KR102057058B1

KR102057058B1 - P38 map 키나제 저해제인 1-피라졸릴-3-(4-((2-아닐리노피리미딘-4-일)옥시)나프탈렌-1-일) 우레아

Info

Publication number: KR102057058B1
Application number: KR1020197018435A
Authority: KR
Inventors: 가츠히로 이토; 캐서린 엘리자베스 샤론; 존 킹-언더우드; 스튜어트 토마스 어니온스; 알리스테어 이안 롱샤우; 루디 브룩스; 월터 필리어스; 알렉스 코프만스
Original assignee: 레스피버트 리미티드
Priority date: 2011-10-03
Filing date: 2012-10-03
Publication date: 2019-12-18
Also published as: JP2015155445A; HK1199642A1; CL2014000813A1; MY167798A; CA2846222A1; IL231025A; US20160009695A1; PL2763984T3; EA201490730A1; US10738032B2; US10266519B2; KR20190077618A; JP2014528404A; US9850231B2; US20180134687A1; ECSP14013282A; BR112014007694A2; JP5765866B1; US20240343711A1; MX342168B

Abstract

본 발명은 p38 미토겐 활성화 단백질 키나제 효소류의 저해제인 화학식 (I)의 화합물 및, 특히 염증 질환, 예를 들어 천식과 COPD 같은 폐 염증 질환의 치료에서 약학 조합물 같은 그의 치료적 용도에 관한 것이다.

Description

P38 MAP 키나제 저해제인 1-피라졸릴-3-(4-((2-아닐리노피리미딘-4-일)옥시)나프탈렌-1-일) 우레아 {1-PYRAZOLYL-3-(4-((2-ANILINOPYRIMIDIN-4-YL)OXY) NAPTHTHALEN-1-YL) UREAS AS P38 MAP KINASE INHIBITORS}

본 발명은 p38 미토겐 활성화 단백질 키나제 효소류의 저해제(여기에서는 p38 MAP 키나제 저해제라 칭함), 예를 들어 그의 알파와 감마 키나제 서브타입, 및 Syk 키나제와 티로신 키나제의 Src류의 저해제인 화합물 및, 특히 염증 질환, 구체적으로 천식과 COPD 같은 폐 염증 질환, 궤양성 대장염과 크론병(Crohn's disease) 같은 위장관 염증 질환, 및 포도막염(uveitis) 같은 눈의 염증 질환의 치료에서 약학 조합물 같은 그의 치료적 용도에 관한 것이다.

4개의 p38 MAPK 이소폼(isoform)(각각 알파, 베타, 감마 및 델타)이 동정되었으며, 각각은 사람에서 상이한 조직 발현 패턴을 나타낸다. p38 MAPK 알파와 베타 이소폼은 몸 전체 어디서나 발견되며 수많은 상이한 세포 종류 내에 존재한다. 알파 이소폼은 염증에서 그의 역할에 대해 잘 특성화되어 있다. 마우스에서의 화학적 유전적 접근을 사용한 연구에서는 p38 MAPK 베타 이소폼이 염증에서 작용하지 않는 것으로 나타났지만(O'Keefe, S. J. et al., J. Biol . Chem., 2007, 282 (48):34663-71), 이것은 COX2 발현의 조절에 의해 통증 메카니즘에 연관될 수 있다(Fitzsimmons, B.L. et al ., Neuroreport, 2010, 21(4):313-7). 이러한 이소폼은 이전에 기술된 수많은 분자량이 작은 화합물에 의해 저해된다. 초기 분류의 저해제들은 화합물들의 다수의 표적 이탈(off-target) 효과를 유발하는 이러한 이소폼의 광범위한 조직 분포로 인하여 매우 유독하였다. 게다가, 실질적인 수의 저해제 개발은 임상시험에서 허용할 수 없는 안전성 프로파일로 인하여 중단되었다(Pettus, L.H. and Wurz, R.P., Curr . Top . Med . Chem ., 2008, 8(16):1452-67). 이러한 부작용은 화학형에 따라 다르고 화합물들은 뚜렷한 키나제 선택성 패턴을 가지지만, 관찰된 독성은 p38 메카니즘에 기초하기 보다는 구조와 연관될 수 있다.

알파와 베타 아이소자임(isozyme)과 달리 특정 조직과 세포에서 발현되는 p38 MAPK 감마와 델타 이소폼에 대하여는 거의 알려져 있지 않다. p38 MAPK 델타 이소폼은 췌장, 고환, 폐, 소장 및 신장에서 더 많이 발현된다. 또한 대식세포에 풍부하고, 호중구, CD4+ T 세포 및 내피세포에서 검출할 수 있다(Shmueli, O. et al., Comptes Rendus Biologies, 2003, 326(10-11):1067-1072; Smith, S. J. Br . J. Pharmacol ., 2006, 149:393-404; Hale, K. K., J. Immunol., 1999, 162(7): 4246-52; Wang, X. S. et al., J. Biol . Chem ., 1997, 272(38):23668-23674). p38 MAPK 감마의 분포에 대하여는 거의 알려져 있지 않지만, 림프구와 대식세포뿐만 아니라 뇌, 골격근 및 심장에서 다량으로 발현된다(Shmueli, O. et al ., Comptes Rendus Biologies, 2003, 326(10-11):1067-1072; Hale, K. K., J. Immunol ., 1999, 162(7):4246-52; Court, N. W. et al ., J. Mol . Cell . Cardiol ., 2002, 34(4):413-26; Mertens, S. et al., FEBS Lett., 1996, 383(3):273-6.).

p38 MAPK 감마와 p38 MAPK 델타의 선택적 소분자 저해제는 현재 입수할 수 없지만, 이전에 기술된 화합물인 BIRB 796은 범(pan)-이소폼 저해활성을 가지는 것으로 알려져 있다. p38 MAPK 감마와 델타 이소폼의 저해는 p38 MAPK 알파와 p38 베타를 저해하는데 필요한 것보다 이 화합물의 더 높은 농도에서 관찰된다(Kuma, Y., J. Biol . Chem ., 2005 280:19472-19479). BIRB 796은 또한 상위 키나제 MKK6 또는 MKK4에 의한 p38 MAPK 또는 JNK의 포스포릴레이션(phosphorylation)을 손상시켰다. Kuma는 이 저해제와 MAPK 단백질의 결합으로 야기되는 입체구조 변화가 그의 포스포릴레이션 부위와 상위 활성체의 도킹 부위 모두의 구조에 영향을 미쳐서 p38 MAPK 또는 JNK의 포스포릴레이션을 손상한다는 가능성을 언급하였다.

p38 MAP 키나제는 심각한 천식과 COPD 등의 인간의 질병에서 만성의 지속성 염증을 개시하고 유지하는 것과 연관된 수많은 시그널링 경로에서 중심적 역할을 하는 것으로 생각된다(Chung, F., Chest , 2011, 139(6):1470-1479). p38 MAP 키나제가 일정 범위의 염증유발(pro-inflammatory) 사이토킨에 의해 활성화되고 그의 활성화로 인하여 추가 염증유발 사이토킨의 보충 및 방출이 발생한다는 것을 입증하는 많은 문헌들이 있다. 실제로, 일부 임상연구의 데이터는 p38 MAP 키나제 저해제로 치료하는 동안 환자의 질병 활성에서 유익한 변화를 입증하고 있다. 예를 들어, Smith는 사람 PBMC로부터 (IL-8이 아니라)TNFα 방출에 대한 p38 MAP 키나제 저해제의 저해 효과를 기술하고 있다.

만성 폐쇄성 폐질환(COPD)의 치료에 p38 MAP 키나제의 저해제를 사용하는 것도 제안되었다. p38 MAPK α/β를 표적으로 하는 소분자 저해제는 일반적으로 코르티코스테로이드에 무감한 COPD 환자(Smith, S. J., Br . J. Pharmacol ., 2006, 149:393-404)와 다양한 생체 내 동물 모델(Underwood, D. C. et al ., Am . J. Physiol., 2000, 279:L895-902; Nath, P. et al ., Eur . J. Pharmacol ., 2006, 544:160-167)에서 얻어진 세포와 조직에서 염증의 다양한 매개변수를 감소시키는데 효과적인 것으로 입증되었다. Irusen과 그의 동료들은 또한 핵에서 글루코코르티코이드 수용체(GR)의 결합 친화성 감소에 의해 코르티코스테로이드 불감성과 p38 MAPK α/β의 연관 가능성을 제안하였다(Irusen, E. et al ., J. Allergy Clin . Immunol., 2002, 109:649-657). 일정 범위의 p38 MAP 키나제 저해제, 예를 들어 AMG548, BIRB 796, VX702, SCIO469 및 SCIO323에 대한 임상 시험이 기술되어 있다 (Lee, M.R. and Dominguez, C., Current Med. Chem., 2005, 12:2979-2994).

COPD는 기저 염증이 흡입용 코르티코스테로이드의 항염증 효과에 실질적으로 내성이 있는 것으로 보고된 증상이다. 따라서, COPD를 치료하기 위한 고도의 전략은 고유의 항염증 효과와 흡입용 코르티코스테로이드에 대한 COPD 환자의 폐 조직의 민감성을 증가시킬 수 있는 능력을 갖는 중재안을 개발하는 것일 수 있다. Mercado 등의 최근 간행물(Mercado, N., et al., Mol . Pharmacol ., 2011, 80(6):1128-1135)에서는 p38 MAPK 감마의 사일런싱(silencing)이 코르티코스테로이드에 대한 민감성을 회복하는 작용이 있음을 입증하였다. 그러므로 COPD와 중증 천식 치료를 위해 p38 MAP 키나제 저해제를 사용하는 것은 환자에게 이원적 이점이 될 수 있다. 그러나, 사람의 만성 염증 질환의 치료에서 p38 MAP 키나제 저해제 사용을 방해하는 주요 장애는 환자에서 관찰된 심각한 독성이었으며, 이로 인해 위에서 특별하게 언급된 모두를 포함하여, 수많은 화합물의 임상개발이 중단되었다.

천식이나 COPD로 진단된 많은 환자들은 제어되지 않는 증상과 입원을 유발할 수 있는 이들의 의료 상태의 악화로 고통받고 있다. 이것은 흡입 코르티코스테로이드와 장시간 작용하는 β-작용제의 조합 생성물을 포함하는, 가장 최신의 현재 시판중인 치료 요법제 사용에도 불구하고 일어난다. 지난 10년 동안 축적된 데이터는 폐 질환의 기저 염증 성분을 효과적으로 관리하지 못하는 것이 악화가 일어나는 가장 근접한 이유임을 나타내고 있다. 천식 치료에서 항염증제로서 코르티코스테로이드, 특히 흡입 코르티코스테로이드의 확립된 효능을 고려할 때, 이러한 사실은 심도있는 조사를 야기하였다. 시험에서는 일부 환경적 손상(insults)이 환자 폐에서 코르티코스테로이드 무감성 염증 변화를 일으키는 것이 확인되었다. 일 예가 바이러스 매개 상기도관 감염(URTI)에서 발생하는 반응으로, 이것은 천식 및 COPD와 연관된 이병률 증가에서 특히 중요하다.

역학조사는 상기도관의 바이러스 감염과 만성 호흡기 질환으로 이미 진단된 환자가 겪고 있는 실질적인 악화율 사이에 강력한 연관성을 나타내었다. 이와 관련한 일부 가장 주목할 만한 자료는 천식을 앓고 있는 어린이에 대한 종적 연구에서 나왔다(Papadopoulos, N.G., Papi, A., Psarras, S. and Johnston, S.L., Paediatr. Respir . Rev ,. 2004, 5(3):255-260). 다양한 추가 시험이 바이러스 감염이 악화에 관여할 수 있고 질환의 심각성을 증가시킨다는 결론을 뒷받침하고 있다. 예를 들어, 실험적인 임상적 라이노바이러스(rhinovirus) 감염은 코르티코스테로이드를 사용한 치료에 대해 무반응인 천식 환자에서 히스타민에 대한 기관지 과민반응을 일으키는 것으로 보고되었다(Grunberg, K., Sharon, R.F., et al ., Am . J. Respir. Crit . Care Med ., 2001, 164(10):1816-1822). 추가 증거는 낭포성 섬유증이 있고 HRV 감염된 환자의 질병 악화 간에 관찰된 연관성에서 유래하였다(Wat, D., Gelder, C., et al ., J. Cyst . Fibros ,. 2008, 7:320-328). 또한, 많은 자료들이 라이노바이러스를 포함한 호흡기 바이러스 감염이 소아 폐 이식물 수령자의 12개월 생존율과 부정적으로 상관하는 독립적 위험인자를 나타낸다는 사실과 일치하고 있다(Liu, M., Worley, S., et al ., Transpl . Infect . Dis ., 2009, 11(4):304-312).

임상연구에서는 바이러스 양이 관찰된 증상과 합병증, 및 함축적으로 염증의 심각성에 비례하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 실험적인 라이노바이러스 감염 후에, 하부 기도 증상과 기관지 과민반응은 바이러스 양과 상당히 연관되어 있다(Message, S.D., Laza-Stanca, V., et al ., PNAS, 2008; 105(36):13562-13567). 마찬가지로, 다른 바이러스제가 존재하지 않는 경우, 면역능력이 있는 소아 환자에서 바이러스 양이 높으면 라이노바이러스 감염은 일반적으로 하부 기도 감염과 천명음(wheezing)과 연관되었다(Gerna, G., Piralla, A., et al ., J. Med . Virol ,. 2009, 81(8):1498-1507).

흥미롭게도, 최근에 라이노바이러스에 노출되기 전에 사람의 폐포식세포에서 박테리아 생성물에 의해 발생된 사이토킨 반응의 감소가 보고되었다(Oliver, B.G., Lim, S., et al ., Thorax, 2008, 63:519-525). 또한, 라이노바이러스에 의한 비강 상피세포 감염이 S. aureus 및 H. influenzae 등의 박테리아 점착을 촉진한다고 기술하였다(Wang, J.H., Kwon, H.J. and Yong, J.J., The Laryngoscope, 2009, 119(7):1406-1411). 이러한 세포 작용은 환자가 상부 기도 감염 후에 하부 기도 감염되는 가능성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 이것은 임상적 세팅에서 그의 이점에 대한 대용 예측인자로서 다양한 시험관내 시스템에서 바이러스 양을 감소하는 새로운 중재의 능력에 초점을 맞추는 것과 치료적으로 관련이 있다.

고위험군은 상부 기도의 라이노바이러스 감염이 심각한 2차 합병증을 유발할 수 있으며, 만성 호흡기 질환 환자에게 한정되지 않는다. 이들은, 예를 들어 급성의 생명을 위협하는 열병을 앓고 있는 화학요법 치료중인 환자뿐만 아니라 하부 기도 감염되기 쉬운 면역약화 환자를 포함한다. 또한, 당뇨병 같은 다른 만성 질환과 약화된 면역방어 반응이 연관되어 있는 것으로 나타났다. 이것은 기도 감염되고 그 결과 입원할 가능성 모두를 증가시킨다(Peleg, A.Y., Weerarathna, T., et al ., Diabetes Metab . Res . Rev ., 2007, 23(1):3-13; Kornum, J.B., Reimar, W., et al., Diabetes Care, 2008, 31(8):1541-1545).

상부 기도관 바이러스 감염이 기저 질환 또는 다른 위험인자를 가진 환자들에서 높은 유병율과 사망율의 원인이지만; 이들은 또한 일반 대중들에 있어서는 상당한 의료 부담이고 학교를 결석하고 직장을 결근하는 주요 원인이 되기도 한다(Rollinger, J.M. and Schmidtke, M., Med . Res . Rev ., 2010, Doi 10.1002/ med.20176). 이러한 고려사항들에 따르면 현재의 치료제보다 개선된 효능을 갖는 신규한 의약이 라이노바이러스 매개 상부 기도관 감염을 예방 및 치료하는데 시급하게 필요한 것이 분명하다. 일반적으로, 향상된 항바이러스제를 발견하기 위해 채택된 전략은 바이러스에 의해 생산된 다양한 단백질을 치료 중재의 포인트로서 표적으로 한다. 그러나, 넓은 범위의 라이노바이러스 혈청형은 이것이 추구하는 특별한 도전과제가 되게 하며, 현 시점에서 라이노바이러스 감염의 예방 및 치료를 위한 의약이 왜 여전히 관리기관에 의해 승인되어야 하는지를 설명한다.

바이러스의 숙주 세포로의 유입은 염증 과정(Ludwig, S, 2007; Signal Transduction, 7:81-88 리뷰) 및 바이러스 증식의 개시와 후속 방출에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각되는 수많은 세포내 시그널링 경로의 활성화와 연관되어 있다. 시험관 내 인플루엔자 바이러스 증식에서 작용을 하는 것으로 측정된 한 가지 메카니즘은 포스포이노시타이드(phosphoinositide) 3-키나제/Akt 경로의 활성화이다. 이 시그널링 경로가 바이러스의 NS1 단백질에 의해 활성화되고(Shin, Y.K., Liu, Q. et al ., J. Gen . Virol ., 2007, 88:13-18), 그의 저해가 후대 바이러스의 역가를 저하시킨다(Ehrhardt, C., Marjuki, H. et al ., Cell Microbiol ., 2006, 8:1336-1348)고 보고되었다.

또한, MEK 저해제 U0126은 바이러스의 내성 변이주의 출현을 유발하지 않고 바이러스 증식을 저해하는 것으로 기술되었다(Ludwig, S., Wolff, T. et al ., FEBS Lett., 2004, 561(1-3):37-43). 보다 최근에, Syk 키나제의 저해를 타겟으로 하는 연구에서 이 효소가 라이노바이러스의 세포 내 유입을 매개하고 ICAM-1 상향조절을 포함하는 바이러스로 유발된 염증 반응에서도 중요한 역할을 하는 것이 입증되었다(Sanderson, M.P., Lau, C.W. et al ., Inflamm . Allergy Drug Targets, 2009, 8:87-95). Syk 활성이 HRV 감염에서 상부 키나제인 c-Src에 의해 제어되는 것으로 보고되었다(Lau, C. et al., J. Immunol., 2008, 180(2):870-880). 소수의 연구에서는 세포내 Src(Src1 또는 p60-Src) 또는 Src 종류 키나제의 활성화와 바이러스 감염에 연계를 나타내었다. 이들은 아데노바이러스가 c-Src 의존성 메카니즘을 통해 Akt의 PI3 키나제 매개 활성화를 유도한다는 보고를 포함하고 있다. 또한, 상피세포 내 라이노바이러스-39 유도성 IL-8 생성은 Src 키나제 활성화에 의존하는 것으로 나타났다(Bentley, J.K., Newcomb, D.C., J. Virol ., 2007, 81:1186-1194). 최종적으로, Src 키나제의 활성화는 상피세포와 점막하 샘(gland)에서 라이노바이러스-14에 의한 뮤신 생성의 유도와 관련되어 있는 것으로 제안되었다(Inoue, D. and Yamaya, M., Respir. Physiol. Neurobiol., 2006, 154(3):484-499).

c-Src 및 Syk 키나제 둘다의 활성을 저해하는 화합물이 라이노바이러스 복제에 대한 유효 약물이고(Charron, C.E. et al ., WO 2011/158042), p59-HCK를 저해하는 화합물이 인플루엔자 바이러스 복제에 대해 유효하다(Charron, C.E. et al ., WO 2011/070369)는 것은 이전에 기술되었다. 위에서 요약한 이유 때문에 이러한 고유 특성과 p38 MAPK의 저해를 결합한 만성 호흡기 질환을 치료하기 위해 설계된 화합물이 특히 효과적일 것으로 기대된다.

특정 p38 MAPK 저해제는 또한 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncitial virus) 복제의 저해제로서 기술되었다(Cass, L. et al., WO 2011/ 158039).

또한, p38 MAPK 저해제가 4주 코스의 치료 동안 지속되지 않은 1주의 치료 후에 IBD 환자에게 이점을 제공하는 것이 확인된 것에 주목할 만하다(Schreiber, S. et al., Clin. Gastro. Hepatology, 2006, 4:325-334).

염증전 경로의 활성을 조절하는 세포 시그널링 작용에서 중심 역할을 하는 이외에도, 키나제 효소는 현재 일정 범위의 세포 기능의 활성을 조절하는 것으로 알려졌다. 최근에 논의되고 있는 것들 가운데 DNA 통합성의 유지(Shilo, Y. Nature Reviews Cancer, 2003, 3:155-168)와 세포 분열의 복잡한 공정의 조직화 (coordination)가 있다. 최근 발견에 대한 설명은 시험관 내에서 소핵(micro-nucleus) 형성의 빈도에 대한 소위 "올라하스키 키나제(Olaharsky kinase)"에 작용하는 저해제 세트의 영향을 기술한 간행물에 있다(Olaharsky, A.J. et al ., PLoS Comput. Biol ., 2009, 5(7):e1000446). 소핵 형성은 유사분열 과정의 중단에 연루되거나 결합되어 있어서, 잠재적인 독성의 바람직하지 않은 징후가 된다. 글리코겐 신타제 키나제 3α(GSK3α)의 저해는 소핵 형성을 촉진하는 키나제 저해제의 가능성을 증가시키는 특별히 중요 인자인 것으로 확인되었다. 최근에, RNAi를 사용한 키나제 GSK3β의 저해 또한 소핵 형성을 촉진하는 것으로 보고되었다(Tighe, A. et al., BMC Cell Biology, 2007, 8:34).

GSK3α 같은 올라하스키 키나제와 약물의 상호작용으로 발생하는 부작용은 투여량의 최적화 및/또는 투여 경로의 변경으로 약화시킬 수 있다. 그러나, 이러한 오프 타겟 효소에 대해 검출할 수 없거나 낮은 활성을 나타내어, 결국 유사분열 어세이로 측정했을 때 유사분열 과정의 중단을 유도하지 않거나 거의 유도하지 않는 치료학적으로 유용한 분자를 동정하는 것이 훨씬 유리하다.

위에서 인용된 문헌들을 고려하여 볼 때, 현재 사용할 수 있는 치료보다 치료 가능성이 향상된 새로운 p38 MAP 키나제 저해제를 동정하고 개발해야 한다는 것은 명백하다. 바람직한 화합물은 적어도 기존 약물과 동등한 유효한 효능을 발휘하여 우수한 치료지수를 나타내지만, 하나 이상의 측면에서 적절한 치료량에서 독성이 없는 화합물들이다. 따라서, 본 발명의 목적은, 예를 들어 특정 서브타입들과, Syk 키나제 및 Src류 내의 티로신 키나제(특히 c-Src)와 함께 p38 MAP 키나제의 효소 활성을 저해하여 우수한 항염증 특성을 가지며 치료 용도에 적합한 신규한 화합물을 제공하는 것이다.

화합물 (I)은 이전에 기술된 알로스테릭(allosteric) p38 MAP 키나제 저해제 BIRB 796 (Pargellis, C. et al ., Nature Struct . Biol ., 2002, 9(4):268-272)과 비교하여 장기간의 활성 및/또는 활성 지속성을 나타낸다. 추가 구체예는 이러한 신규 화합물을 흡입용 의약 제제로 적합한 화학적 및 물리적 안정성이 높은 하나 이상의 고체 결정형으로 제공한다.

따라서, 본 발명의 일 측면에서, 화학식 (I)의 화합물, 약학적으로 허용가능한 그의 염 또는 용매화물, 그의 모든 입체이성체와 토토머를 제공한다:

"화학식 (I)의 화합물"은 또한 여기에서 "화합물 (I)"을 지칭할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 위에서 정의된 화합물 (I)을 자유 염기로서 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 위에서 정의된 화합물 (I)을 무수 자유 염기로서 제공한다.

본 발명의 다른 측면에서, 위에서 정의된 화합물 (I)을 무수 자유 염기의 고체 결정형으로 제공한다.

본 발명의 또다른 측면에서, 위에서 정의된 화합물 (I)을 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 A로 제공한다.

본 발명의 또다른 측면에서, 위에서 정의된 화합물 (I)을 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B로 제공한다.

도 1은 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 A 샘플에서 얻어진 X-선 분말 회절(XRPD) 패턴을 나타낸 것이다.
도 2는 미분화한 후의 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B 샘플에서 얻어진 XRPD 패턴을 나타낸 것이다.
도 3은 미분화한 후의 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B 샘플의 열중량분석(thermogravimetric analysis) 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 미분화한 후의 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B 샘플에서 유도된 동적증기수착(DVS) 등온 플롯을 나타낸 것이다.
도 5는 시간에 대한 상대 습도의 변화로 수분 흡착/탈착 정도와 속도를 측정하기 위해, 미분화 이후의 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B에 대해 수행된 히스테리시스(hysterisis) 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 미분화 이후, 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B 샘플에서 얻어진 적외선(IR) 스펙트럼이다.
도 7은 시차주사열량측정법(DSC)에 의한 (미분된(micronized))화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B 샘플의 열 분석을 나타낸 것이다.

여기에 기술된 화학식 (I)의 화합물은 1-(3-tert-부틸-1-p-톨릴-1H-피라졸-5-일)-3-(4-(2-(페닐아미노)피리미딘-4-일옥시)나프탈렌-1-일)우레아이다. 화합물 (I)의 염의 예는 약학적으로 허용가능한 모든 염, 예컨대 무기 강산의 산부가염, 예컨대 HCl 및 HBr 염, 및 메탄설폰산 같은 유기 강산의 부가염을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

이하에서 사용된 화학식 (I)의 화합물의 정의는 문맥상 달리 특정하여 표시하지 않는 한 상기 화합물의 염, 용매화물 및 모든 토토머를 포함한다. 용매화물의 예는 수화물을 포함한다.

여기에 제공된 본 발명은 화학식 (I) 화합물의 프로드럭(prodrug), 즉 분해 및/또는 생체 내 대사되어 화학식 (I)의 활성 화합물을 제공하는 화합물을 포함한다. 프로드럭의 일반적 예는 간단한 에스테르와, 기타 에스테르, 예컨대 혼합 카보네이트 에스테르, 카바메이트, 글리코사이드, 에테르, 아세탈 및 케탈을 포함한다.

본 발명은 화합물 (I)의 동위원소 유도체를 모두 포함한다. 따라서, 본 발명은 자연에서 가장 흔하게 발견된 원자량 또는 질량수와는 상이한 원자량 또는 질량수를 갖는 원자로 대체된 하나 이상의 원자를 갖거나, 자연에서 흔히 발견되지 않는 원자량 또는 질량수를 갖는 원자의 비율이 증가된 화합물 (I)의 화합물이다(후자의 개념은 "동위원소 농축(isotopic enrichment)"이라 칭함). 그러므로, 본 발명의 화합물은 특정된 원자가 자연적으로 발생하거나 자연적으로 발생하지 않은 동위원소인 것들을 포함한다. 일 구체예에서, 동위원소는 안정한 동위원소이다. 따라서, 본 발명의 화합물은, 예를 들어 중수소 함유 화합물 등을 포함한다. 본 발명의 일 구체예에서, 화합물 (I)은 하나 이상의 수소 원자 내에 농축된 농도의 중수소를 함유한다(예를 들어, 주어진 수소 원자에 대하여 수(數)를 기준으로 20%, 50%, 75%, 90%, 95% 또는 99% 초과의 중수소 동위원소 농도). 화합물 (I)에 결합되거나 화합물 (I)에 농축될 수 있는 다른 동위원소의 예는 자연적으로 발생하거나 비자연적으로 발생하는 동위원소일 수 있는, 수소, 탄소, 질소, 산소, 불소, 요오드 및 염소의 동위원소, 예컨대 ³H, ¹¹C, ¹³C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸F, ¹²³I 또는 ¹²⁵I를 포함한다.

본 발명의 다른 측면에서, 화학식 (I) 화합물의 하나 이상의 대사물질, 특히 화학식 (I) 화합물의 하나 이상의 치료 활성을 보유하는 대사물질을 제공한다. 여기에서 사용된 대사물질이란 생체 내에서 화학식 (I) 화합물의 대사로부터 생성된 화합물, 예컨대 비제한적으로 산화성 대사물질 및/또는, 예를 들어 O-탈알킬화에서 생성된 대사물질이다.

본 발명은 또한 여기에서 정의된 화합물의 다형체 모두를 포함한다.

화학식 (I) 화합물의 제조에 적합한 경로를 이하(반응식 1)에 나타내었다.

보호그룹은 상술한 하나 이상의 반응 중에 화학적으로 민감한 그룹을 보호하여, 공정이 수행될 수 있도록 하고/하거나 효율적으로 되도록 하기 위해 필요할 수 있다. 따라서, 원하거나 필요에 따라, 통상적인 보호그룹을 사용하여 중간체 화합물을 보호할 수 있다. 보호그룹과 이들을 제거하기 위한 방법은 "Protective Groups in Organic Synthesis"(Theodora W. Greene and Peter G. M. Wuts, published by John Wiley & Sons Inc; 4th Rev Ed., 2006, ISBN-10; 0471697540)에 기술되어 있다.

화합물 (I)의 상세한 제법을 실시예 1에 기재하였다.

여기에 기술된 신규한 중간체는 본 발명의 일 측면을 형성한다.

본 발명의 다른 측면에서, 고체 결정형의 무수 자유 염기로서 화합물 (I)을 제공한다. 본 발명의 또다른 측면에서, 화합물 (I)은, 예를 들어 이소프로파일 아세테이트로부터 화합물 (I)을 결정화하여 얻어질 수 있는, 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 A로 제공된다. 본 발명의 특정 측면에서, 화합물 (I)은, 예를 들어 아세톤과 물로부터 화합물 (I)을 결정화하여 얻어질 수 있는 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B로 제공된다. 이 과정에 적합한 아세톤 대 물의 전형적 비율은 5:1 내지 200:1, 예를 들어 약 10:1이다. 선택적으로, 다형체 B는 화합물 (I)을 아세톤만으로 결정화하여 수득할 수 있다. 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 A 및 B의 자세한 제조방법은 각각 실시예 1과 3에 기술하였다.

본 발명의 다른 측면에서, 화합물 (I)의 고체 상태 특성은, 예를 들어 개선된 형태학을 갖거나/갖고 감소된 농도의 잔류 용매를 함유하는 물질을 생산하기 위한 추가 슬러링(slurrying) 또는 재결정 단계에 의해 향상될 수 있다. 예를 들어, 잔류 용매는 화합물 (I)의 다형체 B를 물에 슬러링하거나, 선택적으로 아세톤으로부터 추가 재결정하여 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B로부터 제거할 수 있다. 예시적인 슬러링 과정은 실험부의 실시예 3에 상세하게 기술하였다.

일 구체예에서, 실질적으로 도 1에 나타낸 XRPD 패턴을 갖는 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 A를 제공한다. XRPD 데이터를 얻는 방법은 분석 방법과 실시예 5에서 언급된 데이터에 기술하였다.

따라서, 7.8, 8.7, 10.3, 11.2, 12.4, 15.2, 16.2, 17.5, 19.7, 20.8, 22.6, 23.1, 24.6, 25.5, 26.7, 27.4 (± 0.2 도, 2-θ(theta)값)에서의 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 모든 16)의 피크로 XRPD 패턴을 갖는 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 A를 제공하며, 이러한 피크들은 고체 결정성 다형체 A의 특징이다. 10.3, 15.2, 17.5, 23.1, 24.6, 26.7 및 27.4에서의 피크는 특히 고체 결정성 다형체 A의 특징이며, 따라서 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 모든 7)의 이러한 피크를 XRPD 패턴에서 관찰할 수 있는 것이 바람직하다.

다른 구체예에서, 실질적으로 도 2에 나타낸 XRPD 패턴을 갖는 (미분화된)화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B를 제공한다. 미분화 방법은 실시예 4에 기술하였으며, XRPD 데이터를 얻는 방법은 분석 방법과 실시예 5에서 언급된 데이터에 기술하였다.

따라서, 3.9, 6.1, 7.7, 8.6, 10.9, 11.8, 12.7, 14.3, 15.9, 16.7, 18.3, 18.7, 19.9, 20.9, 22.0, 22.6, 25.2, 28.9(± 0.2 도, 2-θ(theta)값)에서의 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 모든 18)의 피크로 XRPD 패턴을 갖는 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B를 제공하며, 이러한 피크들은 고체 결정성 다형체 B의 특징이다. 3.9, 6.1, 11.8, 14.3, 16.7, 18.3, 18.7 및 28.9에서의 피크는 특히 고체 결정성 다형체 B의 특징이며, 따라서 적어도 하나(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모든 8)의 이러한 피크를 XRPD 패턴에서 관찰할 수 있는 것이 바람직하다.

화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 A 및 B의 녹는점은 실시예 6에 기술된 시차주사열량측정법을 사용하여 측정되었다. 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 A는 191.6 ℃의 녹는점을 가지며, 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B는 214 ℃의 녹는점을 가지는 것으로 확인되었다. 다형체 B는 또한 다형체 A보다 더 높은 융합열을 가지는 것으로 확인되었다. 실시예 6에 설명된 바와 같이, 이러한 결과는 다형체 B가 다형체 A보다 열역학적으로 더 안정하다는 것을 나타낸다.

화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B의 물리적 및 화학적 안정성을 시험하여, 그 결과를 여기에 기술하였다.

물리적 안정성을 평가하기 위해, 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B를 실시예 4에 기술된 방법에 따라 미분하고, 얻어진 물질의 샘플을 개방 용기에 보관하여 상이한 주위 온도와 상대 습도에 배치하였다. 샘플의 물리적 특성과 안정성은 TGA, DSC, DVS, IR 분광법 및 XRPD 분석을 사용하여 시험하였다. 전체 실험과정을 일반적 방법 파트에 기술하였으며, 결과를 실시예 7(표 8)에 요약하였다. 실시예 7에서 언급된 바와 같이, 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B(미분)가 양호한 물리적 안정성을 갖는 것을 확인하였다. 또한, 동일한 실험 방법을 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B를 미분하지 않은 형태로 사용하여 수행하였고, 그 결과가 미분화된 물질에 대해 얻어진 것과 실질적으로 유사한 것을 확인하였으며, 즉 미분화된 형태 및 미분화되지 않은 형태의 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B가 양호한 물리적 안정성을 갖는 것이 확인되었다.

화학적 안정성을 평가하기 위하여 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B를 실시예 4에 기술된 방법에 따라 미분하였다. 미분된 샘플을 개방 용기에 보관하여 상이한 주위 온도와 상대 습도에 배치하였다. 샘플의 화학적 안정성을 HPLC로 분석하였다. 결과를 실시예 8(표 9)에 요약하였으며, 여기에서 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B는 미분화 후에 빛에 대한 약간의 민감성이 검출되었으나 화학적으로 안정한 것으로 나타났다.

여기에 기술된 고체 상태 시험의 결과, 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B는 미분화될 수 있고 얻어진 물질은 양호한 물리적 및 화학적 안정성을 가졌다.

화학식 (I)의 화합물은 (특히 알파 서브타입의)p38 MAP 키나제 저해제이고, 일 측면에서 화합물은 염증성 질환, 예를 들어 COPD 및/또는 천식의 치료에 유용하다.

놀라웁게도, 본 화합물은 이전에 기술된 p38 MAP 키나제 저해제 BIRB796과 비교하여 장기간의 작용성 및/또는 활성의 지속성을 나타냈다.

여기서 사용된 활성의 지속성은 목표물(예컨대 수용체)로부터 화합물의 해리속도 및 해리상수와 연관된다. 낮은 해리속도가 지속성을 유도할 수 있다.

높은 결합속도와 함께 낮은 해리속도는 강력한 치료제를 제공할 수 있다.

화학식 (I)의 화합물은 생체 내에서 강력할 것으로 예상된다.

전형적으로, 이제까지 개발된 종래 화합물들은 경구 투여를 위한 것이었다. 이러한 방법은 적절한 약동학적 프로파일에 의해 활성의 지속기간을 얻고, 그에 따라 충분히 높은 약물 농도를 투여 사이에서 구축 및 유지하여 임상적 효과를 제공하는 화합물의 최적화를 포함한다. 이러한 접근 방식의 불가피한 결과는 모든 신체 조직, 특히 간과 소화관이 치료 중인 질환에 의해 부정적으로 영향을 받고 있는지와 상관없이 치료학적으로 활성인 농도를 초과하는 약물에 노출된다는 것이다.

대안적인 방법은 약물을 염증이 생긴 기관에 직접 투여하는 치료 패러다임(국소요법)을 설계하는 것이다. 이러한 접근법이 모든 만성 염증 질환을 치료하는데 적합하지는 않지만, 폐 질환(천식, COPD), 피부 환부(아토피 피부염 및 건선), 비강 질환(알러지성 비염) 및 위장 장애(궤양성 대장염)에서 광범위하게 이용되어 왔다.

국소 치료에 있어서, 효능은 약물이 장기간 지속하는 활성을 갖고 관련 기관에서 유지되어 전신 독성의 위험을 최소화하거나, 바람직한 효과를 유지하는데 이용할 수 있는, 활성 약물의 "저장소(reservoir)"를 생성하는 제제를 제조하여 얻어질 수 있다. 첫 번째 접근방법은, 예를 들어 항콜린성 약물 티오트로피움 (tiotropium)(Spiriva)이다. 이 화합물은 COPD 치료제로서 폐에 국소적으로 투여되며, 표적 수용체에 특히 높은 친화도를 가져서, 매우 낮은 오프율 및 그에 따른 지속적인 작용 기간을 얻게 된다.

본 발명의 일 측면에서, 화학식 (I)의 화합물은 특히 국소 전달, 예컨대 폐로의 국소 전달, 특히 호흡기 질환, 예를 들어 COPD 및/또는 천식 같은 만성 호흡기 질환의 치료에 적합하다.

일 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 코르티코스테로이드로의 치료 요법에 불응이 된 환자를 코르티코스테로이드에 대해 민감화하는데 적합하다.

화학식 (I)의 화합물은 또한 류마티스성 관절염의 치료에 유용할 수 있다.

화학식 (I)의 화합물은 항바이러스 특성, 예를 들어 피코나바이러스 (picornavirus), 특히 라이노바이러스, 인플루엔자 또는 호흡기 세포융합 바이러스에 의한 세포(예컨대 호흡기 상피 세포)의 감염을 예방하는 능력을 가질 수 있다.

따라서, 본 화합물은 피코나바이러스 감염, 예컨대 라이노바이러스 감염, 인플루엔자 또는 호흡기 세포융합 바이러스의 예방, 치료 또는 완화에 특히 적합한 항바이러스제인 것으로 판단된다.

일 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 라이노바이러스 감염 같은 바이러스성 감염, 및 구체적으로, IL-8 같은 사이토킨을 특히 생체 내에서 방출하는 바이러스 감염에 의해 유도된 염증을 감소시킬 수 있다. 이러한 활성은, 예를 들어 본 발명의 실시예에서 기술된 라이노바이러스 유도 IL-8 어세이를 적용하여 시험관 내에서 시험할 수 있다.

일 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 라이노바이러스에 의해 특히 생체 내에서 유도된 ICAM1 발현을 감소시킬 수 있다. ICAM1은 세포를 감염하는 소위 주그루브(major groove) 라이노바이러스 혈청형에 의해 사용된 수용체 메카니즘이다. 이 활성은, 예를 들어 본 발명의 실시예에서 기술된 방법에 의해 측정할 수 있다.

화학식 (I)의 화합물은 이러한 특성들에 의해 울혈성 심부전, COPD, 천식, 당뇨병, 암 같은 만성 질환 중 하나 이상이 있는 환자 및/또는, 예를 들어 기관이식 후 면역억제된 환자에서 염증 질환의 악화, 특히 바이러스 항진의 치료 및/또는 예방에 사용하는데 특히 적합한 것으로 예상된다

구체적으로, 화학식 (I)의 화합물은 COPD(만성 기관지염 및 폐기종 포함), 천식, 소아 천식, 낭성 섬유증, 유육종증(sarcoidosis), 특발성 폐섬유증, 알러지성 비염, 비염, 부비강염, 특히 천식, 및 COPD(만성 기관지염 및 폐기종 포함)를 포함한 하나 이상의 호흡기 장애의 치료에 유용할 수 있다.

화학식 (I)의 화합물은 또한 알러지성 결막염, 결막염, 알러지성 피부염, 접촉성 피부염, 건선, 궤양성 대장염, 류마티스 관절염 또는 골관절염에 수반되는 염증성 관절을 포함하는, 국소 또는 국부 요법에 의해 치료될 수 있는 하나 이상의 상태의 치료에 유용할 수 있다.

화학식 (I)의 화합물은 류마티스 관절염, 췌장염, 악액질(cachexia)을 포함하는 기타 특정 증상의 치료, 비소세포 폐암종, 유방암종, 위암종, 결장직장암종 및 악성 흑색종을 포함한 종양의 성장 및 전이의 저해에 유용할 것으로 예상된다.

화학식 (I)의 화합물은 알러지성 결막염, 결막염, 당뇨성 망막병증, 반점 부종(습성 반점 부종 및 건성 반점 부종 포함), 수술후 백내장 염증, 또는 특히 포도막염(후방, 전방 및 범(pan) 포도막염 포함)을 포함한 안 질환 또는 장애의 치료에 유용할 수 있다.

화학식 (I)의 화합물은 궤양성 대장염 또는 크론병을 포함한 위장관 질환 또는 장애의 치료에 유용할 수 있다.

화학식 (I)의 화합물은 또한 환자의 상태가 코르티코스테로이드에 반응하지 않을 경우에 코르티코스테로이드 치료에 대한 환자의 상태를 다시 민감화할 수 있다.

게다가, 본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 임의로 조합하여 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 성분들의 혼합을 포함하는 약학 조성물의 제조방법을 제공한다.

희석제와 담체는 비경구, 경구, 국소, 점막 및 직장 투여에 적합한 것들을 포함할 수 있다.

위에서 언급된 바와 같이, 이러한 조성물들은, 예를 들어 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내 또는 관절 주위 투여를 위해, 특히 액체 용액 또는 현탁제의 형태; 경구 투여를 위해, 특히 정제 또는 캡슐의 형태; 국소, 예를 들어, 폐 또는 비강내 투여를 위해, 특히 분말, 점비제(nasal drop) 또는 에어로졸 및 경피 투여의 형태; 예를 들어 볼(buccal), 혀밑(sublingual) 또는 질 점막에 대한 점막 투여, 및 직장 투여(rectal administration)를 위해, 예를 들어, 좌약의 형태로 제조될 수 있다.

조성물은 단위 투약 형태로 편리하게 투여될 수 있으며, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences(17판, Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985))에 기술된 바와 같이, 약학 분야에서 잘 알려진 임의 방법으로 제조될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균수 또는 식염수(saline), 프로파일렌 글리콜과 같은 알킬렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물성 유래 오일, 수소화된 나프탈렌 등을 부형제로서 함유할 수 있다. 비강내 투여용 제제는 고체일 수 있으며, 부형제, 예를 들어 락토스 또는 덱스트란을 함유할 수 있거나, 점비제 또는 계량 스프레이(metered spray) 형태로 사용하기 위한 수성 또는 유성 용액일 수 있다. 볼 투여의 경우, 전형적인 부형제는 당, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 전호화분 녹말(pregelatinated starch) 등을 포함한다.

경구 투여에 적합한 조성물은 하나 이상의 생리적으로 상용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있으며 이는 고체 또는 액체 형태일 수 있다. 정제 및 캡슐은, 결합제, 예를 들어 시럽, 아카시아, 젤라틴, 솔비톨, 트라가칸트, 또는 폴리-비닐피롤리돈; 락토스, 슈크로스, 옥수수 전분, 칼슘 포스페이트, 솔비톨, 또는 글리신 같은 충전제; 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 실리카 같은 윤활제; 및 소듐 라우릴 설페이트 같은 계면활성제와 함께 제조될 수 있다. 액체 조성물은 일반적인 첨가제, 예컨대 현탁화제, 예를 들어 솔비톨 시럽, 메틸 셀룰로스, 당 시럽, 젤라틴, 카복시메틸-셀룰로스, 또는 식용 지방; 에멀젼화제, 예컨대 레시틴, 또는 아카시아; 식물성 오일, 예컨대 아몬드 오일, 코코넛 오일, 대구 간유, 또는 땅콩유; 보존제, 예컨대 부틸레이트화 하이드록시아니솔(BHA) 및 부틸레이트화 하이드록시톨루엔(BHT)을 함유할 수 있다. 액체 조성물은, 예를 들어 젤라틴으로 캡슐화되어 단위 투여 형태를 제공할 수 있다.

고체 경구 투여 형태는 정제, 투-피스 하드쉘 캡슐(two-piece hard shell capsule) 및 연질 탄성 젤라틴(soft elastic gelatin; SEG) 캡슐을 포함한다.

전형적으로, 건조 쉘 제제는 약 40% 내지 60% w/w 농도의 젤라틴, 약 20% 내지 30% 농도의 가소제(예컨대 글리세린, 솔비톨 또는 프로파일렌 글리콜) 및 약 30% 내지 40% 농도의 물을 포함한다. 또한, 보존제, 염료, 유백제(opacifier) 및 향미제 같은 기타 물질도 존재할 수 있다. 액체 충전 물질은 (밀납, 수소화된 캐스터 오일 또는 폴리에틸렌 글리콜 4000과 같은 현탁화제와 함께) 용해, 가용화 또는 분산된 고체 약물, 또는 비히클 또는 미네랄 오일, 식물성 오일, 트리글리세리드, 글리콜, 폴리올 같은 비히클 조합 중의 액체 약물 및 표면활성제를 포함한다.

적합하게, 화학식 (I)의 화합물은 폐에 국소적으로 투여된다. 따라서, 본 발명에 따라 본 발명의 화합물 (I)과 임의로 하나 이상의 국소적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 함께 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 폐로의 국소 투여는 에어로졸 제제를 사용함으로써 가능해질 수 있다. 전형적으로, 에어로졸 제제는 클로로플루오로카본(CFC) 또는 하이드로플루오로카본(HFC) 같은 적합한 에어로졸 분사제(propellant)에 현탁 또는 용해된 활성 성분을 포함한다. 적합한 CFC 분사제는 트리클로로모노플루오로메탄(분사제11), 디클로로테트라플루오로메탄(분사제114), 및 디클로로디플루오로메탄(분사제 12)을 포함한다. 적당한 HFC 분사제는 테트라플루오로에탄(HFC-134a) 및 헵타플루오로프로판(HFC-227)을 포함한다. 전형적으로, 분사제는 전체 흡입 조성물의 40 내지 99.5 중량%, 예를 들어 40 내지 90 중량%로 포함된다. 제제는 공용매(예를 들어, 에탄올) 및 계면활성제(예를 들어, 레시틴, 소르비탄 트리올리에이트 등)를 포함하는 부형제를 포함할 수 있다. 에어로졸 제제는 용기에 포장되거나 적정 투여량이 계량 밸브에 의해 전달된다(예를 들어, Bespack, Valois 또는 3M에 의해 제공).

또한, 폐로의 국소 투여는 수용액 또는 현탁제 같이 무압 제제를 사용하여 이루어질 수 있다. 이는 네뷸라이저(nebuliser)에 의해 투여될 수 있다. 네뷸라이저는 휴대가능하거나 휴대할 수 없다. 또한, 폐로의 국소 투여는 건조 분말 제제를 사용하여 이루어질 수도 있다. 건조 분말 제제는 본 발명의 화합물을, 전형적으로 1 내지 10 ㎛의 질량 평균 공기역학 직경(MMAD)을 갖는 미분 형태로 함유할 것이다. 전형적으로 이 제제는, 일반적으로 거대 입자 크기, 예를 들어 50 ㎛ 이상, 예를 들어 100 ㎛ 이상 MMAD의, 락토스 같은 국소적으로 허용가능한 희석제를 함유한다. 국소적으로 허용가능한 대체 희석제는 만니톨이다. 건조 분말 전달 시스템의 예는 SPIHALER, DISKHALER, TURBOHALER, DISKUS, 및 CLICKHALER를 포함한다. 건조 분말 흡입제 시스템의 추가 예는 ECLIPSE, ROTAHALER, HANDIHALER, AEROLISER, CYCLOHALER, BREEZHALER/NEOHALER, FLOWCAPS, TWINCAPS, X-CAPS, TURBOSPIN, ELPENHALER, TURBUHALER, MIATHALER, TWISTHALER, NOVOLIZER, SKYEHALER, ORIEL 건조 분말 흡입제, MICRODOSE, ACCUHALER, PULVINAL, EASYHALER, ULTRAHALER, TAIFUN, PULMOJET, OMNIHALER, GYROHALER, TAPER, CONIX, XCELOVAIR 및 PROHALER를 포함한다.

본 발명의 일 측면은,

(i) 활성성분으로서 다음 화합물 (I), 즉 1-(3-tert-부틸-1-p-톨릴-1H-피라졸-5-일)-3-(4-(2-(페닐아미노)피리미딘-4-일옥시)나프탈렌-1-일)우레아 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염, 및 그의 모든 입체이성체와 토토머의 미립자 형태(예를 들어, 고체 결정성 형태 B);

(ii) 담체로서 락토스 미립자; 및

(iii) 마그네슘 스테아레이트 같은 스테아린산의 금속염 미립자를 포함하는 흡입용 건조 분말 약학 제제에 관한 것이다:

본 발명은 또한, 상기한 제제의 하나 이상의 투여량을 포함하는 흡입 장치를 제공한다.

화학식 (I)의 화합물은 치료활성을 갖는다. 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위해 본 발명의 화합물을 제공한다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 상기한 상태의 치료에서 사용하기 위해 여기에서 기술된 화합물을 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 상기한 상태를 치료하는 의약의 제조를 위한 여기에 기술된 화합물 (I)의 용도를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 대상에게 본 발명의 화합물 (I) 또는 이 화합물을 포함하는 약학 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 상기한 상태를 치료하는 방법을 제공한다.

"치료"라는 용어는 치료적 처치뿐만 아니라 예방까지를 포함하는 의미이다.

또한, 본 발명의 화합물 (I)은 하나 이상의 다른 활성성분, 예를 들어 상기 한 상태의 치료에 적합한 활성성분과 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 호흡기 장애의 치료를 위해 가능한 조합은 스테로이드(예를 들어, 부데소니드, 베클로메타손 디프로피오네이트, 플루티카손 프로피오네이트, 모메타손 푸로에이트, 플루티카손 푸로에이트), 베타 작용제(예를 들어, 터부탈린, 살부타몰, 살메테롤, 포모테롤) 및/또는 잔틴(예를 들어, 테오필린)과의 조합을 포함한다. 다른 적합한 활성제는 티오트로피움 같은 항콜린제, 및 항바이러스제, 예컨대 비제한적으로 자나미비르(zanamivir) 또는 오셀타미비르를, 예를 들어 포스페이트로서 포함한다. 다른 항바이러스제는 페라미비르 및 라니나미비르를 포함한다. 호흡기 장애의 치료를 위한 가능한 추가 조합은 스테로이드, 예컨대 플루니솔리드, 시클레소니드 및 트리암시놀론; 베타 작용제, 예컨대 밤부테롤, 레발부테롤, 클렌부테롤, 페노테롤, 브록사테롤, 인다카테롤, 레프로테롤, 프로카테롤 및 빌란테롤; 무스카린 길항제(예를 들어, 이프라트로피움, 티오트로피움, 옥시트로피움, 글리코피로늄, 글리코피롤레이트, 아클리디늄, 트로스피움) 및 류코트리엔(leukotriene) 길항제(예를 들어, 자피루카스트(zafirlukast), 프란루카스트, 질루톤(zileuton), 몬텔루카스트)와의 조합을 포함한다. 상기한 활성성분들은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다.

일 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물과 다른 활성성분(들)은 동일한 약학 제제로 함께 제제화될 수 있다. 다른 구체예에서, 다른 활성성분(들)은 하나 이상의 별개 약학 제제로 투여될 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 측면은,

(A) 본 발명의 화합물(즉, 상기한 화학식 (I)의 화합물, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염); 및

(B) 다른 치료제를 포함하는 조합물을 제공하고, 여기에서 성분 (A) 및 (B) 각각은 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 혼합하여 제제화된다.

본 발명의 이러한 측면에서, 조합물은 단일(조합) 약학 제제 또는 키트의 일부일 수 있다.

따라서, 본 발명의 상기 측면은 본 발명의 화합물과 다른 치료제를 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 혼합하여 포함하는 약학 제제를 포함한다(이하, 제제는 "조합물(combined preparation)"이라 칭한다).

또한, 이것은

(i) 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 혼합하여 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 제제 성분; 및

(ii) 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 혼합하여 다른 치료제를 포함하는 약학 제제 성분을 포함하는 성분들의 키트를 포함하고, 성분 (i) 및 (ii)는 각각 서로 합하여 투여에 적합한 형태로 제공된다.

따라서, 성분들의 키트 중 성분 (i)은 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 혼합물 중의 상기한 성분 (A)이다. 마찬가지로, 성분 (ii)는 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 혼합물 중의 상기한 성분 (B)이다.

다른 치료제(즉, 상기한 성분 (B))는, 예를 들어 호흡기 장애의 치료와 관련하여 위에서 언급된 활성성분들 중 어느 하나일 수 있다. 화학식 (I)의 화합물의 항바이러스 특성과 관련하여 이하에 보고된 데이터는 다른 항바이러스 치료제와 화학식 (I)의 화합물과의 조합이 COPD 및/또는 천식 같은 호흡기 질환 및/또는 위에서 열거한 증상 중 하나 이상을 가진 환자의 바이러스로 유발된 악화(예를 들어, 호흡기 바이러스 감염)의 치료 또는 예방에 유용하다는 증거를 제공한다. 따라서, 일 측면에서 COPD 및/또는 천식 같은 호흡기 질환 환자의 호흡기 바이러스 감염의 치료 또는 예방에서 항바이러스 치료제, 예컨대 비제한적으로 자나마비르 또는 오셀타미비르(oseltamivir)(예를 들어 오셀타미비르 포스페이트)와 조합한 화합물 (I)의 용도를 제공한다.

본 발명자들은 또한 다른 항바이러스 치료제는 화합물 (I)과 조합하여 호흡기 질환 이외의 만성 상태, 예를 들어 울혈성 심부전, 당뇨병, 암 등의 상태, 또는 면역억제된, 예를 들어 기관이식 후 상태에 있는 환자에서 바이러스로 유발된 악화(예를 들어, 호흡기 바이러스 감염)의 치료 또는 예방에 유용한 것으로 생각된다. 따라서, 다른 측면에서, 울혈성 심부전, 당뇨병, 암 등의 만성 상태, 또는 면역억제된, 예를 들어 기관이식 후 상태에 있는 환자의 호흡기 바이러스 감염의 치료 또는 예방에서 본 발명의 화합물과 항바이러스 치료제, 예컨대 비제한적으로 자나마비르 또는 오셀타미비르(예를 들어 오셀타미비르 포스페이트)와의 조합물의 용도를 제공한다.

실험부분

여기에서 사용된 약어들을 이하에 정의하였다(표 1). 정의되지 않은 모든 약어들은 일반적으로 받아들여지는 그의 의미에 따르도록 한다.

표 1: 약어

AcOH 빙초산

Aq 수성

ATP 아데노신-5'-트리포스페이트

BALF 기관지 폐포성 유출액(bronchoalveolae lavage fluid)

BEGM 기관지 상피세포 성장 배지

br 광범위(broad)

BSA 소 혈청 알부민

CatCart® 촉매성 카트리지

CDI 1,1-카보닐-디이미다졸

COPD 만성 폐쇄성 폐 질환

CXCL1 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1

d 이중선

DCM 디클로로메탄

DMSO 디메틸 설폭사이드

DSC 시차주사열량측정법

d-U937 세포 PMA 분화 U-937 세포

DVS 동적 증기 수착

(ES⁺) 전기분무 이온화, 양성 모드

Et 에틸

EtOAc 에틸 아세테이트

FCS 소태아혈청

FRET 형광공명에너지전달분광학

GSK3α 글리코겐 신타제 키나제 3α

HBEC 프라이머리 인간 기관지 상피 세포

hr 시간

HRP 호오스래디쉬 퍼옥시다제

HRV 인간 라이노바이러스

ICAM-1 세포간 부착 분자 1

IR 적외선

JNK c-Jun N-말단 키나제

KC 케라틴세포 화학유인물질

Kd 해리상수

LPS 리포폴리사카라이드

(M+H)⁺ 프로톤화된 분자 이온

MAPK 미토겐 단백질 활성화 단백질 키나제

MAPKAP-K2 미토겐 활성화 단백질 키나제-활성화 단백질 키나제-2

Me 메틸

MeCN 아세토니트릴

MeOH 메탄올

MHz 메가헤르츠

min 분

MIP1α 대식세포 염증성 단백질 1 알파

MMAD 질량 중위(mass median) 공기역학적 직경

MOI 감염의 다중성(multiplicity of infection)

m.p. 녹는점

MTT 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨

브로마이드

m/z: 질량 대 전하 비율

NMR 핵자기공명(분광학)

PBMC 말초혈액 단핵세포

PBS 인산염 완충 식염수

Ph 페닐

PHA 파이토헤마글루티닌(phytohaemagglutinin)

PMA 포볼(phorbol) 미리스테이트 아세테이트

pTSA 4-메틸벤젠설폰산

q 사중선(quartet)

RT 실온

RP HPLC 역상 고성능 액체 크로마토그래피

RSV 호흡기 세포융합 바이러스

s 단일선

sat 포화

SCX 고체 지지 양이온 교환(수지)

SDS 소듐 도데실 설페이트

S_NAr 친핵성 방향족 치환

t 삼중선

TCID₅₀ 50% 조직 배양 감염성 투여량

TGA 열중량 분석

THF 테트라하이드로퓨란

TNFα 종양괴사인자 알파

XRPD X-선 분말 회절

일반적 방법

모든 출발물질과 용매는 상업적 공급원으로부터 입수되거나 인용문헌에 따라 제조되었다. 달리 언급되지 않는 한, 모든 반응을 교반하였다. 유기 용액은 무수 마그네슘 설페이트로 통상적으로 건조하였다. 수소첨가반응은 Thales H-큐브 유동 반응기에서 기재된 조건 하에 수행하였다. 컬럼 크로마토그래피는 미리 충전된 실리카(230-400 mesh, 40-63 μm) 카트리지에서 지시된 양을 사용하여 수행하였다. SCX는 Supelco로 구입하여 사용 전에 1M 염산으로 처리하였다. 다른 언급이 없는 한, 정제될 반응 혼합물은 먼저 MeOH로 희석하고 약간의 AcOH로 산성화하였다. 이 용액을 직접 SCX에 올리고 MeOH로 세척하였다. 이후, 원하는 물질을 1% NH₃의 MeOH 용액으로 세척하여 용출하였다.

제조용 역상 고성능 액체 크로마토그래피: Agilent Scalar 컬럼 C18, 5 μm (21.2 x 50 mm), 유속 28 mL min^-1, 0.1 % v/v 포름산을 함유하는 H₂O-MeCN 그래디언트로 10분 동안 215와 254 nm에서의 UV 검출을 사용하여 용출. 그래디언트 정보: 0.0 - 0.5 min: 95% H₂O-5% MeCN; 0.5-7.0 min; 95% H₂O-5% MeCN에서 5% H₂O-95% MeCN으로 램프(ramp); 7.0 - 7.9 min: 5% H₂O-95% MeCN으로 유지; 7.9 - 8.0 min: 95% H₂O-5% MeCN으로 복귀; 8.0 - 10.0 min: 95% H₂O-5% MeCN으로 유지.

분석 방법

역상 고성능 액체 크로마토그래피: (방법 1): Agilent Scalar 컬럼 C18, 5 μm (4.6 x 50 mm) 또는 Waters XBridge C18, 5 μm (4.6 x 50 mm) 유속 2.5 mL min^-1, 0.1 % v/v 포름산(방법 1 산성) 또는 NH₃(방법 1 염기성)를 함유하는 H₂O-MeCN 그래디언트로 7분 동안 215와 254 nm에서의 UV 검출을 사용하여 용출. 그래디언트 정보: 0.0-0.1 min, 95% H₂O-5% MeCN; 0.1-5.0 min, 95% H₂O-5% MeCN에서 5% H₂O-95% MeCN으로 램프; 5.0-5.5 min, 5% H₂O-95% MeCN으로 유지; 5.5-5.6 min, 5% H₂O-95% MeCN으로 유지, 3.5 mL min^- ¹으로 유속 증가; 5.6-6.6 min, 5% H₂O-95% MeCN으로 유지, 유속 3.5 mL min^-1; 6.6-6.75 min, 95% H₂O-5% MeCN으로 복귀, 유속 3.5 mL min^-1; 6.75-6.9 min, 95% H₂O-5% MeCN으로 유지, 유속 3.5 mL.min^-1; 6.9-7.0 min, 95% H₂O-5% MeCN으로 유지, 2.5 mL min^-1으로 유속 감소.

역상 고성능 액체 크로마토그래피: (방법 2): Agilent Extend C18 컬럼, 1.8 μm (4.6 x 30 mm), 40 ℃; 유속 2.5-4.5 mL min^-1, 0.1 % v/v 포름산을 함유하는 H₂O-MeCN 그래디언트로 4분 동안 254 nm에서의 UV 검출을 사용하여 용출. 그래디언트 정보: 0-3.00 min, 95% H₂O-5% MeCN에서 5% H₂O-95% MeCN으로 램프; 3.00-3.01 min, 5% H₂O-95% MeCN으로 유지, 4.5 mL min^- ¹으로 유속 증가; 3.01 3.50 min, 5% H₂O-95% MeCN으로 유지; 3.50-3.60 min, 95% H₂O-5% MeCN으로 복귀, 3.50 mL min^- ¹으로 유속 감소; 3.60-3.90 min, 95% H₂O-5% MeCN으로 유지; 3.90-4.00 min, 95% H₂O-5% MeCN으로 유지, 2.5 mL min^-1으로 유속 감소.

¹ H NMR 분광학:

Bruker Avance III 분광광도계로 400 MHz에서 중수소화되지 않은 잔류 용매를 레퍼런스로 사용하여 스펙트럼을 얻었다.

동적 증기 수착 ( Dynamic Vapour Sorption ): 표면 측정 시스템 동적 증기 수착 모델 DVS-1으로 약 10 mg의 샘플을 사용하여 플롯을 얻었다. 25 ℃에서 대기습도에 대해 중량 변화를 기록하였고, 다음 매개변수들을 사용하여 측정하였다: 건조: 건조 질소 하에서 60분; 평형: 60 min/스텝; 데이터 간격: 0.05% 또는 2.0 min. 상대 습도[RH %] 측정 시점은 다음과 같다:

제1 세트: 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5

제2 세트:10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 0.

X-선 분말 회절: 패턴을 Cu LFF X-선 튜브(45 kV; 40 mA; Bragg-Brentano; 스피너 스테이지)가 구비된 PANalytical(Philips) X'PertPRO MPD 회절계로 입수하여 Cu Kα 조사선을 사용하여 다음 측정 조건 하에서 얻었다: 스캔 모드: 연속; 스캔 범위: 3 내지 50° 2 θ; 스텝 사이즈: 0.02°/스텝; 계수 시간: 30 sec/스텝; 스피너(spinner) 회전 시간: 1 초; 입사 빔 경로(incident beam path): 프로그램. 발산(divergence) 슬릿: 15 mm; 평행(Soller) 슬릿: 0.04 rad; 빔 마스크: 15 mm; 산란방지(anti scatter) 슬릿: 1°; 빔 나이프: +; 회절 빔 경로: 롱(long) 산란방지 쉴드: +; 평행 슬릿: 0.04 rad; Ni 필터: +; 검출기: X’Celerator. 샘플을 제로 백그라운드 샘플 홀더에 도포하여 준비하였다.

적외선 분광학: 마이크로 감쇠 전반사(microATR)를 사용하여 샘플을 적합한 microATR 액세서리 및 다음과 같은 측정 조건을 사용하여 분석하였다: 장치: Thermo Nexus 670 FTIR 분광광도계; 스캔 수: 32; 분해능: 1 cm^-1; 파장 범위: 4000 내지 400 cm^-1; 검출기: KBr 윈도우를 구비한 DTGS; 빔 스플리터: KBr 상의 Ge; 마이크로 ATR 액세서리: Si 결정을 갖는 해릭 스플리트 피(Harrick Split Pea).

시차주사열량측정법: RCS 냉각 유니트가 구비된 TA-Instruments Q1000 MTDSC에서 데이터를 수집하였다. 전형적으로 3 mg의 각 화합물을, 표준 알루미늄 TA-Instrument 샘플 팬에서, 10 ℃/min으로 25 ℃부터 300 ℃까지 가열하였다. 샘플에 대해 50 mL/min의 질소 퍼지를 유지하였다.

열중량 분석: TA-Instruments Q500 열중량계(thermogravimeter)로 데이터를 수집하였다. 전형적으로 10 mg의 각 샘플을 사전 계량된 알루미늄 팬에 옮기고, 달리 지시되지 않는 한 20 ℃/min으로 주위 온도 내지 300 ℃ 또는 < 80[(w/w)%]까지 가열하였다.

HPLC에 의한 화학적 안정성: Waters Xbridge C₁₈ 컬럼(3.0 x 150 mm; 3.5 μm)으로 다음 작업조건을 사용하여 분석하였다: 컬럼 온도: 40 ℃; 샘플 온도: 5 ℃; 유속: 0.45 mL/min; 주입 부피: 7 μL; 260 nm에서의 UV 검출; 이동상 조성물: 상(Phase) A: 10 mM 암모늄 아세테이트 + 0.1%, v/v 트리플루오로아세트산 수용액, 및 상(Phase) B: 아세토니트릴, 하기(표 2)한 매개변수로 규정된 그래디언트 사용.

생물학적 시험을 위한 실험 방법

효소 저해 어세이

여기에 기술된 화합물들의 키나제 효소 결합 활성을 고정 리간드에 대한 활성 부위 특이적 경쟁 결합을 측정하는 독자적 어세이를 사용하여 측정하였다(Fabian, M.A. et al ., Nature Biotechnol., 2005, 23:329-336). 이 어세이는 DiscoverX(이전의 Ambit; San Diego, CA)로 수행되었다. Kd값(해리상수값)을 각 키나제에 대한 화합물의 친화도 지수로 계산하였다.

효소 저해 어세이

여기에 기술된 화합물들의 효소 저해 활성을 FRET에 의해 공여체와 수용체 형광단(fluorophore)(Z-LYTE, Invitrogen Ltd., Paisley, UK) 둘다로 표지된 합성 펩티드를 사용하여 측정하였다.

p38 MAPKα 효소 저해

p38 MAPKα 이소폼(MAPK14: Invitrogen)에 대한 시험 화합물의 저해 활성을 하부 분자, MAPKAP-K2의 활성화/인산화 수준을 측정하여 간접 평가하였다. p38 MAPKα 단백질(80 ng/mL, 2.5 μL)을 시험 화합물(4 μg/mL, 0.4 μg/mL, 0.04 μg/mL 또는 0.004 μg/mL 농도, 2.5 μL 사용)과 2시간 동안 RT에서 혼합하였다. p38α 불활성 표적 MAPKAP-K2(Invitrogen, 600 ng/mL)와 FRET 펩티드(8 μM; MAPKAP-K2의 인산화 표적)의 혼합 용액(2.5 μL)을 첨가하고 키나제 반응을 ATP(40 μM, 2.5μL)를 첨가하여 개시하였다. 혼합물을 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 전개제(프로테아제, 5μL)를 형광 마이크로플레이트 판독기(Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific)에서 검출하기 전에 1시간 동안 첨가하였다.

p38 MAPKγ 효소 저해

p38MAPKγ(MAPK12: Invitrogen)에 대한 본 발명 화합물의 저해 활성을 상기한 것과 유사한 방법으로 평가하였다. 효소(800 ng/mL, 2.5 μL)를 시험 화합물(4 μg/mL, 0.4 μg/mL, 0.04 μg/mL 또는 0.004 μg/mL 농도, 2.5 μL 사용)과 2시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. FRET 펩티드(8 μM, 2.5 μL), 및 적절한 ATP 용액(2.5 μL, 400 μM)을 효소/화합물 혼합물에 첨가하여 1시간 동안 인큐베이션하였다. 전개제(프로테아제, 5 μL)를 형광 마이크로플레이트 판독기(Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific)에서 검출하기 전에 1시간 동안 첨가하였다.

c-Src 및 Syk 효소 저해

c-Src 및 Syk 효소(Invitrogen)에 대한 본 발명 화합물의 저해 활성을 상기한 것과 유사한 방법으로 평가하였다. 관련 효소(각각 3000 ng/mL 또는 2000 ng/mL 농도, 2.5 μL 사용)를 시험 화합물(4 μg/mL, 0.4 μg/mL, 0.04 μg/mL, 또는 0.004 μg/mL 농도, 각각 2.5 μL 사용)과 2시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. FRET 펩티드(8 μM, 2.5 μL), 및 적절한 ATP 용액(2.5μL, c-Src에 대해 800 μM, 및 Syk에 대해 60 μM ATP)을 효소/화합물 혼합물에 첨가하여 1시간 동안 인큐베이션하였다. 전개제(프로테아제, 5μL)를 형광 마이크로플레이트 판독기(Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific)에서 검출하기 전에 1시간 동안 첨가하였다.

GSK 3α 효소 저해

GSK 3α 효소 이소폼(Invitrogen)에 대한 시험 화합물의 저해 활성을 표적 펩티드의 활성화/인산화 수준을 측정하여 평가하였다. GSK3-α 단백질(500 ng/mL, 2.5 μL)을 시험 화합물(4 μg/mL, 0.4 μg/mL, 0.04 μg/mL, 또는 0.004 μg/mL 농도, 2.5 μL 사용)과 2시간 동안 RT에서 혼합하였다. GSK3α의 인산화 표적인 FRET 펩티드(8 μM, 2.5 μL)와 ATP(40 μM, 2.5 μL)를 효소/화합물 혼합물에 첨가하고 얻어진 혼합물을 1시간 동안 인큐베이션하였다. 전개제(프로테아제, 5 μL)를 형광 마이크로플레이트 판독기(Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific)에서 검출하기 전에 1시간 동안 첨가하였다.

모든 경우에서, 부위 특이적 프로테아제가 인산화되지 않은 펩티드만을 절단하여 FRET 시그널을 제거하였다. 각 반응의 인산화 수준을 플루오레신 방출(수용체)에 대한 쿠마린 방출(공여체)의 비율로 계산하였으며, 여기서 낮은 비율은 높은 인산화를 나타내고 높은 비율은 낮은 인산화 수준을 나타낸다. 각 반응의 저해율을 비저해 대조군과 관련하여 계산하였으며, 다음으로 50% 저해 농도(IC₅₀값)를 농도-반응 곡선에서 계산하였다.

세포 어세이

LPS-유도 TNFα / d-U937 세포에서 IL-8의 방출

인간 단핵구 세포주인 U937 세포를 PMA(100 ng/mL)와 48 내지 72시간 동안 인큐베이션하여 대식세포 종류 세포내로 분화하였다. 세포를 최종 농도의 시험 화합물과 2시간 동안 사전 인큐베이션한 다음, LPS(0.1 μg/mL; E. Coli에서 유래: O111:B4, Sigma)로 4시간 동안 자극하였다. 상징액을 TNFα 및 IL-8 농도 측정을 위해 샌드위치 ELISA(Duo-set, R&D systems)로 수집하였다. TNFα 생산의 저해를 10 μg/mL의 BIRB796에 의해 각 농도의 시험 화합물에서 비히클 대조군에 대한 비교로 얻어진 것의 백분율로서 계산하였다. 상대적 50% 유효 농도(REC₅₀)를 얻어진 농도-반응 곡선으로부터 결정하였다. IL-8 생산의 저해를 각 농도의 시험 화합물에서 비히클 대조군과 비교하여 계산하였다. 50% 저해 농도(IC₅₀)를 얻어진 농도-반응 곡선으로부터 결정하였다.

THP-1 세포에서 LPS-유도 TNFα 방출

인간 단핵구 세포주인 THP-1 세포를 3 μg/mL의 LPS(E. Coli에서 유래: 0111:B4, Sigma)로 4시간 동안 자극하여 상징액을 TNFα 농도 측정을 위해 샌드위치 ELISA(Duo-set, R&D systems)로 수집하였다. TNFα 생산의 저해를 각 농도에서 비히클 대조군과 비교하여 계산하였다. 50% 저해 농도(IC₅₀)를 얻어진 농도-반응 곡선으로부터 결정하였다.

BEAS2B 세포에서 폴리 I:C-유도 ICAM-1의 발현

이 시험에서는 폴리 I:C를 간단한 RNA 바이러스 모방체로 사용하였다. 폴리 I:C-올리고펙타민(Oligofectamine) 혼합물(1 μg/mL 폴리 I:C, ± 2% 올리고펙타민, 25 μL; 각각 Invivogen Ltd., San Diego, CA, 및 Invitrogen, Carlsbad, CA)을 BEAS2B 세포(인간 기관지 상피 세포, ATCC)에 형질감염시켰다. 세포를 최종 농도의 시험 화합물과 2시간 동안 사전 인큐베이션하여 세포 표면에서 ICAM-1 발현의 수준을 세포 기반 ELISA로 측정하였다. 폴리 I:C 형질감염의 18시간 후에 세포를 4% 포름알데히드의 PBS(100 μL) 용액으로 고정한 다음, 내인성 퍼옥시다제를 0.1% 소듐 아자이드와 1% 과산화수소를 함유하는 세척 완충액(100 μL, PBS 중의 0.05% Tween: PBS-Tween)을 첨가하여 퀀칭하였다. 세포를 세척 완충액으로 세척하고(3 x 200 μL), 웰을 5% 밀크의 PBS-Tween(100 μL)으로 1시간 동안 블로킹한 다음, 세포를 1% BSA PBS 중의 항인간 ICAM-1 항체(50 μL; Cell Signaling Technology, Danvers, MA)와 밤새 4 ℃에서 인큐베이션하였다.

세포를 PBS-Tween(3 x 200 μL)으로 세척하고 2차 항체(100 μL; HRP-컨쥬게이트된 항래빗 IgG, Dako Ltd., Glostrup, Denmark)와 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 기질(50 μL)과 2-20 분 동안 인큐베이션한 후, 중지 용액(50 μL, 1N H₂SO₄)을 첨가하였다. ICAM-1 시그널을 분광광도계를 사용하여 655 nm의 레퍼런스 파장에 대해 450 nm에서의 흡광도를 판독하여 검출하였다. 이후, 세포를 PBS-Tween(3 x 200 μL)으로 세척하고 각 웰의 전체 세포수를 Crystal Violet 염색(PBS 중의 2% 용액 50 μL) 및 증류수에 용해된 1% SDS 용액(100 μL)으로 용출한 후 595 nm에서의 흡광도를 판독하여 측정하였다. 측정된 OD 450-655 판독값들은 각 웰의 OD595 판독으로 나누어 세포수에 대해 보정하였다. ICAM-1 발현의 저해를 시험 화합물의 각 농도에서 비히클 대조군과 비교하여 계산하였다. 50% 저해 농도(IC₅₀)를 얻어진 농도-반응 곡선으로부터 측정하였다.

세포 유사분열 어세이

건강한 대상의 말초혈단핵혈구(PBMC: peripheral blood mononucleocytes)를 전체 혈액(Quintiles, London, UK)에서 밀도 그래디언트(Histopaque^®-1077, Sigma-Aldrich, Poole, UK)를 사용하여 분리하였다. 이어서, PBMC(샘플당 300만 세포)를 2% PHA(Sigma-Aldrich, Poole, UK)로 48시간 동안 처리하고, 다양한 농도의 시험 화합물에 20시간 동안 노출하였다. 수집하기 2시간 전에, PBMC를 데메콜사인(demecolcine)(0.1 μg/mL; Invitrogen, Paisley, UK)으로 처리하여 세포를 중기에 정지시켰다. 유사분열 세포를 관찰하기 위해, Intraprep(50 μL; Beckman Coulter, France)을 첨가하여 PBMC를 투과 및 고정하고, 이전에 기술(Muehlbauer P.A. and Schuler M.J., Mutation Research, 2003, 537:117-130)된 바와 같이 항-포스포-히스톤 3(0.26 ng/L; #9701; Cell Signalling, Danvers, MA) 및 요오드화프로피듐(1 mg/mL; Sigma-Aldrich, Poole, UK)으로 염색하였다. 형광을 림프구에 대해 게이팅(gating)하는 ATTUNE 유세포분석기(Invitrogen, Paisley, UK)를 사용하여 관찰하였다. 유사분열의 저해율을 비히클(0.5% DMSO) 처리에 비례하여 각 처리에 대해 계산하였다.

라이노바이러스-유도 IL-8 방출 및 ICAM-1 발현

인간 라이노바이러스 RV16을 ATCC(American Type Culture Collection) (Manassas, VA)로부터 입수하였다. Hela 세포를 HRV로 세포의 80%가 세포변성될 때까지 감염시켜 바이러스 원액을 생성하였다.

BEAS2B 세포를 HRV로 5의 MOI로 감염시키고, 흡착 촉진을 위해 서서히 진탕하면서 33 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 PBS로 세척하고, 새로운 배지를 첨가하여 세포를 72 시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. IL-8 농도 어세이를 위해 상징액을 Duoset ELISA 개발 키트(R&D Systems, Minneapolis, MN)로 수집하였다.

세포 표면 ICAM-1 발현의 수준을 세포 기반 ELISA로 측정하였다. 72시간 감염한 후, 세포를 4% 포름알데히드의 PBS 용액으로 고정하였다. 0.1% 소듐 아자이드와 1% 과산화수소를 첨가하여 내인성 퍼옥시다제를 퀀칭한 후, 웰을 세척 완충액 (PBS 중의 0.05% Tween: PBS-Tween)으로 세척하였다. 웰을 5% 밀크의 PBS-Tween 용액으로 1시간 동안 블로킹한 다음, 세포를 5% BSA PBS-Tween 중의 항인간 ICAM-1 항체(1:500)와 밤새 인큐베이션하였다. 웰을 PBS-Tween으로 세척하고 2차 항체(HRP-컨쥬게이트 항래빗 IgG, Dako Ltd.)와 인큐베이션하였다. 기질을 첨가하고 450 nm에서 655 nm의 레퍼런스 파장으로 분광광도계에 의해 판독하여 ICAM-1 시그널을 검출하였다. 이후, 웰을 PBS-Tween으로 세척하고 Crystal Violet 염색과 1% SDS 용액에 의한 용출 후 595 nm에서 흡광도를 읽어서 각 웰 내의 총 세포수를 측정하였다. 측정된 OD_450-655 판독값들을 각 웰의 OD₅₉₅ 판독값으로 나누어 세포수에 대해 보정하였다. HRV 감염 2시간 전과 비감염 HRV를 세척하면 감염 2시간 후에 화합물을 첨가하였다.

MRC5 세포에서 HRV16으로 유도된 CPE의 평가

MRC-5 세포를 5% FCS 및 1.5 mM MgCl₂를 함유하는 DMEM 중에서 HRV16으로 MOI 1로 감염시킨 후, 흡착을 촉진하기 위해 1 시간 동안 33 ℃에서 인큐베이션하였다. 상징액을 흡기한 다음, 새로운 배지를 첨가하고 4일 동안 인큐베이션하였다. 적절하다면, 세포를 화합물 또는 DMSO와 2시간 동안 사전 인큐베이션하고 바이러스를 세척한 후 화합물과 DMSO를 다시 첨가하였다.

상징액을 흡기하여 메틸렌 블루 용액(100 μL, 2% 포름알데히드, 10% 메탄올 및 0.175 % 메틸렌 블루)과 2시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 세척 후, 증류수 중의 1% SDS(100 μL)를 각 웰에 첨가하고, 660 nm에서의 흡광도를 읽기 전에 플레이트를 가볍게 1-2 시간 동안 진탕하였다. 각 웰에 대한 저해율을 계산하였다. IC₅₀값을 시험 화합물의 연속 희석으로 만들어진 농도-반응 곡선으로부터 계산하였다.

일차 기관지 상피세포에서 시험관내 RSV 바이러스의 양

96웰 플레이트에서 배양된 정상 인간 기관지 상피세포(NHBEC)를 15 mM 염화마그네슘을 함유하는 LHC8 배지:RPMI-1640(50:50)에서 RSV A2(균주 A2, HPA, Salisbury, UK)로 MOI 0.001로 감염하여 1시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하여 흡착하였다. 이후, 세포를 PBS(3 x 200 μL)로 세척하고, 새로운 배지(200 μL)를 첨가하여 인큐베이션을 4일 동안 계속하였다. 적절한 경우, 세포를 화합물 또는 DMSO와 2시간 동안 사전 인큐베이션하고 바이러스를 세척한 후에 다시 첨가하였다.

세포를 PBS 용액 중의 4% 포름알데히드(50 μL)로 20분 동안 고정하고, 세척 완충액(3 x 200 μL; 0.5% BSA 및 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS)으로 세척하여 블로킹 용액(5% 연유/PBS)과 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 세포를 세척 완충액(3 x 200 μL)으로 세척하고 1시간 동안 RT에서 5% BSA/PBS-tween 중의 항-RSV (2F7) F-융합 단백질 항체(40 μL; 마우스 모노클로날, lot 798760, Cat. No. ab43812, Abcam)와 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 5% BSA/PBS-tween 중의 HRP-컨쥬게이트 2차 항체 용액(50 μL)(lot 00053170, Cat.No. P0447, Dako)과 인큐베이션한 다음, TMB 기질(50 μL; 기질 시약 팩(pack), lot 269472, Cat. No. DY999, R&D Systems, Inc.)을 첨가하였다. 이 반응을 2N H₂SO₄(50 μL)를 첨가하여 중지한 다음, 얻어진 시그널을 마이크로플레이트 판독기(Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific)에서 비색법(OD: 450 nm, 레퍼런스 파장 655 nm)으로 측정하였다.

이후, 세포를 세척하고 2.5% crystal violet 용액(50 μL; lot 8656, Cat. No. PL7000, Pro-Lab Diagnostics)을 30분 동안 적용하였다. 세척 완충액으로 세척한 후, 1% SDS/증류수(100 μL)를 각 웰에 첨가하여 플레이트를 595 nm에서 흡광도를 읽기 전에 1시간 동안 진탕기에서 가볍게 진탕하였다. OD_450-655 판독값들을 OD₅₉₅ 판독값으로 나누어 측정된 OD_450-655 판독값을 세포수에 대해 보정하였다. 각 웰에 대한 저해율을 계산하고 IC₅₀값을 화합물의 연속 희석으로 만들어진 농도-반응 곡선으로부터 계산하였다.

시험 화합물의 세포 생존능에 대한 효과: MTT 어세이

분화된 U937 세포를 각 시험 화합물(최종 농도: 하기한 배지 200 μL 중에서 1 μg/mL 또는 10 μg/mL)과 함께 두 가지 방법으로 사전 인큐베이션하였다: 첫 번째로 5% FCS RPMI1640 배지에서 4 시간 및 두 번째로 10% FCS RPMI1640 배지에서 24 시간. 상징액을 새로운 배지(200 μL)로 교체하고 MTT 모액(stock solution) (10 μL, 5 mg/ml)을 각 웰에 첨가하였다. 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고, 각 웰에 DMSO(200 μL)를 첨가한 후, 550 nm에서 흡광을 읽기 전에 플레이트를 1시간 동안 가볍게 진탕하였다. 세포 생존능의 손실 백분율을 비히클(0.5% DMSO)-처리군과 비교하여 각 웰에 대해 계산하였다. 그 결과, 비히클과 비교한 약물 처리에 대해 세포 생존능의 뚜렷한 증가가 네가티브 백분율로 표시되었다.

COPD로부터 얻어진 가래 대식세포에서 사이토카인의 생산

COPD 환자에게 3% (w/v) 고장성 식염수의 네불라이즈화 용액을 초음파 네불라이저(Devilbiss, Carthage, MO)를 사용하여 5분 동안의 평상 호흡으로 흡입시켰다. 이 과정을 가래가 충분히 얻어질 때까지 최대 3회 반복하였다. 가래 샘플을 균질화하여 보텍스 혼합기로 0.02% v/v 디티오트레이톨(DTT) 용액에 잘 혼합하였다. 샘플을 PBS(40 mL)에 재현탁시킨 후, 1500 rpm으로 4 ℃에서 10분 동안 원심분리하여 가래 세포 펠릿을 얻었다. 펠릿을 PBS(40mL)로 2회 세척하였다. 가래 세포를 20 U/mL의 페니실린, 0.02 mg/mL 스트렙토마이신 및 5 μg/mL 암포테리신 B를 함유하는 대식세포 혈청이 없는 배지(대식세포-SFM, Life technologies, Paisley, UK; 24웰 플레이트에서 2x10⁶/웰 수득)에 재현탁하고, 하이 바운드(high bound) 96웰 플레이트에 접종한 후, 2시간 동안 37 ℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하여 대식세포가 플레이트의 바닥에 부착되게 하였다. 플레이트의 세포를 새로운 대식세포-SFM(200 μL/웰)로 세척하여 호중구와 다른 오염 세포를 제거하였다. 플레이트에 고착된 세포(주로 가래 대식세포)를 추가 분석에 사용하였다. 가래 유발과 분리는 Guys Hospital의 Quintiles Drug Research Unit에서 수행되었고, Quintiles가 윤리 승인 및 서면동의서를 얻었다.

적절한 경우, 시험 화합물 또는 레퍼런스를 기재된 농도로 함유하는 용액 1 μL, 또는 선택적으로 비히클 대조군으로서 DMSO 1 μL를 각 웰에 첨가(배지로 200 μL)하고, 세포를 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 LPS 용액(50 μL, 최종 농도: 1 μg/mL)으로 자극하고 4시간 동안 37 ℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 이후, 상징액을 모으고 -80 ℃에서 유지하였다. Millipore의 루미넥스(luminex) 키트를 사용하여 4개 분석물을 측정하였다. 상징액을 해동한 후, 마그네틱 항체 비즈를 멀티플렉싱하고 96웰 플레이트에서 표준물, 바탕 용액 또는 적절한 부피의 샘플과 4 ℃에서 진탕하면서 밤새 인큐베이션하였다. 마그네틱 플레이트 세척기를 사용하여 웰마다 키트로 제공된 200 μL의 세척 완충액으로 2회 세척한 후, 비즈를 1시간 동안 RT에서 키트에 의해 제공된 비오틴 컨쥬게이트 항체 용액 25 μL와 진탕하면서 인큐베이션하였다. 스트렙타비딘 용액을 RT에서 진탕하면서 30분 동안 첨가하였다. 웰 당 200 μL의 세척 완충액으로 세척한 후, 비즈를 시스(sheath) 용액(150 μL)에 재현탁하여 즉시 분석하였다. 상징액 중의 각 분석물의 농도를 Xcel Fit 소프트웨어로 4 또는 5 매개변수 방정식에 의해 각각의 표준 곡선을 사용하여 계산하였다. 각 사이토카인 생산의 저해를 각각의 농도에서 비히클 대조군과 비교하여 계산하였다. IC₅₀값을 XL-Fit(idbs, Guildford, UK)를 사용하는 농도-저해 곡선으로부터 결정하였다.

COPD로부터 얻어진 일차 기관지 상피세포에서 사이토카인의 생산

COPD 환자에서 얻어진 일차 기도 상피세포를 Asterand(Royston, UK)에서 구입하여 LHC8(Invitrogen)(500 mL)과 LHC9(Invitrogen)(500 mL) 및 3 μL 레티노산 용액(5 mg/mL 순수 DMSO)을 함께 혼합하여 제조된 기관지 상피세포 성장 배지에서 유지하였다. 배지를 흡인하여 제거하고 새로운 BEGM(200 μL)을 각 웰에 첨가하였다. 적절한 경우, 명시된 농도의 시험 화합물 용액 1 μL 또는 비히클 대조군으로서 DMSO 1 μL를 첨가하고 세포를 2시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 TNFα(50 μL; 최종 농도 50 ng/mL)로 자극한 다음, 4시간 동안 37 ℃, 5% CO₂에서 인큐베이션하였다. 상징액을 수집하고 -20 ℃로 유지하였다.

IL-6 및 IL-8의 농도를 ELISA에 의해 R&D Systems의 인간 IL-6과 IL-8 Duoset® Elisa Kits를 사용하여 측정하였다. IL-6 및 IL-8 생산의 저해를 각 농도에서 비히클 대조군과 비교하여 계산하였다. 50% 저해 농도(IC₅₀)를 얻어진 농도-반응 곡선으로부터 XL-Fit(idbs, Guildford, UK)를 사용하여 측정하였다.

생체내 스크리닝: 약력학 및 항염증 활성

마우스에서 LPS로 유도된 호중구 축적

절식하지 않은 Balb/c 마우스에게 기관내 경로로 비히클, 또는 시험물질을 표시된 시간(2-8 시간 범위 내)에 LPS 챌린지 적용에 의한 염증반응 자극 전에 투여하였다. T = 0일 때, 마우스를 노출 챔버에 넣고 LPS(7.0 mL, PBS 중의 0.5 mg/mL 용액)에 30분 동안 노출하였다. 추가로 8시간이 지난 후에 동물을 마취시키고 기관에 캐뉼라 삽입하여 BALF를 침출에 의해 추출한 다음, 폐에서 기관 카테터를 통해 1.0 mL의 PBS를 취하였다. BALF 샘플 내의 전체 및 분화 백혈구 수를 Neubaur 혈구계(haemocytometer)로 측정하였다. BALF 샘플의 사이토스핀(Cytospin) 도말표본을 200 rpm으로 5분 동안 RT에서 원심분리하여 제조하고 DiffQuik 염색 시스템(Dade Behring)을 사용하여 염색하였다. 세포를 오일 이머젼 현미경으로 계수하였다. BAL 내 호중구 수에 대한 데이터를 평균±S.E.M(평균의 표준오차)으로 나타내었다. 호중구 축적의 저해율을 비히클 처리와 비교하여 각 처리군에 대해 계산하였다.

담배연기 모델

A/J 마우스(수컷, 5주령)를 담배연기(4% 담배연기, 공기로 희석)에 매일 30분씩 11일 동안 작은 동물용 담배연기 흡입 실험 시스템(모델 SIS-CS; Sibata Scientific Technology, Tokyo, Japan)을 사용하여 노출시켰다. 담배연기에 마지막으로 노출한 후, 시험 물질을 3일 동안 1일 1회 비강 내로 투여(50% DMSO/PBS 중의 용액 35 μL)하였다. 최종 투여하고 12시간 후에 각 동물을 마취시키고, 기관에 캐뉼라를 삽입하여 기관지 폐포성 세척 유액(BALF)을 수집하였다. 항-마우스 MOMA2 항체(대식세포) 또는 항-마우스 7/4 항체(호중구)를 사용하여 FACS 분석(EPICS^® ALTRAⅡ, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA)으로 폐포 대식세포 및 호중구의 수를 측정하였다. BALF를 원심분리하여 상징액을 모았다. BALF 내 케라틴세포 화학유인물질(KC; CXCL1) 농도를 Quentikine^® 마우스 KC ELISA 키트(R&D systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 정량하였다.

실시예 1 - 화합물 (I)의 제조

본 발명의 화합물 (I)을 제조하는데 사용된 다음과 같은 중간체들은 이전에 기술되었으며, 이하에 인용된 참고문헌의 방법으로 제조하였다(표 3).

중간체 C: 4-((4-아미노나프탈렌-1-일)옥시)- N -페닐피리미딘-2-아민

중간체 B(50.0 g, 184 mmol)와 THF(200 mL) 중의 아닐린(42.0 mL, 460 mmol) 혼합물의 질소 퍼지 용액에 pTSA(17.5 g, 92.0 mmol)를 한 번에 첨가하였다. 반응 혼합물을 70 ℃로 1.5시간 동안 가열하였고, 이때 침전이 형성되었다. 혼합물을 실온으로 냉각하고 THF(200 mL)로 희석하였다. 여과하여 침전을 모으고, THF(2 x 100 mL)로 세척한 다음, DCM(600 mL)과 aq. NaOH (2M, 200 mL)의 불균일 혼합물에 현탁하여 1시간 동안 강하게 교반하였으며, 이때 현탁된 고체가 용해되었다. 층을 분리하고 수성층을 DCM(200 mL)으로 추출하였다. DCM 추출물을 합쳐서 건조하고 진공으로 증발시켰다. 잔류물을 에테르(150 mL)에 취하여 얻어진 고체를 에테르(2 x 50 mL)로 세척하여 회백색 고체의 중간체 C를 얻었다(26 g, 43%); R^t 1.95 min (방법 2); m/z 329 (M+H)⁺ (ES⁺).

화합물 (I): 1-(3-( tert -부틸)-1-( p - 톨릴 )-1 H - 피라졸 -5-일)-3-(4-((2-( 페닐아미노 )피리미딘-4-일)옥시)나프탈렌-1-일)우레아

Na₂CO₃(3.84 g, 36 mmol) 수용액(42 mL)과 중간체 A(10.5 g, 45.7 mmol)의 이소프로파일 아세테이트(130 mL, 1.082 mol) 용액의 불균일 혼합물을 실온에서 5분 동안 강력하게 교반한 다음, 페닐 카보노클로리데이트(carbonochloridate)(5.77 mL, 45.7 mmol)로 처리하였다. 혼합물을 추가로 4시간 동안 교반한 후, 층을 분리하였다. 유기층을 중간체 C(10.0 g, 30.5 mmol)와 트리에틸아민(423 μL, 3.05 mmol)의 이소프로파일 아세테이트(60 mL, 511 mmol) 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 48 ℃로 1시간 동안 가온한 후, 이소프로파일 아세테이트(190 mL)로 희석하고 실온으로 다시 18시간 동안 냉각하여 침전을 형성하였다. 여과하여 침전을 단리하고 이소프로파일 아세테이트로 세척한 후, 진공으로 40 ℃에서 건조하여 흰색 고체의 표제 화합물, 화합물 (I)(무수 자유 염기, 다형체 A)을 얻었다(16.5 g, 92 %); R^t 2.74 min (방법 2); m/z 584 (M+H)⁺ (ES⁺); ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 1.30 (9H, s), 2.41 (3H, s), 6.43 (1H, s), 6.58 (1H, d), 6.78 (1H, t), 6.97 (2H, t), 7.28 (2H, br m), 7.39 (2H, d), 7.40 (1H, d), 7.49 (2H, d), 7.56 (1H, m), 7.63 (1H, m), 7.82 (1H, dd), 7.95 (1H, d), 8.10 (1H, d), 8.40 (1H, d), 8.77 (1H, s), 9.16 (1H, br s), 9.50 (1H, br s).

실시예 2 - 시험관내 및 생체내 스크리닝 결과의 요약

여기에 기술된 화합물 (I)의 시험관내 프로파일을 상기한 방법을 사용하여 측정하였으며, 구조적으로 연관된 레퍼런스 화합물로, 이전에 항바이러스 활성을 갖는 강력한 항염증제로 기술된 N-(4-(4-(3-(3-tert-부틸-1-p-톨릴-1H-피라졸-5-일)우레이도)나프탈렌-1-일옥시)피리딘-2-일)-2-메톡시아세트아미드와 비교하여 이하(표 4a-f)에 나타내었다(Ito, K. et al ., WO 2010/112936, PCT/GB2010/050575, 2010년 10월 7일 및 Ito, K. et al ., WO 2010/067130, PCT/GB2009/051702, 2010년 6월 17일).

본 발명의 화합물은 키나제 효소 어세이 범위에서 레퍼런스 화합물에 대해 매우 유사한 저해 프로파일을 나타내었으며, 효소 GSK3α에 대해 화합물 (I)의 저해활성은 현저한 예외로, 이것은 레퍼런스 화합물과 비교하여 훨씬 더 약했다(표 4a).

본 발명 화합물 (I)의 키나제 결합 프로파일을 또한 p38 MAPK, HCK, cSrc, Syk, 및 GSK3α/β에 대해 레퍼런스 화합물과 비교하였다. 화합물 (I)은 매우 상이한 표현형을 보였으며, GSK3α에 대한 유의한 효과 없이 p38 MAPK, HCK, cSrc 및 Syk 키나제에 대해 상당한 결합 저해를 나타내었다(표 4b).

본 발명의 화합물은 TNFα 및 IL-8의 내독소 매개 방출에 대해 항염증 특성을 나타내는 세포 어세이에서 레퍼런스 화합물과 유사한 프로파일을 나타내었다(표 4c). 화합물의 프로파일은 또한 호흡기 바이러스 복제(HRV 유도 ICAM1과 CPE 발현 및 F-단백질의 RSV 자극 발현) 및 바이러스로 유도된 염증(IL-8의 HRV 유발성 방출; 표 4d)에 대한 화합물의 효과를 측정하는 세포 시스템에서 유사하였다.

본 발명의 화합물은 플루티카손 프로피오네이트인 코르티코스테로이드에 거의 무감한, COPD 환자의 가래 대식세포 및 기관지 상피세포 내 염증유발 사이토카인 생산에서 고효능을 나타내었다(표 4e).

그러나, 유리하게 화합물 (I)은 세포 생존능과 세포 분열(유사분열)에 대한 영향을 측정하는 어세이 시스템에서 현저하게 낮은 활성을 나타내어, 본 화합물이 레퍼런스 화합물보다 월등한 치료지수를 갖는 것임을 시사하였다(표 4f).

화합물 (I)을 사용한 마우스 처리에서 LPS 유도 호중구 축적에 대해 용량 의존성 저해를 확인하였고 시간 경과에 따른 실험에서는 약물 물질이 장기 지속성 활성을 갖는 것으로 나타났다(표 5).

마우스 담배연기 모델에서 BALF 내 대식세포 및 호중구 축적에 대한 화합물 (I) 처리 결과를 조사하였다(표 6a). 이 시험에 사용된 담배연기 모델은 코르티코스테로이드 내성 시스템인 것으로 보고되었고, (Medicherla S. et al ., J. Pharmacol. Exp . Ther ., 2008, 324(3):921-9), 플루티카손 프로피오네이트가 LPS 유도성 호중구 축적의 >80% 저해를 나타낸 것과 동일한 투여량인 1.75 μg/마우스(35 μL, 1일 2회, i.n.)에서 기도 내에 호중구 또는 대식세포 축적을 저해하지 않는 것을 확인하였다.

화합물 (I)을 사용한 마우스 처리에서 담배연기로 유도된 BALF 내 대식세포와 호중구 축적에 대해 용량 의존성 저해를 나타내는 것을 확인하였다.

화합물 (I)을 사용한 마우스 처리는 또한 BALF 내에서 담배연기로 유발된 CXCL1(KC) 생산을 용량 의존성 방식으로 저해하였다(표 6b).

요약하면, 이러한 결과들은 화합물 (I)이 상기한 레퍼런스 화합물과 유사한 항염증 특성을 가지며, 유리하게 우수한 치료지수와 연관되어 있음을 시사한다.

실시예 3 - 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B의 제조

화합물 (I)(398 g, 다형체 A)을 아세톤(3.98 L)에 취하여 용액을 50 ℃로 가열하였다. NORIT A SUPRA(19.9 g, 활성탄소)와 규조토(융제 소성품(flux-calcined), 3.98 g; 여과제)를 첨가하고, 혼합물을 환류(56 ℃)로 15분 동안 가열하였다. 혼합물을 여과하고, 얻어진 고체를 아세톤(100 mL)으로 세척하였다. 모아진 여과액과 세척 아세톤을 환류(56 ℃)로 가온하고 900 mL의 용매를 대기압 하, 56 ℃에서 증류하여 제거하였다. 혼합물을 50 ℃로 냉각한 다음, 온도를 50 ℃로 유지하면서 물(398 mL)을 1시간 동안 첨가하였다. 50 ℃에서 추가 30분 후에 불균일 혼합물을 20 ℃로 6시간 동안 냉각하고 20 ℃에서 10시간 동안 교반하였다. 얻어진 생성물을 여과하고, 여과 케이크를 아세톤(318 mL)으로 세척하였다. 생성물을 진공으로 45 ℃에서 20시간 동안 건조하여 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체, 결정성 다형체 B를 얻었다(240.9 g; 60.5% 수율).

상기한 방법을 임의로 시딩(seeding)으로 결정화를 촉진하는데 적용할 수 있다.

실시예 3a - 잔류 용매가 감소된 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B의 제조

임의로, 상기한 방법(실시예 3) 또는 유사한 방법에 따라 제조된 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B를 다음과 같이 잔류 용매를 제거하기 위해 물에서 재슬러리할 수 있다:

화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B(230 g, 실시예 3에 따라 제조)를 탈이온수(2.30 L)에 현탁하여 20 ℃에서 4시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고 생성물을 탈이온수(2 x 115 mL)로 세척한 다음, 45 ℃에서 진공으로 건조하여 잔류 용매가 감소된 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B를 얻었다(227 g, 98.7%).

실시예 4 - 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B의 미분화

미분된 화합물 (I) 무수 자유 염기의 결정성 다형체 B는 제트밀 마이크로화 장치(수동 공급기를 사용한 1.5 bar와 1.5 bar의 인젝터 압력)(Hosokawa Alpine 제조)를 사용하여 제조하였다. 입자크기분포를 레이저 회절을 사용하여 측정하였다(Malvern Mastersizer 2000S instrument). 입자크기분포는 D₁₀, D₅₀ 및 D₉₀ 값을 사용하여 나타낼 수 있다. 입자크기분포의 D₅₀ 중앙값은 분포를 절반으로 나눈 입자크기(마이크론)로 정의된다. 레이저 회절에서 유도된 측정은 부피 분포로 더 정확하게 기술되며, 결과적으로 이 방법을 사용하여 얻어진 D₅₀값은 더 의미있게 Dv₅₀값(부피 분포의 중앙값(median))으로 지칭된다. 여기서 사용된 Dv값은 레이저 회절을 사용하여 측정된 입자크기분포를 지칭한다. 마찬가지로, 레이저 회절이란 문맥에서 사용된 D₁₀ 및 D₉₀ 값은 평균 Dv₁₀ 및 Dv₉₀ 값이 되고, 각각 10%의 분포가 D₁₀값 미만에 있고, 90%의 분포가 D₉₀값 미만에 있는 입자크기를 지칭한다. 화합물 (I) 무수 자유 염기의 미분된 결정성 다형체 B는 다음과 같은 입자크기분포를 가졌다: 0.850 μm의 D₁₀; 1.941 μm의 D₅₀ 및 4.563 μm의 D₉₀.

실시예 5 - 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 A 및 B의 XRPD 분석

화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 A 및 B의 XRPD 분석(다형체 B는 실시예 4의 방법에 따라 미분하였다)을 일반적 방법에 기술된 방법을 사용하여 수행하였다. 얻어진 회절 패턴을 도 1과 2에 각각 나타내었다. 두 XRPD 패턴은 할로의 존재가 없는 회절 피크를 나타내었고, 따라서 두 물질이 결정체임을 시사하였다. 피크와 그의 강도를 이하에 열거하였다(표 7a 및 표 7b).

실시예 6 - 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 A 및 B의 녹는점 측정

화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 A 및 B(후자는 미분하여 사용되었다)의 녹는점을 일반적 방법에 기술된 시차주사열량측정법(DSC)을 사용하여 얻었다. 다형체 A는 191.6 ℃에서 용융되었고 다형체 B는 214.0 ℃에서 용융되었다. DSC 데이터로부터 형태 B가 형태 A보다 더 높은 융합열을 갖는 것으로 계산되었다. 형태 B는 또한 형태 A보다 녹는점이 더 높기 때문에 이는 다형체 A 및 B가 관련된 단향성(monotropic)임을 나타내고, 녹는점이 더 높은 다형체 B가 모든 온도에서 녹는점이 낮은 다형체 A보다 더 안정한 것을 의미한다. 이처럼, 다형체 B는 다형체 A보다 열역학적으로 더 안정한 것으로 예상할 수 있다.

실시예 7 - 미분된 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B의 열 분석

(미분된)화합물 (I) 무수 자유 염기의 결정성 다형체 B의 열 분석을 일반적 방법에 기술된 TGA, DVS, XRPD 분석, IR 분광학 및 DSC를 사용하여 수행하였다. 적절한 경우, 주위 온도 및 상대 습도 하의 샘플(레퍼런스 샘플/"0 일")을 다양한 온도와 상대 습도에 저장된 샘플(비교 샘플)과 비교하였다.

열중량 분석: 분석 전에 상이한 저장 조건에 노출된 레퍼런스 샘플(t = 0)과 비교 샘플을 20 ℃/min의 속도로 RT에서 300 ℃까지 가열하였다. 레퍼런스 샘플(t = 0)의 TGA 곡선을 도 3에 나타내었고 모든 샘플의 결과를 이하에 요약하였다(표 8). 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 0.6%의 중량 손실이 RT 내지 180 ℃의 온도 범위에서 관찰되었으며, 이는 용매 증발에 기인한 것이다. 180 ℃ 초과에서 발생된 중량 손실은 생성물의 증발과 분해 때문이었다. 표 8의 비교 샘플들과 이러한 중량 손실 프로파일을 비교한 결과, 유의한 차이는 관찰되지 않았다.

동적 증기 수착: 미분된 레퍼런스 샘플의 DVS 등온 플롯을 도 4에 나타내고 미분된 레퍼런스 샘플의 질량 플롯의 DVS 변화를 도 5에 나타내었다. 초기 건조단계 동안, 중량 손실은 기록되지 않았고 생성물은 흡습 양태를 나타내지 않았다. 생성물은 대기 습도에 따라 최대 0.4%의 수분을 흡수하였다. 생성물이 완전히 건조된 것을 확인하였고 시험하는 동안 IR 스펙트럼으로 입증된 것과 동일한 결정성 고체 상태(형태 B)를 유지하였으며 XRPD 패턴은 DVS 분석 전후와 실질적으로 동일하였다.

XRPD 분석 및 IR 분광광도법: 레퍼런스 샘플(t = 0)의 XPRD 회절 패턴을 도 2에 나타내었으며 IR 결과를 도 6에 나타내었다. 회절 패턴과 IR 결과를 (상이한 저장 조건에 노출한) 비교 샘플들과 비교하였고, 그 결과를 표 8에 요약하였다. 회절 패턴과 IR 결과는 모든 샘플에 대해 동일하였다.

시차주사열량측정법: 미리 상이한 저장 조건에 노출된 레퍼런스 샘플(t = 0)과 비교 샘플을 10 ℃/min의 속도로 25 ℃에서 300 ℃까지 가열하였다. 레퍼런스 샘플의 DSC 곡선을 도 7에 나타내었고 모든 샘플에 대한 결과를 이하에 요약하였다(표 8). 도 7로부터, 레퍼런스 샘플이 용융하여 214.0 ℃에서 분해되는 것이 명확하였다.

요약하면, 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B가 양호한 물리적 안정성을 가지는 것이 분명하다.

실시예 8 - 미분된 화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B의 HPLC 분석

화합물 (I) 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B의 화학적 안정성을 미분한 후에 주위 온도와 상대 습도에서 유지된 샘플(레퍼런스 샘플)과 위에서 설정된 다양한 온도와 상대 습도에서 저장된 샘플(비교 샘플, 표 8)을 비교하여 측정하였다. 이후, 레퍼런스 및 비교 샘플을 HPLC에 의해 일반적 방법에서 기술된 방법과 육안 검사를 사용하여 분석하였다. 이 시험의 결과(표 9에 요약된 데이터)로부터 무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B로 제조된 화합물 (I)이 빛에 대한 약간의 민감성이 관찰되었으나 화학적으로 안정한 것으로 나타났다.

실시예 9 - 약학 제제의 제조

본 발명의 약학 제제는, 예를 들어 0.4 wt.%의 화합물 (I)(무수 자유 염기의 고체 결정성 다형체 B), 98.6 wt.%의 락토스 1수화물(흡입 등급) 및 1.0 wt.%의 마그네슘 스테아레이트를 포함하고, 여기에서 모든 성분의 wt.%는 건조 약학 제제의 중량을 기준으로 한다.

문맥상 달리 해석되지 않는 한, 본 발명의 명세서 및 청구범위를 통해 용어 "포함하다"와 "포함하는"과 같은 그의 변형어는 언급된 정수, 단계, 정수군 또는 단계군을 포함하는 의미이나, 기타 다른 정수, 단계, 정수군 또는 단계군을 배제하지는 않는 것으로 이해되어야 한다.

여기에서 언급된 모든 특허 및 특허출원은 그 전체가 참고로 본 원에 포함되어 있다.

Claims

화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 그의 모든 입체이성체와 토토머를 포함하는, 만성 호흡기 질환 환자에서 악화의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 흡입용 건조 분말 약제학적 제제:

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제1항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 유리 염기 형태인 건조 분말 약제학적 제제.
제1항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 무수 유리 염기 형태인 건조 분말 약제학적 제제.
제1항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 하기 나타낸 X-선 분말 회절 패턴을 갖는 고체 결정성 다형체 형태 A의 무수 유리 염기인 건조 분말 약제학적 제제:

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제4항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 (± 0.2) 7.8, 8.7, 10.3, 11.2, 12.4, 15.2, 16.2, 17.5, 19.7, 20.8, 22.6, 23.1, 24.6, 25.5, 26.7 및 27.4 도 2-쎄타(theta)에서의 피크를 함유하는 X-선 분말 회절 패턴을 갖는 고체 결정성 다형체 형태 A의 무수 유리 염기인 건조 분말 약제학적 제제.
제1항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 하기 나타낸 X-선 분말 회절 패턴을 갖는 고체 결정성 다형체 형태 B의 무수 유리 염기인 건조 분말 약제학적 제제:

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제6항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 (± 0.2) 3.9, 6.1, 7.7, 8.6, 10.9, 11.8, 12.7, 14.3, 15.9, 16.7, 18.3, 18.7, 19.9, 20.9, 22.0, 22.6, 25.2 및 28.9 도 2-쎄타(theta)에서의 피크를 함유하는 X-선 분말 회절 패턴을 갖는 고체 결정성 다형체 형태 B의 무수 유리 염기인 건조 분말 약제학적 제제.
제1항에 있어서, 락토스를 추가로 포함하는 건조 분말 약제학적 제제.
제8항에 있어서, 락토스가 락토스 모노하이드레이트(1수화물)인 건조 분말 약제학적 제제.
제1항에 있어서, 스테아린산의 금속염 미립자를 추가로 포함하는 건조 분말 약제학적 제제.
제10항에 있어서, 스테아린산의 금속염 미립자가 마그네슘 스테아레이트인 건조 분말 약제학적 제제.