체 검출용 키트; 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스에 대한 항체의 존재 여부를 판단하기 위한 정보의 제공 방법; 및 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법에 관한 것이다.
황열(yellow fever)은 플라비바이러스 속에 속하는 황열 바이러스(yellow fever virus)에 의한 질환으로 주로 아프리카와 남아메리카의 밀림지역에서 발생한다. 황열 바이러스의 잠복기는 3~6일로 알려져 있으며 모기에 의해서 전파된다. 임상증세는 무증상 또는 가볍게 지나는 경우에서부터 중증으로 발전하는 경우까지 다양하게 나타난다. 중증으로 발전하는 환자는 약 3일 정도 발열, 오한, 두통 및 오심, 구토 등의 증세를 보이다가 발병 후 4일 정도가 지나면 발열과 맥박이 100 이상으로 빨라지며 구토가 잦아지고 이로 인한 탈수가 생기면서 황달이 나타나는 등 진전된다. 이 시기 환자의 경우 뚜렷한 단백뇨와 출혈 증상이 나타나며 구토물은 파괴된 혈액으로 인해 검게 변색되고 림프구 감소도 보이며 20~50%가 발병 후 7~10일 이내에 사망에 이른다.
전술한 바와 같이 황열은 발병 시 수일 내에 사망으로 이어질 수 있는바, 이를 예방 또는 치료하기 위한 방법을 개발하기 위한 많은 노력이 수반되고 있다. 구체적으로, 황열 바이러스 예방 백신이 개발되어 상용화되었으며, 브라질 등 황열 유행 지역으로의 여행 전에 백신의 접종이 권고되고 있다. 또한, 황열 바이러스의 감염이 의심되는 경우 이를 진단하기 위한 여러 방법이 개발되어 있는 상태이다.
구체적으로, 황열 바이러스의 감염 여부를 확인하는 방법으로는 혈액에서 바이러스를 분리하여 이의 유전자를 검출하는 시험법, 혈청에서 항체를 검출하는 방법 등이 있다.
바이러스의 유전자 검출 검사는 급성기 검체에서 혈청학적 검사가 음성일 경우 바이러스에 감염된 시기가 최근인지를 확인하는 목적으로 사용된다. 상기 유전자 검출 검사는 진단 결과가 정확하다는 장점이 있으나, 숙련된 실험자가 필요하며, 고가의 장비가 요구된다는 단점이 있다.
황열 바이러스 감염에 대한 혈청학적인 진단 방법은 혈구응집억제시험법(haemagglutination inhibition, HI), 보체결합시험법(complement fixation, CF), 중화항체역가측정시험법(plaque reduction neutralization test, PRNT), 면역형광항체시법(immunofluorescence assay, IFA), IgM-포획효소면역측정법(IgM-capture enzyme linked immunosorbent assay, MAC-ELISA), IgG ELISA 등이 있다. 또한, IFA를 이용하여 황열바이러스, 일본뇌염바이러스 등을 동시에 검출할 수 있는 항원슬라이드(한국등록특허 제10-0968063호) 등이 개발된바 있다. 그러나, 상술한 방법들은 진단에 시간이 오래 걸린다는 단점(수 시간 정도)이 있어 일반적인 진단법으로 사용하기는 어려운 실정이었다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 수 분 이내에 황열 바이러스의 감염 여부 등을 신속 진단하는 방법을 개발하고자 예의 노력 연구한 결과, 혈청에 존재하는 황열 바이러스에 대한 항체를 IgG 또는 IgM으로 구분하여 검출하는 키트를 제작하였고, 상기 키트는 높은 민감도 및 특이도로 교차 반응 없이 황열 바이러스에 대한 항체를 빠르게 검출할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는, 황열 바이러스(yellow fever virus) 유래의 NS1(non-structural protein 1) 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 NS1 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 벡터를 포함하는, 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 단일클론항체를 생산하는 융합 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스에 대한 항체 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스에 대한 항체 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스에 대한 항체의 존재 여부를 판단하기 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는, 황열 바이러스(yellow fever virus) 유래의 NS1(non-structural protein 1) 단백질을 제공한다.
본 발명의 용어, "황열 바이러스(yellow fever virus)"는 플라비바이러스(Flavivirus) 속에 속하는 바이러스로서, 직경은 18~25 ㎚이며, 유전자는 비분절 단일가닥 (+)RNA로 크기는 약 11 kb 정도로 알려져 있다. 다른 플라비바이러스 속의 바이러스와 마찬가지로 5'과 3' 말단에 각각 약 100개의 염기와 약 600개 염기의 비암호화 부위(noncoding region, NCR)를 가지고 있다.
본 발명의 용어, "황열 바이러스(yellow fever virus) 유래의 NS1(non-structural protein 1) 단백질"은 황열 바이러스가 발현하는 비구조 단백질을 의미한다. 황열 바이러스는 3개의 구조 단백질(capsid(C), pre-membrane(prM), envelope(E))과 7개의 비구조 단백질(NS1, N2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5)을 만들며, NS1, NS3, NS5 등 일부 단백질을 제외하고는 단백질의 특성이 자세히 밝혀져 있지 않다. NS1 단백질은 약 50 kDa의 당단백질(glycoprotein)로 바이러스 RNA의 복제(replication)와 관련 있는 것으로 알려져 있다. NS1 단백질은 감염된 세포에서 세포 밖으로 분비되는 형태이며, 바이러스 감염 환자의 혈액에서 관찰될 정도로 높은 농도로 분비된다. 감염 후 9일 까지도 혈액에서 관찰되기 때문에 황열 바이러스의 감염 진단 또는 황열 바이러스에 대한 항체 검출에 좋은 후보물질로 알려져 있다.
본 발명에서 이용되는 서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 또한, 상기 용어, "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다.
따라서, 상기 서열번호 1로 표시되는 서열과 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열, 예를 들면 그 상동성이 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 90% 이상의 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명의 목적상, 상기 NS1 단백질은 이의 5' 말단에 BiP(chaperone binding protein); 3' 말단에 신호 펩타이드(signal peptide), HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 및 6개의 연속된 히스티딘(Histidine)을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 NS1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
더욱 구체적으로, 상기 각 말단에 포함되는 펩타이드는 NS1 단백질의 발현을 최적화하는 목적으로 사용되는 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서 발현을 최적화하는 목적으로 사용되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 황열 바이러스 NS1 유전자에 각각 BiP, 신호 펩타이드, HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 및 6개의 연속된 히스티딘을 암호화하는 유전자 서열을 결합시켰고, 이를 발현 벡터에 삽입한 후 아그로박테리아 균주, 및 니코티아나 벤타미아나에 형질전환시킴으로써 니코티아나 벤타미아나에서 NS1 단백질을 생산하였다(도 1 내지 3).
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 NS1 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
이때, 상기 "NS1 단백질"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 서열번호 2의 염기서열로 필수적으로 구성되거나, 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 서열번호 2의 염기서열은 서열번호 2의 염기서열뿐만 아니라, 서열번호 2와 적어도 80% 상동성을 갖는 염기서열도 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 서열번호 1과 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 코팅할 수 있는 염기서열이면 본 발명의 범주에 포함되며, 상기 서열번호 2의 염기서열에 대하여 그 상동성이 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 더욱 구체적으로 90% 이상의 높은 상동성을 갖는 염기서열도 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
또한, 코돈 축퇴성(codon degeneracy)에 의해 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질 또는 이와 상동성을 가지는 단백질로 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드 역시 포함될 수 있음은 자명하다. 또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
또 다른 하나의 양태는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터를 제공한다.
이때, 상기 "폴리뉴클레오티드"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서, 상기 벡터는 기탁번호 KCTC 13473BP로 기탁된 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "벡터"는 적절한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 유전자 삽입물을 포함하고, 상기 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 단백질을 코딩하는 염기서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 한다.
상기 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 염기서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어, 프로모터와 단백질을 코딩하는 염기서열이 작동가능하게 연결되어 염기서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 발현 가능한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용하여 숙주세포를 형질전환시킬 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다.
예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λLB3, λBL4, λⅨII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 또한, pECCG117, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pCES208, pXMJ19 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 벡터는 상동재조합을 일으켜서 염색체 내로 삽입될 수 있으므로 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 폴리뉴클레오티드의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택 가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 황열 바이러스 NS1 유전자에 각각 BiP, 신호 펩타이드, HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 및 6개의 연속된 히스티딘을 암호화하는 유전자 서열을 결합시켰고, 이를 삽입한 발현 벡터를 제작하여 수탁번호 KCTC 13473BP로서 2018년 1월 30일자로 수탁기관인 한국생명공학연구원에 기탁하였다(도 1 내지 3).
또 다른 하나의 양태는 상기 벡터를 포함하는, 형질전환체를 제공한다.
이때, 상기 "벡터"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 제공하는 상기 벡터를 포함하는 형질전환체는 황열 바이러스 유래의 NS1 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하므로, 상기 NS1 단백질을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "형질전환체"는 형질전환에 의하여 유전적 성질이 변화된 생물체를 의미한다.
구체적으로, 상기 형질전환체는 대장균, 아그로박테리아(Agrobacteria), 효모 등의 모든 박테리아, 마우스, 돼지, 닭, 소 등의 모든 동물, 및 애기장대, 벼, 담배 등의 모든 식물일 수 있으며, 더욱 구체적으로 아그로박테리아 또는 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)일 수 있으나, 상기 벡터를 포함할 수 있는 한 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다.
구체적인 예로, CaCl2 침전법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있으나, 상기 벡터를 생물체에 도입할 수 있는 한 이에 제한되지 않는다.
또 다른 하나의 양태는 상기 황열 바이러스 유래의 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
이때, 상기 "황열 바이러스 유래의 NS1 단백질"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "황열 바이러스 유래의 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체"는 상기 NS1 단백질을 항원으로 인식하여 이에 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 명세서에서, "단일클론항체"와 혼용되어 명명될 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 단일클론항체는 상기 NS1 단백질에 특이적으로 결합함으로써 결국 황열 바이러스에 대한 항체를 검출하는데 사용될 수 있다.
이때, 상기 용어, "황열 바이러스에 대한 항체"는 황열 바이러스에 감염되거나, 황열 바이러스에 대한 예방 백신의 접종을 통해, 황열 바이러스를 항원으로 하여 생체 내에서 생산된 항체를 의미한다. 본 명세서에서, "황열항체" 또는 "황열인간항체"와 혼용되어 명명될 수 있다.
상기 단일클론항체를 생산하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 일반적인 방법으로 제조될 수 있다. 일 예로서, 화학적 펩티드 합성방법으로 제조될 수 있고, 상기 단일클론 항체를 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조될 수도 있으며, 상기 단일클론 항체의 면역원을 동물에 주사하여 얻어진 림프구로부터 유래된 하이브리도마 세포주를 사용하여 제조될 수도 있고, 다른 예로서, 상기 단일클론항체가 특이적으로 결합하는 미분화된 치수줄기세포로부터 유래된 단백질을 면역원으로 동물에 접종하고, 상기 동물로부터 얻어진 림프구를 사용하여 제작된 하이브리도마 세포주를 사용하여 제조될 수도 있다.
구체적으로, 본 발명의 방법에 의하여 제조된 단일클론항체는 통상적인 단일클론항체와 마찬가지로, 2개의 전체 길이의 중쇄 및 2개의 전체 길이의 경쇄로 구성될 수 있다. 이때, 상기 중쇄 및 경쇄는 특별히 제한되지 않는다.
또한, 상기 단일클론항체를 구성하는 일부 아미노산 서열이 변이된 형태가 될 수 있다. 단백질 및 폴리펩티드에서, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이며, 이러한 교환에 의하여 본 발명에서 제공하는 단일클론항체의 아미노산 서열로부터 변이된 서열의 단일클론항체가 본 발명의 범주에 포함될 수 있다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 상기 단일클론항체의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 항체 활성이 증가한 변이된 단일클론항체 역시 본 발명의 범주에 포함될 수 있다.
본 발명에서, 상기 단일클론항체는 기탁번호 KCTC 13463BP의 융합 세포주에서 생산되는 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "융합 세포주"는 2개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포로, 폴리에틸렌글리콜 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 어떤 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종 세포가 융합되어, 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포 속에 통합시킨 세포 또는 세포주를 의미한다. 특히, 골수종 세포(myeloma cell)와 비장이나 림프절에 들어 있는 림프구 가운데 항체 생성세포의 선구세포인 B세포를 융합시킨 잡종세포는 단일클론항체를 만들어내므로 연구와 임상에 널리 응용된다. 그 밖에 림포카인(생리활성물질)을 만들어내는 T세포와 그 종양세포인 하이브리드마 등도 실용화되고 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 제조한 NS1 단백질로 면역화된 마우스의 비장 세포와 골수종 세포를 혼합하여 배양함으로써 융합 세포주를 제조하였고, 이를 마우스의 복수액에서 배양함으로써 단일클론항체를 대량 생산하였다(도 4). 또한, 상기 융합 세포주 중에서, 황열 바이러스 NS1 단백질에 대한 항체를 가장 많이 분비하는 융합 세포주를 수탁번호 KCTC 13463BP로서 2018년 1월 18일자로 수탁기관인 한국생명공학연구원에 기탁하였다.
또 다른 하나의 양태는 상기 단일클론항체를 생산하는 융합 세포주를 제공한다.
이때, 상기 "단일클론항체" 및 "융합 세포주"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 융합 세포주는 기탁번호 KCTC 13463BP로 기탁된 것일 수 있다. 상기 융합 세포주는 시험관 내 또는 생체 내에서 대량으로 배양할 수 있다.
또한, 상기의 융합 세포주가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용할 수 있으며, 당업계에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용할 수도 있다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액(ascites fluid)으로부터 분리될 수 있다.
또 다른 하나의 양태는 상기 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스에 대한 항체 검출용 조성물을 제공한다.
이때, 상기 "단일클론항체"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 황열 바이러스에 대한 항체 검출용 조성물은, NS1 단백질에 특이적으로 결합함으로써 결국 황열 바이러스에 대한 항체(황열인간항체)를 검출하는데 사용될 수 있는 상기 단일클론항체를 포함하므로, 황열 바이러스에 대한 항체의 검출에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 용어, "황열 바이러스에 대한 항체"는 황열 바이러스에 감염되거나, 황열 바이러스에 대한 예방 백신의 접종을 통해, 황열 바이러스를 항원으로 하여 생체 내에서 생산된 항체를 의미한다. 황열 바이러스에 노출되면 항상 생산되므로, 황열 바이러스에 대한 방어 기전 이외에 황열 바이러스에 대한 감염 여부나 백신 접종의 성공 여부 등을 확인할 때 사용되기도 한다. 감염 또는 접종 이후 일주일 이내에는 일반적으로 IgM 항체가 생산되며, 이후에는 IgG 항체가 생산된다고 알려져 있다.
본 명세서에서, 상기 황열 바이러스에 대한 항체는 "황열항체" 또는 "황열인간항체"와 혼용되어 명명될 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 조성물은 황열 바이러스 감염 여부를 판단, 진단 또는 확인하는데 사용될 수 있다.
또한, 상기 조성물은 황열 바이러스에 대한 백신의 접종 성공 여부를 판단, 진단 또는 확인하는데 사용될 수 있다.
상기 용어, "황열 바이러스 감염"은 황열 바이러스에 감염되거나, 감염되어 이상 증상을 나타내는 상태를 의미하며, "황열", "황열병", "황열 바이러스 감염병" 등과 호용되어 사용될 수 있다. 황열 바이러스 감염은 주로 모기(Aedes agypti, Aedes sp., Haemogogus sp. 등)에 의해서 전파된다. 황열 바이러스의 잠복기는 3~6일로 알려져 있으며, 임상증세는 무증상 또는 가볍게 지나는 경우에서부터 중증으로 발전하는 경우까지 다양하게 나타난다. 중증으로 발전하는 환자는 약 3일 정도 발열, 오한, 두통 및 오심, 구토 등의 증세를 보이다가 발병 후 4일 정도가 지나면 발열과 맥박이 100 이상으로 빨라지며 구토가 잦아지고 이로 인한 탈수가 생기면서 황달이 나타난다. 이 시기 환자의 경우 뚜렷한 단백뇨와 출혈 증상이 나타나며 구토물은 파괴된 혈액으로 인해 검게 변색되고 림프구 감소도 보이며 20~50%가 발병 후 7~10일 이내에 사망에 이른다. 다만, 회복되는 경우 증상의 경중에 관계없이 후유증은 없는 것으로 알려져 있다.
또 다른 하나의 양태는 상기 단일클론항체를 포함하는, 황열 바이러스에 대한 항체 검출용 키트를 제공한다.
이때, 상기 "단일클론항체" 및 "황열 바이러스에 대한 항체"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
구체적으로, 본 발명에서 상기 황열 바이러스에 대한 항체는 인간 유래의 IgG 또는 IgM인 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 목적상, 상기 키트는 황열인간항체를 IgG 또는 IgM으로 구분하여 검출하는 것일 수 있다.
상기 기술한 바와 같이, IgG 또는 IgM는 황열 바이러스에 대한 노출 시기에 따라 다르게 생산되므로, 본 발명의 키트는 황열 바이러스에 대한 감염 시기를 판단할 수 있으며, 또한 황열 바이러스에 대한 백신의 접종이 성공적으로 이루어졌는지 판단할 수 있다.
구체적인 실시 양태로서, 상기 키트는 (a) 항-인간 IgG 항체, 항-인간 IgM 항체 및 항-마우스 IgG 항체가 고정화된 멤브레인; (b) 본 발명의 단일클론항체 및 금이 결합된 접합체를 포함하는 축합 패드; (c) 완충용액을 포함하는 버퍼 패드; 및 (d) 흡수 패드를 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 멤브레인은 항-인간 IgG 항체, 항-인간 IgM 항체 및 항-마우스 IgG 항체를 고정화하도록 구성될 수 있으며, 이때 상기 항-인간 IgG 항체 및 항-인간 IgM 항체는 검사군 항체로서 사용되고, 항-마우스 IgG 항체는 대조군 항체로서 사용될 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 항-인간 IgG 항체, 항-인간 IgM 항체는 키트를 이용한 진단 시 시료 내에 포함되어 있을 수 있는 황열인간항체(IgG 또는 IgM)에 결합하는 역할을 한다. 즉, 상기 항-인간 IgG 항체 또는 항-인간 IgM 항체는 시료 내 황열인간항체의 존재 여부를 확인하는데 사용되며, 특히 시료 내 존재하는 상기 황열인간항체가 IgG인지 IgM인지 구별하기 위해 사용된다. 한편, 상기 항-마우스 IgG 항체는 인간 항체와는 결합하지 않는다.
아울러, 상기 멤브레인은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 항체가 결합될 수 있는 니트로셀룰로오스 멤브레인, PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인 등이 될 수 있다.
다음으로, 상기 축합 패드는 본 발명의 단일클론항체가 금과 결합된 형태의 축합체를 포함하도록 구성될 수 있다. 이때, 상기 금은 금 입자일 수 있다.
본 발명의 키트에서, 상기 단일클론항체에 결합된 금은, 시료 내 황열인간항체와 멤브레인에 고정화되어 있는 검사군 항체(항-인간 IgG 항체 및 항-인간 IgM 항체)와의 결합을 표시하는 표지물질로서 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 금에 결합된 단일클론항체는 본 발명의 NS1 단백질과 결합하는데, 상기 시료 내 황열인간항체는 상기 NS1 단백질과 결합함과 동시에 멤브레인에 고정화되어 있는 검사군 항체와 결합하므로, 최종적으로 시료에 포함된 황열인간항체의 존재 여부를 확인하기 위한 수단으로 사용된다.
따라서, 상기 단일클론항체 및 금이 결합된 축합체는, NS1 단백질과 결합함으로써 상기 NS1 단백질 및 검사군 항체(항-인간 IgG 항체 및 항-인간 IgM 항체)와 동시에 결합하고 있는 시료 내 황열인간항체의 존재 여부를 확인하는데 이용될 수 있고, 또한 멤브레인에 고정화된 상기 대조군 항체에 직접 결합하므로 시료가 키트에 제대로 적용되었는지 확인하는데 이용될 수 있다.
다음으로, 상기 버퍼 패드는 본 발명의 키트를 사용할 때 상기 키트 내에서 시료의 전달을 보조하고, 항원-항체 반응을 보조하기 위한 완충용액이 포함된 검체 전개액을 포함할 수 있는 다공성 재질로 구성되며, 상기 축합 패드와 연결되어 키트의 말단에 위치하도록 구성될 수 있다. 상기 다공성 재질은 상기 검체 패드에서 정의한 바와 동일하다.
상기 검체 전개액은 상기 버퍼 패드에 포함된 상태로 존재할 수도 있고, 본 발명의 키트에 시료를 가한 후에 검체 전개액을 버퍼 패드에 가할 수도 있는데, 바람직하게는 본 발명의 키트에 시료를 가한 후에 검체 전개액을 버퍼 패드에 가할 수 있다.
상기 검체 전개액에 포함된 완충용액은 시료 전달 및 항원-항체반응을 보조하는 효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 붕산염 완충용액, 트리스 완충용액, 인산염 완충용액 등이 사용될 수 있다. 또한, 상기 검체 전개액은 비특이반응(non-specific reaction)을 억제할 수 있는 Triton X-100, Tween 20, 카제인 등을 포함할 수 있고, 보존제로서 아지드화나트륨 등을 포함할 수 있다.
다음으로, 상기 흡수 패드는 과량의 검체 또는 완충액을 흡수할 수 있는 재질로 구성될 수 있다. 상기 흡수 패드는 과량의 검체 또는 검체 전개액을 흡수하여 제거함으로써, 본 발명에서 제공하는 키트의 검사 결과를 교란시키지 않도록 하는 역할을 수행한다.
아울러, 상기 흡수 패드의 재질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 면, 액체 흡수성 겔 등을 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 키트는 검체 패드를 추가로 포함할 수 있다.
상기 검체 패드는 시료가 본 발명의 키트에 직접적으로 투입되는 투입구의 역할을 수행한다. 또한, 상기 시료에 포함된 고체 성분을 여과하고, 액상 성분만을 상기 멤브레인으로 전달하는 역할을 수행할 수 있다.
이때, 상기 검체 패드는 다공성 재질로 구성될 수 있다. 상기 다공성 재질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 고체 성분(예로서, 혈구 등)을 통과시키지 않을 정도의 공극을 포함하는 다공성 알루미나, 다공성 실리케이트, 다공성 합성수지 등이 될 수 있다. 또한, 상기 검체 패드는 고체 성분을 분리하는 역할을 수행하기 때문에 다공성 재질 이외에도 고체 성분을 흡착시킬 수 있는 재질로 구성될 수도 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 니트로셀룰로오스 멤브레인, PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인 등이 될 수 있다.
본 발명에서, 키트에 사용하기 위한 검정 시스템은 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱디바이스, 면역크로마토그래피법 및 방사 분할 면역검정 디바이스 및 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다. 바람직하게는 면역크로마토그래피법(immunochromatographic assay: ICA)을 이용한 스트립 형태 또는 디바이스 형태의 진단 키트를 이용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 제조한 NS1 단백질, 이에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 및 상기 단일클론항체와 금이 결합된 축합체를 포함하는 축합 패드를 제조하고, 황열 바이러스에 대한 항체와 결합할 수 있는 마우스 항-인간 IgG/IgM 항체가 고정된 멤브레인을 제조하고, 상기 축합 패드 및 멤브레인을 포함하여 버퍼 패드, 흡수 패드 등으로 구성된 면역크로마토그래피 진단 키트를 제작하였다(도 5 및 6). 상기 키트는 황열 바이러스 항체에 대하여 높은 특이도/민감도를 나타내고, 교차반응을 나타내지 않으며, 특히 항체의 아형(IgG 및 IgM)을 높은 정확도로 구분할 수 있음을 확인하였다(도 7 및 8, 및 표 1 및 2).
이는, 본 발명의 키트는 황열 바이러스에 대한 항체를 IgG 및 IgM으로 구분하여 검출하는데 매우 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또 다른 하나의 양태는 및 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스에 대한 항체의 존재 여부를 판단하기 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
이때, 상기 '키트' 및 '황열 바이러스에 대한 항체'에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서, 황열 바이러스에 대한 항체(황열인간항체)의 존재 여부를 판단하기 위한 정보의 제공 방법은 황열 바이러스 감염 여부를 판단, 진단 또는 확인하는 방법일 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 정보의 제공 방법은, 환자에게서 분리한 생물학적 시료를 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 황열 바이러스 유래의 NS1(non-structural protein 1) 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하며, 이는 생물학적 시료를 키트에 적용하는 단계일 수 있다.
본 발명의 용어, "생물학적 시료"는 조직액, 세포액, 전혈, 혈청, 혈장, 또는 세포 배양 상등액 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 황열 바이러스의 감염이 의심되는 환자 또는 감염된 환자에서 분리한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 키트에 적용하여 황열 바이러스 감염 여부를 확인할 수 있다.
본 명세서에서, 상기 생물학적 시료는 "검체", "검액" 또는 "시료"와 혼용되어 명명될 수 있다.
구체적으로, 상기 정보의 제공 방법은, 상기 시료 내 황열인간항체의 존재 여부를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
더욱 구체적으로, 상기 단계는 상기 시료 내 황열인간항체와 키트의 멤브레인에 고정화된 검사군 항체의 결합을 검출하는 단계로서, 상기의 항원-항체 결합 여부를 확인하는 과정이다.
이때, 상기 황열 바이러스에 대한 항체는 본 발명의 단일클론항체, 금 입자 및 NS1 단백질이 결합된 복합체에 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 진단 키트에서, 상기 항원-항체 결합은 색채입자 결합법으로 검출할 수 있으며, 색채입자로는 예를 들어 콜로이드성 금 입자 또는 칼라 유리 또는 플라스틱(예: 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드(bead)를 포함한다. 본 발명에서는 바람직하게 금 콜로이드(입자)를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, (1) 상기 생물학적 시료에 황열인간항체가 존재하는 경우,
상기 생물학적 시료를 키트에 투입 또는 주입하여 적용하면, 본 발명의 단일클론항체와 금 입자가 결합되어 접합체를 형성하며, 본 발명의 단일클론항체는 상기 NS1 단백질에 결합하므로, 'NS1 단백질-단일클론항체-금'의 복합체(A)를 형성하게 된다. 또한, 시료 내 황열인간항체(인간 IgG 또는 인간 IgM)는 상기 NS1 단백질에 결합하므로, 상기 복합체(A)의 NS1 단백질에 결합하여 '황열인간항체-NS1 단백질-단일클론항체-금'의 복합체(B)를 형성하게 된다. 이후, 상기 복합체(B)는 모세관 현상에 의해 멤브레인의 미세구멍을 통해 이동하면서 멤브레인에 고정되어 있는 검사군 항체(마우스 항-인간 IgG 또는 마우스 항-인간 IgM)와 결합하게 되며, 금 입자로 인하여 발색반응이 나타남에 따라 검사선에서 발색 띠(band)가 형성된다.
반면, (2) 상기 생물학적 시료에 황열인간항체가 존재하지 않는 경우,
상기 생물학적 시료를 키트에 투입 또는 주입하여 적용하면, 본 발명의 단일클론항체와 금 입자가 결합되어 접합체를 형성하며, 본 발명의 단일클론항체는 상기 NS1 단백질에 결합하므로, 'NS1 단백질-단일클론항체-금'의 복합체(A)를 형성하게 된다. 그러나, 시료 내 황열인간항체(인간 IgG 또는 인간 IgM)가 존재하지 않으므로 상기 복합체(A)만이 모세관 현상에 의해 멤브레인의 미세구멍을 통해 이동하며, 멤브레인에 고정되어 있는 검사군 항체(마우스 항-인간 IgG 또는 마우스 항-인간 IgM)와 결합하지 않고 이를 지나치게 된다. 따라서, 검사선에서는 발색 띠가 형성되지 않는다.
한편, 대조선에 위치하는 대조군 항체(산양 항-마우스 IgG)는 상기 황열인간항체와는 결합하지 않고, 상기 단일클론항체와 금 입자가 결합된 접합체와 결합하므로, 대조선에는 생물학적 시료 내 황열인간항체의 존재 여부와 상관 없이 생물학적 시료가 적용되면 발색 띠가 항상 형성된다.
따라서, 본 발명의 진단 키트의 대조선 및 검사선이 모두 양성인 경우 시료에 황열인간항체가 존재한다고 판단할 수 있고, 대조선이 양성이고 검사선이 음성인 경우 시료에 황열인간항체가 존재하지 않는다고 판단할 수 있다. 반면, 대조선 및 검사선이 모두 음성인 경우 키트에 시료가 적절히 적용되지 않은 것으로 판단할 수 있다.
구체적으로, 상기 진단 키트의 검사선이 양성인 경우에서, 검사선 1(IgG)이 양성이고, 검사선 2(IgM)가 음성인 경우 황열인간항체 중에서도 IgG 항체가 존재한다고 판단할 수 있고, 검사선 1(IgG)이 음성이고, 검사선 2(IgM)가 양성인 경우 황열인간항체 중에서도 IgM 항체가 존재한다고 판단할 수 있고, 검사선 1(IgG) 및 검사선 2(IgM)가 모두 양성인 경우 황열인간항체 중에서도 IgG 및 IgM 항체가 모두 존재한다고 판단할 수 있다.
또한, 본 발명의 진단 키트는 황열 바이러스 이외의 다른 바이러스에 대한 항체에 대해서는 교차반응을 일으키지 않는 특징을 갖는다.
본 발명의 용어, "교차반응"은 항체가 다른 항원물질에서 동일한 항원결정기(eptope)가 있으면 그것에 대응할 수 있는 것을 의미하며, 상기 용어는 '교차면역' 또는 '교차방어면역'과 혼용되어 사용될 수 있다. 하나의 항원물질에서도 복수인 다수의 항원결정기가 존재하는 경우가 대부분이며, 이는 다중 면역반응을 자극한다. 교차반응은, 일반적으로 진단 테스트를 포함한 의료 테스트에서 결과에 혼동을 유발한다.
본 발명의 목적상, 상기 교차반응은, 황열 바이러스에 대한 항체의 존재 여부 판단 시 황열 바이러스가 아닌 다른 바이러스(황열, 뎅기, 지카, 치쿤쿠니아 또는 마이야로 바이러스 등)에 대한 항체에 의해 '본 발명의 NS1 단백질(항원)-항체 결합'이 일어나 시료 내 존재하는 항체가 황열 바이러스에 대한 것인지 확인할 수 없게 되는 것을 의미한다. 즉, 황열, 뎅기, 지카 또는 마이야로 바이러스는 모기 매개 바이러스에 속하는 것으로 서로의 게놈 서열이 유사함에 따라 이로부터 유래한 단백질의 서열 또는 구조가 유사하여 진단시 교차반응이 일어날 수 있으며, 양성반응의 오류를 일으킬 수 있다.
그러나, 본 발명의 NS1 단백질은 다른 바이러스에는 존재하지 않는 황열 바이러스 특이적인 것이므로, 상기 NS1 단백질을 포함하는 본 발명의 키트는 교차반응을 일으키지 않고 황열 바이러스에 대한 항체에 대해서만 특이적으로 반응한다.
또한, 본 발명의 목적상, 본 발명의 정보의 제공 방법은 황열 바이러스에 대한 백신의 접종 성공 여부를 판단, 진단 또는 확인하는 방법일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 키트를 이용하여 음성 또는 양성 검체를 진단한 결과, ELISA법으로 진단한 결과와 동일한 결과를 나타내며, IgG 또는 IgM을 정확하게 구별할 수 있음을 확인하였다(도 7).
이는, 본 발명의 키트는 황열 바이러스에 대한 항체를 IgG 및 IgM으로 구분하여 검출하는데 매우 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또 다른 하나의 양태는 및 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법을 제공한다.
이때, 상기 '키트' 및 '황열 바이러스에 대한 항체'에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서, 황열 바이러스에 대한 항체(황열인간항체)를 검출하는 방법은 황열 바이러스 감염 여부를 판단, 진단 또는 확인하는 방법일 수 있다.
또한, 본 발명의 목적상, 상기 황열 바이러스에 대한 항체(황열인간항체)를 검출하는 방법은 황열 바이러스에 대한 백신의 접종 성공 여부를 판단, 진단 또는 확인하는 방법일 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 정보의 제공 방법은, 환자에게서 분리한 생물학적 시료를 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 황열 바이러스 유래의 NS1 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하며, 이는 생물학적 시료를 키트에 적용하는 단계일 수 있다.
본 발명의 재조합 NS1 단백질은 이에 특이적인 시료 내 항체를 높은 민감도 및 정확도로 측정할 수 있다. 또한, 상기 단백질 및 이에 특이적으로 결합하는 항체 등을 포함하는 본 발명의 키트는 시료 내 황열 바이러스에 대한 항체를 IgM 또는 IgG로 구분하여 신속하고 간편하게 검출할 수 있으므로, 황열 바이러스의 감염 시기, 백신 접종에 대한 성공 여부 등의 확인에 널리 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 황열 바이러스 유래의 NS1 단백질의 발현을 위한 벡터의 모식도이다.
도 2는 상기 NS1 단백질에 대한 쿠마시 염색(Coomassie staining) 결과를 보여주는 이미지이다.
도 3은 상기 NS1 단백질에 대한 웨스턴블롯 결과를 보여주는 이미지이다.
도 4는 상기 NS1 단백질에 특이적으로 결합하는, 단일클론항체를 생산하는 융합 세포에서 생산된 항체의 양을 보여주는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 황열 바이러스에 대한 항체 진단용 신속 면역크로마토그래피 진단 키트를 도식화한 이미지이다.
도 6은 상기 키트의 다른 구성을 도식화한 이미지이다.
도 7은 상기 키트를 이용하여 황열 바이러스 양성 검체의 시료를 진단한 결과에 관한 도이다. 이때, 'M 양성'은 IgM 항체, 'G 양성'은 IgG 항체, 'M/G 양성'은 IgM 및 IgG 항체가 검출되었음을 의미한다.
도 8은 상기 키트를 이용하여 뎅기바이러스 또는 지카바이러스의 양성 검체를 진단한 결과에 관한 도이다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 재조합 비구조단백질 1(NS1)의 제조 방법
실시예 1-1. NS1 유전자의 확보 및 클로닝
황열 바이러스 항원으로서 비구조단백질 1(non-structural protein 1: NS1) 단백질을 이용하였고, 이를 식물에서 발현시키고자 하였다.
먼저, 비구조단백질 1(이하, 'NS1'로 명명)에 대한 유전자 정보를 확보하고, 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서 발현이 최적화되도록 서열을 변형하여 유전자를 합성하였다. 구체적으로, NS1 유전자의 5' 말단에 BiP(chaperone binding protein)를 결합하고, 3' 말단에 신호 펩타이드(signal peptide)에 해당하는 게노믹 DNA 서열과 HDEL(His-Asp-Glu-Leu)을 암호화하는 유전자 서열을 각각 결합함으로써 발현된 재조합 NS1 단백질이 소포체로 이동하여 보존(retention)될 수 있도록 하였다. 또한, 재조합 NS1의 분리 정제를 위해 6개의 연속된 히스티딘(Histidine)을 암호화하는 유전자 서열을 상기 NS1 유전자의 3' 말단에 결합하였다.
상기의 방법으로 제조된 유전자를 식물 발현 벡터에 삽입하여 재조합 NS1의 발현 벡터를 완성하였다(도 1).
실시예 1-2: 재조합 NS1의 발현
재조합 NS1을 발현시키기 위하여, 상기의 실시예 1에서 준비한 재조합 발현 벡터를 아그로박테리아 균주 LBA4404에 전기충격법(Electrophoration)을 이용하여 형질전환 시켰다. 이후, 형질전환된 아그로박테리아를 5ml의 YEP 액체 배지(효모 추출물 10 g, 펩톤 10 g, NaCl 5 g, 카나마이신 50 mg/L, 리팜피신 25 mg/L), 28℃의 조건에서 16시간 동안 진탕배양한 후 1차 배양액 1ml을 50ml의 새 YEP 배지에 접종하여 28℃의 조건에서 6시간 동안 진탕배양하였다. 이렇게 배양된 아그로박테리아를 원심분리(7,000 rpm, 4℃, 5분)하여 수집한 후, 인필트레이션(Infiltration) 버퍼(10 mM MES (pH 5.7), 10 mM MgCl2, 200 μM 아세토시링곤)에 600 nm의 파장에서 O.D. 1.0의 농도로 다시 현탁하였다. 아그로박테리아 현탁액은 바늘을 제거한 주사기를 이용하여 니코티아나 벤타미아나 잎의 뒷면에 주입하는 방법으로 아그로-인필트레이션(Agro-infiltration)을 수행하였다.
실시예 1-3: 재조합 NS1의 분리 및 정제
발현된 재조합 NS1을 분리 및 정제하기 위하여, 먼저 상기 실시예 1-2에서 준비한 니코티아나 벤타미아 40g에 단백질 추출 용액(50 mM 인산나트륨(pH 8.0), 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸 0.1% 트리톤 X-100, 1X 단백질가수분해효소 억제제(protease inhibitor)) 200 mL을 첨가하고 블랜더로 조직을 파쇄한 후 13,000 rpm에서 20분간 4 ℃에서 원심분리하여 단백질 추출액을 회수하였다.
이후, 상기 단백질 추출액에 대하여 Ni-NTA 아가로스 레진이 충진된 컬럼으로 친화크로마토그래피를 실시하였다. 컬럼에 레진을 5 mL 충진한 후 세척 용액(50 mM 인산나트륨(pH 8.0), 300 mM NaCl, 20 mM 이미다졸) 50 mL로 평형화하였다. 회수한 단백질 추출액을 컬럼에 적용한 후 세척 용액 100 mL을 흘려 보내 레진을 세척하고, 용출 용액(50 mM 인산나트륨(pH 8.0), 300 mM NaCl, 300 mM 이미다졸)으로 재조합 단백질을 용출하였다. 재조합 단백질이 포함된 용출 용액은 30 kD 크기의 필터를 사용하여 생리식염수(PBS) 용액으로 교체 및 농축하였다. 상기 과정을 통해. 분리 및 정제된 NS1은 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 후 쿠마시 염색(Coomassie staining) 및 웨스턴블롯을 통해 확인하였다(도 2 및 3).
실시예 2. 금 축합체용 NS1 특이적 단일클론항체의 제작 방법
실시예 2-1. 면역화 및 세포 융합
NS1 특이적 단일클론항체를 제작하기 위하여, 먼저 상기 실시예 1-3에서 준비한 NS1을 이용하여 마우스를 면역화하고, 상기 NS1에 특이적인 단일클론항체(이하, '단일클론항체'로 명명)를 생산하는 융합 세포주를 제작하였다.
구체적으로, 면역화 방법으로, NS1이 100 ㎍이 들어 있는 용액과 같은 부피의 컴플리트 프레운즈 아주번트(complete Freund's adjuvant)가 섞인 현탁액을 만들어 생후 8주령 암컷 생쥐(BALB/C, 대한바이오링크(주), 한국)의 복강 내에 주입하였다. 2주 후에 인컴플리트 프레운즈 아주번트(incomplete Freund's adjuvant)를 사용하여 같은 요령으로 한 번 더 주사하고, 다시 2주 후에 같은 요령으로 한 번 더 주사하였다. 마지막 면역처리 후 2일 뒤에 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 인산염 완충액에 1/1,000으로 희석하여 효소면역측정법(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로 항체의 역가를 결정하였다. 역가가 낮게 나오는 경우 2주 후에 다시 면역화시켰다.
그 후, 융합 세포주 제조 방법으로, 면역화된 쥐에서 비장을 꺼내고, 조직분쇄기로 비장을 으깬 후, 세포 혼탁액을 용기에 담고 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 골수종 세포는 세포배양용 플라스크에서 회수하여 RPMI1640 배지에 현탁하고 세포수를 계수하였다. 비장세포 역시 세포수를 계수하였다. 1×107개의 골수종 세포와 1×108개의 비장세포를 50 ml 용기로 옮겨 RPMI1640 배지를 적당량 첨가한 후 200×g로 5분간 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 현탁시켜 RPMI1640 배지에 천천히 흔들어 주면서 1 ml의 PEG(50% polyethylene glycol) 용액을 1분 동안 가하였다. 5분 후에 1 ml의 RPMI1640 배지를 30초에 걸쳐 천천히 첨가하고, 다시 3 ml의 RPMI1640 배양액을 30초에 걸쳐 첨가하였다. 또 다시 17 ml의 RPMI1640 배양액을 1분에 걸쳐 넣은 다음 20 ml의 RPMI1640 배양액을 더 넣어주고, 5분 동안 반응시켰다. 이를 200×g로 5 분간 원심분리한 후 배지를 제거하였다. 50 ml의 1% HAT(hypoxathine-aminopterin-thymidine)을 함유하는 RPMI1640 배양액에 주의하여 현탁한 후, 피더 세포(feeder cell)가 들어있는 96웰 세포배양용 플레이트에 웰당 100 ㎕씩 상기 세포를 넣어준 후 37 ℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
실시예 2-2. 융합 세포주의 클로닝 및 복수를 이용한 단일클론항체의 생산
상기 실시예 2-1에서 제조한 여러 개의 융합 세포주 클론(hybridoma cell clone) 중 많은 양의 단일클론항체를 분비하는 융합 세포주(G12B)를 선별하였고, 이를 96-웰 플레이트로부터 T-75 배양 플라스크로 점차 수를 늘려 배양하였다.
한편, 상기 융합 세포주 G12B는 2018년 1월 18자로 기탁기관인 한국생명공학연구원(KCTC)에 국제 기탁하여 KCTC 13463BP로 기탁번호를 부여받았다.
그 결과, 상기 융합 세포는 그 수에 상관 없이 많은 양의 단일클론항체를 분비하며, 그 양은 양성 대조군인 면역화된 마우스의 혈청(1:200으로 희석)과 유사한 정도임을 확인하였다. 반면에 음성 대조군인 PBS(인산완충액, pH 7.4) 또는 건강한 마우스의 혈청(Normal, 1:200 희석)에는 거의 검출되지 않음을 확인하였다(도 4).
또한, 항체의 대량생산을 위해 생후 6-8주령 생쥐(BALB/C)의 복강에 인컴플리트 프레운즈 아주번트(incomplete Freund's adjuvant)를 0.5 ml 주사하였다. 1 주일째 되는 날 상기 융합 세포를 인산염 완충액에 현탁하고 계수하여, 쥐 한 마리당 1.5×106 개의 세포를 0.5 ml 인산염 완충액에 현탁한 후 복강에 주사하였다. 1-2 주가 지나면서 복수(ascitic fluid)가 적당히 차오르면 주사기를 이용하여 복수를 채취한 후 냉동 보관하였다.
실시예 2-3: 단일클론항체의 정제
상기 실시예 2-2에서 채취한 복수에 황산 암모늄(ammonium sulfate)을 10%의 농도로 첨가하여 30 분간 혼합한 후, 15,000 rpm에서 30분간 원심분리하고 상층액을 취하였다. 다시 이 상층액에 황산 암모늄을 50%의 농도로 첨가한 후 4℃에서 30분간 방치하였다. 다시 15,000 rpm에서 30분간 원심 분리하여 상층액은 버리고 침전물을 20 mM 인산완충용액(phosphate buffer, pH 7.0)에 현탁시켰다. 이 현탁액을 20 mM 인산완충용액에서 18시간 이상 투석한 후, 20 mM 인산완충용액 (pH 7.0)으로 평형화된 단백질 G-결합 컬럼(Protein G-coupled column)에 투석액을 주입하고, 모두 주입되고 나면 인산완충용액을 이용하여 흡착하지 않은 물질들을 제거해 주었다. 컬럼에 결합된 항체는 10 mM 글리신용액(glycine solution, pH 2.8) 용액으로 용출(elution)시켰다. 이때 1 M 트리스(Tris, pH 9.0) 용액을 용출액의 1/10 부피로 첨가해 주어 pH가 7.0~7.5가 되도록 보정해 주었다. 용출된 항체액을 농축한 후, 인산완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에서 투석하고, 투석이 끝나면 브래드포드법(Bradford assay)을 이용하여 항체의 양을 확인하고 사용 전까지 냉동 보관하였다.
실시예 3. 황열 바이러스에 대한 항체 진단용 신속 면역크로마토그래피 진단 키트의 구성 요소 제조
실시예 3-1. 단일클론항체-금 축합체 및 축합 패드의 제조
황열 바이러스에 대한 항체(이하, '황열인간항체'로 명명) 진단용 신속 면역크로마토그래피 진단 키트를 제조하기 위하여, 먼저 상기 키트의 일 구성 요소인 단일클론항체-금 축합체와 축합 패드를 제조하고자 하였다.
구체적으로, 0.02% HAuCl4 용액을 교반 가열하면서 끓기 시작하면 0.2% 구연산나트륨 용액을 첨가하여 용액을 환원시켜 금 입자(gold particle)을 제작하였다. 이렇게 제작된 금 입자에 상기 실시예 2를 통해 제조한 단일클론항체를 금 입자용액 100 ml당 1 mg을 첨가하여 축합시켰다. 축합된 단일클론항체-금 축합체를 10,000 g에서 원심분리하여 침전시키고 0.1% BSA를 함유하는 생리식염수(PBS)로 용해하여 OD450 값이 10이 되도록 만들었다.
상기의 방법으로 제작된 용액을 NS1과 함께 섞은 후, 곧바로 0.05% 트윈-20이 전처리된 폴리에스테르 또는 유리패드에 처리하고 건조시켜서 축합 패드를 완성하였다.
실시예 3-2. 멤브레인의 제조
상기 키트의 일 구성 요소인, 검사용 IgG 및 IgM 항체가 결합된 멤브레인을 제조하고자 하였다.
구체적으로, 마우스 항-인간 IgG 항체와 마우스 항-인간 IgM 항체를 니트로셀룰로오스 멤브레인의 검사선1(항-인간 IgG)과 검사선2(항-인간 IgM) 부위에 각각 분주하였다. 또한, 멤브레인의 대조선 위치에는 산양 항-마우스 IgG(Arista Biologicals Inc., 미국) 항체를 1.0 mg/ml의 농도로 PBS로 희석하여 분주하였다.
실시예 3-3 버퍼 패드 및 흡수 패드의 제조
상기 키트의 일 구성 요소인 버퍼 패드 및 흡수 패드를 제조하고자 하였다.
구체적으로, 유리 섬유(glass fiber), 코튼(cotton) 또는 셀룰로오스 재질의 패드에 0.1 M 트리스(pH 8.0)를 처리한 후 건조하여 버퍼 패드로 사용하였다.
흡수 패드는 코튼 재질의 패드를 별도의 처리 없이 잘라서 사용하였다.
실시예 4. 황열인간항체 진단용 신속 면역크로마토그래피 진단 키트의 제조
황열인간항체 진단용 신속 면역크로마토그래피 진단 키트(이하, '진단 키트'로 명명)를 제조하기 위하여, 상기 실시예 3을 통해 제조한 각 구성 요소를 이용하여 스트립 및 스트립이 장착된 키트를 제조하였다.
구체적으로, 도 5에 나타낸 바와 같이, 스트립의 아래쪽으로부터 완충용액이 처리된 버퍼패드, 단일클론항체-금 축합체가 처리된 축합패드, 황열 바이러스 항원으로서 NS1이 처리된 항원패드, 검사선에 마우스 항-인간 IgG 항체 또는 마우스 항-인간 IgM 항체; 및 대조선에 산양 항-마우스 IgG 항체가 고정되어 있는 멤브레인을 순차적으로 부착시키고, 상단에는 흡수패드를 부착시켰다.
한편, 상기 키트의 제조에는, 도 5에 나타낸 바와 같은 단일클론항체-금 축합체와 NS1이 함께 처리된 축합패드를 이용할 수도 있다. 이외의 다른 구성은 도 6에 나타낸 키트와 유사하다.
마지막으로, 상기의 방법으로 준비한 스트립을 플라스틱 카세트에 장착하고 조립하여 진단 키트를 완성하였다.
실시예 5. 진단 키트의 사용 및 진단 방법
황열인간항체가 존재하는 시료(인간의 혈청, 혈장, 전혈 등)를 검체 주입부에 5 ㎕ 넣고, 버퍼패드에 버퍼(카보네이트 버퍼, 트리스 버퍼, PBS 등)을 3방울(약 100 ㎕) 떨어뜨렸다. 이후, 시료의 세포 성분인 혈구는 분리되고, 액상 성분인 혈장(혈청)이 멤브레인으로 이동하여 고정화되어 있는 항-인간 IgG(검사선1) 또는 항-인간 IgM(검사선2)과 반응하였다.
구체적으로, 상기 반응용액은 축합패드로 이동하여 단일클론항체-금 축합체를 용해시킨 후, 항원인 재조합 NS1과 결합하였다. 상기 복합체와 재조합 NS1의 결합체가 멤브레인으로 이동하여 "금-단일클론항체-재조합 NS1-검액 내 황열인간항체-마우스 항 인간 IgG 항체(또는 항 인간 IgM 항체)"와 같은 형태로 반응하여 색 띠를 형성하였다. 한편, 항원인 재조합 NS1과 반응하지 않은 단일클론항체-금 축합체는 대조선 부위에 부착되어 있는 산양 항-마우스 IgG와 반응하여 색 띠를 나타내었다.
실시예 6. 진단 키트의 효능 시험
실시예 6-1. 민감도 및 특이도 확인
상기 실시예 1 내지 5를 통해 제작한, 황열 바이러스에 대한 인간 항체 진단용 신속 면역크로마토그래피 진단 키트의 진단적 효능(민감도 및 특이도)을 평가하였다.
구체적으로, 황열 바이러스의 음성 검체 153건과 양성 검체 83건(IgM 양성 32건, IgG 양성 50건)을 사용하였다. 상기 검체들은 모두 ELISA법으로 황열 바이러스에 대하여 양성 또는 음성으로 확인된 것이다.
N = 235 ELISA 합계
양성(+) 음성(-)
IgG(+) IgM(+)
본 발명의 키트
(GenBody YFV IgG/IgM)		 양성(+) IgG
(+)		 48 0 2 50
IgM
(+)		 0 29 1 30
합계 음성(-) 2 3 150 155
합계 50 32 153 235
그 결과, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 황열 바이러스에 대한 IgG 양성 검체에 대해서는 민감도 96.0%(48/50) 및 특이도 98.0%이고, 황열 바이러스 IgM 양성 검체에 대해서는 민감도 90.6%(29/32) 및 특이도 98.0%로 매우 뛰어난 진단 효능을 나타냄을 확인하였다. 이는, 현재까지 보고된 황열 바이러스에 대한 신속진단키트 중에서 가장 우수한 결과임을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 진단 키트 및 진단 방법은 황열 바이러스 감염의 진단에 있어, 우수한 진단적 정확성을 가지며, 고가의 장비의 도움 없이도 현장에서 신속하게 간편히 검사할 수 있는 진단법으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6-2. 인간 유래 IgG 및 IgM 항체에 대한 구분능 확인
상기 실시예 6-1을 통해 본 발명의 진단 키트는 황열 바이러스에 대한 인간 항체를 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있으며, 특히 IgG와 IgM을 구분하여 검출할 수 있음을 확인한바, IgG 및 IgM 인간 항체에 대한 구분능을 더욱 구체적으로 검증하기 위해 황열 바이러스에 대한 백신을 접종한 사람의 혈액을 본 발명의 키트에 적용하였다.
한편, 백신을 접종 받는 경우, 접종 6일 이내의 초기에는 IgM 항체가 생산되며 10일 이후의 중기및 말기에는 IgG 항체가 생산된다. 따라서, 일반적으로 IgM 항체는 일주일 이내의 최근에 황열 바이러스에 노출된 적이 있는지 확인할 때 사용되고, IgG 항체는 항원 바이러스에 의한 황열의 감염 여부뿐만 아니라 접종된 백신에 의해 항체가 잘 생성되었는지 확인할 때 사용된다.
No. 접종일 ~6일 접종일 10일~15일 접종일 20일 이후
YFV IgG/IgM RDT ELISA YFV IgG/IgM RDT ELISA YFV IgG/IgM RDT ELISA
IgM IgG IgM IgG IgM IgG IgM IgG IgM IgG IgM IgG
1 + - + - + + + + - + - +
2 - - - - + + + + + + + +
3 + + + + + + + + - + - +
4 - - - - + - + - - + - +
5 + - + - + + + + - + - +
그 결과, 상기 표 2 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 키트(YFV IgG/IgM RDT)는 IgG 또는 IgM 양성 검체 모두에 대하여 높은 유의성을 나타내며, 이들을 정확하게 구별할 수 있음을 확인하였다. 특히, 기존에 가장 정확한 진단 방법으로 알려진 ELISA법을 통해 확인한 진단 결과와 동일한 결과를 나타냄을 확인하였다.
결론적으로, 본 발명에 따른 진단 키트 및 진단 방법은 황열 바이러스 감염의 진단에 있어 우수한 진단적 정확성을 가지며, 특히 IgG 또는 IgM을 구분하여 진단할 수 있으므로, 황열 바이러스의 감염 시기, 백신 접종에 대한 성공 여부 등을 신속하게 간편히 검사할 수 있는 진단법으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6-3. 교차반응 확인
상기 실시예 1 내지 3을 통해 제작한 황열 바이러스의 신속 면역크로마토그래피 진단 키트의 교차반응을 확인하였다.
구체적으로, 뎅기바이러스 또는 지카바이러스에 감염된 검체를 상기 키트에 적용하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 뎅기바이러스, 지카바이러스에 대해서는 모두 음성 반응을 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 키트는 황열 바이러스에 대한 항체 이외의 다른 바이러스에 대한 항체에 대해서는 교차반응을 보이지 않음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 KCTC13463BP 20180118 한국생명공학연구원 KCTC13473BP 20180130
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  10. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 재조합단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하고, 상기 단일클론항체는 기탁번호 KCTC13463BP의 융합 세포주에서 생산된 것인, 황열 바이러스에 대한 IgG 또는 IgM 항체 검출용 조성물.
  11. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 재조합단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하고, 상기 단일클론항체는 기탁번호 KCTC13463BP의 융합 세포주에서 생산된 것인, 황열 바이러스에 대한 IgG 또는 IgM 항체 검출용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 황열 바이러스에 대한 항체는 인간 유래의 IgG 또는 IgM인 것인, 키트.
  13. 제11항에 있어서, 상기 키트는 황열 바이러스에 대한 항체를 IgG 또는 IgM으로 구분하여 검출하는 것을 특징으로 하는, 키트.
  14. 제11항에 있어서, 상기 키트는 (a) 항-인간 IgM 항체, 항-인간 IgG 항체 및 항-마우스 IgG 항체가 고정화된 멤브레인; (b) 상기 단일클론항체 및 금이 결합된 접합체를 포함하는 축합 패드; (c) 완충용액을 포함하는 버퍼 패드; 및 (d) 흡수 패드를 포함하는 것인, 키트.
  15. 제11항에 있어서, 상기 키트는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 형태인 것인, 키트.
  16. 제11항의 키트를 이용하여 황열 바이러스에 대한 항체의 존재 여부를 판단하기 위한 정보의 제공 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 방법은 환자에게서 분리한 생물학적 시료를 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 재조합단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
  18. 제11항의 키트를 이용하여 황열 바이러스에 대한 항체를 검출하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 방법은 환자에게서 분리한 생물학적 시료를 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 재조합단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인, 방법.
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