KR102055176B1 - 암 치료용 키나제 저해제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암 치료용 키나제 저해제에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 암 치료에서 아미노아세토니트릴 유도체 (AAD)의 용도에 관한 것이다.
Description
일반적으로, 본 발명은 암 치료용 키나제 저해제에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 암 치료에서 아미노아세토니트릴 유도체 (AAD)의 용도에 관한 것이다.
아미노아세토니트릴 유도체 (AAD)는 약물-내성 선충에 대해 효과적인 구충제 부류이다. 선충, 또는 회충은 인간 및 가축의 다수 병원체를 포함한다. 위장 선충, 예컨대 헤몬쿠스 콘토르투스 (Haemonchus contortus)는 전세계적으로 축산에 상당한 경제적 손실을 입히는 반추 동물의 주요 기생충이다.
모네판텔 (MPL) (N-[(1S)-1-시아노-2-(5-시아노-2-트리플루오로메틸페녹시)-1-메틸에틸]-4-트리플루오로메틸설파닐벤즈아미드)는 이러한 AAD의 일례이며, 양의 위장 기생충을 치료하기 위한 살선충제로서 승인되었다.
MPL은 다양한 종류의 가축-병원성 선충에 대해 효과가 입증되었다.
살선충제로서, MPL은 리간드-개폐형 이온 채널에 영향을 미쳐 신경근 시냅스에서 신호 전달을 방해한다. 이어 영향을 받은 기생충은 근수축 조절장애, 마비, 괴사 및 탈피 결함을 겪을 것이다. 3개의 니코틴 아세틸콜린 수용체 (nAChR) 관련 유전자가 MPL의 주요 표적으로서 규명되었으며, 세 유전자 모두 선충에만 존재하는 nAChR 서브유닛의 DEG-3 서브패밀리를 이루는 단백질을 코딩한다. DEG-3 유전자는 제2 막관통 도메인내 α7 서브유닛의 것과 유사성을 지닌 nAChR α-서브유닛을 코딩한다.
놀랍게도, AAD가 암 치료에도 효과적인 것으로 본 발명에 의해서 밝혀졌다. 과거 50 년동안 의약에서 가장 도전적인 것중의 하나는 정상 조직에 해를 끼치지 않으면서 종양 세포를 효과적으로 죽일 수 있는 약물을 규명하는 것이었다. 알려진 거의 모든 부류의 항암 약물의 부작용 측면 때문에, 특히 후기에 약물에 대한 내성이 보통 발생하는 경우 암 환자를 치료하기 위한 의사의 능력이 결정적으로 제한된다. 벤즈이미다졸과 같은 다른 항구충 약물이 암성 세포의 증식 및 발달을 제어하는데 효과적이라고 보고되었지만, 놀랍게도 화학식 (I)의 화합물, 예컨대 MPL의 항암 활성 및 낮은 독성은 제한된 부작용을 가져 암 치료에 훨씬 유연한 투여 방식을 가능케 한다.
발명의 개요
본 발명의 제1 측면에 따라, 하나 이상의 암의 치료 방법이 제공되며, 이 방법은 치료적 유효량의 화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 대사산물, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 프로드럭을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다:
상기 식에서,
R1, R2 및 R3 및 R5는 각각 독립적으로 H, 알킬, 할로겐, -CF3 또는 -CN중에서 선택되고;
R4 및 R6은 각각 독립적으로 H, 알킬, 할로겐, 알콕시, -CF3, -OCF3, -SO2CF3, -SOCF3, 또는 -S-CF3중에서 선택되고;
X는 헤테로원자, N(알킬) 또는 NH이고;
n은 1 내지 20이다.
바람직하게는, R1은 -CN, H 또는 할로겐이다. 더욱 바람직하게는, R1은 -CN이다. 바람직하게는, R2는 H 또는 할로겐이다. 더욱 바람직하게는, R2는 H이다. 바람직하게는, R3은 -CF3 또는 할로겐이다. 더욱 바람직하게는, R3은 -CF3이다. 바람직하게는, R4는 -S-CF3, -SOCF3, -SO2CF3, -OCF3 또는 -CF3이다. 더욱 바람직하게는, R4는 -S-CF3 또는 -SO2CF3이다. 바람직하게는, R5는 H이다. 바람직하게는, X는 O이다. 바람직하게는, n은 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 2, 또는 1. 더욱 바람직하게는, n은 1이다. 바람직하게는, R4는 아미드 부분에 대해 파라에 위치한다.
화학식 (I)의 화합물은 (R)- 또는 (S)-에난티오머 또는 라세메이트일 수 있다. 바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 (S)-에난티오머이다.
바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 다음 화합물중 어느 하나에서 선택된다:
상기 각 화합물은 (R)- 또는 (S)-에난티오머, 또는 라세메이트, 또는 그의 대사산물, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 프로드럭이다.
바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 MPL (N-[(1S)-1-시아노-2-(5-시아노-2-트리플루오로메틸페녹시)-1-메틸에틸]-4-트리플루오로메틸설파닐벤즈아미드):
또는 그의 대사산물, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 프로드럭이다.
바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 모네판텔 설폰 (MPL-SO2):
또는 그의 대사산물, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 프로드럭이다.
또한 바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 다음 화합물중 어느 하나에서 선택된다:
또는 그의 대사산물, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 프로드럭.
바람직하게는, 암은 키나제와 관련된다.
바람직하게는, 키나제는 사이클린-의존성 키나제, 및 더욱 바람직하게는, cdk2 또는 cdk4이다.
바람직하게는, 키나제와 관련되는 암은 다음중에서 선택된다: 방광, 유방, 결장, 중피종, 신장, 간, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암을 포함한 폐, 두경부, 식도, 담낭, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선, 및 편평 세포 암종을 포함한 피부의 것을 포함한 암종; 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발 세포 림프종, 맨틀 세포 림프종, 골수종, 및 버킷 림프종을 포함한 림프 계통의 조혈 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 전골수성 백혈병을 포함한 골수 계통의 조혈 종양; 지방육종, GIST, 섬유육종 및 횡문근육종을 포함한 간엽 기원의 종양; 성상세포종, 신경아세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함한 중추 및 말초 신경계 종양; 및 흑색종, 정상피종, 기형암종, 골육종, 색소성 건피증, 각질극 세포종(keratoctanthoma), 갑상선 여포성 암 및 카포시 육종을 포함한 기타 종양.
바람직하게는, 치료될 암은 난소, 유방, 전립선 또는 중피종 암중에서 선택되고, 가장 바람직하게는 치료될 암은 난소암이다.
본 발명의 제2 측면으로, 하나 이상의 키나제 관련 암 치료 약제의 제조에서 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 대사산물, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 프로드럭의 용도가 제공된다:
상기 식에서,
R1, R2 및 R3 및 R5는 각각 독립적으로 H, 알킬, 할로겐, -CF3 또는 -CN중에서 선택되고;
R4 및 R6은 각각 독립적으로 H, 알킬, 할로겐, 알콕시, -CF3, -OCF3, -SO2-CF3, -SO-CF3 또는 -S-CF3중에서 선택되고;
X는 헤테로원자, N(알킬) 또는 NH이고;
n은 1 내지 20이다.
본 발명의 제3 측면으로, 하나 이상의 키나제 관련 암의 치료에 사용하기 위한 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 대사산물, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 프로드럭이 제공된다:
상기 식에서,
R1, R2 및 R3 및 R5는 각각 독립적으로 H, 알킬, 할로겐, -CF3 또는 -CN중에서 선택되고;
R4 및 R6은 각각 독립적으로 H, 알킬, 할로겐, 알콕시, -CF3, -OCF3, -SO2-CF3, -SO-CF3 또는 -S-CF3중에서 선택되고;
X는 헤테로원자, N(알킬) 또는 NH이고;
n은 1 내지 20이다.
도 1은 MPL에 의한 세포 증식의 저해를 나타낸다. 난소암 세포주 OVCAR-3, A2780 및 SKOV-3 및 정상 HUVEC (대조군)를 모두 MPL (0, 1, 5, 10, 25, 50 및 100 μmol/L)의 존재하에 72 시간동안 배양하였다. 세포 증식에 대한 MPL의 효과를 SRB 어세이를 이용하여 평가하였다. 대조 (비히클 처리) 세포를 100% 증식을 제공하는 것으로 취하고, MPL 처리 그룹을 대조군에 대한 퍼센트로서 나타내었다. 각 약물 농도를 사중으로 시험하고, 각 실험을 적어도 2회 반복하였다. 데이터 (평균±SEM)는 대조군에 대한 퍼센트로서 표시된다. 통계적 비교를 위해, 각 약물 처리 그룹을 스튜던트 t 검정을 이용하여 대조 그룹과 비교하였다.
도 2는 OVCAR-3 세포의 콜로니 형성 활성에 대한 MPL의 효과를 나타낸다. 세포를 MPL (0, 5, 10 및 25 μmol/L)과 72 시간동안 인큐베이션한 후, 세포를 세척하고, 한천 플레이트로 옮겨 그의 일반 증식 배지로 배양하고, 표준 조건하에서 2 주간 인큐베이션하였다. 이어 세포를 100% 메탄올로 고정하고, 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 콜로니 (50 초과의 세포 클러스터)를 현미경 (5 배율) 하에 계수하였다. 상이한 실험 그룹에 대해 계수된 콜로니의 수를 대조군에 대한 퍼센트로서 표시하였다.
도 3은 MPL이 난소암 세포주의 세포 주기 분포에 어떻게 간섭하는지를 나타낸다. OVCAR-3 (도 3a) 또는 A2780 (도 3b) 세포를 MPL (0, 5, 10 및 25 μmol/L)로 48 시간동안 처리하였다. 프로포듐 요오다이드 염색 세포를 유세포계수 분석을 이용하여 DNA 함량에 대해 분석하였다. 결과 (표 참조)를 G1, S 및 G2/M 상에서의 세포 퍼센트로 나타내었다. 각각의 값은 두 독립 실험의 평균±SEM을 나타낸다.
도 4는 MPL이 세포 주기 조절 단백질 cdk2, cdk4 및 사이클린 E 및 A의 발현에 어떻게 간섭하는지를 나타낸다. 세포를 MPL (0, 5, 10 및 25 μmol/L)로 48 시간동안 처리하였다. 전체-단백질 추출물을 얻고, 전기이동으로 분리한 후, 면역블롯을 지정 항체로 프로빙하였다. 각 추출물에서 이들 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯 분석을 관련 항체를 사용하여 분석하였다. 이미지는 스캔된 노출 방사선 투과 필름을 나타낸다. 하우스 키핑 유전자 (GAPDH)를 사용하여 유사 단백질 로딩 및 블롯 이동을 확인하였다.
도 5는 MPL 처리 세포에서 PARP 및 절단된 PARP의 면역블롯 분석을 나타낸다. 세포 배양 조건하에 증식시킨 OVCAR-3 및 A2780 세포를 다양한 농도의 MPL [0, 5, 10, 25 μM]과 24, 48 또는 72 시간동안 인큐베이션하였다. 이어, 세포 용해물을 준비하고, PARP 및 절단된 PARP의 결정을 위해 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.
도 6은 A2780 난소암 세포를 MPL로 처리하거나, 또는 U87 신경교종 세포를 MPL-SO2로 처리하면 액포 형성으로 이어지는 것을 나타내는데, 이는 MPL 및 MPL-SO2가 이들 세포에서 자식작용을 유도함을 제안한다.
도 6에 도시된 것과 일치하는 도 7은 MPL 처리가 세포 자식작용의 또다른 지표인 ADP/ATP의 세포비를 감소시킴을 나타낸다.
도 8은 MPL이 세포 생존성에 간섭함을 나타낸다. A) MPL (0, 5, 10, 25 μM)에 72 시간 노출된 OVCAR-3 세포의 현미경 이미지. 인간 난소암 세포주 OVCAR-3, A2780, SKOV-3, IGROV-1을 MPL (0, 5, 10, 25, μmol/L)의 존재하에 72 시간 배양하였다. 세포 생존성에 대한 MPL의 효과를 표준 트립판 블루 어세이를 이용하여 평가하였다. 대조 (비히클 처리) 세포를 100% 생존성을 제공하는 것으로 취하고, MPL 처리 그룹을 대조군에 대한 퍼센트로 나타내었다. 각 약물 농도를 사중으로 시험하고, 각 실험을 적어도 2회 반복하였다. 데이터 (평균±SEM)는 대조군에 대한 퍼센트로서 표시된다. 통계적 비교를 위해, 각 약물 처리 그룹을 스튜던트 t 검정을 이용하여 대조 그룹과 비교하였고, p 값이 0.5 이하이면 유의적인 변화가 있는 것으로 간주한다 (p<0..5), * = <0.05, ** < 0.01, *** = p< 0.001.
도 9는 정상 세포의 생존성에 대한 MPL의 효과를 나타내고, MPL의 항증식 효과는 암 세포 배향적임을 나타낸다. 정상 세포 HOSE, CHO, HEK 및 HUVEC를 MPL (0, 5, 10, 25, μmol/L)의 존재하에 72 시간동안 배양하였다. 세포 생존성에 대한 MPL의 효과를 표준 트립판 블루 어세이를 이용하여 평가하였다. 결과를 대조군 (100%)에 대한 평균±SEM으로 나타내었다.
도 10은 MPL이 세포 증식을 어떻게 저해하는지를 나타낸다. 인간 난소암 세포주 OVCAR-3 , A2780 및 SKOV-3 및 IGROV-1을 모두 MPL (0, 5, 10, 25, 50 및 100 μmol/L)의 존재하에 72 시간동안 배양하였다. 세포 증식에 대한 MPL의 효과를 SRB 어세이를 이용하여 평가하였다. 대조 (비히클 처리) 세포를 100% 증식을 제공하는 것으로 취하고, MPL 처리 그룹을 대조군에 대한 퍼센트로서 표시하였다. 각 약물 농도를 사중으로 시험하고, 각 실험을 적어도 2회 반복하였다. 데이터 (평균±SEM)는 대조군에 대한 %로서 표시된다. 통계적 비교를 위해, 각 약물 처리 그룹을 스튜던트 t 검정을 이용하여 대조 그룹과 비교하였다. (A): 아트로핀: 무스카린성 Ach. 수용체 길항제, 토부코라린: 니코틴성 Ach. 수용체 길항제, 메카밀라민: 비선택적, 비경쟁적 니코틴성 수용체 길항제; (B): 카바콜: 무스카린 니코틴성 ach. 수용체 작용제, 니코틴: 니코틴성 ach. 수용체 작용제, 알파-붕가로톡신: 선택적 α7, 니코틴성 ach 수용체 작용제.
도 11은 MPL 항증식 효과가 니코틴성 수용체에 독립적임을 나타낸다. 세포를 증가 농도의 니코틴, 카바콜 또는 수용체 길항제, 아트로핀, 메카밀라민, 투보쿠라린, 및 α-붕가로톡신으로 예비처리하였다 (30 분). MPL (5 μM)을 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에 72 시간 두었다. 각 약물 농도를 사중으로 시험하고, 각 실험을 2회 반복하였다. 결합값 (평균±SEM)은 대조군에 대한 %로서 표시된다.
도 12는 MPL이 신경교종 세포의 증식을 어떻게 저해하는지를 나타낸다. 정상 세포 배양 조건하에 SRB 증식 어세이를 이용한 U87-MG, U251 신경교종 세포주 대 정상 성상세포의 증식에 대한 MPL 처리 (0, 5, 10, 25, 50 μM; 72 시간)의 효과. 데이터는 대조군에 대한 %로서 표시된다.
도 13은 MPL이 자식작용을 어떻게 유도하는지를 나타낸다. 화학적-내성 (chemo-resistant) U87 신경교종 세포를 MPL로 처리하면 자식작용이 생기고, 이는 농도-의존적 방식의 LC3-II 발현 증가로 확인된다. MPL로 처리된 U87-MG 및 U251 신경교종 세포는 자식작용을 농도-의존적으로 형성하는 것으로 입증되었다 (액포로서 나타남). LC3-I의 LC3-II로의 농도-의존적 전환은 이들 세포에서 자식작용 현상의 증가를 보여준다.
도 14는 OVCAR-3 및 A2780 세포의 콜로니 형성 활성에 대한 MPL의 효과를 나타낸다. 세포를 MPL (0, 5, 10, 25 μM)과 72 시간동안 인큐베이션한 후, 세포를 세척하고, 한천 플레이트로 옮겨 그의 일반 증식 배지로 배양하고, 표준 조건하에서 2 주간 인큐베이션하였다. 이어 세포를 100% 메탄올로 고정하고, 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 콜로니 (50 초과의 세포 클러스터)를 현미경 (5 배율) 하에 계수하였다. 상이한 실험 그룹에 대해 계수된 콜로니의 수를 대조군에 대한 퍼센트로서 표시하였다.
도 15는 MPL이 난소암 세포주의 세포 주기 진행에 어떻게 간섭하는지를 나타낸다. OVCAR-3 또는 A2780 세포를 MPL (0, 5, 10, 25 μM)로 48 시간동안 처리하고, 세포를 PI로 염색한 후, 유세포계수 분석 (FACS)으로 검사하였다. 도면과 다양한 세포 주기상에서 세포 분포에 MPL-유도 변화를 제공하는 데이터는 G1, S 및 G2/M 상에서의 세포의 퍼센트로서 나타내었다. 각 값은 독립 결정의 평균±SEM을 나타낸다.
도 16은 MPL이 세포 주기 조절 단백질 cdk2, cdk4, 사이클린 E 및 A의 발현에 어떻게 간섭하는지를 나타낸다. 세포를 MPL (0, 5, 10, 25 μM)로 24, 48 또는 72 시간동안 처리하였다. 전체-단백질 추출물을 얻고, 전기이동으로 분리한 후, 면역블롯을 지정 항체로 프로빙하였다. 각 추출물에서 이들 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯 분석을 관련 항체를 사용하여 분석하였다. 이미지는 스캔된 노출 방사선 투과 필름을 나타낸다. 하우스 키핑 유전자 (GAPDH)를 사용하여 유사 단백질 로딩 및 블롯 이동을 확인하였다.
도 17은 MPL이 어떻게 PARP를 절단하는지를 나타낸다. OVCAR-3 또는 A2780 세포를 MPL (0, 5, 10, 25 μM)에 24, 48 또는 72 시간동안 노출하면 PARP이 절단되어 세포 분해되고 사멸 세포의 마커로서 제공된다.
도 18A 및 18B는 MPL이 ATP 수준을 어떻게 감소시키는지를 나타낸다. OVCAR-3 또는 A2780 세포를 MPL (0, 5, 10, 25 μM)에 24, 48 또는 72 시간동안 노출하면 PARP이 절단되어 세포 분해되고 사멸 세포의 마커로서 제공된다.
도 19는 누드 마우스에서 i.p. (복강내) 투여된 모네판텔이 s.c. (피하) 종양 증식에 미치는 효과를 나타낸다. 이백오십만 대수기 증식 OVCAR-3 세포를 각 마우스의 좌측 옆구리에 s.c. 주사하였다. 종양 증식을 캘리퍼스 측정으로 모니터링하고, 직교 직경을 측정하여 종양 용적을 결정하였다. 결정된 종양 용적을 식 1/2 (길이×너비2)에 기초해 계산하였으며, 여기서 너비는 두 직교 측정치의 더 짧은 것이다. 종양 세포 주사 7 일 후 처리를 시작하였는데, 그 전에 마우스를 처리 또는 대조 그룹 (그룹당 6 마리)으로 무작위로 할당하였다. 0.5% HPMC에 현탁시킨 모네판텔을 2.5 또는 25 mg/kg으로 주 3회 i.p. 투여하였다. 대조 그룹은 비히클로만 처리하였다.
도 20은 누드 마우스에서 i.p. 투여된 모네판텔이 s.c. 종양 증식에 미치는 효과를 나타낸다. 대수기 증식 OVCAR-3 세포를 각 마우스의 좌측 옆구리에 s.c. 주사하였다. 종양 증식을 캘리퍼스 측정으로 모니터링하고, 직교 직경을 측정하여 종양 용적을 결정하였다. 결정된 종양 용적을 식 1/2 (길이×너비2)에 기초해 계산하였으며, 여기서 너비는 두 직교 측정치의 더 짧은 것이다. 종양 세포 주사 7 일 후 처리를 시작하였는데, 그 전에 마우스를 처리 또는 대조 그룹 (그룹당 6 마리)으로 무작위로 할당하였다. 0.5% HPMC에 현탁시킨 모네판텔을 2.5 또는 25 mg/kg으로 주 3회 i.p. 투여하였다. 대조 그룹은 비히클로만 처리하였다.
도 21은 누드 마우스에서 경구 투여된 모네판텔이 종양 증식에 미치는 효과를 나타낸다. OVCAR-3 세포를 각 마우스의 좌측 옆구리에 s.c. 주사하였다. 종양 증식을 캘리퍼스 측정으로 모니터링하고, 직교 직경을 측정하여 종양 용적을 결정하였다. 결정된 종양 용적을 식 1/2 (길이×너비2)에 기초해 계산하였으며, 여기서 너비는 두 직교 측정치의 더 짧은 것이다. 종양 세포 주사 7 일 후 처리를 시작하였는데, 그 전에 마우스를 처리 또는 대조 그룹 (그룹당 6 마리)으로 무작위로 할당하였다. 0.5% HPMC에 현탁시킨 모네판텔을 50 또는 100 mg/kg으로 주 3회 경구 투여하였다 (100 ㎕). 대조 그룹은 비히클로만 처리하였다.
도 19 내지 21은 일반적으로 암컷 누드 마우스에서 s.c. 이종이식에 대한 MPL의 효과를 나타낸다. 마우스의 좌측 옆구리에 이백오십만 대수기 증식 인간 OVCAR-3 세포를 접종하였다. 종양 증식을 캘리퍼스 측정으로 모니터링하고, 직교 직경을 측정하여 종양 용적을 결정하였다. 결정된 종양 용적을 식 1/2 (길이×너비2)에 기초해 계산하였으며, 여기서 너비는 두 직교 측정치의 더 짧은 것이다. 종양 세포 주사 7 일 후 처리를 시작하였는데, 그 전에 마우스를 처리 또는 대조 그룹 (그룹당 5-6 마리)으로 무작위로 할당하였다. 0.5% HPMC에 현탁시킨 모네판텔을 2.5 또는 25 mg/kg (도 19), 25 및 50 mg/kg으로 i.p. 투여 (도 20) 또는 50 및 100 mg/kg으로 경구 투여하였는데, 모두 주 3회 투여되었다. 대조 그룹 마우스에는 동일 부피의 0.5% HPMC를 똑같은 방식 및 횟수로 투여하였다.
도 22는 MPL이 종양 조직에서 괴사를 어떻게 유도하는지를 나타낸다. 누드 마우스내 피하 이종이식편으로부터의 종양 조직을 50 또는 100 mg/kg/일로 격일에 경구 투여되는 MPL로 처리하였다. 종양의 조직학적 이미지를 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 나타내었는데 (H&E; 상부열), 상당한 약물-유도 괴사를 나타내었다 (검은 화살표; 10 배율). MPL 처리 마우스로부터 절개된 종양으로부터 종양 조직학의 대표적인 이미지는 100 mg/kg의 고용량 (s.c. 종양, 경구 처리, 2 주동안 주 3회)에서 대규모 괴사를 나타내었다.
도 2는 OVCAR-3 세포의 콜로니 형성 활성에 대한 MPL의 효과를 나타낸다. 세포를 MPL (0, 5, 10 및 25 μmol/L)과 72 시간동안 인큐베이션한 후, 세포를 세척하고, 한천 플레이트로 옮겨 그의 일반 증식 배지로 배양하고, 표준 조건하에서 2 주간 인큐베이션하였다. 이어 세포를 100% 메탄올로 고정하고, 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 콜로니 (50 초과의 세포 클러스터)를 현미경 (5 배율) 하에 계수하였다. 상이한 실험 그룹에 대해 계수된 콜로니의 수를 대조군에 대한 퍼센트로서 표시하였다.
도 3은 MPL이 난소암 세포주의 세포 주기 분포에 어떻게 간섭하는지를 나타낸다. OVCAR-3 (도 3a) 또는 A2780 (도 3b) 세포를 MPL (0, 5, 10 및 25 μmol/L)로 48 시간동안 처리하였다. 프로포듐 요오다이드 염색 세포를 유세포계수 분석을 이용하여 DNA 함량에 대해 분석하였다. 결과 (표 참조)를 G1, S 및 G2/M 상에서의 세포 퍼센트로 나타내었다. 각각의 값은 두 독립 실험의 평균±SEM을 나타낸다.
도 4는 MPL이 세포 주기 조절 단백질 cdk2, cdk4 및 사이클린 E 및 A의 발현에 어떻게 간섭하는지를 나타낸다. 세포를 MPL (0, 5, 10 및 25 μmol/L)로 48 시간동안 처리하였다. 전체-단백질 추출물을 얻고, 전기이동으로 분리한 후, 면역블롯을 지정 항체로 프로빙하였다. 각 추출물에서 이들 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯 분석을 관련 항체를 사용하여 분석하였다. 이미지는 스캔된 노출 방사선 투과 필름을 나타낸다. 하우스 키핑 유전자 (GAPDH)를 사용하여 유사 단백질 로딩 및 블롯 이동을 확인하였다.
도 5는 MPL 처리 세포에서 PARP 및 절단된 PARP의 면역블롯 분석을 나타낸다. 세포 배양 조건하에 증식시킨 OVCAR-3 및 A2780 세포를 다양한 농도의 MPL [0, 5, 10, 25 μM]과 24, 48 또는 72 시간동안 인큐베이션하였다. 이어, 세포 용해물을 준비하고, PARP 및 절단된 PARP의 결정을 위해 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다.
도 6은 A2780 난소암 세포를 MPL로 처리하거나, 또는 U87 신경교종 세포를 MPL-SO2로 처리하면 액포 형성으로 이어지는 것을 나타내는데, 이는 MPL 및 MPL-SO2가 이들 세포에서 자식작용을 유도함을 제안한다.
도 6에 도시된 것과 일치하는 도 7은 MPL 처리가 세포 자식작용의 또다른 지표인 ADP/ATP의 세포비를 감소시킴을 나타낸다.
도 8은 MPL이 세포 생존성에 간섭함을 나타낸다. A) MPL (0, 5, 10, 25 μM)에 72 시간 노출된 OVCAR-3 세포의 현미경 이미지. 인간 난소암 세포주 OVCAR-3, A2780, SKOV-3, IGROV-1을 MPL (0, 5, 10, 25, μmol/L)의 존재하에 72 시간 배양하였다. 세포 생존성에 대한 MPL의 효과를 표준 트립판 블루 어세이를 이용하여 평가하였다. 대조 (비히클 처리) 세포를 100% 생존성을 제공하는 것으로 취하고, MPL 처리 그룹을 대조군에 대한 퍼센트로 나타내었다. 각 약물 농도를 사중으로 시험하고, 각 실험을 적어도 2회 반복하였다. 데이터 (평균±SEM)는 대조군에 대한 퍼센트로서 표시된다. 통계적 비교를 위해, 각 약물 처리 그룹을 스튜던트 t 검정을 이용하여 대조 그룹과 비교하였고, p 값이 0.5 이하이면 유의적인 변화가 있는 것으로 간주한다 (p<0..5), * = <0.05, ** < 0.01, *** = p< 0.001.
도 9는 정상 세포의 생존성에 대한 MPL의 효과를 나타내고, MPL의 항증식 효과는 암 세포 배향적임을 나타낸다. 정상 세포 HOSE, CHO, HEK 및 HUVEC를 MPL (0, 5, 10, 25, μmol/L)의 존재하에 72 시간동안 배양하였다. 세포 생존성에 대한 MPL의 효과를 표준 트립판 블루 어세이를 이용하여 평가하였다. 결과를 대조군 (100%)에 대한 평균±SEM으로 나타내었다.
도 10은 MPL이 세포 증식을 어떻게 저해하는지를 나타낸다. 인간 난소암 세포주 OVCAR-3 , A2780 및 SKOV-3 및 IGROV-1을 모두 MPL (0, 5, 10, 25, 50 및 100 μmol/L)의 존재하에 72 시간동안 배양하였다. 세포 증식에 대한 MPL의 효과를 SRB 어세이를 이용하여 평가하였다. 대조 (비히클 처리) 세포를 100% 증식을 제공하는 것으로 취하고, MPL 처리 그룹을 대조군에 대한 퍼센트로서 표시하였다. 각 약물 농도를 사중으로 시험하고, 각 실험을 적어도 2회 반복하였다. 데이터 (평균±SEM)는 대조군에 대한 %로서 표시된다. 통계적 비교를 위해, 각 약물 처리 그룹을 스튜던트 t 검정을 이용하여 대조 그룹과 비교하였다. (A): 아트로핀: 무스카린성 Ach. 수용체 길항제, 토부코라린: 니코틴성 Ach. 수용체 길항제, 메카밀라민: 비선택적, 비경쟁적 니코틴성 수용체 길항제; (B): 카바콜: 무스카린 니코틴성 ach. 수용체 작용제, 니코틴: 니코틴성 ach. 수용체 작용제, 알파-붕가로톡신: 선택적 α7, 니코틴성 ach 수용체 작용제.
도 11은 MPL 항증식 효과가 니코틴성 수용체에 독립적임을 나타낸다. 세포를 증가 농도의 니코틴, 카바콜 또는 수용체 길항제, 아트로핀, 메카밀라민, 투보쿠라린, 및 α-붕가로톡신으로 예비처리하였다 (30 분). MPL (5 μM)을 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에 72 시간 두었다. 각 약물 농도를 사중으로 시험하고, 각 실험을 2회 반복하였다. 결합값 (평균±SEM)은 대조군에 대한 %로서 표시된다.
도 12는 MPL이 신경교종 세포의 증식을 어떻게 저해하는지를 나타낸다. 정상 세포 배양 조건하에 SRB 증식 어세이를 이용한 U87-MG, U251 신경교종 세포주 대 정상 성상세포의 증식에 대한 MPL 처리 (0, 5, 10, 25, 50 μM; 72 시간)의 효과. 데이터는 대조군에 대한 %로서 표시된다.
도 13은 MPL이 자식작용을 어떻게 유도하는지를 나타낸다. 화학적-내성 (chemo-resistant) U87 신경교종 세포를 MPL로 처리하면 자식작용이 생기고, 이는 농도-의존적 방식의 LC3-II 발현 증가로 확인된다. MPL로 처리된 U87-MG 및 U251 신경교종 세포는 자식작용을 농도-의존적으로 형성하는 것으로 입증되었다 (액포로서 나타남). LC3-I의 LC3-II로의 농도-의존적 전환은 이들 세포에서 자식작용 현상의 증가를 보여준다.
도 14는 OVCAR-3 및 A2780 세포의 콜로니 형성 활성에 대한 MPL의 효과를 나타낸다. 세포를 MPL (0, 5, 10, 25 μM)과 72 시간동안 인큐베이션한 후, 세포를 세척하고, 한천 플레이트로 옮겨 그의 일반 증식 배지로 배양하고, 표준 조건하에서 2 주간 인큐베이션하였다. 이어 세포를 100% 메탄올로 고정하고, 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 콜로니 (50 초과의 세포 클러스터)를 현미경 (5 배율) 하에 계수하였다. 상이한 실험 그룹에 대해 계수된 콜로니의 수를 대조군에 대한 퍼센트로서 표시하였다.
도 15는 MPL이 난소암 세포주의 세포 주기 진행에 어떻게 간섭하는지를 나타낸다. OVCAR-3 또는 A2780 세포를 MPL (0, 5, 10, 25 μM)로 48 시간동안 처리하고, 세포를 PI로 염색한 후, 유세포계수 분석 (FACS)으로 검사하였다. 도면과 다양한 세포 주기상에서 세포 분포에 MPL-유도 변화를 제공하는 데이터는 G1, S 및 G2/M 상에서의 세포의 퍼센트로서 나타내었다. 각 값은 독립 결정의 평균±SEM을 나타낸다.
도 16은 MPL이 세포 주기 조절 단백질 cdk2, cdk4, 사이클린 E 및 A의 발현에 어떻게 간섭하는지를 나타낸다. 세포를 MPL (0, 5, 10, 25 μM)로 24, 48 또는 72 시간동안 처리하였다. 전체-단백질 추출물을 얻고, 전기이동으로 분리한 후, 면역블롯을 지정 항체로 프로빙하였다. 각 추출물에서 이들 단백질의 수준을 나타내는 웨스턴 블롯 분석을 관련 항체를 사용하여 분석하였다. 이미지는 스캔된 노출 방사선 투과 필름을 나타낸다. 하우스 키핑 유전자 (GAPDH)를 사용하여 유사 단백질 로딩 및 블롯 이동을 확인하였다.
도 17은 MPL이 어떻게 PARP를 절단하는지를 나타낸다. OVCAR-3 또는 A2780 세포를 MPL (0, 5, 10, 25 μM)에 24, 48 또는 72 시간동안 노출하면 PARP이 절단되어 세포 분해되고 사멸 세포의 마커로서 제공된다.
도 18A 및 18B는 MPL이 ATP 수준을 어떻게 감소시키는지를 나타낸다. OVCAR-3 또는 A2780 세포를 MPL (0, 5, 10, 25 μM)에 24, 48 또는 72 시간동안 노출하면 PARP이 절단되어 세포 분해되고 사멸 세포의 마커로서 제공된다.
도 19는 누드 마우스에서 i.p. (복강내) 투여된 모네판텔이 s.c. (피하) 종양 증식에 미치는 효과를 나타낸다. 이백오십만 대수기 증식 OVCAR-3 세포를 각 마우스의 좌측 옆구리에 s.c. 주사하였다. 종양 증식을 캘리퍼스 측정으로 모니터링하고, 직교 직경을 측정하여 종양 용적을 결정하였다. 결정된 종양 용적을 식 1/2 (길이×너비2)에 기초해 계산하였으며, 여기서 너비는 두 직교 측정치의 더 짧은 것이다. 종양 세포 주사 7 일 후 처리를 시작하였는데, 그 전에 마우스를 처리 또는 대조 그룹 (그룹당 6 마리)으로 무작위로 할당하였다. 0.5% HPMC에 현탁시킨 모네판텔을 2.5 또는 25 mg/kg으로 주 3회 i.p. 투여하였다. 대조 그룹은 비히클로만 처리하였다.
도 20은 누드 마우스에서 i.p. 투여된 모네판텔이 s.c. 종양 증식에 미치는 효과를 나타낸다. 대수기 증식 OVCAR-3 세포를 각 마우스의 좌측 옆구리에 s.c. 주사하였다. 종양 증식을 캘리퍼스 측정으로 모니터링하고, 직교 직경을 측정하여 종양 용적을 결정하였다. 결정된 종양 용적을 식 1/2 (길이×너비2)에 기초해 계산하였으며, 여기서 너비는 두 직교 측정치의 더 짧은 것이다. 종양 세포 주사 7 일 후 처리를 시작하였는데, 그 전에 마우스를 처리 또는 대조 그룹 (그룹당 6 마리)으로 무작위로 할당하였다. 0.5% HPMC에 현탁시킨 모네판텔을 2.5 또는 25 mg/kg으로 주 3회 i.p. 투여하였다. 대조 그룹은 비히클로만 처리하였다.
도 21은 누드 마우스에서 경구 투여된 모네판텔이 종양 증식에 미치는 효과를 나타낸다. OVCAR-3 세포를 각 마우스의 좌측 옆구리에 s.c. 주사하였다. 종양 증식을 캘리퍼스 측정으로 모니터링하고, 직교 직경을 측정하여 종양 용적을 결정하였다. 결정된 종양 용적을 식 1/2 (길이×너비2)에 기초해 계산하였으며, 여기서 너비는 두 직교 측정치의 더 짧은 것이다. 종양 세포 주사 7 일 후 처리를 시작하였는데, 그 전에 마우스를 처리 또는 대조 그룹 (그룹당 6 마리)으로 무작위로 할당하였다. 0.5% HPMC에 현탁시킨 모네판텔을 50 또는 100 mg/kg으로 주 3회 경구 투여하였다 (100 ㎕). 대조 그룹은 비히클로만 처리하였다.
도 19 내지 21은 일반적으로 암컷 누드 마우스에서 s.c. 이종이식에 대한 MPL의 효과를 나타낸다. 마우스의 좌측 옆구리에 이백오십만 대수기 증식 인간 OVCAR-3 세포를 접종하였다. 종양 증식을 캘리퍼스 측정으로 모니터링하고, 직교 직경을 측정하여 종양 용적을 결정하였다. 결정된 종양 용적을 식 1/2 (길이×너비2)에 기초해 계산하였으며, 여기서 너비는 두 직교 측정치의 더 짧은 것이다. 종양 세포 주사 7 일 후 처리를 시작하였는데, 그 전에 마우스를 처리 또는 대조 그룹 (그룹당 5-6 마리)으로 무작위로 할당하였다. 0.5% HPMC에 현탁시킨 모네판텔을 2.5 또는 25 mg/kg (도 19), 25 및 50 mg/kg으로 i.p. 투여 (도 20) 또는 50 및 100 mg/kg으로 경구 투여하였는데, 모두 주 3회 투여되었다. 대조 그룹 마우스에는 동일 부피의 0.5% HPMC를 똑같은 방식 및 횟수로 투여하였다.
도 22는 MPL이 종양 조직에서 괴사를 어떻게 유도하는지를 나타낸다. 누드 마우스내 피하 이종이식편으로부터의 종양 조직을 50 또는 100 mg/kg/일로 격일에 경구 투여되는 MPL로 처리하였다. 종양의 조직학적 이미지를 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 나타내었는데 (H&E; 상부열), 상당한 약물-유도 괴사를 나타내었다 (검은 화살표; 10 배율). MPL 처리 마우스로부터 절개된 종양으로부터 종양 조직학의 대표적인 이미지는 100 mg/kg의 고용량 (s.c. 종양, 경구 처리, 2 주동안 주 3회)에서 대규모 괴사를 나타내었다.
정의
"할로겐"은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드, 바람직하게는 불소 또는 염소를 의미한다.
"알킬"은 선형 또는 분지형일 수 있고 쇄에 약 1 내지 약 20개의 탄소원자를 가지는 지방족 탄화수소 그룹을 의미한다. 바람직한 알킬 그룹은 쇄에 약 1 내지 약 12개의 탄소원자를 가진다. 더욱 바람직한 알킬 그룹은 쇄에 약 1 내지 약 6개의 탄소원자를 가진다. 분지형이란 메틸, 에틸 또는 프로필과 같은 하나 이상의 저급 알킬 그룹이 선형 알킬 쇄에 부착된 것을 의미한다. "저급 알킬"은 선형 또는 분지형일 수 있는 쇄에 약 1 내지 약 6개의 탄소원자를 가지는 그룹을 의미한다. "알킬"은 비치환되거나, 동일하거나 상이할 수 있는 하나 이상의 치환체에 의해 임의로 치환될 수 있으며, 각 치환체는 독립적으로 할로, 알킬, 아릴, 사이클로알킬, 시아노, 하이드록시, 알콕시, 알킬티오, 아미노, -NH(알킬), - NH(사이클로알킬), -N(알킬)2, 카복시 및 -C(O)O-알킬로 구성된 그룹중에서 선택된다. 적합한 알킬 그룹의 비제한적인 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 및 t-부틸을 포함한다.
"헤테로원자"는 N, O, P 및 S중에서 선택되는 원자를 의미한다. 필요에 따라, 임의의 지정되지 않은 원자가는 H, OH, 카보닐, n-알킬 또는 알콕시중에서 독립적으로 선택된다.
"n"은 1 내지 20, 바람직하게는 1 내지 10, 더욱 바람직하게는 1 내지 6, 및 가장 바람직하게는 1 내지 4일 수 있다.
"알콕시"는 알킬 그룹이 전술한 바와 같은 알킬-O- 그룹을 의미한다. 적합한 알콕시 그룹의 비제한적인 예로는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시 및 n-부톡시를 포함한다. 모 부분에 대한 결합은 에테르 산소를 통해 일어난다.
"약학적으로 허용가능한 염"이란 생물학적 유효성 및 화학식 (I)의 화합물의 특성을 지니는 통상적인 산부가염 또는 염기부가염을 가리키며, 적합한 비독성 유기 또는 무기산 또는 유기 또는 무기 염기로부터 형성된다. 샘플 산부가염은 염산, 하이드로브롬산, 하이드로요오드산, 황산, 설팜산, 인산 및 질산과 같은 무기산으로부터 유도된 것, 및 p-톨루엔 설폰산, 살리실산, 메탄설폰산, 옥살산, 숙신산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 유도된 것을 포함한다. 샘플 염기부가염은 암모늄, 포타슘, 소듐 및 사급 암모늄 수산화물, 예컨대 테트라메틸암모늄 하이드록사이드로부터 유도된 것을 포함한다. 약학 화합물 (즉, 약물)의 염으로의 화학적 변형은 화합물의 개선된 물리적 및 화학적 안정성, 흡습성, 유동성 및 용해성을 얻기 위해 약화학 분야에 잘 알려진 기술이다. 참조예: H. Ansel et. al., Pharmaceutical Dosage Forms and drug Derivery Systems (6th Ed. 1995) at pp. 196 및 1456-1457.
약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 등과 같이 "약학적으로 허용가능한"이란 특정 화합물이 투여된 대상체에 실질적으로 비독성이고 약물학적으로 허용가능한 것을 의미한다.
치환된 알킬에서와 같이 "치환"은 치환이 하나 이상의 위치에서 일어날 수 있고, 달리 언급이 없으면, 각 치환 부위에서의 치환체가 지정된 것 중에서 독립적으로 선택되고, 복수의 치환체가 다양한 부위에서 동시에 존재할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 화합물의 "프로드럭" 및 "용매화물"이 또한 본 명세서에서 고려된다. 프로드럭에 대한 논의는 [T. Higuchi and V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems (1987) 14 of the A.C.S. Symposium Series, and in Bioreversible Carriers in Drug Design, (1987) Edward B. Roche, ed., American Pharmaceutical Association and Pergamon Press]에 제공되어 있다. 용어 "프로드럭"은 생체내에서 화학식 (I)의 화합물 또는 그 화합물의 대사산물, 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물로 변환되는 화합물 (예컨대, 약물 전구체)을 의미한다. 변환은 다양한 메카니즘 (예컨대, 대사 또는 화학 과정)에 의해 일어날 수 있다. 프로드럭에 대한 논의는 [T. Higuchi and W. Stella, "Prodrugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, and in Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987]에 제공되어 있다.
본 발명의 화합물의 "대사산물"은 대사 중간체 및 산물을 가리킨다.
화학식 (I)의 화합물은 비대칭 또는 키랄 중심을 가질 수 있으며, 따라서 상이한 입체이성체 형태로 존재할 수 있다. 화학식 (I)의 화합물의 모든 입체이성체 형태뿐만 아니라 라세미 혼합물을 포함한 그의 혼합물을 본 발명의 대상으로 하고자 한다. 또한, 본 발명은 모든 기하 및 위치 이성체를 포함한다. 디아스테레오머 혼합물은 그의 물리화학적 차이에 기초해 당업자들에게 공지된 방법, 예컨대, 크로마토그래피 및/또는 분별 결정화에 의해 그의 개별 디아스테레오머로 분리될 수 있다. 에난티오머는 에난티오머 혼합물을 적절한 광학 활성 화합물 (예컨대, 키랄 알콜 또는 모셔(Mosher)의 산 클로라이드와 같은 키랄 보조제)과 반응시켜 디아스테레오머 혼합물로 전환시키고, 디아스테레오머를 분리한 뒤, 개별 디아스테레오머를 상응하는 순수한 에난티오머로 전환시켜 (예컨대, 가수분해) 분리할 수 있다. 에난티오머는 또한 키랄 HPLC 칼럼을 사용하여 분리할 수 있다. 본 발명의 키랄 중심은 IUPAC 1974에 정의된 바와 같이 S 또는 R 배열을 가질 수 있다.
용어 "염", "용매화물", 또는 "프로드럭" 등의 사용은 본 발명의 화합물의 에난티오머, 입체이성체, 로타머, 토토머, 위치 이성체, 라세메이트 또는 프로드럭의 염, 용매화물 및 프로드럭에도 동등하게 적용하고자 한다.
문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 단수 형태는 복수도 의미한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "포함하는"은 "포괄하는"을 의미한다. 단어 "포함하는"의 변형, 예를 들어, "포함하다" 및 "포함한다"는 상응하게 변화되는 의미를 가진다. 따라서, 예를 들어, 화학식 (I)의 화합물을 "포함하는" 약학 조성물은 그 화합물로 배타적으로 구성되거나, 또는 하나 이상의 추가 성분 (예컨대 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및/또는 희석제)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "복수"는 하나 초과를 의미한다. 소정의 특정 측면 또는 구체예에서, 복수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 또는 그 이상, 및 그 안에서 유도가능한 임의의 정수, 및 그 안에서 유도가능한 임의의 범위를 의미할 수 있다
"치료적 유효량"은 인간 종양 세포주를 포함한 인간 종양 세포의 증식을 실질적으로 저해 및/또는 분화를 예방하는 적어도 하나의 화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 대사산물, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 프로드럭의 양을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 원하는 치료 효과를 제공하기 위해 본 발명에서 사용하기 위한 약제 또는 조성물의 비독성이면서 충분한 양인 것을 의미한다. 필요한 정확한 양은 치료할 종, 대상체의 나이, 전신 상태, 치료할 상태의 중증도, 투여되는 특정 약제 및 투여 형태와 같은 다양한 요인에 따라 대상마다 달라질 것이다. 따라서, 모든 구체예에 적용가능한 정확한 "유효량"을 특정하는 것은 불가능하다. 그러나, 주어진 임의의 케이스에 대해, 적합한 "유효량"은 당업자들에 의해 일반적인 실험을 통하여 결정될 수 있다
상세한 설명
AAD (예컨대 화학식 (I))는 유기 합성 방법의 일반 지식을 이용하여 합성될 수 있는 부류의 화합물이다. 예를 들어, AAD는 클로로아세톤에 의한 페놀의 유도체화, 스트레커 반응(Strecker reaction) 및 생성된 아민의 아로일 클로라이드로의 아실화로 합성할 수 있다 (반응식 1에 예시됨). 필요에 따라, 예를 들어, 키랄 분할로 특정 에난티오머를 수득할 수 있다 (반응식 2에 예시됨).
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AAD는 약물-내성 선충을 치료하기 위해 이전에 사용되었던 부류의 화학물질이다. 화합물, MPL은 선충에서 니코틴 아세틸콜린 수용체를 표적으로 하는 이러한 AAD의 일례이며, 반추 동물에서 기생충을 치료하기 위해 널리 사용되고 있다.
놀랍게도, 본 발명자들은 화학식 (I)의 화합물, 예컨대 MPL 및 MPL-SO2가 항암 활성을 가지는 것을 발견하였다. 특히, MPL 및 MPL-SO2를 포함하는 화학식 (I)의 화합물이 암 세포주의 세포 증식 및 콜로니 형성을 저해하는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 난소암 세포주는 화학식 (I)의 화합물에 매우 감수성인 것으로 나타났으며, 다른 세포주 또한 고감수성인 것이 분명하다. 이들은 유방암, 중피종, 전립선암 및 교모세포종 세포주를 포함한다. MPL은 화학-내성, 안드로겐 불감성 PC-3 및 DU 145 전립선암 세포에 매우 효과적이다. 마찬가지로, 화학요법에 고도의 내성을 나타내는 PET 및 YOU 세포 (중피종) 및 U87 세포 (교모세포종)의 복제가 MPL에 의해 완전 억제된다.
이론적인 결부없이, 선충에서 보이는 작용 방식과 달리, 화학식 (I)의 화합물은 암 세포주내에 사이클린-의존성 키나제를 표적으로 하여 작용할 수 있다. 더욱 구체적으로, 화학식 (I)의 화합물은 세포-주기 조절 키나제, 예컨대 사이클린-의존성 키나제 2 (Cdk2) 및 사이클린-의존성 키나제 4 (Cdk4)를 방해하는 것으로 나타났다.
암 세포주를 화학식 (I)의 화합물, 예컨대 MPL 및 MPL-SO2로 처리하면 세포 주기가 정지되는 것으로 나타났다. 또다시 이론적인 결부없이, 세포 주기의 G1 상에서 세포의 축적으로 입증된 바와 같이, 처리는 G1 세포 주기 정지를 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 암 세포주를 화학식 (I)의 화합물, 예컨대 MPL 및 MPL-SO2로 처리하여 비가역 G0 세포 주기 정지를 유도할 수 있음이 제안되는데, 이는 세포가 세포 주기를 종료하고 자식작용 및/또는 아폽토시스를 겪는 것으로 입증된다. 이같은 새로운 부류의 항구충제는 벤즈이미다졸과 메카니즘적 프로파일이 상이하여 암 요법에 새로운 개선된 접근을 제공할 수 있다.
조성물, 의약 및 키트
본 발명은 적어도 하나의 화학식 (I)의 화합물, 또는 상기 화합물의 대사산물, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 프로드럭과 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물, 의약 및 키트를 제공한다. 본 발명에 의해 기술된 화합물로부터 약학 조성물을 제조하기 위해, 불활성의 약학적으로 허용가능한 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 고체 형태 제제는 분말, 정제, 분산성 과립, 캅셀, 카셰 및 좌약을 포함한다. 분말 및 정제는 약 5 내지 약 95%의 활성 성분으로 구성될 수 있다. 적합한 고체 담체는 업계에 공지되었으며, 예를 들면, 마그네슘 카보네이트, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당 또는 락토스이다. 정제, 분말, 카셰 및 캅셀은 경구 투여에 적합한 고체 복용형으로 사용될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 및 다양한 조성물의 제조방법은 [A. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania]에서 찾을 수 있다.
액체 형태 제제는 비경구 주사를 위한 액제, 현탁액 및 에멀젼, 예를 들어 물 또는 물-프로필렌 글리콜 액제를 포함하거나, 경구 액제, 현탁액 및 에멀젼용 감미제 및 유백제가 첨가된다. 액체 형태 제제는 또한 비강내 투여를 위한 액제를 포함할 수 있다.
흡입에 적합한 에어졸 제제는 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 불활성 가압 가스, 예컨대 질소와 함께 사용될 수 있는 액제 및 분말 형태의 고체를 포함할 수 있다. 또한 사용 직전에 경구 또는 비경구 투여를 위해 액체 형태 제제로 전환되도록 의도되는 고체 형태 제제도 포함된다. 이러한 액체 형태는 액제, 현탁액 및 에멀젼을 포함한다.
본 발명의 화합물은 또한 경피적으로 전달될 수 있다. 경피 조성물은 크림, 로션, 에어졸 및/또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있으며, 이러한 목적을 위해 업계에 통상적인 바와 같이, 매트릭스 또는 저장소 타입의 경피 패치에 포함될 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 피하적으로 전달될 수 있다.
바람직하게는, 화학식 (I)의 화합물은 경구적으로 투여된다.
본 발명의 조성물 및 의약은 약학적으로 허용가능한 담체, 애쥬번트, 부형제 및/또는 희석제를 포함할 수 있다. 담체, 희석제, 부형제 및 애쥬번트는 조성물 또는 의약의 다른 성분과 양립성이고, 일반적으로 이의 수령자에게 유해하지 않다는 면에서 "허용적"이어야 한다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제의 예로는, 탈염수 또는 증류수; 생리 식염수; 식물 기반 오일, 예컨대 낙화생유, 홍화유, 올리브유, 면실유, 옥수수 기름; 참기름, 예를 들어, 낙화생유, 홍화유, 올리브유, 면실유, 옥수수 기름, 참기름, 아라키스 오일(arachis oil) 또는 코코넛 오일; 메틸 폴리실록산, 페닐 폴리실록산 및 메틸페닐 폴리솔폭산과 같은 폴리실록산을 포함하는, 실리콘 오일; 휘발성 실리콘; 액상 파라핀, 연질 파라핀 또는 스쿠알란과 같은 미네랄 오일; 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 소듐 카복시메틸셀룰로오스 또는 하이드록시 프로필메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체; 예를 들어, 에탄올 또는 이소프로판올과 같은 저급 알칸올; 저급 아르알칸올; 저급 폴리알킬렌 글리콜 또는 저급 알킬렌 글리콜, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜 또는 글리세린; 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 미리스테이트 또는 에틸 올리에이트와 같은 지방산 에스테르; 폴리비닐피리돈; 한천; 트라가칸트검 또는 아카시아검, 및 석유 젤리를 들 수 있으나, 이들에만 한정되지는 않는다. 전형적으로, 담체 또는 담체들은 조성물 또는 의약의 1 내지 99.9 중량%를 형성할 것이다.
본 발명의 조성물 및 의약은 주사 (예컨대 피하, 근육내 또는 정맥내 주사를 포함한 비경구 투여), 경구 투여 (예를 들어 캅셀, 정제, 카플릿 및 엘릭시르와 같이), 국소 투여 (예컨대 연고, 크림 또는 로션 형태, 또는 점안제로서 전달하기에 적합한 형태), 또는 비강내 흡입 (예컨대 에어졸 형태)에 적합한 형태일 수 있다.
주사 용액 또는 현탁액으로서의 투여를 위해, 비경구적으로 허용가능한 비독성 희석제 또는 담체는 링거액, 등장성 염수, 포스페이트 완충 염수, 에탄올 및 1,2 프로필렌 글리콜을 포함할 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물 및 의약의 제조 방법은 당업자들에게 주지이며, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa]에 상세히 기술되어 있다.
경구 투여를 위해 적합한 담체, 희석제, 부형제 및 애쥬번트의 일부 예로는 낙화생유, 액상 파라핀, 소듐 카복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 소듐 알기네이트, 아카시아검, 트라가칸트감, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 젤라틴 및 레시틴을 포함한다. 또한, 이러한 경구용 제형은 적합한 향미제 및 착색제를 함유할 수 있다. 캅셀형으로 사용하는 경우, 캅셀은 붕해를 지연시키는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 스테아레이트와 같은 화합물로 코팅될 수 있다. 전형적으로, 애쥬번트는 연화제, 유화제, 농후화제, 방부제, 살균제 및 완충제를 포함한다.
경구 투여를 위한 고형 형태는 인간 및 수의 약학 실시에 허용가능한 바인더, 감미제, 붕해제, 희석제, 향미제, 코팅제, 방부제, 윤활제 및/또는 시간 지연제를 함유할 수 있다. 적합한 바인더로는, 아카시아검, 젤라틴, 옥수수 전분, 트라칸트검, 소듐 알기네이트, 카복시메틸셀룰로오스 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 적합한 감미제로는 수크로오스, 락토오스, 글루코오스, 아스파탐 또는 사카린을 포함한다. 적합한 붕해제로는 옥수수 전분, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 구아검, 잔탄검, 벤토나이트, 알긴산 또는 한천을 포함한다. 적합한 희석제로는 락토오스, 소르비톨, 만니톨, 덱스트로오스, 카올린, 셀룰로오스, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 또는 디칼슘 포스페이트를 포함한다. 적합한 향미제로는 페퍼민트 오일, 동록유, 체리, 오렌지 또는 라스베리 향을 포함한다. 적합한 코팅제로는 아크릴산 및/또는 메타크릴산 및/또는 그 에스테르의 중합체 또는 공중합체, 왁스, 지방 알콜, 제인, 셀락 또는 글루텐을 포함한다. 적합한 방부제로는 소듐 벤조에이트, 비타민 E, 알파-토코페롤, 아스코르브산, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤 또는 소듐 바이설파이트를 포함한다. 적합한 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 소듐 올리에이트, 소듐 클로라이드 또는 탈크를 포함한다. 적합한 시간 지연제로는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 포함한다.
경구 투여를 위한 액상 형태로, 상기된 제제 뿐 아니라, 액상 담체를 함유할 수 있다. 적합한 액상 담체로는, 물, 올리브유, 낙화생유, 참기름, 해바라기유, 홍화유, 아라키스 오일, 코코넛 오일과 같은 오일, 액상 파라핀, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 글리세롤, 지방 알콜, 트리글리세리드 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
경구 투여를 위한 현탁액은 분산제 및/또는 현탁화제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 현탁화제로는 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 소듐 알기네이트 또는 아세틸 알콜을 포함한다. 적합한 분산제로는 레시틴, 스테아르산과 같은 지방산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노- 또는 디-올리에이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노- 또는 디-올리에이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트 등를 포함한다.
경구 투여를 위한 제형은 하나 이상의 유화제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 유화제로는 상기 예시된 분산제 또는 구아검, 아카시아검 또는 트라가칸트검과 같은 천연 검을 포함한다.
본 발명의 국소 제형은 활성 성분을 하나 이상의 허용가능한 담체, 및 임의로 임의의 기타 치료 성분과 함께 포함할 수 있다. 국소 투여에 적합한 제형은 피부를 통해 처리가 필요한 부위로 침투하기에 적합한 액체 또는 반-액체 제제, 예컨대 도찰제, 로션제, 크림제, 연고 또는 페이스트, 및 눈, 귀 또는 코에 투여하기에 적합한 점적제를 포함한다.
본 발명에 따른 점적제는 멸균 수성 또는 유성 액제 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 이들은 활성 성분을 살균제 및/또는 살진균제 및/또는 임의의 기타 적합한 방부제로 구성되고 임의로 표면활성제를 포함하는 수용액에 용해시켜 제조될 수 있다. 이어 생성된 용액을 여과로 정화하고, 적합한 컨테이너로 옮겨 살균시킬 수 있다. 살균은 오토클레이빙 또는 90℃-100℃에서 0.5 시간을 유지하거나, 또는 여과한 후, 무균 조작법에 의해 컨테이너로 옮겨 행할 수 있다. 점적제중에 포함시키기에 적합한 살균제 및 살진균제의 예는 페닐머큐릭 니트레이트 또는 아세테이트 (0.002%), 벤잘코늄 클로라이드 (0.01%) 및 클로르헥시딘 아세테이트 (0.01%)이다. 유성 용액의 제조를 위해 적합한 용매는 글리세롤, 희석 알콜 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.
본 발명에 따른 로션제는 피부 또는 눈에 적용하기에 적합한 것을 포함한다. 눈용 로션은 임의로 살균제를 함유하는 멸균 수용액을 포함할 수 있으며, 점적제의 제조와 관련하여 상술된 것과 유사한 방법으로 제조될 수 있다. 피부 적용을 위한 로션제 또는 도찰제는 또한 건조를 촉진하고 피부를 시원하게 하는 제제, 예컨대 알콜 또는 아세톤, 및/또는 글리세롤과 같은 보습제, 또는 피마자유 또는 아라키스 오일과 같은 오일을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 크림제, 연고 또는 페이스트는 외부 적용을 위한 활성 성분의 반-고체 제형이다. 이들은 미분 또는 분말 형태의 활성 성분을 단독으로 또는 수성 또는 비-수성 유체중의 용액 또는 현탁액중에서 지성 또는 비-지성 베이스와 혼합하여 제조될 수 있다. 베이스는 탄화수소, 예컨대 경화, 연화 또는 액체 파라핀, 글리세롤, 비즈왁스, 금속성 비누; 점액질(mucilage); 아몬드, 옥수수, 아라키스, 피마자 또는 올리브유와 같은 천연 기원의 오일, 양모지 또는 그의 유도체, 또는 프로필렌 글리콜 또는 마크로골과 같은 알콜과 함께하는 스테아르산 또는 올레산과 같은 지방산을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 의약에는 음이온성, 양이온성, 또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어, 소르비탄 에스테르 또는 이들의 폴리에틸렌 유도체와 같은 임의의 적합한 계면활성제가 도입될 수 있다. 천연 검과 같은 현탁화제, 셀룰로오스 유도체 또는 실리카성(silicaceous) 실리카와 같은 무기 물질, 라놀린과 같은 다른 성분이 포함될 수도 있다.
본 발명의 조성물 및 의약은 리포좀 형태로 투여될 수 있다. 리포좀을 형성하기에 적합한 방법은 업계에 공지되었으며, [Prescott, (Ed), (1976), "Methods in Cell Biology", Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. p.33 et seq.]를 특정 참조할 수 있다.
애쥬번트 또는 생물 반응 개질제와 같은 보충 활성 성분이 또한 본 발명의 조성물 및 의약에 도입될 수 있다.
임의의 적합한 애쥬번트가 본 발명의 조성물 및 의약에 포함될 수 있다. 예를 들어, 알루미늄-기반 애쥬번트가 채용될 수 있다. 적합한 알루미늄-기반 애쥬번트로는 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스테이트 및 이들의 배합물이 포함되나, 이들에만 한정되지는 않는다. 채용될 수 있는 알루미늄-기반 애쥬번트의 기타 특정 예가 유럽 특허 제1216053호 및 미국 특허 제6,372,223호에 기술되어 있다. 다른 적합한 애쥬번트는 프로인트(Freund) 불완전 애쥬번트 및 완전 애쥬번트 (Difco Laboratories, Detroit, Mich.); 머크 애쥬번트 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.); 알루미늄 하이드록사이드 겔 (alum) 또는 알루미늄 포스테이트와 같은 알루미늄 염; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화 티로신의 불용성 현탁액; 아실화 당; 양이온성 또는 음이온성 유도체화 폴리사카라이드; 폴리포스파젠; 생분해성 미소구체; 모노포스포릴 리피드 A 및 quil A; 유럽 특허 제0399843호, 미국 특허 제7,029,678호 및 PCT 공개 제WO 2007/006939호에 기술되어 있는 것을 비롯한 수중유 에멀젼; 및/또는 추가적인 사이토킨, 예컨대 GM-CSF 또는 인터류킨-2, -7, 또는 -12, 과립대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 모노포스포릴 리피드 A (MPL), 콜레라 톡신 (CT) 또는 그의 구성성분 서브유닛, 열불안정성 엔테로톡신 (LT) 또는 그의 구성성분 서브유닛, 톨-유사 수용체 리간드 애쥬번트, 예컨대 리포폴리사카라이드 (LPS) 및 그의 유도체 (예컨대 모노포스포릴 리피드 A 및 3-탈아실화 모노포스포릴 리피드 A), 무라밀 디펩티드 (MDP) 및 호흡기 합포체 바이러스 (RSV)의 F 단백질을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 치료적 유효량의 적어도 하나의 화학식 (I)의 화합물, 또는 상기 화합물의 대사산물, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 프로드럭과 약학적으로 허용가능한 담체, 비히클 또는 희석제를 포함하는 키트이다.
본 발명의 또다른 측면은 일정량의 적어도 하나의 화학식 (I)의 화합물, 또는 상기 화합물의 대사산물, 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 프로드럭 및 일정량의 적어도 하나의 항암 치료요법 및/또는 상술된 항암제를 포함하고, 여기서 2 이상의 성분의 양은 소정 치료 효과를 내는, 키트이다.
본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 수행하는데 보조가 되는 성분, 예를 들어, 투여 장치(들), 완충제(들), 및/또는 희석제(들)를 포함할 수 있다. 키트는 다양한 성분을 담기 위한 컨테이너 및 본 발명의 방법에서 키트 요소들을 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
특정 구체예에 있어서, 키트는 조합된 키트일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 키트는 분리된 키트일 수 있다.
투여 용량 및 경로
제제, 조성물 및 의약은 수용자에게 비경구 (예컨대 정맥내, 척수내, 피하 또는 근육내), 경구, 국소, 또는 점막 경로 (예컨대 비강내)를 포함하나 이들에만 한정되지는 않는 표준 경로로 투여될 수 있다. 일부 구체예에 있어서, 이들은 수용자에게 다른 추가 치료제(들)와 분리하여 또는 조합하여 투여될 수 있다. 이 구체예에서 투여는 동시 또는 순차적일 수 있다.
일반적으로, 제제, 조성물 및 의약은 투여 경로 및 수용자의 육체적 특성 (건강 상태 포함)에 적합하고 소기 효과(들)가 유도되는 방식으로 (즉, 치료적으로 효과적, 면역성 및/또는 보호적) 투여될 수 있다. 예를 들어, 적절한 용량은 대상체의 육체적 특성 (예컨대 나이, 체중, 성별), 제제, 조성물 또는 의약이 단일 제제 또는 애쥬번트 치료제로 사용되는 지의 여부, 치료하고자 하는 암의 진행 (즉, 병리 상태), 및 당업자들이 쉽게 알 수 있는 다른 인자를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다.
제제, 조성물 및 의약의 적절한 용량을 결정하는데 여러가지 전반적인 고찰이 예를 들어, [Gennaro et al. (Eds), (1990), "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USA; 및 Gilman et al., (Eds), (1990), "Goodman and Gilman's: Pharmacological Bases of Therapeutics", Pergamon Press]에 기술되어 있다.
본 발명의 놀라운 이점은 화학식 (I)의 화합물이 일반적으로 저독성을 나타낸다는 것이다. 예를 들어, MPL은 단일 용량 독성이 체중 kg당 2000 mg을 초과한다. 따라서, 본 발명에 사용하기 위한 제제, 조성물 또는 의약은 체중 kg당 활성 성분(들) 2000 mg을 포함한 상한까지 양의 단일 용량으로서 환자에 투여될 수 있다. 또한, 암을 치료하는데 본 발명을 사용하는데 있어 다른 놀라운 이점은 일반적으로 화학식 (I)의 화합물의 임상 내성이 높다는 것이다. 예를 들어, 1000 mg의 MPL/체중 kg/24 시간의 용량이 포유동물에서 좋은 내성을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 사용하기 위한 제제, 조성물 또는 의약은 1000 mg의 활성 성분(들)/체중 kg/24 시간을 포함한 상한까지의 양으로 환자에 투여될 수 있다.
일반적으로, 유효 용량은 약 0.0001 mg 내지 약 1000 mg의 활성 성분(들)/체중 kg/24 시간; 전형적으로, 약 0.001 mg 내지 약 750 mg/체중 kg/24 시간; 약 0.01 mg 내지 약 500 mg/체중 kg/24 시간; 약 0.1 mg 내지 약 500 mg/체중 kg/24 시간; 약 0.1 mg 내지 약 250 mg/체중 kg/24 시간; 또는 약 1.0 mg 내지 약 250 mg/체중 kg/24 시간의 범위이다. 보다 전형적으로, 유효 용량은 약 1.0 mg 내지 약 200 mg/체중 kg/24 시간; 약 1.0 mg 내지 약 100 mg/체중 kg/24 시간; 약 1.0 mg 내지 약 50 mg/체중 kg/24 시간; 약 1.0 mg 내지 약 25 mg/체중 kg/24 시간; 약 5.0 mg 내지 약 50 mg/체중 kg/24 시간; 약 5.0 mg 내지 약 20 mg/체중 kg/24 시간; 또는 약 5.0 mg 내지 약 15 mg/체중 kg/24 시간의 범위일 것으로 예상된다.
예를 들어, 바람직한 용량은 약 10 - 100 mg의 화학식 (I)의 화합물/체중 kg/24 시간일 수 있다. 또, 바람직한 용량은 약 50 mg의 화학식 (I)의 화합물/체중 kg/24 시간일 수 있다.
전형적으로, 치료 적용에 있어서, 치료는 암의 기간중일 수 있다. 또한, 당업자라면 최적의 양 및 개별적인 투여 간격은 치료할 질병 상태 또는 증상의 특성 및 범위, 투여 형태, 경로 및 부위 및 치료할 특정 대상체의 특징에 따라 결정될 것임을 알 수 있을 것이다. 또한, 최적의 용량은 통상적인 기술에 의해 결정될 수 있다.
많은 경우 (예컨대 예방적 적용), 본 발명의 제제, 조성물 또는 의약을 수회 또는 다중 투여하는 것이 바람직할 수 있으며, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회, 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 투여는 약 1 내지 약 12 주 간격일 수 있고, 특정 구체예에서는 약 1 내지 약 4 주이다. 주기적 재투여가 또한 고려된다.
당업자들에게는 또한 최적의 투여 경로가 통상적인 치료 결정 시험의 과정을 이용하여 확정될 수 있음이 자명할 것이다.
2 이상의 물질 (예컨대 제제 또는 의약)이 대상체에 "함께" 투여되는 경우, 이들은 단일 조성물로 동시에, 또는 분리된 조성물로 동시에, 또는 분리된 조성물로 별도의 시간에 투여될 수 있다.
본 발명의 특정 구체예는 제제, 조성물 또는 의약을 복수의 분리된 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 본원에 기술된 예방적 및 치료적 치료 방법은 복수의 분리된 용량을, 예를 들어, 한정된 기간에 걸쳐 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 일부 구체예에 있어서, 방법은 초회량의 투여를 포함하며, 보조량 (booster dose)이 이어질 수 있다. 보조량은 재접종의 목적일 수 있다. 여러 구체예에 있어서, 제제, 조성물 또는 의약은 적어도 1, 2, 3회 또는 그 이상으로 투여된다.
제제, 조성물 및 의약은 일반적으로 의도하는 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 더욱 특히, 이들은 표적 질환 또는 병태의 발생을 방지하거나, 또는 그의 기존 징후를 완화하는 양을 의미하는 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 유효량의 결정은 당업자들의 능력내에 있다. 예를 들어, 제제, 조성물 및 의약의 치료적 유효량은 처음에 세포 배양 어세이로부터 추정할 수 있다. 예를 들어, 용량은 세포 배양에서 결정된 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 산출하기 위해 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 이 정보를 이용하여 인간 및 다른 포유동물 대상체에서 유용한 용량을 좀 더 정확히 결정할 수 있다.
치료적 유효량은 징후의 발생을 방지하고, 징후를 완화하고/하거나 치료하에 대상체의 생존을 연장하는 제제, 조성물 또는 의약의 양을 가리킨다. 제제, 조성물 및 의약의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물, 및/또는 실험 동물에서 표준 약학 어세이 (예컨대 LD50 (집단의 50% 까지로 치명적인 양) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 양)의 결정으로)에 의해 결정될 수 있다. 독성과 치료 효과 간 용량비는 LD50과 ED50 간의 비로서 표시될 수 있는 치료 인덱스이다. 높은 치료 인덱스를 나타내는 제제, 조성물 및 의약이 바람직하다. 세포 배양 어세이 및/또는 동물 연구로부터 얻은 데이터를 이용하여 인간 또는 다른 포유동물에 사용하기 위한 용량 범위를 공식화할 수 있다. 이러한 화합물의 용량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 또는 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위내에 놓인다. 용량은 사용되는 복용 형태 및 채용되는 투여 경로에 따라 이 범위내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 용량은 대상체의 상태를 고려하여 개개 의사가 어려움없이 선택할 수 있다 (예를 들어, Fingl et al., (1975), in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1 참조). 투여 용량 및 간격은 소정 치료 효과(들) 및/또는 최소 유효 농도 (MEC)를 달성 및 유지하기에 충분한 활성제의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. MEC를 달성하기 위해 필요한 투여량은 투여 경로 및 기타 개인별 특성에 따라 달라질 것이다. 바이오어세이 및/또는 HPLC 어세이를 이용하여 혈장 농도를 결정할 수 있다.
투여 간격은 또한 MEC 값을 이용하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 제제, 조성물 및 의약은 혈장 수준을 시간의 약 10%-90%, 바람직하게는 30%-90% 및 더욱 바람직하게는 약 50%-90% 동안 MEC 이상으로 유지하는 투약 방식으로 투여될 수 있다. 국소 투여 또는 선택적 흡수가 채용되는 구체예에서, 약물의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 관련이 없을 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 예컨대 방사선 치료 및/또는 세포정지제, 세포독성제 (예를 들어, DNA 상호작용제 (예컨대 시스플라틴 또는 독소루비신)); 탁산 (예컨대 탁소테레, 탁솔); 토포이소머라제 Il 저해제 (예컨대 에토포시드); 토포이소머라제 I 저해제 (예컨대 이리노테칸 (또는 CPT-11), 캄토스타(camptostar), 또는 토포테칸); 튜불린 상호작용제 (예컨대 파클리탁셀, 도세탁셀 또는 에포틸론); 호르몬 제제 (예컨대 타목시펜); 티미딜레이트 신타제 저해제 (예컨대 5-플루오로우라실); 항-대사산물 (예컨대 메토트렉세이트); 알킬화제 (예컨대 테모졸로마이드 (TEMODAR(TM) (Schering-Plough Corporation 제품, Kenilworth, New Jersey), 사이클로포스파미드); 파네실 단백질 트랜스퍼라제 저해제 (예컨대, SARASAR(TM)(4-[2-[4-[(11R)-3,10-디브로모-8-클로로-6,11-디하이드로-5H-벤조[5,6]사이클로헵타[1,2-b]피리딘-11-일-]-1-피페리디닐]-2-옥소에틸]-1-피페리딘카복사미드, 또는 SCH 66336 (Schering-Plough Corporation(Kenilworth, New Jersey) 제품), 티피파미브 (Zamestra® 또는 R115777 (Janssen Pharmaceuticals 제품), L778.123 (파메실 단백질 트랜스퍼라제 저해제 (Merck & Company(Whitehouse Station, New Jersey) 제품), BMS 214662 (파메실 단백질 트랜스퍼라제 저해제 (Bristol-Myers Squibb Pharmaceuticals 제품, Princeton, New Jersey); 신호 전달 저해제 (예컨대, 이레사 (Astra Zenec Pharmaceuticals(England) 제품), 타세바 (EGFR 키나제 저해제), EGFR에 대한 항체 (예컨대, C225), GLEEVEC(TM) (C-abl 키나제 저해제 (Novartis Pharmaceuticals 제품, East Hanover, New Jersey); 인터페론, 예를 들어, 인트론 (Schering-Plough Corporation 제품), Peg-인트론 (Schering-Plough Corporation 제품); 호르몬 치료 병용; 아로마타제 병용; ara-C, 아드리아마이신, 사이톡산 및 겜시타빈으로 구성된 그룹중에서 선택되는 하나 이상의 항암제와 같은 하나 이상의 항암 치료 (함께 또는 순차적으로 투여)와 병용시 유용할 수 있다.
대상체
본 발명의 예방 및 치료 방법은 임의의 적합한 대상체에 적용될 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체는 포유동물 대상체이다. 예를 들어, 대상체는 마우스, 래트, 개, 고양이, 소, 양, 말 또는 사회적, 경제적 또는 연구적 중요성을 갖는 임의의 다른 포유동물일 수 있다. 따라서, 대상체는 예를 들어, 인간 또는 비-인간 포유동물 등의 포유동물일 수 있다.
당업자들이라면 특정 구체예에서 설명된 본 발명에 대해 광범하게 기술된 본 발명의 취지 또는 범주를 벗어나지 않고 다양한 수정 및/또는 변경이 행해질 수 있음을 알 수 있을 것이다. 따라서, 본원의 구체예는 모든 측면을 설명하고자 하는 것이고 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 한다.
이하 본 발명에 대하여 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하고자 하자, 이로 제한되는 것으로 해석하여서는 안된다.
실시예
재료
및 방법
세포주
인간 난소암 세포주 OVCAR-3, SKOV-3 및 A2780 및 일차 세포 인간 제대정맥 내피 세포 (HUVEC) 및 모든 다른 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 입수하고 그의 지시에 따라 관리하였다. 성상세포 및 신경교종 세포주는 오스트레일리아 뉴사우스 웨일즈 대학의 로위 암 연구 센터로부터 케리 맥도날드 박사(Dr. Kerry McDonald)가 흔쾌히 제공하였다.
세포 증식 어세이
설포로다민 B (SRB) 어세이를 이용하여 세포 증식을 평가하였다. 96-웰 플레이트 (2,000-3,000 세포/웰)에 시딩한 세포를 를 MPL (0, 1, 5, 10, 25, 50 및 100 μmol/L)로 72 시간동안 처리하였다. 이어 세포를 고정하고, 세척한 후, 1% 아세트산에 용해시킨 100 ㎕의 0.4% (w/v) SRB로 염색하였다. 공기 건조하기 전에 1% 아세트산으로 5회 세척하여 결합되지 않은 염료를 제거하였다. 결합된 SRB를 100 ㎕의 10 mM 트리스 염기 (pH 10.5)로 가용화하고, 570 nm에서 흡광도를 기록하였다. 정확히 동일한 절차를 이용하여 MPL-SO2를 평가하였다. 양 제제를 에탄올에 용해시키고, 세포 배양 어세이에 필요한 최종 농도가 되도록 매질로 희석하였다.
세포 생존성 어세이
생존성 실험을 위해, 6 웰 플레이트에 시딩한 세포를 모네판텔 (MPL)에 0, 1, 10, 50 및 100 μM 농도로 24, 48 또는 72 시간동안 노출하였다. 모네판텔 (Novartis(Basel, Switzerland)에서 공급)을 100% 에탄올에 용해시키고, 세포 배양 배지로 희석하였다. 처리 기간 후, 세포를 PBS로 세척하여 트립신화하고, 트립판 블루 및 혈구계산기를 사용하여 계수하였다. 모든 실험 포인트는 사중으로 설정하고, 각 실험은 적어도 2회 수행하였다.
콜로니 형성 어세이
콜로니 형성 어세이를 위해, 5x106 세포, 예컨대 OVCAR-3 또는 A2780 세포를 100 mm 페트리 접시에 플레이팅하고, 밤새 부착되도록 하였다. 배지를 흡입하고, 대수 증식한 세포를 다양한 농도의 MPL과 72 시간동안 인큐베이션하였다. 이 시점에, 배지를 흡입하고, 접시를 PBS로 세척한 뒤, 무약물 배지를 각 플레이트에 가하였다. 배지를 3 주동안 주 2회 교환하였다. 그 후, 플레이트를 PBS로 살살 세척하고, 세포를 100% 에탄올로 고정하여 여과한 크리스탈 바이올렛 0.5% 용액으로 염색하였다. 50 세포 초과로 구성된 콜로니를 도립 현미경하에 계수하였다.
세포 주기 분석
세포 주기에 대한 MPL의 효과를 표준 유세포 계수 분석 프로토콜 및 절차를 이용하여 결정하였다. 요약하면, 25 cm3 플라스크에 시딩하고, 밤새 부착시킨 0.7×106 밀리온 세포를 MPL로 24 또는 48 시간동안 처리하였다. 세포를 트립신화로 수집하고, 배지중에 부유하는 세포와 풀화하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고, PBS로 세척한 뒤, 메탄올로 고정하였다. 이어 세포를 세척하고, 실온에서 PBS 중 프로포듐 요오다이드 및 리보뉴클레아제 A에 30 분 재현탁시키고, 유세포 계수법으로 분석하였다 (Becton Dickinson FACSort).
웨스턴 블롯 분석
세포내 단백질 발현을 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 결정하였다. 지정 농도의 MPL로 처리한 후, 세포 용해물을 준비하고, cdk2, cdk4, 사이클린 A, 사이클린 E, PARP-1 (1:1000 희석; Cell Signalling Technology), 및 p53 (1:200 희석; Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체로 프로빙하였다. 블롯을 GAPDH 항체 (1:30000 희석; Sigma-Aldrich)로 재프로빙하여 겔상에 비슷한 단백질 적재를 확인하였다.
생체내 실험
암컷 누드 마우스 (6 주령)를 Biological Resources (University of New South Wales)에서 구매하였다. 기관의 동물 윤리 승인을 거친 절차를 마우스에 행하였다. 요약하면, 2.5×106 대수기 증식 OVCAR-3 세포를 각 마우스의 좌측 옆구리에 s.c. 주사하였다. 동물의 체중을 주 1회 재었고, 그의 종양 용적은 주 2회 측정하였다. 종양 증식을 직교 직경의 캘리퍼스 측정으로 모니터링하고, 결정된 종양 용적을 식 1/2 (길이×너비2)에 기초해 계산하였으며, 여기서 너비는 두 직교 측정치의 더 짧은 것이다. 기관의 종양 용적이 500 mm3에 이르기 전에 마우스를 동물 윤리 승인에 준해 안락사시켰다. 종양 세포 접종 8 일 후 처리를 시작하였는데, 그 전에 마우스를 MPL 또는 비히클 처리 그룹 (그룹당 5-6 마리) 중 어느 하나에 무작위로 할당하였다. MPL을 하이드로퍼옥시 메틸셀룰로오스 (0.5% w/v HPMC)에 현탁시키고, 초음파기로 멸균한 후 격일로 복강내 (i.p) 또는 위관 영양으로 경구 (100 ㎕) 투여하였다.
일차 파일롯 시험에서, 약물을 2 주동안 2.5 또는 25 mg/체중 kg으로 주 3 회 i.p. 투여하였다.
성과 후, 다음 동물 세트에서는, 용량을 25 및 50 mg/kg으로 증가시켜 주 3 회 투여하였다.
최종 (3차) 파일롯 시험에서는, 마우스를 경구적으로 처리하였다. 투여된 용량은 주 3 회로 50 및 100 mg/kg이었다. 이들 모든 시험에서, 대조 그룹의 마우스는 유사 부피의 비히클 (0.5% HPMC)을 투여받았다. 종양조직학/면역조직화학을 포르말린 고정된 종양 슬라이스에서 표준 절차에 따라 수행하였다.
통계학적 분석
모든 데이터는 적어도 2회 독립 실험으로부터 평균±표준 오차 (S.E.M.)로 보고되었다. 일원 분산 분석 (one way ANOVA)과 사후 듀넷 검정 (post hoc Dunnett test)을 이용하여 MPL 처리 그룹 대 대조 그룹간 종양 용적 차이를 분석하였다. 양적 변수를 스튜던트 t 검정으로 비교하였다. 유의적인 통계차는 P < 0.05로 정의되었다.
결과
MPL은 세포 증식을 저해한다
OVCAR-3, A2780 및 SKOV-3의 난소암 세포주의 증식에 대한 MPL의 효과를 조사하였다. SRB 어세이를 이용하여, 세포 증식에 대한 MPL의 효과를 조사하였다. MPL은 OVCAR-3, A2780 및 SKOV-3 세포의 증식을 표 1에 따라 각각 6.3, 10.0 및 29.3의 IC50 값으로 농도-의존적 방식으로 저해하였다. 이들 결과로부터 난소암 세포주는 MPL의 항증식 효과에 감수성임이 명백하다. SKOV-3 세포가 최소 감수성을 나타내었다. MPL-SO2를 또한 SRB 증식 어세이를 이용하여 유사한 방식으로 시험하였다. MPL-SO2는 MPL 만큼 효능적인 것으로 입증되었다. MPL-SO2는 배양시 증식하는 암 세포주의 생존성을 감소시켰고, 세포 증식을 저해하였다. MPL-SO2에 대한 IC50 값을 표 1에 나타내었다.
세포 증식에 대한 MPL의 저해 효과를 또한 특정 세포, 예컨대 유방, 전립선 및 중피종 세포에 대해 시험하였다. 얻은 결과를 표 1에 나타내었다. 추가 결과를 표 2에 나타내었다.
세포주 | 암의 형태 | IC 50 (mM) | |
MPL | MPL-SO2 | ||
OVCAR-3 | 난소암 | 6.3 | 5.5 |
A2780 | 난소암 | 10.0 | 4.2 |
SKOV-3 | 난소암 | 29.3 | 26 |
IGROV-1 | 난소암 | 6.1 | - |
1A9 | 난소암 | 1.8 | 4.8 |
T47-D | 유방암 | 5.7 | - |
MDA-MB-231 | 유방암 | 24.0 | 23.6 |
MCF-7 | 유방암 | - | 7.3 |
PET | 중피종 | 26.3 | - |
YOU | 중피종 | 23.1 | - |
PC-3 | 전립선암 | 21.6 | - |
DU-145 | 전립선암 | 23.5 | - |
U87 | 교모세포종 | 26.2 | 20.5 |
HUVEC | 인간 제대정맥 내피 세포 | 87.8 | 47.8 |
CHO | 중국 햄스터 난소 | - | 73.7 |
HEK | 인간 배아 신장 | 50.5 | - |
세포주 | 세포 형태 | IC 50 (μM) | |
MPL | MPL-SO2 | ||
OVCAR-3 | 난소암 | 6.3±0.8 *** | 5.5±1.3 *** |
A2780 | 난소암 | 10±3.8 ** | 4.2±2.1 ** |
SKOV-3 | 난소암 | 31.18±0.76*** | 26 |
IGROV-1 | 난소암 | 4.4±0.27** | 4.4±1.5** |
1A9 | 난소암 | 2.5±0.45** | 3.42±0.1** |
T47-D | 유방암 | 5.3±0.003** | 10.2±0.6** |
MDA-MB-231 | 유방암 | 23.8±0.2** | 21.6±7.5 *** |
MCF-7 | 유방암 | 15.4±1.1** | 8.0±0.7** |
PET | 중피종 | 26 | - |
YOU | 중피종 | 23 | - |
PC-3 | 전립선암 | 21 | - |
DU-145 | 전립선암 | 23 | - |
SW-876 | 지방육종 | 14.57 | - |
HT-1080 | 섬유육종 | 17.16 | - |
U87 | 신경교종 | 18±7.1** | 20.5±1.0 ** |
LN-18 | 신경교종 | 9.38±0.79** | 6.64±0.71** |
T98G | 신경교종 | 18.2±0.61 | 25.4±0.28** |
U251 | 신경교종 | 17±1.2** | - |
HCT-116 | 결장암 | 10.5±0.02** | 22.5±5.7** |
HT-29 | 결장암 | 5.86±0.2** | 2.75±0.7** |
HT-29 5m11 | 결장암 | 10.4 | 21.7 |
HeLa | 상피성 (선암) | 15.8±0.3** | 18.2±2.6** |
HUVEC | 인간 제대정맥 내피 세포 | 87 | 47 |
CHO | 중국 햄스터 난소 | 34.61±0.789*** | 73.7±6.0 ** |
HEK | 인간 배아 신장 | 34.57±0.86** | - |
3T3 | 섬유아세포 | 12.41±0.37** | 11.2±1.1** |
HaCat | 각화세포 | 21.2±3.2** | 42.68±8.0** |
인간 태아 성상세포 | 성상세포 | 85.55±2.7** | - |
*가 없는 것 = 1회 결정, ** = 2회 반복, *** = 3회 반복
표 3 - 계속
AAD | R1 | R2 | R3 | R4 |
1566 (MPL) | CN | H | CF3 | SCF3 |
2105 (MPL-SO) | CN | H | CF3 | SOCF3 |
4670 (MPL-SO2) | CN | H | CF3 | SO2CF3 |
450 | H | H | Cl | CF3 |
907 | H | H | CF3 | CF3 |
970 | H | H | CF3 | OCF3 |
1154 | Cl | H | Cl | OCF3 |
004 | F | H | Cl | OCF3 |
2009 | H | F | Cl | OCF3 |
1336 | F | F | Br | OCF3 |
1470 | F | F | CF3 | OCF3 |
표 3에 따라, "MPL-(R)"는 N-[(1R)-1-시아노-2-(5-시아노-2-트리플루오로메틸페녹시)-1-메틸에틸]-4-트리플루오로메틸설파닐벤즈아미드를 가리키고, "MPL-(S)"는 N-[(1S)-1-시아노-2-(5-시아노-2-트리플루오로메틸페녹시)-1-메틸에틸]-4-트리플루오로메틸설파닐벤즈아미드를 가리킨다.
표 3에 나타낸 결과에 따라, AAD 907, 1336, 1470 및 2224 (MPL-(R))에 대한 IC50 값의 비 (정상 세포/암 세포)가 특히 높은 활성을 나타낸다. 또한, AAD 2224 (MPL-(R)) 및 AAD 1566 (MPL-(S))는 효능이 동등한 것으로 입증되었다. (R)-에난티오머 MPL-(R)은 이전에 구충 활성이 입증된 바가 없음에 주목바란다.
간략히, MPL 및 MPL-SO2를 대폭 상이한 질병 특성을 가지는 광범위 암 세포주에 대해 시험관내 시험하였다. 더 자세한 연구를 위해, 인간 난소암 세포주 OVCAR-3 및 A2780을 선택하였다. 추가로, 정상 인간 난소 표면 상피 세포 (HOSE)를 MPL (0, 5, 10, 25, 50 및 100 μM)의 존재하에 72 시간동안 배양하였다. 세포 생존성을 트립판 블루 어세이를 사용하여 평가하였다 (도 8). 유사하게, 정상 상피, 내피, 배아 및 태아 세포의 증식에 대한 MPL의 효과를 조사하였고 (도 9), 세포 증식을 SRB 어세이 (도 10)를 이용하여 평가하였다. 대조 (비히클 처리) 세포를 100% 증식을 제공하는 것으로 취하고, MPL 처리 그룹을 대조군에 대한 퍼센트±SEM으로서 나타내었다. 각 약물 농도를 사중으로 시험하고, 각 실험을 적어도 2회 반복하였다. 통계적 비교를 위해, 각 약물 처리 그룹을 스튜던트 t 검정을 이용하여 대조 그룹과 비교하였다. 농도 의존성 약물 효과를 조사하기 위해, 분산 분석 (ANOVA)을 이용하였다. P 값은 다음과 같다: * = < 0.05; ** <0.01 및 *** = < 0.001, **** p< 0.0001. 표 2에 나타낸 결과는 MPL이 암 세포주에서 고 항증식 활성을 보이는 반면, 정상 세포는 영향을 훨씬 덜 받는다는 것을 나타낸다. MPL 효과가 니코틴성 아세틸콜린 수용체 및 특히 nACHR7 서브타입을 통해 매개되는지를 알아보기 위해, 세포를 길항제로 예비처리한 후, MPL에 노출시켰다 (도 11).
MPL-SO2에 대해 얻은 결과도 나타내었다. MPL-SO24가 모 약물 MPL과 유사한 체계로 작용하는 것을 알 수 있다. IC50 값의 범위는 매우 가깝고, 이는 MPL-SO2가 암 세포 증식을 억제하는데 MPL 정도로 효과적임을 제시한다 (표 2).
MPL은 콜로니 형성을 저해한다
MPL이 또한 증식능 및 세포주의 콜로니 확립능을 방해하는지를 조사하기 위해, MPL에 노출된 세포의 클론원성 활성을 조사하였다. 다양한 농도의 MPL에 72 시간 노출 후, 세포를 세척하고, 무약물 배지에서 2 주동안 인큐베이션하였다. MPL은 이들 세포에 의한 콜로니 형성을 상당히 방해하는 것으로 나타났다. MPL의 농도가 높아질수록 클론원성 능력이 거의 완전히 상실되었다 (도 2).
약물 노출 및 중단 후 세포 보존성 및 약물 효과 제거능에 대한 MPL의 효과를 조사하기 위해, 세포를 MPL (0, 5, 10, 25 μM)과 72 시간동안 인큐베이션한 후, PBS로 세척하여 한천 플레이트로 옮기고, 증식 배지와 배양한 뒤, 표준 조건하에서 2 주동안 인큐베이션하였다. 이어 세포를 100% 메탄올로 고정하고, 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 콜로니 (50 초과의 세포 클러스터)를 현미경 (5 배율)하에 계수하였다. 상이한 실험 그룹에 대해 계수된 콜로니의 수를 대조군에 대한 퍼센트로서 나타내었다 (도 14). 이들 결과는 MPL에 의한 콜로니 형성의 농도-의존성 저해를 입증한다.
MPL은 사이클린 및 사이클린-의존성 키나제의 발현을 하향 조절하여 세포 주기를 정지시킨다
MPL이 세포 증식 및 콜로니 형성을 저해하는 메카니즘(들)을 조사하기 위해, 유세포 분석으로 세포 주기에 대한 MPL의 효과를 조사하였다. MPL은 세포 주기 진행을 간섭하는 것으로 밝혀졌다 (도 3). MPL에 노출된 세포의 진행은 농도 및 시간-의존적 방식으로 G1 상에서 정지하였다. G1 상에 세포의 축적은 S 및 G2-M 상에서 세포 퍼센트의 급격한 저하를 수반하였다. MPL-유도 세포 주기 정지에 관여하는 분자 메카니즘을 연구하기 위해, 세포 주기 조절 단백질 cdk2, cdk4, 사이클린 A, 및 E의 발현을 조사하였다. MPL 처리된 세포는 cdk2, cdk4, 사이클린 A, 및 E를 낮은 수준으로 발현하였다 (도 4).
MPL은 PARP-1 절단 유도로 이어지는 사이클린 및 사이클린-의존성 키나제의 발현을 하향 조절하여 세포 주기를 정지시킨다
MPL이 세포 증식 및 콜로니 형성을 저해하는 메카니즘(들)을 알아보기 위해, 세포 주기에 대한 MPL의 효과를 유세포 분석 (FACS)으로 조사하였다. MPL은 세포 주기 진행을 간섭하는 것으로 밝혀졌다 (도 22). MPL에 노출된 세포에서 세포 주기는 농도 및 시간-의존적 방식으로 G1 상에서 정지하였다. G1 상에 세포의 축적은 S 및 G2-M 상에서 세포 퍼센트의 급격한 저하를 수반하였다. MPL-유도 세포 주기 정지에 관여하는 분자 메카니즘을 연구하기 위해, 세포 주기 조절 단백질 cdk2, cdk4, 사이클린 A, 및 E의 발현을 조사하였다. MPL 처리된 세포는 cdk2, cdk4, 사이클린 E, 및 사이클린 A를 낮은 수준으로 발현하였다 (도 4 및 16).
MPL은 PARP-1 절단을 유도한다
MPL-유도 세포사가 PARP의 절단을 포함하는지를 조사하기 위해, PARP-1 및 절단된 PARP-1에 대해 MPL-처리된 세포의 용해물의 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. PARP-1의 절단은 DNA-수복-유도 생존을 방지하여 아폽토시스를 촉진한다. PARP는 세포가 그의 생존성을 유지하는 것을 돕고, 따라서 PARP의 절단은 세포 분해를 용이하게 하고 아폽토시스를 겪는 세포의 지표로서 제공된다. 도 5는 PARP가 MPL 처리된 세포에서 절단되었음을 나타낸다.
MPL은 PARP 절단을 유도한다
MPL 처리된 OVCAR-3 및 A2780 세포로부터 제조된 세포 용해물의 웨스턴 블롯 분석은 세포사에 해당하는 PARP의 절단을 고도로 유도하는 것으로 나타났다 (도 17).
MPL은 세포의 ATP 수준을 감소시킨다
도 18A 및 18B에 도시된 바와 같이, MPL로 OVCAR-3 또는 A2780 세포를 처리하였더니 세포에서 관찰된 ATP 수준이 감소되었다.
MPL은 자식작용을 유도한다
도 6은 MPL로 세포를 처리하게 되면 액포가 형성되고, 이는 MPL이 이들 세포에서 자식작용을 유도할 수 있음을 제시하는 것이다. 도 7은 MPL 처리가 세포 자식작용의 또다른 지표인 ADP/ATP의 세포 비율을 감소시킴을 나타낸다.
MPL은 누드 마우스에서 s.c. 이종이식 증식의 비율을 억압한다
도 19-21은 누드 마우스에서 MPL을 생체내 시험한 것을 나타낸다. OVCAR-3 종양을 지닌 마우스를 처음 i.p. 또는 마지막 실험에 따른 것으로, 경구 처리하였다. 얻은 결과는 투여 용량 및 특히 50 mg/kg의 용량 (둘 다 i.p. 및 경구)의 활성이 이들 동물에서 종양 증식을 완전히 억제시킴을 나타낸다. 종양 조직학은 거대한 종양 세포사 영역을 보여준다 (도 22).
콜로니 형성의 억압과 함께 세포 증식의 저해, 및 생체내 결과는 MPL에 대한 증식 조절 효과를 입증한다. MPL 개입은 그의 키나제 cdk2 및 cdk4와 함께 세포 주기 조절 단백질 A 및 E2의 발현 감소를 통해 세포 주기 진행과 함께 나타난다. 정상 세포에서, 하나의 상에서 다른 상으로의 전이는 다양한 단백질에 의해 질서정연하게 잘 조절된 방식으로 일어난다. 사이클린-의존성 키나제 (CDK)는 세포 주기의 특정 시점에 활성화되어 세포 주기 진행에 중추적인 역할을 하는 주 조절 단백질이다. 이들은 상이한 주기 상에서 상이한 사이클린을 필요로 한다. 사이클린 A, D 및 E는 세포 주기의 G1과 G1의 S 상으로의 전이를 위해 필요하다. 지금까지 동정된 다양한 CDK 중에서, CDK2 및 CDK4가 G1 및 G1-S 전이의 진입를 위해 필수적인 것으로 보인다. 사이클린 A 및 E는 CDK2에 결합하는 반면, 사이클린 D는 CDK4 및 CDK6에 결합한다. 암은 세포 주기 관련 현상인 것으로 여겨지는 여러 질병중 하나이다.
도 19-21에서 제공하는 결과는 암컷 누드 마우스에서 s.c. 종양 증식을 억압하는데 있어 MPL 활성을 입증한다. 초기 시도는 i.p. MPL 투여의 용량-의존적 활성을 보여준다. 25 mg/kg 용량이 특히 효과적이었다. 이를 기초로, 다음 시도를 25 및 50 mg/kg 용량으로 앞의 것과 동일한 조건하에서 수행하였다. 이들 동물에서 종양 증식을 억제하는데 50 mg/kg 용량이 더 효과적이었다. 항-기생충제로서, MPL은 많은 동물 모델에서 경구적으로 효과적임이 증명되었다. 50 및 100 mg/kg 용량의 MPL의 경구 치료 활성을 시험하였다. 세가지 모든 파일럿 실험에서, MPL은 0.5% HPMC 중에서 제조되어 현탁액으로 투여되었다. 이들 생체내 실험으로부터 종양 조직의 검사는 MPL 처리된 종양에서 방대한 괴사를 보여주었다 (도 22).
관찰된 효과는 난소암에만 국한되지 않으며, 표 1 및 2에 도시된 바와 같이, MPL은 신경교종, 전립선, 유방, 중피종, 지방육종, 섬유육종을 비롯한 다양한 암의 전형인 각종 세포주에서 시험관내 세포 증식을 효과적으로 억압한다 (표 1 및 2 참조).
다른 중요한 관측은 화학적-내성 세포주에 대한 MPL의 활성이다. 난소의 화학적-내성 세포, 신경교종 테모졸리미드 내성 세포 및 유방암 타목시펜 내성 세포 모두 MPL 항증식 작용에 감수성이었다.
결론적으로, 결과는 암 세포주에서, MPL 및 잠재적으로 그의 대사산물 및 유사체 (AAD)가
1- 세포 증식을 저해하고;
2- MPL-유도 저해는 니코틴성 작용제 또는 길항제의 예비처리에 의해 긍정적이지도 부정적이지도 않은 영향을 받는데, 이는 작용 방식이 니코틴 수용체 매개가 아니며;
2- 콜로니 형성을 저해하고;
3- 세포 주기 [G1 상]를 정지시키고;
4- 세포-주기 조절 단백질 (CdK2, CdK4, 사이클린 A, 사이클린 E)을 하향 조절하고;
5- 세포로의 티미딘 도입을 봉쇄하여 DNA 합성을 저해하고;
6- 세포 ATP 수준을 감소시키고;
7- LC3B-I의 LC3B-II로의 전환으로 확인된 바와 같이, 점진적인 자식작용을 야기하고;
8- 자식작용은 난소 및 신경교종 암 세포주 모두에서 현미경적으로 분명하고;
9- MPL은 또한 PARP-1을 절단하여 세포사를 일으키고;
10- 이는 s.c. 종양을 지니는 누드 마우스에서 종양의 용량-의존적 억압을 나타내는 생체내 데이터로 확인되고;
11- i.p. 및 경구 투여 경로 모두 효과적임을 입증한다.
또, MPL은 일부 표준 화학요법제에 내성인 세포의 증식을 저해한다.
검토
표 1에 도시된 바와 같이, MPL을 또한 HUVEC에 대해 시험하였다. IC50 값이 OVCAR-3의 IC50 값보다 약 10 배 높은 것으로 나타났으며, 이는 MPL이 비-암성 세포보다 암성 세포에 더 세포독성적임을 반영한다.
콜로니 형성 어세이에서, MPL은 한천 플레이트에서 증식한 난소암 세포주에 의한 콜로니의 형성을 농도-의존적 방식으로 억압하였으며, 따라서 암 세포의 증식을 저해하는데 MPL의 효능을 추가로 입증한다.
또한, [OVCAR-3 (돌연변이화), SKOV-3 (눌(null)) 및 A2780 (아생형)] 세포의 p53 상태와 상관없이, MPL은 (비록 효능은 상이하지만) 그의 항-암 효과를 발휘하는 것으로 나타났다. 이는 MPL이 그의 종양 p53 상태와 상관없이 상피성 난소암에 효과적임을 제안한다. 이러한 결과는 p53 돌연변이가 광범위 암에서 매우 흔하기 때문에, 중요할 수 있다.
MPL이 보이는 효과는 난소암 외에 다른 타입의 암에 까지도 확장될 수 있다.
포유동물 세포 주기는 Cdk의 일련의 활성화로 통제된다. G1 상을 통한 진행 및 S 상으로의 진입은 사이클린 A 및 사이클린 E와 복합화된 Cdk2로 조절된다. 따라서, 이들 조절 단백질의 발현 억압은 세포 주기 진행을 붕괴한다.
세포 증식 및 콜로니 형성의 저해는 MPL에 대해 농도-의존성이다. MPL이 세포 주기 진행을 붕괴하는 가능한 메카니즘은 세포 주기 조절 단백질 E 및 A 및 사이클린-의존성 키나제 Cdk4 및 Cdk2의 하향 조절로 G1 정지를 야기하는 것이다. G1 정지의 결과, 세포는 다음 단계의 주기로 진행하지 못하며, 이는 시간 경과에 따른 S 및 G2-M 상 세포의 현저한 감소로 증명된다. 비히클 처리 그룹의 G2-M 상에서의 세포 퍼센트는 25 μM MPL로 처리된 그룹에서의 것보다 세배나 더 높다.
그밖에, MPL로 처리된 암 세포주에서 자식작용의 증거는 세포가 G0 상 세포 주기 정지를 통해 세포-주기를 비가역적으로 빠져나감을 강력하게 제안한다.
Claims (63)
- 제1항에 있어서, R2는 H 또는 할로겐인 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, R3은 -CF3 또는 할로겐인 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, R4는 -S-CF3, -SOCF3, -SO2CF3, -OCF3 또는 -CF3인 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, R5는 H인 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, n은 1인 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, R4는 아미드 부분에 대해 파라 위치인 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 (R)- 또는 (S)-에난티오머 또는 라세메이트인 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 화학식 (I)의 화합물이 (S)-에난티오머인 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 키나제와 관련되는 약학적 조성물.
- 제14항에 있어서, 키나제가 사이클린-의존성 키나제인 약학적 조성물.
- 제15항에 있어서, 사이클린-의존성 키나제가 cdk2 또는 cdk4인 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 방광암종, 유방암종, 결장암종, 중피종암종, 신장암종, 간암종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암을 포함한 폐암종, 두경부암종, 식도암종, 담낭암종, 난소암종, 췌장암종, 위암종, 자궁경부암종, 갑상선암종, 전립선암종, 및 편평 세포 암종을 포함한 피부암종을 포함한 암종; 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발 세포 림프종, 맨틀 세포 림프종, 골수종, 및 버킷 림프종을 포함한 림프 계통의 조혈 종양; 급성 및 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군 및 전골수성 백혈병을 포함한 골수 계통의 조혈 종양; 지방육종, GIST, 섬유육종 및 횡문근육종을 포함한 간엽 기원의 종양; 성상세포종, 신경아세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함한 중추 및 말초 신경계 종양; 및 흑색종, 정상피종, 기형암종, 골육종, 색소성 건피증, 각질극 세포종, 갑상선 여포성 암 및 카포시 육종을 포함한 기타 종양 중에서 선택되는 약학적 조성물.
- 제17항에 있어서, 암이 난소암, 유방암, 전립선암 또는 중피종암 중에서 선택되는 약학적 조성물.
- 제18항에 있어서, 질환이 난소암인 약학적 조성물.
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