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KR101990068B1 - 렌티바이러스 벡터의 안정한 제조 - Google Patents

렌티바이러스 벡터의 안정한 제조 Download PDF

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KR101990068B1
KR101990068B1 KR1020137008387A KR20137008387A KR101990068B1 KR 101990068 B1 KR101990068 B1 KR 101990068B1 KR 1020137008387 A KR1020137008387 A KR 1020137008387A KR 20137008387 A KR20137008387 A KR 20137008387A KR 101990068 B1 KR101990068 B1 KR 101990068B1
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cell line
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cells
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치아라 보보렌타
안나 스토르나이우오로
파올로 리짜르디
풀비오 마빌리오
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몰메드 에스피에이
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Abstract

본 발명은 신규한 안정적 패키징 세포주 및 생산자 세포주 뿐만 아니라, 이를 획득하는 방법 및 이러한 세포주를 이용한 신규한 렌티바이러스 벡터 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 신규한 방법 및 패키징 세포주는 구조 및 조절 렌티바이러스 단백질의 안정한 발현을 위해 배큘로-AAV 하이브리드 시스템을 이용하여 생성되며, 이러한 시스템은 rep 단백질을 암호화하는 플라스미드와 함께, AAV ITRs 측면에 위치한 통합 카세트를 함유하는 배큘로바이러스 백본을 포함한다. 상기 시스템은 구조 및 조절 HIV-1 단백질 gag/pol 및 rev의 안정한 통합을 획득할 수 있도록 한다. 상기 시스템은 구조 및 조절 HIV-1 단백질 gag/pol 및 rev만을 포함하는 제 1 중간물이 인장힌 패키징 세포주 및 생산자 세포주를 획득하기 위한 출발점으로 사용될 수 있도록 한다.

Description

렌티바이러스 벡터의 안정한 제조{STABLE PRODUCTION OF LENTIVIRAL VECTORS}
본 발명은 유전자 치료용 렌티바이러스 벡터(LV)의 제조에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 안정성 렌티바이러스 패키징 세포주, 및 렌티바이러스의 구조 및 조절 단백질의 안정한 인테그레이션을 위한 하이브리드 배큘로-아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 이용한 패키징 세포주 제조 방법에 관한 것이다.
2001년도에 AIDS에 대한 사상 최초의 LV 단계 I 임상 시도 이후에, 유전자 운반 비이클로서 HIV-기초 LV를 개발하는 38가지의 단계 I-II 시도 및 2가지의 단계 II-III 시도가 정부 당국의 정밀 조사를 받았으며, 이 중에서 3가지가 여전히 검토 중에 있다. 최다수의 시도는 단일 유전자 질환을 포함하며, 이의 일부는 쿨리 빈혈증 β-탈라세미아 메이저(Cooley's anemia β-thalassemia major)(4가지의 임상 시도)와 같은 높은 발생률을 갖는다. 대부분의 HIV-1 감염은 암 및 감염 질병이 뒤따른다. 일반적으로, 단계 I/II 시도에 있는 환자의 수는 제한되지만 단계 III에 있는 환자의 수는 그렇지 않다. 따라서, 바라건대 앞으로 더 많은 수로 획득할 수 있는 단계 III 시도에 요구되는 LV 대규모 생산을 처리하기 위해, 2차(LTR-기초) 및 3차(SIN-기초) LV 생산을 위한 안정한 패키징 세포주가 시급히 요구된다. 임시 프로토콜에 기반을 둔 LV 생산은 결국 안전성, 비용 및 재현성 관점에서 세계적 적용에 비현실적이다.
늘어나고 있는 일련의 증거는, 가장 최근에 개발된 유전자 치료용 바이러스 통합 벡터인 LV가 말기에 분화되거나 순환되는 세포를 변환하기 위해 광범위하게 적용가능하며, 초기에 두려워했던 것보다 안전한 것임을 보여준다. 지난 2십년에 걸쳐 몰로니 뮤린 루케미아 바이러스(MoMLV) 감마-레트로바이러스 벡터(γRV)에 축적된 경험은 LV 운반 시스템에 대한 빠른 진척을 이끌었으며, 이의 발전은 비분할 세포를 변환하는 것에 대한 레트로바이러스의 불능을 극복할 필요성에서 기원하였다. 특히, 자가 불활성(SIN) 트랜스퍼 벡터의 생산은 인간 임상 시도에서 LV의 다량 사용의 가능성을 더욱 실현 가능하도록 해주며, 상당히 효율적인 제조 공정의 확대 및 최적화를 제공하였다. 그러나, 여러 명의 사람 및 뮤린의 상업적으로 입수가능한 패키징 세포주에 의해 생산될 수 있는 γRV와는 대조적으로, LV는 현재 연구용 및 GMP-등급용으로만 생산되며, 대부분 트랜시언트 트랜스펙션으로만 사용된다. 이러한 기술은 비용이 많이 들며, 표준화 및 스케일 업하기가 어렵고, 수 많은 다운스트림 입증 시험을 필요로 한다. 더욱이, 아마도 패키징 및 트랜스퍼 벡터 구조물에서 바이러스 서열들간의 재조합을 통해 일어나는 복제 가능 렌티바이러스(RCL)의 위험성은 드물지만, 안정한 생산보다는 일시적인 생산 중에 더 잘 일어난다.
레트로바이러스와 맞먹는 LV에 대해 안정한 패키징 세포주의 개발은 더 느리고 더 어려운 것으로 드러났다. 그 이유는 감마 레트로바이러스와 상반적으로, 엔벨로프(env), 프로테아제 및 일부 부수적인 단백질들과 같은 렌티바이러스 단백질의 발현은 인간 세포에 독성적이기 때문이다. 이 문제를 극복하기 위해, 매우 초기 형태의 패키징 세포에 존재하는 부수적인 유전자들은 최근 세대의 형태에서는 이후에 제거되었다. 제 1 세대 SIV- 및 HIV-기초 LV 패키징 세포주는 원숭이 Vero 세포, 또는 인간 COS, HeLa 및 293 부착 세포(2-5)로부터 획득되었으며, 패키징 신호의 제거와 같은 소수의 중요한 변형을 전달하는 렌티바이러스 게놈으로 조작된다. gp120 env 및 대부분의 부수적인 유전자들은 실제로 유지된다. 그 결과 형성된 LV 타이터는 매우 낮으며(2-5), 보다 중요하게, 이러한 벡터의 가능한 적용은 필연적으로 항-AIDS 유전자 치료 접근을 위한 CD4+ T 세포로 제한된다. 이후에, gp120 env는 베지큘라 스토마티티스 바이러스(VSV-G)로부터 유래된 글리코프로틴으로 치환되고, 모든 부수적인 유전자들은 효율적인 LV 생산에 불필요한 것으로 입증되었기 때문에 제거되었다. VSV-G에 대해서도 기재한 바와 같은 독성을 억제하기 위해, 이의 발현은 Tet, 엑디손(ecdysone), Rev 및 Tet와 큐메이트(cumate)의 조합(6)과 같은 다양한 여러 가지 시스템에 의해 조건부로 유도되었다. 마찬가지로, 클론 선별 중에 바이러스 프로테아제의 독성 효과를 줄이기 위해, Tet 및 독시시클린(doxycycline)과 큐메이트의 조합에 의한 gag-pol 유전자의 조건적인 발현이 기술된 바 있다(6). 이러한 모든 시스템에서, gag-pol, rev 및 env 유전자는 플라스미드 DNA의 트랜시언트 트랜스펙션, 그 다음 약물 선발 및 세포 클로닝에 의해 통합되었다.
실제로 안정한 패키징 세포주를 성취하기 위한 중요한 문제 중 하나는 최상의 바이러스 유전자 운반 비이클의 선택이다. 대부분의 연구자들은 gag-pol, rev 및 env 유전자를 플라스미드 DNA의 트랜시언트 트랜스펙션, 그 다음 약물 선발 및 세포 클로닝에 의해 통합하였다(2-9). 이러한 기술은 시간이 경과함에 따른 유전자 사일런싱 및 유전자 손실로부터 어려움을 겪는 것으로 알려져 있으며(10), 이러한 유전자 사일런싱 및 유전자 손실은 모두 패키징 클론의 장기 안정성을 위태롭게 한다.
변형적인 유전자 운반 비이클은 STAR(11)에 상세히 기재되어 있으며, 보다 최근에는 gag, pol 및 rev 유전자가 MLV-셔틀 벡터에 의해 HEK293T 세포 내로 통합된 GPRG-TL-20(12) 패키징 세포주가 개발되었다. 리코딩된 gag-pol 유전자의 두 복사체는 STAR에 안정하게 통합되었으나, 이러한 정보는 GPRG-TL-20(12)에 유용하지 않다. env 유전자가 트랜스펙션된 STAR와 상반적으로, GPRG-TL-20에서는 모든 잔류하는 바이러스 유전자가 SIN-MLV에 의해 도입된다.
외부 게놈을 숙주 세포 내로 안정하게 통합시킬 수 있는 여러 가지 시스템이 존재한다. Palombo 등(1998)(13)은 숙주 세포 내로의 특이적 통합을 위한 하이브리드 배큘로바이러스-AAV 벡터에 대해 기재하였다. 이러한 벡터는 rep 유전자를 동일한 하이브리드 배큘로바이러스-AVV 벡터에 포함할 경우에 매우 효과적인 것으로 보인다. 이 참고문헌에는, LV 생산을 위해 이러한 종류의 시스템을 사용하는 것에 대해 제시하고 있지 않을 뿐만 아니라, 본 발명의 구성에 대해 언급되어 있지 않다.
거의 지난 2십년에 걸쳐, 안정한 LV 패키징 세포주를 생산하기 위한 여러 시도가 이루어져 왔다. 개시된 다양한 기술에도 불구하고, 현재 이러한 패키징 세포주 중 어느 것도 임상 시험에 사용되고 있지 않으며, 그 시장은 아직 궁지에 내몰려 있다. 따라서, 생산 능력 면에서 효과적이고, 안전하면서, 비용 효율적이고 재현가능한 LV의 대규모 생산을 위한 새로운 시스템이 요구된다.
본 발명은 LV의 생산 기술에 관한 것이다. 유전자 운반 비이클로서 LV를 이용하는 여러 유전자 치료 임상 시험이 진행중이다. 이러한 모든 시험에서, LV 생산은 여전히 트랜시언트(transient) 프로토콜에 기초한다.
본 발명은 HIV-1-기초 패키징 세포주를 생성하는 새로운 전략을 제공한다. 이러한 전략은 rep 단백질을 암호화하는 플라스미드와 함께, AAV 역위 말단 반복(inverted terminal repeats)(ITRs)에 플랭킹된 통합 카세트를 함유하는 배큘로바이러스 백본을 포함하는 하이브리드 벡터, 소위 배큘로-AAV 하이브리드 시스템의 사용에 기초한다. 이러한 시스템은 구조 및 조절 HIV-1 단백질 gag/pol 및 rev의 안정한 통합을 획득가능하게 한다. 본 발명의 시스템은 a) 2 발현 카세트로서, 하나는 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 암호화하는 카세트이며, 다른 하나는 렌티바이러스 rev 및 선발 마커를 암호화하는 카세트인 2 발현 카세트를 함유하는 것을 특징으로 하는 배큘로-AAV 하이브리드 벡터, 및 b) rep 단백질을 암호화하는 플라스미드를 포함한다. 상기 제시된 시스템은 구조 렌티바이러스 단백질을 가진 숙주 세포를 안정적이며 효율적으로 구조 및 조절 HIV 단백질을 운반하기 위한 새롭고 유리한 방법을 나타낸다. 이러한 시스템을 이용하면, 반-안정적 LV 생산에 사용되거나 선택적으로 조절 단백질(Tat) 및 관심있는 엔벨로프 단백질을 포함하는 제 2 및 제 3 세대 패키징 세포주 뿐만 아니라, 트랜스퍼 벡터를 포함하는 생산자 세포주를 획득하기 위한 출발점으로서 사용되는, 구조 및 조절 HIV 단백질인 gag/pol 및 rev만을 포함하는 제 1 중간물이 획득된다.
제 1 중간물은 HIV-1 gag-pol 및 rev 유전자를 트리-시스트로닉 형태로 발현하는 재조합 배큘로-AAV 패키징 구조물의 두 복사체를 운반한다. 이러한 중간물은 PK-7이라 불리며, 실시예에서 PK-7으로 칭하여진다. 배큘로-AAV 패키징 벡터의 게놈 통합은 ITR 벡터 통합에 필요한 것으로 알려진 AAV Rep78 단백질의 트랜시언트 발현에 의해 촉진되었다(14). 이러한 제 1 중간물은 잔류 유전 요소의 트랜시언트 트랜스펙션 후 배양 1년 동안 기능성 LV의 지속적인 생산을 보이는 예기치 않은 유전적 안정성을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 이러한 세포에서 사일런스 현상이 관찰되지 않았다. 더욱이, 논코딩 유전자간 전사 활성 리전에서 2개의 일렬로 통합된 패키징 AAV 벡터의 통합 사이트를 정확히 매핑함으로써, 본 발명자들은 mRNA가 LV에서 편입될 수 있으며, 궁극적으로 숙주 표적 세포에 편입될 수 있는 위험한 유전자의 가능한 활성화에 대한 안전성 논쟁을 제공하였다.
제 1 중간물로부터, 제 2 및 제 3 세대의 안정한 패키징 세포주가 획득될 수 있다. 특히, 본 발명에 따르면, MLV 4070 env, RD114 env 또는 GALV env 레트로바이러스 또는 이의 유도체와 같은 관심있는 엔벨로프 단백질을 제 2 중간물 PK-7에 안정하게 통합시킴으로써 제 3 세대 패키징 세포주가 획득될 수 있다. 안정한 통합은 SIN-LV 운반을 이용하여 획득될 수 있으나, 다른 유전자 운반 비이클이 사용될 수 있다. 본 발명자들은 펠린 내생성 레트로바이러스로부터 유래된 엔벨로프의 세포외 및 트랜스-멤브레인 도메인 및 MLV 4070 env의 세포질 꼬리(15)를 포함하는 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR을 통합시킴으로써 실시예에서 PK-7-RD라 칭한 관련 패키징 세포주를 획득하였다. RD114-TR 키메릭 엔벨로프 단백질 통합은 SIN-LV 운반에 의해 획득되었다.
제 2 및 제 3 세대 생산자 세포주를 확보하기 위해, SIN-Tat, SIN-Env 및 트랜스퍼 벡터, 또는 SIN-Env 및 트랜스퍼 벡터가 각각 연속 운반에 의해 통합되었다. 개념적으로, 이는 시간 소모적임에도 불구하고 하나의 벡터의 통합은 동종 재조합의 위험을 감소시켜, 이에 따라 RCL 형태를 감소시킨다.
렌티바이러스 gag-pol 및 rev의 안정한 발현을 위해 하이브리드 배큘로-AAV 벡터의 사용에 기초하여 개발된 패키징 시스템은 "MolPack"이라 불우며, 이에 따라, 이러한 시스템으로 개발되고 RD114-TR 및 tat를 각각 엔벨로프 및 조절 단백질로서 함유하고, 그리고 치료 유전자로서 Chim3를 암호화하는 트랜스퍼 벡터를 함유하는 제 2 세대 생산자 세포주는 실시예에서 RD2-MolPack-Chim3라 칭하여진다.
현저하게, RD2-MolPack-Chim3로부터 유도된 LV의 타이터는 HEK293T 대조구 세포로부터 생산된 LV의 타이터 보다 2-log 더 높으며, 이는 RD2-MolPack-Chim3가 트랜시언트 프로토콜에 의해 생산된 동등한 LV와 비교하여 보다 기능적인 LV를 생성하며, 비용 효율적이며 보다 안전한 안정한 생산자 세포주에 의해 생산되는 추가적인 이점을 갖는다.
본 발명의 제 1 견지에 따르면,
i. 2개의 발현 카세트를 포함하는 AAV ITRs의 측면에 위치한(flanked by) 통합 카세트를 함유하는 배큘로바이러스 백본을 포함하는 하이브리드 벡터로서, 상기 2 발현 카세트는 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 암호화하는 제 1 발현 카세트 및 렌티바이러스 rev 및 선발 마커를 암호화하는 제 2 발현 카세트를 함유하는, 배큘로바이러스 백본을 포함하는 하이브리드 벡터; 및
ii. 프로모터의 조절 하에 AAV Rep 오픈 리딩 프래임(ORF)을 함유하는 발현 플라스미드
로 구성된, 렌티바이러스 구조 및 조절 단백질의 안정한 발현을 위한 시스템이 제공된다.
바람직하게, 상기 하이브리드 벡터의 2개의 발현 카세트는 꼬리 대 꼬리(tail-to-tail) 배향되고, 각각 구성 프로모터 및 폴리 A에 의해 구동되며, 바람직하게 상기 프로모터는 CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1αSFFV 및 RSV로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 프로모터는 CMV IE 프로모터이다.
본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 상기 선발 마커는 하이그로마이신, 카나마이신, 네오마이신, 제오마이신 내성 유전자로부터 선택되며, 바람직하게 상기 선발 마커는 하이드로마이신 내성 유전자이다.
바람직하게 상기 선발 마커는 클로닝된 다운스트림 내부 리보좀 엔트리 사이트(IRES)이다.
바람직하게, 상기 AAV rep 단백질은 rep78 및 rep68로부터 선택된다. 보다 바람직하게 rep 단백질은 rep78이다.
본 발명의 다른 견지에 따르면, 반-안정적 렌티바이러스 패키징 세포주로서,
이러한 세포는 이의 게놈 내로 안정적으로 통합되는, 2개의 발현 카세트를 포함하는 AAV ITRs의 측면에 위치한(flanked by) 통합 카세트의 적어도 하나의 복사체를 함유하며,
상기 2개의 발현 카세트는 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 암호화하는 제 1 발현 카세트, 및 렌티바이러스 rev 및 선발 마커를 암호화하는 제 2 발현 카세트로 구성되는 것을 특징으로 하는,
렌티바이러스 gag, pol 및 rev를 안정적으로 발현하는 세포들로 구성된, 반-안정적 렌티바이러스 패키징 세포주가 제공된다.
바람직하게, 상기 세포는 인간 세포주이며, 바람직하게 HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 또는 HeLa로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 세포주는 HEK293-T이다.
바람직하게, 상기 2개의 발현 카세트는 꼬리 대 꼬리로 배향되며, 각각 구성 프로모터 및 폴리 A에 의해 구동되며, 바람직하게 상기 프로모터는 CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV 및 RSV로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 프로모터는 CMV IE 프로모터이다.
본 발명의 바람직한 견지에 따르면, 상기 선발 마커는 하이그로마이신, 카나마이신, 네오마이신, 제오마이신 내성 유전자로부터 선택되며, 바람직하게 상기 선발 마커는 하이드로마이신 내성 유전자이다. 보다 바람직하게 상기 선발 마커는 클로닝된 다운스트림 내부 리보좀 엔트리 사이트(IRES)이다.
바람직하게, 상기 AAV rep 단백질은 rep78 또는 rep68로부터 선택된다. 보다 바람직하게, rep 단백질은 rep78이다.
본 발명의 다른 견지에 의하면,
i. 2개의 발현 카세트를 포함하는 AAVITRs 측면에 위치한 통합 카세트를 함유하는 배큘로바이러스 백본을 포함하는 하이브리드 벡터(A)를 제조하는 단계로서,
상기 2개의 발현 카세트는 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 암호화하는 제 1 발현 카세트, 및 렌티바이러스 rev 및 선발 마커를 암호화하는 제 2 발현 카세트로 구성되는, 하이브리드 벡터(A) 제조 단계, 및
ii. 프로모터의 조절 하에서 AAV rep ORF를 함유하는 발현 플라스미드(B)를 제조하는 단계,
iii. 상기 발현 플라스미드(B)로 세포를 트랜스펙션한 다음, 상기 세포를 하이브리드 벡터(A)로 감염시키는 단계,
iv. 상기 세포를 선별용 항생제의 존재 하에서 배양하는 단계,
v. gag, pol 및 rev 단백질을 안정하게 발현하는 세포를 획득하는 단계,
vi. 획득된 상기 세포에 env 유전자를 통합시키는 단계,
vii. 상기 세포를 배양하여 gag, pol, rev 및 env 단백질을 안정하게 발현하는 세포를 획득하는 단계
를 포함하는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 따르면,
i. 2개의 발현 카세트를 포함하는 AAVITRs 측면에 위치한 통합 카세트를 함유하는 배큘로바이러스 백본을 포함하는 하이브리드 벡터(A)를 제조하는 단계로서,
상기 2개의 발현 카세트는 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 암호화하는 제 1 발현 카세트, 및 렌티바이러스 rev 및 선발 마커를 암호화하는 제 2 발현 카세트로 구성되는, 하이브리드 벡터(A) 제조 단계, 및
ii. 프로모터의 조절 하에서 AAV rep ORF를 함유하는 발현 플라스미드(B)를 제조하는 단계,
iii. 상기 발현 플라스미드(B)로 세포를 트랜스펙션한 다음, 상기 세포를 하이브리드 벡터(A)로 감염시키는 단계,
iv. 상기 세포를 선별용 항생제의 존재 하에서 배양하는 단계,
v. gag, pol 및 rev 단백질을 안정하게 발현하는 세포를 획득하는 단계,
vi. 획득된 상기 세포에 렌티바이러스 tat 유전자를 통합시키는 단계,
vii. 상기 세포를 배양하여 gag, pol, rev 및 tat 단백질을 안정하게 발현하는 세포를 획득하는 단계
viii. 획득된 상기 세포에 env 유전자를 통합시키는 단계,
ix. 상기 세포를 배양하여 gag, pol, rev, tat 및 env 단백질을 안정하게 발현하는 세포주를 획득하는 단계
를 포함하는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법이 제공된다.
바람직하게, 상기 하이브리드 벡터의 2개의 발현 카세트는 꼬리 대 꼬리로 배향되며, 각각 구성 프로모터 및 폴리 A에 의해 구동되며, 바람직하게 상기 프로모터는 CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV 및 RSV로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 프로모터는 CMV IE 프로모터이다.
바람직하게, 상기 tat 유전자는 HIV-1 tat이다.
본 발명의 바람직한 견지에 따르면, 상기 선발 마커는 하이그로마이신, 카나마이신, 네오마이신, 제오마이신 내성 유전자로부터 선택되며, 바람직하게 상기 선발 마커는 하이드로마이신 내성 유전자이다. 보다 바람직하게 상기 선발 마커는 클로닝된 다운스트림 내부 리보좀 엔트리 사이트(IRES)이다.
바람직하게, 상기 env 유전자는 AAV 벡터, 레트로바이러스 벡터, 안정한 플라스미드 통합 또는 동종 재조합을 이용하여 숙주 세포에 통합된다. 보다 바람직한 견지에 따르면, 상기 env 유전자는 SIN 렌티바이러스 벡터를 이용하여 통합된다.
바람직하게, 상기 env 유전자는 MLV 4070 env, RD114 env, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114pro 배큘로바이러스 GP64 env 또는 GALV env 또는 이의 유도체로부터 선택되며; 보다 바람직하게 env 유전자는 상기 RD114-TR을 암호화하는 유전자이다.
바람직한 구현으로, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR의 안정한 통합을 위해, 5' 내지 3' 말단에 CMV 프로모터, 이의 서열에 RRE 요소를 함유하는 β-글로빈 인트론 및 RD114-TR ORF를 함유하는 발현 카세트를 포함하는 SIN 렌티바이러스 벡터가 제공된다.
바람직하게, 상기 AAV rep 단백질은 rep78 또는 rep68로부터 선택된다. 보다 바람직하게, rep 단백질은 rep78이다.
본 발명의 다른 견지에 따르면, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주로서, 상기 세포주의 게놈 내로 안정하게 통합되는
i. 2개의 발현 카세트를 포함하는 AAV ITRs의 측면에 위치한(flanked by) 적어도 하나의 통합 카세트의 복사체로서, 상기 2개의 발현 카세트는 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 암호화하는 제 1 발현 카세트 및 렌티바이러스 rev 및 선발 마커를 암호화하는 제 2 발현 카세트로 구성되는, 통합 카세트의 적어도 하나의 복사체; 및
ii. 적어도 하나의 env의 복사체
를 함유하는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주가 제공된다.
본 발명의 동일한 견지에 따르면, 상기 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주는 이의 게놈 내로 안정하게 통합되는 적어도 하나의 HIV-1-tat 유전자의 복사체를 더 포함한다.
바람직하게, 상기 세포는 인간 세포주이며, 바람직하게 HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 또는 HeLa로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 세포주는 HEK293-T이다.
바람직하게, 상기 2개의 발현 카세트는 꼬리 대 꼬리로 배향되며, 각각 구성 프로모터 및 폴리 A에 의해 구동되며, 바람직하게 상기 프로모터는 CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV 및 RSV로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 프로모터는 CMV IE 프로모터이다.
본 발명의 바람직한 견지에 따르면, 상기 선발 마커는 하이그로마이신, 카나마이신, 네오마이신, 제오마이신 내성 유전자로부터 선택되며, 바람직하게 상기 선발 마커는 하이드로마이신 내성 유전자이며, 보다 바람직하게 상기 선발 마커는 클로닝된 다운스트림 내부 리보좀 엔트리 사이트(IRES)이다.
바람직하게, 상기 env 유전자는 AAV 벡터, 레트로바이러스 벡터, 안정한 플라스미드 통합 또는 동종 재조합을 이용하여 숙주 세포에 통합된다. 보다 바람직한 견지에 따르면, 상기 env 유전자는 SIN 렌티바이러스 벡터를 이용하여 통합된다.
바람직하게, 상기 env 유전자는 MLV 4070 env, RD114 env, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114pro, 배큘로바이러스 GP64 env 또는 GALV env 또는 이의 유도체로부터 선택되며; 보다 바람직하게 env 유전자는 상기 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR을 암호화하는 유전자이다.
다른 견지에 따르면,
i. 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 배양하는 단계로서, 이러한 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되는, 2개의 발현 카세트를 포함하는 AAV ITRs의 측면에 위치한 적어도 하나의 통합 카세트의 복사체 및 적어도 하나의 env의 복사체를 함유하며,
상기 2개의 발현 카세트는 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 암호화하는 제 1 발현 카세트, 및 렌티바이러스 rev 및 선발 마커를 암호화하는 제 2 발현 카세트로 구성되는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주 배양 단계; 및
ii. 상기 안정한 패키징 세포주에 트랜스퍼 벡터를 삽입시키는 단계
를 포함하는, 렌티바이러스 벡터 제조 방법이 제공된다.
바람직하게, 상기 2개의 발현 카세트는 꼬리 대 꼬리로 배향되며, 각각 구성 프로모터 및 폴리 A에 의해 구동되며; 바람직하게 상기 프로모터는 CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV 및 RSV로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 구성 프로모터는 CMV IE 프로모터이다.
바람직하게, 상기 선발 마커는 하이그로마이신, 카나마이신, 네오마이신, 제오마이신 내성 유전자로부터 선택되며; 보다 바람직하게 상기 선발 마커는 하이그로마이신 내성 유전자이다. 보다 바람직하게 상기 선발 마커는 클로닝된 다운스트림 내부 리보좀 엔트리 사이트(IRES)이다.
바람직하게, 상기 env 유전자는 VSV-G env, MLV 4070 env, RD114 env, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114pro, 배큘로바이러스 GP64 env 또는 GALV env 또는 이의 유도체로부터 선택되며, 보다 바람직하게 env 유전자는 상기 RD114-TR을 암호화하는 유전자이다.
본 발명의 다른 견지에 따르면,
생산자 세포주(producer cell line)로서, 상기 세포주의 게놈 내로 안정하게 통합되는
i. 2개의 발현 카세트를 포함하는 AAV ITRs의 측면에 위치한 적어도 하나의 통합 카세트의 복사체로서, 상기 2개의 발현 카세트는 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 암호화하는 제 1 발현 카세트 및 렌티바이러스 rev 및 선발 마커를 암호화하는 제 2 발현 카세트로 구성되는, 통합 카세트의 적어도 하나의 복사체;
ii. 적어도 하나의 env 유전자의 복사체; 및
iii. 트랜스퍼 벡터
를 포함하는, 생산자 세포주가 제공된다.
본 발명의 동일한 견지에 따르면, 상기 생산자 세포주는 이의 게놈 내로 안정하게 통합되는 렌티바이러스 tat 유전자를 더 포함한다.
바람직하게, 상기 세포는 인간 세포주이며, 바람직하게 HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 또는 HeLa로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 세포주는 HEK293-T이다.
바람직하게, 상기 통합 카세트의 2개의 발현 카세트는 꼬리 대 꼬리로 배향되며, 각각 구성 프로모터 및 폴리 A에 의해 구동되며, 바람직하게 상기 프로모터는 CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV 및 RSV로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 프로모터는 CMV IE 프로모터이다.
본 발명의 바람직한 견지에 따르면, 상기 선발 마커는 하이그로마이신, 카나마이신, 네오마이신, 제오마이신 내성 유전자로부터 선택되며, 바람직하게 상기 선발 마커는 하이드로마이신 내성 유전자이다. 보다 바람직하게 상기 선발 마커는 클로닝된 다운스트림 내부 리보좀 엔트리 사이트(IRES)이다.
바람직하게, 상기 env 유전자는 AAV 벡터, 레트로바이러스 벡터, 안정한 플라스미드 통합 또는 동종 재조합을 이용하여 숙주 세포에 통합된다. 보다 바람직한 견지에 따르며, 상기 env 유전자는 SIN 렌티바이러스 벡터를 이용하여 통합된다.
바람직하게, 상기 env 유전자는 MLV 4070 env, RD114 env, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114pro, 배큘로바이러스 GP64 env 또는 GALV env 또는 이의 유도체로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 env 유전자는 상기 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR을 암호화하는 유전자이다.
다른 견지에 따르면,
렌티바이러스 벡터 제조 방법으로서, 생산자 세포주의 게놈 내로 안정하게 통합되는
i. 2개의 발현 카세트를 포함하는 AAV ITRs의 측면에 위치한 적어도 하나의 통합 카세트의 복사체로서, 상기 2개의 발현 카세트는 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 암호화하는 제 1 발현 카세트 및 렌티바이러스 rev 및 선발 마커를 암호화하는 제 2 발현 카세트로 구성되는, 통합 카세트의 적어도 하나의 복사체;
ii. 적어도 하나의 env 유전자의 복사체; 및
iii. 관심있는 유전자를 암호화하는 적어도 하나의 트랜스퍼 벡터의 복사체
를 포함하는, 생산자 세포주를 배양하는 단계
를 포함하는, 렌티바이러스 벡터 제조 방법이 제공된다.
바람직하게, 상기 2개의 발현 카세트는 꼬리 대 꼬리(tail-to-tail) 배향되고, 각각 구성 프로모터 및 폴리 A에 의해 구동되며; 바람직하게 상기 프로모터는 CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV 및 RSV로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 구성 프로모터는 CMV IE 프로모터이다.
바람직하게 상기 선발 마커는 하이그로마이신, 카나마이신, 네오마이신, 제오마이신 내성 유전자로부터 선택되며; 보다 바람직하게 상기 선발 마커는 하이그로마이신 내성 유전자이다. 보다 바람직하게, 상기 선발 마커는 클로닝된 다운스트림 내부 리보좀 엔트리 사이트(IRES)이다.
바람직하게, 상기 env 유전자는 VSV-G env, MLV 4070 env, RD114 env, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114pro, 배큘로바이러스 GP64 env 또는 GALV env 또는 이의 유도체로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 env 유전자는 상기 RD114-TR을 암호화하는 유전자이다.
도 1. RD - MolPack 개발의 계획도. (a) 본 연구에 사용된 DNA 플라스미드의 개요도. pPolh, 폴리헤드린 프로모터; attB1, 부착 B1; ITR, 역위 말단 반복; CMV, 사이토메갈로바이러스 프로모터; In, 인트론; RRE, rev 반응 요소; A, 폴리A 서열; IRES, 내부 리보좀 엔트리 사이트; SD, 스플라이스 도너; SA, 스플라이스 억셉터; ψ, 패키징 신호; WPRE, 우드처크 헤파타이티스 전사후 조절 요소; cPPT, 중심 폴리퓨린 트랙; hPGK, 인간 포스포글리세레이트 키나아제 프로모터. (b) AAV-GPR 벡터의 Rep78-매개 게놈 통합의 개요도. AAV Rep78 프로모터는 ITR-측면에 위치한 AAV-GPR 카세트의 절제를 촉진하며, 이의 인간 염색체로의 통합을 촉진한다. (c) 반-안정적 패키징 세포주에 의한 생산의 플로우 차트. GOI, 관심 유전자.
도 2. PK 클론의 특성화. (a) AAV-GPR 벡터 통합의 서던 블롯팅 분석. 상기 카세트의 복사체수 및 강도를 설정하기 위해, PK 클론으로부터 유래된 게놈 DNA(10㎍)를 2가지 다른 제한 효소, BamHI 및 SnaBI으로 각각 처리하였다. (b) GPR 카세트로부터 생산된 바이러스 단백질의 웨스턴 블롯팅 분석. 좌측 패널, PK 클론으로부터 획득된 세포 추출물(50㎍/lane)을 HIV-1 단백질을 인지하는 항-HIV 인간 혈청과 하이브리드화하였다. 후속적으로 그 멤브레인을 항-rev 특이 Ab와 하이브리드화하였다. 우측 패널, PK 클론으로부터 생산된 30ng p24gag-당량의 바이러스성 파티클을 상기 세포 추출물과 동일하게 처리하였다. (c) 2q32.1 위치에 있는 2번 염색체의 롱 암에서 DNA 브레이크-포인트를 확인하는 LM-PCR 기술에 의한 GPR-카세트 통합의 도식적 매핑. (d) AAV-GPR 카세트 및 인간 Hox4 유전자의 2번 염색체로의 코-로칼라이제이션. PK-7 중기 염색체의 원위치 하이브리드화를 각각, gag-특이적(레드) 및 Hox4-특이적(그린) 프로브를 이용하여 수행하였다. (e) PK-7 클론에서 상기 2 GPR 통합 카세트의 재배열 및 이들의 꼬리 대 헤드 배향을 나타내는 개요도.
도 3. PK -7- Tat 클론에서 Tat 의 발현. (a) PK-7-Tat 벌크 세포 및 5개의 유도 클론으로부터 획득된 핵 추출물(50㎍/lane)의 웨스턴 블롯팅 분석. 인터널 대조구로서(internal control) 구성 핵 전사 인자, YY1을 검출하는 항-YY1 Ab로 스트리핑한 후에 멤브레인을 항-tat 특이 Ab와 하이브리드하였다. (b) 선발된 클론으로부터 셀 베이시스에서(on a per cell basis) 발현되는 p24 gag의 생산을 ELISA로 측정하였다. (c) SIN-LV-Tat, SIN-LV-RD114-TR 및 LTR-LV-Chim3 벡터의 강도에 대한 RD2-MolPack-Chim3.14의 게놈 DNA의 서던 블롯팅 분석. TaqMan PCR에 의해 산출된 3 벡터의 벡터 복제수는 괄호에 표시하였다. (d) 거의 2개월동안 범례로 나타낸 바와 같은, 다른 %의 FCS에서 배양된 RD2-MolPack-Chim3.14 세포의 세포 생존성의 그래프.
도 4. RD114 - TR 엔벨로프 발현의 분석. (a) 다른 구조물로부터의 RD114-TR 발현을 검출하기 위한 웨스턴 블롯팅 어세이. PK-7 세포를 CMV-RD114-TR 플라스미드(래인 1)로 트랜시언트 트랜스펙션(TF)하고, 이에 상응하는 전 세포 추출물을 양성 대조구로 사용하였다. SIN-RD114-TR(래인 2 및 3), plRES-RD114-TR-WT 및 plRES-RD114-TR-CO(codon optimized)(래인 4 및 5), SIN-RD114-TR-IN(래인 6 및 7) SIN-RD114-TR-IN-RRE(래인 8 및 9), SIN-RD114-WT-TR-IN-RRE 및 SIN-RD114-TR-CO-IN-RRE(래인 12 및 13)을 PK-7 세포로 트랜스펙션하거나, HEK293T의 스탠다드 트리플 트랜스펙션에 의해 생성된 VSV-G 슈도타입 LV 내로 트랜스 벡터로서 패키징하였다. 그 다음, SIN-RD114-TR을 함유하는 LV는 PK-7 세포(TD)를 스피노큘레이트(spinoculate)하는데 사용하였다. 래인 1-9, 12 및 13은 세포 추출물이며(50㎍/lane); 래인 10 및 11은 LV이다(30ng p24gag-quivalent/lane). 상기 키메릭 엔벨로프의 전구체(PR) 및 트랜스멤브레인(TM)을 인식하나, 상기 키메릭 엔벨로프의 표면 서브유닛(SU)은 인식하지 못하는 항-RD114-TR Ab로 필터를 탐침하였다. 상기 TM* 밴드는 바이러스-의존적 분할 후에 획득된 보다 짧은 트랜스멤브레인 서브유닛이다. (b) 3개의 PK-7-Tat-RD 클론에서 RD114-TR 엔벨로프의 웨스턴 블롯팅 분석. 좌측 패널, 세포 추출물(40㎍/lane)을 상기 항-RD114-TR로 탐침하였다. 스트리핑 후, 상기 멤브레인을 항-p24gag와 하이브리드하여 p24gag 수준에 따른 RD114-TR의 상대 비율을 평가하였으며, PK-7-Tat-RD 클론으로부터 생산된 30ng p24gag-당량의 LV를 상기 세포 추출물과 마찬가지로 처리하였다. 괄호 내의 수는 통합된 SIN-RD114-TR-IN-RRE 벡터의 복사체를 나타낸다. (c) 3개의 PK-RD 클론에서 RD114-TR 엔벨로프의 웨스턴 블롯팅 분석. 좌측 패널, 세포 추출물(40㎍/lane)을 항-RD114-TR Ab로 탐침하였다. 스트링핑 후, 멤브레인을 항-p24gag Ab와 하이브리드하였다. 우측 패널, PK-7-RD 클론으로부터 생산된 30ng p24gag-당량의 LV를 상기 세포 추출물과 마찬가지로 처리하였다. 괄호 내의 수는 통합된 SIN-RD114-TR-IN-RRE 벡터의 복사체를 나타낸다. (d) 3개의 PK-7-RD26 서브클론에서 RD114-TR 엔벨로프의 웨스턴 블롯팅 분석. 좌측 패널, 세포 추출물(40㎍/lane)을 항-RD114-TR Ab로 탐침하였다. 스트리핑 후, 멤브레인을 항-p24gag Ab와 하이브리드하였다. 우측 패널, PK-7-RD26 서브클론으로부터 생산된 30ng p24gag-당량의 LV를 상기 세포 추출물과 마찬가지로 처리하였다. 괄호 내의 수는 좌측 패널에서 통합된 SIN-RD114-TR-IN-RRE 벡터의 복사체를 나타내며, 우측 패널에서 상기 SIN-GFP 트랜스퍼 벡터의 트랜스펙션 후에 서브클론으로부터 생성된 LV의 타이터를 나타낸다.
도 5. 배큘로 - AAV - GPR 게놈 DNA 및 Rep 추정 잔류 DNA 통합의 분석. (a) 재조합 배큘로바이러스-AAV DNA의 서던 블롯팅 분석. 배큘로바이러스 파티클로부터 DNA를 추출하고, MluI 제한 효소로 밤새 다이제스션하고, 블롯팅한 후에 상기 11-kb GPR 카세트 특이 프로브로 탐침하였다. 엔트리-GPR 플라스미드(1pg) 및 배큘로바이러스가 없는 DNA(100ng)를 양성 및 음성 대조구로 각각 로드하였다. (b) 추정 잔류 rep78 플라스미드 DNA의 PK-7 세포 내로의 통합에 대한 검출. Rep78 특이적 PCR을 시료 주형으로서 상기 PK-7 게놈 DNA를 사용하고, 양성 대조구로서 상기 CMV-Rep78(1pg) 플라스미드를 사용하여 수행하였다.
도 6. SIN - RD114 - TR 및 SIN - RD114 - TR - IN 벡터의 전사. 엑스트라 Rev 플라스미드(2.5㎍)의 존재 하에서(래인 2 및 4) 또는 부재 하에서(래인 1 및 3), 상기 SIN-RD114-TR 벡터의 HEK293T 세포 내로의 트랜시언트 트랜스펙션 후, 상기 RD114-TR RNA의 발현의 노던 블롯팅 분석. 코-트랜스펙션 후 48시간에, HEK293T 세포로부터 총 RNA(5㎍)를 추출하여고, 상기 특이적 RD114-TR 프로브와 하이브리드하였다. FL, 전장(full length); Exp. FL, SIN-RD114-TR-IN 벡터의 예측 전장, 이는 β-글로빈 인트론의 존재에 대해 상기 SIN-RD114-TR보다 800-bp 더 긴 것으로 예측된다. 550-bp RD114-TR 프레그먼트가 특이적 프로브로 사용되었다.
본 발명의 바람직한 형태 및 구현의 상세한 설명은 비제한적인 예를 통해 설명된다.
본 발명은 달리 언급하지 않는 한, 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 이용하는 통상의 기술자에 의해 실시될 수 있다. 이러한 기술은 모두 공개된 문헌에 개시되어 있으며 설명되어 있다. 참조 예, J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); Current Protocols in Immunology, ch. 12, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J . M. Polak and James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J . Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. 이러한 공개문헌들은 본 명세서에 참고문헌으로 편입된다.
배큘로 - AAV 하이브리드 시스템
본 발명은 HIV-1-기초 패키징 세포주를 생성하는 새로운 전략을 제공한다. LV 제조 시스템의 최적화는 LV 기술에 기초한 유전자 치료 의학의 발달을 위해 해결해야할 필요가 있는 중요한 문제 중 하나이다. 이러한 기술을 이용하는 임상 시험의 수가 증가되고 있음에도 불구하고, 이러한 시험에서 LV는 여전히 트랜시언트 트랜스펙션 프로토콜을 이용하고 있다. 이러한 방식에서, LV의 제조는 여전히 매우 비용이 많이 들며, 다수의 환자들에게 불만족스럽다. 이러한 이유로, LV를 위한 안정한 패키징 세포주를 개발하기 위한 많은 노력이 이루어져 왔다. 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주의 개발에 있어서 중요한 문제 중 하나는 숙주 세포 조작을 위한 올바른 비이클을 선택하는 것이다. 많은 경우에, 숙주 세포는 플라스미드를 이용하여 조작되지만, 이러한 경우에, 게놈 불안정성 및 유전자 사일런스 현상이 또한 관찰된다. 레트로바이러스 벡터는 2개의 다른 경우에서 gag/pol 및 rev 유전자를 안정하게 통합하기 위해 사용되어 왔다. 지금까지 개발된 안정한 패키징 세포주 중에서 임상에 사용되고 있는 것은 없다.
본 발명의 전략은 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 암호화하는 제 1 발현 카세트, 및 렌티바이러스 rev 및 선발 마커를 암호화하는 제 2 발현 카세트로 구성된 2 발현 카세트를 포함하며, AAV ITRs의 측면에 위치한 통합 카세트를 함유하는 배큘로바이러스 백본; 및 프로모터의 조절 하에 상기 AAV rep ORF를 함유하는 발현 플라스미드를 함께 포함하는 하이브리드 벡터로 구성된, 렌티바이러스 구조 및 조절 HIV 단백질의 안정한 발현을 위한 시스템의 사용에 기초한다. 배큘로바이러스 백본의 존재는 숙주가, 여러 가지 다양한 단백질을 암호화하는 2 발현 카세트를 포함하는 크고 복잡한 통합 카세트를 형성할 수 있게 한다. 그 결과 형성되는 배큘로-AAV 패키징 벡터는 숙주 세포를 단지 1회 감염 이벤트를 통해 안정적이며 효과적으로 LV를 생성하는데 필요한 바이러스 단백질로 조작할 수 있도록 해준다.
배큘로-AAV 패키징 벡터의 게놈 통합은 AAV rep 단백질의 트랜시언트 발현에 의해 획득되었다. 이러한 시스템은 논코딩 유전자간 전사 활성 리전에 AAV 벡터의 통합을 획득가능하게 하며, 이에 따라 mRNA가 LV에서 편입될 수 있으며, 궁극적으로 숙주 표적 세포에 편입될 수 있는 위험한 유전자의 활성화를 배제한다.
상기 제시된 시스템은 구조 및 조절 렌티바이러스 단백질로 숙주 세포를 안정적이며 효율적으로 조작하는 새롭고 유리한 방법을 나타낸다.
바람직한 구현으로, 배큘로-AAV 패키징 구조물에 포함되는 2개의 발현 카세트는 꼬리 대 꼬리 배향되고, 각각 구성 프로모터 및 폴리 A에 의해 구동되며, 바람직하게 상기 프로모터는 CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV 및 RSV로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 프로모터는 CMV IE 프로모터이다. 본 발명의 바람직한 견지에 따르면, 상기 AAV 패키징 벡터에 포함되는 선발 마커는 하이그로마이신, 카나마이신, 네오마이신, 제오마이신 내성 유전자로부터 선택되며; 바람직하게 상기 선발 마커는 하이드로마이신 내성 유전자이며; 보다 바람직하게, 상기 선발 마커는 클로닝된 다운스트림 내부 리보좀 엔트리 사이트(IRES)이다.
배큘로-AAV 패키징 벡터의 게놈 통합은 ITR-매개 AAV 벡터 통합을 위한 AAV Rep 단백질의 트랜시언트 발현에 의해 획득되었다. 바람직한 구현으로, rep 단백질은 rep78 및 rep68로부터 선택되며, 보다 바람직하게 상기 단백질은 rep78이다.
이러한 시스템을 이용함으로써, HIV-1 단백질 gag/pol 및 rev를 안정적으로 발현하도록 조작된 세포를 획득하는 것이 가능하였으며, 이러한 세포를 반-안정적 패키징 세포주라 칭한다. 특히, 본 발명은 이러한 조작된 세포와, 그리고 구조 및 조절 단백질 및 관심있는 엔벨로프 단백질을 포함하는 제 2 및 제 3 세대 패키징 세포주, 및 트랜스퍼 벡터를 포함하는 생산자 세포주를 획득하기 위해 상기 조작된 세포를 사용하는 용도 뿐만 아니라 안정한 패키징 세포주를 제조하는 방법을 개시하고 청구한다.
반-안정적 패키징 세포주
본 발명의 반-안정적 패키징 세포주는 HIV-1 gag-pol 및 rev 유전자를 발현하는 재조합 배큘로-AAV 패키징 구조물의 적어도 하나의 복사체를 운반하는 숙죽 세포로 구성된다. 배큘로-AAV 패키징 벡터의 게놈 통합은 ITR-매개 AAV 벡터 통합을 얻기 위해 AAV rep 단백질의 트랜시언트 발현에 의해 획득되었다. 바람직하게, 2 발현 카세트는 꼬리 대 꼬리 배향되고, 각각 구성 프로모터 및 폴리 A에 의해 구동되며, 바람직하게 상기 프로모터는 CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV 및 RSV로부터 선택된다. 보다 바람직하게 상기 구성 프로모터는 CMV IE 프로모터이다.
본 발명의 바람직한 견지에 따르면, 상기 선발 마커는 하이그로마이신, 카나마이신, 네오마이신, 제오마이신 내성 유전자로부터 선택되며; 바람직하게 상기 선발 마커는 하이드로마이신 내성 유전자이며, 보다 바람직하게, 상기 선발 마커는 클로닝된 다운스트림 내부 리보좀 엔트리 사이트(IRES)이다.
바람직하게, 상기 AAV rep 단백질은 rep78 및 rep68로부터 선택된다. 보다 바람직하게 rep 단백질은 rep78이다. 상기 반-안정적 패키징 세포주를 획득하기 위해 조작될 수 있는 숙주 세포주는 HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 또는 HeLa로부터 선택되는 인간 세포주이며, 보다 바람직하게 상기 세포주는 HEK293-T이다.
이러한 반-안정적 패키징 세포주는 반-안정적 생산 시스템에서 다른 env 및 다른 트랜스퍼 벡터로 잠재적으로 매우 다양한 LV의 생산에 적합하다. 따라서, 이는 비용을 줄여줄 수 있으며, gag-pol 및 rev를 암호화하는 GMP-등급 플라스미드 DNA를 사용할 필요가 없으며, 그리고 트랜시언트 트랜스펙션 중에 플라스미드들간에 재조합 이벤트에 부차적인 RCL 형성의 위험이 감소되기 때문에, 보다 효과적인 LV 생산에 큰 이점을 나타낸다. 상기 반-안정적 패키징 세포주는 다목적 수단이며, 현재 LV 생산을 위한 임상 시험에 사용되는 다른 수단에 비해 보다 안전하고 경제적으로 보다 유리하다.
본 발명의 반-안정적 패키징 세포주는 잔류 유전 요소의 트랜시언트 트랜스펙션 후 배양 1년 동안 기능성 LV의 지속적인 생산을 보이는 예기치 않은 유전적 안정성을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 실제로 사일런스 현상이 관찰되지 않았으며, 이러한 중간물을 이용하여 획득된 LV의 타이터 및 감염성은 모두 1년 후 영향을 받지 않은 채로 유지되었다. 이러한 데이터는 선택압(selective pressure)의 존재 또는 부재 하에서 모두 확인되었다. 현저하게, AAV-ITR 매개 카세트의 통합 안정성과 관련되어 문헌에서 입수가능한 비교할만한 데이터가 없다. 단지 관련된 정보는 와일드 타입 AAV 혈청형 2(AVV-2)로 감염된 인간 골수 유래, 섬유아세포성 세포주(Ruddle's Detroit 6 cells)가 적어도 47 및 118회 패시지 동안 잠복 상태로 바이러스 서열을 유지하였다는 것이다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 반-안정적 패키징 세포주는 적어도 102회 패시지 동안 생존하였다.
안정한 패키징 세포주
본 발명은 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 암호화하는 제 1 발현 카세트, 및 렌티바이러스 rev 및 선발 마커를 암호화하는 제 2 발현 카세트로 구성된 2개의 발현 카세트를 포함하는 적어도 하나의 통합 카세트의 복사체의 안정한 통합을 위한 배큘로-AAV 패키징 구조물의 사용에 기초한다. 이러한 카세트의 안정한 통합은 숙주 세포에서 ITR 매개 안정적 통합을 가능케 하는 rep 단백질의 동시-발현에 의해 획득된다. 이렇게 조작된 숙주 세포는 그 다음, 항생제의 존재 하에서 배양된 다음 클로닝된다. 획득된 반-안정적 패키징 세포주는 제 2 및 제 3 세대 렌티바이러스 패키징 세포주의 생성을 위한 출발점이 된다. 특히, 제 3 세대 안정적 패키징 세포주는 원하는 env 단백질을 더 통합시킴으로써 획득된다. 제 2 세대 안정적 패키징 세포주는 HIV-1 Tat 단백질을 일차 통합한 다음 원하는 엔벨로프를 통합하여 획득된다.
엔벨로프 단백질 및 HIV-1 tat는 AAV 벡터, 레트로바이러스 벡터, 안정한 플라스미드 통합 또는 동종 재조합을 이용하여 숙수 제포에 안정하게 통합될 수 있다. 바람직하게, 엔벨로프 단백질 및 HIV-1 tat는 HIV-SIN 벡터를 이용하여 숙주 세포에 통합된다. MLV 4070 env, RD114 env, 상기 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR, 상기 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-pro, 배큘로바이러스 GP64 env 또는 GALV env 또는 이의 유도체와 같은 여러 종류의 엔벨로프 단백질이 사용될 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 env 유전자는 상기 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR을 암호화하는 유전자이다.
RD114-TR 엔벨로프 단백질의 안정한 통합을 획득하기 위해, CMV 프로모터의 조절 하에서 RD114-TR ORF를 운반하는 pCMV-RD114-TR 플라스미드로부터 유래된 BamHI-BamHI 프레그먼트를 함유하는 SIN 구조물이 초기에 개발되었다. 이러한 구조물은 RD114-TR 단백질을 생성하지 않았다. 상기 SIN-RD114-TR LV의 제작 중에 예기치 않은 발견은 β-글로빈 인트론이 CMV 프로모터와 RD114-TR ORF 사이에 반드시 포함되어야 한다는 것을 인식하였다는 것이다. 일반적으로, SIN-LV 콘텍스트에 구속된 대부분의 세포 및 바이러스 유전자 발현 카세트는 벡터의 SD와 인트론의 SA 사이에 스플라이싱 위험 및 발현 카세트에 함유된 프로모터의 결과적으로 일어나는 삭제 때문에, 인트론 요소가 없다. 이러한 어려움을 회피하기 위해, 2개의 RRE 요소로서, 하나는 SD와 SA 서열 사이에 존재하는 표준적인 SIN-LV 형태이며, 다른 하나는 β-글로빈 인트론에 존재하는 2개의 RRE 요소를 운반하는 새로운 SIN-LV가 생성되었다.
이러한 발견에 기초하여, RD114-TR 생산을 획득하기 위해 β-글로빈 인트론의 예기치 않은 필요성은 RD114-TR ORF에서 또는 RD114-TR 정지 코돈 및 SIN-RD114-TR 구조물에 존재하는 3'BamHI 제한효소의 리전을 포함하는 328-bp 프레그먼트에서 불안정성 또는 네거티브 서열의 존재를 반영할 수 있다는 것이 반박되었다. GENEART AG(Regensburg, Germany)에 의해 수행된 GeneOptimizer®으로 보조된 서열 분석 결과, 배드 코돈 선호도(bad codon usage)를 갖는 코돈이 RD114-TR 유전자 및 328-bp 프레그먼트에 걸쳐 모두 퍼져있는 것으로 나타났으며, 이는 본 발명자들의 추정의 근거를 제공한다. 더욱이, 코돈 최적화 분석 결과, 코돈 적응 지수(codon adaptation index)(CAI)는 0.65에서 0.98로 향상된 것으로 나타났다(1의 CAI가 최적임). 따라서, 원칙적으로, MLV-기초 또는 HIV-기초 SIN 벡터를 이용하여 RD114-TR을 RD-MolPack 내로 통합시키는 대안적이며 보다 간단한 방법은 리코드된 RD114-TR을 사용하는 것일 수 있다. 따라서, 코돈 최적화된 서열을 함유하는 구조물이 제조되고 시험되었다. 한편, 코돈 최적화는 β-글로빈 인트론의 부재 하에서도 RD114-TR 전구체 단백질(PR) 번역을 가능케 하나, 예기치 않게 고 수준의 PR은 SU 및 TM 서브유닛에서 퓨린에 의해 프로세싱되지 않는 것으로 밝혀졌다. 따라서, RD114-TR은 CMV 프로모터 및 RD114-TR ORF 사이의 구조물에 β-글로빈 인트론을 포함하는 HIV-기초 SIN 벡터를 이용하여 패키징 세포주에 성공적으로 통합되었다. 바람직한 구현으로, 5' 내지 3' 말단에 CMV 프로모터, 이의 서열에 RRE 요소를 함유하는 β-글로빈 인트론 및 RD114-TR ORF를 함유하는 발현 카세트를 포함하는 SIN-LV가 제공된다.
본 발명은
i. 상술한 바와 같은 안정적 패키징 세포주를 배양하는 단계;
ii. 상기 반-안정적 패키징 세포주에 트랜스퍼 벡터를 삽입하는 단계
를 포함하는 LV 제조 방법을 제공한다.
현재 임상 시험에 사용되는 LV의 제조 방법은 여전히 필요한 모든 단백질의 트랜시언트 트랜스펙션에 기초한다. 이와 상반적으로, 본 발명의 방법 및 패키징 세포주는 안정한 생산이 가능하다. 특히, 본 발명의 방법에 사용되는 배큘로-AAV 하이브리드 발현 시스템은 유리하게도, 단지 1회의 트랜스펙션/감염 및 클로닝 라운드에서 구조(gag/pol) 및 조절(rev) HIV-1 단백질의 안정하고 안전한 도입을 가능케 한다.
이러한 발현 시스템으로 획득된 중간물은 안정하며, 사일런스 현상을 보이지 않으며, 제 2 및 제 3 세대 패키징 세포주를 개발하는 것을 가능케 하며, 이는 LV 생산을 위해 신속하고 효과적인 개발을 위해 매우 중요한 도구이다. 본 발명의 안정한 패키징 세포주는 비용 효율적이며 보다 안전한 생산을 위해 사용될 수 있다. 실제로, 트랜스펙션이 전적으로 없는 것은 비용을 감소시켜주고, RCL의 형성을 잠재적으로 이끄는 재조합 이벤트 가능성을 줄여줄 수 있다. 더욱이, 본 발명의 방법으로 획득된 안정한 패키징 세포주는 트랜시언트 포로토콜로 생산된 LV에 비해 적어도 대등한 타이터 또는 이보다 높은 타이터로 LV를 생산할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
생산자 세포주
생산자 세포주는 관심있는 유전자(GOI)를 암호화하는 트랜스 벡터를 상술한 바와 같이 안정한 패키징 세포주 내로 안정하게 통합함으로써 획득될 수 있다. 또한, 본 발명은 이러한 생산자 세포주를 배양하는 것을 포함하는 LV 제조 방법을 제공한다.
특히, 실시예에서 RD2-MolPack-Chim3 클론이라 칭한 제 2 세대 안정적 패키징 세포주로부터 생성된 LV의 평균 타이터 및 감염성은 HEK293T 대조구 세포로부터 생산된 LV의 타이터 및 감염성 보다 2-log 더 높으며, 이는 RD2-MolPack-Chim3가 트랜시언트 프로토콜에 의해 생산된 동등한 LV와 비교하여 보다 기능적인 LV를 생성함을 보여주는 것이다. 특히 관심있는 클론은 RD2-MolPack-Chim3.14이며, 이는 서스펜션에서 자발적으로 성장하며, SupT1 세포에서 1.0 × 106TU/ml 및 CD34+ HSCs에서 0.5 × 106TU/ml의 타이터로 LVs를 생성한다.
실시예
실시예 1: 일반적 방법
플라스미드
와일드 타입 HIV-1 gag, pol 및 rev 유전자를 MluI/NarI 및 MluI/NotI 처리에 의해, 각각, pCG719-pKLgagpol(이하 간단히 CMV-GPR이라 함)(도 1a, 스킴 13) 및 pCG720-pKrev(CMV-Rev)(도 1a, 스킴 9) 플라스미드로부터 절제하였다(27). 그 바이러스 유전자를 각각 CMV IE 프로모터에 의해 유래되고 폴리A 서열을 지닌, 꼬리 대 꼬리 배향된 2개의 다른 발현 카세트 내의 Gateway® pENTRTM4 셔틀 벡터(Invitrogen, Co., Carlsbad, CA) 내로 삽입하였다. 제 1 카세트는 gag 및 pol 유전자를 발현하며, 제 2 카세트는 하나의 rev 유전자 및 선발 마커 하이그로마이신 내성(hygro) 유전자를 발현하며; hygro는 바이-시스트로닉 번역이 이루어지도록 클로닝된 다운스트림 IRES이었다. 이러한 2개의 발현 유닛을 감염성 AAV 게놈(18)을 지닌 재조합 pSUB201 플라스미드의 XbaI 사이트에 도입하였다. 그 결과 형성된 5'ITR-CMV-Gagpol-polyA-polyA-hygro-IRES-Rev-CMV-ITR3' 카세트는 그 다음 절제되어, Gateway® pENTRTM4 셔틀 벡터 내로 삽입되었다. 재조합 하이브리드 배큘로-AAV 패키징 벡터(Baculo-AAV-GPR)(도 1a, 스킴 1)는 상기 2개의 카세트를 함유하는 pENTRTM4 셔틀 엔트리 벡터와 BaculoDirect Linear DNA(BaculoDirectTM Baculovirus Expression Systems, Invitrogen, Co.) 사이의 박테리오파지 람다 사이트-특이적 재조합 시스템에 의해 획득되었다. 이에 따라, 동종 재조합 중에, 배큘로 DNA의 폴리헤드린 유전자가 GPR 이중 카세트로 치환되었다. 상기 pABCMV-rep78 발현 플라스미드(CMV-AAV-rep78)는 Recchia 등(2004)(19)에 기술된 바와 같은 발현 벡터 pABS.43의 CMV IE 프로모터 하에서 AAV-rep78 ORF를 클로닝함으로써 획득되었다(도 1a, 스킴 8). pMD.G 플라스미드(CMV-VSV-G)(20)는 수포성 구내염 엔벨로프 글리코프로틴(VSV-G)을 암호화한다(도 1a, 스킴 10). 제 3 세대 트랜스퍼 벡터, pCCLsin.PPT.hPGK.eGFP.WPRE.Amp(SIN-eGFP)는 구성 프로모터 hPGK 하에서 eGFP 유전자를 발현한다(도 1a, 스킴 6). 항-HIV-1 Chim3 트랜스유전자를 발현하는 제 2 세대 PΔN-Chim3 트랜스퍼 벡터는 Porcellini 등(2009 및 2010)(21, 22)에 기술되어 있다(도 1a, 스킴 7). SIN-RD114-TR 벡터(도 1a, 스킴 3-5)는, 펠린 내생성 레트로바이러스 RD114 엔벨로프의 세포외 및 트랜스-멤브레인 도메인 및 A-MLVenv 4070A의 세포질 꼬리(TR)로 이루어진 키메릭 RD114-TR 엔벨로프를 암호화하는 pCMV-RD114-TR(CMV-RD114-TR)(도 1a, 스킴 11) 플라스미드로부터 절제된 RD114-TR ORF를 이용하여 하기의 다른 전략에 따라 제작되었다(22). 간략히, CMV-RD114-TR, CMV-RD114-TR-IN 및 CMV-RD114-TR-IN-RRE 카세트를 각각, 상기 SIN-polyMluI 벡터의 MluI 사이트 내로 클로닝하였으며, 상기 SIN-polyMluI 벡터는 SIN-eGFP 벡터의 변형된 형태로서, hPGK-eGFP 카세트가 제거되고 EcoRV-MluI-SmaI-MluI-NotI-BglII-BamHO-SalI 폴리링커로 치환된 것이다. 상기 SIN-RD114-TR-IN 및 RD114-TR-IN-RRE 구조물(도 1a, 각각, 스킴 4 및 5)은 CMV-RD114-TR 벡터에 존재하는 토끼 β-글로빈을 함유한다(도 1a, 스킴 11). SIN-RD114-TR-IN-RRE에서, "PCR 분석"에 기재된 바와 같이 PCR 증폭된 230-bp RRE 요소를 β-글로빈 인트론 요소의 ScaI 사이트 내로 통합하였다. 제 2 세대 패키징 pCMV-ΔR8.74(CMV-GPRT) 구조물(도 1a, 스킴 12)은 HIV-1 gag, pol, rev 및 tat 유전자를 암호화한다(25). SIN-Tat 벡터(도 1a, 스킴 12)는 CMV-GPRT 플라스미드(도 1a, 스킴 12)로부터 유래된 tat 유전자를 plRESpuro3(Clontech Laboratories Inc., a TakaraBio Company, Mountain View, CA)의 EcoRI 사이트 내로 삽입한 다음, 그 바이-시스트로닉 CMV-Tat-IRES-puro 카세트를 SIN-polyMluI 벡터의 MluI 내로 클로닝하여 제작되었다.
세포
스포돕테라 프루지페다(Spodoptera frugiperda)(Sf9)를 10% FCS(EuroClone Ltd, UK) 및 페니실린-스트렙토마이신과 글루타민(PSG)의 혼합물이 보충된 TC-100 배지(Invtrogen, Co.)에서 서스펜션으로 CO2의 부재 하에서 27℃에서 성장시켰다. 인간 배아 신장 293T(HEK293T) 세포 및 이의 유도체 클론(PK-7)을 10% FCS 및 PSG가 보충된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 증식시켰다. CEM A3.01 및 SupT1 T 림프아구세포를 10% FCS 및 PSG가 보충된 RPMI 1640에서 증식시켰다. CD34+ 조혈 줄기 세포(HSC) 및 신생 백혈구를 피콜-하이패큐 구배(Ficoll-Hypaque gradient)(Lymphoprep, Nycomed Pharma AS, Oslo, Norway) 상에서 제대혈(UCB) 원심분리에 의해 정제하였다. 구배 분리후, CD34+ HSC는 CD34 MicroBeads Kit 및 MiniMACS Separator Columns(Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA)을 이용한 양성 선발에 의해 수집된 UCB 단핵화 세포 고리로부터 분리되었다. CD34+ 세포 순도(>92%)는 항-CD34-PE Ab(BD Pharmingen™, San Diego, CA)를 이용하여, FACS 분석(FACSCalibur BD Bioscience, San Jose, CA) 및 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Inc., Ashland, OR)에 의해 확립되었다. CD34+ 세포는 인간 줄기 세포 인자(h-SCF) 100ng/ml(R&D Systems, Minneapolis, M N), h-Flt3L 100ng/ml(Peprotech, Rocky Hill, NJ), h-IL-6 20ng/ml(R&D Systems) 및 인간 트롬보포이에틴(h-Tpo) 20ng/ml(Peprotech)을 함유하는 20% 혈청 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)에서 24시간 동안 예비-자극되고, 트랜스덕션 중에 동일한 배지에서 유지되었다. 신생 백혈구는 RPMI에서 가용성 항-인간 CD3(30ng/ml)(Orthoclone OKT3, Janssen-Cilag, UK) 및 재조합 인간 IL-2(rhIL-2) 50U/ml (Chiron, Emeryville, CA)으로 48시간 자극된 다음, 10% FCS, PSG 및 rhIL-2가 보충된 RPMI에서 유지되었다.
상기 RD2-MolPack-Chim3.14 클론은 2.5% FCS가 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에서 하기와 같이 성장시켰다: 세포들을 5% CO2 습윤 공기 분위기에서 37℃에서 120rpm으로 회전 교반기 상에서 125-ml 쉐이크 플라스크에서 1.5 × 106 cells/ml의 밀도로 성장시켰다. 생존률은 70%이상을 유지하였으며, 세포들을 0.5 × 106 cells/ml에서 나누고, 매일 배지를 갈아주었다. 다회의 패시지에 걸쳐, FCS는 10%에서 5%, 2%, 2.5%로 감소하였으며; 각각의 혈청 체인지는 적어도 2 배양 패시지 후에 수행하였다.
배큘로바이러스 생산 및 HEK293T 세포의 배큘로 - GPR 감염
재조합 하이브리드 배큘로-AAV-GPR DNA 게놈을 갖는 배큘로바이러스는 Gateway® adapted Baculovirus DNA system (Invitrogen, Co.)를 이용한 배큘로다이렉트 방법(BaculoDirect method)에 따라 생산되었다. 재조합 배큘로바이러스 타이터는 플래크 어세이에 의해 측정하였으며, Sf9 세포에서 3회의 바이러스 증폭 패시지 후에 1 × 1011 pfu/ml에 상응하였다. PK-7 클론은 4㎍의 AAV-rep78 발현 플라스미드로 1.5 × 106 HEK293T 세포를 트랜스펙션한 후에, 24시간 후에 1,000 MOI로 재조합 배큘로-AAV-GPR로 감염시켜 획득되었다. 세포들은 4일간 하이그로마이신 없이 유지되고, 그 다음 5 × 105 cells을 하이그로마이신(100㎍/ml)의 존재 하에서 연속 희석 농도로 22개의 10-cm 디쉬에 시딩하였다. 이 22개의 디쉬를 ELISA에 의헤 p24gag 생성에 대해 스크리닝하였다. 3.7 × 104 cells/dish로 세포가 시딩된 단지 1개의 디쉬에서만 상층액에서 충분한 p24gag 방출이 측정되었다. 상기 디쉬는 모두 픽업되고 스크리닝된 40개의 콜로니를 함유하였다. 이 중에서 p24gag 생성에 대해 양성으로 나타난 3 콜로니를 추가 조사하여 특성을 밝혔다.
렌티바이러스 벡터( LV ) 생산 및 적정
하기 플라스미드의 코-트랜스펙션에 의해 HEK293T 세포로부터 생성된 슈도-타입 LVs를 획득하였다: 패키징 구조물 CMV-GPR(제 3 세대) [또는 CMV-GPRT(제 2 세대)], VSV-G 또는 RD114-TR 엔벨로프 구조물 및 제 3 세대 SIN-eGFP(26) 또는 제 2 세대 PΔN-Chim3 트랜스퍼 벡터(23) 또는 PΔN-eGFP 트랜스 벡터. 패키징:엔벨로프:트랜스퍼 벡터의 비는 다른 언급이 없는 한 6.5:3.5:10㎍ DNA이었다. PK-7 클론의 LV는 상기 env-발현 플라스미드와 상기 트랜스퍼 벡터를 코-트랜스펙션하여 생성되었다. 트랜시언트 트랜스펙션은 스탠다드 Ca++-포스페이트 방법으로 또는 제조자의 지시에 따라 유사한 결과를 얻는 FugeneTM6 시스템(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)으로 수행하였다. 상층액은 트랜스펙션 후 48시간에 수거하고, 0.45-㎛ 필터로 여과하였다. 타이터는 실험 종류에 따라 SupT1, CEM A3.01, 일차 활성화 말초 혈액 단핵구(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 및 제대혈 유래 CD34+ HSC에서 산출되었다. 간략히, SupT1 및 활성화 일차 단핵구는 밤새 휴지기에 의해 분리된 폴리브렌(8㎍/ml)(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)의 존재 하에서 2 사이클의 스피노큘레이션(1,240×g, 1시간)에 의해 트랜스덕션(형질도입)되고; CD34+ HSCs는 폴리브렌이 함유되지 않은 레트로넥틴-코팅된 플래이트(Takara Bio, Otsu, Japan)에서 24시간 동안 트랜스덕션되었다. 트랜스덕션 효율은 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Inc., Ashland, OR)를 사용하여, Porcellini 등(2009 및 2010)(23, 24)에 기재된 바와 같이, eGFP 발현(SIN-eGFP) 또는 ΔLNFGR 발현(PΔN-Chim3)의 플로우 사이토메트리 분석(FACS Calibur BD Bioscience, San Jose, CA)에 의해 모니터되었다. 5-20% 양성 세포 범위의 트랜스덕션 값을 하기 식에 따라 각 LV 제조물의 타이터를 산출하는데 사용하였다: TU = [세포수 × (%GFP/100)]vol sup(in ml).
타이터 -기초 클론 스크리닝 프로토콜
선발을 가속화하기 위해, 상층액의 LV 타이터를 산출함으로써 모든 PK-7 유도체 서브클론을 스크리닝하였다. LV를 생성하기 위해 소 규모로 Ca++-포스페이트에 기초한 1개의 또는 2개의 플라스미드 코-트랜스펙션을 확립하고, 이의 효능을 소-규모 트랜스덕션 프로토콜에 의해 SupT1 세포에서 산출하였다. 간략히, 6 × 104/well PK-7 유도 세포들을 48-웰 플레이트에 시딩하고, 24시간 후에 기능성 LV를 획득하는데 필요한 잔류 플라스미드들과 코-트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 48시간 후, 200㎕의 배양 상층액을 사용하여 7.5 × 104/ml의 농도로 시딩된 3 × 104/well SupT1 세포를 트랜스덕션하였다.
노던 및 서던 블롯팅 어세이
노던 블롯팅 어세이. 총 RNA를 제조자의 지시에 따라 Trizol Reagent(Life TechnologiesTM Inc., Gaithersburg, MD)로 추출하였다. 5㎍/sample을 0.8% 아가로즈-포름알데히드 겔에 런닝하고, 이를 모세관 트랜스퍼에 의해 Hybond-N 멤브레인 상에 트랜스퍼하고, 최종적으로 PerfectHyb PLUS 하이브리드 버퍼(Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO)에서 1 x 106dpm/ml의 32P-표지된 550-bp RD114-TR 프로브로 탐침하였다. 익스텐시브 워싱 후에 상기 멤브레인을 -70℃에서 X-선 필름에 노출하였다.
서던 블롯팅 어세이. 게놈 DNA(gDNA)는 제조자의 지시에 따라 QIAamp Mini kit (QIAGEN GmbH, Germany)에 의해 분리하였다. 배큘로바이러스 DNA는 QIAamp DNA micro kit(QIAGEN)에 의해 바이러스 파티클로부터 추출하였다. 표시된 제한효소로 밤새 다이제스션한 후, 10㎍의 gDNA를 0.8% 아가로즈겔에 런닝하고, 나일론 멤브레인(Duralon, Stratagene, TX, USA) 상에서 서던 캐필러리 트랜스퍼에 의해 블롯팅한 다음, PerfectHyb PLUS 하이브리드 버퍼에서, 1 ×106 dpm/ml의 32P-랜덤 프라임 표지된 600-bp CMV 또는 11-kb GPR 카세트, 250-bp tat, 600-bp Chim3 및 500-bp RD114-TR 특이 프로브에 하이브리드하였다. 익스텐시브 워싱 후에 상기 멤브레인을 -70℃에서 X-선 필름에 노출하거나 Phosphorlmager(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)에 노출하였다.
PCR 분석
DNA 주형으로서 1ng SIN-eGFP 벡터를 사용하고 프라이머 세트 및 PCR 조건을 다음과 같이 사용하여 230-bp RRE 앰플리콘을 획득하였다: RRE-포워드: 5'-AGT ACT GGA GCT TTG TTC CTT GGG-3'; RRE-리버스: 5'-AGT ACT AAA TCC CCA GGA GCT G-3', PCR 조건: 98℃ 7분, 30사이클의 94℃ 30초, 50℃ 30초 및 72℃ 30초.
AAV-Rep78 플라스미드의 PK-7 세포로의 잔류성 통합의 스크리닝을 위한 PCR 분석은 하기 프라이머 세트 및 PCR 조건을 이용하여 300ng의 게놈 gDNAs 상에서 수행되었다: AAV-Rep78 포워드: 5'-CGG GCT GCT GGC CCA CCA GG-3'; AAV-Rep78 ㄹ리리버스: 5'-ATG CCG GGG TTT TAC GAG ATT GTG-3' 및 PCR 조건: 98℃ 7분, 30사이클의 94℃ 30초, 66℃ 30초 및 72℃ 1.5분.
상기 2 GPR 카세트의 방향을 설정하기 위해, PCR 증폭은 하기 프라이머 세트 및 PCR 조건을 이용하여 300ng의 게놈 gDNAs 상에서 수행되었다: rev 포워드(rev forward): 5'- CTT GAG GAG GTC TTC GTC GC-3'; 베타-글로빈 리버스(beta-globin reverse): 5'- CCC TGT TAC TTC TCC CCT TCC -3'; rev 포워드 네스티드(rev forward nested): 5'- TGT CTC CGC TTC TTC CTG CC-3'; 베타-글로빈 네스티드 리버스(beta-globin nested reverse): 5'- TTA ACC ATA GAA AAG AAG GGG-3' 및 PCR 조건: 94℃ 2분, 35사이클의 94℃ 30초, 52℃ 30초 및 72℃ 1.5분.
p24gag ELISA
물리적 LV 생산은 배양 상층액에서 제조자의 지시에 따라 Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit(Perkin Elmer Life and Analytical Sciences, Inc. Waltham, MA)에 의해 측정하였으며, 1pg p24gag는 1×104 물리적 파티클에 해당하는 것으로 가정하였다.
웨스턴 블롯팅 분석
PK-7 세포로부터 유래된 전 세포 및 핵 추출물, 및 분리된 세포-프리 VLP 또는 LV로부터 유래된 바이러스 단백질을 종래에 기술된 바와 같이(23, 24) 준비하였다. 단백질들은 SDS-PAGE에 의해 크기-분획화되고(size-fractionated), Hybond ECL 니트로셀룰로즈 멤브레인(GE Healthcare, Life Sciences, UK Ltd, UK)에 일렉트로블롯팅하였다. 멤브레인들은 5% 저지방 분유로 블로킹되고, 그 다음 적절한 일차 Ab로 배양하였다. AIDS 환자로부터 얻은 항-HIV-1 혈청을 1:2,000 희석으로 사용하였으며; 단백질의 엑토도메인에서 2개의 15-mer 펩타이드(aa 95-109, QNRRGLDLLTAEQGG 및 aa 65-79, SGIVRNKIRTLQEEL)를 인식하는 항-RD114-TR 토끼 혈청(22)을 1:500 희석으로 사용하였으며; HIV-1 rev MoAb(Rev-6, sc-69730) 및 친화성 정제된 토끼 폴리클로날 항-YY1 Ab(C-20, sc-281)(S. Cruz Biotechnology, Inc., S. Cruz, CA) 및 마우스 항-p24gag(Acris Antibodies, Germany)를 각각, 1:200, 1:1,000 및 1:500 희석으로 사용하였다. Ab 바인딩은 제조자의 지시에 따라 인핸스드 화학발광 시스템(ECL, Amersham)에 의해 가시화되었다.
실시간 TaqMan PCR 에 의한 벡터 복제수 ( VCN ) 정량화
통합된 벡터의 벡터 복제수(VCN)는 ABI Prism 7,900 FAST instrument(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용한 정량적 TaqMan PCR에 의해 확립되고, SDS 2.3 소프트웨어(Applied Biosystems)에 의해 분석되었다. PCR 조건은 다음과 같았다: GAG 표적 서열에 대해 50℃ 2분 및 95℃ 5분, 그 다음 사이클당 0.1℃씩 상승시키면서 40사이클의 95℃ 15초 및 60℃ 15초. gDNA를 다음과 같은 프라이머 및 프로브를 이용하여 증폭하였다:
Figure 112013028392754-pct00001

라이게이션 -매개 (LM)-PCR
게놈 DNA는 제조자의 지시에 따라 QIAamp Mini kit (QIAGEN)에 의해 PK-7 세포로부터 추출하고, Bg/II 및 BamHI으로 37℃에서 밤새 다이제스션하였다. 5'-GATC-3' 스티키 엔드와 호환적인 어뎁터 76-bp 올리고뉴클레오타이드 링커의 라이게이션을 표준 조건 하에서 수행하였다. LM-PCR은 하기 네스티드 프라이머쌍을 이용하여 수행하였다: ITR 포워드:16s: 5'-GTA GCA TGG CGG GTT AAT CA-3', 및 17s/long nested: 5'-TTA ACT ACA AGG AAC CCC TAG TGA TGG-3'; 링커 리버스 프라이머: Linker-1: 5'-GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3' 및 Linker-2 네스티드: 5'-AGG GCT CCG CTT AAG GGA C-3'. 상기 링커 서열은 5'-GAT CGT CCC TTA AGC GGA GCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA CCA GGG AAT TCG CCT CGG GAT ATC ACT CAG CAT AAT G-3'에 상응하였다. 2라운드의 LM-PCR을 AmpliTaq Gold DNA Polymerase(Applied Biosystems)를 이용하여 수행하였으며, 각각 30사이클(95℃ 30초, 52℃ 30초, 72℃ 2분)을 포함하였다. PCR 증폭물은 TOPO® cloning kit(Invitrogen, Co.)를 이용하여 클로닝되고, 약 100-200bp의 삽입물을 운반하는 플라스미드 콜로니가 시퀀싱을 위해 선택되었다. 서열 상동성은 BLAST search, NCBI에 의해 확인하였다.
형광 원 위치 하이브리드화( FISH )
PK-7 세포를 콜히친(10㎍/ml)(Sigma # C9754)로 37℃에서 2시간 동안 처리하여 중기 염색체를 획득하였다. 인산 완충염수(PBS) 세정 후, 세포를 저장액(hypotonic solution)(75mM KCl)에서 실온에서 6분간 유지하고, 메탄올/아세트산(3:1)으로 4회 세정하여 고정시킨 다음, 깨끗한 유리 슬라이드 상에 스프레딩하였다. 세포유전적 시료를 70% 포름아마이드 용액에 72℃에서 2분간 변성시키고, 콜드 70%, 85% 및 95% 에탄올 연속 세정으로 탈수하고, 그 다음 공기 건조하였다. 특이적 프로브를 다음과 같이 준비하였다: 상기 GPR 카세트를 함유하는 13-kb 플라스미드 DNA를 Random Primed DNA Labeling Kit(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)를 이용하여, SpectrumOrange-dUTP(Vysis, Inc., Downers Grove, IL)로 표지하였으며, 인간 hox4 유전자를 함유하는 대조구 30-kb 코스미드 DNA는 FISHSr/g ji™ Nucleic Acid Labeling kit(Kreatech Biotechnology, Amsterdam, The Netherlands)를 이용하여 표지하였다. 하이브리드화는 250㎕의 50% 포름아미드, 2 × SSC 및 10% 덱스트란 설페이트 및 50ng/㎕의 인간 C0T-1 DNA 하이브리드 버퍼(Invitrogen)에서 5ng/㎕의 각 프로브를 배양하여 수행하였다. 시료를 변성 프로브로 75℃에서 10분간 코팅하고, Parafilm®M으로 커버하고, 습 챔버에서 37℃에서 밤새 배양하였다. 시료를 0.4 × SSC, pH=7, 72℃에서 2분간 1회 세정하고, 0.0025% Tween-20을 함유하는 4 × SSC, pH=7에서 RT에서 30초간 1회 세정하고, PBS 1 ×에서 RT에서 1분간 2회 세정하였다. 슬라이드들은 0.02㎍/㎕의 49,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(Sigma)로 대조염색되었다. 가시화 및 사진을 Nikon 80i 업라이트 현미경(Nikon Instruments S.p.A., Italy)으로 그린(FITC) 및 스펙트럼 오렌지(spectrum orange) 여과 조명을 이용하여 취하였다. 이미지는 Genikon software(Nikon)으로 처리하였다.
실시예 II : 제 1 중간물 PK -7 클론의 생성
제 2 또는 제 3 세대 LV의 연속 생산을 위한 RD-MolPack 패키징 세포주를 획득하기 위해, 여러 HEK293T-유래 중간물 클론들을 획득하였다. 첫번째 것을 PK-7으로 명명하였으며, 재조합 하이브리드 배큘로-AAV 벡터(rhBaculo-AAV-GPR)(도 1a, 스킴 1)를 이용하여 HIV-1 gag, pol 및 rev 유전자의 안정한 통합에 의해 획득하였다. 이러한 운반 시스템은 상기 AAV ITR-측면에 위치한 통합 카세트를 절제하고 이를 인간 염색체 내로 통합시키기 위해 일시적으로 제공되는 AAV-rep78 단백질의 인테그라아제 활성을 이용한다(도 1b). 상기 rh-배큘로-AAV 벡터는 BaculoDirect Linear DNA 및 ITR-측면에 위치한 GPR 카세트를 함유하는 Gateway® pENTR™4 엔트리 플라스미드간의 동종 재조합에 의해 생성되었다(도 1a, 스킴 1). Sf9 곤충 세포에서 재조합 배큘로바이러스 증폭의 3 사이클(p3) 후에, 하이브리드 배큘로-AAV DNA의 타이터 및 포텐셜 재조합 이벤트를, 각각, 플래크 어세이 및 바이러스 게놈 DNA 서던 블롯팅으로 측정하였다. p3에서의 타이터는 6 × 1010 pfu/ml이었으며, 서던 블롯팅 분석 결과, 단일 샤프 밴드가 나타났으며, 이는 바이러스 증폭 공정 중에 재조합 이벤트가 없었음을 입증하는 것이다(도 5).
그 다음, AAV-Rep78 플라스미드 트랜스펙션의 투여량 및 시간, 및 rh-배큘로-AAV 감염 및 감염된 HEK293T 세포의 클로닝 조건을 조심스럽게 규정하였다(도 1c). 실제로, 이러한 실험적 설정의 선택은 중요한 것으로 나타났다. 따라서, 광범위한 조건을 시험한 후, 결국, rh-배큘로-AAV 감염전 24시간에 1,000 MOI로 AAV-rep78 플라스미드 DNA로 트랜스펙션하는 단일 투여가 최상의 실험 디자인인 것으로 확립되었다. 또한, 총 5 × 105 cells이 22 90-mm-페트리디쉬에 분배되고, 각 디쉬는 다른 농도로 시딩되고, 시딩 후 4일에 하이그로마이신 100㎍/ml을 첨가한 시딩이 가장 많은 수의 세포 클론을 수집하는 최상의 조건이었다. 카운팅된 360개의 클론 중에서 단지 3개만이, 즉, PK-7, PK-17 및 PK18만이 100pg/ml이상의 안정 한계점(settled threshold)으로 p24gag를 발현하였다. 상기 클론들의 서던 블롯팅 분석 결과, 각 클론은 2 복사체의 코렉트-인-사이즈 벡터(correct-in-size vector)를 함유하는 것으로 나타났다(도 2a). 잔류 AAV-rep78 플라스미드 DNA의 가능한 통합을 배제하기 위해, PK-7 gDNA에서 rep78 특이적 PCR을 수행하여 양성 신호를 검출하였다(도 5b). GPR 카세트로부터 발현된 HIV-1 단백질 발현 패턴을 3개의 PK 클론 및 이에 부합하는 배지에 방출된 바이러스성 파티클(VLP)을 웨스턴 블롯팅하여 모니터하였다. 모든 바이러스 단백질은 코렉트-인-사이즈(correct-in-size)로 그리고 올바른 상대적 비율로(in the right, relative proportion) 적절히 프로세싱되었다(도 2b). 퓨처 워킹(future working) PK 클론은, 상기 VSV-G 플라스미드 및 상기 제 3 세대 트랜스퍼 벡터 SIN-eGFP로 코-트랜스펙션한 후에 3 클론으로부터 생성된 LV의 효능을 SupT1 세포에서 산출함으로써 선발되었다(표 1). 특히, 트랜시언트 트랜스펙션에 의해 생성된 대조구 HEK293T LV의 타이터가 PK-7 및 PK-18 LV의 타이터에 비해 5배 더 높았음에도 불구하고, 이의 감염성은 상기 PK LV의 감염성과 거의 동일하였다. 이는 상기 PK 클론이 "질(quality)"적인 관점에서 통상적인 방법에 의해 생성된 것과 대등한 LV를 생성함을 제시하는 것이다(표 1). PK-7 및 PK-18 LV의 효능이 유사하였으나, PK-7 클론이 PK-18 클론보다 이의 형태, 성장, 생존성 및 p24gag 생산값이 더 우수하였기 때문에 추가적인 유전적 조작을 위해 선발되었다(표 1).
Figure 112013028392754-pct00002
그 다음, PK-7 클론에서 ITR-측면에 위치한(ITR-flanked) GPR 카세트의 통합은, 정량 LM-PCR, TaqMan PCR(도 2c) 및 FISH 기술(도 2d)에 의해 PK-7 클론에서 면밀히 특성화되었다. 통합 사이트를 정확히 매핑하기 위해, 2번 염색체, 2q32.1에서 브레이크 포인트를 집중조사하는 LM-PCR 연구를 수행하였다(도 2c). 이 결과는 특이적 GPR 프로브를 이용한 원 위치 하이브리드화에 의해 확인되었으며, 이는 염색체 암(arm)의 길이 및 중심립 위치에 기초하여 2번 염색체의 단일 스폿을 나타내었다. 이러한 위치 지정을 확인하기 위해, 염색체 2q31.2에서 매핑하는 것으로 알려진 HOX4 프로브를 사용하였다. HEK293T 세포가 삼배체이기 때문에, HOX4는 3개의 모든 2번 염색체에서 올바로 검출되었다(도 2d). 마지막으로, 이는 정량 TaqMan PCR에 의해 2 복사체가 통합된 것으로 확인되었으며, 그리고 적절한 디자인의 프라이머를 이용한 네스티드 PCR(도 2e)에 의해 2 복사체가 종렬형(tandem)의 꼬리 대 꼬리 배향인 것으로 확인되었다. 꼬리 대 꼬리 배향은 또한 와일드 타입 AAV 및 대부분의 rAAV 벡터 연쇄체(concatamers)의 숙주 세포 게놈 내로의 통합에서 관찰되는 자연적인 형태이다(16). 상기 꼬리 대 꼬리 결합을 포함하는 증폭물의 서열 분석 결과, 제 1 및 제 2 카세트의 양 ITRs와 함께 제 1 카세트의 3'CMV 프로모터의 303-bp 및 제 2 카세트의 전체 5'CMV 프로모터를 포함하는 910-bp 프레그먼트가 소실된 것으로 나타났다(도 2e, 레드 박스). 벡터-세포 재조합 이벤트의 대부분은 실제로 벡터의 ITR 서열에서 일어난다. 이러한 재배열은 PK-7 세포에서 제 2 카세트의 gag-pol 유전자의 전사 결핍을 일으키고, 제 1 카세트의 rev 및 hygro 유전자의 전사 결핍을 일으키기 쉽다. 그러나, 결실된 CMV 프로모터의 좌측 285-bp 리전(도 2e, 스킴의 중심에서 회색 삼각형)은 여전히 TATA 박스를 함유하며, 이는 rev 및 hygro 유전자의 전사를 유도하기에 충분할 수 있다. 결론적으로, PK-7은 하나의 gag-pol 유전자 및 하나 또는 둘의 rev 및 hygro 유전자를 집합적으로 전사하는 2개의 통합된 카세트를 함유한다.
시간 경과에 따른 PK-7 클론의 안정성을 입증하기 위해, 상기 세포들을 하이그로마이신의 존재 또는 부재 하에서 350일간 배양하고(이는 약 420 세포 배가에 해당함), 세포 베이시스에 따른(on a per cell basis) p24gag 생산을 측정하였다(표 2). 하이그로마이신의 존재 하에서 평균 생산은 15.34±8.47SD ng p24gag/l × 106 cells이었으며, 항생제의 부재 하에서는 6.70±3.51SD ng p24gag/l x 106 cells이었다(표 2).
Figure 112013028392754-pct00003
이러한 차이는 하이그로마이신 약제 압력(drug pressure)이 하이드로 내성 유전자의 전사를 "온(on)" 상태로 유지하고, 이에 따라 염색질이 또한 유지되는 사실로부터 나온 것으로 보인다. 이는 gag-pol 유전자의 보다 높은 전사를 선호할 수 있다. PK-7 클론으로부터 생성된 VLP가 수백 배가(더블링) 후에도 기능적인지 평가하기 위해, PK-7 세포를 p60 및 p102에 VSV-G 엔벨로프 및 SIN-eGFP 트랜스퍼 벡터로 코-트랜스펙션하고, SupT1 세포에서 LV 효능을 산출하였다. 현저하게도, 선택 약물의 존재 및 부재 하에서 모두 생성된 LV의 타이터 및 감염성은 이러한 장기 시간 후에 여전히 정상 수준을 지속하였다(표 2). 이러한 데이터는 약제 압력의 존재 또는 부재와 관계없이 GPR 카세트의 유전적 불안정성이 없으며, 장래의 특성화에서 하이그로마이신의 사용을 회피할 수 있음 보여준다. AAV-ITR 매개 카세트의 통합 안정성과 관련되어 문헌적으로 입수가능한 비교할만한 데이터가 없다. 단지 관련된 정보는 와일드 타입 AAV 혈청형 2(AVV-2)로 감염된 인간 골수 유래, 섬유아세포성 세포주(Ruddle's Detroit 6 cells)가 적어도 47 및 118회 패시지 동안 잠복 상태로 바이러스 서열을 유지하였다는 것이다(16, 17). 특히, PK-7 세포는 적어도 102회 패시지 동안 생존하였다.
실시예 III : 제 2 세대 RD2 - MolPack 을 위한 제 2 중간물 , PK -7- Tat7 클론의 개발
다음 단계는 SIN-LV 운반(도 1, 스킴 2)에 의해 HIV-1 조절 인자 Tat를 PK-7 세포 내로 안정하게 통합하는 것으로 이루어진 제 2 세대 RD-Molpack(도 1c)의 개발에 대한 것이다. 세포들은 2사이클의 스피노큘레이션에 의해 트랜스덕션되고, 그 다음 퓨로마이신(puromycin) 선별 후 제한 희석에 의해 클로닝되었다. 11개의 성장된 클론을 픽업하고, p24gag 제조에 기초한 제 1 스크리닝 후, Tat 발현은 5ng p24gag/1 × 106 cells 값 이상을 보이는 5개의 클론으로부터 획득된 핵 추출물을 이용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 확립되었다. 단지 PK-7-Tat5 및 PK-7-Tat7 클론만이 고 수준의 tat(도 3a) 및 p24gag(도 3b)를 나타내었다. 따라서, 이들 2개의 클론만이 PK-7-Tat5가 12 및 PK-7-Tat7 6개의 tat 유전자 복사체를 함유하는 TaqMan PCR에 의해 추가 특성화되었으며; 또한 LV 효능은 잔류 VSV-G 엔벨로프 플라스미드 및 PΔN-eGFP 제 2 세대 트랜스퍼 벡터를 코-트랜스펙션함으로써 측정되었다. 양 클론의 타이터가 2-log미만이었음에도, 감염성은 대조구 세포보다 단지 1-log 더 낮았다(표 3). 이에 기초하여, PK-7-Tat7을 중간 클론으로 선택하여 후속적으로 RD114-TR 엔벨로프를 통합하였다.
Figure 112013028392754-pct00004
실시예 V: SIN - RD114 - TR - IN - RRE 벡터의 제작
SIN-LV 운반에 의해 PK-7 및 PK-7-Tat7 클론 내로 RD114-TR 엔벨로프를 첨가하기 위해, SIN-RD114-TR 벡터의 제작시 처음에 다수의 시도들이 이루어졌다(도 1a, 스킴 3). 이러한 목적을 위해, SIN-eGFP 벡터의 PGK-eGFP 카세트(도 1a, 스킴 6)는 CMV-RD114-TR 카세트로 치환되었으며, 이는 본래의 CMV-RD114-TR 플라스미드에 존재하는 β-글로빈 인트론을 함유하지 않았다(도 1a, 스킴 12). β-글로빈 인트론은 cPPT 요소의 업스트림에 위치한 스플라이스 억셉터(SA) 뿐만 아니라 β-글로빈 인트론의 SA와 함께 SIN 벡터의 패키징 신호의 업스트림에 위치한 강한 스플라이스 도너(SD)에 의해 유도되는 가능한 다중 스플라이싱 이벤트의 염려로 구조물에서 처음에 배제되었다. 후자의 경우에, 실제로 스플라이싱은 벡터의 게놈 RNA로부터 CMV 프로모터를 제거할 수 있다(도 1, 스킴 6). 예기치 않게, SIN-벡터 및 동일한 발현 카세트 형태를 갖는 모든 중간 플라스미드는 RD114-TR 단백질을 생산하지 못하였다. 실제로, SIN-RD114-TR로 트랜스펙션되거나(TF) 트랜스덕션된(TD) 세포로부터 획득된 세포 추출물을 웨스턴 블롯팅으로 분석했을때, RD114-TR 단백질의 수준은 CMV-RD114-TR 대조구 플라스미드로부터 획득된 것에 비해 검출불가능하였다(도 4a, 래인 1-3). 노던 블롯팅 분석 결과, 상기 플라스미드를 PK-7 세포 내로 트랜스펙션한 후에 SIN-RD114-TR-특이 전사물은 전장(FL) 및 싱글 스플라이스드 전사물에 상응하였으나, 내부 CMV-RD114-TR 카세트의 전사물은 아니었다. 이는 효율적인 RD114-TR 전사물 축적을 위해 β-글로빈 인트론의 가능한 필요성을 제시한다(도 6, 래인 1 및 2).
이러한 발견에 기초하여, RD114-TR 생산을 획득하기 위해 β-글로빈 인트론의 예기치 않은 필요성은 RD114-TR ORF에서 불안정성 또는 네거티브 서열의 존재를 반영할 수 있다는 것이 반박되었다. GENEART AG(Regensburg, Germany)에 의해 수행된 GeneOptimizer®으로 보조된 서열 분석 결과, 배드 코돈 선호도(bad codon usage)를 갖는 코돈이 RD114-TR 유전자에 걸쳐 모두 퍼져있는 것으로 나타났으며, 이는 본 발명자들의 추정의 근거를 제공한다. 더욱이, 코돈 최적화 분석 결과, 코돈 적응 지수(codon adaptation index)(CAI)는 0.65에서 0.98로 향상된 것으로 나타났다(1의 CAI가 최적임). 따라서, 벡터 디자인에 β-글로빈 인트론을 포함시킬 필요성을 회피하기 위해, 전체 RD114-TR ORF가 GENEART AG 서비스를 통해 코돈 최적화되었다. 코돈 최적화는 β-글로빈 인트론의 부재 하에서도 RD114-TR 전구체 단백질(PR) 번역을 가능케 하나, 예기치 않게 고 수준의 PR은 SU 및 TM 서브유닛에서 퓨린에 의해 프로세싱되지 않는 것으로 밝혀졌다(도 4a, 래인 7). 다량의 언프로세싱된 PR의 축적은 과량의 기질에 부수적이었다는 가능성이 배제되었으며, 그 이유는 매우 적은 량의 플라스미드 트랜스펙션(10pg DNA/106 cells) 후에도 단백질 가수분해 분할이 나타나지 않았기 때문이다. 따라서, 하나 이상의 사일런트 돌연변이(들)이 단백질의 전사/번역 속도를 변형시킬 수 있으며, 이에 따라 이의 올바른 폴딩 및 퓨린-의존적 분할의 접근성이 용인되는 것으로 결론지어졌다.
따라서, β-글로빈 인트론, SIN-RD114-TR-IN 및 SIN-RD114-TR-RRE 서열을 함유하는 WT RD114-TR을 발현하는 다른 두 벡터를 생성하였으며(도 1a, 각각, 스킴 4 및 5); 후자에서, 엑스트라 RRE는 이를 스플라이싱으로부터 보호하기 위해 β-글로빈 인트론 내에 매립되었다. SIN-RD114-TR-IN 벡터는 트랜스펙션 후에 다량의 단백질을 생성하였으나(도 4a, 래인 6), SIN-RD114-TR-IN 트랜스덕션된 세포에서는 단백질을 생성하지 않았다(도 4a, 래인 7). 이러한 발견은 검출불가능한 전장 게놈 RNA를 나타내는 노던 블롯팅 분석에 의해 뒷받침되며, 이는 800-bp β-글로빈 인트론의 존재에 기인하여 SIN-RD114-TR보다 느리게 이동하는 것으로 예측되었다(도 6, 래인 3 및 4, Exp. FL(full length)). 이와 대조적으로, 다량의 스플라이싱된 RNAs가 상기 β-글로빈 인트론의 SD 및 SA의 작용에 의해 유도되었다(도 6, 래인 3 및 4).
특히, SIN-RD114-TR-RRE 벡터 내의 RRE는 트랜스펙션 및 트랜스덕션된 PK-7 세포(도 4a, 래인 8 및 9) 및 각각의 VLPs(도 4a, 래인 10 및 11)에서 모두 엔벨로프 발현을 가능케 하는데 필수적이고 충분한 것으로 관찰되었다. VLP 내로 편입된 RD114-TR은 정상적으로 프로세싱되어 고 수준의 트랜스-멤브레인 서브유닛 TM 및 TM*을 나타내었으며; 후자는 Sandrin 등(2004)(22)에 의해 나타낸 바와 같이 바이러스 프로테아제에 의한 TM 서브유닛의 분할로부터 생겨한 것이다. PR 분자와 함께 동시 이동해야 하는 RD114-TR SU 서브유닛은 본 발명자들이 사용한 특이 항-RD114-TR에 의해 검출되지 않는다. 그 다음, SIN-RD114-TR-CO-IN-RRE 벡터를 생성하고, 단백질 생산 및 프로세싱에 대해 시험하였다. 이 벡터로부터 생성된 단백질은 아직까지 적절히 생성되고 프로세싱된 것이 없다(도 4a, 래인 13). 이 결과는 RD114-TR의 올바른 생산을 위해 이용가능한 구조물은 단지 SIN-RD114-TR-IN-RRE임을 결론짓게 한다.
실시예 V: RD2 - MolPack 을 획득하기 위한 PK -7- Tat - RD19 클론 및 RD3 - MolPack 을 획득하기 위한 PK -7- RD32 클론의 개발
지금까지 나타낸 결과에 기초하여, RD114-TR 엔벨로프는 VSV-G 슈도타입 SIN-RD114-TR-IN-RRE LV 운반에 의해 PK-7-Tat7 및 PK-7 클론 모두에 안정하게 통합되었다. PK-7-Tat7 세포를 제한 희석으로 스피노큘레이팅하고 클로닝하였다. 그 다음, 9개의 클론을 제 2 세대 PΔN-eGFP 트랜스퍼 벡터의 트랜스덕션 후에 생성된 LV의 타이터를 산출함으로써 스크리닝하고(표 4); 1×105 TU/ml 이상의 타이터를 나타내는 클론들에 대해서만, 즉, PK-7-Tat7-RD3, PK-7-Tat7-RD12 및 PK-7-Tat-RD19 클론들에 대해서만 RD114-TR의 수준을 웨스턴 블롯팅 및 TaqMan PCR에 의한 통합 복사체의 수에 의해 조절하였다(도 4b). PK-7-Tat7-RD19 클론이 가장 높은 타이터를 생성하였고, SIN-RD114-TR-IN-RRE LV 통합된 복사체의 수와 관련하여 우수한 양의 RD114-TR을 생성하였기 때문에, 이를 선택하였다(도 4b, 괄호 안의 수).
Figure 112013028392754-pct00005
그 다음, PK-7-Tat-RD 클론을 생성하는데 적용된 것과 동일한 트랜스덕션, 선발, 클로닝 및 스크리닝 프로토콜을 사용하여 RD114-TR을 PK-7 세포 내로 통합하였다(표 5). 선발된 PK-7-RD-26, PK-7-RD-28 및 PK-7-RD-32 세포를 웨스턴 블롯팅 및 TaqMan PCR 기술에 의해 분석하였다(도 4c). PK-7-RD26 클론이 저 타이터로 LV를 생성하였음에도 불구하고, 다른 선발 클론에 비해 그리고 심지어 프로제니터 PK-7 클론에 비해 가장 높은 수준의 p24gag를 생성하기 때문에 PK-7-RD26 클론을 선택하였다(표 7).
Figure 112013028392754-pct00006
특히, RD114-TR TM 서브유닛의 수준은, PK-7-RD28과 PK-7-RD32 클론간에 RD114-TR 복사체의 수의 뚜렷한 차이에도 불구하고 PK-7-RD28과 PK-7-RD32 클론에서 동등하였으며(도 4c, 괄호 안의 수), 이는 RD114-TR-IN-RRE 벡터의 일부가 PK-7-RD32 클론에서 기능적이지 않음을 제시한다. 따라서, PK-7-RD26 클론에서 고 수준의 p24gag 생산과 아마도 보다 높은 수준의 RD114-TR 단백질을 함께 나타내기 위해, 추가 2회의 사이클의 SIN-RD114-TR-IN-RRE 통합, 선발 및 클로닝을 수행하여, 제 1 사이클의 서브클론 PK-7-RD26.72로부터 그리고 제 2 사이클의 서블클론 RD26.72.10으로부터, 2에서 11로 증가된, 그 다음 22로 증가된 RD114-TR 복제수와 7.0 × 102 내지 1.1 × 104 및 최종적으로 2.7 × 105의 타이터가 각각 획득되었다(도 4d, 괄호 안의 수).
실시예 VI : 제 2 세대 RD - MolPack - Chim3 안정성 생산자 세포주의 개발
최종 제 2 세대 RD-MolPack 패키징 세포를 획득하기 위해, PK-7-Tat-RD19 세포 내로 트랜스 벡터 PΔN-Chim3를 통합하였으며(도 1a, 스킴 7), 이의 치료 유전자 Chim3는 항-HIV/AIDS 유전자 치료에서 포괄적으로 특성화된 것이다(23, 24). 표준화 스크리닝 프로토콜을 수행한 후, 3개의 클론 PK-7-Tat7-RD19-Chim3.2, PK-7-Tat7-RD19-Chim3.3 및 PK-7-Tat7-RD19-Chim3.14(표 6)를 추가 특성화를 위해 선택하였다.
Figure 112013028392754-pct00007
PK-7-Tat7-RD19-Chim3.14(이하, RD2-MolPack-Chim3.14라 칭함)가 서스펜션에서 자발적으로 성장하였기 때문에 이를 선택하였다. 상기 클론은 2달에 가까운 기간 동안 배양시 생존하였으며, SupT1 세포에서 타이터 측정시 3TU/cell/day를 생성하는 것으로 입증되었다. 더욱이, RD2-MolPack-Chim3.14 세포는 5% FCS를 함유하는 DMEM 배지에서 정상적으로 생존할 수 있으며, 한편 이의 생존성은 2.5% FCS를 함유하는 DMEM 배지에서 배양시 감소하였다(도 3d). 이의 성장 특징은 바이오리액터에서 잠재적 대량 규모 배양에 중요하다. 또한, 관심있는 Chim3-LV의 높은 복제수에도 불구하고, 바이러스 유전자의 재배열이 서던 블롯팅 분석에 의해 관찰되지 않았으며, 이는 통합된 벡터의 유전적 안정성을 입증하는 것이다(도 3c). 현저히, RD2-MolPack-Chim3.14 클론으로부터 생산된 LV의 타이터는 SupT1 또는 CD34+ 세포에서 산출될 경우에 잔류 플라스미드로 트랜시언트 트랜스펙션된 PK-7 및 HEK293T 대조구 세포로부터 생산된 LV의 타이터보다 높다(표 6).
참고문헌
Figure 112013028392754-pct00008

Figure 112013028392754-pct00009
<110> MolMed SpA <120> Stable production of lentiviral vectors <130> IPP-2013-0045 <150> EP 10175088.3 <151> 2010-09-02 <160> 27 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(24) <400> 1 agtactggag ctttgttcct tggg 24 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(22) <400> 2 agtactaaat ccccaggagc tg 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(20) <400> 3 cgggctgctg gcccaccagg 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(24) <400> 4 atgccggggt tttacgagat tgtg 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(20) <400> 5 cttgaggagg tcttcgtcgc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(21) <400> 6 ccctgttact tctccccttc c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(20) <400> 7 tgtctccgct tcttcctgcc 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(21) <400> 8 ttaaccatag aaaagaaggg g 21 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="protein" /note="peptide" /organism="artificial sequences" <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> SOURCE <400> 9 Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Thr Ala Glu Gln Gly Gly 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="protein" /note="peptide" /organism="artificial sequences" <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(15) <223> SOURCE <400> 10 Ser Gly Ile Val Arg Asn Lys Ile Arg Thr Leu Gln Glu Glu Leu 1 5 10 15 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(20) <400> 11 gtagcatggc gggttaatca 20 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(27) <400> 12 ttaactacaa ggaaccccta gtgatgg 27 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(22) <400> 13 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial 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Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(27) <400> 19 aggttactcc agatgtccaa ttttagc 27 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(20) <400> 20 gggagtgggt atcgcaagag 20 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(16) <400> 21 cagagccaac aatctt 16 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(21) <400> 22 acatcaagca gccatgcaaa t 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(20) <400> 23 atctggcctg gtgcaatagg 20 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="probe" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(31) <400> 24 catcaatgag gaagctgcag aatgggatag a 31 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(17) <400> 25 tactgacgct ctcgcacc 18 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="primer" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(17) <400> 26 tctcgacgca ggactcg 17 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> /mol_type="DNA" /note="probe" /organism="artificial sequences" <220> <221> source <222> (1)..(20) <400> 27 atctctctcc ttctagcctc 20

Claims (31)

  1. i. 아데노 관련 바이러스(AAV) 역위 말단 반복(inverted terminal repeats)(ITRs)에 의해 플랭크된(flanked) 통합 카세트를 함유하는 배큘로바이러스 백본을 포함하는 하이브리드 벡터(A)를 제조하는 단계로서, 여기서 상기 통합 카세트는 2개의 발현 카세트를 포함하며, 여기서 제 1 발현 카세트는 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 암호화하며, 제 2 발현 카세트는 렌티바이러스 rev 및 선발 마커를 암호화하며, 여기서 각각의 AAV ITR은 연결된 2개의 발현 카세트의 양쪽 말단에 AAV ITR-제 1 발현 카세트-제 2 발현 카세트-AAV ITR 순서로 위치하는, 하이브리드 벡터(A) 제조 단계, 및
    ii. 프로모터의 조절 하에서 AAV rep 오픈 리딩 프래임를 함유하는 발현 플라스미드(B)를 제조하는 단계,
    iii. 상기 발현 플라스미드(B)로 세포를 트랜스펙션한 다음, 상기 세포를 하이브리드 벡터(A)로 감염시키는 단계,
    iv. 상기 세포를 선별용 항생제의 존재 하에서 배양하는 단계,
    v. gag, pol 및 rev 단백질을 안정하게 발현하는 세포를 획득하는 단계,
    vi. 발현 벡터를 이용하여 상기 세포에 env 유전자를 통합시키는 단계,
    vii. 상기 세포를 배양하여 gag, pol, rev 및 env 단백질을 안정하게 발현하는 세포를 획득하는 단계
    를 포함하는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법.
  2. i. 아데노-관련 바이러스(AAV) 역위 말단 반복(inverted terminal repeats)(ITRs)에 의해 플랭크된(flanked) 통합 카세트를 함유하는 배큘로바이러스 백본을 포함하는 하이브리드 벡터(A)를 제조하는 단계로서, 여기서 상기 통합 카세트는 2개의 발현 카세트를 포함하며, 여기서 제 1 발현 카세트는 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 암호화하며, 제 2 발현 카세트는 렌티바이러스 rev 및 선발 마커를 암호화하며, 여기서 각각의 AAV ITR은 연결된 2개의 발현 카세트의 양쪽 말단에 AAV ITR-제 1 발현 카세트-제 2 발현 카세트-AAV ITR 순서로 위치하는, 하이브리드 벡터(A) 제조 단계, 및
    ii. 프로모터의 조절 하에서 AAV rep ORF를 함유하는 발현 플라스미드(B)를 제조하는 단계,
    iii. 상기 발현 플라스미드(B)로 세포를 트랜스펙션한 다음, 상기 세포를 하이브리드 벡터(A)로 감염시키는 단계,
    iv. 상기 세포를 선별용 항생제의 존재 하에서 배양하는 단계,
    v. gag, pol 및 rev 단백질을 안정하게 발현하는 세포를 획득하는 단계,
    vi. 발현 벡터를 이용하여 상기 세포에 렌티바이러스 tat 유전자를 통합시키는 단계,
    vii. 상기 세포를 배양하여 gag, pol, rev 및 tat 단백질을 안정하게 발현하는 세포를 획득하는 단계
    viii. 발현 벡터를 이용하여 상기 세포에 env 유전자를 통합시키는 단계,
    ix. 상기 세포를 배양하여 gag, pol, rev, tat 및 env 단백질을 안정하게 발현하는 세포주를 획득하는 단계
    를 포함하는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 하이브리드 벡터의 2개의 발현 카세트는 꼬리 대 꼬리로 배향되며, 각각 구성 프로모터에 의해 구동되고 폴리 A를 포함하는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 프로모터는 CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV 및 RSV로부터 선택되는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 프로모터는 CMV IE인, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 선발 마커는 하이그로마이신, 카나마이신, 네오마이신 및 제오마이신 내성 유전자로부터 선택되는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 선발 마커는 하이그로마이신 내성 유전자인, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 선발 마커는 내부 리보좀 엔트리 사이트(IRES)의 다운스트림 쪽에 클로닝된 것인, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 선발 마커는 내부 리보좀 엔트리 사이트(IRES)의 다운스트림 쪽에 클로닝된 것인, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 AAV Rep 단백질은 Rep78인, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    env 유전자는 MLV 4070 env, RD114 env, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-pro, 배큘로바이러스 GP64 env, GALV env 및 이의 유도체로부터 선택되는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    env 유전자는 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR인, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 RD114-TR은 5' 말단부터 3' 말단으로 순차적으로 배열되어 있는 CMV 프로모터, 이의 서열에 RRE 요소를 함유하는 β-글로빈 인트론 및 RD114-TR ORF를 함유하는, 발현 카세트를 포함하는 SIN 렌티바이러스 벡터를 사용하여 통합되는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 획득하는 방법.
  14. 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주로서, 상기 세포주의 게놈 내로 안정하게 통합되는
    i. 2개의 발현 카세트를 포함하는 AAV ITRs에 의해 플랭크된(flanked) 적어도 하나의 통합 카세트의 복사체로서, 여기서 제 1 발현 카세트는 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 암호화하며, 제 2 발현 카세트는 렌티바이러스 rev 및 선발 마커를 암호화하며, 여기서 각각의 AAV ITR은 연결된 2개의 발현 카세트의 양쪽 말단에 AAV ITR-제 1 발현 카세트-제 2 발현 카세트-AAV ITR 순서로 위치하는, 적어도 하나의 통합 카세트의 복사체; 및
    ii. 적어도 하나의 env 유전자의 복사체
    를 함유하는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 세포는 상기 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되는 HIV-1 tat 유전자를 더 포함하는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 세포는 HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 및 HeLa로부터 선택된 인간 세포주인, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 통합 카세트의 2개의 발현 카세트는 꼬리 대 꼬리(tail-to-tail) 배향되고, 각각 구성 프로모터에 의해 구동되고 폴리 A를 포함하는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 프로모터는 CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV 및 RSV로부터 선택되는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주.
  19. 제14항에 있어서,
    상기 선발 마커는 하이그로마이신, 카나마이신, 네오마이신 및 제오마이신 내성 유전자로부터 선택되는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주.
  20. 제14항에 있어서,
    env 유전자는 MLV 4070 env, RD114 env, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114pro, 배큘로바이러스 GP64 env, GALV env 및 이의 유도체로부터 선택되는, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주.
  21. 제14항에 있어서,
    env 유전자는 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR을 암호화하는 유전자인, 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주.
  22. i. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항의 안정한 렌티바이러스 패키징 세포주를 배양하는 단계; 및
    ii. 상기 안정한 패키징 세포주에 트랜스퍼 벡터를 삽입시키는 단계
    를 포함하는, 렌티바이러스 벡터 제조 방법.
  23. 생산자 세포주(producer cell line)로서, 상기 세포주의 게놈 내로 안정하게 통합되는
    i. 2개의 발현 카세트를 포함하는 AAV ITRs에 의해 플랭크된 적어도 하나의 통합 카세트의 복사체로서, 여기서 제 1 발현 카세트는 렌티바이러스 gag 및 pol 유전자를 암호화하며, 제 2 발현 카세트는 렌티바이러스 rev 및 선발 마커를 암호화하며, 여기서 각각의 AAV ITR은 연결된 2개의 발현 카세트의 양쪽 말단에 AAV ITR-제 1 발현 카세트-제 2 발현 카세트-AAV ITR 순서로 위치하는, 적어도 하나의 통합 카세트의 복사체;
    ii. 적어도 하나의 env 유전자의 복사체; 및
    iii. 트랜스퍼 벡터
    를 포함하는, 생산자 세포주.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 세포는 상기 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되는 적어도 하나의 렌티바이러스 tat 유전자 복사체를 더 포함하는, 생산자 세포주.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 세포는 HEK293, HEK293-T, HEK293-SF, TE671, HT1080 및 HeLa로부터 선택된 인간 세포주인, 생산자 세포주.
  26. 제23항에 있어서,
    상기 통합 카세트의 2개의 발현 카세트는 꼬리 대 꼬리(tail-to-tail) 배향되고, 각각 구성 프로모터에 의해 구동되고 폴리 A를 포함하는, 생산자 세포주.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 프로모터는 CMV, CMV IE, PGK, SV40, eF1α, SFFV 및 RSV로부터 선택되는, 생산자 세포주.
  28. 제23항에 있어서,
    상기 선발 마커는 하이그로마이신, 카나마이신, 네오마이신 및 제오마이신 내성 유전자로부터 선택되는, 생산자 세포주.
  29. 제23항에 있어서,
    env 유전자는 MLV 4070 env, RD114 env, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR, 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114pro, 배큘로바이러스 GP64 env, GALV env 및 이의 유도체로부터 선택되는, 생산자 세포주.
  30. 제23항에 있어서,
    env 유전자는 키메릭 엔벨로프 단백질 RD114-TR를 암호화하는 유전자인, 생산자 세포주.
  31. i. 제23항 내지 제30항 중 어느 한 항의 생산자 세포주를 배양하는 것을 포함하는, 렌티바이러스 벡터 제조 방법.
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