KR102075103B1

KR102075103B1 - 홍어 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102075103B1
Application number: KR1020180116017A
Authority: KR
Inventors: 박성민; 이정노; 김문회
Original assignee: 주식회사 코씨드바이오팜
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2018-09-28
Publication date: 2020-02-10

Abstract

본 발명은 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다. 상기 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물은 홍어 또는 홍어코를 효소로 가수분해하여 수득한 가수분해물을 멸균시킨 후 발효 균주로 발효시킨 것으로, 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 생성을 억제하여, 피부 주름을 개선시킬 수 있고, 아쿠아포린-3(AQP-3)의 발현을 증가시켜, 피부 보습을 개선시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 천연 추출물을 유효성분으로 함유하기 때문에 부작용이 적고 보다 안전하다.

Description

홍어 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION CONTAINING THE FERMENTED EXTRACT OF OKAMEJEI KENOJEI}

본 발명은 홍어 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부 환경으로부터 인체를 보호하고, 내부의 수분 및 유용 성분이 밖으로 유출되는 것을 막아주는 장벽기능, 체온조절, 배설 등 다양한 생리적 기능을 담당하는 중요한 기관이다. 그러나 일반적으로 나이가 들어감에 따라 피부는 내·외적인 환경에 의하여 수분, 탄력성, 색, 윤기 등을 잃고 거칠어지는데, 이러한 과정을 피부 노화라 한다. 피부 노화는 세월이 흘러감에 따른 노화 현상인 내인성 노화(intrinsic aging)와 오랜 햇빛 노출에 따른 노화 현상인 광노화(photo aging)로 나눌 수 있다. 내인성 노화 및 광노화는 모두 유해한 활성 산소에 의해 발생되는 점에서 동일하나, 광노화는 이 활성 산소가 자외선에 의해 생성된다는 점에서 차이가 있다.

피부 노화는 콜라겐 분해 효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(Matrix Metalloproteinase-1; 이하, MMP-1)에 의해서 촉진될 수 있다. 생체 내에서는 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해가 적절하게 조절되지만, 노화가 진행되면 콜라겐 합성이 감소하고 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 생기게 된다. 따라서, 피부 노화 및 주름을 방지하기 위해서는 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP-1의 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 필요가 있다.

현재까지 알려진 주름 개선을 위한 가장 효과적인 방법은 레티놀과 레티노익산을 이용하는 것이다. 레티놀과 레티노익산의 주름 개선 또는 탄력 개선 효과는 문헌을 통하여 잘 알려져 있지만, 소량만으로도 피부에 자극을 주는 단점을 가지며, 불안정성으로 인하여 공기 중에 노출되면 쉽게 산화 변질되기 때문에 사용하는데 많은 제약이 있다. 이에 레티노이드를 안정화하기 위한 연구는 계속해서 진행되고 있으나, 아직까지 피부에 대한 안전성 문제는 해결되지 않고 있다.

한편, 자외선은 아쿠아포린-3(aquaporin-3; 이하, AQP-3)의 발현을 감소시켜 피부 건조를 유발한다고 알려져 있다. AQPs는 작은 소수성 세포막 내재 단백질(Small hydrophobic integral membrane proteins)로 수분을 특이적으로 수송하는 역할을 담당한다. 인간 각질형성 세포는 세포막에 AQP-3를 발현하고 있고, AQP-3 부족시 피부 보습, 피부 보호막 손상, 상처치유능 저하 등의 피부 문제가 나타난다.

한국등록특허 제10-1230650호 (2013.01.31. 등록)

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 홍어 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 우수한 효과를 가진 기능성 화장료로 사용될 수 있다. 상기 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물은 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 생성을 억제하여, 피부 주름을 개선시킬 수 있고, 아쿠아포린-3(AQP-3)의 발현을 증가시켜, 피부 보습을 개선시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 천연 추출물을 유효성분으로 함유하기 때문에 부작용이 적고 안전하여, 합성 화학 물질을 함유하여 피부에 자극을 주는 여러 화장료에 대한 소비자의 거부감을 해소할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 홍어코 발효 추출물의 분자량을 고성능액체크로마토그래피-겔투과크로마토그래피(HPLC-GPC)를 이용하여 측정한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍어 추출물의 농도에 따른 콜라겐 분해 효소인 MMP-1 생성 억제능을 측정한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 홍어코 추출물의 농도에 따른 MMP-1 생성 억제능을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍어 발효 추출물의 농도에 따른 MMP-1 생성 억제능을 측정한 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍어코 발효 추출물의 농도에 따른 MMP-1 생성 억제능을 측정한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 홍어 추출물의 농도에 따른 아쿠아포린-3(AQP-3) 발현 효과를 측정한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 홍어코 추출물의 농도에 따른 AQP-3 발현 효과를 측정한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 홍어 발효 추출물의 농도에 따른 AQP-3 발현 효과를 측정한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍어코 발효 추출물의 농도에 따른 AQP-3 발현 효과를 측정한 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명자는 천연 추출물을 함유하는 기능성 화장품에 초점을 두고, 여러 원물들에 있어서 피부 주름개선 또는 보습용 화장료 조성물로의 응용 가능성을 연구한 결과, 천연물로 홍어를 선정하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "홍어(Okamejei kenojei)"는 가오리과에 속하는 연골, 저서성 어류로 우리나라의 남서해, 일본의 중부이남 해역 및 동중국해에 많이 분포하고 있다. 홍어는 우리나라에서 상업적 가치가 높으며, 목표 등지에서는 전통 발효식품으로 애용된다. 홍어는 불포화지방산이 함유되어 있어 혈중 콜레스테롤을 낮춰주는 효과가 있고, 타우린과 베타인이 함유되어 있어 숙취해소 및 간 기능 개선에도 도움이 되며, 관절염 치료에 사용되는 황산콘드로이친(Chondroitin sulfate)이 풍부하게 함유되어 있어 골다공증 예방 등 뼈 건강 개선에도 효과가 있다. 또한, 홍어에는 콜라겐과 더불어 피부에 좋은 여러 영양소가 함유되어 있어, 이를 이용하면 피부에 탄력이 생기고 주름이 줄어드는 효과를 볼 수 있다. 특히, 홍어의 얼굴 제일 앞쪽의 삼각형 모양 부위의 홍어코는 황산콘드로이친, 프로테오글리칸 등이 다량 함유되어 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 함유할 수 있고, 상기 홍어 발효 추출물은 홍어의 꼬리, 애, 또는 몸통 중에서 선택된 어느 하나 이상으로부터 얻은 발효 추출물일 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에서, 상기 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물은 홍어 또는 홍어코를 효소로 가수분해하여 수득한 가수분해물을 멸균시킨 후, 발효 균주로 발효시킨 것 일 수 있다.

상기 가수분해물은 상기 홍어 또는 홍어코를 알칼라아제(Alcalase)로 제1 차 가수분해하고, 프로테아제(Protease)로 제2 차 가수분해하여 수득한 것을 포함할 수 있다. 상기 효소는 단백질 분해 효소로, 상기 알칼라아제 및 프로테아제 외에도 키모트립신(Chymotrypsin), 펩신(Pepsin) 등을 첨가하여 가수분해할 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 효소의 종류에 따라, 온도, pH, 및 반응시간 등을 조절하여 가수분해할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에서, 상기 가수분해물은 프로테오글리칸을 포함할 수 있다.

본 발명에서 "프로테오글리칸(Proteoglycan)"은 중심 단백질(coreprotein)과 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)이 결합된 것으로, 골, 연골, 피부, 인대 등에 함유되어 있다. 대표적인 글리코사미노글리칸은 헤파린(heparin), 황산헤파란(heparan sulfate), 황산콘드로이틴(chondroitin sulfate), 황산더마탄(dermatan sulfate), 황산케라탄(keratan sulfate) 및 하이알루로난(hyaluronan)이 있으며, 이들 글리코사미노글리칸이 하나 이상 복합적으로 조합되어 매우 복잡한 분자적 다양성을 보인다.

프로테오글리칸 분자 속에는 수산기(-OH)가 많아, 물과 결합력이 뛰어나 높은 수분력을 가진다. 또한, 조직의 섬유 성분과 세포 성분을 보호하고, 조직 표면에 가해지는 압박을 견딜 수 있는 탄성을 갖게 하여 피부 탄력 개선에도 도움을 준다. 그러나 일반적으로 프로테오글리칸은 분자량이 120만Da 정도로 큰 고분자이기 때문에, 피부에 흡수율이 낮은 편이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에서, 상기 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물은 상기 프로테오글리칸을 상기 발효 균주로 발효시킨 것 일 수 있다. 고분자인 상기 프로테오글리칸이 발효를 통해 저분자화되면, 피부에 보다 잘 흡수될 수 있다.

상기 발효 균주는 맥주 효모(Saccharomyces cerevisiae), 누룩균(Aspergillus oryzae), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 갈락토미세스(Galactomyces reessii), 흑효모(Aureobasidium pullulans) 등을 포함할 수 있고, 바람직하게는 락토바실러스 람노서스일 수 있다.

본 발명에서 "락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)"는 사람의 소화기관, 여성의 질 내벽, 및 구강 내에서 발견되는 유익균으로, 전반적인 소화력 향상에 도움을 주며 설사, 내장 세포의 사멸을 막아 내장 궤양 등을 치료할 수 있다. 대장균, 포도상구균 등에 대한 항생 효과가 있으며, 알레르기를 완화시키는 역할을 하여 피부염, 습진, 여드름, 아토피 등을 치유할 수 있다. 그뿐 아니라, 배양 과정에서 생성되는 대사물질인 세포외다당체(exopolysaccharide)가 함유되어 있어 피부의 보습력을 높여 피부가 맑아지는 효과를 볼 수 있다. 본 발명에서 락토바실러스 람노서스는 발효 과정에서 다당류인 프로테오글리칸을 분해하여 저분자화할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물은 상기 발효 후, 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매로 추출하여 제조된 것일 수 있다. 상기 용매 추출 외에 추가적인 방법을 덧붙여 추출, 분리 및 정제하여 제조된 것일 수 있다.

상기 용매 추출에 한정되지 않고, 상기 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 다양한 추출 및 분리 방법, 예를 들어, 초고압 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 및 크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 크로마토그래피에 의한 분리 등의 추가적 방법으로 제조된 것일 수 있다.

상기 초고압 추출법은 홍어 또는 홍어코를 압력 100 내지 3000 MPa, 온도 40 내지 90℃에서 20 내지 30시간, 바람직하게는 압력 500 내지 1000 MPa, 온도 40 내지 60℃에서 23 내지 25시간 처리하여 추출할 수 있다. 또한, 초고압 추출 시 pH는 특정 pH에 한정하는 것은 아니나, 초고압기 내부 물의 pH를 1 내지 6으로 낮춰 처리하는 것이 보다 바람직하다.

상기 초고압 처리된 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 물, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 헥산 및 그의 혼합물로부터 선택된 용매를 이용하여 환류 추출하고 냉침한 후 여과시킬 수 있다. 상기 여과액은 농축조로 이송하여 50℃ 이하에서 감압 농축 및 동결 건조될 수 있다.

상기 방법에 따라 수득한 추출물, 감압 농축물 또는 동결 건조물은 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 및 프로필렌글리콜로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매로 액상으로 제형화될 수 있다. 이에 한정되지 않고, 상기 화장료 조성물은 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있고, 보다 상세하게는 화장수, 에센스, 로션, 크림, 팩, 파운데이션, 젤, 연고 또는 스프레이의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물에서, 상기 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물은 화장료 조성물 전체 100 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량% 함유될 수 있다. 상기 발효 추출물이 0.001 중량% 미만으로 포함되는 경우에는 본 발명에서 확인한 여러 피부 기능성의 발휘 효과가 미미하고, 20 중량%를 초과하는 경우에는 재료 투입량 대비 효율성이 떨어져 경제적이지 못하다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제, 예를 들어 친수성 또는 친유성 겔화제, 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양으로, 예를 들어, 조성물 전체 100 중량에 대하여 0.001 내지 20중량%가 함유될 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 상기 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물 이외에 항산화, 미백, 주름개선 및 항염 효과를 나타내는 다른 유효성분을 하나 이상 포함할 수 있다. 다만, 어떠한 경우라도 상기 보조제, 상기 유효성분 및 그 함유량은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 발효 과정을 통해 프로테오글리칸이 저분자화되어 피부에서의 흡수율이 높아질 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 피부 주름개선 또는 피부 보습 개선의 효과를 가질 수 있다. 후술하는 실시예들을 통해, 그 효과를 확인할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[실시예 1 : 홍어 또는 홍어코 연골의 효소 처리에 따른 프로테오글리칸의 수율 및 함량(%)]

본 실시예에서는 홍어 또는 홍어코 연골의 분해 효소별 가수분해 후 프로테오글리칸의 수율을 확인하고자 하였다. 잘게 썰어진 홍어의 연골 부피의 4배에 해당하는 물을 첨가하고, 가수분해하기 위해 5가지 단백질 분해 효소를 사용하여 가수분해를 수행하였다. 가수분해물의 수율과 프로테오글리칸을 측정함으로써 효소 가수분해에 적합한 최적의 효소 농도, pH, 및 반응시간 등을 선정하고자 하였다.

홍어로부터 프로테오글리칸의 추출 효율을 높이기 위한 적절한 단백질 분해 효소를 선택하기 위해, 플라보자임(Flavourzyme), 프로타멕스(Protamex) 1.5MG, 뉴트라아제(Neutrase), 알칼라아제(Alcalase), 및 프로테아제(Protease)를 사용하여 가수분해를 수행하였다. 상기 5가지 단백질 분해 효소를 약 2.0％씩 각각 첨가하고, 각 효소의 pH 및 온도는 플라보자임 pH 6.5, 45℃; 프로타멕스 1.5MG, pH 5.5, 40℃; 뉴트라아제, pH 6.5, 40℃; 알칼라아제, pH 7.0, 50℃; 프로테아제, pH 7, 37℃로 조정하여 각각 24 시간 동안 가수분해한 후 각 분해물의 프로테오글리칸 수율 및 함량을 측정하였다.

효소	수율	함량
Alcalase	19.6	17.1
Protease	20.5	17.8
Flavourzyme	11.2	8.8
Neutrase	13.1	6.9
Protamex 1.5MG	15.3	9.1

표 1은 실시예 1에 따라 단백질 분해 효소에 따른 프로테오글리칸의 수율 및 함량을 나타낸 것이다. 표 1을 참조하면, 상기 단백질 분해 효소 중 알칼라아제와 프로테아제를 사용하여 가수분해를 수행하였을 때, 상기 프로테오글리칸의 수율 및 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.

[실시예 2 : 발효에 따른 프로테오글리칸의 저분자화]

본 실시예에서는 홍어 또는 홍어코 연골을 발효 균주별로 발효한 후, 프로테오글리칸의 저분자화를 확인하고자 하였다. 잘게 썰어진 홍어의 연골 부피의 4배에 해당하는 물을 첨가하고 상기 실시예 1에서 프로테오글리칸의 수율과 함량이 높았던 알칼라아제와 프로테아제를 사용하여 가수분해 후, 발효 균주인 맥주 효모, 누룩균, 락토바실러스 람노서스. 갈락토미세스, 흑효모로 발효시켰다.

맥주 효모(Saccharomyces cerevisiae YM배지, 30℃; 누룩균(Aspergillus oryzae) PDA배지, 26℃; 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) MRS배지, 37℃; 갈락토미세스(Galactomyces reessii) 4% Malt배지, 21℃; 흑효모(Aureobasidium pullulans) PDA배지, 26℃로 조정하여 각각 24 시간 동안 발효한 후, 각 발효물의 프로테오글리칸 분자량을 측정하였다.

	프로테오글리칸	맥주 효모	누룩균	락토바실러스 람노서스	갈락토미세스	흑효모
분자량(Da)	1,200,000	변화없음	변화없음	5,900	변화없음	변화없음

표 2는 실시예 2에 따라 각각의 발효 균주를 사용하여 발효시킨 가수분해물의 프로테오글리칸의 분자량을 측정한 것이다. 표 2를 참조하면, 120만Da의 프로테오글리칸이 락토바실러스 람노서스에 의해 발효되었을 때, 처음 분자량의 약 1/200 정도로 저분자화되었다. 그에 비해 나머지 발효 균주에서는 분자량의 변화가 없었다.

[실시예 3 : 홍어 추출물의 제조]

홍어를 구입하여 불순물을 제거하기 위하여 물로 수세하고, 칼을 이용하여 홍어의 몸통, 꼬리로부터 연골을 채취하여 출발 재료로 하였다. 상기 홍어의 연골로부터 핀셋을 사용하여 고형 지방을 제거하고, 멸균 식염수로 세척하였다. 이어서 분쇄기로 잘게 분쇄하여, 잘게 썰어진 홍어의 연골을 얻었다. 상기 연골 부피의 4배에 해당하는 물을 첨가하고 2개의 효소를 순차적으로 첨가하여 가수분해를 수행하였다.

먼저, 50℃ 및 pH7 조건에서 알칼라아제 효소를 첨가하여 1시간 동안 반응시키는 제1 차 가수분해를 수행하였다. 이때, 알칼라아제 대 홍어는 1:100(W/W)의 비율로 혼합하여 반응시켰다. 제1 차 가수분해 수행 후, 37℃ 및 pH7 조건에서 상기 반응물에 다른 효소인 프로테아제를 첨가하여 4시간 동안 반응시키는 제2 차 가수분해를 수행하였다. 이때, 프로테아제 대 홍어는 1:100(W/W)의 비율로 혼합하여 반응시켰다.

상기 제2 차 가수분해 반응이 완료된 다음, 열수조에서 10분 동안 가열하여 상기 효소를 불활성화시키고, 가수분해물을 분리하였다. 상기 가수분해물을 와트만(whatman) #5 여과지로 여과하여 홍어 추출물을 제조하였다.

[실시예 4 : 홍어코 추출물의 제조]

홍어를 구입하여 불순물을 제거하기 위하여 물로 수세하고, 칼을 이용하여 홍어코로부터 연골을 채취하여 출발 재료로 하였다. 상기 홍어코의 연골로부터 핀셋을 사용하여 고형 지방을 제거하고, 멸균 식염수로 세척하였다. 이어서 분쇄기로 잘게 분쇄하여, 잘게 썰어진 홍어코 연골을 얻었다. 상기 연골 부피의 4배에 해당하는 물을 첨가하고 2개의 효소를 순차적으로 첨가하여 가수분해를 수행하였다.

먼저, 50℃ 및 pH7 조건에서 알칼라아제 효소를 첨가하여 1시간 동안 반응시키는 제1 차 가수분해를 수행하였다. 이때, 알칼라아제 대 홍어코는 1:100(W/W)의 비율로 혼합하여 반응시켰다. 제1 차 가수분해 수행 후, 37℃ 및 pH7 조건에서 상기 반응물에 다른 효소인 프로테아제를 첨가하여 4시간 동안 반응시키는 제2 차 가수분해를 수행하였다. 이때, 프로테아제 대 홍어코는 1:100(W/W)의 비율로 혼합하여 반응시켰다.

상기 제2 차 가수분해 반응이 완료된 다음, 열수조에서 10분 동안 가열하여 상기 효소를 불활성화시키고, 가수분해물을 분리하였다. 상기 가수분해물을 와트만(whatman) #5 여과지로 여과하여 홍어코 추출물을 제조하였다.

[실시예 5 : 홍어 발효 추출물의 제조]

실시예 3에 따라 제조된 홍어 추출물을 121℃에서 고압 멸균시키고 락토바실러스 람노서스 균사체를 50,000cfu/L 첨가하여 37℃, pH5 내지 7, 바람직하게는 pH6의 호기적 조건의 발효조에서 약 1일 내지 7일간, 바람직하게는 3일간 배양하여 발효시켰다. 발효 후 상기 발효물을 121℃ 및 1.5atm 조건에서 15분 동안 멸균시켜 균을 사멸한 후, 0.45㎛의 여과막을 이용하여 여과하였다. 여과된 발효물을 50℃ 이하에서 감압 농축 및 동결 건조하였다. 상기 감압 농축 및 동결 건조물을 하기 실험예에 따라 농도별로 제조하여 사용하였다.

[실시예 6 : 홍어코 발효 추출물의 제조]

실시예 4에 따라 제조된 홍어코 추출물을 121℃에서 고압 멸균시키고 락토바실러스 람노서스 균사체를 50,000cfu/L 첨가하여 37℃, pH5 내지 7, 바람직하게는 pH6으로 호기적 조건으로 발효조에서 약 1일 내지 7일간, 바람직하게는 3일간 배양하여 발효시켰다. 발효 후 상기 발효물을 121℃ 및 1.5atm 조건에서 15분 동안 멸균시켜 균을 사멸한 후, 0.45㎛의 여과막을 이용하여 여과하였다. 여과된 발효물을 50℃ 이하에서 감압 농축 및 동결 건조하였다. 상기 감압 농축 및 동결 건조물을 하기 실험예에 따라 농도별로 제조하여 사용하였다.

	최종 분해물의 건조중량(단위:g)
홍어 추출물	61.5
홍어코 추출물	60.7
홍어 발효 추출물	58.2
홍어코 발효 추출물	55.3

표 3은 실시예 3 내지 6에 따라 제조된 홍어 추출물, 홍어코 추출물, 홍어 발효 추출물, 및 홍어코 발효 추출물의 최종 분해물의 건조 중량이다.

또한, 도 1은 본 발명에 따른 홍어코 발효 추출물의 분자량을 고성능액체크로마토그래피-겔투과크로마토그래피(HPLC-GPC)를 이용하여 측정한 그래프이다. 도 1을 참조하면, 상기 실시예 6에 따라 제조된 상기 홍어코 발효 추출물은 분자량이 5,900Da로 측정되어 저분자화되었음을 확인할 수 있다.

[실험예 1 : 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물의 MMP-1 생성 억제능 측정]

본 실험예에서는 상기 실시예 3 내지 6에서 수득한 홍어 추출물, 홍어코 추출물, 홍어 발효 추출물, 및 홍어코 발효 추출물의 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 생성 억제 효과를 확인하고자 하였다.

인간 피부 섬유아세포를 24-웰 플레이트(well plate)에 2×10⁵ cells/well의 농도로 분주하고, 37℃, 5% CO₂조건에서 24시간 동안 배양하였다. 생리 식염액(Phosphate buffer saline; 이하, PBS)으로 2회 세척한 뒤, 생리 식염액을 넣은 채로 UV 조사기를 이용하여 6 J/㎝²만큼의 UV를 조사시켰다. 상기 실시예 3 내지 6의 홍어 추출물, 홍어코 추출물, 홍어 발효 추출물, 및 홍어코 발효 추출물은 2% FBS(fetal bovine serum)를 첨가한 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Media) 배지와 상기 추출물 및 상기 발효 추출물이 포함되지 않은 대조군으로의 2% DMEM 배지에서 48시간 동안 배양되었다.

배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 키트(R&D system, 미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(ng/㎖)을 측정하고, 하기 식 1에 따라 MMP-1 생성 억제율(%)을 계산하였다.

[식 1]

도 2 내지 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍어 추출물, 홍어코 추출물, 홍어 발효 추출물, 또는 홍어코 발효 추출물의 농도에 따른 콜라겐 분해 효소인 MMP-1 생성 억제능을 측정한 그래프이다.

도 2 및 도 3을 참조하면, 홍어 추출물은 3% 농도에서 약 25% MMP-1 생성 억제 효능을 발휘함을 확인할 수 있고, 홍어코 추출물은 3% 농도에서 약 40% MMP-1 생성을 억제하여, 상기 홍어 추출물보다는 MMP-1의 생성 억제능이 높게 나타났다.

도 4 및 도 5를 참조하면, 홍어 발효 추출물과 홍어코 발효 추출물은 3%의 농도에서 약 50%의 MMP-1 생성 억제능을 보여, 아데노신(Adenosine) 100㎍/㎖ 농도와 거의 유사한 효능을 발휘함을 확인할 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 홍어 추출물, 홍어코 추출물, 홍어 발효 추출물 및 홍어코 발효 추출물은 모두 MMP-1 생성 억제능을 가짐을 확인할 수 있었고, 그 중에서도 홍어 발효 추출물 및 홍어코 발효 추출물에서 우수한 MMP-1 생성 억제능을 보여, 추출물보다는 발효 추출물이 더 우수한 피부 노화 및 주름 방지 효과를 가진다고 할 수 있다.

[실험예 2 : 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물의 AQP-3 발현 효과 확인]

본 실험예에서는 상기 실시예 3 내지 6에서 수득한 홍어 추출물, 홍어코 추출물, 홍어 발효 추출물, 및 홍어코 발효 추출물의 아쿠아포린-3(AQP-3) 발현 효과를 확인하고자 하였다.

피부 각질세포(HaCaT)를 2ｘ10⁵ cells/ml로 6웰(well)에 2ml씩 분주하고 안정화시킨 후, 시료를 농도별로 처리하여 6시간 동안 반응시켰다. PBS를 이용하여 세포를 얻은 다음, 세포 용해 버퍼를 이용해 얼음상에서 30분간 반응시켜 세포막을 파괴하고 1,200rpm에서 15분간 원심분리를 하였다. 원심분리 후, 상층액만 따로 옮기고 BCA(Bicinchoninic acid) assay를 이용하여 단백질을 정량하였다.

일정량의 단백질을 SDS-겔 로딩 버퍼(SDS gel-loading buffer)와 혼합하여 100℃에서 3분간 가열하여 불활성화 시키고, SDS-폴리아크릴아미드겔(SDS-polyacrylamide gel)을 이용하여 전기영동(SDS-PAGE)을 실시하였다. SDS-폴리아크릴아미드겔을 60mM에서 90분간 폴리플루오린화바이닐리덴(Polyvinylidene fluoride; 이하, PVDF) 멤브레인(membrane)으로 이동시키고 5% 탈지유(skim milk)에서 1시간 블로킹(blocking) 하였다. 상기 블로킹을 마친 PVDF 멤브레인에 1차 항체(Aquaporin-3)를 4℃에서 24 시간 동안 반응시키고 1X TTBS 용액을 10분 간격으로 3번 교환하여 30분간 세척하였다. 5% 탈지유에서 1차 특이적 2차 항체(primary-specific secondary antibody)를 2시간 동안 반응시키고 다시 1X TTBS 용액으로 10분 간격으로 3번 교환하여 30분간 세척하였다. PVDF 멤브레인을 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액으로 반응시키고 Chemi DocTM XRS+ 장치를 이용해 밴드(band)를 분석하였다.

도 6 내지 도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 홍어 추출물, 홍어코 추출물, 홍어 발효 추출물, 또는 홍어코 발효 추출물의 농도에 따른 아쿠아포린-3(AQP-3) 발현 효과를 측정한 그래프이다.

도 6 내지 도 9를 참조하면, 홍어 추출물, 홍어코 추출물, 홍어 발효 추출물, 및 홍어코 발효 추출물 모두 농도 의존적으로 AQP-3의 발현을 증가시킴을 확인할 수 있다. 특히, 홍어 추출물과 홍어코 추출물에 비해, 홍어 발효 추출물과 홍어코 발효 추출물에서 AQP-3의 발현이 보다 명확하게 관찰되었고, 홍어 발효 추출물 및 홍어코 발효 추출물은 3% 농도에서 양성 대조군인 덱사메타손(Dexamethason) 1μM과 거의 유사한 효능을 발휘함을 확인할 수 있었다.

즉, 본 실험을 통해, 본 발명에 따른 홍어 추출물, 홍어코 추출물, 홍어 발효 추출물 및 홍어코 발효 추출물 모두 AQP-3의 발현을 증가시킴을 확인할 수 있었고, 그 중에서도 홍어 발효 추출물 및 홍어코 발효 추출물에서 높은 AQP-3의 발현이 관찰되어, 상기 추출물보다 상기 발효 추출물이 보다 우수한 피부 보습 효과를 발휘함을 확인할 수 있다.

[제조예: 홍어 발효 추출물 및 홍어코 발효 추출물을 함유하는 화장료의 제조]

상기 실시예 5 및 6에 따른 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 3.0 중량% 함유하는 화장료 조성물을 상기 표 4의 조성으로 제조하였고, 제조예 1 및 제조예 2라 하였다. 한편, 효능을 확인하기 위해 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 포함하지 않는 화장료 조성물, 즉 홍어 추출물 및 홍어코 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 비교제조예 1 및 비교제조예 2로 하여 상기 표 4에 나타내었다.

구분	성분	제조예 1 함량(중량%)	제조예 2 함량(중량%)	비교제조예 1 함량(중량%)	비교제조예 2 함량(중량%)
A	실시예 3	-	-	3.0	-
	실시예 4	-	-	-	3.0
	실시예 5	3.0	-	-	-
	실시예 6	-	3.0	-	-
	EDTA-2Na	0.02	0.02	0.02	0.02
	정제수	to 100	to 100	to 100	to 100
B	세토스테아릴알코올	2.0	2.0	2.0	2.0
	글리세릴스테아레이트	1.5	1.5	1.5	1.5
	마이크로크리스탈린	0.7	0.7	0.7	0.7
	스쿠알란	5.0	5.0	5.0	5.0
	유동파라핀	3.0	3.0	3.0	3.0
	트리옥타노인	5.0	5.0	5.0	5.0
	폴리솔베이트	1.2	1.2	1.2	1.2
	솔비탄스테아레이트	0.5	0.5	0.5	0.5
	토코페릴아세테이트	0.2	0.2	0.2	0.2
	사이클로메치콘	3.0	3.0	3.0	3.0
	BHT	0.05	0.05	0.05	0.05
C	향, 방부제	적량	적량	적량	적량

[실험예 3 : 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부 주름개선 효과 확인]

본 실험예에서는 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부 주름개선 효과에 대한 인체적용시험을 실시하였다.

인체적용시험은 실험예 1에서 효능을 나타내었던 실시예 5 또는 6을 함유하고 있는 제조예 1 또는 2와, 홍어 추출물 또는 홍어코 추출물을 포함하는 비교제조예 1 또는 2의 화장료 조성물을 함유하는 화장료의 사용으로 인한 피부 주름개선 효과를 확인 및 비교 평가하였다. 상기 시험은 각 화장료의 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다.

실험자(20세 - 35세의 여성) 20명의 여성을 대상으로 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물 제조예 실험군의 대조군인 비교제조예 1 및 2를 얼굴 오른쪽 부위에, 제조예 1 및 2를 각각 얼굴 왼쪽 부위에 도포하여 실험을 진행하였다. 피부 주름개선 효과는 제품 사용 전과 8주간 사용 후의 각 피검자의 주름개선 효과를 숙련된 의사의 육안 관찰 및 기기 측정(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)을 통하여 평가하였으며, 실험 결과는 하기의 표 5에 나타내었다.

	주름 개선 효과			개선율(%)
	우수	약간	없음	개선율(%)
제조예 1 (실시예 5)	12	4	4	70.0
제조예 2 (실시예 6)	15	3	2	82.5
비교제조예 1 (실시예 3)	0	11	9	27.5
비교제조예 2 (실시예 4)	0	13	7	30.0

표 5는 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 주름 개선 효과를 육안 평가 및 기기 평가로 나타낸 것이다. 표 5를 참조하면, 본 발명에 따른 홍어 발효 추출물 및 홍어코 발효 추출물을 함유한 제조예 1 및 2의 화장료 조성물은 대조군인 비교제조예 1 및 2에 대비하여 피부 주름개선에 대해 높은 개선율을 보였다. 특히, 제조예 2, 홍어코 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 매우 우수한 피부 주름개선 효과를 보여주었다. 또한, 상기 실험 결과는 홍어 추출물, 홍어코 추출물과 같은 고분자 추출물보다 홍어 발효 추출물, 홍어코 발효 추출물과 같은 저분자의 발효 추출물이 피부에 더 잘 흡수되어, 주름개선에 더 효과적임을 알 수 있다.

[실험예 4 : 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물 함유하는 화장료 조성물의 피부 보습력 개선 효과 확인]

본 실험예에서는 상기 제조예에서 제조한 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 피부 보습력 개선 효과를 확인하고자 하였다.

피부 질환이 없는 실험자(20~40대) 25명을 대상으로 1조 당 20명씩 2개조로 나누고, 각 조별로 상기 제조예 1 및 2와 비교제조예 1 및 2의 화장료를 얼굴 및 전박부에 도포하게 하였다. 도포 시작 전, 미리 항온, 항습 조건(24℃, 습도 40%)에서 수분측정기(conneometer, CM820 courage Khazaka electronic GmbH, Germany)를 이용하여 피부 전도도를 측정하여 그 증가율을 평가하였다. 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.

시료명	1주 후	2주 후	4주 후
제조예 1	48	52	55
제조예 2	50	55	57
비교제조예 1	26	30	35
비교제조예 2	30	34	39

표 6은 실험예 4에 따른 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물 함유하는 화장료의 피부 보습력 개선효과 실험 결과를 나타낸다. 표 6을 참조하면, 본 발명에 따른 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 함유하는 화장료인 제조예 1 및 2는 비교제조예 1 및 2의 홍어 추출물 또는 홍어코 추출물을 함유하는 화장료에 비하여 피부 전도도 증가율이 매우 우수함을 확인할 수 있다. 일반적으로, 피부 전도도는 피부 수분량에 비례하므로, 상기의 결과는 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 함유하는 본 발명 화장료 조성물이 피부 수분 함량을 높게 유지하여 우수한 피부 보습 효과를 발휘함을 의미하는 것이다.

이제까지 본 발명에 대한 구체적인 실시예들을 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물로서,
상기 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물은 상기 홍어 또는 홍어코를 효소로 가수분해하여 수득한 프로테오글리칸을 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)로 발효시킨 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 홍어 발효 추출물은,
홍어의 꼬리, 애, 또는 몸통 중에서 선택된 어느 하나 이상으로부터 얻은 발효 추출물인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 프로테오글리칸은,
상기 홍어 또는 상기 홍어코를 알칼라아제(Alcalase)로 제1 차 가수분해하고, 프로테아제(Protease)로 제2 차 가수분해하여 수득한 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물은,
물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸 아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매로 추출하여 제조된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 홍어 발효 추출물 또는 홍어코 발효 추출물은,
화장료 조성물 전체 100 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량% 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
피부 주름개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 화장료 조성물은,
피부 보습용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.