KR102051811B1

KR102051811B1 - 세포막으로 이루어진 필터를 포함하는 글루코스 측정용 바이오센서

Info

Publication number: KR102051811B1
Application number: KR1020180074546A
Authority: KR
Inventors: 김인수; 권도형; 윤대성; 이동택; 이상원; 이규도
Original assignee: 고려대학교산학협력단
Priority date: 2017-07-27
Filing date: 2018-06-28
Publication date: 2019-12-04
Anticipated expiration: 2038-06-28
Also published as: KR20190013474A

Abstract

본 발명은 글루코스 측정용 바이오센서에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는, 세포막으로 이루어진 필터부를 포함하는 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서에 관한 것이다. 본 발명의 바이오센서는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는, 세포막으로 이루어진 필터부를 포함하고 있어 종래에 상용화되어 있는 혈당측정센서에 비하여 글루코스 검출 민감성이 높고, 동시에 프럭토스, 자일로스, 말토스, 시스테인, 아스코르브산, 요산, 갈락토오스 등과 같은 신호방해물질의 첨가에도 글루코스 검출 특이성이 높다. 더욱이, 본 발명의 글루코스 측정용 바이오센서에 포함된, 세포막으로 이루어진 필터부는 수분, 습기 등 공기 중의 조건 변화에 크게 영향을 받지 않는바, 1회용 혈당 측정 시험지, 부착형 또는 체내 삽입형 당 측정 기기 등 다양한 제품에 적용될 수 있다.

Description

세포막으로 이루어진 필터를 포함하는 글루코스 측정용 바이오센서{Biosensor for measuring glucose comprising cytoplasmic filter}

본 발명은 글루코스 측정용 바이오센서에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는, 세포막으로 이루어진 필터부를 포함하는 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서에 관한 것이다.

당뇨병은 체내에 흡수된 글루코스를 제대로 사용하지 못하는 부적절한 탄수화물 대사로 인하여 발생하며, 혈액 내에 과다한 혈당을 가지게 되어 다양한 합병증을 유발할 수 있는 질환이다. 이는 크게 세 가지로 분류되며, 제1형 당뇨병은 인슐린 의존성 당뇨병으로, 이자 세포의 자가면역반응에 의하여 인슐린을 합성하거나 분비하는 기능을 상실하는 타입이라 할 수 있다. 다음으로, 제2형 당뇨병은 인슐린 비의존성 당뇨병으로, 인슐린에 대한 체내 저항성 또는 부적절한 인슐린 분비 등에 의해 발병한다. 그 외에 임신 중 발생할 수 있는 태아 당뇨병이 있다. 그러나 제1형 당뇨병과 태아 당뇨 형태의 당뇨병은 흔하지 않으며, 당뇨병 중 대부분은 제2형 당뇨병으로서 선진국 당뇨질환 중 90 내지 95%를 차지하고 있는 것으로 알려져 있다.

현대인의 식습관, 정신적 스트레스, 생활 패턴에 의하여 대사성 질환에 해당하는 당뇨병을 앓는 환자의 수는 계속 늘어나는 추세이고, 구체적으로는 2015년 기준 전 세계의 약 9%인 4억1500만명으로 추산되며, 2040년에는 당뇨병 환자가 약 10%인 6억4200만명으로 증가할 것으로 추정된다. 이에 따라 연간 6730억 달러에 달하는 비용이 소모되고 있으며 이는 전체 헬스케어 시장의 12%에 해당한다(국제 당뇨 연맹).

당뇨병을 앓은 환자들은 주기적으로 인슐린을 투여하여야 하며, 정확한 인슐린의 투여를 위해 글루코스 센서라고 불리는 자가 혈당 진단 기기를 이용하게 된다. 이러한 기기의 이용은 인슐린 투여 시간과 용량의 결정에 매우 중요하며 이는 결국 당뇨병 치료에 중요한 부분을 차지한다. 또한, 전세계적으로 4억 명 정도의 환자들이 매일 5~10여개의 센서를 사용하며 이는 자가 혈당 측정이 당뇨병 환자에게 중요한 것임을 반증한다.

상기와 같은 혈당 진단 기기들은 일반적으로 전기 화학적 방식을 사용해 신속하며 높은 정밀도를 가지는 것을 목표로 한다. 특히 효소를 사용한 방법으로 글루코스 산화효소(Glucose oxidase) 혹은 글루코스 탈수소효소(Glucose dehydrogenase)를 이용하여 혈액 내의 글루코스를 전기적인 신호로 바꾸어 측정하는 기술이 상용화되어 있다. 즉 혈액 속의 글루코스가 상기 효소들과 만나면서 산화-환원반응을 촉진시키게 되면 글루코스는 산화되고 전자 전달 물질 (물 또는 조효소)은 환원되어 전기적 신호를 띄게 된다. 환원된 전자 전달 물질이 전극과 만나 전자를 주어 발생한 전기적 신호의 세기를 측정하여 용액 혹은 혈액의 글루코스 농도를 빠른 시간 내에 측정한다. 다만, 상기와 같은 효소 기반 글루코스 센서는 효소의 안정성, 산소 의존 또는 매개체의 역할, 효소 침출 면에서 많은 문제점이 있다. GOx는 pH 4 이하 및 pH 7 이상에서 빠르게 그 활성을 상실하고 70℃ 이상에서 빠르게 변성된다. 고습도 및 저습도는 센서의 저장 뿐만 아니라 사용에도 유해하다.

그 외에도 최근 비침습적으로 혈당을 측정하는 기기가 등장하기 시작하였으나 이들 혈당 측정 기기는 여전히 채혈 또는 채뇨 등을 통한 혈당 측정 기기에 비하여 글루코스 농도 검출 효율이 현저하게 낮고, 채혈 또는 채뇨를 통한 글루코스 측정 기기 또한 신호방해입자들에 의한 글루코스 검출 효율 및 정확도가 떨어지는바 직접적으로 글루코스 농도를 측정하는 대신 당화헤모글로빈 검출 등 혈당을 측정하기 위하여 다양한 우회적인 방법을 이용해왔다. 이에, 직접적인 글루코스 검출이 가능하며, 동시에 글루코스 검출 효율 및 정확도가 높은 당뇨병 진단 방법에 대하여 연구를 진행하던 중 본 발명의 세포막 필터를 이용한 생물학적 시료 내 글루코스 검출용 바이오센서를 완성하였다.

KR

10-2013-0059304

A

KR

10-2017-0053189

A

본 발명의 목적은 세포막으로 이루어진 필터부를 포함하는 생물학적 시료 내글루코스 측정용 바이오센서, 이를 포함하는 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 키트, 및 상기 바이오센서를 이용한 생물학적 시료 내 글루코스 농도 측정 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 제1 양태는 세포막으로 이루어진 필터부를 포함하는 글루코스 측정용 바이오센서로서, 상기 필터부는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는 것인, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서를 제공한다.

또한, 본 발명의 제2 양태는 상기 바이오센서를 포함하는, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명의 제3 양태는 상기 바이오센서에 생물학적 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내 글루코스 농도 측정 방법을 제공한다.

본 발명의 바이오센서는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는 세포막으로 이루어진 필터부를 포함하고 있어 종래에 상용화되어 있는 혈당측정센서에 비하여 글루코스 검출 민감성이 높고, 동시에 아스코르브산, 요산 또는 갈락토오스와 같은 신호방해물질의 첨가에도 생물학적 시료 내 글루코스 검출 특이성이 높다. 더욱이, 본 발명의 글루코스 측정용 바이오센서에 포함된, 세포막으로 이루어진 필터부는 수분, 습기 등 공기 중의 조건 변화에 크게 영향을 받지 않는바, 본 발명의 바이오센서는 1회용 혈당 측정 시험지, 부착형 또는 체내 삽입형 당 측정 기기 등 다양한 제품에 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 글루코스 측정용 바이오센서의 원리를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 글루코스 측정용 바이오센서의 구조를 도식화하여 나타낸 도이다. 도 2에서 (iii)은 필터부, (ii)는 센서부, (i)은 측정부이고, 해독부는 도면상에 나타나진 않으나 센서의 뒤쪽 부분에 회로를 연결하여 전기화학장비 (potentiostat)에 연결되는 형태이다.
도 3은 본 발명의 글루코스 측정용 바이오센서를 제조하기 위하여, 적혈구로부터 세포막을 분리하여 센서부에 도포하는 과정을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 4는 SEM 분석을 통해 글루코스 측정용 바이오센서의 표면을 확인한 결과를 나타낸 도로, 도 4a는 세포막 필터를 도포한 실험군에 대한 결과를 나타낸 도이고, 도 4b는 대조군에 대한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 바이오센서 내 필터부 두께 차이에 따른 신호 전달 효율을 확인한 결과를 나타낸 도로, (a)는 적혈구 세포막의 농도와 필터부 두께의 상관관계를 확인한 결과를 나타낸 도이고, (b)는 적혈구 세포막의 농도와 전류량간의 상관관계를 확인한 결과를 나타낸 도이며, (c)는 (b)의 결과 중 3초 내지 10초 사이의 선형성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 암세포 세포막의 두께에 따른 전류량의 관계를 나타낸 도이다.
도 7은 글루코스 농도 변화에 따른 바이오센서의 글루코스 검출 민감성을 전류량으로 확인한 결과를 나타낸 도로, 도 7b는 도 7a 중 일부 농도 범위(2.5~10 mM)를 확대한 도이다.
도 8은 본 발명에 따라 암세포 세포막(2.5%)이 도포된 바이오센서에 대해 글루코스 농도를 달리하여 Cyclic voltammetry(CV) 방식으로 전류량을 측정한 결과를 나타낸 도이고(a); 글루코스의 농도에 따른 CV 측정 신호 중 가장 높은 값(peak current)를 모아 글루코스 농도에 대한 전류량 관계를 나타낸 도이다(b). 각 점들을 이은 linear fitting 값과 그 식을 그래프 내부에 나타냈다.
도 9는 신호방해물질 첨가에 따른 바이오센서의 글루코스 검출 특이성을 확인한 결과를 나타낸 도로, 도 9a는 아스코르브산(ascorbic acid, AA), 도 9b는 요산(uric acid, UA), 도 9c는 갈락토오스(galactose, GA), 도 9d는 AA, UA 및 GA를 모두 첨가한 결과이다.
도 10은 암세포 세포막을 도포하지 않은 바이오센서(a)과, 암세포 세포막을 도포한 바이오센서(b)를 대상으로 글루코스 외의 물질(방해물질)에 대해 얼마나 신호를 나타내는지를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.(G: glucose 5 mM, F: fructose 5 mM, Xy: xylose 5 mM, Mal: maltose 1 mM, Cys: cysteine 1 mM, AA: ascorbic acid 1 mM, UA: uric acid 0.5 mM).
도 11은 혈청 내 글루코스 농도 증가에 따른 바이오센서의 글루코스 검출 민감성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 적혈구 세포막(RBCM)을 필터로 포함하는 바이오센서와 암세포 세포막(CCM)을 필터로 포함하는 바이오센서의 혈청(serum)에 대한 신호를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 글루코스 측정용 바이오센서의 공기 중 안정성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태는 세포막으로 이루어진 필터부를 포함하는 글루코스 측정용 바이오센서로서, 상기 필터부는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는 것인, 글루코스 측정용 바이오센서를 제공한다.

본 발명에 있어서, '바이오센서'는 생물이 가지고 있는 기능을 이용하여 물질의 성질 등을 조사하는 기계로서 피분석물의 검출을 위해 사용하는 분석장치를 지칭하는 것으로, 크게 감지성 생물적 요소(sensitivity biological element), 전도체 또는 검출 요소(transducer or the detector element) 및 바이오센서 해독 장치(biosensor reader device)를 가지는 것이 특징이며, 본 발명의 목적상 상기 바이오센서는 글루코스 센서로 해석될 수 있다.

본 발명에 있어서, 바이오센서는 체내 이식형, 패치형 또는 1회용 혈당 시험지에 적용되는 형태일 수 있으며, 글루코스 측정을 목적으로 하는 한 어떠한 형태로든 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 바이오센서는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는, 세포막으로 이루어진 필터부; 투과된 글루코스를 인식하는 센서부; 인식된 글루코스에 의한 신호를 해독하는 해독(read)부;를 포함하며, 센서부와 해독부 사이에 인식된 글루코스를 신호로 변환하는 측정부를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, '생물학적 시료'는 글루코스를 포함하고 있는 분석대상을 지칭하는 것으로, 혈액, 소변, 땀, 눈물 등을 포함하며, 바람직하게는 혈액이나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, '필터부'는 생물학적 시료를 정제하는 구역을 의미하는 것으로, 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는 역할을 한다. 본 발명에 따른 '필터부'는 '세포막'으로 이루어져있으며, 상기 세포막은 적혈구 또는 암세포로부터 유래될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 세포막은 바람직하게는 막 단백질, 글루코스 수송체(Glucose trasporter, GLUT) 단백질을 포함할 수 있다.

상기 글루코스 수송체 단백질은 세포막에 글루코스를 통과시켜 세포 내에 이입시키는 단백질의 일종으로 세포 내외의 글루코스 농도 차이를 글루코스 수송의 원동력으로 하는 촉진확산형 수송체이며, GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4 등일 수 있으며, 바람직하게는 GLUT1이나 이에 제한되지 않는다.

상기 필터부의 두께는 글루코스의 선택적 투과 및 안정적인 신호 전달을 위해, 세포막의 종류 및 생물학적 시료의 종류에 따라 조절하여 최적화될 수 있다.

필터부는 바이오센서에 세포막을 도포함으로써 형성할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 적혈구 세포막의 농도가 증가함에 따라 세포막의 두께가 증가함을 확인하였다(도 5a).

본 발명에서, ‘적혈구 세포막의 농도’는 1 ml의 0.1 M 인산완충용액에 포함된 적혈구 세포막의 부피를 기준으로 %(v/v)로 표시된다.

본 발명에서, 필터부의 두께는 100 내지 300 nm인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 150 내지 250 nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 필터부의 두께가 100 nm 미만이면 포도당 외의 분자가 세포막을 통과할 확률이 늘어나는 문제가 있고, 300 nm 초과이면 포도당의 세포막 통과가 지연되는 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 0.25 %(v/v) 농도의 적혈구 세포막을 도포하여 약 220 nm 두께의 필터부를 형성한 경우 반응 초반부의 단위 시간당 신호 세기의 변화량이 가장 높게 나타남을 확인하였다(도 5 참조).

생물학적 시료가 혈액인 경우 100 내지 300 nm, 바람직하게는 150 내지 250 nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 소변 및 눈물 등 다른 농도 대역의 생물학적 시료의 경우 다르게 두께를 조절하여 최적화될 수 있다.

본 발명에 있어서, '센서부'는 필터부에 의하여 투과된 생물학적 시료 내 글루코스를 인식하는 구역을 의미한다. 상기 센서부는 바람직하게는 글루코스 산화효소(Glucose oixdase), 글루코스 탈수소효소(GDH; glucose dehydrogenase), 글루코스 헥소키나아제(glucose hexokinase), 콜레스테롤 옥시다제, 글루타믹 옥살아세틱 트랜스미나아제(GOT; Glutamic Oxaloacetic Transaminase) 또는 글루타믹 피루빅 트랜스미나아제(GPT; Glutamic Pyruvic Transaminase) 등의 효소를 포함할 수 있으며, 더 나아가 상기 각 효소에 조효소인 피로퀴놀린퀴논(PQQ; pyrroquinoline quinone)를 더 포함하도록 구성할 수 있으나, 글루코스를 기질로 하는 효소라면 제한없이 포함될 수 있다. 센서부에 포함된 효소들이 혈액 속의 글루코스와 만나면 글루코스는 산화되고 효소들은 환원되어 전기적 신호를 띄게 되고, 환원된 효소들이 전극과 만나 전자를 줌으로써 전기적 신호를 발생하게 된다.

본 발명에 있어서, '측정부'는 센서부와 해독부 사이에 위치하면서 센서부에 의하여 인식된 글루코스를 신호로 변환하는 구역이다. 일례로 상기 센서부 내 효소와 전자 전달 매개체(mediator) 간의 일련의 산화환원반응을 통하여 글루코스를 전자(e^-) 형태의 신호로 변환시키고, 이에 따른 산화전위를 전극으로 인가시켜 전류를 발생시킬 수 있다.

이때, 상기 전자 전달 매개체는 페로센(ferrocene), 페로센 유도체, 퀴논(quinones), 퀴논 유도체, 유기 전도성 염(organic conducting salt) 또는 비오로겐(viologen), 포타슘핵사시아노페레이트(Ⅲ)(Potassium hexacyanoferrate Ⅲ), 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide), 포타슘페로시아나이드(potassium ferrocyanide) 또는 염화헥사아민루세늄(Ⅲ)(hexaammineruthenium Ⅲ) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 전극은 금(Au), 은(Ag) 또는 구리(Cu) 전극일 수 있고, 전기적인 신호의 정확성을 고려할 때 금 전극이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, '해독부'는 인식된 글루코스에 의한 신호를 해독하는 구역이다. 일례로, 글루코스를 변환하여 얻은 전류 신호를 객관적인 수치로 표시하여 정보를 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 측정부를 거치지 않고 글루코스 자체를 수치화하여 정보를 제공하도록 하였다.

본 발명의 다른 양태는 상기 바이오센서를 포함하는, 글루코스 측정용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 키트는 보다 효과적으로 글루코스를 측정할 수 있도록 본 발명의 바이오센서 외에 채혈 또는 채뇨 등을 도와주는 도구 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 키트는 외부패키지를 포함할 수 있으며, 외부패키지는 구성요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 상기 바이오센서에 생물학적 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내 글루코스 농도 측정 방법을 제공한다.

상기 방법의 목적상 글루코스 농도 측정을 통해 당뇨병의 진단 또는 예후를 판단할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 하기 단계를 포함하는, 글루코스 측정용 바이오센서의 제조방법을 제공한다:

(1) 세포를 원심분리하여 세포막을 수득하는 단계;

(2) 상기 (1) 단계에서 수득한 세포막을 초음파 처리 또는 압출하여 소낭 상태로 제조하는 단계; 및

(3) 상기 (2) 단계에서 제조한 소낭 상태의 세포막을 센서부에 도포하는 단계.

각 단계에 대해 보다 구체적으로 설명한다.

상기 (1) 단계는 세포로부터 막단백질을 포함하는 세포막 이외의 물질, 즉, 세포내 소기관 또는 헤모글로빈을 제거하는 단계이며, 세포막 분리 효율을 높이기 위해 원심분리를 반복할 수 있다.

상기 (2) 단계는 세포막의 효율적인 도포를 위해 세포막을 초음파 처리 또는 압출하여 소낭 상태로 제조하는 단계이며, 상기 초음파 처리는 약 20분 내지 60분 동안 수행할 수 있고, 바람직하게는 약 30분 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 초음파 처리 또는 압출을 통해 제조된 소낭은 바람직하게는 70 내지 200 nm의 지름 크기를 가지며, 이에 제한되지 않는다.

상기 (3) 단계는 소낭 상태의 세포막이 필터부의 역할을 할 수 있도록 소낭 상태의 세포막을 센서부에 도포하는 단계이며, 상기 소낭 상태의 세포막은 0.1 내지 0.5 vol%의 농도로 도포될 수 있고, 이에 제한되지 않는다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 막단백질을 포함하는 세포막 구조로 이루어진 필터부를 포함하는 바이오센서의 제조

1-1. 세포막의 분리

1-1-1. 적혈구로부터 세포막의 분리

EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)가 처리된 튜브를 이용하여 혈액(전혈)을 채취한 후, 이를 4 ℃ 조건에서 500 g로 5분간 원심분리하였다. 이에 따라 상대적으로 가벼운 혈장 및 백혈구를 포함하는 상층액을 제거하고. 적혈구를 포함하는 하층액만을 분리하였다. 분리한 하층액에 1ml의 1X PBS(pH 7.4, Gibco)를 첨가하고, 500 g로 5분간 원심분리한 후, 적혈구를 제외한 상층부를 제거하는 워싱을 3회 반복하여 적혈구를 정제하였다. 이후 적혈구의 용혈을 유도하기 위하여 20분 동안 0.25X PBS에 담가놓았다. 적혈구 세포막과 막 단백질, 그리고 헤모글로빈이 혼재하는 상기 PBS 용액에서 막 단백질 및 적혈구 세포막만을 분리하기 위하여 추가적으로 1000 g에서 5분 동안 원심분리를 수행하였다. 이후 상층액을 제거하여 연분홍빛으로 가라앉은 막단백질을 포함하는 적혈구 세포막을 수득하였으며, 추가 정제를 위하여 1 ml의 1X PBS를 첨가하고 1000 g 5분 원심분리하는 과정을 3회 반복하였다.

1-1-2. 암세포로부터 세포막의 분리

한국 세포주 은행으로부터 수득한 암세포 MDA-MB-231와 배양배지 PBS (pH 7.4, Gibco)를 혼합한 후 4 ℃, 500 g로 5분 동안 원심분리를 수행하여 하층에 가라앉은 군집을 형성한 세포들 외 상층액을 제거하였다. 이에 1 ml의 1X PBS(pH 7.4, Gibco)를 첨가하고, 500 g로 5분간 원심분리하고 상층액을 제거하는 정제과정을 3회 반복하였다. 이후 세포막의 분리를 유도하기 위하여 20분 동안 0.25X PBS에 담가놓았다. 세포막과 막단백질, 그리고 세포 내 소기관이 혼재하는 상기 PBS 용액에서 막단백질 및 세포막을 분리하기 위하여 추가적으로 1000 g에서 5분 동안 원심분리를 수행하였다. 이후 상층액을 제거하여 하층에 가라앉은 막단백질을 포함하는 세포막을 수득하였으며, 정제를 위하여 1 ml의 1X PBS를 첨가하고, 1000 g로 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하는 과정을 3회 수행하였다.

1-2. 바이오센서의 센서부에 세포막의 도포

상기 실시예 1-1-1, 및 1-1-2에서 분리한 막단백질을 포함하는 정제된 세포막 2.5 μl를 각각 1 ml의 증류수에 용해시켜 400배 희석시켰다. 그리고 나서, 30분 동안 초음파를 처리하여 세포막이 지름 약 170 nm 크기의 소낭 상태가 되도록 하였다. 이어서 상업적으로 판매되고 있는 제품(The Accu-Chek　Inform II system, Roche Diagnostics, USA)으로부터 글루코스 센서를 분리한 후, 이의 효소 부분(약 33 mm²), 즉 센서부를 충분히 감쌀 수 있도록 상기 글루코스 센서 위에 소낭 상태가 된 세포막 25 μL를 도포하였다. 상기 세포막이 효소를 손상시키지 않는 범위 내에서 센서 위에 충분히 도포될 수 있도록 50 ℃로 맞춰진 건조 오븐에서 50분간 열을 가해주었다. 50분이 경과한 후에는 상온에서 50분간 방치하였다.

본 발명에 따른 바이오센서의 원리를 도 1에, 구조를 도 2에 나타내었다. 아울러, 상기 일련의 바이오센서 제조과정을 도식화하여 도 3에 나타내었다.

실험예 1. SEM 분석을 통한 바이오센서 내 세포막 도포 여부 확인

상기 실시예 1-2에서 제조한 세포막이 도포된 바이오센서의 센서부를 SEM으로 분석하여 막단백질을 포함하는 세포막이 정상적으로 도포되었는지 확인하였다. 아울러 본 발명의 세포막을 도포하지 않은 제품(The Accu-Chek　 Inform II system, Roche Diagnostics, USA)의 동일 부분을 대조군으로 하여 SEM 분석을 수행하였다. 실험군에 대한 결과는 도 4a에 나타내었고, 대조군에 대한 결과는 도 4b에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 바이오센서의 센서부 관찰을 통해 세포막의 도포가 정상적으로 이루어졌음을 확인하였다.

실험예 2. 적혈구 세포막을 도포한 필터부의 두께 차이에 따른 전류량 확인

본 발명의 바이오센서를 제조하는 과정에서 최적의 필터부 두께를 확인하기 위하여 상기 실시예 1-1-1에서 수득한 적혈구 세포막의 농도를 0에서 0.5 %(v/v)의 농도로 바이오센서의 센서부에 도포하였다. 보다 구체적으로, 1 ml의 0.1 M 인산완충용액에 포함된 적혈구 세포막의 부피를 기준으로 %(v/v)를 계산하였으며, 예를 들어, 0.25 %(v/v)는 1 ml의 인산완충용액에 상기 실시예 1-1-1에서 수득한 적혈구 세포막 2.5 ul를 첨가한 경우를 의미한다. 적혈구 세포막의 농도에 따른 필터의 두께를 stylus profiler (Alpha-step D100, KLA-Tencor)를 이용하여 측정하였으며, 이는 도 5a에 나타내었다.

도 5a에 나타낸 바와 같이, 적혈구 세포막의 농도가 증가함에 따라 필터부의 두께가 증가함을 확인하였다.

또한, 0.1 %(v/v), 0.25 %(v/v), 0.5 %(v/v) 농도의 적혈구 세포막을 이용하여 제조한 바이오센서 내 전류량을 전기화학장비인 potentiostat (versastat3)으로 분석하였으며, 상기 결과를 토대로 1 내지 10초 사이의 선형성을 분석하였다. 이를 위해 센서부(세포막 필터의 위)에 30 ul의 측정 용액을 떨어트리고 -0.3V의 전압을 걸어주어 0.5초 단위로 측정하였다. 각각의 실험 결과를 도 5b 및 도 5c에 나타내었다. 도 5b는 각 농도에 대한 전기적 신호의 변화를 1초에서 60초까지 관찰한 결과를 나타내며, 도 5c는 도 5b의 1초 내지 10초 사이의 선형성을 분석하여 나타낸 것이다.

도 5b 및 도 5c에 나타낸 바와 같이, 0.25 %(v/v) 농도의 적혈구 세포막(약 220 nm의 두께)을 이용한 경우 신호 전달이 안정적으로 일어남을 확인하였다. 특히, 글루코스 센서의 특성상 빠르게 결과를 얻는 것이 중요한데, 도 5c에 나타낸 바와 같이 반응 초반부의 단위 시간당 신호 세기의 변화량이 0.25 %(v/v) 농도의 적혈구 세포막(약 220 nm의 두께)을 이용한 경우 가장 높게 나타남을 확인하였다.

실험예 3. 암세포 세포막을 도포한 필터부의 두께 차이에 따른 전류량 확인

본 발명의 바이오센서를 제조하는 과정에서 최적의 필터부 두께를 확인하기 위하여 상기 실시예 1-1-2에서 수득한 암세포 세포막을 0에서 5 %(v/v)의 농도로 바이오센서의 센서부에 도포하였다. 보다 구체적으로, 1 ml의 0.1 M 인산완충용액에 포함된 암세포 세포막의 부피를 기준으로 %(v/v)를 계산하였으며, 예를 들어, 0.5 %(v/v)는 1 ml의 인산완충용액에 상기 실시예 1-1-1에서 수득한 적혈구 세포막 5.0 ul를 첨가한 경우를 의미한다. 암세포 세포막의 농도에 따른 필터의 두께를 stylus profiler (Alpha-step D100, KLA-Tencor)를 이용하여 측정하였다. 암세포 세포막의 농도가 증가함에 따라 필터부의 두께가 증가함을 확인하였다.

또한, 0.5 %(v/v) (두께: 450 ± 40 nm), 1 %(v/v) (두께: 900 ± 53 nm), 5 %(v/v) (두께 : 4700 ± 102 nm) 농도의 암세포 세포막을 도포한 바이오센서에 대하여, 글루코스 농도를 0 내지 20mM로 달리하여 전기화학장비인 potentiostat (versastat3)으로 전류량을 분석하였다. 도 6은 암세포 세포막의 두께별 전류량을 확인한 결과이다. 암세포 세포막을 너무 두껍게(5%) 도포한 경우 신호가 낮게 나오는 경향을 보였으며, 0.5~1% 농도의 암세포 세포막을 도포할 경우 도포하지 않은 전극과 차이가 없이 전기신호 전달이 일어남을 확인하였다.

실험예 4. 막단백질을 포함하는 적혈구 세포막으로 이루어진 필터부의 포함 여부 및 시료에 포함된 글루코스 농도 변화에 따른 글루코스 검출 효율 확인

본 발명의 바이오센서의 글루코스 검출 효율을 확인하기 위하여, 막단백질을 포함하는 세포막 구조로 이루어진 필터부의 포함 여부에 따른 글루코스 검출 효율을 비교 분석하였다. 구체적으로 대조군으로 아큐첵퍼포마(ACCU-CHECK사; Control sensor) 및 아큐첵퍼포마에 GLUT1이 없는 인공 인지질막을 도포한 바이오센서(DPPC sensor)를 이용하고, 실험군으로 본 발명의 막단백질을 포함하는 적혈구 세포막을 도포한 바이오센서(RBCM sensor)를 이용하였다. 이후 0 내지 40 mM 농도의 글루코스 (sigma) (인산 완충용액 pH 7.4에 녹임) 시료를 30 ul 첨가한 후, -0.3V의 전압을 걸어준 상태에서 전류량을 측정하였고, 3초 내지 7초의 신호변화량을 도출하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었으며, 도 7b는 임상적으로 건강한 사람의 혈당 농도인 3.5~7 mM 및 당뇨병 환자의 혈당 농도인 7 mM 초과 부분을 보다 정확하게 확인하기 위하여, 도 7a의 결과 중 2.5 내지 10 mM 농도 범위의 측정 결과만을 확대하여 나타낸 도이다. 이때, 도면 내 x축은 글루코스의 농도이고, y축은 3초 내지 7초 사이의 전기신호 변화량 값이다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 인공 인지질막을 도포한 바이오센서의 경우, 막의 도포로 인하여 필터부의 정제율을 증가시킬 수 있으나, 궁극적으로는 글루코스의 이동 자체를 제한하여 글루코스의 농도 변화를 민감하게 측정할 수 없음을 확인하였다. 반면 본 발명의 세포막을 도포한 바이오센서는 별도로 막을 도포하지 않은 바이오센서보다 혈청에서의 측정 한계 (LOD)가 뛰어남을 확인했다. 구체적으로, 막을 도포하지 않은 바이오센서의 경우 인산완충용액에서 1.34 mM의 LOD를 가지는데 반해, 혈청에서는 2.51 mM의 LOD를 가지고 있어, 혈청에서 측정한계가 약 2배 저하되는 것을 확인하였다. 반면에 본 발명의 적혈구 세포막을 도포한 바이오센서의 경우, 인산완충용액에서는 1.06 mM의 LOD, 혈청에서는 1.11 mM의 LOD를 가져 혈청의 단백질 및 이온의 영향을 크게 받지 않음을 확인하였다.

실험예 5. 암세포 세포막을 도포한 바이오센서에 대해 시료에 첨가된 글루코스 농도 변화에 따른 검출 민감성 확인

본 발명의 바이오센서의 글루코스 검출 효율을 확인하기 위하여, 막단백질을 포함하는 암세포 세포막으로 이루어진 바이오센서에 대해 시료에 첨가된 글루코스 농도 변화에 따른 검출 민감성을 분석하였다. 구체적으로 본 발명에 따라 2.5% 농도의 암세포 세포막을 도포한 바이오센서(RBCM sensor)에 대하여 0 내지 20 mM 농도의 글루코스 (sigma) (인산 완충용액 pH 7.4에 녹임) 시료를 30 ul 첨가한 후, -0.1 내지 0.4 V의 전압을 걸어준 상태에서 Cyclic voltammetry(CV) 방식으로 전류량을 측정하여, 그 결과를 도 8(a)에 나타내었다. 도 8(b)는 글루코스의 농도에 따른 CV 측정 신호 중 가장 높은 값(peak current)를 모아 글루코스 농도 에 대한 전류량 관계를 나타낸 그래프이다(b). 이때, 도면 내 x축은 글루코스의 농도이고, y축은 3초 내지 7초 사이의 전기신호 변화량 값이다. 각 점들을 이은 linear fitting 값과 그 식을 그래프 내부에 나타내었고 측정 한계(limit of detection)을 계산한 결과 0.24 mM까지의 한계를 갖는 것으로 나타났다.

막을 도포하지 않은 바이오센서의 경우 인산완충용액에서 1.34 mM의 LOD를 가지는데 반해, 글루코스에서는 0.24 mM의 LOD를 가지고 있어, 측정한계가 현저하게 상승되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 암세포 세포막을 도포한 바이오센서의 경우, 측정한계가 현저히 향상됨을 확인하였다.

실험예 6. 신호방해물질 첨가에 따른 본 발명의 적혈구 세포막이 도포된 바이오센서의 글루코스 검출 특이성 확인

본 발명에 따른 적혈구 세포막이 도포된 바이오센서의 글루코스 검출 특이성을 확인하기 위하여, 시료에 인체 내 평균 글루코스 농도인 5 mM의 글루코스에 추가적으로 신호방해물질인 아스코르브산(ascorbic acid, AA), 요산(uric acid, UA) 또는 갈락토오스(galactose, GA)를 각각 농도 구배별로 첨가한 후, 전류량 변화를 측정하였다. 구체적으로, 센서에 시료를 30 ul 첨가한 후, -0.3V의 전압을 걸어준 상태에서 전류량을 측정하였고, 3초 내지 7초의 신호를 받아들여 변화량을 도출하였다. AA를 추가적으로 첨가하였을 때의 결과를 도 9a에 나타내었고, UA를 추가적으로 첨가하였을 때의 결과를 9b에 나타내었으며, GA를 추가적으로 첨가하였을 때의 결과를 도 9c에 나타내었다. 이때, 신호방해물질이 없을 때의 값을 도면 내 점선으로 표시하였다.

아울러, 5 mM의 글루코스를 포함하는 시료에 신호방해물질인 AA, US 및 GA를 100 μM씩 모두 넣은 후, 전류량 변화를 측정하였다. 그 결과는 도 9d에 나타내었다. 대조군으로는 세포막을 도포하지 않은 아큐첵퍼포마를 이용하였다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군은 신호방해물질의 농도 증가에 따라 정상 값과의 차이가 증가하나, 본 발명의 세포막을 도포한 바이오센서를 이용하는 경우에는 신호방해물질을 첨가하더라도 크게 영향을 받지 않고 글루코스만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따라 막단백질을 포함하는 적혈구 세포막을 필터로 이용할 경우, 시료 내 존재하는 단당류, 이당류뿐만 아니라 글루코스 외 다른 다당류 또한 투과하지 못하게 함으로써 시료 내 존재하는 글루코스를 높은 민감도로 검출할 수 있다.

실험예 7. 신호방해물질 첨가에 따른 본 발명의 암세포 세포막이 도포된 바이오센서의 글루코스 검출 특이성 확인

본 발명에 따른 암세포 세포막이 도포된 바이오센서의 글루코스 검출 특이성을 확인하기 위하여, 암세포 세포막을 도포하지 않은 바이오센서와 암세포 세포막을 도포한 바이오센서를 대상으로, 시료에 인체 내 평균 글루코스 농도인 5 mM의 글루코스에 추가적으로 신호방해물질인 프럭토스(fructose), 자일로스(Xylose), 말토스(Maltose), 시스테인(Cysteine), 아스코르브산(ascorbic acid, AA) 또는 요산(uric acid, UA)을 각각 농도 구배별로 첨가한 후, 전류량 변화를 측정하여 그 결과를 도 10에 나타냈다. 구체적으로, 센서에 시료를 30 ul 첨가한 후, -0.3V의 전압을 걸어준 상태에서 전류량을 측정하였고, 3초 내지 7초의 신호를 받아들여 변화량을 도출하였다. 단일 분자들의 신호값을 왼쪽의 흑백 그래프에 나타내었고, 5 mM의 글루코스에 각각의 분자들을 첨가하여 측정한 값을 오른쪽의 컬러그래프 및 표로 나타내었다. 이때, 신호방해물질이 없을 때의 값을 도면 내 점선으로 표시하였다. 대조군으로는 세포막을 도포하지 않은 아큐첵퍼포마를 이용하였다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 대조군은 신호방해물질의 농도 증가에 따라 정상 값과의 차이가 증가하나, 본 발명의 암세포 세포막을 도포한 바이오센서를 이용하는 경우에는 신호방해물질을 첨가하더라도 크게 영향을 받지 않고 글루코스만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따라 막단백질을 포함하는 암세포 세포막을 필터로 이용할 경우, 시료 내 존재하는 단당류, 이당류뿐만 아니라 글루코스 외 다른 다당류 또한 투과하지 못하게 함으로써 시료 내 존재하는 글루코스를 높은 민감도로 검출할 수 있다.

실험예 8. 혈청에 글루코스 첨가에 따른 본 발명의 바이오센서의 글루코스 검출 민감성 확인

본 발명에 따른 바이오센서의 검출 민감성을 확인하기 위하여, Sigma로부터 공급받은 사람의 혈청을 시료로 하고, 이에 글루코스를 농도별로 첨가한 후 본 발명의 바이오센서에 대해 글루코스의 첨가에 따른 전류량 변화를 측정하였다. 구체적으로, 적혈구 세포막(RBCM)이 도포된 바이오센서에 시료를 30 ul 첨가한 후, -0.3V의 전압을 걸어준 상태에서 전류량을 측정하였고, 3초 내지 7초의 신호를 받아들여 변화량을 도출하였다. 대조군으로는 세포막을 도포하지 않은 아큐첵퍼포마를 이용하였다. 그 결과는 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 혈청에 첨가한 글루코스 양이 증가함에 따라 전하의 세기가 비례하여 증가하였으며, 본 발명의 적혈구 세포막을 도포한 바이오센서는 대조군에 비하여 현저하게 높은 민감도로 글루코스를 검출할 수 있음을 확인하였다. 이는 혈액 내 그 자체로 전기적 신호를 가지는 물질이나 효소-글루코스 작용이 방해하는 물질이 존재하여 세포막을 도포하지 않은 기존 바이오센서의 경우 글루코스 검출 효율이 다소 떨어지지만, 본 발명과 같이 막단백질을 포함하는 적혈구 세포막을 필터로 포함하는 바이오센서를 이용할 경우 혈청 자체를 시료로 이용하더라도 높은 민감도로 글루코스를 검출할 수 있음을 나타낸다.

실험예 9. 적혈구 세포막(RBCM)을 도포한 바이오센서와 암세포 세포막(CCM)을 도포한 바이오센서의 글루코스 검출 민감도 비교

적혈구막(RBCM)을 도포한 바이오센서와 암세포막(CCM)을 도포한 바이오센서의 글루코스 검출 민감성을 비교하기 위해, Sigma로부터 공급받은 사람의 혈청을 시료로 하고, 이에 글루코스를 농도별로 첨가한 후 적혈구 세포막(RBCM)을 도포한 바이오센서와 암세포 세포막(CCM)을 도포한 바이오센서에 대해 혈청에 대한 검출 신호 강도를 측정하였다. 구체적으로, 적혈구 세포막(RBCM)을 도포한 바이오센서와 암세포 세포막(CCM)을 도포한 바이오센서에 시료를 30 ul 첨가한 후, -0.3V의 전압을 걸어준 상태에서 potentiostat (Versastat3)를 이용하여 검출 신호 강도를 분석하여, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 적혈구 세포막을 필터로 포함하는 바이오센서 및 암세포 세포막을 필터로 포함하는 바이오센서 모두 높은 민감성을 나타내며 혈청 내 글루코스를 검출할 수 있음을 알 수 있다.

실험예 10. 바이오센서의 안정성 확인

본 발명의 바이오센서를 실제 활용하기 위하여, 공기 중 안정성을 확인하였다. 구체적으로 본 발명의 바이오센서를 제조한 직후 및 3주 동안 건조 장치인 데시케이터(desicator) 내에 넣어둔 후, 글루코스 농도별 전류량 변화를 측정하였다. 그 결과는 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 바이오센서는 공기와의 접촉에도 큰 영향을 받지 않고 제조 직후와 동일하게 선택적 글루코스 투과 능력을 보유하고 있으며, 효과적으로 글루코스를 검출할 수 있음을 확인하였다. 이와 같이, 본 발명에 따른 세포막 필터부는 수분, 습기 등 공기 중의 조건에 의하여 영향을 크게 받지 않는바, 산업적으로 활용 가치가 높다.

종합적으로, 본 발명의 바이오센서는 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는 세포막 필터부를 포함하고 있어 종래에 상용화되어 있는 혈당측정센서에 비하여 글루코스 검출 민감성이 높고, 동시에 프럭토스, 자일로스, 말토스, 시스테인, 아스코르브산, 요산, 갈락토오스 등과 같은 신호방해물질의 첨가에도 글루코스 검출 특이성이 높다. 더욱이, 본 발명의 글루코스 측정용 바이오센서에 포함된 세포막 필터부는 수분, 습기 등 공기 중의 조건 변화에 크게 영향을 받지 않는바, 1회용 혈당 측정 시험지, 부착형 또는 체내 삽입형 당 측정 기기 등 다양한 제품에 적용될 수 있다.

Claims

세포막으로 이루어지며, 글루코스 수송체(Glucose trasporter, GLUT) 단백질을 포함하여, 생물학적 시료 내 글루코스를 선택적으로 투과시키는 필터부;
상기 필터부에서 투과된 글루코스를 인식하는 센서부; 를 포함하며,
상기 센서부는 글루코스 산화효소(Glucose oixdase), 글루코스 탈수소효소(GDH; glucose dehydrogenase), 글루코스 헥소키나아제(glucose hexokinase), 콜레스테롤 옥시다제, 글루타믹 옥살아세틱 트랜스미나아제(GOT; Glutamic Oxaloacetic Transaminase) 또는 글루타믹 피루빅 트랜스미나아제(GPT; Glutamic Pyruvic Transaminase)를 포함하는 것인, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 세포막은 적혈구 및 암세포로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 세포로부터 분리한 것인, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서.
삭제
제1항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 혈액, 눈물, 소변 및 땀으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것인, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 필터부의 두께는 100 내지 300 nm인 것인, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서.
제1항에 있어서,
상기 바이오센서는
센서부에서 인식된 글루코스에 의한 신호를 해독하는 해독(read)부;를 더 포함하는 것인, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서.
제6항에 있어서,
센서부와 해독부 사이에 인식된 글루코스를 신호로 변환하는 측정부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 바이오센서.
제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 바이오센서를 포함하는, 생물학적 시료 내 글루코스 측정용 키트.
제1항, 제2항, 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 바이오센서에 생물학적 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물학적 시료 내 글루코스 농도 측정 방법.