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KR102039302B1 - A composition comprising an exosome derived from stem cell as an active ingredient and its application for reinforcing or improving skin barrier - Google Patents

A composition comprising an exosome derived from stem cell as an active ingredient and its application for reinforcing or improving skin barrier Download PDF

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KR102039302B1
KR102039302B1 KR1020180138604A KR20180138604A KR102039302B1 KR 102039302 B1 KR102039302 B1 KR 102039302B1 KR 1020180138604 A KR1020180138604 A KR 1020180138604A KR 20180138604 A KR20180138604 A KR 20180138604A KR 102039302 B1 KR102039302 B1 KR 102039302B1
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skin
skin barrier
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조병성
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주식회사 엑소코바이오
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Abstract

본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 피부 장벽 보호, 강화 내지 기능 개선과 관련된 객관적 지표들을 개선시킨다. 본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 예를 들어, TEWL(경피수분손실)과 같은 피부 각질층의 수분 감소 지표를 개선시키고, 피부수분 함유량(skin hydration)을 증가시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 세라마이드, 디히드로세라마이드 및 스핑고 염기의 함량 증가, 이들의 합성에 관여하는 효소 활성 증가, 및 이들의 분해에 관여하는 효소 활성 감소의 효능을 나타낸다. 뿐만 아니라 본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 피부장벽 손상과 밀접한 관련이 있는 TSLP, IL-4 및 IL-13을 감소시켜 피부장벽에 기여하는 지질 및 단백질이 감소하는 악순환을 저지하여 피부장벽 기능 회복에 기여할 수 있다. The composition for enhancing skin barrier function or improving the function of the present invention improves objective indicators related to skin barrier protection, enhancement or function improvement. The composition for strengthening the skin barrier or improving the function of the present invention may improve the water reduction index of the stratum corneum, such as TEWL (transdermal moisture loss), and increase skin hydration. In addition, the composition for enhancing skin barrier or improving the function of the present invention is effective in increasing the content of ceramide, dehydroceramide and sphingo base, increasing the activity of enzymes involved in their synthesis, and decreasing the activity of enzymes involved in their degradation. Indicates. In addition, the composition for enhancing skin barrier or improving the function of the present invention reduces TSLP, IL-4 and IL-13 which are closely related to skin barrier damage, thereby preventing a vicious cycle in which lipids and proteins that contribute to skin barrier are reduced. May contribute to the recovery of barrier function.

Description

줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부장벽 강화 내지 기능 개선 용도 {A composition comprising an exosome derived from stem cell as an active ingredient and its application for reinforcing or improving skin barrier}A composition comprising an exosome derived from stem cell as an active ingredient and its application for reinforcing or improving skin barrier}

본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부장벽 강화 내지 기능 개선 용도에 관한 것이다.The present invention relates to the use of the skin barrier to enhance the function of the composition comprising a stem cell-derived exosomes as an active ingredient.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물에 관한 것이다.In addition, the present invention relates to a pharmaceutical composition, skin external preparation and cosmetic composition for skin barrier enhancement or function improvement, comprising the composition.

피부는 표피, 진피, 피하지방조직의 3개 층으로 크게 구성된다. 표피(epidermis)는 바깥쪽에서 안쪽으로 각질층, 투명층, 과립층, 기저층으로 나뉜다. 표피의 최외곽 층인 피부 각질층(stratum corneum)은 피부장벽 기능의 가장 중요한 구조로서, 무핵의 편평한 각질세포(corneocytes)와, 각질세포간 지질(SC intercellular lipid)로 이루어져 있다. 피부 각질층의 각질세포 간에는 스핑고지질(sphingolipids), 인지질(phospholipids), 콜레스테롤 황산염(cholesterol sulfate), 중성지질(neutral lipids) 등 다양한 종류의 지질이 존재하고, 이러한 지질들은 각질세포 사이에 존재하여 피부 수분의 증발을 방지하고, 외부 자극이나 오염으로부터 피부를 보호하는 피부장벽의 기능을 한다.The skin is largely composed of three layers: epidermis, dermis and subcutaneous fat tissue. The epidermis is divided into stratum corneum, transparent layer, granule layer and basal layer from the outside to the inside. The stratum corneum, the outermost layer of the epidermis, is the most important structure of skin barrier function, and consists of unnuclear flat corneocytes and SC intercellular lipids. Between keratinocytes of the stratum corneum, there are various types of lipids such as sphingolipids, phospholipids, cholesterol sulfate, and neutral lipids.These lipids are present between the keratinocytes and the skin. It acts as a skin barrier to prevent evaporation of moisture and to protect the skin from external irritation or contamination.

특히, 각질세포가 합성하는 세라마이드, 콜레스테롤, 및 지방산과 같은 세포간 지질로 형성된 다층 라멜라 지질층(multi lamella lipid layer) 또는 다층 라멜라 구조(multi lamella structure)는 피부 수분의 과도한 유실을 방지하고, 외부의 알레르겐이나 유해 물질이 피부로 침투하는 것을 방지하는 피부장벽 역할을 한다. 세라마이드는 N-아실레이티드 스핑고이드(N-acylated sphingoid) 화합물로서, 스핑고신, 피토스핑고신, 스핑가닌이라는 스핑고 염기(sphingoid base)에 지방산이 아미드 결합된 물질이다. 또한, 각질세포 외피는 인볼루크린(involucrin), 로리크린(loricrin), 필라그린(filaggrin) 등의 단백질 막으로 구성되며, 세라마이드 중 히드록시 세라마이드(hydroxyceramide)는 이들 단백질에 강력하게 결합하여 피부장벽의 구조를 견고하게 하는 것이 알려져 있다. 따라서, 세라마이드와 히드록시 세라마이드는 다층 라멜라 지질층의 피부장벽을 형성하고 단백질 피부장벽 구조 강화에 기여하므로, 세라마이드, 히드록시 세라마이드 및/또는 스핑고 염기의 생성량 증가, 이들의 합성에 관여하는 효소 활성 증가, 및 이들의 분해에 관여하는 효소 활성 감소는 피부 장벽 강화에 기여한다고 할 수 있다.In particular, a multi lamella lipid layer or a multi lamella structure formed of intercellular lipids such as ceramide, cholesterol, and fatty acids synthesized by keratinocytes prevents excessive loss of skin moisture. It acts as a skin barrier to prevent allergens and harmful substances from penetrating the skin. Ceramide is an N-acylated sphingoid compound in which fatty acids are amide-bound to a sphingoid base called sphingosine, phytosphingosine, or sphinginine. In addition, the keratinocyte envelope is composed of protein membranes such as involucrin, loricrin, and filaggrin, and hydroxyceramide of ceramide strongly binds to these proteins to the skin barrier. It is known to solidify the structure of. Thus, ceramides and hydroxy ceramides form the skin barrier of the multilayer lamellar lipid layer and contribute to the strengthening of the protein skin barrier structure, thus increasing the amount of ceramide, hydroxy ceramide and / or sphingo bases, and increasing the enzyme activity involved in their synthesis. , And decreased enzyme activity involved in their degradation contribute to skin barrier strengthening.

한편, 각종 스트레스나 환경 오염으로 인한 피부 스트레스, 잦은 세안 및 자연적인 피부 노화, 필라그린 유전자(FLG) 기능소실 돌연변이 등의 여러 가지 원인으로 인하여 피부장벽이 손상될 수 있다. 피부장벽이 손상되면 화학물질과 미생물들이 피부 속으로 쉽게 침투하여 피부염, 피부 건조증 등을 유발할 수 있다. On the other hand, the skin barrier may be damaged due to various causes such as skin stress due to various stresses or environmental pollution, frequent face-washing and natural skin aging, mutations in the Fila Green gene ( FLG ) loss. Damage to the skin barrier can easily penetrate chemicals and microorganisms into the skin, causing dermatitis and dry skin.

따라서, 피부장벽의 손상이 오기 전에 피부장벽을 선제적으로 보호, 강화 내지는 개선하기 위해 피부 장벽 강화 또는 피부 보습을 위한 조성물이나 기능성 화장품이 최근 주목을 받고 있다. 피부장벽 강화 내지 기능 개선을 위해 예를 들어, 수분을 흡수하는 성질이 있는 휴멕턴트(humectant)나, 수분 증발을 방지하는 폐쇄 보습제(occlusive moisturizer)가 사용되고 있다. 피부장벽이 일단 손상되면, 보습제를 바르더라도 피부장벽이 잘 회복되지 않아 스테로이드 치료제를 처방하지만, 스테로이드 치료제를 장기간 사용하게 되면 피부가 위축되거나 모세혈관이 확장될 수 있고, 오히려 피부장벽 기능의 약화를 초래할 수 있다. 따라서, 피부장벽이 손상되기 전에 피부장벽의 보호, 강화 내지는 기능 개선을 하는 것이 중요하다.Therefore, in order to preemptively protect, strengthen or improve the skin barrier before the damage of the skin barrier, compositions or functional cosmetics for strengthening the skin barrier or moisturizing the skin have been recently attracting attention. For example, a humectant that absorbs moisture or an occlusive moisturizer that prevents evaporation of water is used to enhance skin barrier or improve function. Once the skin barrier is damaged, even if moisturizer is applied, the skin barrier does not recover well and steroid treatment is prescribed.However, long-term use of steroid treatment may cause skin atrophy or capillary enlargement. Can cause. Therefore, it is important to protect, strengthen or improve the function of the skin barrier before the skin barrier is damaged.

이러한 문제점을 감안하여 천연물을 이용한 피부장벽 강화 내지 기능 개선에 대한 연구가 활발하다. 이러한 천연물을 원료로 하는 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물의 경우, 천연 추출물 내의 유효성분 함량이 적은 관계로 피부장벽 강화 내지 기능 개선 효과를 얻기 위해서는 많은 양의 사용이 필요하고, 이들 중 대부분은 천연물 소재라는 점을 마케팅에 활용하고 있을 뿐 피부장벽 강화 내지 기능 개선의 실질적 효능에 대해서는 과학적 연구가 좀더 필요한 상황이다.In view of these problems, there are active studies on skin barrier enhancement or function improvement using natural products. In the case of skin barrier reinforcement or function improvement composition using the natural material as a raw material, a large amount of use is required in order to obtain a skin barrier reinforcement or function improvement effect due to the low content of active ingredients in the natural extract. Only the fact that it is a material is used for marketing, but more scientific research is needed on the actual effect of strengthening skin barrier or improving function.

한편, 줄기세포를 이용하여 피부 상태나 질환을 개선 또는 치료하고자 하는 방법이 제안되고 있다. 배아줄기세포 또는 태아조직 유래 줄기세포는 분화능력 및 재생치료능력이 우수하고 거부반응이 적지만, 윤리적 문제로 임상에 적용될 수 없고 종양을 형성할 수 있는 위험성이 존재한다. 이에 대한 대안으로서 성체줄기세포를 이용하여 피부 상태나 질환을 개선 또는 치료하고자 하는 방법이 제안되었다. 그러나, 환자 자신의 성체줄기세포가 아닌 타인의 성체줄기세포를 사용한 경우 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)을 일으킬 위험이 있고, 자가 성체줄기세포를 이용하여 치료를 하기 위해서는 환자로부터 성체줄기세포를 채취한 후 이를 배양하는 과정이 필요하여 복잡하고 비용이 많이 드는 문제가 있다. On the other hand, a method for improving or treating skin conditions or diseases using stem cells has been proposed. Although embryonic stem cells or fetal tissue-derived stem cells have excellent differentiation and regenerative treatment ability and low rejection, they are not applicable to clinical practice due to ethical issues and there is a risk of forming tumors. As an alternative, a method for improving or treating a skin condition or disease using adult stem cells has been proposed. However, there is a risk of graft-versus-host disease if adult stem cells of other than the patient's own adult stem cells are used, and adult stem cells may be used to treat autologous adult stem cells. There is a complicated and expensive problem because the process of culturing stem cells after harvesting them.

최근에는 전술한 바와 같은 줄기세포의 문제점을 감안하여 성체줄기세포를 배양하여 얻은 배양액을 이용하여 피부 상태나 질환을 개선 또는 치료하고자 하는 시도가 있다. 그러나, 성체줄기세포 배양액에는 성체줄기세포가 분비하는 다양한 단백질, 사이토카인, 성장인자 등이 함유되어 있는 반면, 세포가 성장하면서 분비한 노폐물, 오염방지를 위해 첨가된 항생제, 동물유래 혈청 등의 성분도 포함되어 있기 때문에 피부에 사용할 경우 각종 위험에 노출될 가능성이 높다. Recently, in view of the problems of stem cells as described above, there is an attempt to improve or treat skin conditions or diseases using a culture medium obtained by culturing adult stem cells. However, the adult stem cell culture medium contains various proteins, cytokines, and growth factors secreted by the adult stem cells, while other components such as waste products secreted as the cells grow, antibiotics added to prevent contamination, and animal-derived serum. Because it is included, it is likely to be exposed to various risks when used on the skin.

최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다. Recently, research has been reported that the cell secretome contains various bioactive factors that regulate the behavior of the cells. Especially, in the cell secretion, 'exosomes', which have intercellular signaling functions, As it is included, research on its components and functions is actively underway.

세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.Cells release various membrane types of endoplasmic reticulum into the extracellular environment, which are commonly referred to as extracellular vesicles (EVs). Extracellular vesicles are called cell membrane-derived vesicles, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes, and the like, and in some cases, may be used separately from exosomes.

엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579). Exosomes are tens to hundreds of nanometers of endoplasmic reticulum consisting of a double phospholipid membrane identical to the structure of a cell membrane, and include proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosome cargo. Exosome cargo includes a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and differently regulated by the environment of the secretory cell. Exosomes are intercellular signaling media secreted by cells, and the various cellular signals transmitted through them regulate cell behavior, including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells. Known. Exosomes contain specific genetic material and bioactive factors depending on the nature and state of the cells from which they are derived. Stem cell-derived exosomes, which proliferate, regulate cell behavior such as cell migration, proliferation and differentiation, and reflect stem cell characteristics related to tissue regeneration (Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).

그러나, 엑소좀을 이용한 일부 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 보다 면밀한 임상 및 비임상 연구가 필요하며, 특히 엑소좀이 작용하는 다양한 표적을 과학적으로 규명하여 엑소좀을 다양한 질환 치료에 응용할 수 있는 기술의 개발이 필요한 실정이다.However, despite various studies, such as suggesting the possibility of treating some diseases using exosomes, more detailed clinical and nonclinical studies are needed, and in particular, exosomes are scientifically identified for various targets on which exosomes work. It is necessary to develop a technology that can be applied to the treatment of various diseases.

본 발명자들은 피부장벽 강화 내지 기능 개선과 관련하여 종래 알려진 보습제나 스테로이드 치료제에 비하여 피부장벽 강화 내지는 기능 개선 효과가 뛰어나고 안전한 새로운 소재를 개발하고자 노력하였다. 이에 본 발명자들은 줄기세포로부터 유래된 엑소좀의 새로운 용도에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 줄기세포 배양액으로부터 분리된 엑소좀이 전술한 바와 같은 줄기세포 자체나 줄기세포 배양액의 안전성 문제를 해결할 수 있고, 피부장벽 강화 내지 기능 개선에 효과적임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.The present inventors endeavored to develop a new material having excellent skin barrier enhancement or function improvement and safety as compared to the conventionally known moisturizer or steroid treatment in relation to skin barrier enhancement or function improvement. Therefore, the present inventors have been intensively researching new uses of exosomes derived from stem cells, and exosomes isolated from stem cell cultures can solve the safety problems of stem cells or stem cell cultures as described above. The present invention was completed by confirming that it is effective in enhancing skin barrier or improving function.

한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.On the other hand, it is to be understood that the matters described as the background art are only for the purpose of improving the understanding of the background of the present invention and are not cited as an approval that they can be used as the "prior art" of the present invention.

대한민국 공개특허공보 제10-2017-0099743호 (2017.09.01)Republic of Korea Patent Publication No. 10-2017-0099743 (2017.09.01) 대한민국 공개특허공보 제10-2016-0116802호 (2016.10.10)Republic of Korea Patent Publication No. 10-2016-0116802 (2016.10.10)

Man MQ et al., Characterization of a hapten-induced, murine model with multiple features of atopic dermatitis: structural, immunologic, and biochemical changes following single versus multiple oxazolone challenges, Journal of Investigative Dermatology (2008) 128(1), 79-86 (2007.08.02)Man MQ et al., Characterization of a hapten-induced, murine model with multiple features of atopic dermatitis: structural, immunologic, and biochemical changes following single versus multiple oxazolone challenges, Journal of Investigative Dermatology (2008) 128 (1), 79- 86 (2007.08.02) Pin Li et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics, 2017, 7(3): 789-804 (2017.01.26)Pin Li et al., Progress in Exosome Isolation Techniques, Theranostics, 2017, 7 (3): 789-804 (January 26, 2017) Coumans et al., Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles, Circulation Research, 2017, 120:1632-1648 (2017.05.12)Coumans et al., Methodological Guidelines to Study Extracellular Vesicles, Circulation Research, 2017, 120: 1632-1648 (2017.05.12)

본 발명의 목적은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물의 피부장벽 강화 내지 기능 개선 용도를 제공하는데 있다.Disclosure of Invention An object of the present invention is to provide a skin barrier strengthening or functional improvement of a composition comprising a stem cell-derived exosome as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition, skin external preparation and cosmetic composition for skin barrier enhancement or function improvement comprising the composition.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 피부장벽 강화 내지 기능 개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공하는데 있다.  Still another object of the present invention is to provide a cosmetic method for controlling the condition of mammalian skin by enhancing the skin barrier or improving the function except for the treatment.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여, 피부장벽 기능 손상으로 인한 피부질환의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법을 제공하는데 있다.Still another object of the present invention is to provide a method for preventing, inhibiting, alleviating, ameliorating or treating a skin disease caused by impaired skin barrier function using the composition.

그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.However, the problems of the present invention as described above are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby. Further objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for enhancing the skin barrier to improve the function, including the stem cell-derived exosomes as an active ingredient.

본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.As used herein, the term "exosomes" refers to vesicles of a size ranging from tens to hundreds of nanometers (preferably approximately 30 to 200 nm) consisting of a double phospholipid membrane identical to the structure of a cell membrane, provided that Particle size of exosomes may vary depending on the cell type, isolation method and measurement method) (Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007 / s00216-015-8535-3). Exosomes include proteins called exosome cargo (cargo), nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.). Exosome cargo includes a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and differently regulated by the environment of the secretory cell. Exosomes are intercellular signaling media secreted by cells, and the various cellular signals transmitted through them regulate cell behavior, including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells. Known.

한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.On the other hand, the term "exosome" as used herein has a nano-size vesicle structure secreted by stem cells and released into the extracellular space and a vesicle having a composition similar to exosomes (eg, exosomes- Pseudo vesicles). The type of the stem cells is not limited, but as an example, which does not limit the present invention, preferably may be mesenchymal stem cells, for example, fat, bone marrow, umbilical cord or cord blood-derived stem cells, more preferably Fat-derived stem cells. The type of the adipose derived stem cells is not limited as long as there is no risk of infection by the pathogen and does not cause an immune rejection reaction, but preferably, human adipose derived stem cells.

그러나 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래의 엑소좀은 피부장벽 강화 내지 기능 개선에 효과가 있고 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래의 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 줄기세포 유래의 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.However, the stem cell-derived exosomes used in the present invention may be effective in enhancing skin barrier or improving function, and may be used in the art or may be used in the future as long as they do not cause adverse effects on the human body. Of course. Therefore, the exosomes derived from stem cells isolated according to the isolation method of the embodiments described below should be understood as an example of the exosomes that can be used in the present invention, and the present invention is not limited thereto.

본 명세서에서 사용되는 용어, "피부장벽 강화 내지 기능 개선"이라 함은 피부 각질층(stratum corneum)의 피부장벽 기능을 보호, 강화 내지는 개선하는 것을 의미하고, 진피나 피하지방조직의 재생이나 기능 개선을 의미하지 않는다. 예를 들어, "피부장벽 강화 내지 기능 개선"은 피부 각질층의 수분 감소 방지, 예를 들어 TEWL(경피수분손실)과 같은 피부 각질층의 수분감소 지표의 개선, 피부수분 함유량(skin hydration)의 증가, 세라마이드, 디히드로세라마이드 및/또는 스핑고 염기의 생성량 증가 등과 같은 피부장벽지표 개선을 통해 진정한 의미의 피부 각질층의 피부장벽 기능의 보호, 강화 및/또는 개선을 가져오는 것을 의미한다.As used herein, the term "strengthening or improving the skin barrier" refers to protecting, enhancing or improving the skin barrier function of the stratum corneum and improving the regeneration or function of the dermis or subcutaneous fat tissue. Does not mean For example, "strengthening the skin barrier or improving the function" can be used to prevent the loss of moisture in the stratum corneum, for example, to improve the water loss index of the stratum corneum, such as TEWL (transdermal moisture loss), to increase the skin hydration, Improving skin barrier indicators, such as increasing the amount of ceramide, dihydroceramide and / or sphingo base, means protecting, enhancing and / or improving the skin barrier function of the stratum corneum in the true sense of the skin.

본 명세서에서 사용되는 용어인 "피부 보습"은 피부의 수분 손실(수분 증발) 등을 적절히 조절하여 생체의 항상성을 유지하는 것을 의미한다. "피부 트러블"이란 외부 자극이나 신체적 변화에 의해 피부가 붉게 변하고 가려움증이 나타나며, 심한 경우 작은 돌기나 뾰루지 등이 생기는 현상을 의미한다. As used herein, the term "skin moisturizing" means maintaining the homeostasis of the living body by appropriately controlling the moisture loss (moisture evaporation) of the skin and the like. "Skin Trouble" refers to a phenomenon in which the skin turns red and itch due to external stimulation or physical changes, and in severe cases, small bumps or rashes occur.

줄기세포 유래의 엑소좀을 이용한, 제한적인 주름개선 및 피부재생 효과가 보고된 바가 있다. 그러나, 상기 종래기술에 있어서의 엑조좀을 이용한 피부재생은 피부각질층의 피부장벽 기능의 보호, 강화 또는 개선에 관한 것이 아니고, 피하지방조직의 재생을 통해 주름을 개선하거나 피부 탄력을 회복시키는 것에 관한 것이었다. 그리고 줄기세포, 줄기세포 배양액 등을 이용하여 피부 중 진피층을 재생하여 창상을 치료하고, 피하지방조직을 재생하여 피부 탄력을 개선하고자 한 시도는 있으나, 현재까지 줄기세포 배양액으로부터 분리 정제된 엑소좀을 사용할 때 전술한 바와 같이 정의된 "피부장벽 강화 내지 기능 개선" 효과가 있다는 것에 대해서는 공지된 바가 없었다.Limited wrinkling and skin regeneration effects have been reported using exosomes derived from stem cells. However, skin regeneration using exosomes in the prior art is not related to the protection, reinforcement or improvement of the skin barrier function of the stratum corneum, but to improve wrinkles or restore skin elasticity through regeneration of subcutaneous fat tissue. Was. In addition, there have been attempts to improve skin elasticity by regenerating the dermis layer of the skin using stem cells and stem cell cultures, and to improve skin elasticity by regenerating subcutaneous fat tissues. It is not known that when used there is a "skin barrier to function improvement" effect as defined above.

본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 약학 조성물, 피부외용제 또는 화장료 조성물로 적용될 때, 유효성분으로 함유된 줄기세포 유래의 엑소좀이 피부장벽 강화 내지 기능 개선에 유의적인 효과를 나타내며, 줄기세포 자체나 줄기세포 배양액의 안전성 문제를 해결할 수 있다. 따라서, 본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물에 포함된 줄기세포 유래의 엑소좀은 종래에 알려진 제한적인 주름개선 및 피부재생과는 전혀 다른 메카니즘으로 피부장벽의 강화 내지 기능개선 효능을 나타내며 이러한 효능은 종래기술로부터 전혀 예측할 수 없는 것임을 명백히 밝혀 둔다.When the composition for skin barrier enhancement or function improvement of the present invention is applied as a pharmaceutical composition, a skin external preparation or a cosmetic composition, the exosomes derived from stem cells as an active ingredient exhibit a significant effect on skin barrier enhancement or function improvement. The safety of the cells themselves or stem cell culture can be solved. Therefore, the exosomes derived from stem cells included in the skin barrier strengthening or function improving composition of the present invention have a mechanism that is completely different from the conventional limited wrinkle improvement and skin regeneration and exhibits the effect of strengthening or improving the skin barrier. Efficacy is clearly unpredictable from the prior art.

본 발명의 일 구체예의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함한다.Skin barrier reinforcement to function improvement composition of one embodiment of the present invention, the stem cell-derived exosomes as an active ingredient.

본 발명의 일 구체예의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 TEWL(transepidermal water loss)을 감소시키고 피부수분 함유량(skin hydration)을 증가시키는 것을 특징으로 한다.In the composition for strengthening the skin barrier or improving the function of an embodiment of the present invention, the exosome is characterized by reducing the transepidermal water loss (TEWL) and increasing the skin moisture content (skin hydration).

본 발명의 일 구체예의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 피부에서 세라마이드, 디히드로세라마이드 또는 스핑고 염기 중 적어도 1종의 생성량을 증가시키는 것을 특징으로 한다. In the composition for strengthening the skin barrier or improving the function of an embodiment of the present invention, the exosome is characterized by increasing the amount of at least one of ceramide, dehydroceramide or sphingo base in the skin.

구체적으로, 상기 엑소좀은 C16 세라마이드, C18 세라마이드, C20 세라마이드, C22 세라마이드, C24 세라마이드, 또는 C24:1 세라마이드 중 적어도 1종의 생성량 및 총 세라마이드의 생성량을 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 엑소좀은 C16 디히드로세라마이드, C18 디히드로세라마이드, C22 디히드로세라마이드, C24 디히드로세라마이드, 또는 C24:1 디히드로세라마이드 중 적어도 1종의 생성량 및 총 디히드로세라마이드의 생성량을 증가시킬 수 있다. 추가로, 상기 엑소좀은 S1P(Sphingosine-1-phosphate) 또는 스핑고신 중 적어도 1종의 생성량을 증가시킬 수 있다.Specifically, the exosomes may increase the production amount of at least one of C16 ceramide, C18 ceramide, C20 ceramide, C22 ceramide, C24 ceramide, or C24: 1 ceramide and total ceramide production. In addition, the exosomes may increase the production amount of at least one of C16 dihydroceramide, C18 dihydroceramide, C22 dihydroceramide, C24 dihydroceramide, or C24: 1 dihydroceramide and the total amount of dihydroceramide. have. In addition, the exosomes can increase the production amount of at least one of S1P (Sphingosine-1-phosphate) or sphingosine.

본 발명의 일 구체예의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 피부에서 스핑고신 키나아제(Sphingosine kinase)인 SPHK1의 활성을 증가시키고 스핑고 염기인 S1P(Sphingosine 1-phosphate)를 분해하는 효소인 S1P 리아제(S1P lyase)의 활성을 감소시킬 수 있다.In the composition for enhancing skin barrier or improving function of an embodiment of the present invention, the exosomes increase the activity of SPHK1, a sphingosine kinase, and decompose sphingosine 1-phosphate (S1P), which is a sphingosine kinase in the skin. It can reduce the activity of the enzyme S1P lyase (S1P lyase).

본 발명의 일 구체예의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물에 있어서, 상기 엑소좀은 피부에서 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin), IL-4 및 IL-13의 발현 또는 생성을 감소시킬 수 있다.In the composition for strengthening the skin barrier or improving the function of an embodiment of the present invention, the exosome can reduce the expression or production of TSLP (Thymic stromal lymphopoietin), IL-4 and IL-13 in the skin.

본 발명의 일 구체예의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 주사제로 제조될 수 있다. Skin barrier strengthening to improve the composition of one embodiment of the present invention may be a pharmaceutical composition. For example, the pharmaceutical composition may be prepared by injection.

본 발명의 일 구체예의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 화장료 조성물 또는 피부 외용제일 수 있다. 예를 들어, 화장료 조성물은 크림 또는 로션일 수 있다.The composition for enhancing skin barrier or improving function of one embodiment of the present invention may be a cosmetic composition or an external preparation for skin. For example, the cosmetic composition may be a cream or lotion.

본 발명의 일 구체예의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 다양한 원인에 기인한 피부장벽 기능 손상의 예방, 억제, 완화 또는 개선에 효과적으로 이용될 수 있다.The composition for enhancing skin barrier or improving function of an embodiment of the present invention can be effectively used for the prevention, suppression, alleviation or improvement of skin barrier function damage due to various causes.

본 발명의 일 구체예의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 약학 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물이 약학 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 일 구체예에 따른 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. The composition for enhancing skin barrier or improving function of one embodiment of the present invention may be prepared as a pharmaceutical composition. When the composition for enhancing skin barrier or improving function of one embodiment of the present invention is prepared as a pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition according to one embodiment of the present invention may be various oral or parenteral formulations.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 과립제, 엘릭시르제(elixirs), 에어로졸 등의 경구투여용 제제, 외용제, 좌제, 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. The pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent. The carrier, excipient and diluent may include lactose, dextrose, trehalose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium carbonate, calcium silicate, cellulose , Methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like, but are not limited thereto. . Pharmaceutical compositions of one embodiment of the present invention, powders, pills, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, granules, oral preparations such as elixirs, aerosols, external preparations, suppositories, according to a conventional method Or in the form of sterile injectable solutions.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여로는 경피 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 림프 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 유효량은 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.Administration of the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention means introducing a predetermined substance into the patient in any suitable manner, the route of administration of the pharmaceutical composition via any general route as long as the drug can reach the target tissue. Can be. For example, the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention may be administered orally or parenterally, and parenteral administration may include transdermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intraarterial administration, lymphatic administration, intramuscular administration, Subcutaneous administration, intradermal administration, topical administration, rectal administration, and the like can be discussed. However, it is not limited thereto and does not exclude various methods of administration known in the art. In addition, the pharmaceutical compositions of one embodiment of the present invention may be administered by any device in which the active substance may migrate to the target tissue or cell. In addition, an effective amount of the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention means an amount required for administration in order to expect a therapeutic effect.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 또는 좌제일 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 비경구 투여용 제제는 주사제로도 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.Formulation for parenteral administration of the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention may be a sterile aqueous solution, non-aqueous solvent, suspension, emulsion, lyophilized formulation, or suppository. Formulations for parenteral administration of the pharmaceutical compositions of one embodiment of the invention may also be prepared by injection. Injectables of one embodiment of the present invention may be, but are not limited to, aqueous injections, non-aqueous injections, aqueous suspension injections, non-aqueous suspension injections, or solid injections used by dissolution or suspension. Injectables of one embodiment of the present invention, depending on the type of distilled water for injection, vegetable oil (for example, peanut oil, sesame oil, camellia oil, etc.), monoglycerides, diglycerides, propylene glycol, camphor, ester benzoic acid benzoic acid, bismuth bismuth It may include at least one of sodium arsenobenzol, or streptomycin, and optionally may include a stabilizer or preservative.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약학 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.The blending ratio of the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention may be appropriately selected depending on the kind, amount, form, etc. of the additional ingredients as described above. For example, with respect to the total amount of injection, the pharmaceutical composition of the present invention may be included in an amount of about 0.1 to 99% by weight, preferably about 10 to 90% by weight. In addition, suitable dosages of the pharmaceutical compositions of one embodiment of the present invention include the type of disease of the patient, the severity of the disease, the type of formulation, the method of formulation, the age, sex, weight, health condition, diet, excretion rate, time of administration and administration of the patient. It can be adjusted according to the method. For example, when administering the pharmaceutical composition of an embodiment of the present invention to adults, it may be administered in one to several divided doses of 0.001 mg / kg to 100 mg / kg per day.

한편, 본 발명의 일 구체예의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물이 피부외용제 및/또는 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장품이나 피부외용제에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다. On the other hand, when the composition for strengthening the skin barrier to improve the function of one embodiment of the present invention is made of a skin external preparation and / or a cosmetic composition, the components usually used in cosmetics or external preparations within the range that does not impair the effects of the present invention, For example, a moisturizer, antioxidant, oily component, ultraviolet absorber, emulsifier, surfactant, thickener, alcohol, powder component, colorant, aqueous component, water, various skin nutrients, etc. can be suitably blended as needed.

또한, 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 줄기세포 유래의 엑소좀 이외에, 그 작용(피부장벽 강화 내지 기능 개선 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 피부장벽 강화 내지 기능 개선제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 엑소좀은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에서, 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.In addition, the skin external preparation and / or cosmetic composition of one embodiment of the present invention, in addition to exosomes derived from stem cells, has been used conventionally for enhancing skin barrier to the extent that it does not impair its action (such as skin barrier enhancement or function improvement). Modifiers and / or moisturizers may be used together. For example, the exosomes of the present invention may be supported or mixed on at least one of a hydrogel, hyaluronic acid, a hyaluronic acid salt (for example, sodium hyaluronate), or a hyaluronic acid gel. In the external preparation for skin and / or cosmetic composition of one embodiment of the present invention, the type of the hydrogel is not limited, but preferably may be a hydrogel obtained by dispersing a gelling polymer in a polyhydric alcohol. The gelling polymer is at least one selected from the group consisting of pluronic, purified agar, agarose, gellan gum, alginic acid, carrageenan, cassia gum, xanthan gum, galactomannan, glucomannan, pectin, cellulose, guar gum and locust bean gum. The polyhydric alcohol may be at least one selected from the group consisting of ethylene glycol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, isobutylene glycol, dipropylene glycol, sorbitol, xylitol, and glycerin.

본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다. 예를 들어, 상기 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적될 수 있다.The external preparation for skin and / or cosmetic composition of one embodiment of the present invention may include, for example, patches, mask packs, mask sheets, creams, tonics, ointments, suspensions, emulsions, pastes, lotions, gels, oils, packs, sprays, and aerosols. It can be applied to various forms such as, mist, foundation, powder and oil paper. For example, the external preparation for skin and / or cosmetic composition may be applied or deposited on at least one side of a patch, mask pack or mask sheet.

본 발명의 일 구체예의 피부외용제가 화장료 조성물로 제조되는 경우, 피부장벽 강화, 기능 개선 및/또는 피부 보습을 목적으로 사용되며, 화장품 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.When the external preparation for skin of one embodiment of the present invention is made of a cosmetic composition, it is used for the purpose of strengthening skin barrier, improving function and / or skin moisturizing, and the cosmetic formulation may be prepared as any formulation commonly prepared in the art. have. For example, patch, mask pack, mask sheet, supple cosmetics, nourishing cosmetics, astringent cosmetics, nourishing cream, massage cream, eye cream, cleansing cream, essence, eye essence, cleansing lotion, cleansing foam, cleansing water, sunscreen, lipstick , Soaps, shampoos, surfactant-containing cleansing, bathing agents, body lotions, body creams, body oils, body essences, body cleaners, hair dyes, hair tonic and the like, but is not limited thereto.

본 발명의 일 구체예의 피부외용제 및/또는 화장료 조성물은 피부외용제 및/또는 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 피부외용제 및/또는 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 피부외용제 및/또는 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다. The external preparation for skin and / or cosmetic composition of one embodiment of the present invention comprises ingredients conventionally used in external preparations for skin and / or cosmetics, such as conventional adjuvants such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavorings. And a carrier. In addition, in each formulation for the external preparation for skin and / or cosmetic composition, other ingredients may be appropriately selected and blended by those skilled in the art without difficulty according to the kind or purpose of use of the external preparation for skin and / or cosmetic composition.

본 발명의 다른 구체예는 상기 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물을 이용하여, 치료용을 제외한 피부장벽 강화 내지 기능 개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 미용방법에 있어서, 피부의 상태 조절이란 피부의 상태를 개선시키고/시키거나 피부의 상태를 예방적으로 조절하는 것을 의미하고, 피부의 상태 개선이란 피부 조직의 외관 및 느낌의 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화를 의미한다. 예를 들어, 피부의 상태 개선이란 피부 보습 향상, 피부 매끄러움 향상, 피부건조증 예방, 피부 트러블 예방, 피부의 붉은기 감소 등일 수 있다.Another embodiment of the present invention provides a cosmetic method for controlling the condition of the mammalian skin through the skin barrier enhancement or function improvement except for the treatment using the skin barrier enhancement or function improvement composition. In the cosmetic method of the present invention, controlling the condition of the skin means improving the condition of the skin and / or preventing the condition of the skin, and improving the condition of the skin is a visual and / or Or it means a positive change that can be perceived tactilely. For example, improving the condition of the skin may include improving skin moisturizing, improving skin smoothness, preventing skin dryness, preventing skin trouble, reducing redness of the skin, and the like.

본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (a) 상기 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함한다. 상기 (a) 단계에서는 상기 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다. The cosmetic method of one embodiment of the present invention, (a) directly applying the composition for enhancing the skin barrier to improve the function of the skin of the mammal, (b) the composition for enhancing or improve the skin barrier to the function is applied or deposited Contacting or attaching the patch, mask pack or mask sheet to the skin of a mammal, or sequentially proceeding with (a) and (b) above. In the step (a), a lotion or cream may be used as the composition for strengthening the skin barrier or improving the function.

대안으로, 본 발명의 일 구체예의 미용방법은, (c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 (c) 단계에서는 상기 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물로서 로션이나 크림이 사용될 수 있다. Alternatively, the cosmetic method of one embodiment of the present invention, (c) after removing the patch, mask pack or mask sheet from the skin of the mammal after step (b), the composition for strengthening the skin barrier to improve the function It may further comprise the step of applying to the skin of the mammal. In the step (c), a lotion or cream may be used as the composition for strengthening the skin barrier or improving the function.

본 발명의 또 다른 구체예는 상기 약학 조성물의 치료학적으로 유효한 양을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 피부장벽 기능 손상으로 인한 피부질환을 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 포유동물은 인간, 개, 고양이, 설치류, 말, 소, 원숭이, 또는 돼지일 수 있다.Another embodiment of the present invention provides a method for preventing, inhibiting, alleviating, ameliorating or treating a skin disease caused by impaired skin barrier function, comprising administering to a mammal a therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition. do. The mammal may be a human, dog, cat, rodent, horse, cow, monkey, or pig.

본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 피부 장벽 보호, 강화 내지 기능 개선과 관련된 객관적 지표들을 개선시킨다. 본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 예를 들어, TEWL(경피수분손실)과 같은 피부 각질층의 수분 감소 지표를 개선시키고, 피부수분 함유량(skin hydration)을 증가시킬 수 있다. The composition for enhancing skin barrier function or improving the function of the present invention improves objective indicators related to skin barrier protection, enhancement or function improvement. The composition for strengthening the skin barrier or improving the function of the present invention may improve the water reduction index of the stratum corneum, such as TEWL (transdermal moisture loss), and increase skin hydration.

또한, 본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 세라마이드, 디히드로세라마이드 및/또는 스핑고 염기의 함량 증가, 이들의 합성에 관여하는 효소 활성 증가, 및 이들의 분해에 관여하는 효소 활성 감소의 효능을 나타낸다. In addition, the composition for enhancing skin barrier or improving the function of the present invention is to increase the content of ceramide, dihydroceramide and / or sphingo base, increase the enzyme activity involved in their synthesis, and decrease the enzyme activity involved in their degradation It shows efficacy.

뿐만 아니라 본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 피부장벽 손상과 밀접한 관련이 있는 TSLP, IL-4 및 IL-13을 감소시켜 피부장벽에 기여하는 지질 및 단백질이 감소하는 악순환을 저지하여 피부장벽 기능 회복에 기여할 수 있다. In addition, the composition for enhancing skin barrier or improving the function of the present invention reduces TSLP, IL-4 and IL-13 which are closely related to skin barrier damage, thereby preventing a vicious cycle in which lipids and proteins that contribute to skin barrier are reduced. May contribute to the recovery of barrier function.

따라서, 본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.Therefore, the skin barrier strengthening to improve the composition of the present invention can be usefully used as a pharmaceutical composition, skin external preparation and cosmetic composition for skin barrier strengthening to improve the function.

한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.On the other hand, the scope of the present invention is not limited by the effects as described above.

도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 1A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "도 1D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 2는 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 3은 RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 본 발명의 엑소좀을 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 iNOS mRNA의 발현량이 감소한 것을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀에 의한, 염증 반응의 일종인 NO 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 4에서 PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), EXO는 엑소좀, CM은 지방줄기세포 배양액(conditioned media), CM-EXO는 엑소좀이 제거된 지방줄기세포 배양액(exosome-depeleted conditioned media)을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀에 의한, 염증성 사이토카인인 TNF-α 형성의 감소 효과를 확인한 실험 결과를 도시한다. 도 5에서, PBS는 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline), DEX는 덱사메타손(dexamethasone), 각 숫자는 엑소좀 처리량(μg/mL)을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀에 의한 NO 형성 감소 효과와, 종래의 침전법(PPT)에 의해 분리된 엑소좀에 의한 NO 형성 감소 효과를 비교한 실험 결과를 도시한다. 도 6A는 종래의 침전법에 의해 분리된 엑소좀의 NTA 분석 결과이고, 도 6B는 본 발명의 일 구체예에 따른 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀의 NTA 분석 결과이며, 도 6C는 NO 형성 감소 효과를 비교 도시한 그래프이다. NO 형성의 감소 정도는 양성대조군인 덱사메타손(Dex)에 의한 NO 형성 감소 정도에 대한 상대 비율(%)로 표시하였다.
도 7은 피부장벽 손상이 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 엑소좀의 용량 의존적으로 TEWL(transepidermal water loss)이 감소하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 8은 피부장벽 손상이 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 엑소좀의 용량 의존적으로 피부수분 함유량(skin hydration)이 증가하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 9는 피부장벽 손상이 유발된 마우스의 체중을 측정한 결과, 덱사메타손 처리군에서는 부작용으로 체중이 감소한 반면에, 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 실험군에서는 체중이 거의 감소하지 않은 것을 나타내는 그래프이다.
도 10a 내지 도 10g는 피부장벽 손상이 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 피부에서 세라마이드의 함량이 증가한 것을 나타내는 그래프이다.
도 11a 내지 도 11f는 피부장벽 손상이 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 피부에서 디히드로세라마이드의 함량이 증가한 것을 나타내는 그래프이다.
도 12는 피부장벽 손상이 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 피부에서 스핑고 염기의 함량이 증가한 것을 나타내는 그래프이다. 도 12A는 S1P(Sphingosine-1-phosphate)의 함량이 증가한 것을 도시하고, 도 12B는 스핑고신의 함량이 증가한 것을 도시한다.
도 13은 피부장벽 손상이 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 피부에서 SPHK1의 활성이 증가되고 S1P 리아제(S1P lyase)의 활성이 감소된 것을 나타내는 그래프이다.
도 14a는 각 실험군 별로 등 피부 조직을 H&E로 염색한 후 촬영한 조직 절편 사진이고, 도 14b는 귀 두께를 비교한 그래프이다.
도 15는 각 실험군 별로 피부 조직을 톨루이딘 블루로 염색한 후 촬영한 조직 절편 사진이다.
도 16은 각 실험군 별로 마우스의 지라 크기를 비교한 사진이다.
도 17은 피부장벽 손상이 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 피부에서 TSLP 수준이 감소한 것을 나타내는 ELISA 결과 그래프이다.
도 18은 피부장벽 손상이 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 피부에서 IL-4 수준이 감소한 것을 나타내는 ELISA 결과 그래프이다.
도 19는 피부장벽 손상이 유발된 마우스에 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 결과, 피부에서 IL-13 수준이 감소한 것을 나타내는 ELISA 결과 그래프이다.
도 20은 피부장벽 손상 시 TSLP, IL-4, IL-13 등이 증가하고 Th2 타입의 사이토카인(IL-4 및 IL-13)이 피부장벽에 기여하는 지질 및 단백질을 감소시켜 피부장벽을 손상시키는 악순환을 반복하게 되는 것을 설명하는 다이어그램이다.Figure 1 shows the results of physical characterization of the exosomes obtained in accordance with one embodiment of the present invention. FIG. 1A shows particle size distribution and particle number by tunable resistive pulse sensing (TRPS) analysis. FIG. 1B shows particle size distribution and number of particles by nanoparticle tracking analysis (NTA) analysis. FIG. 1C shows the particle images by magnification by means of the transmitted electron microscopy (TEM) analysis. FIG. 1D shows Western blot results of exosomes obtained according to one embodiment of the invention. FIG. 1E shows the results of flow cytometry for CD63 and CD81 in marker analysis for exosomes obtained according to one embodiment of the invention.
Figure 2 shows the results of confirming that there is no cytotoxicity after treating exosomes according to one embodiment of the present invention to HS68 cells, which are human skin fibroblasts.
Figure 3 shows the real-time PCR results confirmed that the expression level of TNF-α, IL-6, IL-1β and iNOS mRNA induced by LPS when treated with the exosome of the present invention with LPS for RAW 264.7 cells It is a graph shown.
Figure 4 shows the experimental results confirming the effect of reducing the formation of NO, a kind of inflammatory response by the exosomes according to an embodiment of the present invention. In Figure 4, PBS is a phosphate buffer (phosphate-buffered saline), DEX is dexamethasone (dexamethasone), EXO is exosomes, CM is a fat stem cell culture (conditioned media), CM-EXO is a exosome-derived fat stem cells Exosome-depeleted conditioned media is shown.
Figure 5 shows the experimental results confirming the effect of reducing the inflammatory cytokine TNF-α formation by the exosomes according to an embodiment of the present invention. In Figure 5, PBS is a phosphate buffer (phosphate-buffered saline), DEX is dexamethasone (dexamethasone), each number represents the exosome throughput (μg / mL).
Figure 6 shows the experimental results comparing the effect of reducing NO formation by exosomes separated by the exosomes separated according to an embodiment of the present invention, and the effect of reducing NO formation by exosomes separated by the conventional precipitation method (PPT) . Figure 6A is a result of NTA analysis of exosomes separated by a conventional precipitation method, Figure 6B is a result of NTA analysis of exosomes separated and purified by a method according to an embodiment of the present invention, Figure 6C is NO formation reduction It is a graph comparing the effect. The decrease in NO formation was expressed as a relative percentage (%) to the reduction in NO formation by the positive control dexamethasone (Dex).
FIG. 7 is a graph showing that the treatment of exosomes according to one embodiment of the present invention results in a decrease in transepidermal water loss (TEWL) depending on the dose of the exosomes.
8 is a graph showing that skin hydration is increased in dose-dependent manner of exosomes as a result of treating exosomes according to an embodiment of the present invention in mice in which skin barrier damage is induced.
Figure 9 is the weight of the mouse skin barrier damage induced, as a result of weight loss in the dexamethasone treated group, while weight in the experimental group treated with exosomes according to an embodiment of the present invention almost no weight loss It is a graph indicating that.
10A to 10G are graphs showing that the content of ceramide in the skin is increased as a result of treating the exosomes according to one embodiment of the present invention to mice in which skin barrier damage is induced.
11A to 11F are graphs showing that the content of dehydroceramide in the skin is increased as a result of treating exosomes according to an embodiment of the present invention in mice in which skin barrier damage is induced.
12 is a graph showing that the sphingo base content in the skin is increased as a result of treating exosomes according to one embodiment of the present invention in mice induced skin barrier damage. FIG. 12A shows an increase in the content of Sphingosine-1-phosphate (S1P), and FIG. 12B shows an increase in the content of sphingosine.
FIG. 13 is a graph showing that the treatment of exosomes according to an embodiment of the present invention in mice induced skin barrier damage resulted in increased SPHK1 activity and decreased S1P lyase activity in the skin.
14A is a photograph of tissue sections taken after staining the back skin tissue with H & E for each experimental group, and FIG. 14B is a graph comparing ear thickness.
15 is a tissue section photograph taken after staining the skin tissue with toluidine blue for each experimental group.
Figure 16 is a photograph comparing the size of the spleen of the mouse for each experimental group.
17 is a graph of ELISA results showing that the skin barrier damage induced mice treated with exosomes according to an embodiment of the present invention, the TSLP level in the skin is reduced.
18 is a graph of ELISA results showing that the skin barrier injury induced mice treated with exosomes according to an embodiment of the present invention, the IL-4 level in the skin is reduced.
19 is an ELISA result graph showing that the skin barrier injury induced mice treated with exosomes according to an embodiment of the present invention, the IL-13 level in the skin is reduced.
20 shows that TSLP, IL-4, IL-13, etc. increase when skin barrier is damaged, and Th2 type cytokines (IL-4 and IL-13) reduce the lipids and proteins that contribute to skin barrier and damage skin barrier. This diagram illustrates the repetition of a vicious cycle.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail in the following examples. However, the following examples merely illustrate the contents of the present invention and do not limit or limit the scope of the present invention. From the detailed description and examples of the present invention, those skilled in the art to which the present invention pertains can be easily inferred to be within the scope of the present invention. References cited in the present invention are incorporated herein by reference.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout the specification, when a part is said to "include" a certain component, it means that it can further include other components, except to exclude other components unless specifically stated otherwise.

실시예Example

실시예 1: 세포의 배양Example 1 Culture of Cells

마우스 대식세포주인 RAW 264.7은 한국세포주은행에서 구입하여 배양하였다. 세포 배양을 위해 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.RAW 264.7, a mouse macrophage, was purchased from the Korea Cell Line Bank and cultured. 5% CO in DMEM (purchased from ThermoFisher Scientific) medium containing 10% fetal bovine serum (purchased from ThermoFisher Scientific) and 1% antibiotic-antimycotics (purchased from ThermoFisher Scientific) for cell culture Subcultured at 2 , 37 ° C.

인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.HS68 cells, which are human dermal fibroblasts, were purchased from ATCC and were prepared by 10% fetal bovine serum (purchased from ThermoFisher Scientific) and 1% antibiotic-antimycotics (purchased from ThermoFisher Scientific). Passage was carried out in DMEM (purchased from ThermoFisher Scientific) medium containing 5% CO 2 at 37 ° C.

당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.Fat-derived stem cells were cultured at 5% CO 2 , 37 ° C. according to cell culture methods known in the art. Then, washed with phosphate-buffered saline (purchased from ThermoFisher Scientific), replaced with serum-free, phenol-free medium, cultured for 1 to 10 days, and the supernatant (hereinafter, culture) was recovered. .

엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.In the separation of exosomes, 2% by weight of trehalose was added to the culture to obtain exosomes with uniform particle size distribution and high purity. After the addition of trehalose, the culture solution was filtered through a 0.22 μm filter to remove impurities such as cell debris, waste, and large particles. The filtered culture immediately separated the exosomes through a separation process. In addition, the filtered culture was stored in the refrigerator (image 10 ℃ or less) and then used for exosome separation. In addition, the filtered culture solution was stored frozen in an cryogenic freezer of -60 ℃ or less and thawed and then exosomes were separated. Thereafter, exosomes were separated from the culture using a tangential flow filtration device (TFF).

실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제Example 2: Isolation and Purification of Exosomes by TFF Method

실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.In Example 1, the exosomes were separated from the culture medium filtered with a 0.22 μm filter, and the TFF (Tangential Flow Filtration) method was used for concentration, desalting and diafiltration. The filter for the TFF method was a cartridge filter (aka hollow fiber filter; purchased from GE Healthcare) or a cassette filter (purchased from Pall or Sartorius or Merck Millipore). TFF filters can be selected by various molecular weight cutoffs (MWCO). Exosomes were selectively isolated and concentrated by the selected MWCO, and particles, proteins, lipids, nucleic acids, and small molecule compounds smaller than MWCO were removed.

엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.MWCO 100,000 Da (Dalton), 300,000 Da, or 500,000 Da TFF filter was used to isolate and concentrate the exosomes. The culture solution was concentrated to a volume of 1/100 to 1/25 by using the TFF method, while exosomes were separated by removing substances smaller than MWCO.

분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다. The separated and concentrated exosome solution was further subjected to desalting and diafiltration using the TFF method. At this time, desalting and buffer exchange were carried out continuously (discontinuous diafiltration) or at least 4 times, preferably 6 times to 10 times, more preferably, relative to the starting volume. It was performed using a buffer solution having a volume of 12 times or more. To the buffer solution was added 2% by weight of trehalose dissolved in PBS to obtain exosomes with uniform particle size distribution and high purity.

실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석Example 3: Characterization of Isolated Exosomes

분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis:　NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 1A 내지 도 1C에 도시하였다.The isolated exosomes were measured for particle size and concentration by nanoparticle tracking analysis (NTA; purchased from Malvern) or tunable resistive pulse sensing (TRPS; purchased from Izon Science). The uniformity and size of the isolated exosomes were analyzed using a transmitted electron microscopy (TEM). TRPS, NTA, TEM analysis results of the exosomes isolated in accordance with one embodiment of the present invention are shown in Figures 1A to 1C.

도 1D는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.FIG. 1D shows the results of Western blot for exosomes isolated according to the method of one embodiment of the present invention, confirming the presence of CD9, CD63, CD81 and TSG101 markers. Anti-CD9 (purchased from Abcam), anti-CD63 (purchased from System Biosciences), anti-CD81 (purchased from System Biosciences), and anti-TSG101 (purchased from Abcam) were used as antibodies to each marker.

도 1E는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.Figure 1E confirmed the presence of the CD63 and CD81 markers as a result of analysis using a flow cytometer for the exosomes isolated in accordance with the method of one embodiment of the present invention. To isolate exosomes positive for CD63, an exosome-human CD63 separation / detection kit (purchased from ThermoFisher Scientific) was used according to the manufacturer's method, and PE-mouse anti-human CD63 (PE-Mouse anti markers were stained using -human CD63) (purchased from BD) and PE-mouse anti-human CD81 (purchased from BD) and analyzed using a flow cytometer (ACEA Biosciences). It was.

한편, 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래의 엑소좀은 전술한 바와 같은 실시예들의 엑소좀에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래의 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 상기 실시예들에 따라 분리된 줄기세포 유래의 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 줄기세포 유래의 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.On the other hand, the stem cell-derived exosomes used in the present invention is not limited to the exosomes of the embodiments as described above, it is possible to use a variety of stem cell-derived exosomes used in the art or can be used in the future Of course. Stem cell-derived exosomes isolated in accordance with the above embodiments should be understood as an example of the stem cell-derived exosomes that can be used in the present invention, it will be apparent that the present invention is not limited thereto.

실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정Example 4 Measurement of Cytotoxicity According to Exosome Treatment

인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다. In order to evaluate the toxicity of exosomes obtained according to the isolation method of an embodiment of the present invention in HS68 cells, which are human skin fibroblasts, cells were treated with exosomes at different concentrations, and cell proliferation rates were confirmed. HS68 cells were suspended in DMEM containing 10% FBS and then aliquoted to have a confluency of 80-90% and incubated in 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 24 hours. After 24 hours, the culture solution was removed and the exosomes prepared in Example 2 were treated for each concentration, and cultured for 24 to 72 hours to evaluate cell viability. Cell viability was determined by WST-1 reagent (purchased from Takara), MTT reagent (purchased from Sigma), CellTiter-Glo reagent (purchased from Promega), or Aramamar blue reagent ( Measurements were performed using alamarBlue reagent (purchased from ThermoFisher Scientific) and a microplate reader (purchased from Molecular Devices).

비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 본 발명의 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 2).The comparison group was based on the number of cells cultured in the normal cell culture medium not treated with exosomes, it was confirmed that no cytotoxicity by the exosomes of the present invention within the tested concentration range (Fig. 2).

실시예 5: 마크로파지 세포주를 이용한 염증 반응 측정Example 5 Inflammation Response Measurement Using Macrophage Cell Line

RAW 264.7 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에 현탁시키고 이를 멀티웰 플레이트(multiwell plate)의 각 웰에 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하였다. 다음 날 LPS가 포함된 새로운 무혈청 배지에 희석한 본 발명의 엑소좀 (실시예 2에서 준비된 엑소좀)을 적정 농도로 1~24시간 동안 처리하여 배양하였다. 배양이 끝난 배양상층액을 취하고 배양액 내에 존재하는 NO 및 염증성 사이토카인을 측정하여 염증 반응을 확인하였다. 배양액 내의 염증 반응은 NO 검출키트(detection kit)(인트론바이오 혹은 프로메가에서 구입)를 이용하여 측정하였다. ELISA 키트 (R&D system에서 구입) 제조사의 매뉴얼대로 수행하여 LPS만을 처리한 군과 본 발명의 엑소좀이 함께 처리된 군의 염증성 사이토카인 TNF-α 양을 확인하였다. 양성대조군으로 덱사메타손(dexamethasone) (Sigma에서 구입)을 처리하였다. 또한, 위와 같이 처리된 RAW 264.7 세포로부터 얻은 총 RNA로부터 cDNA를 제조하였고 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 iNOS, TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 mRNA 변화량을 측정하였다. 상기 유전자들을 정량하기 위한 표준 유전자로서 GAPDH 유전자를 사용하였다. 리얼타임 PCR에 사용한 프라이머의 종류와 서열은 하기의 표 1과 같다.RAW 264.7 cells were suspended in DMEM medium containing 10% FBS and aliquoted into 80-90% confluency in each well of a multiwell plate. Next day, the exosomes of the present invention (exosomes prepared in Example 2) diluted in fresh serum-free medium containing LPS were incubated for 1 to 24 hours at an appropriate concentration. After culturing, the culture supernatant was taken, and the inflammatory response was confirmed by measuring NO and inflammatory cytokines present in the culture. Inflammatory responses in the culture were measured using a NO detection kit (purchased from Intron Bio or Promega). ELISA kit (purchased from the R & D system) was performed according to the manufacturer's manual to determine the amount of inflammatory cytokine TNF-α of the group treated with LPS only and the group treated with the exosome of the present invention. Positive control was treated with dexamethasone (purchased from Sigma). In addition, cDNA was prepared from total RNA obtained from the above treated RAW 264.7 cells, and mRNA changes of iNOS, TNF-α, IL-6 and IL-1β were measured using real-time PCR. The GAPDH gene was used as a standard gene for quantifying the genes. The kind and sequence of primers used for real-time PCR are shown in Table 1 below.

리얼타임 PCR에 사용된 프라이머 종류 및 염기서열Primer Types and Sequences Used in Real-Time PCR 유전자gene 서열order 정방향 프라이머 (5' → 3')Forward primer (5 '→ 3') 역방향 프라이머 (5' → 3')Reverse primer (5 '→ 3') TNF-αTNF-α TCT CAT CAG TTC TAT GGC CCA GAC (서열번호 1)TCT CAT CAG TTC TAT GGC CCA GAC (SEQ ID NO: 1) GGC ACC ACT AGT TGG TTG TCT TTG (서열번호 2)GGC ACC ACT AGT TGG TTG TCT TTG (SEQ ID NO: 2) iNOSiNOS GCT ACC ACA TTG AAG AAG CTG GTG (서열번호 3)GCT ACC ACA TTG AAG AAG CTG GTG (SEQ ID NO: 3) CCA TAG GAA AAG ACT GCA CCG AAG (서열번호 4)CCA TAG GAA AAG ACT GCA CCG AAG (SEQ ID NO: 4) GAPDHGAPDH GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG CAG (서열번호 5)GAC ATC AAG AAG GTG GTG AAG CAG (SEQ ID NO: 5) CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT CAT (서열번호 6)CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT CAT (SEQ ID NO: 6) IL-6IL-6 GCC AGA GTC CTT CAG AGA GAT ACA (서열번호 7)GCC AGA GTC CTT CAG AGA GAT ACA (SEQ ID NO: 7) ATT GGA TGG TCT TGG TCC TTA GCC (서열번호 8)ATT GGA TGG TCT TGG TCC TTA GCC (SEQ ID NO: 8) IL-1βIL-1β GCA ACG ACA AAA TAC CTG TGG CCT (서열번호 9)GCA ACG ACA AAA TAC CTG TGG CCT (SEQ ID NO: 9) AGT TGG GGA ACT CTG CAG ACT CAA (서열번호 10)
AGT TGG GGA ACT CTG CAG ACT CAA (SEQ ID NO: 10)

우선, 도 3에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 대해 LPS와 함께 본 발명의 엑소좀을 처리한 경우 LPS에 의해 유도되는 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 mRNA의 발현량이 감소하였고, NO 생성효소인 iNOS의 mRNA의 발현량이 감소하였다. 다음으로, 도 4에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS 존재 하에서 본 발명의 엑소좀을 처리한 결과 LPS에 의해 유도되는 염증 반응인 NO 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인하였다. 또한, 도 5에 도시된 바와 같이, 생쥐의 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS 존재 하에서 본 발명의 엑소좀을 처리한 결과 LPS에 의해 유도되는 염증성 사이토카인인 TNF-α 생성을 감소시킴을 확인하였다. 이러한 결과들은 본 발명의 엑소좀이 염증 반응에 기인한 피부장벽 기능의 손상을 예방, 억제, 완화 또는 회복시킬 수 있음을 시사하며, 이를 통해 본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 피부장벽 기능의 보호, 강화 또는 개선에 유용할 것으로 기대된다.First, as shown in FIG. 3, when the exosome of the present invention was treated with LPS on RAW 264.7 cells, which are macrophages of mice, TNF-α, IL-6 and IL, which are inflammatory cytokines induced by LPS The expression level of mRNA of -1β was decreased and the expression level of mRNA of iNOS, a NO producing enzyme, was decreased. Next, as shown in Figure 4, as a result of treating the exosome of the present invention in the presence of LPS in macrophage RAW 264.7 cells of the mouse it was confirmed that the concentration of the inflammatory response NO induced by LPS reduced concentration-dependently It was. In addition, as shown in Figure 5, the treatment of the exosome of the present invention in the presence of LPS in macrophage RAW 264.7 cells of the mouse was confirmed to reduce the TNF-α production of inflammatory cytokines induced by LPS . These results suggest that the exosomes of the present invention can prevent, suppress, alleviate or recover damage to the skin barrier function caused by the inflammatory response, through which the composition for strengthening or improving the skin barrier of the present invention is a skin barrier. It is expected to be useful for protecting, enhancing or improving functionality.

실시예 6: 분리 방법에 따른 NO 형성 감소 효과의 비교Example 6 Comparison of NO Formation Reduction Effects According to Separation Methods

분리 방법에 따른 엑소좀의 NO 형성 감소 효과를 비교하기 위하여 본 발명의 일 구체예의 TFF 분리 정제에 의해 얻어진 엑소좀 이외에 종래의 침전법에 의해 분리된 엑소좀을 준비하였다. 침전법은 제조사(System Biosciences)의 프로토콜에 따라 시행하였다. 종래의 침전법에 의해 분리된 엑소좀(도 6A 참조)은 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀(도 6B 참조)과 비교하여 입자크기 분포의 균일도가 낮고 다양한 크기를 갖는 것을 확인하였다. 또한, 도 6C에 도시한 바와 같이 본 발명의 일 구체예의 TFF 방법에 의해 분리 정제된 엑소좀은 종래의 침전법에 의해 얻어진 엑소좀에 비해 훨씬 높은 수준으로 NO 형성을 억제함을 확인하였다. 이러한 결과들은 본 발명의 일 구체예에 따라 분리 정제된 엑소좀이 종래 방법에 따라 분리된 엑소좀에 비해 입자크기 분포의 균일도와 NO 형성 억제 측면에서 우수하다는 것을 보여주고 있다.In order to compare the NO formation reduction effect of the exosomes according to the separation method, in addition to the exosomes obtained by the TFF separation and purification of one embodiment of the present invention was prepared exosomes separated by a conventional precipitation method. Precipitation was performed according to the protocol of the manufacturer (System Biosciences). Exosome isolated by the conventional precipitation method (see FIG. 6A) has a uniform uniformity of particle size distribution and various sizes compared to the exosomes separated and purified by the TFF method of one embodiment of the present invention (see FIG. 6B). It was confirmed. In addition, as shown in Figure 6C it was confirmed that the exosomes separated and purified by the TFF method of one embodiment of the present invention inhibits NO formation to a much higher level than the exosomes obtained by the conventional precipitation method. These results show that the exosomes separated and purified according to one embodiment of the present invention are superior in terms of uniformity of particle size distribution and inhibition of NO formation compared to exosomes separated according to the conventional method.

따라서, 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀은 종래의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀과 비교하여 성능 또는 기능적 활성(예를 들어, 입자크기 분포의 균일성, NO 생성 억제, 염증 반응 감소 등)이 훨씬 우수하고, 이와 같이 기능적 활성이 우수한 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 염증 반응에 기인한 피부장벽 기능의 손상을 예방, 억제, 완화 또는 회복시키는 효과 면에서 종래기술 보다 훨씬 우수하다고 할 수 있다.Thus, the exosomes obtained according to the separation method of one embodiment of the present invention have a performance or functional activity (eg, uniformity of particle size distribution, inhibition of NO production, Increasing the inflammatory response, etc.), the composition for strengthening the skin barrier function to improve the function of the present invention containing an exosome derived from stem cells excellent functional activity as an active ingredient damage of the skin barrier function due to the inflammatory response It can be said to be much superior to the prior art in terms of the effect of preventing, suppressing, mitigating or recovering.

실시예 7: 피부장벽 손상이 유발된 동물 모델Example 7: Animal Models That Cause Skin Barrier Damage

피부장벽 강화 내지 기능 개선을 확인하기 위한 동물 모델을 확립하기 위해 옥사졸론(oxazolone)을 사용하였다. 옥사졸론은 피부에 도포 시 피부장벽 기능 손상을 가져오는데, TEWL(transepidermal water loss) 증가로 나타나는 피부 각질층의 수분 감소, 피부장벽의 구조단백질인 로리크린, 인볼루크틴, 필라그린의 발현 감소, 피부 각질층의 pH 증가를 유발하여 피부 장벽 기능이 손상된 동물 모델을 제공할 수 있다(Journal of Investigative Dermatology (2008) 128(1), 79-86 참조).Oxazolone was used to establish an animal model to confirm skin barrier enhancement or function improvement. Oxazolone causes impaired skin barrier function when applied to the skin, which reduces water in the stratum corneum, which is indicated by increased transepidermal water loss (TEWL), decreases the expression of lyochlorine, involuctin and filaggrin, the structural proteins of the skin barrier. Increasing the pH of the stratum corneum can provide an animal model with impaired skin barrier function (see Journal of Investigative Dermatology (2008) 128 (1), 79-86).

암컷 SKH-1 생쥐(5주령; 중앙실험동물에서 구입)를 구매하여 7일 동안의 적응기를 통해 본 실험에 사용하였다. 적응기를 거친 생쥐는 피부장벽 손상을 유발 한 후 아래와 같이 각각 6군으로 분류하였다. Female SKH-1 mice (5 weeks old; purchased from a central experimental animal) were purchased and used for this experiment through an adaptation period for 7 days. Mice that had undergone adaptation were classified into 6 groups as follows after inducing skin barrier damage.

(1) Normal: 정상 대조군 (도 7에서 "N"으로 표기);(1) Normal: normal control (denoted “N” in FIG. 7);

(2) Control (피부장벽 손상 유발군): 옥사졸론으로 피부장벽 손상을 유발한 음성 대조군 (도 7에서 "C"로 표기);(2) Control (skin barrier damage induction group): negative control (indicated by "C" in Figure 7) that caused skin barrier damage with oxazolone;

(3) 엑소좀 저용량: 옥사졸론으로 피부장벽 손상을 유발한 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 개체 당 1 μg의 용량으로 주 3회씩 4주간 피하 투여(SC: subcutaneous injection)한 실험군 (도 7에서 "L"로 표기);(3) Exosome low dose: Experimental group subcutaneous injection (SC: subcutaneous injection) three times a week at a dose of 1 μg per subject after the exosome prepared in Example 2 after causing skin barrier damage with oxazolone (Fig. 7 Denoted by "L");

(4) 엑소좀 중용량: 옥사졸론으로 피부장벽 손상을 유발한 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 개체 당 3 μg의 용량으로 주 3회씩 4주간 피하 투여한 실험군 (도 7에서 "M"으로 표기);(4) Exosome medium dose: Experimental group in which the exosome prepared in Example 2 was subcutaneously administered three times a week for 4 weeks at a dose of 3 μg per individual after causing skin barrier damage with oxazolone (denoted as "M" in FIG. 7). );

(5) 엑소좀 고용량: 옥사졸론으로 피부장벽 손상을 유발한 후 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 개체 당 10 μg의 용량으로 주 3회씩 4주간 피하 투여한 실험군 (도 7에서 "H"로 표기);(5) Exosome high dose: experimental group in which the exosome prepared in Example 2 was subcutaneously administered three times a week for 4 weeks at a dose of 10 μg per individual after causing skin barrier damage with oxazolone (marked as "H" in FIG. 7). );

(6) 덱사메타손: 옥사졸론으로 피부장벽 손상을 유발한 후 에탄올에 용해시킨 0.03% 덱사메타손(Sigma에서 구입)을 개체 당 100 μL의 용량으로 주 3회씩 4주간 피하 투여한 실험군 (양성대조군) (도 7에서 "D"로 표기).(6) Dexamethasone: Experimental group (positive control group) in which subcutaneous administration of 0.03% dexamethasone (purchased from Sigma) dissolved in ethanol after subcutaneous administration three times a week at a dose of 100 μL per subject after causing skin barrier damage with oxazolone (FIG. 7 as "D").

(2)~(6)의 각 실험군의 생쥐 등피부(back skin)에 2% 옥사졸론(Sigma에서 구입) 200 μL를 도포하여 감작하였고, 감작 후 5~7일간 피부장벽 회복 기간을 거친 다음 약 15일동안 격일로 (2)~(6)의 각 실험군의 생쥐 등피부에 0.025%~0.05% 옥사졸론 100 μL를 도포하여 피부장벽 손상을 유발하였다. 또한, 피부장벽 손상 유지를 위해 엑소좀 처리 기간 동안 격일로 (2)~(6)의 각 실험군의 생쥐 등피부에 0.025%~0.05% 옥사졸론 100 μL를 도포하여 처리하였다.200 μL of 2% oxazolone (purchased from Sigma) was applied to the back skin of the mice in each of the experimental groups (2) to (6), and then subjected to skin barrier recovery period for 5-7 days after sensitization. Skin barrier damage was induced by applying 100 μL of 0.025% to 0.05% oxazolone to the mouse skin of each experimental group of (2) to (6) every other day for 15 days. In addition, 100 μL of 0.025% to 0.05% oxazolone was applied to the mouse skin of each experimental group of (2) to (6) every other day during the exosome treatment period to maintain skin barrier damage.

본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리되기 전후에, TEWL 측정 장비를 이용하여 피부의 평균 수분 증발량을 측정하였고, 수분측정기(Corneometer CM825)(Courage-Khazaka eletronic GmbH, Germany)를 이용하여 피부수분 함유량을 측정하였다. 측정된 생쥐 마리수는 각 실험군 마다 12 마리였다(n=12).Before and after the exosome of one embodiment of the present invention, the average moisture evaporation amount of the skin was measured using a TEWL measuring equipment, the skin moisture content using a moisture meter (Corneometer CM825) (Courage-Khazaka eletronic GmbH, Germany) Was measured. The number of mice measured was 12 for each experimental group (n = 12).

그 결과, 질환 대조군(피부장벽 손상 유발군)에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군에서 엑소좀의 용량 의존적으로 TEWL(transepidermal water loss)이 감소하는 것, 즉 각질층의 수분 증발량 감소를 확인하였다(도 7). 또한, 질환 대조군에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군에서 엑소좀의 용량 의존적으로 피부수분 함유량(skin hydration)의 증가를 확인하였다(도 8). 따라서, 본 발명의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 각질층의 수분증발을 감소시키고 피부 보습을 향상시킴으로써 피부장벽을 보호 및 강화시킬 수 있다.As a result, the dose-dependent transepidermal water loss (TEWL) was reduced in the experimental group of (3) to (5) treated with the exosome of one embodiment of the present invention compared to the disease control group (skin barrier injury causing group). That is, it was confirmed that the evaporation amount of water in the stratum corneum (Fig. 7). In addition, it was confirmed that the dose-dependent increase in skin hydration (skin hydration) of the exosomes in the experimental group of (3) ~ (5) treated with the exosomes of one embodiment of the present invention compared to the disease control (Fig. 8). Therefore, the composition comprising the exosome of the present invention as an active ingredient can protect and strengthen the skin barrier by reducing the water vaporization of the stratum corneum and improve skin moisturization.

한편, 각 실험군의 체중을 측정한 결과(n=12), 덱사메타손을 처리한 (6)의 실험군에서는 부작용으로 체중이 감소하였으나, 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 처리한 (3)~(5)의 실험군에서는 정상 대조군에 비해 체중이 거의 감소하지 않았다(도 9). 즉, 피부장벽 손상의 회복 내지는 완화를 위해 일반적으로 사용되는 덱사메타손이 체중 감소와 같은 부작용을 나타내는 반면에, 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부장벽을 보호 및 강화시키면서도 체중 감소와 같은 부작용을 줄일 수 있는 장점이 있다.On the other hand, as a result of measuring the weight of each experimental group (n = 12), in the experimental group of (6) treated with dexamethasone, the weight was reduced as a side effect, but treated with exosomes according to one embodiment of the present invention (3) ~ In the experimental group of (5) almost no weight loss compared to the normal control (Fig. 9). That is, while dexamethasone, which is generally used for recovery or alleviation of skin barrier damage, has side effects such as weight loss, a composition comprising exosomes according to one embodiment of the present invention as an active ingredient protects and protects the skin barrier. While strengthening, there are advantages to reduce side effects such as weight loss.

실시예 8: 피부장벽 지표들의 개선 확인Example 8: Confirmation of Improvement of Skin Barrier Indicators

실시예 7의 생쥐들을 희생시키고 피부 샘플을 채취한 후, 각 실험군 별로 세라마이드, 디히드로세라마이드, 스핑고신 및 스핑고신-1-인산(S1P)의 함량, 스핑고신 키나아제(Sphingosine kinase)인 SPHK1의 활성, 및 S1P(Sphingosine 1-phosphate)를 분해하는 효소인 S1P 리아제(S1P lyase)의 활성을 측정하였다. 측정에 사용된 생쥐의 마리수는 각 실험군 별로 8 마리였다(n=8).After sacrificing the mice of Example 7 and taking a skin sample, the content of ceramide, dihydroceramide, sphingosine and sphingosine-1-phosphate (S1P), sphingosine kinase (SPHK1) activity for each experimental group , And the activity of S1P lyase (S1P lyase), an enzyme that degrades S1P (Sphingosine 1-phosphate). The number of mice used for the measurement was 8 for each experimental group (n = 8).

카본길이별 세라마이드, 총 세라마이드, 스핑고신, 및 스핑고신-1-인산(S1P) 함량을 LC-MS/MS(API 3200 Triple quadruple mass, AB/SCIEX)를 이용하여 다음과 같이 분석하였다. 전체 지질은 당업계에 알려진 문헌에 따라 추출하였다(J Invest Dermatol. 2010 Oct, 130(10):2472-80). 세라마이드, 스핑고신, 및 스핑고신-1-인산을 OPA(o-phthalaldehyde) 시약으로 유도체화하고 형광검출기가 장착된 LC-MS/MS 시스템을 이용하여 정량하였다(J Invest Dermatol. 2010 Oct, 130(10):2472-80; Arch Pharm Res. 2009 Dec, 32(12):1795-801; Proc Natl Acad Sci USA. 2016 Mar 8, 113(10): E1334-E1342). 스핑고지질의 함량은 "pmol/g 단백질"로 표현하였고, 단백질 정량은 통상적인 BCA 방법에 따라 수행하였다.Ceramide, total ceramide, sphingosine, and sphingosine-1-phosphate (S1P) by carbon length were analyzed using LC-MS / MS (API 3200 Triple quadruple mass, AB / SCIEX) as follows. Total lipids were extracted according to literature known in the art (J Invest Dermatol. 2010 Oct, 130 (10): 2472-80). Ceramide, sphingosine, and sphingosine-1-phosphate were derivatized with OPA (o-phthalaldehyde) reagent and quantified using an LC-MS / MS system equipped with a fluorescence detector (J Invest Dermatol. 2010 Oct, 130 ( 10): 2472-80; Arch Pharm Res. 2009 Dec, 32 (12): 1795-801; Proc Natl Acad Sci USA. 2016 Mar 8, 113 (10): E1334-E1342). The content of sphingolipids was expressed as "pmol / g protein" and protein quantification was performed according to conventional BCA methods.

도 10a 내지 도 10g에 도시된 바와 같이, 질환 대조군에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군의 피부 조직에서, C16 세라마이드, C18 세라마이드, C20 세라마이드, C22 세라마이드, C24 세라마이드, C24:1 세라마이드 및 총 세라마이드의 함량이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 11a 내지 도 11f에 도시된 바와 같이, 질환 대조군에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군의 피부 조직에서, C16 디히드로세라마이드, C18 디히드로세라마이드, C22 디히드로세라마이드, C24 디히드로세라마이드, C24:1 디히드로세라마이드 및 총 디히드로세라마이드의 함량이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, 도 12A 및 도 12B에 도시된 바와 같이, 질환 대조군에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군의 피부 조직에서, 스핑고신-1-인산(S1P) 및 스핑고신 함량 역시 증가된 것을 확인할 수 있었다.As shown in Figure 10a to 10g, in the skin tissue of the experimental group of (3) to (5) treated with the exosome of one embodiment of the present invention compared to the disease control group, C16 ceramide, C18 ceramide, C20 ceramide, C22 The content of ceramide, C24 ceramide, C24: 1 ceramide and total ceramide was increased. In addition, as shown in Figure 11a to 11f, in the skin tissue of the experimental group of (3) to (5) treated with the exosome of one embodiment of the present invention compared to the disease control, C16 dehydroceramide, C18 dehydro It was confirmed that the contents of ceramide, C22 dihydroceramide, C24 dihydroceramide, C24: 1 dihydroceramide and total dihydroceramide were increased. In addition, as shown in Figures 12A and 12B, in the skin tissue of the experimental group of (3) to (5) treated with the exosome of one embodiment of the present invention compared to the disease control, sphingosine-1-phosphate ( S1P) and sphingosine content was also confirmed to increase.

한편, 스핑고신 키나아제(Sphingosine kinase)인 SPHK1의 활성을 LC-MS/MS을 이용하여 다음과 같이 분석하였다. 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 3 mM β-머캅토에탄올, 5% 글리세롤, 프로테아제 저해제(Sigma-Aldrich) 및 포스파타아제 저해제(Roche)를 함유하는 20 mM 트리스 버퍼(pH7.4) 내의 피부 조직 파쇄물을 10μL의 200 μM C17-스핑고신(SPHK 기질)(Avanti Polar Lipids)과 함께 인큐베이션하였다. SPHK1 활성의 평가를 위해, 어세이 버퍼에 0.5% 트리톤 X-100(Triton X-100)을 첨가하였고, 37℃에서 30 동안 인큐베이션하였다. 효소 반응은 CHCl3: MeOH: HCl(8:4:3, v/v/v)의 첨가에 의해 종료시켰다. C17-스핀가닌-1-포스페이트(100 pmol; Avanti Polar Lipids)를 내부 표준자(internal standard)로서 첨가하였다. CHCl3 첨가에 의해 분리된 유기상(organic phage)을 진공 하에서 건조하였고, 건조물을 메탄올에 재용해시킨 후 LC-ESI-MS/MS (API 3200 Triple quadruple mass, AB/SCIEX)로 분석하였다. SPHK1 활성은 "C17-S1P pmol/mg 단백질/min"으로 표현하였고, 단백질 정량은 통상적인 BCA 방법에 따라 수행하였다.On the other hand, the activity of sphingosine kinase (Sphingosine kinase) SPHK1 was analyzed using LC-MS / MS as follows. Skin tissue in 20 mM Tris buffer (pH7.4) containing 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 3 mM β-mercaptoethanol, 5% glycerol, protease inhibitor (Sigma-Aldrich) and phosphatase inhibitor (Roche) The lysates were incubated with 10 μL of 200 μM C17-sphingosine (SPHK substrate) (Avanti Polar Lipids). For evaluation of SPHK1 activity, 0.5% Triton X-100 was added to assay buffer and incubated at 37 ° C. for 30 days. The enzymatic reaction was terminated by the addition of CHCl 3 : MeOH: HCl (8: 4: 3, v / v / v). C17-spinganine-1-phosphate (100 pmol; Avanti Polar Lipids) was added as an internal standard. The organic phase separated by CHCl 3 addition was dried under vacuum and the residue was redissolved in methanol and analyzed by LC-ESI-MS / MS (API 3200 Triple quadruple mass, AB / SCIEX). SPHK1 activity was expressed as “C17-S1P pmol / mg protein / min” and protein quantification was performed according to conventional BCA methods.

또한, S1P 리아제의 활성을 LC-MS/MS을 이용하여 다음과 같이 분석하였다. 피부 조직 파쇄물을 10 nmol의 S1P (Avanti Polar Lipids)와 함께 20분 동안 인큐베이션하였다. 100 pmol의 (2E)-d5-헥사데세날(hexadecenal)(Avanti Polar Lipids)을 내부 표준자로서 첨가하였고, 지질 추출에 의해 반응을 중지시켰다. 5% 포름산을 함유하는 메탄올 내의 5-mM 세미카르바지드 하이드로클로라이드(semicarbazide hydrochloride)(Avanti Polar Lipids)로 전체 지질 추출물을 40℃에서 2시간 동안 유도체화하고, LC-ESI-MS/MS로 분석하였다. S1P 리아제 활성은 "펜타데칸알 pmol/mg 단백질/min"으로 표현하였고, 단백질 정량은 통상적인 BCA 방법에 따라 수행하였다.In addition, the activity of S1P lyase was analyzed as follows using LC-MS / MS. Skin tissue lysates were incubated with 10 nmol of S1P (Avanti Polar Lipids) for 20 minutes. 100 pmol (2E) -d5-hexadecenal (Avanti Polar Lipids) was added as internal standard and the reaction was stopped by lipid extraction. Whole lipid extracts were derivatized at 40 ° C. for 2 hours with 5-mM semicarbazide hydrochloride (Avanti Polar Lipids) in methanol containing 5% formic acid and analyzed by LC-ESI-MS / MS It was. S1P lyase activity was expressed as "pentadecanal pmol / mg protein / min" and protein quantification was performed according to conventional BCA methods.

도 13에 도시된 바와 같이, 질환 대조군에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군의 피부 조직에서, SPHK1의 활성 증가(28.79% 증가)와 S1P 리아제(S1P lyase)의 활성 감소를 확인할 수 있었다. SPHK1은 피부장벽을 구성하는 스핑고지질의 합성에 관여하는 효소이므로 이의 활성 증가는 세라마이드 합성 증가 및 피부 장벽 강화를 의미한다. 또한, S1P 리아제는 스핑고신-1-인산을 분해하여 스핑고지질의 합성을 방해하는 효소이므로 이의 활성 감소는 세라마이드 합성 방해 감소 및 피부장벽 강화를 의미한다.As shown in Figure 13, in the skin tissue of the experimental group of (3) to (5) treated with the exosome of one embodiment of the present invention compared to the disease control, increased activity of SPHK1 (28.79% increase) and S1P lyase ( Decreased activity of S1P lyase). Since SPHK1 is an enzyme involved in the synthesis of sphingolipids constituting the skin barrier, its increased activity means increased ceramide synthesis and enhanced skin barrier. In addition, since S1P lyase decomposes sphingosine-1-phosphate to interfere with the synthesis of sphingolipids, the decrease in its activity means less interference with ceramide synthesis and skin barrier strengthening.

상기와 같은 결과들로부터 본 발명의 일 구체예의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 장벽 기능의 보호, 강화 및/또는 개선과 관련된 객관적 지표들을 개선시키는 것, 예를 들어 세라마이드, 디히드로세라마이드 및 스핑고 염기의 생성량 증가, 이들의 합성에 관여하는 효소 활성 증가, 및 이들의 분해에 관여하는 효소 활성 감소를 나타내는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구체예의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 약학 조성물, 피부외용제 및 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.From the above results, the composition comprising the exosome of one embodiment of the present invention as an active ingredient improves objective indicators related to the protection, strengthening and / or improvement of skin barrier function, for example, ceramide, dehydroceramide And an increase in the amount of sphingo bases produced, an increase in the activity of enzymes involved in their synthesis, and a decrease in the activity of enzymes involved in their degradation. Therefore, the composition comprising the exosome of one embodiment of the present invention as an active ingredient may be usefully used as a pharmaceutical composition, skin external preparation and cosmetic composition for skin barrier enhancement or function improvement.

실시예 9: 동물 모델의 귀 두께 및 지라 크기 비교Example 9 Ear Thickness and Spleen Size Comparison of Animal Models

실시예 7의 생쥐들의 귀 두께를 캘리퍼를 이용하여 측정하였고, 생쥐들을 희생시킨 후, 각 실험군 별로 당업계에 알려진 H&E 염색법에 의해 등 피부 조직을 염색하였다. 각 실험군 별로 8 마리였다(n=8).Ear thicknesses of the mice of Example 7 were measured using a caliper, and after sacrifice, mice were stained with back skin tissues by H & E staining known in the art. There were 8 animals in each experimental group (n = 8).

도 14a는 생쥐의 등 피부 조직을 H&E로 염색한 후 촬영한 절편 사진이고, 도 14b는 (2)~(6)의 각 실험군에서 측정된 귀 두께를 (1)의 정상군과 비교하여 도시한 그래프이다. 질환 대조군에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군에서 귀 두께가 엑소좀의 용량의존적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. Figure 14a is a section photograph taken after staining the back skin tissue of the mouse with H & E, Figure 14b shows the ear thickness measured in each experimental group of (2) ~ (6) compared with the normal group of (1) It is a graph. Compared to the disease control group, the experimental group treated with the exosomes of one embodiment of the present invention (3) ~ (5) was confirmed that the ear thickness was dose-dependently reduced.

한편, 희생시킨 생쥐의 피부 조직을 톨루이딘 블루로 염색한 후, 염증 세포의 일종인 마스트 세포의 침윤 정도를 관찰하였다. 도 15는 희생시킨 생쥐의 피부 조직을 톨루이딘 블루로 염색한 후 촬영한 절편 사진으로서, 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀이 처리된 (5)의 실험군(엑소좀 고용량 처리 실험군)에서 마스트 세포의 침윤이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 반면에 양성 대조군인 덱사메타손을 처리한 경우에는 마스트 세포의 침윤이 감소되지 않았다. On the other hand, after staining the skin tissue of the sacrificed mice with toluidine blue, the degree of infiltration of mast cells, a type of inflammatory cells, was observed. FIG. 15 is a fragment photograph taken after staining skin tissue of a sacrificed mouse with toluidine blue, and the mast cell of the experimental group (exo-high dose treatment experimental group) of (5) treated with exosomes according to an embodiment of the present invention. It was confirmed that the infiltration of significantly decreased. On the other hand, treatment with dexamethasone, a positive control, did not reduce mast cell infiltration.

상기 결과들은 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 염증 반응으로 인하여 표피 두께가 두꺼워지는 것과 마스트 세포의 침윤을 억제 내지 완화시켜 주는 것을 보여준다.The results show that the exosome of one embodiment of the present invention thickens the epidermal thickness due to the inflammatory response and inhibits or alleviates the infiltration of mast cells.

또한, 질환 대조군에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군에서 지라의 크기가 엑소좀의 용량 의존적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 16). 이는 염증 반응 내지는 면역 반응과 밀접한 관련이 있는 지라 크기가 증가하는 것을 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 억제 내지 완화시켜 주는 것을 보여준다. In addition, it was confirmed that the size of the spleen was dose-dependently reduced in the experimental group of (3) to (5) treated with the exosome of one embodiment of the present invention compared to the disease control group (FIG. 16). This shows that the exosome of one embodiment of the present invention inhibits or mitigates the increase in size because it is closely related to the inflammatory response or the immune response.

이러한 실험결과들은 본 발명의 일 구체예의 엑소좀을 포함하는 조성물이 염증 반응 및 이에 기인한 피부장벽 기능의 손상을 예방, 억제, 완화 또는 회복시킬 수 있음을 시사한다. 따라서, 본 발명의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 조성물은 피부장벽 기능의 보호, 강화 또는 개선에 유용할 것으로 기대된다.These experimental results suggest that the composition comprising the exosome of one embodiment of the present invention can prevent, inhibit, alleviate or repair the inflammatory response and damage to the skin barrier function thereby. Therefore, it is expected that the composition for enhancing skin barrier function or improving the function of the present invention will be useful for protecting, enhancing or improving skin barrier function.

실시예 10: 피부장벽 손상과 관련이 깊은 사이토카인의 감소 확인Example 10 Confirmation of Reduction of Cytokines Deeply Associated with Skin Barrier Injury

실시예 7의 생쥐들을 희생시키고 피부 샘플을 채취한 후, 각 실험군 별로 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin), IL-4, IL-13 등의 피부 조직 내 수준을 ELISA로 확인하였다. 측정에 사용된 생쥐의 마리수는 각 실험군 별로 8 마리였다(n=8). 피부 조직 샘플을 얼음 상의 5mL 리파 버퍼(Ripa buffer)(1× 프로테아제 저해제 함유)에 넣고 잘게 자른 후, 4℃에서 5분 동안 2,000 rpm으로 원심 분리하여 불순물을 제거하였다. BCA 키트로 단백질을 정량하였고, 프로테아제 저해제 함유 리파 버퍼로 단백질 농도를 100 μg/mL로 조정한 후 100 μL(10μg 단백질)를 ELISA 분석에 사용하였다. TSLP ELISA 키트, IL-4 ELISA 키트 및 IL-13 ELISA 키트(ThermoFisher에서 구입)를 사용하여 실험을 진행하였고 450 nm에서 흡광도를 측정하여 TSLP, IL-4 및 IL-13의 조직 내 수준을 정량하였다. After sacrificing the mice of Example 7 and taking a skin sample, the levels of skin tissue such as TSLP (Thymic stromal lymphopoietin), IL-4, and IL-13 were confirmed by ELISA for each experimental group. The number of mice used for the measurement was 8 for each experimental group (n = 8). Skin tissue samples were placed in 5 mL Ripa buffer (containing 1 × protease inhibitor) on ice and chopped, followed by centrifugation at 2,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. to remove impurities. Proteins were quantified with the BCA kit and 100 μL (10 μg protein) was used for ELISA analysis after adjusting the protein concentration to 100 μg / mL with lipase buffer containing protease inhibitors. Experiments were carried out using the TSLP ELISA kit, IL-4 ELISA kit, and IL-13 ELISA kit (purchased from ThermoFisher), and the absorbance was measured at 450 nm to quantify the intracellular levels of TSLP, IL-4 and IL-13. .

한편, TSLP는 피부장벽 손상 시 케라티노사이트(keratinocytes)와 마스트 세포(mast cells)에서 분비가 촉진되고, 항원제시 세포(수지상 세포 및 랑게르한스 세포 등)의 성숙에 관여한다. 이와 같이 성숙된 항원제시 세포는 Th 세포를 활성화시키고 활성화된 Th 세포는 IL-4, IL-13 등의 Th2 타입의 사이토카인을 증가시키게 되는데, IL-4 및 IL-13는 피부장벽에 기여하는 지질(예: 세라마이드) 및 단백질(예: 필라그린, 인볼루크린 및 로리크린)을 감소시켜 피부장벽을 더욱 손상시키는 악순환을 반복하게 된다(도 20 참조). 따라서 피부장벽기능 회복에 관여하는 후보물질이 TSLP, IL-4 및/또는 IL-13의 발현 및/또는 생성을 감소시키면, 위와 같은 악순환을 끊을 수 있고 피부장벽기능 회복 및 기능강화에 기여한다고 할 수 있다.On the other hand, TSLP promotes secretion from keratinocytes and mast cells upon skin barrier damage, and is involved in the maturation of antigen-presenting cells (such as dendritic cells and Langerhans cells). These mature antigen presenting cells activate Th cells, and activated Th cells increase Th2 type cytokines such as IL-4 and IL-13. IL-4 and IL-13 contribute to skin barrier. Reducing the lipids (e.g. ceramides) and proteins (e.g. filaggrins, involuclins and loricleans) leads to a vicious cycle that further damages the skin barrier (see Figure 20). Therefore, if candidate substances involved in skin barrier function recovery reduce the expression and / or production of TSLP, IL-4 and / or IL-13, this vicious cycle may be interrupted and contribute to the recovery and function of skin barrier function. Can be.

도 17 내지 도 19에 도시된 바와 같이, 질환 대조군에 비해 본 발명의 일 구체예의 엑소좀이 처리된 (3)~(5)의 실험군의 피부 조직에서, TSLP, IL-4 및 IL-13의 수준이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 일 구체예의 엑소좀은 피부 조직에서 TSLP 수준을 유의적으로 감소시키고, 이에 따라 항원제시 세포의 성숙을 억제하여 Th2 활성화를 저하시킨다고 할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 엑소좀 처리에 의한 Th2 활성화 저하 및 이로 인한 Th2 사이토카인인 IL-4 및 IL-13의 감소는 피부장벽에 기여하는 지질 및 단백질이 감소하는 악순환을 저지하여 피부장벽기능 회복에 기여한다고 할 수 있다.As shown in Figure 17 to 19, compared to the disease control of the skin tissue of the experimental group of (3) to (5) treated with the exosome of one embodiment of the present invention, TSLP, IL-4 and IL-13 It was confirmed that the level was significantly reduced. That is, the exosome of one embodiment of the present invention significantly reduces the level of TSLP in skin tissue, thereby inhibiting the maturation of antigen-presenting cells, thereby reducing Th2 activation. In addition, the reduction of Th2 activation by the exosome treatment of one embodiment of the present invention and the reduction of the Th2 cytokines IL-4 and IL-13 thereby inhibits the vicious cycle in which lipids and proteins that contribute to the skin barrier decreases the skin barrier It can be said to contribute to the recovery of function.

실시예 11: 본 발명의 엑소좀을 포함하는 화장료 조성물의 제조Example 11: Preparation of a cosmetic composition comprising the exosome of the present invention

(로션의 제조)(Production of lotion)

상기 실시예 2에서 준비된 1704 μg/mL 농도의 엑소좀 원액을 희석하고 하기 표 2에 기재된 성분들과 혼합하여 현탁한 후 화장료 조성물(로션)을 제조하였다. 최종 화장료 조성물이 엑소좀을 2×104 입자/mL의 농도로 함유하도록 제조하였다. 각 성분의 함량은 하기 표 2와 같다.The exosome stock solution of 1704 μg / mL concentration prepared in Example 2 was diluted and mixed with the components shown in Table 2 below to prepare a cosmetic composition (lotion). The final cosmetic composition was prepared to contain exosomes at a concentration of 2 × 10 4 particles / mL. The content of each component is shown in Table 2 below.

로션의 성분 및 함량Ingredients and Contents of Lotions 성분ingredient 함량 (중량%)Content (% by weight) 실시예 2에서 준비된 엑소좀Exosomes prepared in Example 2 1One 글리세린glycerin 7.3757.375 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드Caprylic / Capric Triglycerides 66 세틸 에틸헥사노에이트 Cetyl ethylhexanoate 55 프로판디올Propanediol 55 페닐 트리메티콘Phenyl trimethicone 3.53.5 스테아르산Stearic acid 33 1,2-헥산디올1,2-hexanediol 22 판테놀Panthenol 22 세테아릴 올리베이트Cetearyl Oliveate 1.81.8 소르비탄 올리베이트Sorbitan Oliveate 1.21.2 디이소스테아릴 말레이트Diisostearyl malate 1One 프룩탄Fructan 1One 암모늄 아크릴로일디메틸타우레이트/VP 코폴리머Ammonium Acryloyldimethyl Taurate / VP Copolymer 0.30.3 아라키딜 알코올Arachidil Alcohol 0.250.25 베헤닐 알코올Behenyl alcohol 0.150.15 아라키딜 글루코사이드Arachidil Glucoside 0.10.1 하이드로제네이티드 레시틴Hydrogenated Lecithin 0.10.1 시어버터Shea butter 0.090.09 잔탄검Xanthan Gum 0.050.05 라벤더 오일Lavender oil 0.020.02 베르가모트 오일Bergamot Oil 0.020.02 세라마이드엔피 (Ceramide NP) Ceramide NP 0.020.02 오렌지껍질 오일 Orange Peel Oil 0.020.02 피토스핑고신Phytosphingosine 0.0150.015 팔미토일 테트라펩타이드-7Palmitoyl Tetrapeptide-7 0.010.01 팔미토일 트리펩타이드-1 Palmitoyl Tripeptide-1 0.010.01 정제수Purified water 잔량Remaining amount

(크림의 제조)(Production of cream)

상기 실시예 2에서 준비된 1704 μg/mL 농도의 엑소좀 원액을 희석하고 하기 표 3에 기재된 성분들과 혼합하여 현탁한 후 화장료 조성물(크림)을 제조하였다. 최종 화장료 조성물이 엑소좀을 2×104 입자/mL의 농도로 함유하도록 제조하였다. 각 성분의 함량은 하기 표 3과 같다.The exosome stock solution of 1704 μg / mL concentration prepared in Example 2 was diluted and mixed with the components shown in Table 3 below to prepare a cosmetic composition (cream). The final cosmetic composition was prepared to contain exosomes at a concentration of 2 × 10 4 particles / mL. The content of each component is shown in Table 3 below.

크림의 성분 및 함량Ingredients and content of cream 성분ingredient 함량 (중량%)Content (% by weight) 실시예 2에서 준비된 엑소좀Exosomes prepared in Example 2 1One 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드Caprylic / Capric Triglycerides 1212 글리세린glycerin 9.759.75 부틸렌글리콜Butylene glycol 77 세테아릴알코올 Cetearyl Alcohol 3.53.5 하이드로제네이티드 식물성오일 Hydrogenated Vegetable Oil 3.53.5 1,2-헥산디올1,2-hexanediol 22 스테아르산Stearic acid 22 페닐트리메티콘Phenyltrimethicone 22 호호바씨오일Jojoba Seed Oil 22 비즈왁스Beads wax 1.71.7 글리세릴스테아레이트Glyceryl Stearate 1.51.5 스테아릴알코올Stearyl alcohol 1.451.45 글리세릴스테아레이트에스이 Glyceryl Stearate S 1One 세틸알코올Cetyl alcohol 1One 판테놀Panthenol 1One 시어버터Shea butter 0.880.88 솔비탄세스퀴올리에이트Solbitan Sesquioleate 0.50.5 폴리글리세릴-2스테아레이트 Polyglyceryl-2 Stearate 0.450.45 암모늄아크릴로일다이메틸타우레이트/브이피코폴리머Ammonium Acryloyldimethyl Taurate / V-Picopolymer 0.30.3 하이드로제네이티드 레시틴Hydrogenated Lecithin 0.10.1 베르가모트오일Bergamot oil 0.040.04 세라마이드엔피Ceramide NP 0.040.04 피토스핑고신Phytosphingosine 0.030.03 아이비고드열매추출물 Ivy God Fruit Extract 0.02250.0225 한련초추출물 Nasturtium Extract 0.02250.0225 라벤더오일Lavender oil 0.020.02 오렌지껍질오일 Orange Peel Oil 0.020.02 카퍼트리펩타이드-1 Coppertripeptide-1 0.010.01 팔미토일 테트라펩타이드-7Palmitoyl Tetrapeptide-7 0.010.01 팔미토일 트리펩타이드-1 Palmitoyl Tripeptide-1 0.010.01 칼라민Calamine 0.0010.001 정제수Purified water 잔량Remaining amount

(마스크팩의 제조)(Manufacture of Mask Pack)

상기 실시예 2에서 준비된 1704 μg/mL 농도의 엑소좀 원액을 희석하고 하기 표 4에 기재된 성분들과 혼합하여 현탁한 후 얻어진 화장료 조성물을 도포 내지는 침적시킨 마스크팩을 제조하였다. 엑소좀은 4×103 입자/mL의 농도로 마스크팩에 도포 내지는 침적되었다. 각 성분의 함량은 하기 표 4와 같다.The exosome stock solution of 1704 μg / mL concentration prepared in Example 2 was diluted and mixed with the components shown in Table 4 below to prepare a mask pack coated or deposited with the obtained cosmetic composition. Exosomes were applied or deposited onto the maskpack at a concentration of 4 × 10 3 particles / mL. The content of each component is shown in Table 4 below.

마스크팩의 성분 및 함량Ingredients and Contents of the Mask Pack 성분ingredient 함량 (중량%)Content (% by weight) 실시예 2에서 준비된 엑소좀Exosomes prepared in Example 2 0.10.1 글리세린glycerin 3.0700453.070045 디프로필렌글리콜Dipropylene glycol 3.033.03 메틸프로판디올Methylpropanediol 22 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드Caprylic / Capric Triglycerides 1.5000251.500025 올리브오일Olive oil 0.80.8 1,2-헥산디올1,2-hexanediol 0.72350.7235 폴리솔베이트60Polysorbate 60 0.70.7 솔비탄스테아레이트Sorbitan stearate 0.64750.6475 알지닌Arginine 0.130.13 카보머Carbomer 0.130.13 하이드록시에틸셀룰로오스Hydroxyethyl cellulose 0.130.13 알란토인Allantoin 0.10.1 트레할로오스Trehalos 0.10.1 녹차추출물Green Tea Extract 0.070.07 부틸렌글리콜Butylene glycol 0.070.07 생강추출물Ginger Extract 0.070.07 스페인감초뿌리추출물Spanish Licorice Root Extract 0.070.07 콥티스뿌리추출물Coptis Root Extract 0.070.07 수크로오스코코에이트Sucrose Cocoate 0.05250.0525 에틸헥실글리세린Ethylhexylglycerin 0.050.05 디포타슘글리시리제이트Dipotassium glycylizate 0.030.03 디소듐이디티에이Disodium ID 0.020.02 토코페릴아세테이트Tocopheryl Acetate 0.020.02 판테놀Panthenol 0.020.02 세라마이드엔피Ceramide NP 0.0000010.000001 소듐히알루로네이트Sodium hyaluronate 0.010.01 자일리틸글루코사이드Xylylglucoside 0.0040.004 안하이드로자일리톨Anhydroxylitol 0.00280.0028 자일리톨Xylitol 0.00120.0012 글루코오스Glucose 0.00040.0004 하이드로제네이티드 레시틴Hydrogenated Lecithin 0.0000050.000005 향료Spices 0.0120.012 콜레스테롤cholesterol 0.0000010.000001 정제수Purified water 잔량Remaining amount

이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.As mentioned above, although this invention was demonstrated to the said Example, this invention is not limited to this. Those skilled in the art can make modifications and changes without departing from the spirit and scope of the present invention, and it will be appreciated that such modifications and changes also belong to the present invention.

<110> ExoCoBio Inc. <120> A composition comprising an exosome derived from stem cell as an active ingredient and its application for reinforcing or improving skin barrier <130> P17-0030KR <150> KR 10-2017-0158950 <151> 2017-11-24 <150> KR 10-2018-0071805 <151> 2018-06-22 <150> KR 10-2018-0093873 <151> 2018-08-10 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha forward primer <400> 1 tctcatcagt tctatggccc agac 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha reverse primer <400> 2 ggcaccacta gttggttgtc tttg 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS forward primer <400> 3 gctaccacat tgaagaagct ggtg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS reverse primer <400> 4 ccataggaaa agactgcacc gaag 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 5 gacatcaaga aggtggtgaa gcag 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 6 ccctgttgct gtagccgtat tcat 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 forward primer <400> 7 gccagagtcc ttcagagaga taca 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 reverse primer <400> 8 attggatggt cttggtcctt agcc 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta forward primer <400> 9 gcaacgacaa aatacctgtg gcct 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta reverse primer <400> 10 agttggggaa ctctgcagac tcaa 24 <110> ExoCoBio Inc. <120> A composition comprising an exosome derived from stem cell as an          active ingredient and its application for reinforcing or          improving skin barrier <130> P17-0030KR <150> KR 10-2017-0158950 <151> 2017-11-24 <150> KR 10-2018-0071805 <151> 2018-06-22 <150> KR 10-2018-0093873 <151> 2018-08-10 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha forward primer <400> 1 tctcatcagt tctatggccc agac 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha reverse primer <400> 2 ggcaccacta gttggttgtc tttg 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS forward primer <400> 3 gctaccacat tgaagaagct ggtg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> iNOS reverse primer <400> 4 ccataggaaa agactgcacc gaag 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 5 gacatcaaga aggtggtgaa gcag 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 6 ccctgttgct gtagccgtat tcat 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 forward primer <400> 7 gccagagtcc ttcagagaga taca 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 reverse primer <400> 8 attggatggt cttggtcctt agcc 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta forward primer <400> 9 gcaacgacaa aatacctgtg gcct 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-1beta reverse primer <400> 10 agttggggaa ctctgcagac tcaa 24

Claims (20)

줄기세포 유래의 이중인지질막 구조를 갖는 세포외소포인 엑소좀을 유효성분으로 포함하고,
피부에서 세라마이드 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물.Exosome is an extracellular vesicle having a double phospholipid membrane structure derived from stem cells as an active ingredient,
Cosmetic composition for strengthening or improving the skin barrier of the stratum corneum, characterized in that to increase the ceramide production in the skin. 삭제delete 제1항에 있어서,
피부에서 세라마이드, 디히드로세라마이드 또는 스핑고 염기 중 적어도 1종의 생성량을 증가시키는, 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물.The method of claim 1,
Cosmetic composition for strengthening or improving the skin barrier of the stratum corneum to increase the amount of at least one of ceramide, dehydroceramide or sphingo base in the skin. 제3항에 있어서,
피부에서 C16 세라마이드, C18 세라마이드, C20 세라마이드, C22 세라마이드, C24 세라마이드, 또는 C24:1 세라마이드 중 적어도 1종의 생성량 및 총 세라마이드의 생성량을 증가시키는, 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물.The method of claim 3,
A cosmetic composition for strengthening or improving the function of the skin barrier of the stratum corneum, which increases the production of at least one of C16 ceramide, C18 ceramide, C20 ceramide, C22 ceramide, C24 ceramide, or C24: 1 ceramide and the total ceramide production. 제3항에 있어서,
피부에서 C16 디히드로세라마이드, C18 디히드로세라마이드, C22 디히드로세라마이드, C24 디히드로세라마이드, 또는 C24:1 디히드로세라마이드 중 적어도 1종의 생성량 및 총 디히드로세라마이드의 생성량을 증가시키는, 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물.The method of claim 3,
Skin barrier of the stratum corneum, which increases the production of at least one of C16 dehydroceramide, C18 dihydroceramide, C22 dihydroceramide, C24 dehydroceramide, or C24: 1 dihydroceramide and the total amount of dehydroceramide Strengthening to improve the cosmetic composition. 제3항에 있어서,
피부에서 S1P(Sphingosine-1-phosphate) 또는 스핑고신 중 적어도 1종의 생성량을 증가시키는, 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물.The method of claim 3,
Cosmetic composition for strengthening or improving the skin barrier of the stratum corneum to increase the production of at least one of S1P (Sphingosine-1-phosphate) or sphingosine in the skin. 제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
피부에서 SPHK1의 활성을 증가시키고 S1P 리아제(S1P lyase)의 활성을 감소시키는, 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물.The method according to any one of claims 1 and 3 to 6,
Increasing the activity of SPHK1 in the skin and decreases the activity of S1P lyase (S1P lyase), the cosmetic composition for enhancing the skin barrier or function of the stratum corneum. 제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
피부에서 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin), IL-4 및 IL-13의 생성 또는 발현을 감소시키는, 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물. The method according to any one of claims 1 and 3 to 6,
Cosmetic composition for strengthening or improving the skin barrier of the stratum corneum to reduce the production or expression of TSLP (Thymic stromal lymphopoietin), IL-4 and IL-13 in the skin. 삭제delete 삭제delete 제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더 및 기름 종이로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 형태에 적용하는 것을 특징으로 하는, 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물.The method according to any one of claims 1 and 3 to 6,
At least one selected from the group consisting of patches, mask packs, mask sheets, creams, tonics, ointments, suspensions, emulsions, pastes, lotions, gels, oils, packs, sprays, aerosols, mists, foundations, powders and oil papers Cosmetic composition for strengthening or improving the skin barrier of the stratum corneum, characterized in that applied to the form. 제11항에 있어서,
패취, 마스크팩 또는 마스크시트의 적어도 일면(一面)에 도포되거나 침적되는 것을 특징으로 하는, 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물.The method of claim 11,
Cosmetic composition for strengthening or improving the skin barrier of the stratum corneum, characterized in that applied to or deposited on at least one side of the patch, mask pack or mask sheet. 삭제delete 제11항에 있어서,
크림 또는 로션인, 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물.The method of claim 11,
Cream or lotion, the cosmetic composition for enhancing the skin barrier to improve the function of the stratum corneum. (a) 제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 직접 도포하는 것, (b) 상기 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 포유동물의 피부에 접촉 또는 부착하는 것, 또는 상기 (a) 및 (b)를 순차적으로 진행하는 것을 포함하는, 치료용을 제외한 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법.(a) Applying the cosmetic composition for enhancing or improving the skin barrier of the stratum corneum according to any one of claims 1 and 3 to 6 directly on the skin of a mammal, (b) the skin barrier of the stratum corneum Treatment comprising applying or depositing a patch, mask pack or mask sheet to which the cosmetic composition for strengthening or improving function is applied or deposited on the skin of a mammal, or sequentially proceeding with (a) and (b) above. Beauty method for controlling the condition of the skin of the mammal by enhancing the skin barrier or function of the stratum corneum except for the dragon. 제15항에 있어서,
상기 (a) 단계에서는 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 미용방법.The method of claim 15,
In the step (a), a lotion or cream is used as a cosmetic composition for enhancing the skin barrier or improving the function of the stratum corneum. 제15항에 있어서,
(c) 상기 (b) 단계 이후에 상기 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 상기 포유동물의 피부로부터 제거하고, 상기 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물을 포유동물의 피부에 도포하는 단계를 더 포함하는, 미용방법.The method of claim 15,
(c) removing the patch, mask pack or mask sheet from the skin of the mammal after step (b), and applying a cosmetic composition for strengthening or improving the skin barrier of the stratum corneum to the skin of the mammal. Further comprising, beauty method. 제17항에 있어서,
상기 (c) 단계에서는 각질층의 피부장벽 강화 내지 기능 개선용 화장료 조성물로서 로션이나 크림이 사용되는, 미용방법.The method of claim 17,
In the step (c), a lotion or cream is used as a cosmetic composition for enhancing skin barrier or improving function of the stratum corneum. 삭제delete 삭제delete
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