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KR102081356B1 - 포자를 닮은 세포들의 계군 및 그 용도 - Google Patents

포자를 닮은 세포들의 계군 및 그 용도 Download PDF

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KR102081356B1
KR102081356B1 KR1020187021471A KR20187021471A KR102081356B1 KR 102081356 B1 KR102081356 B1 KR 102081356B1 KR 1020187021471 A KR1020187021471 A KR 1020187021471A KR 20187021471 A KR20187021471 A KR 20187021471A KR 102081356 B1 KR102081356 B1 KR 102081356B1
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마틴 피. 버칸티
찰스 에이. 버칸티
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브이셀 세라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

특이적인 세포 표면 마커 및 유전자 발현 마커를 발현하는 포자를 닮은 세포들의 계군이 제공된다. 일실시예에서, 상기 세포들은 Oct4, 나노그(nanog), Zfp296, 크립토(cripto), Gdf3, UtFl, Ecatl, Esgl, Sox2, Pax6, 네스틴(nestin), SCA-1, CD29, CD34, CD90, Bl 인테그린(integrin), cKit, SP-C, CC10, SF1, DAX1, 및 SCG10으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 세포 표면 마커 또는 유전자 발현 마커를 발현한다. 또한, 포자를 닮은 세포들의 모집단에서 관심 대상이 되는 포자를 닮은 세포들의 계군을 정제하는 방법과, 분리된 포자를 닮은 세포들을 내배엽, 중배엽, 또는 외배엽 기원의 세포들로 분화하도록 유도하는 방법이 제공된다. 포자를 닮은 세포들은 3개의 배엽층 모두로부터 유래하는 세포들을 생성하는데 사용될 수 있고, 다양한 조직, 예를 들어 망막, 장, 방광, 신장, 간, 폐, 신경계, 또는 내분비계에서 기능성 세포들의 결핍을 갖는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

포자를 닮은 세포들의 계군 및 그 용도 {SUBPOPULATIONS OF SPORE-LIKE CELLS AND USES}
본 발명은 포자를 닮은 세포들의 계군(系群)의 동정, 분리 및 용도에 관한 것이다.
분화만능 세포들(pluripotent cells)의 사용은 의학 연구 분야에서 이로운데, 특히 유전적 결함, 상처 및/또는 질환 과정의 결과인 조직 손상을 치료하는 물질 제공 분야에서 유익하다. 이상적으로, 관련 세포 타입으로 분화할 수 있는 세포들은 이를 필요로 하는 환자로 이식될 수 있으며, 이식 세포들은 장기의 미세 환경과 상호작용을 하고 필요한 세포 타입을 제공하여 상처를 치료하게 된다. 배아줄기세포(Embryonic stem (ES) cells)는 배반포(blastocyst)에서 유래한 분화만능 세포로서, 시험관내에서는 미분화상태에서 무제한적으로 증식될 수 있고 생체 내에서는 모든 세포 계통(cell lineages)으로 분화될 수 있으며 시험관내에서도 대부분의 세포 타입으로 분화되도록 유도될 수 있다(Martin, Proc Natl Acad Sci U.S.A., 78:7634-7638 (1981)). 비록 배아줄기세포(ES cells)가 인간에서 분리되지만, 치료제 및 연구분야에서의 배아줄기세포의 이용은 윤리적인 문제와 부닥치고 있다 (Frankel, Science. 287:1397 (2000)).
배아가 아닌 조직에서 줄기세포를 분리하고자 하는 노력들이 있는데, 예를 들어 조혈모세포(미국특허 제5,750,397호), 신경조직(Gage, Science, 287:1433-1438 (2000)), 위장 조직(Potten, Philos Trans R Soc LondB Biol Sci. 353:821-830 (1998)), 상피 조직(Watt, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci., 353:831-837 (1998)) 및 중간엽 줄기세포(MSC)(미국특허 제5,736,396호)로부터 줄기세포를 분리하고자 하는 연구들이 있었다. 다른 세포군으로서, 다기능성인원본세포(multipotent adult progenitor cells; MAPCs)가 골수로부터 정제된 바가 있다 (Reyes et al., Blood, 98(9):2615-2625 (2001); Reyes & Vetfaillie, Ann NY Acad Sci, 938:231-235 (2001)). 이들 세포는 텔로미어 단축이나 핵형 이상으로의 발전 없이 세포집단 단위로 100배 이상으로 늘리는 것이 가능하다. 또한, 다기능성인원본세포(MAPCs)는 제한된 배양 조건 하에서 다양한 중간엽 줄기세포 타입(예를 들어, 조골세포, 조연골세포, 지방세포 및 골격 근원세포(skeletal myoblast)), 내피조직 및 신경외배엽 세포로 분화할 수 있는 것으로 보고되었으며, 최근에는 간세포(hepatocytes)로 분화할 수 있는 것이 알려졌다(Schwartz et al., Clin Invest, 109:1291-1302 (2000)).
환자의 재생 치료를 위한 배아줄기세포 또는 다른 분화만능 세포들에 대한 도전은 이들 세포를 환자 치료에 필요한 특정 세포 타입으로 세포를 생장시키고 분화시키는 것이다. Schuldiner et al, Proc Natl Acad Sci USA, 97:11307-11312 (2000)의 문헌에 기술된 바에 따르면, 사용된 8개의 생장 인자들 어느 것도 한가지 세포 타입으로의 배타적 분화를 이끌어내지 못했다. 따라서, 상처 및/또는 다양한 장기 및/조직 질환의 치료를 포함하는 다양한 응용에 적합하고 이식가능한 분화다능 및 분화만능 세포들의 집단을 생성하기 위한 새로운 접근방식에 대한 요구가 계속되고 있다. 더욱이, 분화다능 세포 또는 분화만능 세포는 살아 있는 조직에서 채취해야 하므로 재료 확보 차원에서 제약이 있다.
한편, 미국공개특허공보 제2004/0057942호 및 제2004/0033598호(Vacanti, et al.)는 산소 결핍에 대해 예외적으로 높은 내성을 갖는 작은 원시세포(primitive cells)를 개시하고 있다. "포자를 닮은 세포"("spore-like cells")로 불리는 이들 세포는 적어도 24시간 동안의 완전한 산소 고갈도 견디는 것으로 나타났는데, 이들 세포는 4시간 또는 24시간 동안의 산소 고갈에도 불구하고 생존하였다. 포자를 닮은 세포는 특정 조직에서 분리된 세포로서 최종적으로 분화된 세포들 보다 뛰어난 증식 능력을 갖고 있다. 증식 능력은 매우 중요한 특성인데, 이는 조직 공학, 세포 치료 및 유전자 기반 치료가 종종 환자에게 투여하기에 충분한 수의 세포를 의사가 얻을 수 없는 문제로 방해받기 때문이다.
미국공개특허공보 제2004/0057942호 (2004.03.25) 미국공개특허공보 제2004/0033598호 (2004.02.19)
본 발명의 목적은 특정 세포 표면 마커 또는 유전자 발현 마커를 발현하는 포자를 닮은 세포들의 계군(subpopulation)을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 포자를 닮은 분화만능 세포들의 계군을 제공하고 이러한 포자를 닮은 분화만능 세포들의 계군을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
특정 세포 표면 수용체 및/또는 유전자 발현 마커를 발현하는 포자를 닮은 세포들의 계군을 확인하였다. 일실시예에서, 이들 세포는 Oct4, 나노그(nanog), Zfp296, 크립토(cripto), Gdf3, UtFl, Ecatl, Esgl, Sox2, Pax6, 네스틴(nestin), SCA-1, CD29, CD34, CD90, Bl 인테그린(integrin), cKit, SP-C, CC10, SF1, DAX1, 및 SCG10과 같은 적어도 하나의 세포 표면 마커 및/또는 유전자 발현 마커를 발현한다. 또한, 이들 세포들은 상기 마커들의 조합을 발현한다. 그리고, 내배엽, 중배엽, 또는 외배엽 기원의 세포들로 분화하도록 유도될 수 있는 포자를 닮은 세포들의 계군이 제공된다. 이들 포자를 닮은 세포들의 계군은 조직 기원에 관계없이 3개 배엽층 모두로부터 유래하는 세포들을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
포자를 닮은 세포들의 계군을 확인하고 수득하는 방법이 기술된다. 이들 방법은 세포 표면 마커 및/또는 유전자 발현 마커의 발현을 위해 충분한 시간 동안 분리된 포자를 닮은 세포들을 배양하는 단계와, 세포 표면 마커 및/또는 유전자 발현 마커를 확인하는 단계를 포함한다.
또한, 포자를 닮은 세포들의 모집단으로부터 관심대상이 되는 포자를 닮은 세포들의 계군을 정제하는 방법들도 기술된다. 몇몇 실시예에서, 이들 방법은 (a) 포자를 닮은 세포들의 모집단을 제공하는 단계와, (b) Oct4, 나노그(nanog), Zfp296, 크립토(cripto), Gdf3, UtFl, Ecatl, Esgl, Sox2, Pax6, 네스틴(nestin), SCA-1, CD29, CD34, CD90, Bl 인테그린(integrin), cKit, SP-C, CC10, SF1, DAX1, 및/또는 SCG10과 같은 하나 이상의 마커를 발현하는 포자를 닮은 세포들의 계군을 확인하는 단계와, (c) 상기 포자를 닮은 세포들의 계군을 정제하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 이들 세포는 세포 표면 마커에 대해 특이적인 항체를 이용하여 분리된다.
피부병, 종양, 또는 당뇨병과 같은 질환을 갖는 환자는, 예를 들어 포자를 닮은 세포들의 계군을 손상된 부위(예를 들어, 환자 피부의 손상 영역, 종양이 제거된 부위 또는 췌장)에 투여함으로써 처치될 수 있다. 전신 투여 또한 가능하다. 이들 방법은 다양한 조직, 예를 들어 망막, 장, 방광, 신장, 간, 폐, 척수 또는 뇌와 같은 신경계, 또는 내분비계에서 기능성 세포들의 결핍 또는 이상을 갖는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 포자를 닮은 세포들의 계군은 조직 기원에 관계없이 3개 배엽층 모두로부터 유래하는 세포들을 생성할 수 있다. 본 발명의 포자를 닮은 세포들의 계군은 피부병, 종양, 또는 당뇨병 환자나 다양한 조직, 예를 들어 망막, 장, 방광, 신장, 간, 폐, 척수 또는 뇌와 같은 신경계, 또는 내분비계에서 기능성 세포들의 결핍 또는 이상을 갖는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.
도 1은 인슐린종(insulinoma)(췌장 종양)으로부터 분리된 포자를 닮은 세포들을 나타내는 사진이다.
I. 정의
본 명세서에서 사용되는 분화만능의 포자를 닮은 세포는 3개 배엽층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽) 모두로부터 유래하는 세포들을 생성할 능력을 갖는 세포이다.
포자를 닮은 세포과 관련하여 사용되는 "분리된"이라는 용어는 세포가 원시 환경으로부터 떨어진 상태로 존재하는 것을 의미한다. 분리된 세포는 다른 세포 타입과 완전히 분리되거나 모집단 내에서 증가된 양으로 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "풍부하게 된 포자를 닮은 세포 모집단"은 원시 환경에 존재하는 다른 세포들과 분리된 세포들의 집단으로서, 세포 혼합물 내에 포자를 닮은 세포의 비율이 원시 환경이나 즉시 이어지는 분리 후의 상태에서 보다 높다.
본 명세서에서 사용되는 "검출가능한 표지"는 관심대상의 결합 파트너에 추가될 수 있는 물질로서 상기 결합 파트너의 검출을 허용하는 것을 지칭한다.
II. 포자를 닮은 세포 모집단(Spore like Cell Populations)
포자를 닮은 세포들의 원천
포자를 닮은 세포들은 조류, 파충류, 양서류 또는 포유류와 같은 동물 공여자로부터 얻을 수 있다. 예를 들어 포유류 유래의 포자를 닮은 세포들은 설치류, 토끼, 소, 돼지, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 인간이 아닌 영장류 또는 인간으로부터 분리될 수 있다. 포자를 닮은 세포들은 성숙한 동물로부터 수득될 수 있다. 포자를 닮은 세포들은 분화된 세포들 보다 산소 결핍을 견뎌낼 수 있기 때문에 살아있는 포자를 닮은 세포들은 사망 후 24시간 이상이 경과한 동물을 포함하여 사망한 동물로부터도 분리될 수 있다. 포자를 닮은 세포들은 슈퍼마켓에서 구입한 닭의 간(조류)로부터 분리되었다. 최초 분리시, 트립판 블루 색소배제 시험(trypan blue dye exclusion test)에서 매우 작은 살아 있는(색소 배제됨) 포자를 닮은 세포들이 확인되었다. 분리 후 3일째에 셀 수 없이 많은 포자를 닮은 세포들의 커다란 부유 클러스터를 육안으로 확인할 수 있었다(데이터 미도시).
주어진 공여자 내에서, 포자를 닮은 세포들은 다양한 원천들로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 포자를 닮은 세포들은 체액(예를 들어, 혈액, 타액, 또는 소변)으로부터 수득될 수 있고, 전부는 아니더라도 대부분은 기능성 장기들(functional organs)로부터 수득될 수 있다. 또한, 포자를 닮은 세포들은 다른 사람 또는 다른 종의 동물로부터 얻은 포자를 닮은 세포들에 의해 처치되는 환자로부터 수득될 수 있다. 자가, 동종 및 이종의 포자를 닮은 세포들의 계군이 수득될 수 있고 환자 치료 또는 조직 생장을 위해 사용될 수 있다.
포자를 닮은 세포들은 질환을 가진 조직, 예를 들어, 암조직으로부터도 분리될 수 있다(도 1). 따라서, 포자를 닮은 세포들은 적정 조건 하에서 유의적인 재생 능력을 갖는다.
포자를 닮은 세포들의 분리
포자를 닮은 세포들의 분리방법은 미국특허 제7,060,492호, 제7,575,921호 및 제7,560,275호(Vacanti, et al)에 개시되어 있다. 간략하게 조직 샘플 또는 혈액 샘플은 동물로부터 얻는다. 얻기 가장 쉬운 샘플 중 하나는 전혈 샘플이다. 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 분리 방법은 출발물질로 사용되는 조직의 타입에 따라 약간씩 가변될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 샘플이 전혈이면 항-응고제를 함유하는 튜브 내에 전혈을 위치시킬 수 있다.
수집 후, 샘플이 채액 샘플이건 고형 장기로부터 얻은 세포 현탁액이건 조직 샘플은 세포 펠릿을 형성하기에 충분한 시간 및 속도로 원심분리되고, 이때 원심분리 튜브의 바닥에 샘플 내의 세포가 펠릿으로 위치하게 된다. 그 결과 얻어진 펠릿은 글루코오스, 트랜스페린, 인슐린, 퓨트리신(putricine), 셀레늄, 프로게스테론, EGF(epidermal growth factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)가 보충된 DMEM/F-12 배지와 같은 적합한 배지에서 재현탁된다.
재현탁된 세포들은 조직 배양 용기로 옮기고 37℃ 또는 대략 그 근방에서 인뷰베이션된다. 최초 샘플이 혈액 샘플일 때 배양 플라스크는 조혈모 세포들을 1차적으로 포함한다. 그러나, 몇일 동안 배양한 후, 적혈구 파쇄가 나타나고 배양액은 배타적이지는 않지만 포자를 닮은 세포들을 1차적으로 포함한다. 이는 적혈구가 핵을 가지고 있지 않기 때문이지만 포자를 닮은 세포들은 이러한 조건 하에서 생존상태를 유지한다. 포자를 닮은 세포들이 고형 조직으로부터 분리될 때, 분화된 세포들은 피펫으로 샘플을 연속적으로 잘게 만듬으로써 파쇄될 수 있는데 각각의 피펫은 앞서 사용된 피펫 보다 더 작은 보어 직경(bore diameter)을 갖는 것을 사용한다. 예를 들어, 맨마지막에 사용된 피펫은 대략 15μ의 보어 직경을 가질 수 있다. 몇일 간의 추가적인 배양 후, 포자를 닮은 세포들은 증식되고 서로 합쳐져 세포들의 클러스터(구체)를 형성할 수 있다. 시간이 경과함에 따라, 통상 대략 7일 정도에서 세포들의 수는 크게 증가한다. 통상, 포자를 닮은 세포들이 전술한 방법에 따라 분리되었을 때 이중 90% 이상이 트립판 블루 색소 배제법에 따르면 살아있는 것으로 확인된다.
본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 점점 작아지는 보어 피펫을 통한 분쇄(trituration)가 크기가 큰 분화 세포들로부터 포자를 닮은 세포들을 분리하는 유일한 방법이 아닌 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 포자를 닮은 세포들과 분화된 세포들을 포함하는 현탁액이 특정 크기의 구멍을 갖는 필터에 대해 통과될 수 있다. 필터 내의 구멍(그리고 유사하게 분쇄에 사용되는 피펫의 직경)의 크기는 분리과정이 얼마나 엄격하게 진행되는냐에 따라 가변될 수 있다. 일반적으로, 필터 내의 구멍이 작거나 분쇄에 사용되는 피펫의 직경이 작으면 분리과정에서 살아남는 분화된 세포들의 수가 적어진다. 포자를 닮은 세포들의 다른 분리방법으로는 동결/해동 및 크기 배제(size exclusion)가 있다.
몇몇 실시예에서, 혈액/골수로부터 포자를 닮은 세포들을 분리하되 다른 타입의 세포/줄기세포의 배제를 보장하는 방법은 동해방지제(cyroprotectant agent) 첨가없이 항응고 처리된 전혈을 -20 내지 -80℃까지 동결시키고, 그런 다음 동결된 샘플을 해동하는 과정을 포함한다. 동결 과정 동안에 형성된 세포 내 얼름 결정은 다른 모든 세포들을 죽인다. 그리고 세포들은 배양 배지에서 분쇄처리되고, 그런 다음 배양된다. 생존하고 남아 생장하는 세포들은 포자를 닮은 세포들이다. 혈액으로부터 포자를 닮은 세포들을 분리하는 다른 기술은 24시간 동안의 산소 결핍을 포함한다. 혈액 또는 골수 샘플은 고장액(hypertonic solution)에서 용혈현상이 나타나 세포들/줄기세포들을 파쇄시켜 버린다. 배양액에 혈청이나 피더 세포(feeder cell)를 사용하지 않으면 포자를 닮은 세포들을 선택할 수 있다. 이러한 방법들은 혈액 뿐만아니라 다른 조직에 대해서도 유효하다.
포자를 닮은 세포들의 계군을 풍부하게 하는 과정
풍부하게 된 포자를 닮은 세포들의 계군을 풍부하게 하고 특징을 결정하며, 확인 또는 분석하는 방법이 개시되어 있다. 풍부하게 된 포자를 닮은 세포들의 계군은 세포들에 의해 발현된 세포 표면 마커 및/또는 유전자 발현 마커를 이용하여 확인된다. 세포들은 실시예에서 설명되는 바와 같이 특이적 마커 발현을 위해 충분한 시간 동안 배양되고 마커 발현은 본 발명의 기술분야의 당업자에게 알려진 기술을 이용하여 확인된다. 풍부하게 된 포자를 닮은 세포들의 모집단은 Oct4, 나노그(nanog), Zfp296, 크립토(cripto), Gdf3, UtFl, Ecatl, Esgl, Sox2, Pax6, 네스틴(nestin), SCA-1, CD29, CD34, CD90, Bl 인테그린(integrin), cKit, SP-C, CC10, SF1, DAX1, 및 SCG10과 같은 하나 이상의 특이적 세포 마커에 대해 양성이다. 풍부하게 된 포자를 닮은 세포들의 모집단은 관심 대상의 마커들의 검출을 위해 사용될 수 있고, 포자를 닮은 세포들은 추가로 배양되어 분화되도록 할 수 있으며, 상기 마커들 발현 세포들은 풍부하게 된 계군으로부터 추가적인 분리를 위해 사용될 수 있다.
관심 대상 단백질을 발현하는 세포들을 분리하고 추가적으로 증식시키는 방법은 본 발명의 기술분야의 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 관심 대상 마커를 발현하는 세포들은 상업적으로 구입가능하고 미국특허 제7,310,147호에 개시된 클론픽스 FL 시스템(ClonePix FL system)(Gentix, UK)을 이용하여 분리될 수 있는데, 상기 장비는 수천개의 세포들을 이미징하여 동작한다. 그리고, 특이적인 형광 프로브가 형광 콜로니를 검출 및 확인하기 위해 사용된다. 원하는 혈광 레벨을 갖는 세포들(예를 들어, 표적 단백질에 대해 가장 높은 형광을 발하는 것)이 자동적으로 수집된다(Mann, Nature Methods, ｉ-ⅱ, (2007)). 이들 세포의 구형 클러스터에 대한 연속적인 통과에 의해 미성숙 상태이고 보다 원시적 줄기세포에 대한 순도를 높일 수 있다. 다른 실시예에서, 세포 표면 마커 또는 유전자 발현 마커는 관심 대상이 되는 포자를 닮은 세포들의 계군을 분리하는데 사용된다. 세포 표면 마커들의 일실시예에서, 상기 분리 방법은 (a) 앞서 기술한 바와 같이 분리된 포자를 닮은 세포들의 집단을 제공하는 단계와, (b) 상기 마커들을 발현하기에 충분한 시간 동안 포자를 닮은 세포들의 집단을 배양하는 단계와, (c) 마커 특이적인 결합 파트너와 상기 세포들의 집단을 접촉시키되, 포자를 닮은 세포들의 집단의 각각의 세포 상에 해당 타겟이 존재할 경우 상기 결합 파트너의 타겟에 대한 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에서 접촉시키는 단계와, (d) 마커 양성의 포자를 닮은 세포들의 계군을 분리하는 단계를 포함한다.
몇몇 실시예에서, 전술한 (c) 단계에서 포자를 닮은 세포들은 제1 마커에 대해 특이적인 제1 결합 파트너와, 상기 제1 마커와는 상이한 제2 마커에 대해 특이적인 제2 결합 파트너와 접촉하되, 포자를 닮은 세포들의 집단의 각각의 세포 상에 해당 타겟이 존재할 경우 상기 결합 파트너 각각의 타겟에 대한 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에서 접촉된다. 상기 분리 방법은 (d) 단계에서 상기 마커들에 대해 양성인 포자를 닮은 세포들의 제1 계군을 선택하고, (e) 하나 이상의 추가적인 세포 표면 마커들에 대해 특이적인 하나 이상의 추가적인 결합 파트너들과 상기 포자를 닮은 세포들의 제1 계군을 접촉시키되, 상기 포자를 닮은 세포들의 제1 계군의 각각의 세포 상에 해당 타겟이 존재할 경우 각각의 결합 파트너의 타겟에 대한 결합을 허용하기에 충분한 조건 하에서 접촉시키는 단계와, (f) 상기 포자를 닮은 세포들의 제1 계군으로부터 (e) 단계의 적어도 하나의 항체(결합 파트너)에 결합하는 세포들을 제거하는 단계와, (g) 포자를 닮은 세포들의 제2 계군을 수집하여 포자를 닮은 세포들의 계군을 분리하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 결합 파트너는 세포 표면 마커에 대해 특이적인 항체이다.
상기 개시된 포자를 닮은 세포들의 계군의 분리는 FACS(fluorescence-activated cell sorting)를 포함하는 하나 이상의 특이적 마커들의 발현 또는 발현 결여에 기초하여 세포를 분리할 수 있는 방법론을 이용하여 수행될 수 있으나, 본 발명이 이에 제한되는 것이 아님은 물론이다. 상기 마커들은 Oct4, 나노그(nanog), Zfp296, 크립토(cripto), Gdf3, UtFl, Ecatl, Esgl, Sox2, Pax6, 네스틴(nestin), SCA-1, CD29, CD34, CD90, Bl 인테그린(integrin), cKit, SP-C, CC10, SF1, DAX1 및 SCG10으로 구성된 군으로부터 선택된다.
분리 단계는 일련의 단계로서 단계별로 수행되거나 동시에 수행될 수 있다. 예를 들어, 각 마커의 존재 또는 부존재가 개별적으로 평가되어 각 마커의 존재 여부에 기초하여 각 단계에서 2개의 계군을 생성할 수 있다. 그런 다음, 관심 대상 계군이 선택되고 다음 마커의 존재 또는 부존재의 기초하여 추가로 구분될 수 있다.
대안으로, 상기 계군은 특정 마커 프로필을 갖는 세포들만을 분리하여 생성될 수 있는데, 여기서 "마커 프로필"이란 2개 이상의 마커들의 존재 또는 부존재의 요약을 지칭한다. 마커들의 조합들 각각은 서로 상이한 마커 프로필을 나타낸다. 추가적인 마커들이 추가되면 마커 프로필은 보다 복잡해지고 세포들의 최초 혼합 모집단에 대해 보다 적은 비율에 대응하게 된다. 몇몇 실시예에서, 마커들에 특이적인 항체들은 관심 대상 마커 프로필을 갖는 포자를 닮은 세포들의 계군의 분리 및/또는 정제를 위해 사용되고, 관심 대상 마커 프로필에 기초하여 상기 항체들은 모집단 중 양성 또는 음성 부분을 선택하는데 사용될 수 있으며 일부의 경우 이들 부분은 추가로 세분화된다.
몇몇 실시예에서, 결합 파트너들은 검출가능한 표지로 표지된다. 서로 상이한 마커들에 결합하는 서로 상이한 결합 파트너들은 서로 상이한 검출가능한 표지로 표지되거나 동일한 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 다양한 검출가능한 표지가 당업자에게 알려져 있는데, 검출가능한 표지를 항체 및 그 절편, 및/또는 이들의 유도체와 같은 생리활성물질에 접합하는 방법들이 사용된다. 대표적인 검출가능한 물질로는 공유결합으로 부착되는 발색단(chromophore), 형광물질, 효소, 항원, 특이적 반응성을 갖는 반응기, 화학 발광 물질 및 전기화학적으로 검출가능한 물질 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일부의 경우, 결합 파트너들은 비오틴화된다. 몇몇 실시예에서, 세포 표면 상의 마커들에 결합하는 비오틴화된 결합 파트너들(제1 결합 파트너)은 형광표지에 접합된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 포함하는 제2 결합 파트너를 이용하여 검출되며, 상기 표지로는 Cy3, Cy5 및 Cy7이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 몇몇 실시예에서, 상기 결합 파트너는 Cy3, Cy5 또는 Cy7과 같은 형광 표지에 의해 직접 표지된다. 상기 결합 파트너는 형광 표지에 의해 직접 표지되고 항체에 결합한 세포들은 형광-활성화된 세포 분류법에 의해 분리된다. 추가적인 검출 전략들도 당업자에 알려져 있다.
III. 포자를 닮은 세포들 계군의 응용들
세포 배양과 유전자 조작
본 명세서에서 설명된 포자를 닮은 세포들은 환자에 직접 투여거나, 투여 전에 내배엽 기원, 외배엽 기원 또는 중배엽 기원의 세포들로 분화가 유도되거나, 이어지는 유전자 조작에 의해 특정 인자들을 발현하도록 만들어 질 수 있다. 예를 들어, 포자를 닮은 세포들의 계군은 인슐린과 같은 호르몬을 발현하도록 조작될 수 있는데, 특정 인자들을 인코딩하는 서열을 포함하는 유전자 구조체로 세포들을 트랜스펙션함으로써 수행된다.
포자를 닮은 세포들 계군의 분화
포자를 닮은 세포들의 계군은 그 조직의 기원에 관계없이 3개의 배엽층들 중 어느 배엽층의 세포들로도 분화가 유도될 수 있는데, 예를 들어, 상피 세포, 각질 세포(keratinocytes), 멜라닌 세포(melanocyte), 지방세포를 포함하는 피부 세포 및 모(毛)세포, 뼈 형성 세포, 근원세포, 연골세포, 골세포, 폐포 세포와 같은 근육 및 결합 조직, 간세포, 신장세포, 부신세포 및 췌도세포(예를 들어, 알파 세포, 델타 세포, PP 세포 및 베타 세포)와 같은 유조직 세포(parenchymal cell), 혈액 세포(예를 들어, 백혈구, 적혈구, 대식세포 및 림프구), 망막 세포(그리고 귀 안에 모세포를 형성하는 세포 또는 혀 위의 맛봉오리를 형성하는 세포와 같은 감각 인식과 관련된 다른 세포들), 뇌와 신경을 포함하는 신경 조직, 그리고 섬유아세포로의 분화가 유도될 수 있다.
포자를 닮은 세포들의 계군은 다양한 방식으로 분화가 유도될 수 있다. 마커 양성의 포자를 닮은 세포들은 환자 신체 내의 조직과 접촉할 때 또는 상기 조직으로부터 방출되는 물질(예를 들어, 생장인자들, 효소들 또는 호르몬들)에 의해 영향을 받을 정도로 조직에 충분히 가까울 때 분화될 수 있다. 상기 세포들의 분화는 주변 조직으로부터 수용하는 신호들에 의해 영향을 받는다. 이러한 시그널링은 예를 들어, 세포 표면 상의 수용체가 결합되어 환자의 조직에 의해 방출되는 생장인자, 효소 또는 호르몬과 같은 분자로부터의 신호를 전달할 때 일어난다. 대안으로 또는 추가적으로, 본 명세서에서 설명된 포자를 닮은 세포들은 세포 환경에 특정 물질(예를 들어, 생장인자, 효소, 호르몬 또는 다른 시그널링 분자)를 첨가함으로써 분화가 유도될 수 있다. 예를 들어, 특정 물질이 포자를 닮은 세포들의 계군을 포함하는 배양 접시, 메쉬, 또는 세포 또는 조직을 적용하기에 적합한 다른 기질, 또는 환자 신체 내 조직에 첨가될 수 있다. 세포들의 분화를 유도하는 물질이 전신으로 또는 국소적으로 투여될 때, 약제학적으로 허용가능한 방법에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 단백질, 폴리펩티드 또는 올리고뉴클레오티드는 담체 또는 부형제와 함께, 또는 담체 또는 부형제 없이 생리학적으로 허용가능한 완충용액에 녹여 투여될 수 있다. 따라서, 포자를 닮은 세포들의 계군은 배양액 또는 환자 신체에서 분화될 수 있고, 이어지는 고형 지지체와의 접촉을 하거나, 자연적으로 발현되거나 외부에서 투여되거나 유전자 조작의 결과로 발현되는 물질에 노출될 수 있다.
일실시예에서, 포자를 닮은 세포들의 계군은 세포들을 "외배엽 분화" 배지에 노출시킴으로써 외배엽 기원의 세포로 분화가 유도된다. 다른 실시예에서, 포자를 닮은 세포들의 계군은 세포들을 "중배엽 분화" 배지에 노출시킴으로써 중배엽 기원의 세포로 분화가 유도된다. 또 다른 실시예에서, 포자를 닮은 세포들의 계군은 세포들을 "내배엽 분화" 배지에 노출시킴으로써 내배엽 기원의 세포로 분화가 유도된다. "내배엽", "중배엽" 및 "외배엽" 배지는 본 발명의 기술분야의 당업자에게 알려져 있다. 공지의 세포 표면 마커들은 세포들이 실제로 대응하는 세포 배양 배지의 세포 계통으로 분화하는지를 입증하기 위해 사용될 수 있다. 3개의 배엽층의 분화를 확인하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 마커들은 내배엽 세포들의 경우 알파 태아 단백질이고, 중배엽 세포들의 경우 알파 평활근 액틴이며, 외배엽 세포들의 경우 베타-III 튜불린이다. 이들 모두는 해당 조직의 발생 과정 초기에 정상적으로 발현되는 것들이다.
분화 자극에 관계없이, 조직의 유지 또는 치료에 충분히 도움이 되도록 분화하였거나 분화하는 포자를 닮은 세포들의 계군은 환자에 투여될 수 있다. 예를 들어, 화상 부위 또는 피부의 다른 외상 부위, 뼈 골절, 인대 파열, 근육 위축(atrophied muscle), 분비선 이상(malfunctioning gland), 신경퇴화 과정 또는 자가면역 반응에 의해 악영향을 받은 부위에 포자를 닮은 세포들은 투여될 수 있다.
종양으로부터 유래한 포자를 닮은 세포들(Tumor Spore-like Cells)
(i) 백신 치료
수득된 포자를 닮은 세포들의 계군은 매우 유용한 연구 수단이며 치료 잠재력을 갖는데, 예를 들어, 췌장 종양으로부터 분리된 포자를 닮은 세포들은 연속적인 세포 매개 백신으로서 수지상의 항원 제공 세포로 사용될 수 있다.
현재 실험에 따르면 수지상 백신은 짧은 기간 동안만 작동하고 결국에는 대부분 실패하는데 이는 수지상 백신이 성숙한 종양 세포로부터 유래하였기 때문이다. 종양세포가 유전적으로 변경된다면, 이러한 백신은 해를 거듭할 수록 바이러스성 인푸루엔자 백신에게 나타나는 것과 유사하게 쓸모없게 될 수 있다. 강력한 진화형 종양 줄기세포는 보다 효율적인 백신제작을 가능하게 한다. 종양 유래의 포자를 닮은 세포들의 모집단이 배양되고, 면역계의 세포들을 자극함으로써 종양 또는 악성 종양을 공격하고 잠재적으로 치료하기 위해 사용되는데 이에 대한 일예가 Liau et al., J. of Neuro. 90 (6): 1115-24 (1999)에 설명되어 있다. Liau et al의 문헌에서는 특정한 형태의 뇌종양(두개골 내 신경교종(intra cranial glioma))은 뇌종양 세포를 분리하여 처치하고 수지상 세포로 불리는 환자로부터 유래할 수 있는 특정 타입의 면역세포를 자극하면 실제 종양에 의해 생성되는 항원들을 프로세싱하게 되고 결국에는 면역계 나머지도 자극하여 뇌종양을 공격하게 함으로써 종양의 축소 또는 소멸이 나타난다고 설명하고 있다. 이러한 공격은 B 세포 뿐만아니라 T-8, T-4와 같은 면역 세포 및 자연살해세포(natural killer cell)에 의해 생성되는 싸이토카인의 생성을 통해 매개된다. 이러한 특별한 접근법은 동물과 초기 임상 시험에서 뇌종양 치료에 있어 치료적 이점을 나타낸다. 이러한 기술의 주요 제한의 하나는 효과적인 백신이 특정 타입의 종양 세포에 대해 제작될 수 있다고 하더라도 시간이 경과함에 따라 종양의 돌연변이가 일어나고 결국에는 초기 백신에는 반응하지 않는 새로운 종양이 나타날 수 있다는 것이다. 따라서, 보다 더 다양한 항원을 발현하고 배양액에서 계속적으로 유지가능한 종양 유래의 포자를 닮은 세포들이 종양세포 대신에 사용될 수 있다. 이러한 포자를 닮은 세포들은 항원들을 발현하고 돌연변이를 일으킬 수 있기 때문에 업데이트된 백신들이 합성될 수 있고 환자에게 재발된 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명자들은 인슐린종(insulinoma)으로 불리는 특정 타입의 종양에서 포자를 닮은 세포들의 존재를 주목하였다. 모든 종양 타입에서 포자를 닮은 세포들이 분리될 수 있다고 예측할 수없고 이에 대한 근거도 없다. 종양 유래의 포자를 닮은 세포들을 사용하여 백신을 자극하는 것의 잠재적 장점의 하나는 포자를 닮은 세포들이 매우 원시적이기 때문에 발현에 있어서의 완전한 잠재력을 가져 다양한 종양세포로 분화되고 다양한 항원을 발현한다는 것이다. 즉, 보다 기본적인 종양 세포가 백신을 만들기 위해 사용된다면, 서로 상이한 타입의 종양 항원들을 만들 수 있는 큰 잠재력을 가진 세포에 대한 다양한 면역 반응은 종양에서 발생하는 일반 돌연변이들에 기인하는 보다 강력한 백신을 만들 수 있게 할 것이다. 또한, 포자를 닮은 세포들은 자연살해세포(NK 세포), T-4 세포, T-8 세포 및 B 세포 또는 항체 생성 세포들을 포함하는 면역계의 모든 세포 타입들로 분화할 수 있는 능력을 가진 혈액, 골수 및 흉선으로부터 분리될 수 있다. 추가로, 덴드로사이트(dendrocyte)(항원 제공 세포)는 포자를 닮은 세포들로부터 발전할 수 있다. 이는 다양한 형태의 종양 세포들 뿐만아니라 바이러스, HIV, 탄저병과 같은 세균 등의 미생물에 의해서도 면역계가 시험관내 자극이 가능하다는 것이다. 이는 종양, HIV 및 탄저병과 같은 감염성 질환에 대한 새로운 백신을 생산하는 메카니즘을 제공할 수 있다. 또한, 생검에 의해 얻은 종양으로부터 유래한 포자를 닮은 세포들은 시험관내에서 배양될 수 있고 서로 다른 치료제들이 시험관내의 악성의 포자를 닮은 세포들에 대한 영향을 평가하기 위해 사용되어 화학치료제, 백신 또는 방사선에 대한 환자 반응을 예측할 수 있다. 마치 환자로부터 분리된 세균이 배양되고 항생제 민감성에 의해 유효한 항생제 치료를 선택하는 것처럼, 생검 샘플로부터의 종양유래의 포자를 닮은 세포들을 분리하여 종양 배양을 한 후 화학치료 민감도에 대해 시험하는 것이 가능하다. 추가로, 환자로부터 분리된 종양유래의 포자를 닮은 세포들은 분자적 진단 및 프로테오믹스(proteonomics)의 발전 분야에서의 사용에 적합한데, 이는 진단과 치료적 개입이 필요한 환자 종양의 프로파일을 제공한다.
(ii) 종양세포에서의 DNA 복구(DNA Repair)
살아있는 세포내의 DNA는 지속적으로 방사선, 발암물질 및 산화와 같은 손상 요인에 노출되어 있다. 손상된 DNA는 세포의 악성 형질전환과 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 세포들은 DNA 복구 유전자에 의해 악성으로 되는 것으로부터 보호된다. 예를 들어, 특정 타입의 암에 대한 유전적 소인을 갖고 있는 사람에서 일부의 경우 DNA 복구 시스템의 결함이 나타날 수 있다. 일례가 유전성 비용종성 대장암 증후군(hereditary non-polyposis colon cancer syndrome)이다. 이 질환은 가족력 직장암으로 나타나는 DNA 복구 결함으로 구성된다. 뉴클레오티드 미스매칭이 암으로 나타날 수 있다. 정상적인 DNA 복구 유전자는 이러한 미스매칭을 고침으로써 종양 형성이 방지된다. 최근의 줄기 세포 연구는 이동하는 신경교종(특정 타입의 뇌종양) 세포를 따라가 추적하는 능력을 가진 신경 줄기세포를 보고한 바가 있다. 이러한 종양 추적 현상 때문에 신경 줄기세포는 인터페론-감마, TNF(tumor necrosis factor) 및 인터루킨 12와 같은 물질들을 위한 유전자들이 삽입된다. 이러한 독특한 줄기세포를 이식하면, 뇌종양 세포를 추적하여 항종양 물질을 분비하여 뇌종양 세포에 손상을 줄 수 있다. 추가로 최근 문헌은 성인 줄기 세포가 신체 내에 위치되면 정상 세포와 융합하는 능력이 있음을 보이고 있다. 전술한 바와 같은 DNA 복구와 관련한 내용은 예를 들어 다음과 같은 문헌에서 발견될 수 있다(Ourednik. et al., Nature Biotechnol, 20 (11): 1103-1110 (2002); Stewart, et al., Bioessays, 24 (8): 708-13 (2002); Ehtesham, et al., Cancer Therapy, 9 (11): 925-934 (2002); Ehtesham, et al, Cancer Reserves, 62 (20): 5657-63 (2002); Ferguson, et al., Oncogene 20(40): 5572-9 (2001)).
따라서, 본 명세서에 설명하는 포자를 닮은 세포들의 계군은 추적, 융합 및 DNA 복구에 의해 악성 세포들을 발견해 내는 독특한 특성을 이용하여 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 시험관내에서 포자를 닮은 세포들은 클러스터를 형성하고 포자를 닮은 세포들과 함께 배양액에서 생장하는 정상 세포들과 융합하는 것이 관찰된다. 포자를 닮은 세포들은 준비가 안된 항응고처리된 동결 혈액으로부터 쉽게 분리되고 배양액에서 증식될 수 있다. 신경 줄기세포와 달리, 이들 포자를 닮은 세포들은 특히 혈액에서 쉽게 유도되고 배양시 빠르게 수가 증가된다. 또한, 이들은 크기가 작고 수가 많으며 매우 간단한 구조 때문에 종양 세포들과 용합할 기회가 더 많다. 앞선 설명에서는 필수적으로 매우 작고 간단한 구조 또는 막 결합된 DNA의 패킷을 보여 주고 있다. 모든 세포들은 자연적인 DNA 복구 시스템을 갖고 있다. 일례가 손상된 결함 DNA를 엔도뉴클레아제로 잘라내고 이들 손상된 DNA 절편을 DNA 중합효소를 이용하여 정상 DNA로 대체하는 것이다. 세포가 노화됨에 따라, DNA 복구 시스템은 작동하지 않아 악성 형질전환을 나타내게 된다. 대부분의 암 치료 방식들은 종양의 외과적 제거와 화학적 치료, 방사선 또는 면역학적 치료와 같은 종양세포 사멸 메카니즘의 사용에 집중되어 있다. 이러한 접근법들은 항상 효과적이지는 않은 유의적 이환율과 연관되어 있다. 종양 세포를 정상 세포로 전환하는 DNA 복구 시스템이 존재하고 이것의 실패가 암 유발과 관련되어 있음이 알려져 있음에도 이를 이용한 접근법은 존재하지 않는다. 환자 자신의 혈액으로부터 유래하고 신선한 DNA 복구 시스템을 갖는 수십억개의 포자를 닮은 세포들을 주입하면 종양 세포들을 추적하여 찾아내고 종양 세포들과 융합함으로써 결함이 있는 종양 세포들에게 DNA 복구 시스템을 줄 수 있을 것이다. 또한, 포자를 닮은 세포들은 영양 효과를 갖는 인자들을 분비함으로써 종양 세포들에 대한 복구 효과를 발휘할 수도 있다. 이러한 포자를 닮은 세포들은 직접 종양에 주입되거나, IV 루트 또는 IP 루트를 통해 투여될 수 있다. 이러한 방법은 존재하는 것으로 알려진 자연적인 DNA 복구 시스템의 추가이기 때문에 화학적 치료와 같은 전통적인 세포 사멸 방식에 비해 부작용이 최소화된다. 이러한 작업을 수행하기 위해 필수적으로 포자를 닮은 세포들은 환자 자신의 혈액으로부터 그 수의 제한없이 생성될 수 있다.
추가로, 유전 삽입 기술이 인터페론-감마 및 TNF와 같은 항종양 물질들을 발현하는 뉴클레오티드 서열들을 포자를 닮은 세포들에 삽입하기 위해 사용될 수 있다. 일단 주입되면, 이들 유전적으로 조작된 포자를 닮은 세포들은 종양 세포들을 추적하여 융합함으로써 치료효과를 갖는 인터페론 또는 TNF를 종양에 직접 전달하게 된다. 이는 포자를 닮은 세포들의 계군이 시험관내에서 증식되어 종양세포를 추적하고 융합함으로써 종양세포 내에서 발견되는 손상된 DNA를 복구할 수 있는 간단한 세포 구조체들을 무진장 공급할 수 있기 때문에 선행기술에 대한 개량을 제공한다고 할 수 있다. 선행기술은 신경 세포들이 상기 특성을 갖는다고 설명하고 있지만, 환자로부터 신경 줄기세포를 수득하는 것은 많은 위험을 수반할 수 있다. 따라서, 본 발명의 치료방법은 유방암, 폐암, 뇌암, 전립선암 및 다른 장기의 암 치료에 유용하다고 할 수 있다.
(iii) 퇴행성 질환의 회복(Reversal of Degenerative Diseases)
유전자 기반의 치료 또는 유전자 삽입 기술은 특정 뉴클레오티드 서열들 또는 유전자들의 효과적인 전달을 포함하여 특정 유전자에 의해 생성되는 필요한 단백질의 생성과 관련하여 임상적인 향상을 가져온다. 가능한 용도로는 암 치료, 백신, 유전적 이상 및 대사 이상 치료, 바이러스 감염을 포함하는 다른 영역에서의 치료, 심혈관계 질환 치료 그리고 다른 장기의 질환 상태 치료를 포함한다. 유전자 기반의 치료에서의 주요 제한 중 하나는 적합하면서도 효과적인 전달 시스템의 발견이다. 유전자 삽입과 관련한 많은 연구가 수행되었고, 환자에게 아데노바이러스 벡터를 감염시켜 치료 유전자를 삽입함으로써 환자에게 필요한 단백질의 발현을 이끄는 연구가 수행되었다. 문제는 원하는 숙주로의 비효율적인 유전자 삽입과 실제로 숙주를 감염시키는 바이러스성 벡터의 위험성이다. 예시로서 설명된 바와 같이, 포자를 닮은 세포들의 계군은 환자 혈액으로부터 쉽게 분리되어 증식된 후, 다양한 경로, 예를 들어, 정맥내(IV), 복강내 또는 피하 등의 경로를 통해 환자에게 안전하게 투여될 수 있다. Vacanti, et al의 문헌에 개시된 바와 같은 기술을 이용하여 팩터 8 (혈우병 치료용)과 같은 단백질을 인코딩하는 유전자는 시험관내 환경에서 포자를 닮은 세포들에 삽입될 수 있고, 이들 세포들은 새로운 치료용 유전자를 가진 집단으로 증식하여 상기 단백질 산물을 생성할 수 있다(Vacanti, et al., Transplantation Proceedings, 33:592-598 (2001)). 추가적인 잠재적 용도에 대한 증거로는 활성 핵산 합성을 나타내는 Brdu의 발현을 들 수 있다. 이 방법은 결과적으로 치료용 단백질을 생성하는 재조합 기술에서 포자를 닮은 세포들의 계군을 이용하여 팩터 8과 같은 필요한 치료용 단백질을 실제 시험관내에서 생성할 수도 있다. 이상적으로, 생체내에서 효과가 영구적일 수도 있다. 예를 들어, 혈액의 포자를 닮은 세포들의 계군은 혈우병 또는 테이새크스병(Tay Sach's disease)을 갖는 환자로부터 분리되고 유전자가 시험관내에서 삽입된 후 결함이 고쳐진 세포들이 환자로 다시 안전하게 이식되어 증식된 세포들에서 효소 결핍을 고치는 능력을 가짐으로써 질환을 치료할 수 있다. 질환에 이르게 하는 알려진 유전자 효소 결함은 전술한 접근법을 이용한 치료로 바로 잡을 수 있다. 잠재적으로 치료가능한 질환으로는 헌팅턴 무도병(Huntington's Disease), 근이영양증(muscular dystrophy), 가족성 고(高)콜레스테롤 혈증(familial hypercholesterolemia), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 페닐케톤뇨증(phenylketonuria), 혈색소증(hemachromatosis), 겸상적혈구빈혈(sickle cell anemia) 및 당원저장증(glycogen storage disease) 등을 들 수 있다. 인간의 게놈 지도 완성에 따라, 질병으로 이르는 대부분의 유전자 돌연변이들에 대해 연구가 진행되었고 이에 따라 적절한 유전자 삽입 기술로 치료할 수 있는 장을 열게 되었다. 자가유래의 포자를 닮은 세포들의 계군은 고쳐된 유전자들의 전달을 위해 필요한 비히클(vehicle)을 제공할 수 있다. 이들 세포의 작은 크기와 분열하여 잘 자라는 능력 그리고 발현되는 치료용 핵산 염기서열들의 삽입을 허용하는 특성들은 합리적인 응용수단임을 나타낸다. 포자를 닮은 세포들로의 유전자 삽입은 필요한 유전자 서열을 포함하는 DNA 자체 만으로도 시험관내에서 일어날 수 있다. 따라서, 아데노바이러스 기술과 같은 바이러스성 벡터의 사용시 일어날 수 있는 어떠한 잠재적인 위험도 피할 수 있다. 이러한 방식의 유전자 삽입을 이용하면 종양 성장을 멈추기 위한 종양 억제 단백질 또는 신생혈관생성 억제제와 같은 치료제로 만들기 위해 핵산 서열들을 삽입하는 것과 같은 추가적인 치료 방식을 제공할 수 있다. 포자를 닮은 세포들의 계군으로 삽입될 수 있는 다른 유전자로는 혀혈성 심장병을 치료하기 위한 VEGF와 같은 혈관활성 유전자를 들 수 있는데, 이를 이용하면 심장 수술을 우회하는 기술적 요구를 회피할 수 있다. 낭포성 섬유증을 치료하기 위한 단백질을 만드는 CFRT 유전자는 순환계를 통해 폐로 도달하거나 기관지를 통해 폐로 주입되어 결국에는 이식되는 포자를 닮은 세포들에 의해 발현될 수 있고 폐조직에서 분화하여 필요한 유전자 산물을 생성함으로써 낭포성 섬유증 증후군을 치료하는데 도움을 줄 수 있다.
필요한 산물의 대량 생산이 요구되면, 포자를 닮은 세포들은 생분해성의 스캐폴드 재료, 하이드로겔, 또는 천연 유래 매트릭스(본 발명자가 분리한 동결 혈액, 그리고 심장, 폐 및 CSF와 같은 다른 조직으로부터 분리)와 함께 이식될 수 있다. 유전자 삽입 치료술의 최우선의 제한은 시간 경과에 따라 산물의 생성량이 감소하는 것인데, 이는 고쳐진 세포들의 신체 내로의 흩어짐과 이에 따른 최종적 소멸에 기인하는 것으로 보인다. 삽입된 유전자 뉴클레오티드를 갖는 포자를 닮은 세포들의 계군을 이용하여 천연 또는 생분해성 스캐폴드 상에서 조직 구성물을 생성하는 것이 상기한 바와 같은 제한을 극복하는 길이 될 수 있다.
세포들의 구조 및 투여를 위한 제형
포자를 닮은 세포들의 계군은 포자를 닮은 세포 단독, 담체 또는 지지체 안에 위치하는 세포, 또는 담체 또는 지지체 상의 세포를 포함하는 조성물로 환자에게 투여될 수 있다. 다수의 실시예에서, 담체는 필요하지 않다. 포자를 닮은 세포들은 이들 세포를 원하는 부위 상에 또는 그 내부로 투여된다. 이러한 경우, 포자를 닮은 세포들은 통상 세척되어 세포 배양 배지가 제거된 후 생리학적 완충용액에서 현탁된다.
다른 실시예에서, 포자를 닮은 세포들은 지지체와 함께 제공되거나, 지지체 상 또는 내에 일체화되어 제공되다. 지지체는 메쉬, 고형 지지체, 튜브, 다공성 구조 및/또는 하이드로겔일 수 있다. 지지체는 전체 또는 일부가 생분해성이거나 생분해성이 아닐 수 있다. 지지체는 천연 또는 합성 폴리머, 티타늄과 같은 금속, 뼈 또는 수산화인회석(hydroxyapatite), 또는 세라믹으로 형성될 수 있다. 천연 폴리머로는 콜라겐, 히알루론산, 다당류(polysaccharides) 및 글루코스아미노글리칸을 들 수 있다. 합성 폴리머로는 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid) 및 이들의 공중합체와 같은 폴리하이드록시산(polyhydroxyacids), 폴리하이드록시부틸산(polyhydroxybutyrate), 폴리오르토에스테르(polyorthoester), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리우레탄, 폴리카보네이트 및 폴리에스테르와 같은 폴리하이드록시알카노에이트를 들 수 있다.
고형 지지체(Solid Supports)
지지체는 느슨한 직물 메쉬 또는 부직물 메쉬일 수 있고, 세포들은 상기 메쉬 내 및 메쉬 상에 파종된다. 지지체는 고형의 지지체를 포함할 수 있다. 지지체는 튜브, 예를 들어, 신경 액손의 재생을 위한 신경관일 수 있다. 지지체는 스텐트 또는 밸브일 수 있다. 지지체는 무릎이나 엉덩이와 같은 관절 보철물 또는 그 일부로서 세포의 내부생장 및/또는 세포의 파종을 허용하는 다공성 인터페이스를 갖는 다공성 구조이다.
지지체는 작은 구멍과 같은 공극 또는 틈을 갖는 투과성 구조물일 수 있는데 이는 하이드로겔-세포 혼합물의 형태를 만들고 지지한다. 예를 들어, 지지체는 다공성 폴리머 메쉬, 천연 또는 합성 스폰지, 또는 뼈 또는 수산화인회석과 같은 재료 또는 금속으로 형성된 지지구조물일 수 있다. 지지체의 다공성은 영양분이 구조체 내로 확산될 수 있어 효과적으로 영양분이 내부에 위치하는 세포들에 도달할 수 있으며, 세포들에 의해 생성된 노폐물은 구조물 밖으로 확산될 수 있을 정도이어야 한다.
지지체는 새로운 조직이 요구하는 공간에 맞게 형상을 가질 수 있다. 예를 들어, 지지체는 화상을 입은 피부 영역, 또는 손실된 연골 또는 뼈 일부의 형상에 맞게 형상을 가질 수 있다. 지지체가 만들어지는 재료에 따라, 지지체는 절단, 몰딩, 캐스팅 또는 원하는 형상을 생성하는 다른 방법들에 의해 형상이 형성될 수 있다. 지지체는 구조물에 세포가 파종되거나 후술하는 하이드로겔-세포 혼합물이 채워지기 전 또는 후에 형상이 형성될 수 있다.
생장인자, 분화 또는 탈분화를 유도하는 다른 인자들, 분비생성물, 면역조절자, 항-염증인자, 회귀인자(regression factors), 신경자극전달을 촉진하거나 림프계 네트워크(lymphatic network)를 증강시키는 생물학적으로 활성인 화합물, 및 약물과 같은 추가적인 인자들이 폴리머 지지체에 일체로 포함될 수 있다.
적합한 폴리머의 예는 폴리글락틴(polyglactin)이며, 이는 글리코라이드(glycolide)와 락타이드(lactide)의 90:10 공중합체로서 VICRYL™ 실의 흡수성 봉합사로서 제작된다(Ethicon Co., Somerville, N.J.). 폴리머 섬유(예: VICRYL™)는 직조될 수 있거나, 원하는 어떤 형상으로 절단될 수 있는 펠트 유사형 폴리머 시이트(felt-like polymer sheet)로 압축될 수 있다. 대안으로, 폴리머 섬유는 몰드 내에서 함께 압축되어 원하는 지지체 형상으로 캐스팅될 수 있다. 일부의 경우, 추가의 폴리머가 몰딩시 폴리머 섬유에 추가되어 섬유 메쉬에 추가 구조를 부여하거나 추가 구조로 변경할 수 있다. 예를 들어, 폴리탁트산 용액이 폴리글리콜산 섬유 메쉬의 시이트에 추가될 수 있고, 이들 조합은 함께 몰딩되어 다공성 지지체를 형성할 수 있다. 폴리락트산은 폴리글리콜산 섬유의 가교에 결합하여 개개의 섬유를 코팅하고 몰딩된 섬유의 형상을 고정하게 된다. 또한, 폴리탁트산은 섬유들 사이의 공간을 채운다. 따라서, 다공성은 지지체에 도입되는 폴리탁트산의 양에 따라 가변될 수 있다. 섬유 메쉬를 원하는 형상으로 몰딩하는데 요구되는 압력은 중간 정도일 수 있다. 섬유들은 폴리락트산의 결합과 코팅 작용이 발휘되기 위해 충분히 오래 동안 제 위치에 유지되는 것이 필요하다.
대안으로 또는 추가적으로, 지지체는 본 발명의 기술분야에서 알려진 공지기술에 의해 생산되는 다른 형태의 폴리머 섬유 또는 폴리머 구조를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리머 박막이 폴리머 용액으로부터 용매를 증발시켜 얻을 수 있다. 이러한 필름은 폴리머 용액이 원하는 형상의 릴리프 패턴(relief pattern)을 갖는 몰드로부터 증발되면 원하는 형상으로 캐스팅될 수 있다. 또한, 폴리머 겔은 당업계에 알려진 압축 몰딩 기술을 이용하여 얇으면서 투과성을 지닌 폴리머 구조로 몰딩될 수 있다.
또한, 수많은 다른 형태의 지지체가 가능하다. 예를 들어, 지지체는 스폰지, 발포 형태(foam), 산호 형태(coral), 또는 내부 구멍을 갖는 생체 적합성 무기물 구조, 또는 섞어서 짠 폴리머 섬유들의 메쉬 시이트로 형성될 수 있다. 이들 지지체는 공지의 방법을 이용하여 준비될 수 있다.
하이드로겔(Hydrogels)
다른 실시예에서, 포자를 닮은 세포들은 하이드로겔과 혼합되어 세포-하이드로겔 혼합물을 형성한다. 세포-하이드로겔 혼합물은 손상된 조직에 직접 적용될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제5,944,754호에 설명된 바와 같이, 하이드로겔-세포 혼합물은 단순히 원하는 표면 상으로 솔질하거나, 떨어뜨리거나 분무하여 적용될 수 있으며, 원하는 빈 공간 또는 장치를 채울 수 있다. 하아드로겔은 세포들이 부착하여 생장하는 얇은 매트릭스 또는 스캐폴드를 제공한다. 이러한 투여 방법들은 환자 질환과 연관된 조직이 불규칙한 형상을 갖거나 세포들이 먼 위치에 적용될 때(예를 들어, 포자를 닮은 세포들이 당뇨병 치료를 위해 신피막(腎皮膜) 아래에 위치할 때) 특히 적합하다.
대안으로, 하이드로겔-세포 혼합물은 투과성이면서 생체적합성의 지지체로 도입될 수 있는데, 이에 따라 하이드로겔-세포 혼합물이 지지체를 채우면서 고형화됨에 따라 지지체 형상을 추정할 수 있게 된다. 따라서, 지지체는 내부에 위치하는 포자를 닮은 세포들 또는 이들의 후손으로부터 성숙되는 조직의 발생과 형태를 안내할 수 있다. 추가로 후술되는 바와 같이, 지지체는 하아드로겔-세포 혼합물로 채우기 전 또는 후에 환자에게 제공될 수 있다. 예를 들어, 지지체는 조직 내(예를 들어, 피부, 간 또는 골격계의 손상 영역)에 위치되고, 이어서 주사기, 카테터 또는 다른 적당한 기구를 이용하여 하이드로겔-세포 조성물로 채워질 수 있다. 바람직하게, 지지체의 형상은 손상된 조직의 형상에 맞게 만들어질 수 있다. 후술하는 설명 부분에서, 적합한 지지체의 구조, 하이드로겔 및 전달 방법들이 설명된다.
하이드로겔은 생체적합성이고, 생분해성이며 살아있는 세포들을 유지할 수 있어야 하고, 바람직하게는 생체내에서 신속하게 고형화되어야 한다(예를 들어 지지체에 전달된 후 대략 5분 이내). 많은 수의 세포들이 하이드로겔 내에 고르게 분포될 수 있다. 하이드로겔은 일반적으로 대략 5×lO6 세포/ml를 유지할 수 있다. 또한, 하이드로겔은 확산을 가능하게 하여 영양분은 세포들에게 도달하게 하고 노폐물은 운반될 수 있도록 한다.
다양한 하이드로겔이 사용될 수 있다. 다음의 것들을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니다: (1) 체온에서 고형화되거나 고정되는 온도 의존적인 하이드로겔 (예를 들어, PLURONICS™.); (2) 이온에 의해 가교화된 하이드로겔(예를 들어, 알긴산 나트륨); (3) 가시광선 또는 자외선 노출시 고정되는 하이드로겔 (예를 들어, 아크릴레이트 말단기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리탁트산의 공중합체); 및 (4) pH 변화시 고정되거나 고형화되는 하이드로겔(예를 들어, TETRONICS™). 전술한 바와 같은 다른 폴리머들의 합성 방법들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려져 있다(참조: 예를 들어, Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, J. I. Kroschwitz, Ed., John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1990). 폴리(아크릴산), 알지네이트 및 PLURONICS™은 상업적으로 입수가능하다.
알지네이트 또는 키토산과 같은 이온성 다당류는 포자를 닮은 세포들 및 그들의 자손을 포함하는 살아있는 세포들을 현탁하기 위해 사용될 수 있다. 이들 하이드로겔은 알긴산의 음이온성 염, 해초로부터 분리된 탄수화물 폴리머를 칼슘 양이온들과 같은 이온들로 가교함으로써 생성될 수 있다. 하이드로겔의 강도는 칼슘 이온 또는 알긴산의 농도를 증가시키면 증가된다. 미국특허 제4,352,883호는 실온에서 알긴산과 2가 양이온의, 물에서의 이온 가교를 통해 하이드로겔 매트릭스를 형성하는 것을 기술하고 있다.
포자를 닮은 세포들의 계군은 알지네이트 용액과 혼합된다. 이 용액은 먼저 이식된 지지체로 전달되어 생체 내 칼슘 이온의 생리학적 농도의 존재 때문에 짧은 시간 내에 고형화된다. 대안으로, 상기 용액은 이식 전에 지지체에 전달되고 칼슘 이온을 포함하는 외부 용액에서 고형화된다.
통상, 이들 폴리머는 수용액에서 적어도 부분적으로 용해된다(예를 들어, 물, 하전된 측쇄기를 갖는 수용성 알콜 용액 또는 이의 1가 이온염). 양이온과 반응할 수 있는 산성 측쇄기를 갖는 폴리머들의 많은 예가 있다(예를 들어, 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산) 및 폴리(메타크릴산)). 산성 그룹들의 예로는 카르복실산 그룹, 설폰산 그룹 및 할로겐화(바람직하게는 플루오르화) 알콜 그룹을 들 수 있다. 음이온과 반응할 수 있는 염기성 측쇄기를 갖는 폴리머들의 예로는 폴리(비닐 아민), 폴리(비닐 피리딘) 및 폴리(비닐 이미다졸)을 들 수 있다.
하전된 측쇄기를 갖는 수용성 폴리머들은 반대의 전하를 갖는 다가 이온들을 포함하는 수용액과 반응하여 가교되는데, 폴리머가 산성의 측쇄기를 가지면 다가 양이온, 그리고 폴리머가 염기성의 측쇄기를 가지면 다가 음이온과 반응하여 가교된다. 하이드로겔을 형성하기 위해 산성 측쇄기와 반응하여 폴리머를 가교하는 양이온들로는 구리, 칼슘, 알루미늄, 마그네슘 및 스트론튬과 같은 2가 양이온 및 3가 양이온을 들 수 있다. 이들 양이온들에 대한 염의 수용액이 폴리머에 첨가되어 부드럽고 많이 팽창된 하이드로겔을 형성한다.
하이드로겔을 형성하기 위해 폴리머를 가교하는 음이온들로는 저분자량의 디카르복실레이트(dicarboxylate) 이온, 테레프탈레이트(terepthalate) 이온, 설페이트 이온 및 카보네이트 이온과 같은 2가 음이온 및 3가 음이온을 들 수 있다. 양이온에 대해 앞서 서술된 바와 같이, 이들 음이온들에 대한 염의 수용액이 폴리머에 첨가되어 부드럽고 많이 팽창된 하이드로겔을 형성한다.
항체들이 하이드로겔로 통과되는 것을 방지하지만 영양분의 통과는 허용하기 위해 하이드로겔에 사용되는 유용한 폴리머 크기는 10 내지 18.5 kDa의 범주이다. 작은 폴리머는 작은 구멍과 함께 겔의 밀도를 높게 한다.
온도 의존적이거나 열민감성의 하이드로겔 또한 사용될 수 있다. 이러한 하하이드로겔은 소위 "가역성 겔화"(reverse gelation) 특성, 즉 실온과 같거나 낮으면 액상이고 그 이상의 온도(예를 들어 체온)로 높아지면 겔로 되는 특성을 갖는다. 따라서, 이러한 하이드로겔은 실온과 같거나 낮은 온도에서 액상으로 쉽게 적용될 수 있고, 체온까지 올라가면 반-고형의 겔을 자동적으로 형성한다. 결과적으로, 이들 겔은 지지체가 최초 환자에게 이식된 후 하이드로겔-세포 조성물로 지지체가 채워질 때 특히 유용하게 된다. 이러한 온도 의존적인 하이드로겔의 예로는 PLURONICS™ (BASF-Wyandotte), 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 F-108, F-68 및 F-127, 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드), 및 N-이소프로필아크릴아마이드 공중합체를 들 수 있다.
이들 공중합체들은 다공성, 분해속도, 천이 온도 및 강직도와 같은 물리적 특성에 영향을 주기 위해 표준 기술에 의해 다루어질 수 있다. 예를 들어, 염의 존재 또는 부존재 하에서 저분자량 당류의 첨가는 전형적인 열민감성 폴리머의 LCST(lower critical solution temperature)에 영향을 준다. 또한, 이들 겔이 4℃에서 분산된 5 내지 25% (W/V) 범위의 농도로 준비될 때 점도와 겔-졸 천이 온도는 영향을 받는다. 겔-졸 천이 온도는 농도에 반비례한다. 이들 겔은 분산 특성을 가져 포자를 닮은 세포들과 이들의 자손이 생존하고 영양분을 공급받는 것을 가능하게 한다.
미국특허 제4,188,373호는 수용액 조성의 PLURONIC™ 폴리올을 이용한 열적 겔화 수용성 시스템을 제공하고 있다. 미국특허 제4,474,751호, 제4,474,752호, 제4,474,753호 및 제4,478,822호는 열고정형 폴리옥시알킬렌 겔을 이용한 약물 전달 시스템을 기술하고 있다. 이들 시스템을 이용하면, 겔의 젤 천이 온도 및/또는 강직도 모두가 폴리머의 농도 뿐만아니라 pH 및/또는 이온세기의 조정에 의해 변형될 수 있다.
다른 적합한 하이드로겔은 pH 의존적이다. 이들 하이드로겔은 특정 pH에서, 특정 pH 아래 또는 위에서 액상이고, 특정 pH, 예를 들어 인체 내의 세포외액(extracellular fluid)의 정상 pH 범위인 7.35 내지 7.45에 노출되면 겔로 된다. 따라서, 이들 하이드로겔은 이식된 지지체에 액상으로서 쉽게 전달될 수 있고, 인체의 pH에 노출될 때 반-고형의 겔을 자동적으로 형성하게 된다. 이러한 pH 의존적인 하이드로겔의 예로는 TETRONICS™ (BASF-Wyandotte), 에틸렌 디아민의 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 폴리머, 폴리(디에틸 아미노에틸 메타크릴레이트-g-에틸렌 글리콜), 및 폴리(2-하이드록시메틸 메타크릴레이트)를 들 수 있다. 이들 공중합체들은 물리적 특성에 영향을 주기 위해 표준 기술에 의해 다루어질 수 있다.
포자를 닮은 세포들 또는 이들의 자손을 투여하기 위해 사용될 수 있는 다른 하이드로겔은 가시광선 또는 자외선에 의해 고형화될 수 있다. 이들 하이드로겔은 수용성 영역, 생분해성 영역 및 적어도 2개의 중합가능한 영역을 포함하는 마크로머(macromer)로 만들어진다(미국특허 제5,410,016호 참조). 예들 들어, 상기 하이드로겔은 코어, 상기 코어의 각각의 말단 상의 연장부 및 각 연장부 상의 말단캡을 포함하는 생분해성이면서 중합가능한 마크로머로 시작할 수 있다. 상기 코어는 친수성 폴리머이고, 상기 연장부는 생분해성 폴리머이며, 상기 말단캡은 가시광선 또는 자외선, 예를 들어 긴 파장의 자외선에 노출시 마크로머들을 가교시킬 수 있는 올리고머이다.
이러한 광 고형화 하이드로겔의 예로는 폴리에틸렌 옥사이드 블록 공중합체(polyethylene oxide block copolymers), 아크릴레이트 말단기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 폴리락트산 공중합체, 그리고 양 말단이 아크릴레이트로 캡핑된 10K 폴리에틸렌 글리콜-글리콜라이드 공중합체를 들 수 있다. PLURONIC™ 하이드로겔의 경우와 같이, 이들 하이드로겔을 포함하는 공중합체들은 분해속도, 결정도(crystallinity) 차이 및 강직도와 같은 물리적 특성을 변형하기 위해 표준 기술에 의해 다루어질 수 있다.
하이드로겔은 주사기 또는 카테터에 의해 투여되거나, 다른 지지체의 이식 시점에서 투여될 수 있다. 가교는 투여 전, 투여 동안, 또는 투여 후 일어날 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 다르게 정의되지 않는 한, 본 실시예에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본 명세서에서 인용된 공개문헌들과 이를 인용하기 위한 자료들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예
본 명세서에서 기술된 방법들을 사용하여 포자를 닮은 세포들의 계군을 외배엽, 중배엽 및 내배엽을 대표하는 몇몇 조직들 뿐만아니라 골수로부터 분리하였다. 분리 후 바로, 포자를 닮은 세포들은 항생제 B27, FGF 및 EGF를 갖는 DMEM/F12로 구성된 "기본 배지"("basic media")로 지칭되는 배지에 위치시켰다. 이들 세포는 몇 주 동안 기본 배지에서 유지시켰는데, 이 기간 동안에 시간 순차적인 연구들이 이들 세포에 의해 발현되는 마커들을 확인하기 위해 수행되었다. 마커들은 유전자 발현 분석과 단백질 발현 확인에 대한 면역조직화학법(immunohistochemistry)을 이용하여 확인하였다.
내배엽, 중배엽 및 외배엽을 대표하는 조직들부터 얻은 포자를 닮은 세포들은 "기본 배지"에 노출되는 동안 배아줄기세포와 연관된 마커들의 발현에 대해 분석되었다. 내배엽 조직(폐 및 간), 중배엽 조직(근육) 및 외배엽 조직(척수 및 부신)으로부터 획득한 포자를 닮은 세포들의 모집단에 대해 "기본 배지"에 유지시키면서 골수에서 얻은 포자를 닮은 세포들과 동일한 유전자 마커들 및 단백질 마커들의 패널에서의 발현 뿐만아니라 골수 유래 포자를 닮은 세포들의 동일 마커들 부존재에 대해 분석하였다.
그런 다음, 세포들은 3개의 분화 배지(내배엽 분화 배지, 중배엽 분화 배지 및 외배엽 분화 배지) 중 하나로 노출시켰다. 상기 분화 배지의 조성은 다음과 같다.
내배엽 분화 배지: 간세포 배양 배지, 아스코르브산, BSA-FAF, 하이드로코르티손(hydrocortisone), 트랜스페린, 인슐린, hEGF, 게노미오신(genomyosin) + 10% FBS(fetal bovine serum).
중배엽 분화 배지: DMEM + 20% FBS(fetal bovine serum).
외배엽 분화 배지: DMEM/F12 + B27, BEDA FGF, EGF로 구성된 기본 배지에 10% FBS(fetal bovine serum) 첨가.
골수 및 대표적인 조직 각각으로부터 얻은 해체된 클러스터를 포함하는 포자를 닮은 세포들의 모집단이 전술한 바와 같은 보충된 "분화 배지" 각각에 노출될 때, 상기 세포들은 사용된 배지의 기능으로 내배엽, 중배엽 또는 외배엽의 대표적 세포들로 분화되는데, 이는 알려진 단백질 마커들 및 유전자 마커들에 의해 결정된다. 즉, 내배엽 분화 배지가 사용되었을 때, 세포들은 내배엽 조직과 일치하는 다음과 같은 단백질 마커들을 발현하였다: 사이토케라틴 18(cytokeratin 18), 알부민 및 알파 태아 단백질. 또한, 유전자 마커인 GATA4가 발현되었다.
중배엽 분화 배지가 사용되었을 때, 세포들은 중배엽 조직과 일치하는 다음과 같은 단백질 마커들을 발현하였다: 미오신, 데스민(desmin), 알파 평활근 액틴(alpha smooth muscle actin). 또한 유전자 마커인 브라키어리(burachyury)가 발현되었다.
외배엽 분화 배지가 사용되었을 때, 세포들은 외배엽 조직과 일치하는 다음과 같은 단백질 마커들을 발현하였다: 네스틴(Nestin), 맵2 베타-Ⅲ 튜불린(Map2 Beta-Ⅲ tubulin)(이들 모두 뉴론의 마커임), 04(희돌기교세포(oligodendrocytes)의 마커임), GFAP(신경교세포의 마커임). 또한, 맵2(Map2)의 발현이 유전자 발현 분석에 의해 확인되었다.
본 발명의 기술분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 3개의 배엽층의 분화를 확인하는데 가장 일반적으로 받아들여지는 마커들은 내배엽의 경우 알파 배아 단백질이고, 중배엽의 경우 알파 평활근 액틴이며, 외배엽의 경우 베타-Ⅲ 튜불린이다. 이들 모두는 해당 조직의 발생에 있어서 매우 초기에 정상적으로 발현된다. 또한, 유전자 마커인 맵2(map2), 브라키어리(burachyury) 및 gata4는 배아의 배엽층 형성시 매우 초기에 발현된다.
결과들
(i) 골수 유래의 포자를 닮은 세포들:
골수에서 분리된 포자를 닮은 세포들의 계군은 몇일 안에 다수의 세포 클러스터를 생성하였다. 개별 세포는 클러스터 내에 포함되거나 다음과 같은 유전자 마커들을 단독으로 발현하였고 이들 발현 마커들은 배아 줄기 세포와 연관되어 있다: Oct4, 나노그(Nanog), Daxl, Fgf4, Zfp296, 크립토(Cripto), Gdf3, Utfl, Cdx2, Ecatl, Esgl, Sox2 및 Pax6, cMyc (증식 유전자), Fgf5, 01ig2 및 Pdgfrl2. 또한, 마커 네스틴(신경 줄기 세포와 유전적으로 연관된 마커)도 관찰되었다.
Oct4는 POU 전사인자이고 나노그는 NK-2 클래스 홈박스(homebox) 전사인자이며, 이들 모두 미분화 상태의 유지 및 배아 줄기 세포에서의 분화만능과 연관되어 있다(Pan, et al., Cell Res., 12:321-329 (2002); Clark, et al., Stem Cells, 22: 169-179 (2004); Niwa, Development, 134:635-646 (2007)). 크립토(기형암종(teratocarcinoma) 유래의 생장인자 1)는 내세포집단(inner cell mass)에서 초기에 발현되는 마커로서 척추동물 배아발생과정에서 중요한 역할을 하는 다기능 세포 표면 단백질이다(Strizzi, Oncogene, 24:5731-5741 (2005)). GDF3은 분화만능 상태에서 특이적으로 발현되는 TGF-β 리간드들의 슈퍼 패밀리 중의 하나이다(Levine, Development, 133:209-16 (2005)). 미분화된 배아 전사 인자(UtFl)는 줄기 세포 특이적인 방식으로 마우스 배아 줄기 세포에서 발현되는 전사 보인자(transcription co-factor)로서 최초 확인되었다. Utfl은 분화만능에 대한 마커로서 여겨지고 있다(Niwa, Cell Structure and Function, 26(3):137-148 (2001)). 배아 줄기세포와 연관된 전사인자 1(Ecatl)은 배아 줄기세포-연관된 트랜스 유전자(trans gene)이다. KH-도메인을 포함하는 단백질을 인코딩하는 배아 줄기세포-특이적인 유전자(Esgl)는 ES 세포, 배아 생식세포(germ cell) 및 분화다능 생식세포계열 줄기세포를 포함하는 분화만능 세포에서 발현된다(Kanatsu-Shinohara, Cell, 1001-1012 (2004)). Sox2 및 Pax6로도 알려진 SRY(성 결정 영역 Y)-박스 2(box 2)는 ES 세포 및 신경 줄기세포와 연관된 마커들이다. Sox2는 유도된 분화만능 줄기세포에서 요구되는 핵심 전사인자 중 하나이다(Zhao, J. Cell. Biochem. 105(4): 949-55 (2008)). 네스틴(Nestin)은 중추 신경계로부터의 줄기세포에서 우세하게 발현되는 클래스 VI 중간 필라멘트 단백질(class VI intermediate filament protein)이다(Frederisken, et al., J. Neurosci, 8:1144-51 (1988)). 따라서, 골수로부터 얻은 포자를 닮은 세포들은 분화만능을 나타내는 마커들을 발현한다.
또한, 포자를 닮은 세포들은 배아 줄기세포와 연관된 다음의 단백질 마커들을 발현하였다: 면역조직화학법에 의해 보여지는 바와 같은 C-kit 및 Sca1 (표면 마커들), 및 E-카데린(E-cadherin).
골수로부터 분리된 포자를 닮은 세포들은 다음과 같은 배아 줄기세포 마커들에 대해 음성으로 염색된 것은 주목할 사실이다: Dax 1, Fgf4(fibroblast growth factor 4), Cdx2(caudal type homeobox transcription factor 2), Neo 및 Eras (ES 세포의 종양 형성 유전자), 및 Rex 1. 이들 세포는 신경능선 줄기세포 마커인 P75에 대해 음성으로 염색되었다. 이들 세포는 Cd45, Cd31 또는 Cd34 (내피 줄기세포 마커 및 조혈모 줄기세포 마커임)와 같은 단백질 마커들을 발현하지 않았다.
(ii) 근육
근육에서 얻은 포자를 닮은 세포들은 골수로부터 얻은 포자를 닮은 세포들에서 관찰된 배아 줄기세포 마커들과 동일한 마커들을 발현하였다. 즉, 이들 세포는 Oct4, Daxl, Fgf4, Zfp296, 크립토, Gdf3, Utfl, Cdx2s Ecatl, Esgl, Sox2 및 Pax6, cMyc, Fgf5, Olig2, Pdgfr12를 발현하였다.
근육 유래의 포자를 닮은 세포들은 골수 유래의 포자를 닮은 세포들과 유사하게 Daxl, Fgf4, Cdx2, Neo 및 Eras, Rex 1 (배아 줄기세포 마커들), P75(신경능선 줄기세포 마커), Cd45 또는 Cd31(내피 줄기세포 마커 및 조혈모 줄기세포 마커임)에 대해 음성으로 염색되었다.
근육에서 분리된 포자를 닮은 세포들은 다수의 세포 클러스터(구체 형상)를 형성한 후 조사되었다.
구체(sphere)는 빠르면 몇 일 내에 형성되기 시작했으나, 최초 분리 후 적어도 3주 동안은 마커들에 대해 테스트하지 않았다. 구체들은 궁극적으로 직경이 300 마이크론 이상으로 성장하였다. 근육 유래의 포자를 닮은 세포들로부터 형성된 구체들은 줄기세포를 나타내는 세포 표면 마커이나 배아 줄기세포(ESC)에서는 필수적이지 않은 ckit 마커에 대해 양성으로 염색되었다. 구체들 세포의 거의 50%가 3주째에 양성이었으나, 90일째에는 단지 1-5%만이 양성이었다(이는 성숙할 때 줄기세포성을 상실하는 것을 나타냄).
근육세포 구체(myosphere)로부터 떨어져 나온 세포들에 대해서도 분석하였다. 이들은 생장 및 성숙에 따라 근육세포 구체에서 유래하고 떨어져 나온 세포들이다. 줄기세포 항원 1(Sca-1), CD31 및 CD45에 대한 항체들을 PE에 직접 접합시켰다. CD29, CD34 및 CD90에 대한 항체들은 FITC에 직접 접합시켰다. 구체 내의 세포들은 SCA-1, CD29, CD34, CD90 및 Bl 인테그린에 대해 양성인 반면에, 보다 성숙한 세포들에 대한 조혈모 세포 및 내피세포 마커들인 CD31, CD45에 대해서는 음성이었다. 마커 발현은 시간 경과에 따라 변화하였다. 구체에서 떨어져 나온 세포들이 부착됨에 따라, 이들은 최초 미성숙 마커인 CD90을 상실하였고 Sca-1을 상실하기 시작하였다. 또한, 근육세포 구체의 세포들은 성숙세포 마커인 MyoD를 발현하지 않았고 Pax7 및 Myf5는 발현하지 않거나 거의 발현하지 않았다.
그러나, 이들 근육세포 구체를 플레이트에 위치시켰을 때, 부착 세포는 성숙하여 Pax7, MyoD 및 데스민을 발현하였고 분화 배지를 첨가 후에는 융합하여 다핵성의 근관(myotube)을 형성하였다. 지방세포 형성 및 골세포 형성 배지에 놓인 근육세포 구체는 지방과 뼈로 분화하였다. 근육세포 구체로부터 유래한 세포들을 GFP로 표지하고 근육으로 주입할 때, 이들은 GFP로 표지된 근육 섬유를 생성하였다. 근육세포 구체 형성을 통해 생성된 세포들은 Pax7, Myf5, 및 MyoD와 같은 근육성 마커들을 아직 발현하지 않기 때문에 분화다능 줄기세포이다. 그러나, 이들은 성숙함에 따라 상기 마커들을 발현하고, 다핵성 근관, 지방 생성 세포 및 골 생성 세포를 형성할 수 있으며 생체내에서 손상된 근육을 재생할 수 있다. MyoD(핵), 데스민(세포질) 및 Sca-1 (표면)에 대한 염색은 황적색으로 나타났다. Pax7(핵)에 대한 염색은 녹색으로 나타났다. 근육세포 구체가 근원성 전단계(pre-myogenic)이고 Pax7, Myf5 또는 MyoD를 발현하지 않는 것은 역전사 PCR로 확인하였다. 근육세포 구체로부터 떨어져 나온 세포들이 부착되고 성숙하면 Pax7, Myf5 및 MyoD를 발현하였다.
(iii) 폐
유사한 시간 의존적인 마커 발현들이 폐로부터 분리된 포자를 닮은 세포들에서 확인되었다. 폐로부터 분리된 포자를 닮은 세포들은 초기에 cKit를 발현한 다음, 네스틴을 발현하였다.
이후 구체에서 떨어져 나온 세포들은 허파꽈리의 타입 II 내피세포에 대한 마커인 SP-C를 발현하였고(유전자 발현 및 단백질 분석), 세기관지세포(Clara cell)에 대한 CC10을 발현하였다(유전자 발현 및 단백질 분석).
(iv) 부신(Adrenal Gland)
부신은 매우 초기에 줄기세포 마커들을 발현하고 난 다음, 성숙하여 크롬친화성 세포(chromaffin cell)의 마커들을 발현하며, 세포는 카테콜아민(catecholamines)을 만든다. 최초 분리되었을 때, 부신에서 얻은 포자를 닮은 세포들은 골수로부터 얻은 세포들과 유사하게 Oct4, Daxl, Fgf4, Zfp296, 크립토, Gdf3, Utfl, Cdx2, Ecatl, Esgl, Sox2 및 Pax6, cMyc, Fgf5, 01ig2, Pdgfr12를 발현하였다.
부신 유래의 포자를 닮은 세포들은 골수 유래 세포들과 유사하게 Daxl, Fgf4, Cdx2, Neo 및 Eras, Rex 1 (배아 줄기세포 마커들), P75(신경능선 줄기세포 마커), Cd45 또는 Cd31(내피 줄기세포 마커 및 조혈모 줄기세포 마커임)에 대해 음성으로 염색되었다.
성숙된 세포들에서는 SF1, 부신피질의 스테로이드 합성 마커, DAX1, SCG10 전구체(progenitor), 크로마핀(cromaffin)이 발현되었다.
(v) 뇌 및 말초신경계
뇌 및 말초신경계는 뇌, 척수 및 말초신경을 포함한다. 이들 조직에서는 배아 마커인 Sca-1 및 Oct-4를 확인하였다. 이들은 성숙하면 네스틴, 다른 신경 마커들 그리고 말초 신경 내의 슈반 세포(Schwann cells)에 대한 마커를 나타낸다.

Claims (8)

  1. 세포들의 분리된 계군이고,
    상기 세포들의 분리된 계군은, 옥타머-결합 단백질(Oct4:octamer-binding transciption factor 4), 나노그(nanog), 징크 핑거 단백질 296(Zfp296: Zinc Finger Protein 296), 기형암종(teratocarcinoma) 유래의 생장인자(cripto(크립토)), 증식 분화 인자3(Gdf3:growth differentiation factor-3), 미분화 배아세포 전사인자 1(UtFl:undifferentiated embryonic cell transcription factor 1), 배아줄기세포 관련 전사물 1(Ecatl:embryonic stem cell associated transcript 1), 배아줄기세포-특이적 유전자 1(Esgl:embryonic stem cell-specific gene 1), 성결정영역 Y박스 2(Sox2:sex determining region Y-box2), 페어드 박스 단백질 6(Pax6: paired box protein 6), 및 네스틴(nestin)의 마커들을 발현하고, 외배엽 조직, 중배엽 조직 및 내배엽 조직으로 구성된 군으로부터 선택된 출산 후(post-natal) 동물 조직에서 분리되며,
    상기 세포들은, 적어도 4시간 동안 완전한 산소 제거에 이어지는 상기 출산후 동물 조직에서 생존하는 세포들의 초기의 계군을 분리하고, 상기 마커들의 발현을 위한 시간 동안 기본 배지에서 초기의 세포 군을 배양하고, 상기 마커들을 발현하는 세포의 계군을 분리하는 과정을 포함하는 공정에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는, 세포들의 분리된 계군.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 출산 후 동물 조직은 포유류 조직, 조류 조직, 파충류 조직 및 양서류 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포들의 분리된 계군.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 출산 후 동물 조직은 심장, 장, 방광, 신장, 간, 폐, 부신, 피부, 망막 및 췌장으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 세포들의 분리된 계군.
  4. 세포들의 계군을 분리하는 방법으로서, 상기 방법은, 옥타머-결합 단백질(Oct4:octamer-binding transciption factor 4), 나노그(nanog), 징크 핑거 단백질 296(Zfp296: Zinc Finger Protein 296), 기형암종(teratocarcinoma) 유래의 생장인자(cripto(크립토)), 증식 분화 인자3(Gdf3:growth differentiation factor-3), 미분화 배아세포 전사인자 1(UtFl:undifferentiated embryonic cell transcription factor 1), 배아줄기세포 관련 전사물 1(Ecatl:embryonic stem cell associated transcript 1), 배아줄기세포-특이적 유전자 1(Esgl:embryonic stem cell-specific gene 1), 성결정영역 Y박스 2(Sox2:sex determining region Y-box2), 페어드 박스 단백질 6(Pax6: paired box protein 6), 및 네스틴(nestin)의 마커들을 발현하는 세포들의 계군을 분리하는 방법이고,
    상기 방법은,
    (a) 적어도 4시간 동안 완전한 산소 제거에 이어지는, 출산후 동물 조직에서 생존하는 세포의 초기 계군을 분리하는 단계;
    (b) 상기 마커들의 발현을 위한 시간 동안 상기 세포들을 기본 배지에서 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 마커들을 발현하는 세포들을 확인하고 분리하는 단계를 포함하는, 세포들의 계군을 분리하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 단계 (c)는,
    (i) 상기 단계 (b)에서의 세포들을, 상기 마커들에서 선택된 하나의 마커에 특이적인 결합 파트너를 접촉시키되, 각 세포상의 상기 마커에 상기 결합 파트너의 결합을 허용하는 데 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계, 및
    (ii) 마크-양성 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 세포들의 계군을 분리하는 방법.
  6. 삭제
  7. 제5항에 있어서,
    상기 결합 파트너는 상기 마커에 특이적인 항체인, 세포들의 계군을 분리하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 마커-양성 세포들은 형광-활성화된 세포 분류를 이용하여 분리되는 것을 특징으로 하는, 세포들의 계군을 분리하는 방법.
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