KR101951403B1 - 곡기생 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 곡기생 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 곡기생 추출물을 포함하는 조성물은 대장염으로 인한 대장 내 출혈 또는 부종 발생을 억제하고, 장 길이 감소를 억제하며, 대장염과 관련된 염증성 사이토카인 등의 인자를 조절할 수 있으므로, 안전하면서도 효과적인 염증성 장질환 치료제로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

곡기생 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물 {A composition for preventing or treating inflammatory bowel disease comprising mistletoe extract as an active ingredient}

본 발명은 곡기생 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 곡기생 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품, 및 곡기생 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

염증성 장질환 (Inflammatory bowel disease, IBD)은 위장관 내에 만성적인 염증을 유발하는 질환으로, 비교적 청년층부터 발병하며 복통, 발열, 설사, 하혈 등의 증상을 수반하는 질병이다. 일반적으로 염증성 장질환은 궤양성 대장염 (Ulcerative colitis, UC)과 크론병 (Cron's disease, CD)의 2가지 형태로 분류된다. 상기 궤양성 대장염은 주로 점막을 침범하여, 문드러짐이나 궤양을 형성하는 확산성 비특이성 염증 (diffuse nonspecific inflammation)의 일종으로서, 그 원인이 명확하게 밝혀져 있지 않으며, 혈성 설사를 비롯하여 다양한 전신 증상을 유발한다. 상기 크론병은 구강에서 항문까지 이르는 전 소화관의 점막에서 궤양, 섬유화, 협착, 병변(病變)을 비연속적으로 유발하는 육아종성 염증성 병변으로, 복통, 만성 설사, 발열, 영양장애 등의 전신 증상을 수반한다.

상기 염증성 장질환의 발병원인은 아직까지 구체적으로 밝혀져 있지 않으나, 면역기능의 이상이 관여하는 것으로 알려져 있으며, 이에 관여하는 면역학적 요인으로는 선천적 면역성, 사이토카인 (Cytokine)의 생성, CD4의 활성화 등이 알려져 있다. 특히, 사이토카인이 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있으며, 특히 염증 부위에서 종양괴사인자 (Tumor nerosis cytokine; TNF-α), 인터루킨 (Interluekin; IL)-1, IL-6, IL-8 생성이 궤양성 대장염과 크론병 환자에게 현저하게 증가되는 것이 확인되었다.

이러한 염증성 장질환을 치료하기 위하여 사용되는 약물로는 스테로이드성 면역억제제, 프로스타글란딘 (prostaglandins)의 생성을 차단하는 5-아미노살리실산 (5-aminosalicylic acid; 5-ASA) 계통 약물 (예, 설파살라진 등), 메살라진 등이 사용되고 있는데, 이들은 염증성 장질환의 치료효과가 미미할 뿐만 아니라 복부허실 (fullness), 두통, 발진, 간질환, 백혈구 감소증, 무과립구증, 남성 불임 등의 심각한 부작용을 유발하기 때문에, 상기 치료제의 사용이 제한되고 있다.

따라서, 부작용을 유발하지 않는 염증성 장질환 치료제를 개발할 수 있다면, 보다 안전하면서도 효과적으로 염증성 장질환 환자들을 치료할 수 있을 것으로 예상되고 있으나, 아직까지는 부작용이 없는 치료제가 개발되지 못하고 있는 실정이다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 부작용을 유발하지 않는 천연물로부터 유래된 염증성 장질환 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 곡기생 추출물을 포함하는 조성물이 대장염으로 인한 대장 내 출혈 또는 부종 발생을 억제하고, 장 길이 감소를 억제하며, 대장염과 관련된 염증성 사이토카인 등의 인자를 조절할 수 있어, 염증성 장질환의 치료에 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 곡기생 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 곡기생 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 곡기생 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 곡기생 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "곡기생(寄生)"이란, 겨우살이과의 겨우살이 (Viscum album L. var. coloratum Ohwi)의 건조시킨 잎·줄기·가지를 말한다. 곡기생은 허리와 무릎이 시리거나 무력한 증상을 치료하며 뼈와 근육을 튼튼하게 해 주는 것으로 알려져 있으며, 약리작용으로는 혈압강하, 관상동맥확장 작용, 혈류증가작용, 혈소판 응집 억제작용, 항혈전작용, 이뇨작용, 항균작용 등이 보고되었다. 그러나, 대장염의 예방 및 치료 효능에 대해서는 알려진 바가 없다.

본 발명의 용어 "추출물"이란, 상기 곡기생을 물 또는 유기용매로 추출하여 수득한 추출물을 의미하며, 본 발명의 목적상 염증성 장질환의 예방, 치료 또는 개선용 조성물의 유효성분이 될 수 있다.

상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올, 핵산, 클로로포름, 메틸아세테이트, 부탄올 등의 용매를 사용하여 추출될 수 있으며, 구체적으로, 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합용매인 추출용매를 사용하여 추출된 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 보다 더 구체적으로 열수 추출물 또는 70% 에탄올 추출물이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "염증성 장질환(Inflammatory bowel disease, IBD)"이란, 복통, 발열, 설사, 하혈 등의 증상을 수반하면서, 위장관 내에 만성적인 염증을 유발하는 질환을 의미한다. 구체적으로, 상기 염증성 장질환은 대장염인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 염증성 장질환은 구체적으로 궤양성 대장염 또는 크론병일 수 있다. 상기 궤양성 대장염은 주로 점막을 침범하여, 문드러짐이나 궤양을 형성하는 확산성 비특이성 염증 (diffuse nonspecific inflammation)의 일종으로서, 그 원인이 명확하게 밝혀져 있지 않으며, 혈성 설사를 비롯하여 다양한 전신 증상을 유발한다. 상기 크론병은 구강에서 항문까지 이르는 전 소화관의 점막에서 궤양, 섬유화, 협착, 병변(病變)을 비연속적으로 유발하는 육아종성 염증성 병변으로, 복통, 만성 설사, 발열, 영양장애 등의 전신 증상을 수반한다.

본 발명의 용어 "예방"이란, 상기 약학 조성물의 투여로 염증성 장질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "치료"란, 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 모든 행위를 의미하며, 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키고, 전이를 예방하며, 질병 진행 속도를 감소시키고, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 본 발명의 목적상 상기 치료는 상기 약학 조성물의 투여로 염증성 장질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 포함하는 것으로 해석될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 제공하는 약학 조성물은 유효성분으로서 곡기생 추출물을 포함하는데 상기 약학 조성물은 대장염으로 인해 감소된 체중을 회복시키거나, 짧아진 대장의 길이를 회복시키거나, 대장 내 출혈 또는 부종을 억제할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 곡기생 추출물을 포함하는 조성물을 수득하고 (실시예 1), 대장염이 유발된 생쥐에게 상기 조성물을 경구 투여한 결과, 대장염에 의해 감소되었던 체중과, 짧아졌던 대장의 길이가 곡기생 추출물의 처리에 의해 회복되었으며, DAI (Disease Activity Index) 지표 수치가 현저하게 감소되었음을 확인하였다 (도 1).

또한, 대장염이 유발된 생쥐에게 상기 곡기생 추출물을 포함하는 조성물을 경구 투여하고 대장 내시경을 통해 확인한 결과, 곡기생 추출물을 투여한 군의 대장 내부는 대장염에 의한 대장 내 출혈과 부종이 억제 및 완화되었음을 확인하였다 (도 2).

따라서, 곡기생 추출물을 포함하는 조성물은 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

상기 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

한편, 본 발명의 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 혼합물의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 곡기생 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 "곡기생", "추출물", "염증성 장질환", "예방"에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "개선"은 본 발명에 따른 식품 조성물의 섭취로 인해 염증성 장질환이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 곡기생은 종래로부터 약재로 사용되어 그의 안전성이 입증되었으므로, 식품 조성물로 사용할 수 있음을 알 수 있다.

상기 곡기생 추출물을 포함하는 조성물은 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 구체적으로 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다. 식품이 음료인 경우에는 100 ㎖를 기준으로 1 ~ 30 g, 바람직하게는 3 ~ 20 g의 비율로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있고, 기능성 식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다. 아울러 본 발명의 식품 조성물은 당업자의 선택에 따라 식품에 포함될 수 있는 적절한 기타 보조성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함한다.

또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 구체적으로, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신 (niacin), 비오틴 (biotin), 폴레이트 (folate), 판토텐산 (panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연 (Zn), 철 (Fe), 칼슘 (Ca), 크롬 (Cr), 마그네슘 (Mg), 망간 (Mn), 구리 (Cu), 크륨 (Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제 (소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제 (표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제 (부틸히드록시아니졸 (BHA), 부틸히드록시톨류엔 (BHT) 등), 착색제 (타르색소 등), 발색제 (아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제 (아황산나트륨), 조미료 (MSG, 글루타민산나트륨 등), 감미료 (둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료 (바닐린, 락톤류 등), 팽창제 (명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제 (호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물 (food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 곡기생 추출물을 유효성분으로 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 "곡기생", "추출물", "염증성 장질환", "예방" 및 "개선"에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명에 있어서, "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 “기능성”이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 곡기생 추출물을 포함하는 조성물을 수득하고 (실시예 1), 대장염이 유발된 생쥐에게 상기 조성물을 경구 투여한 결과, 대장염에 의해 감소되었던 체중과, 짧아졌던 대장의 길이가 곡기생 추출물의 처리에 의해 회복되었으며, DAI (Disease Activity Index) 지표 수치가 현저하게 감소되었음을 확인하였다 (도 1).

또한, 대장염이 유발된 생쥐에게 상기 곡기생 추출물을 포함하는 조성물을 경구 투여하고 대장 내시경을 통해 확인한 결과, 곡기생 추출물을 투여한 군의 대장 내부는 대장염에 의한 대장 내 출혈과 부종이 억제 및 완화되었음을 확인하였다 (도 2).

따라서, 곡기생 추출물을 포함하는 조성물은 염증성 장질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물, 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강식품 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 곡기생 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 장질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

상기 "곡기생", "추출물", "염증성 장질환", "예방" 및 "치료"에 대해서는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "개체"란, 상기 염증성 장질환이 발병될 가능성이 있거나, 또는 발병된 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써, 염증성 장질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학적 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.

본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 혈관 투과성 증가를 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 곡기생 추출물을 포함하는 조성물은 대장염으로 인한 대장 내 출혈 또는 부종 발생을 억제하고, 장 길이 감소를 억제하며, 대장염과 관련된 염증성 사이토카인 등의 인자를 조절할 수 있으므로, 안전하면서도 효과적인 염증성 장질환 치료제로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은, 5% Dextran sodium sulfate (DSS)가 포함된 음수를 제공받은 생쥐의 체중 변화 (A), 대장 길이 (B)와 Disease activity index (DAI) 지표 (C)에 대한 곡기생 추출물 (VCE)의 대장염 억제 효능을 도식화한 결과이다. DSS에 의하여 유발되는 체중 감소, 장길이 수축 및 DAI 지표가 곡기생 추출물에 의하여 억제됨을 보여준다. (*P < 0.05, **P < 0.01은 DSS 그룹 대비)
도 2는, 생쥐의 대장내시경 (A), 조직학적 변화 (B), 장조직 내 Mast cell tryptase (C), F4/80 (D)의 발현에 대한 곡기생 추출물의 대장염 억제 효능을 나타내는 그림이다. DSS에 의한 장내 출혈, 부종, 장상피층 소실, 면역세포 (비만세포 및 호중구) 침윤이 곡기생 추출물에 의하여 억제됨을 보여준다.
도 3은, ZO-1 (A) 및 MMP-9 (B)의 발현에 대한 곡기생 추출물의 대장염 억제 효능을 나타내는 그림이다. DSS에 의한 ZO-1 발현 감소, MMP-9의 발현 증가가 곡기생 추출물에 의하여 억제됨을 보여준다.
도 4는, 곡기생 추출물이 DSS 투여된 생쥐의 혈액 내 IgE (A), 염증성사이토카인 (IL-6와 TNF-α)의 생성 (B & C) 및 Myeloperoxidase (MPO) 활성 (D)에 대한 억제 효능을 도식화한 그래프이다. (*P < 0.05, **P < 0.01은 DSS 그룹 대비)
도 5는, 곡기생 추출물이 DSS 투여된 생쥐의 장조직에서 MMP-9과 MMP-2의 활성과 Mast cell tryptase, MMP-9, MMP-2 및 ZO-1 발현에 대한 억제 정도를 나타낸 자이모그램 (A) 및 웨스턴블럿 결과 (B)의 전기영동 사진이다. (*P < 0.05, **P < 0.01은 DSS 그룹 대비)
도 6은, 곡기생 추출물과 Viscotoxin A3가 염증성 매개인자로 활성화된 Caco-2 세포에서 분비된 MMP-9과 MMP-2의 활성에 대한 효능을 비교한 자이모그램의 전기영동 사진이다. (**P < 0.01은 염증성 매개인자 함유 배양액 (RBL media) 그룹 대비, ##P < 0.01는 곡기생 추출물 대비)

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 곡기생 추출물 제조

곡기생 추출물을 제조하기 위하여, 1 kg의 곡기생을 파쇄한 후에 6 리터의 70% 에탄올에 침체시킨 다음 40℃에서 24 시간 교반하였다. 이를 통해 얻은 용액을 거름종이로 여과한 후, 여과액을 취하여 동결건조하여 곡기생 추출물 (건조물)을 얻었다. 상기 건조물은 -20℃의 온도에서 보관하였으며, 모든 실험에서 1% 카르복시메틸셀룰로오스 (Carboxymethylcullulose) 용액에 녹여서 사용하였다.

실험예 1: 곡기생 추출물의 대장염 억제 효능에 대한 형태학적 관찰

1-1. 대장염 유도 생쥐의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 곡기생 추출물의 대장염에 대한 억제 효능을 평가하기 위하여 C57/BL6 수컷 생쥐에게 DSS를 투여하여 급성대장염을 유도하였다.

구체적으로, 순화 적응을 마친 생쥐에게 급성대장염을 유발하기 위하여 5% DSS가 포함된 음수를 6 일 동안 제공한 후, 이틀 간 DSS가 포함되지 않은 음수로 교체하여 제공하였다.

한편, 곡기생 추출물은 100 혹은 200 mg/kg 농도로 DSS가 포함된 음수를 제공하기 하루 전부터 희생하기 전까지 경구로 투여하였다.

1-2. 대장염으로 유발된 체중 및 장 길이 감소, DAI 수치 증가에 대한 곡기생 추출물의 치료 효과 검정

상기 실시예 1에서 제조한 곡기생 추출물이, 대장염으로 인한 체중 감소, 장 길이 감소, 및 DAI (Disease Activity Index) 수치 증가에 대해 미치는 영향을 평가하고자 하였다.

구체적으로, 생쥐의 체중은 곡기생 추출물을 투여하기 전에 측정하였으며, DAI 지표는 대변 형태로 평가하였다. 대장의 길이는 희생 후에 대장을 분리하여 측정하였으며, 체중, 장 길이 및 DAI 지표는 도 1에 나타내었다.

그 결과, 도 1의 A 및 B와 같이, 대장염에 의해 감소되었던 체중이 곡기생 추출물에 의하여 회복되었으며, 대장염에 의해 짧아졌던 대장의 길이도 곡기생 추출물의 처리에 의해 통계적으로 유의성있게 회복되었음을 확인하였다.

또한, 도 1의 C와 같이, 증가되었던 DAI 지표 수치도 곡기생 추출물에 의하여 현저하게 감소되었음을 확인하였다.

따라서, 곡기생 추출물이 체중 감소, 장 길이 감소, DAI 지표 증가와 같은 대장염의 증상을 현저하게 억제하므로, 곡기생 추출물의 대장염 예방 및 치료 효과가 있음을 알 수 있다.

1-3. 대장염에 의한 출혈 및 부종에 대한 곡기생 추출물의 치료 효과 검정

곡기생 추출물이 대장염으로 인한 장 내 출혈 및 부종에 대해 미치는 치료 효과를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 대장내시경은 DSS 투여 5 일과 7 일에 Miniendoscope (670 mm length and 2.8 mm diameter, OLYMPUS, Co., Ltd)로 관찰하였으며, 대장내시경 사진은 도 2의 (A)에 나타내었다. 곡기생 추출물의 투여 방법은 상기 실험예 1-1과 동일하다.

관찰 결과, DSS를 처리한 군의 대장 내부에 대장염으로 인한 출혈 및 부종이 발생하였으나, 곡기생 추출물을 투여한 군의 대장 내부는 DSS에 의한 대장 내 출혈과 부종이 현저하게 억제 및 완화되었음을 확인하였다.

따라서, 곡기생 추출물이 대장염에 의한 대장 내벽의 출혈 및 부종을 현저하게 억제하므로, 곡기생 추출물의 대장염 예방 및 치료 효과가 우수함을 알 수 있다.

실험예 2: 곡기생 추출물의 대장염 억제 효능에 대한 조직학적 관찰

다음으로, 대장염에 대한 곡기생 추출물의 치료 효과를 조직학적으로 관찰하여 확인하고자 하였다.

구체적으로, 실험예 1-1에서 분리 및 세척된 장조직을 4% Paraformaldehyde 수용액을 이용하여 고정하고, 파라핀 블록을 제조한 후에 Microtome으로 절편하였다. 조직 절편은 Hematoxylin-eosin으로 염색하거나, Anti-Mast cell tryptase, F4/80, ZO-1 또는 MMP-9 항체로 면역 염색하였다.

Hematoxylin-eosin 염색, Mast cell tryptase, F4/80, ZO-1 그리고 MMP-9 조직 염색 결과를 각각 도 2 (B, C, D) 및 도 3에 나타내었다. 면역 염색에 사용한 항체는 Thermofisher Scientific, Inc.와 Santa Cruz Biotechnology, Inc.에서 구입하여 사용하였다.

그 결과, 도 2의 (B) 내지 (D), 도 3과 같이, DSS에 의하여 붕괴되었던 장상피 조직이 곡기생 추출물에 의하여 회복되었고, DSS에 의하여 장상피 조직 내에 증가된 면역세포 (비만세포 및 호중구) 침윤이 감소되었으며, DSS에 의하여 감소되었던 장상피 조직의 Tight junction 구성단백질인 ZO-1 발현을 증가시킨 반면에, ZO-1을 분해하는 MMP-9의 발현은 감소시켰음을 확인하였다 (도 2 및 도 3).

따라서, 곡기생 추출물은 손상된 장상피 조직을 회복하고, 장상피 조직 내 면역세포의 침윤을 감소시키며, 장상피 조직 내 Tight junction 구성 단백질을 회복시킴으로써, 대장염에 대한 우수한 예방 및 치료 효과를 나타냄을 알 수 있다.

실험예 3: 혈액 내 IgE , 염증성 사이토카인 생성 및 장조직 내 MPO 활성에 대한 곡기생 추출물의 억제 효과 측정

대장염과 관계된 염증성 사이토카인으로 잘 알려진 IL-6와 종양괴사인자-α (TNF-α) 및 IgE의 혈액 내 증가와 장조직 내 MPO 활성 증가에 대한 곡기생 추출물의 억제 효과를 아래와 같은 방법으로 측정하였다.

구체적으로, 염증성 사이토카인을 측정하기 위하여 채혈된 혈액은 4℃에서 하루 방치한 후에 17,000g으로 10 분 간 원심분리하고, 상등액을 -80℃에서 보관하였으며, 해동하여 분석에 사용하였다. MPO 활성을 측정하기 위하여 분리된 대장에서 분변을 제거하고, 차가운 1x PBS로 세척한 후에 250 mg/ml 농도로 0.1% NP-40이 포함된 1x PBS를 넣고 마쇄하였다. 조직 현탁액을 취하여 4℃에서 17,000g으로 10 분 간 원심분리하고, 상등액을 -80℃에서 보관하였으며, 해동하여 분석에 사용하였다.

보다 구체적으로, 혈청 중 IgE, IL-6 및 TNF-α의 농도를 ELISA 키트 (BioLegend, Inc; e-Bioscience, Inc.)를 사용하여 측정하였고, MPO 활성은 MPO Activity Assay kit (ThermoFisher Scientific, Inc.)를 사용하여 제조자의 매뉴얼에 따라 측정하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.

그 결과, 도 4의 (A) 내지 (D)와 같이, DSS로 증가되었던 혈중 IgE, IL-6 그리고 TNF-α의 함량이 곡기생 추출물에 의하여 현저하게 감소하였고, 장조직 내 MPO 활성도 감소하였음을 확인하였다.

따라서, 곡기생 추출물이 대장염으로 인해 증가된 혈중 IgE, IL-6 및 TNF-α의 함량과 장조직 내 MPO 활성을 현저하게 감소시킴으로써, 대장염에 대한 우수한 예방 및 치료 효과를 나타냄을 알 수 있다.

실험예 4: 곡기생 추출물의 MMP -9과 MMP -2의 활성 및 발현, Mast cell tryptase와 ZO -1 발현에 대한 효과 측정

곡기생 추출물의 대장염 예방 및 치료 효과를 보다 구체적으로 확인하기 위하여, MMP-9과 MMP-2의 활성 및 발현, Mast cell tryptase와 ZO-1 발현에 대한 곡기생 추출물의 효과 측정하였다.

구체적으로, 실험예 3에서 분리 및 세척된 장조직 25 mg에 1 ml RIPA buffer를 넣고 마쇄한 다음 17,000g으로 10 분 간 원심분리하고, 상등액을 -80℃에서 보관하였으며, 해동하여 분석에 사용하였다. 상등액에서 총단백질 함량을 정량한 후에 자이모그램으로 MMP-9과 MMP-2의 활성을 측정하였으며, 웨스턴블럿으로 장조직 내 Mast cell tryptase, MMP-9, MMP-2 및 ZO-1의 발현을 측정하였다. 웨스턴블럿에 사용한 항체는 Thermofisher Scientific, Inc.와 Santa Cruz Biotechnology, Inc.에서 구입하여 사용하였다.

상기 자이모그램과 웨스턴블럿 결과의 전기영동 사진을 도 5에 나타내었다. 웨스턴블럿 결과의 로딩 대조군으로는 β-액틴 (β-actin)을 사용하였다.

그 결과, 도 5의 (A) 및 (B)와 같이, 본 발명의 곡기생 추출물은 DSS로 유도된 MMP-9과 MMP-2의 활성을 효과적으로 억제하였으며, Mast cell-trypase, MMP-2, MMP-9의 발현을 역시 감소시켰다. 또한, DSS로 감소되었던 Tight junction 구성단백질인 ZO-1 발현을 회복시켰다.

따라서, 곡기생 추출물이 대장염으로 인해 증가된 MMP-2와 MMP-9의 활성 및 발현을 효과적으로 억제하고, Tight junction 구성단백질인 ZO-1 발현을 회복함으로써, 대장염에 대한 우수한 예방 및 치료 효과를 나타냄을 알 수 있다.

실험예 5: 곡기생 추출물과 Viscotoxin A3의 MMP -9과 MMP -2의 활성에 대한 효능 비교

곡기생 추출물의 염증성 장질환의 장벽 보호 효능이 곡기생에 미량 함유된 항암인자인 비스코티오닌 (Viscotoxin; 약 0.28% 함유)과 상관관계가 있는지 확인하기 위하여, 곡기생 추출물 또는 Viscotoxin A3 (VTA3)가 포함된 염증성 매개인자가 풍부한 배양 배지에 Caco-2 세포를 24 시간 배양한 후에 그 배양액을 취하여 원심분리 및 농축한 후에 자이모그램으로 MMP-9과 MMP-2의 활성을 측정하였다.

상기 자이모그램의 전기영동 사진을 도 6에 나타내었다.

그 결과, 도 6과 같이, 본 발명의 곡기생 추출물은 염증성 매개인자로 활성화된 Caco-2 세포로부터 분비된 MMP-9과 MMP-2의 활성을 유의적으로 억제한 반면에 비스코티오닌 중에서 항암 효능이 가장 뛰어난 Viscotoxin A3는 오히려 MMP-9과 MMP-2의 활성을 저해하지 못하여, 대장염의 치료 효과가 사실상 없는 것으로 확인되었다.

이로써 본 발명의 곡기생 추출물이 염증성 장질환에서 장내벽을 보호하고, 면역세포의 침윤을 억제하여 염증성 장질환의 예방 또는 치료용 조성물로서 사용될 수 있음을 확인하였으며, 곡기생 추출물의 항대장염 효능은 비스코티오닌과 상관관계가 없을 뿐만 아니라, 비스코티오닌에 비해 현저히 우수한 대장염 예방 및 치료 효과를 나타냄을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

1. 곡기생 추출물을 유효성분으로 포함하는, 궤양성 대장염 또는 크론병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 ~ C4의 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출된 것인, 약학 조성물.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 알콜 용매는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
   
4. 삭제
5. 제1항에 있어서,
   약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
   
6. 곡기생 추출물을 유효성분으로 포함하는, 궤양성 대장염 또는 크론병의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
   
7. 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 궤양성 대장염 또는 크론병의 예방 또는 치료방법.
   

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