KR102127771B1 - 한방복합추출물을 유효성분으로 하는 항산화, 항염증, 항노화 또는 피부진정을 위한 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한방복합추출물을 유효성분으로 하는 피부상태개선용 조성물에 관한 것으로, 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금으로 이루어진 한방추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 항산화, 항염증, 항노화 및 피부진정 효과를 가지며, 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료 및 약학적 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.

Description

한방복합추출물을 유효성분으로 하는 항산화, 항염증, 항노화 또는 피부진정을 위한 조성물{A composition for antioxidation, anti-inflammation, antiaging or skin soothing comprising herb complex extracts}

본 발명은 한방추출물을 유효성분으로 하는 피부상태개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금으로 이루어진 한방추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 항노화 및 피부진정 효과를 가지는 화장료 및 약학적 조성물에 관한 것이다.

인체의 피부는 신체를 외부 자극으로부터 보호하는 역할을 하는 중요한 기관으로서, 피부 표면은 피지와 땀샘에서 분비되는 피지막이 각질층을 덮고 있는 구조로 이루어져 항상 부족한 수분을 보충해주고 윤기 있는 건강한 상태로 유지된다. 또한 피부는 자외선으로부터 피부를 보호하며, 체내 온도 조절 기능을 수행하는 등 신체의 중요한 역할을 담당하고 있다. 피부는 다른 기관에 비해서 소멸과 생성이 주기적으로 활발히 일어나는 기관으로 물리적 보호와 체내 수분 손실을 막아주는 기능을 한다. 각질층의 수분함량이 20%일 때 이상적이지만 수분이 손실이 되면 각질이 탈락되면서 외부에 노출되기 용이하게 되면서 자극에 대한 염증 및 피부 질환이 유발된다.

또한 노화를 가속화시키는 다른 요인으로 수분 부족과 피부 염증을 들 수 있다. 인체의 60~70%가 수분으로 이루어져 있으나, 외부 자극으로 인해 수분을 공기 중으로 빼앗기게 되어 피부는 수분을 잃게 되며, 이로 인해 수분 부족과 피부 탄력 저하 등 피부 노화가 시작된다. 염증 반응은 조직에 해롭거나 해로울 가능성이 있는 요인들로부터 생체를 보호하는 생리적 반응이다. 과다 염증에 의해 유발되는 단백질 분해효소들에 의해 세포 및 결합조직이 손상을 입고 피부탄력을 감소시켜 주름의 원인이 되며 이로 인해 빠른 피부 노화를 초래한다. 따라서 과다염증에 의해 생성되는 단백질 및 지질 분해 효소들을 억제하여 손상되는 세포들을 보호함으로서 피부 노화를 억제할 수 있다.

건조한 피부는 면역기능이 약화되어 아토피 피부염뿐만 아니라 피부 홍반, 가려움증, 따가움 등의 알러지가 유발되기 쉬워진다. 그러므로 피부의 수분손실을 방지하는 것은 중요하다. 이러한 피부를 보호하고 장벽강화 및 피부 증진 효능을 위해 사용하는 화장품에는 여러 가지 성분들이 혼합되어있는데, 피부 보호 목적과 관련이 적은 가용화제, 유화제, 방부제, 향료, 자외선 차단제, 기타 기능성 활성성분은 피부 자극이나 염증, 알러지, 홍반, 부종, 가려움증 등을 유발하는 원인이 된다고 알려져 있다.

따라서 화장품의 자극을 완화시켜 주는 물질에 대한 관심이 높아지고 있으며, 피부자극을 완화하기 위한 여러 가지 방법이 시도되어 왔다. 예를 들면 피부 자극을 유발하는 물질을제거하는 방법이 시도되었다. 그러나, 기능성 원료 자체가 자극원으로 작용하는 경우가 허다하기 때문에 이와같은 연구에는 한계가 있으며, 기능성 원료의 효과는 그대로 유지하면서, 부작용을 줄이고 자극완화 효과를 갖는 물질을 이용하는 것이 요구된다.

이에 본 발명자들은 항산화, 항염증, 항노화 및 피부진정 효과를 가지면서 인체 부작용이 적은 새로운 천연물질을 개발하기 위해 계속 연구를 진행한 결과, 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금으로 이루어진 한방 복합추출물이 세포 독성이 없으면서도 항산화, 항염증, 항노화 및 피부진정 효과를 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 항산화, 항염증, 항노화 및 피부 진정 효과를 가지면서 인체 안정성이 우수한 조성물을 제공하기 위한 것이다.

상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금으로 이루어진 한방복합추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 항염증, 항노화 및 피부 진정을 위한 조성물을 제공한다.

바람직하게, 본 발명에서 한방복합추출물을 포함하는 조성물은 화장료 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.

본 발명에 있어서, 항노화란 피부 보호 및 피부 상태 개선, 피부 미백, 피부 노화 및 주름의 예방 또는 개선, 모공 수축, 축소, 피부 수렴, 피부 보습, 피부 진정, 피부 보호 및 피부의 염증 반응의 완화, 면역질환 개선능, 또는 피부 장벽 기능 개선, 피부자극 완화, 피부 세포 증식 및 재생능, 항산화능, 콜라겐 합성 증진능, 자외선에 따른 피부 보호, 자외선에 의한 피부 손상개선, 항균, 여드름개선 등을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명에 있어서, 피부진정은 피부 트러블을 완화시키는 것을 의미하며, 예를 들어 여름철 같은 경우나 스트레스로 인해서, 피지가 더 많이 생기다보면 피부 트러블이 발생하고, 피부 트러블이 일어난 부위는 점점 더 빨개지게 되는데, 이러한 피부 트러블을 완화시키는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 한방복합추출물의 혼합 중량비율은 다양하게 변화시킬 수 있으나, 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금을 1-5 : 1-5 : 1-5 : 1-5의 건조 중량비로 혼합하는 것이 바람직하며, 특히 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금의 건조 중량비율을 2:1:1:1로 혼합하는 것이 보다 더 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 병풀은 산형화목 미나리과의 여러해살이풀로, 아프리카의 마다가스카르 섬이 원산지이나 인도양 해안지역을 비롯한 서남아시아 및 중남미의 고온 다습한 곳에 폭넓게 자생하고 있으며 국내에서는 제주도 및 남부 도서 지방에 분포하고 있다. 또한 병풀은 아시아 등지에서 전통요법을 통해 오래전부터 약용으로 이용되어 왔으며 피부외상, 만성궤양, 뇌질환 등의 치료에 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 특히 수용성 추출물 내 주요성분인 아시아토시코사이드, 마데카소사이드, 아시아트산 및 마데카스산은 피부조직의 재생력을 갖는 물질들로 콜라겐 생성 촉진을 통한 세포외기질 생성의 개선효과가 보고되고 있으며, 실제로 이 중 아시아티코사이드는 피부주름 개선용 유효성분으로 인증 및 사용되고 있다.

본 발명에서 사용하는 약쑥은 국화과에 속하는 다년생 초본이며, 전호를 말린 것을 애엽 또는 애호라고 하며, 줄기와 잎은 약용으로, 어린잎은 식용으로, 보통 잎은 약재로 이용한다. 우리나라 전역에 걸쳐 자생하는 번식력이 강하다. 약 400여종의 아트레미시아(Atremisia) 속 식물 중 300여 종이 우리나라에 자생하는 것으로 추정된다. 약쑥은 식용뿐만 아니라 한방에서는 출혈, 지혈 등의 효과가 보고되었다. 쑥의 향기 성분이나 정유성분은 살충, 항균 및 항종양 등의 여러 가지 생리적 활성이 있는 것으로 알려져 있으며, 주요성분은 시네올(cineole), a-투조(thujon), 세스퀴테르펜(sesquiterpene), 세스퀴테르펜 알콜, 캠퍼(camper), 테르피넨-4-올(terpinene-4-ol), 쿠마린(coumarin), 카필린(capillin), 보르네올(borneol) 등이 있다.

본 발명에서 사용하는 팔각회향은 붓순나무과(Illciacease)에 속하며, 미국, 멕시코, 동남아 등지에 40여 종이 있으며 항염, 거담제, 위장질환 등의 치료를 위해 민간 및 전통의학으로 사용되었다. 그중 팔각회향은 별모양과 아니스향의 열매로 중국 및 베트남에서 주로 자라며 아시아에서는 향신료로, 라틴아메리카에서는 차료 사용되고 있다. 팔각회향은 열매로서 그대로 또는 끓는 물에 데쳐서 말린 것이며 대회향으로 불린다. 팔각회향의 성분은 정유, 세스퀴테르펜, 페닐프로파노이드(phenylpropanoids), 리가난(liganan) 등으로 구성되어 있으며, 특히 정유성분에는 트랜스-아네톨(trans-anethole), 아니스알데히드(anisaldehyde), 리모넨(limonene), 에스타라골(estragole), 아니실 아세테이트(anisyl acetate), 페니쿨린(feniculin), 리날울(linalool), A-트랜스-베르가모텐(bergamotene) 등이 포함되어 있고 트랜스-아네톨(trans-anethole)이 86-93% 가량 포함되어 있다. 세스퀴테르펜류로 베르아니사티온(veranisations) A, B, C, 아니사틴(anisatin), 메오아니사틴(meoanisatin) 등이 있으며, 페닐프로파노이드 및 리그난으로는 베리몰(verimols) A, B, C, D, E, F, K 등이 보고되어 있다.

본 발명에서 사용하는 황금(黃芩)은 꿀풀과에 속한 다년생 초본이며, 높이는 20-60cm에 달하며 한국, 중국, 몽골 및 시베리아 동부지역에 분포하며 산지의 풀밭에서 자라며 지금은 흔히 재배하고 있다. 황금의 껍질을 제거한 뿌리로 가을에 채취하여 잔뿌리와 겉껍질을 제거하여 건조한 것이다. 한방에서 기관지 천식, 아토피성 피부염, 고지혈증 및 동맥경화증과 같은 알러지성 염증성 질환을 치료하기위한 치료제로 사용되었다. 황금의 플라보노이드 성분인 바이칼레인(baicalein), 우고닌(wogonin), 우고노사이드(wogonoside) 등 다양한 생리활성물질이 함유되어 있다. 효능으로는 항염, 항알러지, 항박테리아 및 항바이러스와 같은 다양한 활성을 가지며, 그밖에도 지질과산화억제, 라디칼성생억제 등의 항산화활성이 보고되었다.

본 발명의 용어 "추출물(extract)"은 생약을 적절한 침출액으로 짜내고 침출액을 증발시켜 농축한 제제를 의미하는 것으로, 이에 제한되지는 않으나, 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 상기 한방복합추출물은 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금의 4가지 건조 한방약재를 먼저 혼합하고 추출용매로 추출하거나, 또는 각각의 한방약재를 먼저 추출한 다음 혼합할 수도 있다.

본 발명의 한방추출물은 당업계에 공지된 일반적인 추출방법, 분리 및 정제방법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법으로는 열탕 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용하는 추출 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 이들의 혼합용매(예를 들어, 함수알코올, 함수글리세린, 함수에틸렌글리콜, 함수프로필렌글리콜, 함수 부틸렌글리콜)중에서 선택된 것일 수 있고, 물, 탄소수 1 내지 4의 무수알코올 또는 함수알코올에서 선택된 용매로 추출되는 것이 바람직하다. 여기서, 탄소수 1 내지 4의 알코올은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, tert-부탄올일 수 있으며, 에탄올이 바람직하다. 여기서, 함수알코올은 물을 0.3 내지 90(wt/wt)%로 함유할 수 있다. 이들 추출용매 중 함수 에탄올이 가장 바람직하며, 함유된 물의 양은 30 내지 90(wt/wt)% 내가 바람직하며, 60(wt/wt)%가 보다 더 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금추출물은 예를 들어, 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금 각각의 건조중량의 1~50배 부피량의 물, 탄소수 1~4의 알코올 또는 이들의 함수 알코올과 중에서 선택된 추출용매를 부가하여 30 내지 100℃에서 1 내지 48시간 동안 가열 추출하거나 또는 4∼30℃에서 3∼20일간 침적시켜 유효성분을 추출한 후 추출용매를 감압농축기로 농축하여 각각 수득될 수 있다. 이 때 용매가 증발되는 것을 방지하기 위하여 냉각 콘덴서를 구비한 추출기를 사용할 수 있다.

본 발명에서 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금의 각 사용부위는 잎, 꽃, 뿌리, 종자 모두 사용가능하다.

본 발명의 조성물에서 병풀, 약쑥, 팔각회향, 황금추출물은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.001~10.0중량%의 양으로 조성물에 첨가될 수 있고, 바람직하게는 0.001∼5.0중량%의 양으로 조성물에 첨가될 수 있다.

본 발명의 한방복합추출물을 함유하는 조성물은 항산화 효과, 항염증 효과, 항노화 효과 및 피부진정효과를 나타내며, 천연 물질로서 세포독성이 거의 없다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 한방복합추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따른 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 한방복합추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 검등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기의 병풀, 약쑥, 팔각회향, 황금추출물 외에 다른 성분들을 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 예를 들어, 화장료 조성물에 통상적으로 사용 되는 착색제(색소), 착향제(향료), 현탁화제, 유화제, 용해보조제, 안정제, 등장제, pH 조절제, 점도조절제, 용제, 방부제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시양태에 따른 약학적 조성물은 한방복합추출물 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 당분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑시르제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 한방복합추출물은 천연물질로서 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료 및 약학적 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.

본 발명의 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금의 한방복합추출물을 함유하는 조성물은 항산화, 항염증, 항노화 효과 및 피부진정 효과가 가지며, 세포 독성 및 피부 부작용이 없어 화장료 및 약학적 조성물에 안전하게 사용할 수 있다.

도 1는 한방복합추출물의 종양 괴사 인자-α 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 한방복합추출물의 인터루킨 (IL)-1β 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 한방복합추출물의 IL-8 생성량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 한방복합추출물의 세포독성을 나타낸 그래프이다.

이하 실시예 등을 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 등은 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 참조예 및 실시예 등에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금추출물의 한방복합추출물 제조

병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금추출물을 정제수로 세척한 후 건조시킨 병풀 25g, 약쑥 25g, 팔각회향 25g 및 황금 25g(1:1:1:1의 중량비율)을 증류수 2㎏을 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기에서 60℃로 2시간 가온하여 3회 추출한 후 300메쉬 여과지로 여과하고, 1주일간 실온에서 방치하여 침전물을 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하였다. 이어서, 감압 농축기를 이용하여 40~50℃의 온도에서 농축한 후 동결건조시킨 한방복합추출물 분말 12g을 얻었다.

<실시예 2 내지 17>

하기 표 1에 나타낸 바와 같은 중량비율로 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금을 혼합하여 실시예 1에 기재된 추출방법에 따라 한방복합추출물을 제조하였다.

<비교예 1 내지 15>

하기 표 1에 나타낸 바와 같은 중량비율로 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금을 혼합하여 실시예 1에 기재된 추출방법에 따라 한방복합추출물을 제조하였다.

구 분	혼합 중량비율
실시예 1	1:1:1:1
실시예 2	1:1:1:2
실시예 3	1:1:2:1
실시예 4	1:2:1:1
실시예 5	2:1:1:1
실시예 6	1:1:2:3
실시예 7	1:2:3:1
실시예 8	2:3:1:1
실시예 9	3:2:3:1
실시예 10	3:1:1:4
실시예 11	1:4:4:1
실시예 12	1:4:2:4
실시예 13	4:1:1:1
실시예 14	1:2:1:5
실시예 15	1:1:5:1
실시예 16	1:5:1:2
실시예 17	5:1:1:1
비교예 1	1:-:-:-
비교예 2	-:1:-:-
비교예 3	-:-:1:-
비교예 4	-:-:-:1
비교예 5	1:1:-:-
비교예 6	1:-:1:-
비교예 7	1:-:-:1
비교예 8	-:1:1:-
비교예 9	-:1:-:1
비교예 10	-:-:1:1
비교예 11	1:-:1:-
비교예 12	1:1:1:-
비교예 13	1:1:-:1
비교예 14	1:-:1:1
비교예 15	-:1:1:1

<시험예 1> 항산화 효과 측정

(1) DPPH 라디칼 소거능 측정

전자공여능 (EDA; electron donating ability)은 Blois의 방법(1958)에 따라 측정하였다. 각 시료용액 2 mL에 0.2 mM의 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질 (DPPH) 1 mL 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거능은 다음 수학식 1에 따라 계산하였다.

이 때, OD_Sample은 시료와 DPPH용액을 섞어 측정한 흡광도 값이며, OD_Blind는 시료 대신 에탄올을 넣어 측정한 흡광도 값이다.

DPPH 라디칼 소거능의 측정은 일종의 전자공여능을 측정하는 방법으로서 환원력이 클수록 강력한 항산화제가 된다는 것에 착안하여 DPPH의 환원 정도를 기준으로 측정물질의 환원력과 항산화력을 가늠할 수 있다. 지질과산화의 연쇄반응에 관여하여 유리 라디칼의 전자를 공여하여 산화를 억제시키는 DPPH 전자공여능 실험해서 한방복합추출물을 10~1,000 ug/ml 농도로 조절 및 첨가하여 측정하였다. 양성대조군으로 항산화제인 디부틸히드록시톨루엔 (dibutyl hydroxy toluene, BHT) 및 비타민 C를 사용하였으며, 50% 저해농도(IC₅₀)는 하기 표 2에 나타내었다.

구 분	IC50
실시예 1	25.2
실시예 2	26.4
실시예 3	24.5
실시예 4	26.5
실시예 5	35.4
실시예 6	31.1
실시예 7	23.6
실시예 8	24.1
실시예 9	22.4
실시예 10	24.1
실시예 11	24.6
실시예 12	25.5
실시예 13	33.5
실시예 14	25.2
실시예 15	21.6
실시예 16	23.1
실시예 17	32.1
비교예 1	8.1
비교예 2	7.3
비교예 3	8.4
비교예 4	8.3
비교예 5	9.1
비교예 6	11.4
비교예 7	12.1
비교예 8	13.4
비교예 9	13.5
비교예 10	12.1
비교예 11	15.5
비교예 12	16.3
비교예 13	14.2
비교예 14	16.5
비교예 15	15.4
BHT	101.4
비타민 C	24.8

상기 표 2에서 보듯이, 본 발명의 한방복합추출물은 ABTS 라디칼 저해활성이 우수하여 항산화 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 양성대조군인 비타민 C보다 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

(2) ABTS 라디칼 양이온 소거능 측정

2,2-아지노-비스(3-에틸-벤티아졸린-6-술폰산)(ABTS) (14.8 mM)와 과항산 칼륨 (5 mM)을 혼합(1:1, v/v)하고 실온 암소에서 16시간 반응시켰다. ABTS 용액은 3차 증류수로 희석하여 734 nm에서 흡광도 0.700 ± 0.05로 맞추어 사용했다. 이 후 한방복합추출물 (20 μL)과 ABTS 용액 (180 μL)을 96-웰 플레이트에 넣고 암소에서 30분간 반응했다. 반응액은 723 nm에서 흡광도를 측정했다. 공시험은 증류수 (200 μL)를 사용했고, 대조군은 증류수(20 μL)와 ABTS 용액 (180 μL)이 사용됐다. 자유 라디칼 소거능은 다음 수학식 2에 따라 계산하였다.

실험값은 3회 반복하고 측정한 후 평균값으로 나타냈다.

양성대조군으로 항산화제인 디부틸히드록시톨루엔 (dibutyl hydroxy toluene, BHT)를 사용하였으며, 50% 저해농도(IC₅₀)는 하기 표 3에 나타내었다.

구 분	IC50
실시예 1	33.5
실시예 2	32.6
실시예 3	33.2
실시예 4	32.6
실시예 5	35.2
실시예 6	32.5
실시예 7	31.4
실시예 8	33.6
실시예 9	31.2
실시예 10	31.5
실시예 11	31.7
실시예 12	31.1
실시예 13	31.5
실시예 14	33.4
실시예 15	31.3
실시예 16	32.3
실시예 17	32.2
비교예 1	4.6
비교예 2	6.4
비교예 3	5.1
비교예 4	7.3
비교예 5	8.5
비교예 6	10.1
비교예 7	12.2
비교예 8	11.3
비교예 9	12.4
비교예 10	11.2
비교예 11	14.1
비교예 12	11.3
비교예 13	14.1
비교예 14	14.3
비교예 15	12.3
BHT	34.1

상기 표 3에서 보듯이, 본 발명의 한방복합추출물은 ABTS 라디칼 저해활성이 우수하여 항산화 효과를 가지는 것을 확인할 수 있었다.

< 시험예 2> 항염활성 측정

1) NO 생성량 측정

RAW264.7 대식세포는 24-웰 세포 배양 플레이트에 웰 당 2.5 × 10⁵ cells/mL로 분주하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터 조건하에 18시간 배양하였다. 배양된 세포는 NO의 생성을 유도하기 위하여 리포폴리사카라이드 (LPS) 1 μg/mL가 포함된 배지로 교환한 후, 상기 실시예에서 제조된 한방복합추출물을 첨가하여 24시간 재배양하였다. 이후 생성된 NO의 양은 세포배양 상등액 100 μL와 Griess 시약 (0.1% 나프틸에틸렌디아민 디하이드로클로라이드 및 2.5% 인산 내 1% 설파닐아민, 1:1) 100 μL를 혼합하여 96-웰 플레이트에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA 리더(Xmark microplate absorbance spectrophotometer, Bio-Rad, XMark^TM, Japan)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 질산나트륨 (NaNO₂)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

NO는 반응성이 강한 무기 저분자의 활성산소 중 하나이며, L-아르기닌을 기질로 NOS에 의해 L-시트룰린으로 합성되며, 박테리아를 죽이거나 암세포에 대항하는 세포사멸 유도, 신호전달, 혈액응고 및 혈소판억제, 혈관 확장에 관여하는 신경전달물질 등 체내 생리적, 병적인 반응에서 중요한 역할을 한다. 그러나 과도하게 형성된 NO는 염증을 유발하여 조직손상, 유전자 변이, 신경손상 및 관절염과 기관지염 같은 면역질환을 일으킬 수 있다(Weise & Nathan 1991; Hyun et al., 2015).

구 분	NO 생성(%)
실시예 1	63.3
실시예 2	65.2
실시예 3	63.4
실시예 4	64.4
실시예 5	60.8
실시예 6	64.1
실시예 7	63.3
실시예 8	63.1
실시예 9	66.3
실시예 10	65.8
실시예 11	66.6
실시예 12	63.4
실시예 13	61.5
실시예 14	63.4
실시예 15	65.7
실시예 16	64.8
실시예 17	60.2
비교예 1	84.3
비교예 2	86.4
비교예 3	85.3
비교예 4	87.5
비교예 5	88.1
비교예 6	90.9
비교예 7	92.1
비교예 8	91.6
비교예 9	85.4
비교예 10	84.1
비교예 11	84.2
비교예 12	81.3
비교예 13	84.5
비교예 14	84.1
비교예 15	82.1
대조군	100
무처리군	43

그 결과 LPS 처리군(대조군)은 LPS 무처리군에 비해 높은 NO 발현량을 나타내었으며, 실시예 1 내지 17은 최고 40%의 NO 생성 저해율을 나타내었으며, 비교군 1 내지 15는 최대 18%의 NO 생성 저해율을 나타내었다.

2) 사이토카인(Cytokine) 생성량 측정

효소결합면역흡착 분석 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 통하여 TNF-α, IL-1β 및 IL-8과 같은 염증성사이토카인 생성에 미치는 한방복합추출물의 혼합물의 효과를 검증하기 위해서 LPS (1 μg/mL)로 RAW 264.7 세포를 자극하고 동시에 추출물을 처리한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양한 후 배양액을 회수하여 각각의 TNF-α, IL-1β, IL-6 함량은 ELISA 사이토카인 키트 (R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 제조사에서 제시한 방법에 따라 실시하였다.

항체가 코팅된 96-웰 플레이트에 표준용액(100 μL) 및 세포배양액(100 μL)을 첨가하여 실온에서 2시간 동안 반응시키고 세척액으로 세척한 후 검색 항체 (100 μL)를 첨가하여 1시간 동안 결합시켰다. 다시 각 웰에 아비딘-HRP 100 μL를 첨가하고 30분 동안 반응한 후, 세척액으로 세척한 후 TMB 100 μL를 첨가 후 암실에서 20분 동안 반응시키고 정지 용액(stop solution) 100 μL을 첨가하여 반응을 450 nm에서 흡광도를 측정함으로써 사이토카인의 분비량을 계산하였다.

대식세포는 선천면역과 획득면역에 관여하여 체내의 항상성을 유지하는 세포로, 체내에 항원이 침입하게 되면 식세포 작용으로 항원을 제거하거나 항원을 다른 면역세포에 제시하여 염증반응이 일어나도록 유도해 항원의 증식을 막는 역할을 한다(Lee et al., 2007). 대식세포는 인터페론 (IFN), 당지질 (LPS) 등의 면역증강물질에 의해 활성이 증가되며, 면역반응을 증가시키는 종양 괴사 인자-α (TNF-α), 인터루킨 (IL)-1β, IL-8, 산화질소(nitric oxide, NO) 등을 분비하게 된다(Hibbs et al., 1998). TNF-α는 비만세포가 활성화되면 분비하는 다기능성 사이토카인으로 면역반응과 염증반응에 관여하며, IL-1β, IL-8과 같은 다른 염증성 사이토카인의 분비를 촉진한다(Barnes and Adcock, 1993; Butler et al., 1995). IL-8은 호중구, 림프구, 호산구의 동원을 촉진하는 화학주성인자로서, 호중구를 활성화시켜 리소좀 효소를 방출하고 활성산호 생산을 유발하며, 관절염이나 패혈증 등과 같은 염증성 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다(Harada et al., 1996). 또한 IL-1β는 단핵백혈구(monocyte)와 대식세포계 세포에 의해 생산되는 사이토카인으로서 T세포를 활성화시키고, T세포에서 분비되는 IL-2와 같은 사이토카인의 활성을 증진시키는 등 사이토카인 네트워크에 중요한 역할을 한다(Cah et al., 2010).

상기 실시예에서 제조된 한방복합추출물을 LPS(1 μg/mL) 처리한 RAW 264.7 대식세포의 배양 상층액으로부터 분비되는 사이토카인(TNF-α, IL-1β, IL-8) 분비량을 각각 측정하였다.

도 1는 한방복합추출물의 종양 괴사 인자-α 생성량을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, TNF-α의 경우 LPS 처리군(대조군)은 LPS 무처리군에 비해 높은 TNF-α 발현량을 나타내었으며, 실시예 1 내지 17은 최대 30%의 TNF-α 생성 저해율을 나타내었음을 확인할 수 있었다.

도 2는 한방복합추출물의 인터루킨 (IL)-1β 생성량을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, IL-1β의 경우 LPS 처리군(대조군)은 LPS 무처리군에 비해 높은 IL-1β 발현량을 나타내었으며, 실험군 1 내지 8은 최대 29%의 IL-1β 생성 저해율을 나타내었음을 확인할 수 있었다.

도 3은 한방복합추출물의 혼합물의 IL-8 생성량을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, IL-8의 경우 LPS 처리군(대조군)은 LPS 무처리군에 비해 높은 IL-8 발현량을 나타내었으며, 실험군 1 내지 8은 최대 27%의 IL-8 생성 저해율을 나타내었음을 확인할 수 있었다.

<시험예 3> 한방복합추출물의 세포독성시험

한방복합추출물에 대한 세포독성 여부를 조사하였다. 본 실험에서는 인간 각질세포주인 HaCaT 세포와 마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포 배양을 이용하여 세포독성 실험(MTT)을 수행하였다. HaCaT 세포와 RAW264.7 세포에 샘플을 처리한 후, 무혈청 (serum free) 상태로 세포를 배양하여 세포의 세포독성효과를 MTT 분석방법을 이용하여 측정하였다. MTT (3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide)는 담황색의 기질로서 생세포의 미토콘드리아 내의 호흡쇄효소에 의해 개열하고 암청색의 포르마잔(formazan)을 생성한다. 죽은 세포에서는 반응이 일어나지 않으므로 이 포르마잔의 생성량은 생세포수 측정에 이용된다. 이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4는 한방복합추출물의 세포독성을 나타낸 그래프이다. 여기에서 보듯이, HaCaT의 경우, 한방복합추출물(실시예 5)은 200 ppm 이하 농도에서는 세포독성을 나타내지 않았다. 그러나 200 ppm 이상의 농도에서는 약간의 세포독성을 나타내었다. RAW264.7의 경우, 한방복합추출물은 100 ppm이하의 농도에서는 세포독성을 나타내지 않았으며, 100 ppm 이상의 농도에서는 약간의 세포독성을 나타내었다.

<시험예 4> 한방복합추출물의 인체 피부에 대한 안전성 확인 실험

상기 시험예 3의 세포독성시험에서 한방복합추출물은 세포독성이 없다고 판명되었으므로, 실제 인체 피부에도 안전한지 여부를 확인하기 위하여 피부 안전성 검증실험을 수행하였다. 스쿠알렌을 기본으로 한방복합추출물을 1, 10 및 100 ppm 첨가한 제형을 제조하여 이를 사용하여 건강한 30명의 성인을 대상으로 윗팔뚝 부위에 격일로 총 9회의 24시간 누적 첩포를 시행하여 한방복합추출물이 피부에 자극을 주는지 여부를 측정하였다. 첩포방법은 핀 챔버 (Finn chanber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였으며 챔버에 상기에서 제조한 피부외용제를 각각 15 ㎕씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응의 정도를 하기 수학식 3을 이용하여 점수화하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

상기 수학식 3에서, 반응도에서 ±는 1점, +는 2점 및 ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균반응도가 3 미만일 때 안전한 조성물로 판정된다.

시험물질		반응이 나타난 피검자 수									평균 반응도
		1주			2주			3주
		1차	2차	3차	1차	2차	3차	1차	2차	3차
		a b c	a b c	a b c	a b c	a b c	a b c	a b c	a b c	a b c
대조군 (스쿠알렌)		- - -	- - -	- - -	- - -	1 - -	- - -	- - -	- - -	- - -	0.09
한방복합 추출물	1ppm	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	0.00
	10ppm	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	0.00
	100ppm	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	0.00

상기 표 5에서, a : -, b : +, c :++를 나타낸다.

상기 표 5에서 보듯이, 대조군의 경우 -, +, ++에 해당하는 사람의 수가 2주차의 2차 첩포에서 각각 1명, 0명, 0명이었고, 나머지 기간에 대한 첩포에 대하여는 피부에 반응이 나타나지 않았다. 그리고, 한방복합추출물을 실험한 모든 시험군에서는 피부에 반응이 나타나지 않았다. 상기 표 5의 결과를 상기 수학식 3에 따라 계산한 결과, 대조군의 평균 반응도는 0.09이며, 시험군의 평균 반응도는 1, 10 및 100 ppm에서 각각 0.00, 0.00 및 0.00로 나타나 안전한 물질로 판단되었다.

<제조예 1> 화장료의 제조

1-1. 크림의 제조

하기 표 6과 같이 한방복합추출물(실시예 5)을 유효성분으로 포함하는 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량 %)
한방복합추출물(실시예 5)	0.03 또는 0.01
카보머940	0.12
트레할로스	3.00
솔비톨	1.00
1,3-부틸렌 글리콜	5.00
비스-피이지-18 메틸에테르 다이메틸 실란	1.00
글라이세롤	4.00
디엘-판테놀	0.30
이디티에이	0.02
폴리솔배이트 60	0.80
글리세롤 모노스테아레이트	1.20
글리세롤 스테아레이트/피이지-100 스테아레이트	0.90
솔비탄 세스퀼레테이트	0.30
라네트-오	1.60
세틸 에틸헥소노에이트	3.00
카프릴릭/카르릭 트리글리세라이드	1.00
사이클로메티콘	6.50
트리리에탄올아민	0.13
페노닙	0.70
향, 방부제	미량
정제수	잔량
합계	100

1-2. 토너의 제조

하기 표 7과 같이 한방복합추출물(실시예 5)을 유효 성분으로 포함하는 토너를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량 %)
한방복합추출물(실시예 5)	0.03 또는 0.01
다이소듐 이디티에이	0.01
아미노코트	1.00
디엘-판테놀	0.10
트레할로스	0.10
글리세롤	3.00
카보폴 이티디 2020	0.07
알콜	3.00
비스-피이지-18 메틸 에테르 디메틸 실란	0.20
페닐 트리메티콘	0.10
피이지-40 하이드로게네이티드 코스톨 오일	0.15
메틸파라벤	0.05
트리에탄올아민	0.13
페노닙	0.70
페녹시에탄올	0.50
향, 방부제, 색소	미량
정제수	잔량
합계	100

1-3. 로션의 제조

하기 표 8와 같이 한방복합추출물(실시예 5)을 유효성분으로 포함하는 로션을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량 %)
한방복합추출물(실시예 5)	0.03 또는 0.01
카보머941	0.05
알란토인	3.00
허브엑스 히알루론	1.00
메틸파라벤	0.10
글리세롤	1.10
다이소듐 이디티에이	0.05
폴리솔베이트60	1.00
솔리탄 세스키올레이트	1.00
스테아릭 에시드	1.00
글리세롤 스테아레이트/피이지-100 스테아레이트	1.50
세틸 알콜	1.30
프로필파라벤	0.05
부틸파라벤	0.05
마카다미아 오일	0.05
디메티콘	0.50
카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	1.00
미네랄오일	4.50
트리에탄올아민	0.10
페녹시에탄올	0.50
향	미량
정제수	잔량
합계	100

< 시험예 4> 한방복합추출물의 피부진정 효과

피부 트러블이 심한 지원자 대상으로 평가 그룹당 30명이 되도록 그룹을 나눈 후, 각 그룹당 실시예 5에서 얻어진 한방복합추출물을 지급하고 2주일간 매일 1 회 제품을 사용하게 한 후, 평가전과 사용 2주일 후의 피부 트러블 완화 효과 및 피부 진정 효과를 평가하게 하여 평균을 산출하여 각 시험물질의 피부 진정효과를 평가하였다.

	피부 트러블 완화 효과	피부 진정 효과
대조군(정제수)	1.0	2.0
한방복합추출물	4.8	4.9

상기 표 10에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 한방복합추출물은 정제수만을 사용한 것보다 피부 트러블 완화 효과 및 피부 진정 효과, 피부 트러블 완화효과가 모두 향상되는 것을 확인할 수 있었다.

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Claims (3)

1. 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금이 2: 1: 1: 1의 중량비율로 혼합된 한방복합추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 화장료 조성물.
2. 병풀, 약쑥, 팔각회향 및 황금이 2: 1: 1: 1의 중량비율로 혼합된 한방복합추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물.
3. 삭제

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