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KR101967345B1 - 안지오포이에틴-2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드 및 그 용도 - Google Patents

안지오포이에틴-2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드 및 그 용도 Download PDF

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KR101967345B1
KR101967345B1 KR1020120116155A KR20120116155A KR101967345B1 KR 101967345 B1 KR101967345 B1 KR 101967345B1 KR 1020120116155 A KR1020120116155 A KR 1020120116155A KR 20120116155 A KR20120116155 A KR 20120116155A KR 101967345 B1 KR101967345 B1 KR 101967345B1
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Abstract

안지오포이에틴-2(Ang2) 유래 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함함하는 Ang2와 인테그린 간 결합 저해용 조성물, 및 상기 펩타이드를 포함하는 Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물이 제공된다.

Description

안지오포이에틴-2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드 및 그 용도{Peptides for inhibition of binding between angiopoietin-2 and integrin and uses thereof}
안지오포이에틴-2(Ang2) 유래 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 Ang2와 인테그린 간 결합 저해용 조성물, 및 상기 펩타이드를 포함하는 암 또는 암 전이의 예방 및/또는 치료용 조성물이 제공된다.
안지오포이에틴-2 (Angiopoietin-2; Ang2)는 혈관내피세포에 존재하는 수용체 Tie2의 길항적인 리간드 (antagonistic ligand)로서, Tie2의 작용물질 (agonist)인 안지오포이에틴-1(Angiopoietin-1; Ang1)과 Tie2 결합에 대해 경쟁함으로써 Tie2에 의한 신호전달을 억제하는 작용을 한다. 따라서 Ang2는 혈관내피세포의 안정성을 유지하는 Ang1-Tie2 결합과 이를 통한 신호전달을 저해하여, 결과적으로 혈관의 역동적인 재배열 (dynamic rearrangement)을 통한 신생혈관형성을 촉진한다.
신생혈관형성과정은 암의 성장에 필수적인 요소이므로, 위와 같은 Tie2 의존적인 Ang2의 기능을 저해하여 신생혈관형성을 억제함으로써 암의 추가적인 성장을 막을 수 있음은 여러 전임상 모델의 연구에 의해 알려져 있고, 실제로 Ang2 특이적 항체를 이용하여 암의 진행을 막으려는 시도가 다양하게 이루어지고 있다.
　최근, Ang2는 Tie2 의존적인 (Tie2-dependent) 신생혈관형성을 통한 암의 성장을 유발할 수 있을 뿐 아니라 Tie2 독립적인 (Tie2-independent) 기작을 통해 암의 전이를 촉진할 수 있음을 보이는 현상들이 관찰되고 있지만, 그 구체적인 메커니즘에 대한 연구 결과는 아직 미미한 실정이다.
　Ang2에 의한 암의 진행을 효과적으로 저해하는 방법으로 앞서 언급한 Ang2에 의한 Tie2 시그널링을 억제하는 것도 중요하지만, 이와 더불어 Ang2의 Tie2 독립적인 기작을 차단함으로써, 더욱 탁월한 성능의 암치료제 확보가 가능할 수 있을 것으로 기대된다. 따라서, Ang2의 Tie2 독립적인 기작을 밝히고 이를 억제하는 물질의 개발이 요구된다.
본 발명의 일 예는 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드를 제공한다.
다른 예는 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 또는 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체를 제공한다.
다른 예는 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 Ang2와 인테그린 간 결합 저해용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치료적 유효량을 Ang2와 인테그린 간 결합 저해를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 Ang2와 인테그린 간 결합 저해 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치료적 유효량을 Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 Ang2와 인테그린 간 결합 저해를 위한 용도, 또는 Ang2와 인테그린 간 결합 저해용 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료에 있어서의 용도, 또는 Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
다른 예는 인테그린 및 Ang2의 반응물 중 일부에 후보물질을 처리하여, 상기 후보물질 처리된 반응물에서의 인테그린과 Ang2 간 결합 정도가 후보물질이 처리되지 않은 반응물에서의 인테그린과 Ang2 간 결합 정도보다 낮은 경우, 상기 후보 물질을 Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약물로 결정하는, Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 개발 방법을 제공한다.
다른 예는 상기 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 인테그린 검출용 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 시료에 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 처리하는 단계 및 상기 펩타이드와 결합하는 단백질의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는 인테그린 검출 방법을 제공한다.
Tie2를 발현하지 않는 세포의 Ang2-의존적인 부착을 저해한다는 것은, 암세포나 혈관내피세포 (특히 endothelial tip cell)의 이동 및/또는 침투에 중요한 Tie2　독립적인 신호전달을 저해함을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는 Tie2를 발현하지 않는 교모세포종(Glioblastoma) 암세포주인 U87MG가 Ang2이 코팅된 표면에 부착(adhesion)할 수 있는지를 측정하여, Tei2 이외의 신규한 Ang2의 결합 수용체를 확인하고, 상기 Ang2와 신규한 수용체 간의 결합을 저해하는 펩타이드를 선별함으로써, Tie2 독립적인 Ang2 작용을 저해하는 선도물질로서 제공된다.
상기 Tie2 독립적인 Ang2 작용을 확인을 위하여, 하기하는 실시예 1에서 Tie2를 발현하지 않는 세포가 Ang2가 코팅된 표면에 부착함을 확인하여, Tie2 이외에 새로운 Ang2의 결합 수용체가 존재함을 확인하였으며, 실시예 3에서 상기 새로운 Ang2의 결합 수용체가 인테그린임을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 일 예는 인테그린의 Ang2 결합 수용체로서의 용도를 제공한다.
상기 Ang2는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대 인간 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. O15123 등), 원숭이 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. Q8MIK6 등), 마우스 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. O35608 등), 래트 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. O35462 등) 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인테그린(integrin)은 세포 부착을 매개하는 대표적인 단백질로서, 알파(α) 서브유닛과 베타(β) 서브유닛을 포함하는 헤테로다이머 구조이다. 포유류에서는 18 종류의 알파 서브유닛과 8종류의 베타 서브유닛이 동정되어 있다. 상기 인테그린으로 상기 인테그린은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대 인간 인테그린, 원숭이 인테그린, 마우스 인테그린, 래트 인테그린 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 각 종(species) 마다 24종의 인테그린이 알려져 있으며, 이들의 아미노산 서열은 잘 동정되어 있어서 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확한 사항이다. 예컨대, 상기 인테그린은 인간 인테그린일 수 있고, 대표적인 인테그린 종류로서 alpha5beta1(α5β1)(α5: NCBI Accession No. P08648, β1: NCBI Accession No. P05556), alphaVbeta1(αVβ1)(αV: NCBI Accession No. P06756, β1: NCBI Accession No. P05556), 및 alphaVbeta3(αVβ3)(αV: NCBI Accession No. P06756, β3: NCBI Accession No. P05106) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 예는 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드를 제공한다.
상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드는 Ang2 단백질에서 Tie2 등과의 리셉터 결합에 관여하는 수용체 결합 도메인(Receptor binding domain; RBD)의 일부에서 유래하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드는 Ang2 단백질(예컨대 NCBI Accession No. O15123 (서열번호 42) 등)의 RBD (상기 서열번호 42의 Ang2 단백질의 282번째부터 496번째까지의 아미노산 서열에 해당) 내의 연속하는 5 내지 50개, 구체적으로 5 내지 30개, 보다 구체적으로 5 내지 15개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다.
상기 펩타이드는 인테그린과의 결합에 있어서 Ang2와 경쟁함으로써, Ang2와 인테그린의 결합을 저해한다.
한 구체예에서, Ang2 단백질 (NCBI Accession No. O15123; 서열번호 42) 중의 RBD (상기 서열번호 42의 Ang2 단백질의 282번째부터 496번째까지의 아미노산 서열에 해당) 내의 연속하는 15개의 아미노산을 갖고, 이 중 10개의 아미노산이 인접하는 펩타이드와 중복되도록 총 41개의 펩타이드를 설계할 수 있다(표 1 참조).
서열번호 펩타이드의 아미노산 서열 서열번호 펩타이드의 아미노산 서열
1 RDCAE VFKSG HTTNG 21 EAYSL YEHFY LSSEE
2 VFKSG HTTNG IYTLT 22 YEHFY LSSEE LNYRI
3 HTTNG IYTLT FPNST 23 LSSEE LNYRI HLKGL
4 IYTLT FPNST EEIKA 24 LNYRI HLKGL TGTAG
5 FPNST EEIKA YCDME 25 HLKGL TGTAG KISSI
6 EEIKA YCDME AGGGG 26 TGTAG KISSI SQPGN
7 YCDME AGGGG WTIIQ 27 KISSI SQPGN DFSTK
8 AGGGG WTIIQ RREDG 28 SQPGN DFSTK DGDND
9 WTIIQ RREDG SVDFQ 29 DFSTK DGDND KCICK
10 RREDG SVDFQ RTWKE 30 DGDND KCICK CSQML
11 SVDFQ RTWKE YKVGF 31 KCICK CSQML TGGWW
12 RTWKE YKVGF GNPSG 32 CSQML TGGWW FDACG
13 YKVGF GNPSG EYWLG 33 TGGWW FDACG PSNLN
14 GNPSG EYWLG NEFVS 34 FDACG PSNLN GMYYP
15 EYWLG NEFVS QLTNQ 35 PSNLN GMYYP QRQNT
16 NEFVS QLTNQ QRYVL 36 GMYYP QRQNT NKFNG
17 QLTNQ QRYVL KIHLK 37 QRQNT NKFNG IKWYY
18 QRYVL KIHLK DWEGN 38 NKFNG IKWYY WKGSG
19 KIHLK DWEGN EAYSL 39 IKWYY WKGSG YSLKA
20 DWEGN EAYSL YEHFY 40 WKGSG YSLKA TTMMI
41 YSLKA TTMMI RPADF
상기 41개의 펩타이드 중 서열번호 3, 4, 15, 16, 17, 24 및 40의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 현저하게 높은 Ang2와 인테그린의 결합에 대한 저해 활성을 보인다 (도 10 참조).
이 중에서, 우수한 인테그린-Ang2 결합 저해 활성을 보이는 서열번호 15 내지 17의 펩타이드는 10개의 아미노산이 중복된 서로 인접하는 펩타이드로서, 서열번호 43 (EYWLGNEFVSQLTNQQRYVLKIHLK)의 아미노산 서열 중 10개의 아미노산이 중복되면서 연속하는 15개 아미노산을 포함하도록 설계된 것이다. 상기 서열번호 43 중에서 11번째부터 15번째까지의 아미노산은 Ang2 단백질의 362번째부터 366번째까지의 아미노산 부위에 해당하는 것으로 Ang2 단백질의 3차 구조에서 외부에 노출된 측쇄를 가지므로, 인테그린과 결합 활성이 우수하다. 또한, 도 11 내지 14에서 입증되는 바와 같이, 특히 서열번호 43의 11번째 아미노산(Q)(Ang2 단백질(서열번호 42)의 362번째 아미노산에 해당)이 인테그린과의 결합 및 이에 따른 cell invasion에서 중요한 역할을 한다. 따라서, 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드는 상기 서열번호 43 중 11번째 아미노산 또는 11번째부터 15번째까지의 아미노산을 필수적으로 포함하는 연속하는 5개 내지 25개, 구체적으로 연속하는 5개 내지 20개, 보다 구체적으로 연속하는 5개 내지 15개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다.
서열번호 3 및 4의 펩타이드 역시 우수한 인테그린-Ang2 결합 저해 활성을 보이는 펩타이드로, 10개의 아미노산이 중복된 서로 인접하는 펩타이드이며, 서열번호 44 (HTTNGIYTLTFPNSTEEIKA)의 아미노산 서열 중 10개의 아미노산이 중복되면서 연속하는 15개 아미노산을 포함하도록 설계된 것이다. 서열번호 3 및 4의 펩타이드의 우수한 인테그린-Ang2 결합 저해 활성에 비추어, 상기 서열번호 44의 중 서열번호 3 및 4에 중복된 10개 아미노산 (밑줄로 표시)의 전부 또는 일부를 포함하면 인테그린-Ang2 결합 저해 활성을 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드는 서열번호 44의 아미노산 서열 중 연속하는 11개 내지 20개, 구체적으로 연속하는 11개 내지 15개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드는 서열번호 44의 아미노산 서열 중 6번째부터 15번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 11개 내지 20개, 구체적으로 연속하는 11개 내지 15개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다.
따라서, 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드는
서열번호 43의 아미노산 서열 중 11번째 아미노산 또는 11번째부터 15번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 5개 내지 25개의 아미노산을 포함하는 펩타이드 (예컨대, 서열번호 15, 서열번호 16 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드),
서열번호 44의 아미노산 서열 중 6번째부터 15번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 11 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩타이드 (예컨대, 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드),
서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 및
서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드
로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또 다른 예에서, 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드가 다른 펩타이드와 연결되어 소정의 구조를 갖는 폴리펩타이드 분자가 제공된다.
예컨대, 상기 폴리펩타이드 분자는
제1 펩타이드 및 제2 펩타이드를 포함하고,
상기 제1 펩타이드는 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드, 즉 서열번호 43 (EYWLGNEFVSQLTNQQRYVLKIHLK) 중 11번째 아미노산 또는 11번째부터 15번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 5개 내지 25개의 아미노산을 포함하는 펩타이드, 서열번호 44의 아미노산 서열(HTTNGIYTLTFPNSTEEIKA) 중 6번째부터 15번째까지의 아미노산을 포함하는 연속하는 11 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩타이드, 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 펩타이드, 또는 상기 펩타이드가 2개 이상 (예컨대, 2개 내지 20개, 구체적으로 2개 내지 10개, 보다 구체적으로 2개 내지 5개) 반복된 펩타이드 반복체이고;
상기 제2 펩타이드는 항체의 중쇄, 경쇄, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 불변부위, 및 항체의 Fc 단편으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 제2 펩타이드는 폴리펩타이드 분자의 구조 유지 또는 지지체로서의 기능을 하는 펩타이드로서, 항체 또는 항체의 일부일 수 있으며, 예컨대, 항체의 중쇄, 경쇄, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 불변부위, 및 항체의 Fc 단편으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄의 불변부위 또는 Fc 단편은 통상적인 항체의 불변부위 또는 Fc 부위를 의미하는 것으로, 특별한 제한은 없으며, 예컨대 인간 면역글로불린의 모든 이소타입 (예컨대, IgA, IgD, IgG, IgE, IgM)의 불변부위 또는 Fc 단편일 수 있다.
상기 폴리펩타이드 분자는 링커를 추가로 포함할 수 있다. 상기 링커는 제1 펩타이드와 제2 펩타이드 간, 또는 제1 펩타이드가 펩타이드 반복체인 경우 상기 펩타이드 반복체 내의 2개 이상의 펩타이드 간을 연결하는 역할을 하는 것으로, 2 내지 20개, 예컨대 3 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드일 수 있으며, 그 아미노산 서열에는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 상기 링커는 GmSn(m과 n은 아미노산 G와 S의 개수를 의미하는 것으로, 각각 독립적으로 1 내지 10의 정수, 예컨대 1 내지 5의 정수임)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 폴리펩타이드 분자는 상기 제1 펩타이드(즉, Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드 또는 상기 펩타이드 반복체)가 상기 링커를 통하거나 통하지 않고 상기 제2 펩타이드(예컨대, 항체의 중쇄, 경쇄, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 불변부위, 또는 항체의 Fc 단편)의 N 말단, 또는 C 말단, 또는 N 말단과 C 말단 모두에 각각 결합된 구조일 수 있다.
또 다른 예에서, 상기 폴리펩타이드 분자 2 개 이상, 예컨대 2개 내지 4개를 포함하는 폴리펩타이드 복합체가 제공된다. 상기 폴리펩타이드 복합체는 2개 이상, 예컨대 2개 내지 4개의 상기 폴리펩타이드 분자가 결합하여 다합체 구조를 갖는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드 복합체 내의 2개 이상의 폴리펩타이드 분자에 포함된 제1 펩타이드와 제2 펩타이드는 서로 동일하거나 상이한 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드 분자는 상기 제2 펩타이드 부위 (예컨대 Fc 단편 부위)에서 결합되어 다합체 구조를 형성할 수 있다.
상기 폴리펩타이드 분자 또는 폴리펩탄이드 복합체는 상보성 결정 영역(CDR)과 유사한 역할을 하는 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드 또는 이의 반복체 (제1 펩타이드)와 구조적 기능을 하는 제2 펩타이드(예컨대, 항체의 중쇄, 경쇄, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 불변부위, 또는 항체의 Fc 단편)를 포함하여 항체와 유사한 구조를 갖게 되므로, 본 명세서에서는 이를 펩티바디(peptibody)로 명명한다.
일 구체예에서, 상기 펩티바디는 도 15의 구조를 갖는 것일 수 있다. 도 15의 구조체는 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드 4개가 링커 (GGGS)로 연결된 펩타이드 반복체가 Fc 단편의 N 말단과 C 말단에 각각 링커 (GGGS)로 연결된 폴리펩타이드 분자 2개가 Fc 단편에서 연결되어 있는 구조이다.
상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드 뿐 아니라, 이를 포함하는 펩티바디(폴리펩타이드 분자 또는 폴리펩타이드 복합체) 역시 Ang2와 인테그린 간의 결합을 유의적으로 저해한다(도 16 내지 22 참조).
상기 폴리펩타이드 분자 또는 폴리펩타이드 복합체 내의 구조적 기능을 하는 제2 펩타이드가 고유의 CDR을 포함하는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄인 경우, 상기 폴리펩타이드 분자 또는 폴리펩타이드 복합체는 Ang2-인테그린 간 결합 저해 효과에 더하여 상기 항체가 고유하게 가지는 항원 특이적 효과를 추가로 발휘할 수 있다.
따라서, 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 폴리펩타이드 분자, 및/또는 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체는 Ang2와 인테그린 간 결합 저해 활성이 우수하며, 이로 인하여 Ang2 활성화 및/또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질환 (예컨대, 암, 암 전이, 안질환, 염증성 질환 등)에 우수한 예방 및/또는 치료 효과를 갖는다.
본 발명의 다른 예는 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 Ang2와 인테그린 간 결합 저해용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치료적 유효량을 Ang2와 인테그린 간 결합 저해를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 Ang2와 인테그린 간 결합 저해 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 투여 단계 이전에 Ang2와 인테그린 간 결합 저해를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 예는 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 Ang2와 인테그린 간 결합 저해를 위한 용도, 또는 Ang2와 인테그린 간 결합 저해용 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 예는 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치료적 유효량을 Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 투여 단계 이전에 암 및/또는 암 전이의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 예는 상기 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 용도, 또는 Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물의 제조를 위한 용도를 제공한다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물 내의 유효성분의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 약학 조성물의 1일 투여량은 유효성분을 기준으로 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 또한 상기 치료적 유효량 또는 약학적 유효량은 유효성분이 소정의 활성, 즉 Ang2와 인테그린 간 결합 저해 활성 또는 암 및/또는 암 전이의 예방 및/또는 치료 활성을 나타낼 수 있는 투여량을 의미한다.
상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병은 암, 암 전이, 황반 변성(예컨대, 노인성 황반 변성) 등의 안질환, 패혈증, 건선, 급성 장기 부전 등의 염증성 질환 등일 수 있다.
상기 암은 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되거나 촉진되는 모든 암을 포함할 수 있으며, 예컨대 고형암일 수 있다. 구체적으로, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 예에서, 인테그린의 Ang2 결합 수용체로서의 용도를 이용하여, Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병(예컨대, 암 및/또는 암 전이)의 예방 및/또는 치료를 위한 후보 물질의 스크리닝 방법이 제공된다.
구체적으로, 상기 스크리닝 방법은
인테그린 발현 세포 또는 인테그린이 코팅된 표면을 준비하는 단계;
상기 세포 또는 표면에 안지오포이에틴-2(Ang2)을 처리하여 반응시키는 단계;
상기 반응물 중 일부에 시료 물질을 처리하는 단계; 및
상기 시료 물질을 처리한 반응물과 상기 시료 물질을 처리하지 않은 반응물에서의 Ang2와 인테그린 간 결합 정도를 측정하는 단계
를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 스크리닝 방법은
안지오포이에틴-2(Ang2)이 코팅된 표면을 준비하는 단계;
상기 표면에 인테그린을 표면 발현하는 세포 또는 인테그린을 처리하여 반응시키는 단계;
상기 반응물 중 일부에 시료 물질을 처리하는 단계; 및
상기 시료 물질을 처리한 반응물과 상기 시료 물질을 처리하지 않은 반응물에서의 Ang2와 인테그린 간 결합 정도를 측정하는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 스크리닝 방법에서 상기 시료 물질을 처리한 반응물에서의 Ang2와 인테그린 간 결합 정도가 시료 물질을 처리하지 않은 반응물에서의 Ang2와 인테그린 간 결합 정도보다 낮은 경우, 상기 시료 물질을 Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병의 예방 또는 치료를 위한 후보 물질로 결정할 수 있다.
상기 시료 물질은 인공적으로 합성되거나 천연의 각종 화합물, 항체, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, shRNA(short hairpin RNA), siRNA(small interference RNA), 압타머, 천연물 추출물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 Ang2와 인테그린 간 결합 정도는 통상적인 모든 방법으로 측정 가능하며, 예컨대 flow cytometry나 ELISA 방법 등으로 측정할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인테그린 또는 Ang2가 코팅된 표면은 단백질을 코팅할 수 있는 표면이면 특별한 제한이 없으며, 플라스틱, 유리, 금속, 고분자 수지, 등 통상적으로 사용되는 모든 재질의 고형 또는 반고형 표면일 수 있다.
다른 예는 상기 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 인테그린 검출용 조성물을 제공한다. 다른 예는 시료에 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 분자 및 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 폴리펩타이드 복합체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 처리하는 단계 및 상기 펩타이드와 결합하는 단백질의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는 인테그린 검출 방법을 제공한다.
상기 시료는 생체로부터 분리된 세포, 조직, 체액 등이거나, 그 외 단백질 혼합물일 수 있다. 상기 펩타이드와 단백질의 존재 여부는 통상적인 단백질-펩타이드 결합 검출 방법에 의하여 측정할 수 있으며, 예컨대 flow cytometry나 ELISA 방법 등에 의하여 측정할 수 있다.
본 발명에서 제시되는 Ang2-인테그린 간의 결합을 효과적으로 차단할 수 있는 펩타이드는 Ang2와 인테그린 간 결합을 저해함으로써 Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 질병의 치료 효과, 예컨대, 암세포의 이동/침투/전이뿐 아니라 혈관내피세포의 이동/침투에도 유효한 저해 효과를 나타낼 수 있다. 또한 이 펩타이드는 여러 생물학적 제재 (biologics)에 융합 형태로 사용 가능함으로, 향후 암을 치료함에 있어 펩타이드 단독으로의 유용성 외에도 다양한 다른 치료제와의 병용 또는 융합 형태로도 사용 가능하다.
도 1은 Tie2를 발현하지 않는 뇌암세포주(U87MG)를 이용한 세포 부착 실험 설계를 모식적으로 보여주는 그림이다.
도 2는 Ang2 코팅된 웰에서의 U87MG 부착 정도를 보여주는 그래프이다 (ALU: arbitrary light unit).
도 3은 U87MG 세포주에서 Tie2 발현 여부를 확인한 결과이다.
도 4는 Ang2의 결합에 의한 U87MG 세포의 형태 변화를 관찰한 결과이다.
도 5는 인테그린에 FLAG 태깅된 Ang2(FLAG-Ang2)의 in vitro 결합 정도를 발색반응 결과로 보여주는 그래프이다.
도 6은 인테그린과 FLAG-Ang2의 세포막 상에서의 결합 정도를 cell flow cytometry data로 분석한 결과를 보여주는 것으로, y축은 트랜스펙션 마커인 GFP 발현 여부를 나타내고, x축은 Ang2 결합 정도를 보여주며, 붉은 점은 각 y축 구간에 해당하는 여러 세포들의 Ang2 결합 정도에 대한 평균을 나타낸다.
도 7은 상기 도 6의 결과를 linear-log scale의 그래프로 보여주는 것이다.
도 8은 Ang2와 U87MG 세포 부착 저해하는 Ang2 유래 펩타이드를 동정하기 위한 실험 설계를 모식적으로 보여주는 그림이다.
도 9는 Ang2 유래 펩타이드의 아미노산 서열(표)과, Ang2의 입체 구조(그림)를 보여주는 것으로, 표의 왼쪽 노란색, 초록색 또는 붉은색으로 표시된 아미노산 서열의 위치는 그림에서 동일한 색으로 나타낸 부위이다.
도 10은 도 9의 표에 기재된 41개의 Ang2 유래 펩타이드 처리에 따른 Ang2 코팅된 웰에서의 U87MG 세포 부착 저해 정도를 보여주는 그래프이다.
도 11은 Ang2 단백질과 이의 변이체(Q362A) 의 Ang2-인테그린 결합 정도를 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 12는 Ang2 단백질과 이의 변이체(Q362A) 처리시의 Ang2-Tei2 결합 정도를 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 13은 Ang2 유래 펩타이드 (15번)의 Ang2 입체 구조상의 위치를 보여주는 그림이다.
도 14는 Ang2 단백질과 이의 변이체(Q362A) 처리시의 U87MG 세포의 이동 정도를 보여주는 그래프(왼쪽) 및 형광 사진(오른쪽)으로, 상기 펩타이드의 세포 침투(cell invasion) 저해 정도를 보여준다.
도 15는 일 예에 따른 펩티바디 (C-body)의 구조를 모식적으로 보여주는 그림이다.
도 16은 Ang2 유래 펩타이드 (15번)를 포함하는 C-body 처리시의 Ang2 코팅된 웰에서의 U87MG 세포주 부착 저해 정도를 보여주는 그래프이다.
도 17은 인테그린과 FLAG-Ang2의 세포막 상에서의 결합 정도를 cell flow cytometry data로 분석한 결과(위) 및 상기 결과를 linear-log scale의 그래프(아래)로 보여주는 것이다.
도 18은 라이신, Ang2, 또는 피브로넥틴 코팅한 웰에서 C-body를 처리하거나 처리하지 않고 U87MG 세포주 부착시킨 후 FAK 인산화 정도를 웨스턴블라팅으로 측정한 결과를 보여준다.
도 19는 C-body 처리시의 Ang2-Tei2 결합력을 ELISA로 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 20은 Ang2와 함께 C-Body 또는 Fc (대조군)을 처리시의 림프관내피세포의 이동 정도를 시간에 따라서 나타낸 그래프이다.
도 21은 Ang2와 함께 C-Body 또는 Fc (대조군)을 처리시의 림프관내피세포의 하부 챔버로의 이동 정도를 세포 이동 유도 24시간 후에 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 C-body를 처리 시의 인테그린 (αVβ3)과 Ang2 간의 결합 정도를 C-body 농도에 따라 보여주는 그래프이다.
이하 하기의 실시예를 본 발명을 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐이며, 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: Tie2 가 발현되지 않은 뇌암세포주( U87MG )의 Ang2 의존적 세포 부착 확인
1.1. U87MG 의 Ang2 의존적 세포 부착 확인
인테그린을 발현하고 Tie2를 발현하지 않는 것으로 알려진 U87MG 세포주의 Angiopoietin-2 (이하 Ang2) 의존적 세포 부착을 시험하여, Ang2가 Tie2 이외에 다른 수용체와 결합함을 확인하였다 (도 1 참조).
구체적으로, Ang2(R&D systems; 623-AN-025/CF)를 인산완충용액(Phosphate buffered saline; PBS)에 10 ug/ml의 농도로 희석시킨 용액 100 ul 를 96 웰플레이트에 처리하고 4℃에서 16시간동안 인큐베이션하여 웰을 Ang2로 코팅하였다. 이후 Ang2 코팅된 96 웰을 PBS로 2회 세척하고, 2%(v/v) 우혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)을 포함하는 PBS 200 ul를 처리하여 실온에서 2시간동안 인큐베이션하여 블라킹하였다. 음성대조군으로 Ang2 코팅 없이 블라킹만 된 웰(BSA만 처리)을 준비하였다.
블라킹 과정 중, T75 플라스크에서 약 70~80% 정도의 confluency를 보이는 뇌암세포주 U87MG(ATCC, HTB-14TM)을 트립신처리(trypsinize)하여 떼어낸 후, 무혈청 배지(serum-free media; IMDM, invitrogen)로 2회 세척하고, 10 ml 의 무혈청 배지에 약 3 x 105 cells/ml의 농도로 재현탁하였다. 상기 얻어진 세포 현탁액 150 ul를 앞서 준비된 코팅 및 블라킹 과정이 끝난 96 웰플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 37℃의 CO2 인큐베이터에서 2시간동안 인큐베이션하여 세포 부착을 유도하였다.
이후 37℃로 데워진 무혈청 배지로 4회 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 세포의 부착정도는, IMDM에 1:1로 희석된 CellTiter-Glo reagent (Promega) 200ul를 첨가한 후 10분 후에 EnVision
Figure 112012084922451-pat00001
Multilabel Reader (PerkinElmer)에서 발광 정도(luminescence)를 측정하여 정량화하였다.
상기 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 음성 대조군으로 준비된 BSA만을 처리한 웰에서 U87MG 세포 부착이 거의 일어나지 않은 반면, Ang2가 부착된 웰에서는 현저하게 높은 수준으로 U87MG 세포 부착이 일어남을 확인할 수 있다.
1.2. U87MG 에서의 Tie2 발현 여부 확인
상기 실시예 1.1에서 사용된 U87MG 세포주에서 실제 Tie2이 발현되지 않는지를 확인하였다. 이를 위하여, U87MG 세포주(ATCC, HTB-14TM)의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 실험법으로 전개하고 nitrocellulose paper에 transfer 한 후, Tie2에 대한 항체(santa cruz biotechnology, SC-324)를 처리하여 western blot 방법을 수행하였다. Tie2를 발현하는 것으로 잘 알려진 혈관내피세포주 Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC; ATCC, CRL-1730TM)을 양성 대조군으로 사용하였다. GAPDH는 gel에 loading된 총 단백질 양에 대한 control로 사용하였다.
상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, U87MG 세포주는 Tie2를 발현하지 않음을 알 수 있다.
실시예 2. Ang2 의 결합에 의한 U87MG 세포의 형태 변화 시험
Ang2에 의한 세포의 형태 변화를 관찰하기 위하여, μ-Slide 8 well (ibidi GmbH)의 각각 웰을 폴리-L-라이신(Sigma-Aldrich) 100 ug/ml, 피브로넥틴 (Sigma-Aldrich) 10 ug/ml, 또는 Ang2 (R&D systems) 10 ug/ml을 사용하여 상기 실시예 1.1의 방법으로 각각 코팅하고, 2 % BSA로 blocking한 후, 상기 실시예 1.1과 동일하게 준비된 U87MG cell 현탁액 150 ul을 첨가하여 37℃의 CO2 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 37℃로 데워진 무혈청 배지로 4회 세척하여 부착되지 않은 세포들은 세척으로 제거하고, 부착된 세포는 4% formaldhyde를 첨가 후 15분간 실온에서 인큐베이션하여 고정하였다. 부착된 Rhodamine-phalloidin(Life Technologies)과 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole, Sigma-Aldrich)를 이용하여 fibrous actin (f-actin, 녹색)과 핵 (빨간색)을 염색한 후 형광형미경으로 관찰하였다.
상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 전기적인 힘으로 세포를 단순하게 붙이는 폴리-L-라이신으로 코팅된 경우와는 Ang2를 코팅한 경우 f-actin이 밀집하여 존재하는 방사형의 뾰족한 돌출 부위가 다수 관찰되었다. 이는 인테그린의 대표적인 ligand로 알려져 있는 피브로넥틴을 코팅한 경우에 관찰되는 stress fiber나 focal adhesion와는 다른 독특한 구조로 Ang2와 인테그린의 결합은 f-actin 의존적으로 세포막의 돌출을 유도하여 다른 조직으로의 침투를 용이하게 할 수 있음을 보여 준다.
실시예 3. Ang2 와 인테그린 간 결합 확인 ( in vitro )
3종의 인테그린(integrin; alpha5beta1(α5β1; α5: NCBI Accession No. P08648, β1: NCBI Accession No. P05556), alphaVbeta1(αVβ1; αV: NCBI Accession No. P06756, β1: NCBI Accession No. P05556), 및 alphaVbeta3(αVβ3; αV: NCBI Accession No. P06756, β3: NCBI Accession No. P05106); R&D systems) 단백질을 5 ug/ml의 농도로 PBS에 희석한 희석액을 ELISA 플레이트에 코팅한 후 (18시간, 4℃), 1%(v/v) BSA로 상온에서 2시간동안 블라킹하였다. 이후, FLAG 서열 (DYKDDDDK, Sigma)이 N-terminal에 태깅되어 있는 Ang2 단백질 (FLAG-Ang2, PBS에 10 ug/ml의 농도로 희석된 Ang2 단백질 용액 0.1 ml)을 처리하여 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, PBS-t (0.1%(v/v) triton X-100 in PBS)로 5회 세척하였다. 그 후, horse radish peroxidase (HRP)가 접합(conjugation)되어 있는 항-FLAG 항체(Sigma)를 첨가하여 반응시키고, 다시 PBS-t로 5회 세척하였다. TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine)를 HRP의 기질로 사용한 발색반응을 통해 ELISA 플레이트내 남아있는 항-FLAG 항체의 양을 측정함으로써 간접적으로 Ang2와 상기 3종의 인테그린 간의 결합을 확인하였다. 음성 대조군으로 Ang2 단백질 처리 없이 블라킹(BSA 처리)만 된 것을 사용하였다.
상기 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, Ang2 단백질이 상기 3종의 인테그린과 모두 결합함을 확인할 수 있다.
실시예 4. Ang2 와 인테그린 간 세포막에서의 결합 확인
Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포주(한국생명공학연구원 생명자원센터)에 트랜스펙선 마커로서 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein; GFP)을 encoding하는 cDNA(pTRACERTM-CMV2, Invitrogen)와 각 인테그린(α5β1, αVβ1, 및 αVβ3)의 cDNA 쌍을 lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen)을 사용하여 제조사의 추천 실험 방법을 따라 트랜스펙션하였다. Transfection에 사용된 각 cDNA (integrin α5, αV, β1, β3 4종)는 Origene에서 구입하여 polymerase chain reaction 해당 open reading frame을 증폭하고 pcDNA3.1(+)/myc-His A (invitrogen)에 cloning 하였다.
트랜스팩션을 한 세포는 24시간 동안 정상 세포 배양 조건 (IMDM에 10%의 10% Fetal Bovine Serum과 Penicillin/streptomycin이 포함되어 있는 배지, 37?의 CO2 인큐베이터)에서 배양하였다.
그 이후 세포들을 상기 실시예 1.1의 방법을 이용하여 떼어내어 무혈청배지(IMDM)에 약 2x107 cells/ml 로 재현탁하고, 이 세포 용액 45 ul에 PBS에 200 ug/ml 농도로 희석된 FLAG-Ang2 5 ul와 섞은 후 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 세포들은 3%(v/v) 포름알데히드로 고정시키고 IMDM으로 세척한 후, 다시 R-Phycoerythrin을 접합시킨 항-FLAG 항체(Sigma)로 염색하여, flow cytometry로 분석하였다.
상기 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다. 도 6의 dot plot에서 y축은 트랜스펙션 마커인 GFP 발현 여부를, x축은 Ang2 결합 정도를 보여준다. 빨간점은 각 y축 구간에 해당하는 여러 세포들에서의 인테그린과 Ang2과의 결합 정도에 대한 평균을 나타낸다. 각 그래프의 윗부분의 빨간점이 이루는 선의 기울기가 낮을수록 Ang2와의 결합 정도가 높음을 나타낸다. 상기 도 6에 나타난 Ang2 결합 정도를 보다 명확하게 나타내기 위하여, 도 6 중의 빨간점을 linear-log scale의 그래프로 다시 작성하여 도 7에 나타내었다. 도 7에서, 세포막에서 Ang2가 3종의 인테그린에 결합하는 양상을 보였으며 특히 α5β1에 더욱 잘 결합함을 확인할 수 있다. 반면, 음성 대조군으로 사용한 integrin 없는 vector만 트랜스팩션한 세포의 경우는 인테그린과의 결합이 GFP 발현 여부와 무관하였으므로, Ang2는 발현시킨 인테그린에 특이적으로 결합함을 나타낸다.
실시예 5. Ang2 유래 펩타이드 제작 및 상기 펩타이드의 Ang2 와 인테그린 간 결합 저해 시험
5.1. Ang2 유래 펩타이드 제작
Ang2 단백질 (O15123; 서열번호 42) 중에서 Tie2와의 결합에 관여하는 Ang2의 도메인인 Receptor binding domain(RBD)에서 유래하는 펩타이드를 제작하였다. 보다 구체적으로 상기 서열번호 42의 Ang2 단백질의 282번째부터 496번째까지의 아미노산 서열 내의 연속하는 15개의 아미노산을 갖고, 이 중 10개의 아미노산이 인접하는 펩타이드와 중복되도록 총 41개의 펩타이드를 설계하였다. 이들 펩타이드의 아미노산 서열을 아래의 표 2에 나타내었다.
서열번호 펩타이드의 아미노산 서열 서열번호 펩타이드의 아미노산 서열
1 RDCAE VFKSG HTTNG 21 EAYSL YEHFY LSSEE
2 VFKSG HTTNG IYTLT 22 YEHFY LSSEE LNYRI
3 HTTNG IYTLT FPNST 23 LSSEE LNYRI HLKGL
4 IYTLT FPNST EEIKA 24 LNYRI HLKGL TGTAG
5 FPNST EEIKA YCDME 25 HLKGL TGTAG KISSI
6 EEIKA YCDME AGGGG 26 TGTAG KISSI SQPGN
7 YCDME AGGGG WTIIQ 27 KISSI SQPGN DFSTK
8 AGGGG WTIIQ RREDG 28 SQPGN DFSTK DGDND
9 WTIIQ RREDG SVDFQ 29 DFSTK DGDND KCICK
10 RREDG SVDFQ RTWKE 30 DGDND KCICK CSQML
11 SVDFQ RTWKE YKVGF 31 KCICK CSQML TGGWW
12 RTWKE YKVGF GNPSG 32 CSQML TGGWW FDACG
13 YKVGF GNPSG EYWLG 33 TGGWW FDACG PSNLN
14 GNPSG EYWLG NEFVS 34 FDACG PSNLN GMYYP
15 EYWLG NEFVS QLTNQ 35 PSNLN GMYYP QRQNT
16 NEFVS QLTNQ QRYVL 36 GMYYP QRQNT NKFNG
17 QLTNQ QRYVL KIHLK 37 QRQNT NKFNG IKWYY
18 QRYVL KIHLK DWEGN 38 NKFNG IKWYY WKGSG
19 KIHLK DWEGN EAYSL 39 IKWYY WKGSG YSLKA
20 DWEGN EAYSL YEHFY 40 WKGSG YSLKA TTMMI
41 YSLKA TTMMI RPADF
또한 상기 펩타이드의 Ang2 단백질의 3차 구조에서의 위치를 도 9에 나타내었다.
5.2. 상기 펩타이드의 Ang2 와 인테그린 간 결합 저해 시험
실시예 1.1에서와 같은 방법으로 Ang2를 코팅한 플레이트에 U87MG 세포 처리할 때, 상기 표 2의 Ang2에서 유래한 41개 펩타이드 중 하나를 함께 처리하여 각 펩타이드 처리에 따른 U87MG 세포의 부착 저해 효과를 살펴보았다(도 8 참조). 각 펩타이드는 100 ug/ml의 농도로 처리하고, U87MG 세포 개수는 각 펩타이드 당 약 4 x 104 개로 하였다. 세포 부착 정도의 측정은 상기 실시예 1.1과 동일하게 하였다. 즉, IMDM에 1:1로 희석된 CellTiter-Glo reagent (Promega) 200ul를 첨가한 후 10분 후에 EnVision
Figure 112012084922451-pat00002
Multilabel Reader (PerkinElmer)에서 발광 정도(luminescence)를 측정하여 정량화하였다.
상기 얻어진 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에서 확인되는 바와 같이, 표 2의 펩타이드 중 서열번호 3, 4, 15, 및 24의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 처리시 아무것도 처리하지 않은 경우 (+로 표시)에 비해 Ang2 의존적인 세포 부착이 50% 이상 감소하였다. Ang2가 코팅되지 않고 BSA로 블라킹만 한 경우 (-로 표시)를 음성 대조군으로 사용하였다.
실시예 6. Ang2 유래 펩타이드의 활성 시험
상기 실시예 5.2에서 Ang2 의존적 세포 부착 저해 활성이 가장 우수한 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 (이하, '펩타이드 15'로 칭함)의 Ang2 단백질의 3차 구조 상의 위치를 도 13에 나타내었다 (도 13의 아미노산 서열 중 녹색 음영 부분이 펩타이드 15임). 도 13에서 알 수 있는 바와 같이, 펩타이드 15는 Ang2 단백질의 352번째부터 366번째까지의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 이 중에서 Ang2 단백질의 362번째 아미노산에 해당하는 글루타민(Q)의 측쇄가 Ang2 단백질의 3차 구조에서 외부에 노출되어 있다.
본 실시예에서는 인테그린 결합 부위가 펩타이드 15번 부위임을 재확인하기 위하여, Ang2 단백질의 3차 구조 상에서 외부에 노출된 아미노산 잔기인 362번째 아미노산인 글루타민(Q)이 알라닌(A)으로 치환된 변이체 (이하 'Q362A'로 기재)와 치환되지 않은 Ang2 단백질의 활성을 비교하였다.
우선, Ang2 단백질의 아미노산 서열(서열번호 42) 중 362번에 해당하는 글루타민을 알라닌으로 치환하고, FLAG 태그로 표지하여 FLAG-Ang2 단백질 변이체(Q362A)를 제작하였다. 상기 실시예 3과 같은 방법으로, 인테그린(αVβ3)을 ELISA 플레이트에 코팅한 후, 여기에 야생형 Ang2 단백질(서열번호 42)과 Q362A Ang2 단백질을 각각 5 ug/ml로 처리하여 인테그린에 대한 결합 정도를 비교하였다.
상기 얻어진 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11의 그래프의 Y축은 코딩되어 있는 integrin αVβ3나 음성 대조군인 BSA 에 각 Ang2 단백질들이 결합한 정도를 나타낸다. 도 11에서와 같이, Q362A 변이체의 인테그린과의 결합 정도는 야생형 Ang2 펩타이드의 인테그린과의 결합 정도의 약 50% 이하인 것으로 나타나, Ang2 펩타이드의 Q362A 변이가 Ang2-인테그린 결합을 50 이상 저해하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 상기 변이 부위가 인테그린과 Ang2와의 결합 부위임을 확인시키는 것이다. 도 11에서 BSA는 인테그린이 코팅되지 않고 BSA로 블라킹만 된 음성 대조군을 의미한다.
인테그린 대신 tie2 단백질(Q02763, R&D systems) 를 ELISA 플레이트에 코팅하여, 상기와 동일한 방법으로 Ang2-tie2 결합을 관찰하여, 그 결과를 도 12에 나타내었다. Y축은 코딩되어 있는 Tie2 나 음성 대조군인 BSA 에 각 Ang2 단백질들이 결합한 정도를 나타낸다. 도 12에서와 같이, Q362A 변이체와 Tie2와의 결합 정도는 야생형 Ang2 펩타이드와 Tie2와의 결합 정도와 별다른 차이 없는 것으로 나타났으며, 이는 상기 변이 부위가 tie2-Ang2 결합에는 관여하지 않음을 의미하는 것이다.
상기 도 11과 도 12의 결과는 Ang2 펩타이드의 변이 부위(Ang2 아미노산 서열 중 362번째 아미노산 부위)가 인테그린에 특이적인 결합 부위임을 확인시키는 것이라 할 수 있다.
실시예 7. 암세포 침투( invasion ) 시험
이틀동안 serum starvation 해준 U87MG 세포를 세포 해리 용액(cell dissociation solution, EDTA 용액)을 이용해 떼어낸 뒤, 0% serum IMDM 배지에 희석하여, 7.5x104개씩 Matrigel-coated transwell chamber (24well, BD bioscience)의 상부 챔버에 처리하였다. 하부 챔버는 야생형 Ang2 단백질 또는 이의 Q362A 변이체(실시예 6 참조)를 2% serum IMDM 배지에 5 ug/ml의 농도로 희석한 희석액을 채워주었다. 48시간이 지난 후, Calcein-AM 용액 (4ug/ml; BD Biosciences)을 이용하여 세포를 염색하고 형광현미경으로 관찰하여, 아래쪽으로 침투된 세포의 수를 측정하였다.
상기 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14의 왼쪽은 하부챔버로 이동한 세포 수를 그래프로 나타낸 것이고, 오른쪽은 하부 챔버로 이동한 세포를 형광처리하여 형광 현미경으로 관찰한 결과이다. 도 14 중 '-'는 하부 챔버에 Ang2 단백질 또는 이의 변이체를 처리하지 않은 음성 대조군이다. 도 14에서, 야생형 Ang2 단백질과 비교하여 이의 Q362A 변이체는 암세포 침투의 유도 정도가 현저하게 낮은 것을 알 수 있다 (약 절반 수준). 이러한 결과는 인테그린에 특이적인 Ang2 단백질의 변이 부위(Ang2 아미노산 서열 중 362번째 아미노산 부위)가 암세포 침투 (또는 이동)에 관여함을 의미하고, 더 나아가 Ang2와 인테그린의 결합이 암세포 이동 및 전이에 관여함을 의미하는 것이라고 할 수 있다.
실시예 8. 펩티바디 (C- body ) 제작
Ang2 펩타이드 15를 반복적으로 포함하는 펩타이드를 면역글로블린 Fc 단편 (immunoglobulin Fc fragment)의 N-말단 또는 C-말단 부위에 부착하여 펩티바디 (이하 'C-body'로 명명)를 제작하였다 (도 15 참조).
이와 같이, Ang2 펩타이드 15가 반복적으로 포함된 C-body 형태로 사용되는 경우 낮은 농도(예컨대, 5ug/ml 정도)에서도 우수한 세포 부착 저해 효과를 나타낼 수 있다.
상기 C-body 제작 과정을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 상기 실시예 5.2에서 Ang2-의존적 세포 부착 저해 활성이 우수한 펩타이드 15를 선택하여, N-말단부터 펩타이드 15와 링커가 번갈아가며 4회 반복적으로 위치하는 단편, 즉 N 말단-펩타이드 15-링커-펩타이드 15-링커-펩타이드 15-링커-펩타이드 15-링커-C 말단 구조의 Ang2 유래 펩타이드-링커 반복체 단편을 제작하였다. 이와 유사하게 N 말단-링커-펩타이드 15-링커-펩타이드 15-링커-펩타이드 15-링커-펩타이드 15-C 말단 구조의 링커-펩타이드 반복체 단편 또한 제작하였다. 본 실시예에서 C-body 제작을 위하여 사용된 링커의 아미노산 서열은 'Gly-Gly-Gly-Ser'이다.
상기 제작된 Ang2 유래 펩타이드-링커 반복체 단편 중 하나의 C 말단 (링커 부분)을 인간 면역글로블린G1 (human IgG1) Fc 단편의 N 말단에, 또 다른 하나의 N 말단 (링커 부분)을 상기 면역글로불린 Fc 단편의 C 말단에 융합시켜, (Ang2 유래 펩타이드-링커 반복체 단편)-(Fc 단편)-(Ang2 유래 링커-펩타이드 반복체 단편)의 구조를 갖는 구조체를 제작하였다. 상기 제작된 구조체는 Fc가 dime를 이루는 성질로 인해 세포내의 생산 중 도 15의 구조를 갖게 된다.
실시예 9. C- body 의 Ang2 의존적 세포 부착 저해 활성 시험
실시예 1.1에서와 같은 방법으로 Ang2를 코팅한 플레이트에 U87MG 세포 처리하고, 상기 세포 처리시에 상기 실시예 8에서 제작된 C-body를 함께 처리하여, C-body 처리에 따른 U87MG 세포의 부착 저해 효과를 살펴보았다. C-body는 20ug/ml 또는 5 ug/ml의 농도로 처리하고, 사용된 U87MG 세포 개수는 각 농도 당 약 4 x 104 개로 하였다.
세포 부착 정도를 실시예 1.1과 동일한 방법으로 측정하여, 도 16에 나타내었다. 도 16에서 확인되는 바와 같이, C-body 처리시, 처리하지 않은 경우(0ug/ml)와 비교하여, 세포 부착이 현저하게 저해됨을 알 수 있다.
실시예 10. C- body 의 Ang2 - 인테그린 결합 저해 활성 시험
인테그린(α5β1)의 cDNA와 GFP를 공동 트랜스펙션시킨 CHO 세포에 FLAG-Ang2 처리 시에 10ug/ml의 C-body를 함께 처리하는 것을 제외하고 실시예 4와 동일한 방법으로 실험하여 flow cytometry로 분석한 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17의 상단 그래프에서 y축은 트랜스펙션 마커인 GFP 발현 여부를, x축은 인테그린(α5β1)와 Ang2와의 결합 정도를 보여준다. 빨간점은 각 y축 구간에 해당하는 여러 세포들에서의 인테그린과 Ang2과의 결합 정도에 대한 평균을 나타낸다. 각 그래프의 윗부분의 빨간점을 이은 선의 기울기가 낮을수록 Ang2와의 결합 정도가 높음을 나타낸다. 도 17 상단 그래프 중의 도 6 중의 빨간점을 linear-log scale의 그래프로 다시 작성하여 하단의 그래프로 나타내었다. 도 17에서 확인되는 바와 같이, C-body 처리에 의하여 Ang2와 인테그린 간의 결합이 현저하게 저해됨을 알 수 있다. Vector는 아무런 gene을 발현하지 않는 음성 대조군에 해당한다.
또한, FLAG-Ang2 처리시에 0ug/ml, 0.8ug/ml 및 4ug/ml의 C-body를 처리하는 것을 제외하고 실시예 3과 동일한 방법으로 실험하여, 인테그린 (αVβ3)과 Ang2 간의 결합 정도를 확인하여, 그 결과를 도 22에 나타내었다. 도 22에서 보여지는 바와 같이, C-body가 인테그린 (αVβ3)과 Ang2 간의 결합을 농도 의존적으로 저해함을 확인할 수 있다.
실시예 11. C- body 의 Ang2 - 인테그린 결합에 의한 신호 전달 저해 활성 시험
상기 실시예 2에서와 동일한 방법으로, 6 웰을 폴리-L-라이신 100ug/ml, Ang2 10ug/ml, 또는 Fibronectin 10ug/ml로 각각 코팅하고 2%(v/v) BSA로 블라킹 한 표면에 2ml의 U87MG 세포 현탁액 (약 3 x 105 cell/ml)를 첨가하여 세포 부착 시험을 수행하였다. 세포 첨가 시에 각각의 코팅 조건에 대하여 5 ug/ml의 C-body를 처리하거나 처리하지 않았다. 2시간 동안 37℃의 CO2 인큐베이터에서 세포부착을 유도한 후, 부착된 세포와 부착되지 않은 세포를 모두 수거하여 397번 tyrosine이 인산화되어 있는 FAK만 인식하는 항체 (Life Technologies)나 910번 serine이 인산화되어 있는 FAK만 인식하는 항체 (Life Technologies)를 이용한 웨스턴블라팅으로 FAK의 인산화 정도를 알아 보았다.
상기 얻어진 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18에서 알 수 있는 바와 같이, 세가지의 코팅 조건 모두에서 C-body의 유무에 따라 전체 FAK (focal adhesion kinase)의 발현 정도 (세번째 패널) 나 FAK의 910번 Serine의 인산화 (두번째 패널)는 큰 차이가 없었으나, integrin의 clustering으로 인해 autophosphorylation되는 397번 tyrosine의 인산화는 Ang2 코팅 조건에서만 C-body에 의해 크게 감소하였다. 이는 C-body가 Fibronectin과 Integrin의 결합은 저해하지 않고 Ang2-Integrin 결합만을 선택적으로 저해한다는 것을 의미함과 동시에, Ang2-Integrin 결합은 FAK의 phophorylation과 같은 인테그린 의존적 신호전달을 야기할 수 있음을 의미한다. GAPDH는 gel에 loading된 총 단백질 양에 대한 control로 사용하였다.
실시예 12. C- body 의 Ang2 - Tei2 결합 저해 여부 시험
실시예 6에서와 같이, tie2가 코팅된 ELISA 플레이트에 FLAG-Ang2 (5 ug/ml) 100 ul를 넣어 인큐베이션하는 동안, 상기 실시예 8에서 제작된 C-body 를 5 ug/ml의 농도로 처리하거나 처리하지 않고 시험하여, C-body의 존재 유무에 따른 Ang2-Tie2 결합의 변화를 살펴 보았다.
상기 얻어진 결과를 도 19에 나타내었다. 도 19에서 보여지는 바와 같이, Ang2와 Tie2 결합력 측정시 C-body가 포함되어 있지 않은 경우 (-로 표시한 dark-gray), 및 포함되어 있는 경우 (C-body로 표시한 light gray) 모두에서 Ang2-Tie2 결합에 유의미한 차이를 보이지 않았다. 따라서, 상기 C-body는 Tei2와 Ang2의 결합에 대해서는 저해 효과를 나타내지 않았다. 즉, C-body는 인테그린과 Ang2의 결합만을 선택적으로 저해함을 확인할 수 있다.
실시예 12. C- body 의 림프관내피세포(LEC)의 이동 억제 활성 시험
CIM-플레이트16 (GE healthcare)의 하부 챔버의 각 웰에 2%(v/v) 우태아혈청(FBS)가 첨가된 EBM 배지(Lonza)에 2 ug/ml Ang2와 함께 상기 실시예 8에서 제작된 C-Body 10 ug/ml 또는 음성 대조군인 Fc 10 ug/ml (human IgG1)을 넣은 뒤 피브로넥틴 코팅된 상부 챔버와 조립하였다. 무혈청 배지로 재현탁된 림프관내피세포(lymphatic endothelial cell, LEC; Lonza)를 각 well에 40,000 개씩 넣어 주고 xCelligence Realtime cell analyzer (GE Healthcare)에 장착하여 30시간 동안 상부 챔버와 하부 챔버 간의 임피던스(impedance) 측정값을 표시하여 세포 이동을 정량화하였다.
상기 얻어진 결과를 도 20 및 21에 나타내었다. 도 20은 시간에 따른 세포 이동 정도를 나타내는 것이고, 도 21은 세포 이동을 유도하고 24시간 후의 세포 이동 정도를 막대 그래프로 나타낸 것이다. 도 20 및 21에 기재된 control은 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군을 의미한다.
도 20 및 21에 나타난 바와 같이, C-body 처리에 의하여 암세포 이동이 control 수준으로 현저하게 감소한 것을 알 수 있다.
<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO., LTD. <120> Peptides for inhibition of binding between angiopoietin-2 and integrin and uses thereof <130> DPP20126141KR <160> 44 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 1 <400> 1 Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 2 <400> 2 Val Phe Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 3 <400> 3 His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn Ser Thr 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 4 <400> 4 Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 5 <400> 5 Phe Pro Asn Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 6 <400> 6 Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 7 <400> 7 Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile Gln 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 8 <400> 8 Ala Gly Gly Gly Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 9 <400> 9 Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 10 <400> 10 Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln Arg Thr Trp Lys Glu 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 11 <400> 11 Ser Val Asp Phe Gln Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 12 <400> 12 Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 13 <400> 13 Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 14 <400> 14 Gly Asn Pro Ser Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 15 <400> 15 Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 16 <400> 16 Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg Tyr Val Leu 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 17 <400> 17 Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 18 <400> 18 Gln Arg Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 19 <400> 19 Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr Ser Leu 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 20 <400> 20 Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr 1 5 10 15 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 21 <400> 21 Glu Ala Tyr Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu 1 5 10 15 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 22 <400> 22 Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg Ile 1 5 10 15 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 23 <400> 23 Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly Leu 1 5 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 24 <400> 24 Leu Asn Tyr Arg Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly 1 5 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 25 <400> 25 His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile 1 5 10 15 <210> 26 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 26 <400> 26 Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile Ser Gln Pro Gly Asn 1 5 10 15 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 27 <400> 27 Lys Ile Ser Ser Ile Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys 1 5 10 15 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 28 <400> 28 Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp 1 5 10 15 <210> 29 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 29 <400> 29 Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys Cys Ile Cys Lys 1 5 10 15 <210> 30 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 30 <400> 30 Asp Gly Asp Asn Asp Lys Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 31 <400> 31 Lys Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 32 <400> 32 Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 33 <400> 33 Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn 1 5 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 34 <400> 34 Phe Asp Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 35 <400> 35 Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln Asn Thr 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 36 <400> 36 Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 37 <400> 37 Gln Arg Gln Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr 1 5 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 38 <400> 38 Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser Gly 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 39 <400> 39 Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 40 <400> 40 Trp Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 41 <400> 41 Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe 1 5 10 15 <210> 42 <211> 496 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Ang2 protein <400> 42 Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys 20 25 30 Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala 50 55 60 Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu 65 70 75 80 Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys 85 90 95 Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile 100 105 110 Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly 115 120 125 Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp 130 135 140 Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu 145 150 155 160 Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp 165 170 175 Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu 180 185 190 Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser 195 200 205 Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn 210 215 220 Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn 225 230 235 240 Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn 245 250 255 Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr 260 265 270 Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe 275 280 285 Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn 290 295 300 Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln 325 330 335 Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu 340 345 350 Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg 355 360 365 Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr 370 375 380 Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg 385 390 395 400 Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile 405 410 415 Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys 420 425 430 Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp 435 440 445 Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln 450 455 460 Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser 465 470 475 480 Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe 485 490 495 <210> 43 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ang2 fragment 1 <400> 43 Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln 1 5 10 15 Arg Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys 20 25 <210> 44 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ang2 fragment 2 <400> 44 His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn Ser Thr Glu 1 5 10 15 Glu Ile Lys Ala 20

Claims (12)

  1. 서열번호 42의 안지오포이에틴-2 (Ang2) 단백질의 282번째부터 496번째까지의 아미노산 서열에 해당하는 수용체 결합 도메인(Receptor binding domain; RBD) 내의 연속하는 15 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 포함하고,
    상기 펩타이드는,
    서열번호 43의 아미노산 서열(EYWLGNEFVSQLTNQQRYVLKIHLK) 중 서열번호 15, 16, 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 15개 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드,
    서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드,
    서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 및
    서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드
    로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인,
    Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 암 전이의 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 또는 골육종인, Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 암 전이의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제1 펩타이드 및 제2 펩타이드를 포함하고,
    상기 제1 펩타이드는, 서열번호 42의 안지오포이에틴-2 (Ang2) 단백질의 282번째부터 496번째까지의 아미노산 서열에 해당하는 수용체 결합 도메인(Receptor binding domain; RBD) 내의 연속하는 15 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로서, (1) 서열번호 43의 아미노산 서열 중 서열번호 15, 16, 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 연속하는 15개 내지 25개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드, (2) 서열번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, (3) 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 및 (4) 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 펩타이드, 또는 상기 하나 이상의 펩타이드가 2개 내지 20개 반복된 펩타이드 반복체이며,
    상기 제2 펩타이드는 항체의 중쇄, 경쇄, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 불변부위, 및 항체의 Fc 단편으로 이루어진 군에서 선택된 것이고,
    상기 제1 펩타이드는 상기 제2 펩타이드 의 N 말단, C 말단, 또는 양 말단에 결합되어 있는,
    폴리펩타이드 분자.
  6. 제5항에 있어서,
    링커를 추가로 포함하고,
    상기 링커는 상기 제1 펩타이드와 제2 펩타이드 간, 또는 상기 펩타이드 반복체 내의 2개 내지 20개의 펩타이드 간을 연결하는 것인,
    폴리펩타이드 분자.
  7. 제5항의 폴리펩타이드 분자 2개 내지 4개를 포함하는 폴리펩타이드 복합체.
  8. 제6항의 폴리펩타이드 분자 2개 내지 4개를 포함하는 폴리펩타이드 복합체.
  9. 제5항 또는 제6항의 폴리펩타이드 분자, 또는 제7항 또는 제8항의 폴리펩타이드 복합체를 유효성분으로 포함하는, Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 암 전이의 예방 또는 치료용 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 또는 골육종인, Ang2 활성화 또는 Ang2와 인테그린 간 결합에 의하여 유발되는 암 전이의 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 삭제
  12. 삭제
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