KR101954726B1 - Animal model for pendred syndrome and method for producing the same - Google Patents
Animal model for pendred syndrome and method for producing the same Download PDFInfo
- Publication number
- KR101954726B1 KR101954726B1 KR1020170027182A KR20170027182A KR101954726B1 KR 101954726 B1 KR101954726 B1 KR 101954726B1 KR 1020170027182 A KR1020170027182 A KR 1020170027182A KR 20170027182 A KR20170027182 A KR 20170027182A KR 101954726 B1 KR101954726 B1 KR 101954726B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- syndrome
- mouse
- human
- gene
- slc26a4
- Prior art date
Links
- 238000010171 animal model Methods 0.000 title claims abstract description 153
- 208000004843 Pendred Syndrome Diseases 0.000 title claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 16
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims abstract description 191
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 124
- 102200115374 rs121908362 Human genes 0.000 claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 132
- 101001094048 Homo sapiens Pendrin Proteins 0.000 claims description 109
- 102000058129 human SLC26A4 Human genes 0.000 claims description 82
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 72
- 101150030803 SLC26A4 gene Proteins 0.000 claims description 53
- 102100035278 Pendrin Human genes 0.000 claims description 49
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 claims description 30
- 108050001616 Pendrin Proteins 0.000 claims description 30
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 claims description 30
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 claims description 30
- 210000000262 cochlear duct Anatomy 0.000 claims description 29
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 27
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 27
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 25
- 210000003477 cochlea Anatomy 0.000 claims description 24
- 210000003027 ear inner Anatomy 0.000 claims description 24
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 21
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 claims description 20
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 claims description 20
- 210000001062 endolymphatic sac Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 8
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 claims description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001365 lymphatic vessel Anatomy 0.000 claims description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 2
- 108700039855 mouse a Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 claims 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 9
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 6
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 25
- 108091006507 SLC26A4 Proteins 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 13
- 101100202284 Mus musculus Slc26a4 gene Proteins 0.000 description 12
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 231100000895 deafness Toxicity 0.000 description 9
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 8
- 101100518992 Mus musculus Pax2 gene Proteins 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 6
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 6
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 4
- 208000009966 Sensorineural Hearing Loss Diseases 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 206010018498 Goitre Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 201000003872 goiter Diseases 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000010603 microCT Methods 0.000 description 2
- 238000009806 oophorectomy Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 230000001720 vestibular Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010011891 Deafness neurosensory Diseases 0.000 description 1
- 101100369915 Drosophila melanogaster stas gene Proteins 0.000 description 1
- 208000017701 Endocrine disease Diseases 0.000 description 1
- 101150026630 FOXG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 208000011755 Hearing abnormality Diseases 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000000860 cochlear nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 208000016097 disease of metabolism Diseases 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 210000000959 ear middle Anatomy 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 208000030172 endocrine system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 1
- 210000002768 hair cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 210000001439 intercalated cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 230000008140 language development Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000005445 natural material Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000005495 thyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 229940036555 thyroid hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
- G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0356—Animal model for processes and diseases of the central nervous system, e.g. stress, learning, schizophrenia, pain, epilepsy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
- C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 이식된 동물 모델 및 이를 이용하여 펜드리드 증후군의 치료제 나아가 치료방법의 개발에 유용한 펜드리드 증후군 동물 모델이 제공된다. 나아가, 펜드리드 증후군 동물 모델의 제조 방법과 이를 통해 제조된 동물 모델을 이용한 펜드리드 증후군에 효과적인 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다. An animal model in which a human p.H723R mutant gene has been transplanted and an animal model of Pendlet syndrome useful for the development of a therapeutic agent and a therapeutic method for Pendrim syndrome are provided. Further, a method for screening an effective therapeutic agent for Pendream syndrome using a method for producing a Pendream syndrome animal model and an animal model produced thereby is provided.
Description
본 발명은 펜드리드 증후군 동물 모델 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 인간 펜드린 돌연변이 유전자가 이식된 펜드리드 증후군 동물 모델 및 이의 제조방법과 펜드리드 증후군 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to an animal model of Pendream syndrome and a method for producing the same, and more particularly, to an animal model of Pendre syndrome in which a human pendrin mutant gene has been transplanted, a method for producing the animal model and a composition for treating Pendrim syndrome ≪ / RTI >
SLC26A4 유전자는 염색체 7번에 위치하며, 펜드린 (pendrin) 단백질을 코딩하는 것으로 알려져 있다. 또한, SLC26A4 유전자는 내이, 콩팥 갑상선에서 발현될 수 있다. 구체적으로 SLC26A4 유전자는 갑상선 상피세포 (thyrocytes) 내의 여포강 (follicular lumen) 에서 아이오딘 (iodine) 을 방출하고 콩팥의 개재세포 (intercalated cells) 의 산-염 조절에 있어서 Cl-/HCO3 - 교환을 매개하며, 내이에서 내림프액의 조절을 수반하는 Cl-/HCO3 - 교환을 매개하는 기능을 할 수 있다. 이러한 SLC26A4 유전자의 변화 또는 돌연변이는 펜드리드 증후군 (Pendred syndrome) 을 야기할 수 있다. The SLC26A4 gene is located on chromosome 7 and is known to encode a pendrin protein. In addition, the SLC26A4 gene can be expressed in the inner ear, kidney thyroid. Specifically, the SLC26A4 gene releases iodine from the follicular lumen in the thyroid cells and cleaves Cl - / HCO 3 - exchange in the acid - salt control of the intercalated cells of the kidney Mediated, and mediates the exchange of Cl - / HCO 3 - exchange with the regulation of the lymphatic fluid in the inner ear. Such changes or mutations in the SLC26A4 gene may cause Pendred syndrome.
펜드리드 증후군의 증상으로는 감각신경성 난청/전정 기능 장애, 관자뼈 이상, 갑상선종의 출현 등이 있을 수 있다. 펜드리드 증후군은 특히, 신생아의 선천성 난청과 연관 있을 수 있다. 예를 들어, 부모 각각으로부터 돌연변이의 SLC26A4 유전자를 받고 태어난 신생아는 선천성 난청을 갖고 있을 수 있다. 선천성 난청을 포함하는 펜드리드 증후군에 특이적인 치료제는 갑상선 호르몬제외에 특별히 밝혀진바 없다. 이의 치료 방법으로는 언어치료, 와우관 이식이 있을 수 있으나, 선천성 난청의 경우 언어 발달에 있어 가장 중요할 수 있는 시기인 2세 이전에 치료되지 않는다면, 선천성 난청 환자는 언어 재활의 어려움이 있을 수 있다. Symptoms of Pendridium syndrome include sensory nerve deafness / vestibular dysfunction, observer bone abnormalities, and the appearance of goiter. Pendridium syndrome may be associated with congenital hearing loss, especially in newborns. For example, a newborn born with a mutated SLC26A4 gene from each parent may have congenital hearing loss. Therapeutic agents specific to Pendrim syndrome, including congenital hearing loss, have not been specifically addressed except for thyroid hormones. In congenital hearing loss, it may be difficult to achieve language rehabilitation if it is not treated before the age of 2 years, which is the most important stage of language development, for the treatment of congenital hearing loss. have.
이에 따라, 펜드리드 증후군에 대하여 효과적인 조기 진단방법의 개발과 함께 효과적인 치료제 또는 치료 방법의 개발은 지속적으로 요구되고 있는 실정이다. Thus, there is a continuing need to develop an effective early diagnosis method for Pendrim syndrome as well as an effective treatment or treatment method.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
선행기술문헌: Ying-Chang Lu 등, PLOS One vol6 no7 e22150(20110730 공개)BACKGROUND OF THE INVENTION [0002] Techniques as a background of the invention have been made in order to facilitate understanding of the present invention. And should not be construed as an admission that the matters described in the technical background of the invention are present in the prior art.
Prior Art Document: Ying-Chang Lu et al., PLOS One vol6 no7 e22150 (published on 20110730)
펜드리드 증후군에 대한 치료제의 개발에 있어서, 펜드리드 증후군 동물 모델은 치료 후보 물질에 대한 효과를 입증하는, 전 임상단계에서 매우 중요할 수 있다. In the development of therapeutic agents for Pendrim syndrome, Pendrim syndrome animal models can be very important in the pre-clinical phase, demonstrating efficacy against candidate therapeutic agents.
이에, 본 발명의 발명자들은 펜드리드 증후군 동물 모델의 개발에 대한 중요성을 인지하여, 펜드리드 증후군 인간 환자와 동일한 증상을 나타내는 동물 모델을 개발하고자 하였다. Accordingly, the inventors of the present invention have recognized the importance of developing an animal model of Pendream syndrome and attempted to develop an animal model exhibiting the same symptoms as Pendrim syndrome human patients.
특히, 본 발명의 발명자들은 펜드리드 증후군을 유발하는 SLC26A4 유전자의 돌연변이들 중 p.H723R 돌연변이가 국내의 펜드리드 증후군 환자에게서 가장 큰 빈도로 나타나는 것을 인지할 수 있었다. In particular, the inventors of the present invention were able to recognize that the p.H723R mutation among the mutations of the SLC26A4 gene causing Pendrim syndrome is the most frequent in the patients with Pendrim syndrome in Korea.
이에, 본 발명의 발명자들은 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자 특히, p.H723R 돌연변이 유전자를 이식 (knock-in) 하여 펜드리드 증후군 동물 모델을 만들 수 있음을 인지하였고, 이의 다양한 제조 방법에 대하여 연구하였다.Accordingly, the inventors of the present invention have recognized that an animal model of Pendrill's syndrome can be produced by knocking in a human SLC26A4 mutation gene, in particular, a mutant gene of p.H723R, and various production methods thereof have been studied.
그 결과 본 발명의 발명자들은 펜드리드 증후군 증상 중 하나인, 난청과 와우관의 기형이 나타나는 동물 모델을 개발하는 데 이르렀다. As a result, the inventors of the present invention have developed an animal model showing degeneration of the deaf and womb duct, which is one of the symptoms of Pendream syndrome.
이에, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 이식된 펜드리드 증후군 동물 모델 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, an object to be solved by the present invention is to provide an animal model of PredrD syndrome transplanted with a human SLC26A4 mutant gene and a method for producing the same.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, 내이에서 특이적으로 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 발현하는 펜드리드 증후군 동물 모델 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.Another object to be solved by the present invention is to provide an animal model of Pendrill's syndrome in which a human SLC26A4 mutation gene is specifically expressed in the inner ear and a method for producing the same.
나아가, 본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 과제는, 펜드리드 증후군 동물 모델을 이용하여 펜드리드 증후군에 효과적인 치료용 조성물을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다. Still another object of the present invention is to provide a method for screening a therapeutic composition effective for Pendrim syndrome using an animal model of Pendrim syndrome.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The problems of the present invention are not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned can be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 이식된 동물 모델로서, 와우관 기형 또는 난청이 유발된 펜드리드 증후군 동물 모델이 제공된다.According to one embodiment of the present invention, an animal model with a human SLC26A4 mutant gene is provided, wherein an animal model of Peedle's syndrome induced by cochlear or deafness is provided.
본 명세서에서 사용되는 용어, "SLC26A4 돌연변이 유전자"는 돌연변이 도메인을 갖는 모든 SLC26A4 유전자를 의미할 수 있다. 여기서, 돌연변이는 SLC26A4 유전자의 유전적 기능을 변화시키는 모든 행위를 의미하며, 구체적으로는 SLC26A4 유전자의 돌연변이는 생물의 여러 가지 변이 중 SLC26A4 유전자의 양적 또는 질적인 변화에 의해 생긴 변이를 의미할 수 있다. 예를 들어, SLC26A4 돌연변이 유전자는 이의 DNA 염기 중 하나 이상이 다른 염기로 치환된 분자 수준의 변화, 즉, DNA의 하나 또는 다수 염기의 치환, 결실, 부가, 역위, 중복 또는 염기 중 1개 내지 2개의 삽입 또는 결실에 따른 염기배열의 이동 (frame shift) 과 같은 분자 수준의 변화를 통해, DNA가 갖는 유전정보에 따라 제조되는 효소나 펩타이드가 만들어지지 않거나 활성이 소실되는 변화가 나타나거나 원래의 활성이 증대되거나 변화된 유전자일 수 있다. SLC26A4 돌연변이 유전자는 p.H723R, p.T410M, p.L676Q 또는 pM147V 돌연변이 유전자 중 적어도 하나의 인간 돌연변이 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, SLC26A4 돌연변이 유전자로부터 생산된 펜드린 단백질은 정상 펜드린 단백질에 비하여 생물학적 활성의 저하가 나타날 수 있고, 이러한 비정상의 펜드린 단백질은 펜드리드 증후군을 유발할 수 있다. 특히, 이들 돌연변이 중, p.H723R 돌연변이는 펜드리드 증후군 환자에게서 다른 돌연변이에 비하여 높은 빈도로 나타날 수 있다.As used herein, the term " SLC26A4 mutant gene " may refer to any SLC26A4 gene having a mutant domain. Here, the mutation refers to all the actions that change the genetic function of the SLC26A4 gene, and specifically, the mutation of the SLC26A4 gene may mean a mutation caused by a quantitative or qualitative change of the SLC26A4 gene among various mutations of the organism . For example, a SLC26A4 mutant gene is a mutant gene in which one or more of its DNA bases is replaced by another base, ie, a change in the level of one or more bases, such as substitution, deletion, addition, inversion, The change in molecular level, such as the frame shift due to insertion or deletion of DNA, results in changes in enzymes or peptides that are not produced or disappear according to the genetic information of DNA, May be an increased or altered gene. The SLC26A4 mutation gene may be, but is not limited to, a human mutant gene of at least one of the p.H723R, p.T410M, p.L676Q, or pM147V mutant genes. At this time, the pendrin protein produced from the SLC26A4 mutation gene may show a decrease in biological activity as compared with the normal pendrin protein, and the abnormal pendrin protein may cause the Pendrite syndrome. In particular, among these mutations, the p.H723R mutation may be more frequent in Pendrim syndrome patients than in other mutations.
여기서, "p.H723R 돌연변이 유전자"는 SLC26A4 유전자에 나타날 수 있는 돌연변이 중 His723Arg 돌연변이가 나타난 SLC26A4 유전자와 대응할 수 있다. 이때, p.H723R 돌연변이는 펜드린 단백질의 723번 째 아미노산에서 일어난 돌연변이를 의미할 수 있다. 예를 들어, p.H723R 돌연변이는 펜드린 단백질 C-말단의 STAS 도메인에서 CAT가 CGT로 바뀐 점 돌연변이로 (point mutation) 일 수 있다. 이의 결과로, 펜드린 단백질의 723번 째 아미노산은 히스티딘 (His, histidine) 에서 아르기닌 (Arg, arginine) 으로 바뀌게 된다. 이때, p.H723R 돌연변이가 일어난 부위는 펜드린 단백질의 폴딩 (folding) 에 있어서 중요한 부위일 수 있다. 이에 따라, p.H723R 돌연변이는 펜드린 단백질 기능에 치명적인 영향을 미칠 수 있다. 또한, SLC26A4의 돌연변이 중 p.H723R 돌연변이는 펜드리드 증후군을 야기할 수 있다. Here, the " p.H723R mutation gene " can correspond to the SLC26A4 gene showing a mutation of His723Arg among the mutations that can appear in the SLC26A4 gene. Here, the p.H723R mutation may mean a mutation in the 723th amino acid of the pendrin protein. For example, the p.H723R mutation may be a point mutation in which the CAT is changed to the CGT in the STAS domain of the pendrin protein C-terminus. As a result, the 723th amino acid of the pendrin protein is changed from histidine (histidine) to arginine (Arg, arginine). At this time, the site where the p.H723R mutation has occurred may be an important site for folding of the pendrin protein. Thus, the p.H723R mutation can have a devastating effect on pendrin protein function. Also, the p.H723R mutation in the mutation of SLC26A4 can cause Pendrim syndrome.
본 명세서에서 사용되는 용어, "펜드리드 증후군"은 SLC26A4의 돌연변이로 인해 나타날 수 있는 모든 질환을 의미할 수 있다. 바람직하게, 펜드리드 증후군은 내분비, 영양 및 대사 질환일 수 있다. 펜드리드 증후군의 증상으로는 선천성 난청을 포함하는 감각신경성 난청과 전정 기능 장애, 관자뼈 이상, 갑상선종의 출현 등이 있을 수 있다. 펜드리드 증후군의 증상으로는 와우관의 기형과 난청이 있을 수 있다. As used herein, the term " Pendrim ' s syndrome " may refer to any disease that may occur due to a mutation in SLC26A4. Preferably, Pendream syndrome can be an endocrine, nutritional and metabolic disease. Symptoms of Pendrimed syndrome include sensory neural deafness including congenital hearing loss, vestibular dysfunction, observer bone abnormalities, and the appearance of goiter. Symptoms of Pendrim syndrome include malformations of the cochlea and deafness.
본 명세서에서 사용되는 용어, "와우관의 기형"은 SLC26A4 유전자의 돌연변이, 특히 p.H723R 돌연변이로 인해 내이 (inner ear) 에 존재하는 와우관의 외형적 이상과, 이로 인한 와우관의 기능적 이상을 의미할 수 있다. 여기서 와우관은 청각기관으로서 달팽이관으로 명명되기도 한다. 와우관 내에는 림프액이 채워져 있고 소리를 받아들이는 데 중심적 역할을 하는 유모세포들이 존재 할 수 있다. 이때, 펜드리드 증후군 환자에서 나타나는 와우관의 기형으로는 와우관의 내림프관 (endolymphatic drift) 의 확장, 와우관의 내림프낭 (endolymphatic sac) 크기의 확장이 있을 수 있다. As used herein, the term " anomalies of the cochlea " refers to the abnormalities of the cochlear ducts in the inner ear due to the mutation of the SLC26A4 gene, in particular the p.H723R mutation, It can mean. Here, the cochlear duct is also called the cochlea as an auditory organ. In the cochlea, lymphatic fluids are filled and there may be hair cells that play a central role in accepting sounds. The anomalies of the cochlear ducts in patients with Pendream syndrome may include enlargement of the endolymphatic drift of the cochlea, and enlargement of the endolymphatic sac of the cochlea.
본 명세서에서 사용되는 용어, "난청"은 와우관의 소리를 감지하는 기능에 이상이 생기거나 소리에 의한 자극을 뇌로 전달하는 청신경의 이상으로 나타나는 감각신경성 난청을 의미할 수 있다. 나아가, 본 발명의 난청은 SLC26A4 돌연변이 유전자를 부모로부터 받음으로써 나타날 수 있는 선천성 난청을 포함할 수 있다. As used herein, the term " hearing loss " may refer to sensory neural deafness, which is caused by an abnormality in the function of detecting the sound of the cochlea or an abnormality of the auditory nerve transmitting the stimulation by sound to the brain. Further, the hearing loss of the present invention may include congenital hearing loss that may occur by receiving the SLC26A4 mutation gene from the parent.
펜드리드 증후군에 대한 치료제, 치료법의 개발에 있어서, 펜드리드 증후군 동물 모델은 치료 후보 물질에 대한 효과를 입증하는 전 임상단계에서 매우 중요할 수 있다.In the development of therapies and therapies for Pendream syndrome, animal models of Pendrim syndrome can be very important in the pre-clinical phase of demonstrating efficacy against candidate therapeutic agents.
본 명세서에서 사용되는 용어, "동물 모델"은 질환 동물 모델을 의미한다. 구체적으로, 동물 모델은 인간의 질병과 유사한 상태의 질병에 걸리거나 선천적으로 그 질병에 걸리도록 만들어낸 동물 모델일 수 있다. 본 명세서에서 동물 모델은 펜드리드 증후군 동물 모델일 수 있다. 또한, 본 발명의 펜드리드 증후군 동물 모델로 이용될 수 있는 동물은 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지 또는 염소의 비인간 동물일 수 있다. 바람직하게 펜드리드 증후군 동물 모델은 마우스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. As used herein, the term " animal model " refers to a disease animal model. Specifically, an animal model may be an animal model that has acquired a condition that is similar to that of a human disease or that has inherently caused the disease. The animal model herein may be an animal model of Pendream syndrome. In addition, the animal that can be used as an animal model of Pendream syndrome of the present invention may be a non-human animal such as a monkey, dog, cat, rabbit, guinea pig, rat, mouse, cattle, sheep, pig or goat. Preferably, the Pendream syndrome animal model may be, but is not limited to, a mouse.
본 발명의 펜드리드 증후군 동물 모델은 펜드리드 증후군에 따른 난청 및 와우관 기형에 대한 치료제, 치료법 개발에 있어서, 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 이식된 동물 모델이 바람직할 수 있다. 본 명세서에는, 예시적으로 펜드리드 증후군 환자에게서 가장 큰 빈도로 나타나는 SLC26A4 돌연변이 유전자인, 인간 p.H723R 돌연변이의 유전자가 이식된 동물 모델을 이용한 펜드리드 증후군 동물 모델을 설명한다. 그러나, 이에 제한되지 않고 펜드리드 증후군과 연관된 다양한 SLC26A4 돌연변이 유전자가 이식된 동물 모델 또한, 본 발명이 제공하는 펜드리드 증후군 동물 모델 제작 방법을 이용하여 펜드리드 증후군 동물 모델로서 제공될 수 있다. 예를 들어, 펜드리드 증후군과 연관된 SLC26A4 돌연변이 유전자는 p.H723R, p.T410M, p.L676Q 및 pM147V 유전자 일 수 있다.An animal model of Pendream syndrome according to the present invention may be preferably an animal model in which a human SLC26A4 mutant gene has been transplanted in the development of therapies and therapies for deafness and warts anomalies according to Pendream syndrome. Herein, we describe an animal model of Peddle syndrome using an animal model transplanted with the gene of human p.H723R mutation, which is an SLC26A4 mutation gene, which is exemplified by the greatest incidence in patients with Pendream syndrome. However, an animal model in which a variety of SLC26A4 mutation genes associated with Pendream syndrome are implicated, including but not limited to, can also be provided as an animal model of Pendrim syndrome using the method of producing Pendrim syndrome animal models provided by the present invention . For example, the SLC26A4 mutation gene associated with Pendrim syndrome may be the p.H723R, p.T410M, p.L676Q, and pM147V genes.
이상의 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 이식된 동물 모델은 펜드리드 증후군 인간 환자에게서 나타나는 난청 및 와우관의 기형이 나타날 수 있어, 펜드리드 증후군 동물 모델로 이용될 수 있다. 나아가, 인간 SLC26A4 돌연변이 의 유전자가 이식된 동물 모델은 전술한 증상에 제한되지 않고 펜드리드 증후군 인간 환자에게서 나타날 수 있는 다양한 증상들을 나타낼 수 있다. Animal models transplanted with the above human SLC26A4 mutant gene can be used as an animal model of Pendrill's syndrome, which may result in deafness and womb duct anomalies in human patients with Pendrim syndrome. Furthermore, the animal model transplanted with the gene of human SLC26A4 mutation is not limited to the above-mentioned symptoms, but may exhibit various symptoms that may occur in human patients with Pendrim syndrome.
SLC26A4 유전자는 내이, 콩팥 또는 갑상선에서 발현할 수 있음에 따라, 펜드리드 증후군 동물 모델 내의 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자 또한 내이, 콩팥 또는 갑상선에서 발현할 수 있다. 그러나, SLC26A4 유전자 돌연변이에 의한 난청이 유발된 펜드리드 증후군 동물 모델을 위해, 동물 모델은 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 다른 부위를 제외한 내이에서만 발현하는 모델이 바람직할 수 있다. As the SLC26A4 gene can be expressed in the inner ear, kidney or thyroid, the human SLC26A4 mutant gene in the Pendream syndrome animal model can also be expressed in the inner ear, kidney or thyroid. However, for an animal model of Pendrill's syndrome in which hearing loss has been induced by SLC26A4 mutation, an animal model may be preferred in which the human SLC26A4 mutant gene is expressed only in the inner ear except for the other regions.
본 명세서에서 사용되는 용어, "발현"은 유전자의 발현, 더 나아가 단백질의 생성을 의미할 수 있다. 예를 들어, 동물 모델 내의 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자의 발현은 돌연변이의 인간 SLC26A4 유전자의 전사에 의한 mRNA를 포함하는 전사체의 생성, 또는 p.H723R 돌연변이를 갖는 인간 SLC26A4 유전자의 번역에 의한 펜드린 단백질의 생성일 수 있다. As used herein, the term " expression " may refer to the expression of a gene, and moreover, the production of a protein. For example, the expression of a human SLC26A4 mutation gene in an animal model can be used to generate a transcript that includes mRNA by transcription of the human SLC26A4 gene of the mutation, or to a translation of the pendrin protein by translation of the human SLC26A4 gene with the p.H723R mutation Lt; / RTI >
다만, 펜드리드 증후군 동물 모델에 대하여 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자의 이식을 위해 이용되는 전이 유전자 (transgene) 내에 loxP가 존재하는 경우, 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자의 발현이 일어나지 않을 수 있다. 이때, loxP는 전사를 중단시키는 염기서열 또는 유전자 자리 (locus) 일 수 있다. 예를 들어, 유전자의 전사 단계에서 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 삽입된 유전자 자리 앞에 loxP가 존재하는 경우, 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자의 발현이 일어나지 않을 수 있다. 즉, 이러한 동물 모델은 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 이식되었음에도, 난청 또는 와우관 기형등과 같은, 인간 펜드리드 증후군 환자에게서 나타나는 증상이 나타나지 않을 수 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, cre-재조합효소 (cre-recombinase) 가 이용될 수 있다. cre-재조합효소는 loxP를 인식하여 이를 절단할 수 있는 효소이다. 예를 들어, cre-재조합효소가 발현되는 부위를 갖는 동물 모델에 loxP와 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자를 포함하는 전이 유전자를 주입할 경우, loxP는 제거되고, 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자는 cre-재조합효소가 발현되는 부위에서 발현할 수 있다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른, 동물 모델은 내이에서 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자, 특히 이들 중 p.H723R 돌연변이 유전자가 발현될 수 있도록, 내이에 특이적으로 cre-재조합효소를 발현하는 동물 모델, 구체적으로 cre-재조합효소를 발현하는 마우스일 수 있다. However, the expression of the human SLC26A4 mutant gene may not occur when loxP is present in the transgene used for the transplantation of the human SLC26A4 mutant gene for the Pendream syndrome animal model. At this time, loxP may be a nucleotide sequence or locus that stops transcription. For example, if loxP is present in front of the locus in which the human SLC26A4 mutation gene is inserted in the transcription step of the gene, expression of the human SLC26A4 mutation gene may not occur. That is, even though the human SLC26A4 mutant gene has been transplanted, these animal models may not exhibit the symptoms that appear in human Pendrite syndrome patients, such as deafness or wow tuberculosis. To solve this problem, a cre-recombinase can be used. The cre-recombinant enzyme is an enzyme capable of recognizing loxP and cleaving it. For example, when a transgene containing loxP and a human SLC26A4 mutation gene is injected into an animal model having a region where cre-recombinase is expressed, loxP is removed and the human SLC26A4 mutant gene is expressed in a cre-recombinant enzyme Lt; / RTI > site. Accordingly, an animal model according to an embodiment of the present invention is an animal model expressing a cre-recombinant enzyme specifically in the cerebrospinal fluid such that a human SLC26A4 mutant gene, particularly a p.H723R mutant gene thereof, can be expressed in the inner ear, Specifically, it may be a mouse expressing a cre-recombinant enzyme.
나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른, 마우스는 마우스 본연의 SLC26A4 유전자가 결손 (knock-out) 되고, 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 이식된 마우스일 수 있다. Furthermore, according to one embodiment of the present invention, the mouse may be a mouse in which the mouse-inherent SLC26A4 gene is knocked out and the human SLC26A4 mutant gene is transplanted.
이에, 본 명세서에서 사용되는 용어 "SLC26A4 유전자가 결손된 마우스"는 마우스 본연의 SLC26A4 유전자가 결손된 마우스를 의미할 수 있다. 마우스의 SLC26A4 유전자를 결손 시키는 방법으로는 전술한 loxP와 cre-재조합효소를 이용하는 방법이 있을 수 있다. 예를 들어, 타겟 유전자인 마우스의 SLC26A4 유전자의 양 옆에 loxP를 삽입한 마우스와 cre-재조합효소를 발현하는 마우스를 교배시킴으로써, 마우스의 SLC26A4 유전자가 결손된 마우스를 얻을 수 있다. Thus, the term " SLC26A4 gene deficient mouse " as used herein may mean a mouse lacking the original SLC26A4 gene of the mouse. As a method of disrupting the SLC26A4 gene in a mouse, there may be a method using the above-mentioned loxP and cre-recombinant enzyme. For example, a mouse lacking the SLC26A4 gene of the mouse can be obtained by crossing a mouse in which loxP is inserted on both sides of the SLC26A4 gene of a mouse as a target gene and a mouse expressing a cre recombinase.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 내이에서 특이적으로 cre-재조합효소를 발현하는 마우스와 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 형질 주입된 마우스를 교배하여 1세대 마우스를 얻는 단계, 1세대 마우스와 SLC26A4 유전자가 결손된 마우스를 교배하여 펜드리드 증후군 마우스 모델은 얻는 단계를 포함하는, 펜드리드 증후군 동물 모델 제조 방법이 제공된다.According to one embodiment of the present invention, a step of obtaining a first-generation mouse by crossing a mouse expressing a cre-recombinant enzyme specifically in the inner ear with a mouse into which a human SLC26A4 mutant gene has been transplanted to obtain a first generation mouse, To obtain a Pendlet syndrome mouse model. ≪ Desc / Clms Page number 3 >
본 명세서에서 사용되는 용어, "형질 주입"는 외부로부터 DNA를 받아들여 생물체의 유전적인 성질이 변하는 것을 의미할 수 있다. 형질전환 방법으로는 리보솜의 사용, 전기천공, 유리 DNA 업테이크를 증가시키는 화학물질, 숙주세포로 DNA 직접 주입, 입자 총 충격 및 마이크로발사를 이용한 방법이 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않고 더 다양한 방법이 형질전환 방법으로 이용될 수 있다. As used herein, the term " trait injection " may mean that a genetic property of an organism is changed by receiving DNA from the outside. Transformation methods may include, but are not limited to, use of ribosomes, electroporation, chemicals that increase the uptake of the DNA, direct DNA injection into the host cell, particle gun impact, and micro- Can be used as a transformation method.
본 명세서에서 사용되는 용어, "1세대 마우스"는 내이에서 인간 p.H723R 돌연변이 유전자와 마우스 SLC26A4 유전자가 발현하는 마우스를 의미할 수 있다. 1세대 마우스는 전술한 바와 같이 cre-재조합효소를 발현하는 마우스와 인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 형질 주입된 마우스를 교배하여 얻을 수 있는데, 이때 cre-재조합효소를 발현하는 마우스는 Foxg1-cre 마우스를 이용하는 것이 바람직할 수 있다. 구체적으로, Foxg1의 프로모터 (promoter) 는 내이 특이적일 수 있어, Foxg1-cre 마우스의 cre-재조합효소는 내이 특이적으로 발현할 수 있다. 또한, cre-재조합효소를 발현하는 마우스로 알려진 pax2-cre 마우스를 이용할 경우, pax2-cre 마우스와 인간 SLC26A4 유전자가 형질 주입된 마우스를 교배하여 얻은 마우스는 펜드리드 증후군 동물 모델에 대한 대조군 모델로 이용될 수 있다. 이러한 마우스는 인간 SLC26A4 유전자가 마우스의 내이뿐만 아니라 콩팥, 갑상선에서 발현할 수 있다. 이의 결과로, pax2-cre 마우스와 인간 SLC26A4 유전자가 형질 주입된 마우스를 교배하여 얻은 마우스는 예를 들어 잘못 폴딩 펜드린 단백질이 콩팥이나 갑상선 등에서 발현되어 정상 마우스에 비하여 수명이 짧을 수 있다. 따라서, pax2-cre 마우스는 펜드리드 증후군 동물 모델로 이용하는데 부적합할 수 있다. As used herein, the term " first generation mouse " may refer to a mouse p.H723R mutant gene and a mouse SLC26A4 gene expressed in the inner ear. First-generation mice can be obtained by crossing a mouse expressing the cre-recombinant enzyme and a mouse transfected with the human p.H723R mutant gene as described above, wherein the mouse expressing the cre-recombinant enzyme is Foxg1-cre mouse May be preferred. Specifically, the promoter of Foxg1 may be innate-specific, and the cre-recombinant enzyme of Foxg1-cre mouse can specifically express inner-specificity. In addition, when pax2-cre mice, known as mice expressing cre-recombinase, were used, mice obtained by crossing of pax2-cre mice with human SLC26A4 transgenic mice were used as a control model for Pendrij syndrome animal models Can be used. These mice can express the human SLC26A4 gene in the inner ear of the mouse as well as in the kidney and thyroid. As a result, a mouse obtained by crossing between a pax2-cre mouse and a mouse into which a human SLC26A4 gene has been transfected has a defective folding pendrin protein expressed in the kidney or thyroid, for example, and may have a shorter lifespan than a normal mouse. Thus, pax2-cre mice may be unsuitable for use as Pender syndrome animal models.
본 명세서에서 사용되는 용어, "펜드리드 증후군 마우스 모델"은 내이에서 마우스 SLC26A4 유전자가 결손된, 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 발현하는 마우스를 의미할 수 있다. 즉, 전술한 1세대 마우스와 SLC26A4 유전자가 결손된 마우스를 교배하여 얻은 2세대 마우스들 중 상기 1세대 마우스로부터 SLC26A4 돌연변이 유전자를 받은 마우스들은 펜드리드 증후군 마우스 모델로 이용될 수 있다. 이와 같은 펜드리드 증후군 마우스 모델은 이형접합체일 수 있다. 즉, 펜드리드 증후군 마우스 모델은 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 이식되고, 마우스 SLC26A4가 결실된 7번 염색체를 가질 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 제조 방법으로 제조된 펜드리드 증후군 동물 모델은 내이에서 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 발현하며, 난청과 와우관의 기형과 같은 펜드리드 증후군과 연관된 표현형을 나타낼 수 있다. As used herein, the term "Pendream syndrome mouse model" may refer to a mouse expressing a human SLC26A4 mutant gene in which the mouse SLC26A4 gene is deficient in the inner ear. That is, among the second-generation mice obtained by crossing the above-described first-generation mouse and the SLC26A4 gene-deficient mouse, the mice that received the SLC26A4 mutation gene from the first-generation mouse can be used as a mouse model of Predride syndrome. Such Pendrimed syndrome mouse models may be heterozygous. That is, the PendriD syndrome mouse model can have chromosome 7, in which the human SLC26A4 mutation gene has been transplanted and the mouse SLC26A4 has been deleted. Thus, the Pendream syndrome animal model produced by the method of the present invention expresses the human SLC26A4 mutation gene in the inner ear and can express the phenotype associated with Pendrim syndrome such as deafness and womb tube malformation have.
나아가, 이상의 방법으로 제조된 펜드리드 증후군 동물 모델들을 교배하여 얻은 3세대 마우스들 중, 동형접합체의 마우스들은 난청 또는 와우관의 기형 증상의 정도가 펜드리드 증후군 동물 모델보다 심각할 수 있다. 즉, 3세대 마우스는 7번 염색체에 동형의 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자를 갖고 있어, 펜드리드 증후군과 연관된 표현형이 보다 뚜렷하게 나타날 수 있다.Furthermore, of the third generation mice obtained by crossing the animal models of Pendre syndrome produced by the above method, the mice of the homozygous can be more severe than the Pendre syndrome animal model in the degree of deformity of the hearing loss or cochlear duct. That is, the third generation mouse has the homologous human SLC26A4 mutation gene on chromosome 7, so that the phenotype associated with Pendrim syndrome can be more pronounced.
본 발명의 일 실시예에 따른, 형질 주입된 마우스는 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 삽입된 cre-재조합효소 유도 전이 유전자 (cre-recombinase inducible transgene) 를 형질 주입한 마우스와 대응할 수 있다.According to one embodiment of the present invention, a transgenic mouse can be matched with a mouse transfected with a cre-recombinase inducible transgene into which a human SLC26A4 mutation gene is inserted.
본 명세서에서 사용되는 용어, "전이 유전자"는 DNA기술에 의해 외부에서 인공적으로 도입한 유전자를 의미한다. 이러한 전이 유전자는 외부 핵산체를 형질 전환 또는 형질 주입 동물에 옮길 수 있다. 본 발명의 cre-재조합효소 유도 전이 유전자는 전이 유전자의 구조에 loxp를 포함하여, cre-재조합효소에 의해 인식될 수 있다. As used herein, the term " metastatic gene " refers to a gene that has been artificially introduced externally by DNA technology. Such a transgene can transfer an exogenous nucleic acid to a transgenic or transgenic animal. The cre-recombinant enzyme inducible transgene of the present invention can be recognized by a cre-recombinant enzyme including loxp in the structure of the transgene.
1세대 마우스의 제작을 위해서 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자 또는 인간 SLC26A4 유전자가 삽입된 cre-재조합효소 유도 전이 유전자를 형질 입하는 방법으로는 미세 주입 (microinjection) 이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자 또는 인간 SLC26A4 유전자가 삽입된 cre-재조합효소 유도 전이 유전자는 마우스 수정란에 직접 미세 주입될 수 있다. 이의 결과로 생성된 수정란이 대리모에 이식되고, 이로부터 태어난 마우스는 상기 유도 전이 유전자가 형질 주입된 마우스로 이용될 수 있다. 이때, 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자 또는 인간 SLC26A4 유전자가 형질 주입된 마우스는 유전자형 검사 (genotyping) 를 통해 선별될 수 있다. Microinjection may be desirable as a method for producing a recombinase-inducible transgene in which a human SLC26A4 mutant gene or a human SLC26A4 gene is inserted for generation of a first generation mouse. For example, a human SLC26A4 mutant gene or a cre-recombinant enzyme-induced transgene in which the human SLC26A4 gene is inserted can be directly microinjected into a mouse embryo. The resulting embryos are transplanted into surrogate mothers, and the resulting mice can be used as mice transduced with the inducible metastasis gene. At this time, a mouse in which the human SLC26A4 mutation gene or the human SLC26A4 gene is transfected can be selected through genotyping.
또한, cre-재조합효소 유도 전이 유전자 내에 삽입된 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자는 삽입된 유전자 자리에 따라, 형질 주입된 마우스 내에서의 발현 수준이 달라질 수 있다.In addition, the human SLC26A4 mutation gene inserted into the cre-recombinant enzyme inducible transgene may have a different expression level in the transduced mouse depending on the inserted gene locus.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따른, 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자는 cre-재조합효소 유도 전이 유전자 내의 XhoI 및 NotI 핵산 내부가수분해효소 (endonuclease) 인식 자리 사이에 삽입될 때 높은 발현 수준을 나타낼 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않고 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자는 마우스 내에서 이의 발현이 가능한, cre-재조합효소 유도 전이 유전자내의 모든 유전자 자리에 삽입될 수 있다. Accordingly, the human SLC26A4 mutant gene according to an embodiment of the present invention may exhibit a high expression level when inserted between the XhoI and NotI nucleic acid internal hydrolase recognition sites in the cre-recombinant enzyme inducible transgene. However, without being limited thereto, the human SLC26A4 mutation gene can be inserted into all gene loci within the cre-recombinant enzyme inducible transgene, which can express it in the mouse.
나아가, 본 발명의 cre-재조합효소 유도 전이 유전자는 프로모터, 외래 유전자인 인간 SLC26A4 유전자, loxp를 포함할 수 있다. 예를 들어, cre-재조합효소 유도 전이 유전자는 병아리 ß-엑틴 프로모터 (Chick ß-actin promoter), 발현을 증강 시켜주는 CMV-IE-인헨서 (CMV-IE-enhancer), 두 개의 loxp와 loxp 사이에 존재하는 PGK-Neo PGK-pA (Phosphoglucokinase-Neomycin Phosphoglucokinase-poly A) 를 포함할 수 있고, XhoI 및 NotI 제한효소가 인식할 수 있는 염기서열을 포함할 수 있다. 이때, 인간 SLC26A4 유전자 또는 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자는 XhoI 및 NotI 제한효소 자리 사이에 삽입되는 것이 바람직할 수 있다. 또한, cre-재조합효소 유도 전이 유전자는 인간 SLC26A4 유전자 또는 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 삽입된 자리 뒤에, 이의 발현을 증가시킬 수 있는 토끼-ß-글로블린 pA (Rabbit-ß-Globlin pA) 를 더 포함할 수 있다. 이상의 구조를 갖는 cre-재조합효소 유도 전이 유전자는 cre-재조합 효소에 의해 loxp-PGK-Neo PGK-pA-loxp 복합 구조가 절단됨으로써 병아리 ß-엑틴 프로모터에 인간 SLC26A4 유전자 또는 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 연결될 수 있다. 이의 결과로 형질 주입된 마우스 내의 인간 SLC26A4 유전자 또는 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자는 발현할 수 있다. Furthermore, the cre-recombinant enzyme inducible transgene of the present invention may include a promoter, a human SLC26A4 gene as a foreign gene, and loxp. For example, the cre-recombinant enzyme-inducible transgene contains the chick ß-actin promoter, the CMV-IE-enhancer that enhances expression, the two loxp and loxp NeoCyme Phosphoglucokinase-polyA (PGK-Neo PGK-pA) present in the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and may include a nucleotide sequence recognizable by XhoI and NotI restriction enzymes. At this time, it may be preferable that the human SLC26A4 gene or the human SLC26A4 mutation gene is inserted between the XhoI and NotI restriction enzyme sites. In addition, the cre-recombinant enzyme-inducible transgene may further contain a rabbit-ß-Globlin pA that can increase the expression thereof after insertion of the human SLC26A4 gene or the human SLC26A4 mutation gene have. The CRE-recombinant enzyme-derived transgene having the above structure is cleaved by the cre-recombinant enzyme to cleave the loxp-PGK-Neo PGK-pA-loxp complex structure so that the human SLC26A4 gene or the human SLC26A4 mutant gene can be linked to the chick ß- have. As a result, the human SLC26A4 gene or the human SLC26A4 mutation gene in the transfected mouse can be expressed.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 펜드리드 증후군 동물 모델에 대하여 펜드리드 증후군 치료용 후보 물질을 투여하는 단계 및 후보 물질을 투여한 동물 모델에 대한 청력을 측정하거나 와우관의 내림프관 또는 내림프낭의 크기를 측정하는 단계를 포함하는, 펜드리드 증후군 치료용 조성물 스크리닝 방법이 제공된다. According to one embodiment of the present invention, there is provided a method of treating a Pendlet syndrome animal model, comprising administering a candidate substance for treating Pendrim syndrome, measuring the hearing of the animal model administered with the candidate substance, There is provided a method for screening a composition for treating Pendlet syndrome, comprising the step of measuring the size of the lymphocyte.
본 명세서에서 사용되는 용어, "스크리닝"은 약물 스크리닝을 의미할 수 있으며, 펜드리드 증후군의 증상에 대하여 개선 효과를 갖는 펜드리드 증후군 치료용 조성물의 후보 물질을 탐색하는 것 일수 있지만, 이에 제한되지 않는다.As used herein, the term " screening " may refer to drug screening and may search for a candidate for a composition for the treatment of Pendream syndrome which has an improvement effect on symptoms of Pendrim syndrome, It does not.
나아가, 본 명세서에서 사용되는 용어, "후보 물질"은 펜드리드 증후군에 따른 증상에 대하여 개선 효과를 기대할 수 있는 모든 물질을 의미할 수 있고, 이의 형태, 종류가 제한된 것은 아니다. 예를 들어, 후보 물질은 SLC26A4 돌연변이 유전자 특히, p.H723R 돌연변이 유전자의 발현을 억제하거나 이의 발현 수준을 낮출 수 있는 화학 합성물, 재조합 단백질, 천연물이 될 수 있다. 또한, 유전자 치료 (gene therapy) 의 연구에 있어, 후보 물질은 이에 이용되는 정상의 SLC26A4 유전자 자체가 될 수 있다.Furthermore, the term " candidate substance " as used herein may mean any substance that can be expected to have an improvement effect on the symptoms according to Pendrim syndrome, and its form and kind are not limited. For example, a candidate substance may be a chemical compound, a recombinant protein, or a natural substance that can inhibit the expression of the SLC26A4 mutant gene, particularly the p.H723R mutant gene, or lower its expression level. Also, in the study of gene therapy, the candidate material may be the normal SLC26A4 gene itself.
본 명세서에서 사용되는 용어, "치료"는 펜드리드 증후군 치료용 후보 물질을 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델에 투여했을 때, 펜드리드 증후군에 따른 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다. 예를 들어, 펜드리드 증후군에 대한 치료 효과를 갖는 치료용 후보 물질을 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델에 투여했을 때, 동물 모델은 투여 전보다 난청의 개선 또는 와우관의 기형의 개선을 나타낼 수 있다. As used herein, the term " treatment " is intended to mean that a candidate for Pendream syndrome treatment is administered to an animal model of Pendream syndrome according to one embodiment of the present invention to improve symptoms associated with Pendrim syndrome It means all the activities that enable us to be benefited. For example, when a therapeutic candidate having a therapeutic effect on Pendrim syndrome is administered to an animal model of Pendream syndrome according to an embodiment of the present invention, the animal model may be used to improve hearing loss, May indicate an improvement in malformations.
치료용 후보 물질에 대한 난청과 와우관의 기형의 개선효과를 확인하기 위해, 청력 측정 또는 와우관의 내림프관, 와우관 내림프낭의 크기를 측정하는 방법이 이용될 수 있으나, 전술한 것에 제한되지 않고 다양한 방법들이 치료용 후보 물질에 대한 효과를 확인할 수 있는 방법으로 이용될 수 있다. In order to confirm the hearing loss and the improvement of the anomaly of the cochlear duct, hearing measurement or a method of measuring the size of the lymph node in the inner lumen of the cochlea and the lymphocyte in the cochlear duct may be used. However, And various methods can be used as a method for confirming the effect on the therapeutic candidate substance.
청력 측정방법으로는 ABR 검정 (auditory brainstem response test) 가 있을 수 있고, 와우관의 내림프관, 와우관 내림프낭의 크기를 측정하는 방법으로는 CT촬영이 있을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. Auditory brainstem response test (ABR) can be used to measure the hearing level. CT images can be obtained by measuring the size of the lymphatic vessels of the cochlear ducts and the lymphocytes in the cochlear ducts.
발명의 일 실시예에 따른, 후보 물질의 투여는 복강내 투여, 비강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 경피 투여, 피하 투여, 흡입 투여, 경구 투여, 난원창내 투여, 고막내 주사 자궁내 주사일 수 있다. 바람직한 후보 물질의 투여 방법은 난원창내 투여 고막내 주사 또는 자궁내 주사일 수 있으나 이에 제한되지 않고 펜드리드 증후군에 대한 치료용 후보 물질이 목적하는 부위에 도달 할 수 있다면, 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 나아가, 치료용 후보 물질을 투여하고자 하는 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델의 령기, 또는 임신 여부에 따라, 투여 방법은 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 펜드리드 증후군 모델이 생후 1주령 내지 2개월령의 마우스일 경우, 후보 물질의 바람직한 투여 방법은 고막내 주사 또는 난원창의 투여일 수 있다. 이때, 난원창의 투여는 수술적치료로 중이강을 노출시키고, 내이로 들어가는 난원창을 노출시킨 후에 후보 물질을 직접 난원창에 뿌려주거나 미세바늘 (micropipette)로 찔러서 주입하는 형식으로 수행될 수 있다. According to one embodiment of the invention, the administration of the candidate substance may be performed by intraperitoneal administration, intranasal administration, intravenous administration, intramuscular administration, transdermal administration, subcutaneous administration, inhalation administration, oral administration, It can be my shot. The preferred method of administering the candidate agent may be intramuscular injection or intrauterine injection in the oviduct, but not limited thereto, if the candidate for treatment for Pendrim syndrome can reach the desired site, . Further, depending on the age of the Pendream syndrome animal model according to one embodiment of the present invention in which the candidate therapeutic substance is to be administered, or whether it is pregnant, the administration method can be easily selected by those skilled in the art. For example, when the Pendream syndrome model is a mouse at 1 to 2 months of age, the preferred method of administration of the candidate agent may be administration of intramuscular injection or oophorectomy. At this time, the administration of oophorectomy can be performed by exposing the middle ear canal by surgical treatment, exposing the oophorus entering the oophoria, injecting the candidate material directly to the oophorus, or injecting with a micropipette.
펜드리드 증후군에 따른 선천성 난청의 경우, 전술한 바와 같이 생후 2년 안의 치료가 중요할 수 있다. 이에, 펜드리드 증후군에 따른 선천성 난청에 대한 치료용 후보 물질을 스크리닝하기 위해서는, 본 발명의 일 실시예에 따른, 펜드리드 증후군 동물 모델이 생후 1주령 내지 2개월령의 마우스인 것이 바람직 할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the case of congenital hearing loss due to Pendream syndrome, treatment within two years of birth may be important as described above. Therefore, in order to screen candidates for treatment of congenital hearing loss according to Pendrim syndrome, it is preferable that an animal model of Pendrim syndrome according to an embodiment of the present invention is a mouse of 1 week old to 2 months old have. However, it is not limited thereto.
또한, 펜드리드 증후군에 따른 선천성 난청의 치료는 펜드리드 증후군의 태아를 임신한 산모에 대해 이루어질 수 있다. 이에, 후보 물질의 투여는 펜드리드 증후군 마우스 모델들을 교배하여 임신한 마우스를 얻는 단계 및 임신한 마우스에 상기 펜드리드 증후군 치료용 후보 물질을 투여하는 것일 수 있다. 이때, 후보 물질의 투여 방법은 자궁내 주사가 바람직할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로, 자궁내 주사는 후보 물질을 마우스의 자궁 내 귀소포 (otic vesicle) 에 직접 미세 주입하는 방법이 있을 수 있다. In addition, the treatment of congenital hearing loss according to Pendrite syndrome can be performed on a woman who is pregnant with a Pendrite syndrome fetus. Thus, the administration of the candidate substance may be a step of crossing the Pender syndrome mouse models to obtain a pregnant mouse, and a step of administering to the pregnant mouse a candidate substance for treating the Pender syndrome. At this time, the method of administration of the candidate substance may be preferably, but not limited to, intrauterine injection. More specifically, intrauterine injection may be a method of microinjecting a candidate substance directly into the uterine vesicle of a mouse.
여기서, 펜드리드 증후군 마우스 모델들은 전술한 바와 같이, 7번 염색체의 대립 유전자 중 하나만이 인간 SLC26A4 돌연변이를 갖는 이형접합체, 또는 7번 염색체의 대립 유전자 모두 인간 SLC26A4 돌연변이를 갖는 동형접합체의 마우스일 수 있다. 이에 따라, 이들로부터 태어난 마우스 또한 동형접합체 또는 이형접합체의 마우스로서, 부모와 같이 펜드리드 증후군과 연관된 표현형을 나타낼 수 있어, 펜드리드 증후군에 따른 선천성 난청 모델로 이용될 수 있다. Here, the Predry syndrome mouse models are as described above, in which only one of the alleles of chromosome 7 is a heterozygote having a human SLC26A4 mutation, or alleles of chromosome 7 are mouse of a homozygous mutant having a human SLC26A4 mutation have. Thus, mice born from these can also be homozygous or heterozygous mouse, expressing phenotypes associated with Pendrim syndrome like parents, and can be used as a congenital hearing impairment model according to Pendrim syndrome.
임신한 마우스의 자궁 내의 펜드린 단백질의 수준 또는 SLC26A4 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 펜드리드 증후군의 치료용 후보 물질에 대한 효과가 확인될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델에 대한 자궁 내의 펜드린 단백질의 수준 또는 SLC26A4 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 확인될 수 있다. , 치료용 후보 물질의 효과는 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델 내의 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자의 발현 수준의 감소를 측정함으로써 확인될 수 있다. 그러나 펜드리드 증후군 치료용 후보 물질에 대한 평가를 위해, 펜드린 단백질의 수준 또는 SLC26A4 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 전술한 임신한 마우스의 펜드리드 증후군 모델에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 후보 물질에 대한 효과를 확인하고자 하는 펜드리드 증후군 동물 모델이 1주령 내지 2개월령인 경우, 이의 내이에서의 펜드린 단백질의 수준 또는 SLC26A4 유전자의 발현 수준을 측정함으로써, 후보 물질에 대한 효과를 평가할 수 있다. By measuring the level of the Pendrin protein in the uterus of the pregnant mouse or the expression level of the SLC26A4 gene, the effect on candidate therapeutic agents of Pendrim syndrome can be confirmed. Further, it can be confirmed by measuring the level of the Pendrin protein in the uterus or the expression level of the SLC26A4 gene in a Pendream syndrome animal model according to an embodiment of the present invention. , The efficacy of the therapeutic candidate can be ascertained by measuring a decrease in the expression level of the human SLC26A4 mutation gene in a Pendream syndrome animal model according to one embodiment of the present invention. However, for the evaluation of candidate substances for treatment of Pendrim syndrome, the method of measuring the level of pendrin protein or the expression level of the SLC26A4 gene is not limited to the Pendrim syndrome model of the pregnant mouse described above. For example, by measuring the level of the pendrin protein in the inner ear or the expression level of the SLC26A4 gene when the Pendream syndrome animal model for which the effect on the candidate substance is to be determined is 1 to 2 months, The effect can be evaluated.
SLC26A4 유전자 또는 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응 (reverse transcription-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응 (competitive reverse transcription-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응 (realtime reverse transcription-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA, RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩 (DNA chip) 의 방법이 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The measurement of the expression level of the SLC26A4 gene or the human SLC26A4 mutant gene can be carried out by using reverse transcription-PCR, competitive reverse transcription-PCR, real-time reverse transcription-PCR, RNase protection assay (RPA), Northern blotting, and DNA chip (DNA chip) methods can be used, but the present invention is not limited thereto.
또한, 펜드린 단백질의 수준의 측정은 웨스턴 블랏 (Western blot), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석 (RIA, Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직 면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 결합 분석법 (complement fixation assay), 유세포분석 (FACS, fluorescence activated cell sorter) 및 단백질 칩 (protein chip) 의 방법이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. In addition, the level of pendrin protein can be determined by Western blotting, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion Immunoprecipitation Assay, Complement Fixation Assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), and Protein Chip (FACS) methods have been used for the treatment of cancer, But is not limited thereto.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples. It should be understood, however, that these examples are for illustrative purposes only and are not to be construed as limiting the scope of the invention.
본 발명은 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 이식된 동물 모델을 제공하고, 이를 이용하여 펜드리드 증후군의 치료제 나아가 치료방법의 개발에 유용한 펜드리드 증후군 동물 모델을 제공할 수 있는 효과가 있다.The present invention provides an animal model in which a human SLC26A4 mutant gene has been transplanted and provides an animal model of Pendlet syndrome which is useful for the development of a therapeutic agent for Pendrim syndrome and a therapeutic method using the same.
또한, 본 발명은 펜드리드 증후군에 의해 야기될 수 있는 감각신경성 난청에 대하여, 이에 대한 치료를 입증하는데 필수적일 수 있는 귀에서만 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 발현하는 동물 모델을 제공할 수 있는 효과가 있다. In addition, the present invention has the effect of providing an animal model in which the human SLC26A4 mutant gene is expressed only in the ear, which may be essential for proving treatment for sensory neural deafness, which may be caused by Pendream syndrome .
더 나아가, 본 발명은 펜드리드 증후군 동물 모델의 제조 방법을 제공할 수 있으며, 이에 의해 제조된 동물 모델은 펜드리드 증후군 치료용 조성물 스크리닝 방법에 이용될 수 있는 효과가 있다. Furthermore, the present invention can provide a method for producing an animal model of Pendream syndrome, and the animal model produced thereby can be used for screening a composition for treating Pendream syndrome.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.The effects according to the present invention are not limited by the contents exemplified above, and more various effects are included in the specification.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델의 제조 방법을 나타내는 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델을 포함한 5 가지 동물 모델에 대한 펜드린 단백질의 발현 수준을 나타내는 실험 결과이다.
도 3a는 마우스 본연의 SLC26A4 유전자를 갖는 마우스 모델의 와우관을 조직학적으로 분석하여 나타내는 실험 결과이다.
도 3b는 마우스 p.H723R 돌연변이 유전자를 갖는 마우스의 와우관을 조직학적으로 분석하여 나타내는 실험 결과이다.
도 3c는 인간 SLC26A4 유전자가 이식되고 마우스 본연의 SLC26A4 유전자는 결실된 마우스의 와우관을 조직학적으로 분석하여 나타내는 실험 결과이다.
도 3d는 인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 이식되고 마우스 본연의 SLC26A4 유전자는 결실된 마우스인 본 발명의 일 실시예에 따른, 펜드리드 증후군 동물 모델의 와우관을 조직학적으로 분석하여 나타내는 실험 결과이다.
도 3e는 인간 SLC26A4 유전자가 이식되지 않고 마우스 본연의 SLC26A4 유전자는 결실된 마우스의 와우관을 조직학적으로 분석하여 나타내는 실험 결과이다.
도 3f는 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델을 포함하는 4 가지 동물 모델에 대한 와우관을 조직학적으로 분석하여 나타내는 실험 결과이다.
도 3g는 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델을 포함하는 4 가지 동물 모델에 대한 와우관의 내림프관 및 내림프낭의 크기를 측정하여 나타낸 실험 결과이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델을 포함하는 4 가지 동물 모델에 대한 ABR 검정의 결과를 나타내는 실험 결과이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델을 포함하는 4 가지 동물 모델에 대한 ABR 검정의 결과를 나타내는 실험 결과이다.
도 5a는 마우스 p.H723R 돌연변이 유전자를 갖는 마우스를 이용한 펜드리드 증후군 동물 모델에 대한 서던 블롯, 와우관의 조직학적 분석 및 ABR 검정의 결과를 나타내는 실험 결과이다.
도 5b 및 5c는 pax2 cre-마우스를 이용한 펜드리드 증후군 동물 모델에 대한 와우관의 조직학적 분석 및 ABR 검정의 결과를 나타내는 실험 결과이다.1 is a diagram showing a method of manufacturing an animal model of Pendream syndrome according to an embodiment of the present invention.
Figure 2 is an experimental result showing the expression level of pendrin protein in five animal models including Pendream syndrome animal models according to one embodiment of the present invention.
FIG. 3A shows the results of histological analysis of the cochlea of a mouse model of mouse-derived SLC26A4 gene.
FIG. 3B is an experimental result showing histological analysis of a cochlear duct of a mouse having the mouse p.H723R mutant gene.
FIG. 3C shows the results of histological analysis of mouse cochlear ducts in which a human SLC26A4 gene has been transplanted and a mouse-derived SLC26A4 gene has been deleted.
FIG. 3D is an experimental result showing histological analysis of the cochlea of an animal model of Pendrim syndrome according to an embodiment of the present invention in which the human p.H723R mutant gene is transplanted and the mouse native SLC26A4 gene is deleted mouse .
FIG. 3E shows the results of an experiment in which a mouse SLC26A4 gene was not transplanted and the mouse original SLC26A4 gene was deleted and the mouse cochlear duct was histologically analyzed.
FIG. 3f is an experimental result showing histological analysis of cochlear ducts for four animal models including an animal model of Pendream syndrome according to an embodiment of the present invention.
FIG. 3g shows the results of measuring the size of the endolymphatic and endolymphatic sacs of the cochlea in four animal models including an animal model of Pendream syndrome according to an embodiment of the present invention.
4A is an experimental result showing the results of the ABR test for four animal models including the Pendream syndrome animal model according to one embodiment of the present invention.
Figure 4b is an experimental result showing the results of ABR assays for four animal models including Pendream syndrome animal models according to one embodiment of the present invention.
5A is an experimental result showing the results of histological analysis and ABR test of Southern blot, cochlear duct, and animal model of Peddor syndrome using a mouse having a mouse p.H723R mutant gene.
Figures 5b and 5c are experimental results showing the results of histological and ABR assays of cochlear ducts for pendridial syndrome animal models using pax2 cre-mice.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS The advantages and features of the present invention and the manner of achieving them will become apparent with reference to the embodiments described in detail below with reference to the accompanying drawings. It should be understood, however, that the invention is not limited to the disclosed embodiments, but is capable of many different forms and should not be construed as limited to the embodiments set forth herein. Rather, these embodiments are provided so that this disclosure will be thorough and complete, To fully disclose the scope of the invention to those skilled in the art, and the invention is only defined by the scope of the claims.
이하에서는, 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델 및 펜드리드 증후군 동물 모델 제조방법으로 제조된 마우스 모델에 대하여, 이에 대한 내이의 구조 분석, 청력 측정을 통해 펜드리드 증후군에 따른 난청 유발 정도를 평가하여 설명한다. 그러나, 후술되는 효과에 제한되지 않고 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델 및 펜드리드 증후군 동물 모델 제조방법으로 제조된 마우스 모델은 펜드리드 증후군에 따라 나타날 수 있는 다양한 증상이 유도될 수 있다. 나아가, 이하에서는 SLC26A4 유전자 돌연변이 중 인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 이식된 마우스를 예시적으로, 설명하나 이에 제한되는 것은 아니다. 이에, 본 발명에서 제공하는 펜드리드 증후군 동물 모델 및 펜드리드 증후군 동물 모델 제조방법으로 제조된 마우스 모델은 SLC26A4 유전자 돌연변이에 의해 나타날 수 있는 다양한 질환에 대하여, 이에 대한 동물 모델로서 이용될 수 있다. Hereinafter, an animal model of Pendream syndrome according to an embodiment of the present invention and a mouse model prepared by the method for producing Pendre syndrome animal model, The degree of induced hearing loss is evaluated and explained. However, the effect of the present invention is not limited to the following effects. An animal model of Pendream syndrome according to an embodiment of the present invention and a mouse model prepared by the method of manufacturing Pendre syndrome animal model may be various symptoms . Further, in the following, a mouse transplanted with a human p.H723R mutation gene among SLC26A4 mutation mutants is exemplarily described but not limited thereto. Accordingly, the mouse model prepared by the animal model of Pendream syndrome and the method of producing Pendlet syndrome animal model provided by the present invention can be used as an animal model for various diseases that may be caused by SLC26A4 gene mutation .
실시예 1: 펜드리드 증후군 동물 모델에 대한 평가Example 1: Evaluation of an animal model of Pendrim syndrome
펜드리드 증후군 동물 모델의 제조Manufacture of Pendrite syndrome animal models
이하에서는 실시예 1의 평가 이용되는 본 발명의 일 실시에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델 및 펜드리드 증후군 동물 모델 제조 방법으로 제조된 펜드리드 마우스 모델의 제조 방법에 대하여 설명한다. Hereinafter, an animal model of Pendream syndrome according to one embodiment of the present invention evaluated and used in Example 1, and a method of producing a pendrided mouse model prepared by the method of producing Pendlet syndrome animal models will be described.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델의 제조 방법을 나타내는 결과이다.1 is a diagram showing a method of manufacturing an animal model of Pendream syndrome according to an embodiment of the present invention.
도 1의 (a)를 참조하면, 마우스에 인간 p.H723R 돌연변이 유전자 또는 인간 SLC26A4 유전자의 이식을 위한 전이 유전자의 구조가 도시된다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델을 제조하기 위한 전이 유전자는 loxp가 포함된 cre-유도 전이 유전자이다. cre-재조합효소 유도 전이 유전자는 병아리 ß-엑틴 프로모터, CMV-IE-인헨서, 두 개의 loxp와 loxp 사이에 존재하는 PGK-Neo PGK-pA를 포함한다. 이때, 인간 SLC26A4 유전자 또는 인간 p.H723R 돌연변이 유전자는 XhoI 및 NotI 제한효소 자리 사이에 삽입된다. 또한, cre-재조합효소 유도 전이 유전자는 인간 SLC26A4 유전자 또는 인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 삽입된 자리 뒤에, 이의 발현을 증가시킬 수 있는 토끼-ß-글로블린 pA를 포함한다. 이상의 구조를 갖는 cre-재조합효소 유도 전이 유전자는 cre-재조합 효소에 의해 loxp-PGK-Neo PGK-pA-loxp 복합 구조가 절단됨으로써 병아리 ß-엑틴 프로모터에 인간 SLC26A4 유전자 또는 인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 연결될 수 있다. 이의 결과로 형질 주입된 마우스 내에서의 인간 SLC26A4 유전자 또는 인간 p.H723R 돌연변이 유전자는 발현할 수 있다. Referring to Figure 1 (a), the structure of the transgene for transplantation of human p.H723R mutant gene or human SLC26A4 gene into mouse is shown. Specifically, the transgene for producing an animal model of Pendream syndrome according to an embodiment of the present invention is a cre-induced transgene containing loxp. The cre-recombinant enzyme inducible transgene contains the chick ß-actin promoter, the CMV-IE-enhancer, and the PGK-Neo PGK-pA between the two loxp and loxp. At this time, the human SLC26A4 gene or the human p.H723R mutation gene is inserted between the XhoI and NotI restriction enzyme sites. In addition, the cre-recombinant enzyme inducible transgene contains a rabbit-β-globulin pA capable of increasing its expression after insertion of the human SLC26A4 gene or the human p.H723R mutant gene. The cre-recombinant enzyme-derived transgene having the above structure is cleaved by the cre-recombinant enzyme to cleave the complex structure of loxp-PGK-Neo PGK-pA-loxp, so that the human SLC26A4 gene or the human p.H723R mutant gene Can be connected. As a result, the human SLC26A4 gene or the human p.H723R mutation gene in the transfected mouse can be expressed.
도 1의 (b)를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델의 제조 방법이 도시된다. 구체적으로, 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자를 포함하는 cre-유도 전이 유전자가 이식된 cre-유도 전이 유전자 이식 마우스와 cre-foxg1 마우스를 교배하여 1세대 마우스를 얻는다. 1세대 마우스는 내이 조직에서 인간 p.H723R 돌연변이 유전자와 마우스 본연의 SLC26A4 유전자가 발현될 수 있다. 이때, 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자를 포함하는 cre-유도 전이 유전자가 이식된 마우스에서는 내이 조직에서 인간 SLC26A4 유전자와 마우스 본연의 SLC26A4 유전자가 발현될 수 있다. 그 다음, 1세대 마우스와 SLC26A4 유전자가 결손된 마우스를 교배하여 얻은 2세대 마우스를 얻는다. 이들 2세대 마우스들 중 1세대 마우스로부터 p.H723R 돌연변이 유전자를 받은 마우스들은 펜드리드 증후군 마우스 모델로 이용될 수 있다. 즉, 펜드리드 증후군 마우스 모델은 인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 이식되고 마우스 SLC26A4가 결신된, 7번 염색체를 갖는 이형접합체의 마우스일 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 일 실시예에 따른 제조 방법으로 제조된 펜드리드 증후군 동물 모델은 내이에서 인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 발현하며, 난청과 와우관의 기형과 같은 펜드리드 증후군과 연관된 표현형을 나타낼 수 있다. Referring to FIG. 1 (b), a method of manufacturing an animal model of Pendream syndrome in accordance with an embodiment of the present invention is illustrated. Specifically, a cre-induced transgene-transgenic mouse and a cre-foxg1 mouse transplanted with a cre-inducible transgene containing the human SLC26A4 mutant gene are crossed to obtain a first-generation mouse. First generation mice can express the human p.H723R mutant gene and the mouse native SLC26A4 gene in inner ear tissues. At this time, in mice transplanted with a cre-induced transgene containing the human SLC26A4 mutation gene, the human SLC26A4 gene and the mouse-derived SLC26A4 gene can be expressed in the inner ear tissue. Next, a second-generation mouse obtained by crossing the mouse of the first generation with the mouse lacking the SLC26A4 gene is obtained. Mice receiving the p.H723R mutant gene from the first generation of these second generation mice can be used as a model of Peddle syndrome mice. That is, the Pendream syndrome mouse model can be a mouse of heterozygous having the chromosome 7, in which the human p.H723R mutation gene is transplanted and the mouse SLC26A4 is deficient. Accordingly, the animal model of Pendrim syndrome produced by the method according to an embodiment of the present invention expresses a human p.H723R mutation gene in inner ear, and a phenotype associated with Pendrim syndrome such as deafness and womb duct malformation .
펜드리드 증후군 동물 모델에 대한 펜드린 단백질 수준 측정Pendrin Protein Levels for Pendrimed Syndrome Animal Models
펜드리드 증후군 동물 모델에 대한 펜드린 단백질 수준을 측정하기 위해 먼저, 5 가지 동물 모델을 준비한다. 구체적으로, 5 가지 동물 모델은 마우스 본연의 SLC26A4 유전자를 갖고 있는 마우스 (이하, 대조군), 인간 SLC26A4 유전자가 이식되지 않고 마우스 본연의 SLC26A4 유전자는 결실된 마우스 (이하, 인간 SLC26A4(-)), 인간 SLC26A4 유전자가 이식되고 마우스 본연의 SLC26A4 유전자는 결실된 마우스 (이하, 인간 SLC26A4(+)), 인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 이식되지 않고 마우스 본연의 SLC26A4 유전자는 결실된 마우스 (이하, 인간 p.H723R(-)) 및 본 발명의 펜드리드 증후군 동물 모델인 인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 이식되고 마우스 본연의 SLC26A4 유전자는 결실된 마우스 (이하, 인간 p.H723R(+)) 로 구성된다. 펜드린 단백질의 수준은 웨스턴 블랏을 이용하여 5 가지 모델의 내이에서 측정된다.To determine the level of pendrin protein for the Pendream syndrome animal model, first prepare five animal models. Specifically, the five animal models are mice (hereinafter, referred to as a control group) having a mouse-inherent SLC26A4 gene, mice lacking the human SLC26A4 gene (SLC26A4 (-)) (Hereinafter referred to as human SLC26A4 (+)), the mouse p.H723R mutant gene was not transplanted and the mouse original SLC26A4 gene was deleted (hereinafter, human p.H723R (-)) and a human p.H723R mutant gene of the Pendream syndrome animal model of the present invention is transplanted and the mouse original SLC26A4 gene is deleted (hereinafter, human p.H723R (+)). Levels of pendrin protein were measured in five models of inner ear using western blot.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델을 포함한 5 가지 동물 모델에 대한 펜드린 단백질의 발현 수준을 나타내는 실험 결과이다. Figure 2 is an experimental result showing the expression level of pendrin protein in five animal models including Pendream syndrome animal models according to one embodiment of the present invention.
도 2를 참조하면, 대조군과 대조적으로 인간 SLC26A4(-), 인간 SLC26A4(+), 인간 p.H723R(-) 및 인간 p.H723R(+)에서 펜드린 단백질의 수준이 낮게 측정된 것을 알 수 있다. 나아가, 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드린 증후군 동물 모델인 인간 p.H723R(+)에서는 정상의 인간 SLC26A4(+)과 다르게 단일 밴드가 나타난다. 즉, 펜드린 단백질이 당단백질인 것을 고려했을 때, 정상의 인간 SLC26A4(+)에서는 정상 펜드린 단백질이 생성되어 여러 개의 밴드 나타날 수 있으나, 인간 p.H723R(+)에서는 돌연변이의 펜드린 단백질이 생성되어, 당화가 이루어지지 않아 단일 밴드가 나타날 수 있다. 이의 결과로, p.H723R 돌연변이는 SLC26A4 유전자의 당화 부위에서 일어난 돌연변이임을 예측할 수 있다. 2, the levels of pendrin protein in human SLC26A4 (-), human SLC26A4 (+), human p.H723R (-) and human p.H723R have. Furthermore, in human p.H723R (+), an animal model of Pendrin syndrome according to an embodiment of the present invention, a single band appears unlike normal human SLC26A4 (+). That is, considering that pendrin protein is a glycoprotein, normal pendrin protein can be generated in normal human SLC26A4 (+), and several bands can appear. In human p.H723R (+), mutant pendrin protein So that a saccharide is not formed and a single band may appear. As a result, the p.H723R mutation can be predicted to be a mutation at the glycation site of the SLC26A4 gene.
펜드리드 증후군 동물 모델에 대한 와우관의 조직학적 분석Histological analysis of the cochlear duct in an animal model of Pendrim syndrome
본 실험에서는 와우관의 조직학적 분석을 위해, 마이크로-C.T (micro-computed tomography) 를 이용하여, 마우스 모델들의 우측 좌측의 내림프낭과 와우관의 크기를 측정한다. 이때, 마우스 모델들은 전술한 단백질 수준 측정 실험에서의 대조군, 인간 SLC26A4(-), 인간 SLC26A4(+), 인간 p.H723R(-) 및 인간 p.H723R(+)의 마우스 모델에 추가적으로, 마우스 p.H723R 돌연변이 유전자를 갖는 마우스 (이하, 마우스 p.H723R(+)) 를 이용한다. For the histological analysis of the cochlear duct, we used micro-computed tomography (M-CT) to measure the size of the left endolymphocyte and cochlea of mouse models. At this time, mouse models were used in addition to the mouse models of the control group, human SLC26A4 (-), human SLC26A4 (+), human p.H723R (-) and human p.H723R . A mouse having the H723R mutation gene (hereinafter referred to as mouse p.H723R (+)) is used.
도 3a는 마우스 본연의 SLC26A4 유전자를 갖는 마우스 모델 (대조군) 의 와우관을 조직학적으로 분석하여 나타내는 실험 결과이다. 도 3b는 마우스 p.H723R 돌연변이 유전자를 갖는 마우스 (마우스 p.H723R(+)) 의 와우관을 조직학적으로 분석하여 나타내는 실험 결과이다. 도 3c는 인간 SLC26A4 유전자가 이식되고 마우스 본연의 SLC26A4 유전자는 결실된 마우스 (인간 SLC26A4(+)) 의 와우관을 조직학적으로 분석하여 나타내는 실험 결과이다. 도 3d는 인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 이식되고 마우스 본연의 SLC26A4 유전자는 결실된 마우스인 본 발명의 일 실시예에 따른, 펜드리드 증후군 동물 모델 (인간 p.H723R(+)) 의 와우관을 조직학적으로 분석하여 나타내는 실험 결과이다. 도 3e는 인간 SLC26A4 유전자가 이식되지 않고 마우스 본연의 SLC26A4 유전자는 결실된 마우스 (인간 SLC26A4(-)) 의 와우관을 조직학적으로 분석하여 나타내는 실험 결과이다. FIG. 3A shows the results of an experiment in which a mouse model (control group) having a mouse-derived SLC26A4 gene was histologically analyzed. FIG. 3B shows the results of an experiment in which the mouse p.H723R mutant gene-bearing mouse (mouse p.H723R (+)) was histologically analyzed. FIG. 3C shows the results of experiments showing histological analysis of the cochlea of a mouse (human SLC26A4 (+)) in which the human SLC26A4 gene has been transplanted and the mouse original SLC26A4 gene has been deleted. Figure 3d illustrates the expression of the Pheid's syndrome animal model (human p.H723R (+)) in the cochlea according to one embodiment of the present invention in which the human p.H723R mutant gene is transplanted and the mouse native SLC26A4 gene is deleted. Histologically, the results of the experiment are shown. FIG. 3E is an experimental result showing histological analysis of the cochlea of a mouse (human SLC26A4 (-)) in which the human SLC26A4 gene was not transplanted and the mouse original SLC26A4 gene was deleted.
도 3a의 (a) 및 (b)를 참조하면, 대조군에서는 와우관의 내경이 0.3 ㎜로 나타나, 내림프낭의 크기와 와우관의 크기의 확장은 일어나지 않은 것을 알 수 있다. 나아가, 도 3b의 (a) 및 (b)를 참조하면, 마우스 p.H723R(+)에서는 와우관의 내경이 0.25 ㎜로 나타나 정상의 마우스와 마찬가지로 내림프낭과 와우관의 확장이 관찰되지 않았다. 특히, 도 3c의 (a) 및 (b)를 참조하면, 인간 SLC26A4(+)에서는 와우관의 내경이 0.11 ㎜로 나타나, 정상의 마우스와 마찬가지로 내림프낭과 와우관의 확장이 관찰되지 않았다. 이의 결과로, 펜드리드 증후군에 따른 난청의 유전자 치료에 있어서, 정상 SLC26A4의 삽입은 펜드리드 증후군의 치료에 효과가 있을 수 있다.3A and 3B, in the control group, the inner diameter of the cochlea was 0.3 mm, and the size of the endolymphatic sac and the size of the cochlea were not enlarged. 3B and 3B, the inner diameter of the cochlear duct was 0.25 mm in the mouse p.H723R (+), and the enlargement of the endolymphatic sac and cochlea was not observed similarly to the normal mouse . In particular, referring to FIGS. 3 (a) and 3 (b), in the human SLC26A4 (+), the inner diameter of the cochlear duct was 0.11 mm and expansion of the endolymphatic sac and cochlear ducts was not observed as in normal mice. As a result, the insertion of normal SLC26A4 in gene therapy for deafness due to Pendrim syndrome may be effective in the treatment of Pendrim syndrome.
도 3d의 (a) 및 (b)를 참조하면, 인간 p.H723R(+)의 본 발명의 일 실시예에 따른, 펜드리드 증후군 동물 모델은 와우관의 내경이 0.53 ㎜로 나타나, 내림프낭 및 와우관의 확장이 관찰되었다. 나아가, 3e의 (a) 및 (b)의 인간 SLC26A4(-)에서는 와우관의 내경이 0.72 ㎜로 나타나, 본 발명의 펜드리드 증후군 마우스 모델과 마찬가지로 내림프낭 및 와우관의 확장이 관찰되었다. Referring to Figs. 3d (a) and (b), an animal model of Pindhid syndrome according to an embodiment of the present invention of human p.H723R (+) showed an inner diameter of the cochlea of 0.53 mm, Extension of the sac and cochlea were observed. Furthermore, in the human SLC26A4 (-) of 3e (a) and (b), the inner diameter of the cochlea was 0.72 mm, and expansion of the endolymphatic sac and cochlea was observed in the same manner as the Pendre syndrome mouse model of the present invention .
도 3f는 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델을 포함하는 4 가지 동물 모델 (인간 SLC26A4(-), 인간 SLC26A4(+), 인간 p.H723R(-) 및 인간 p.H723R(+)) 에 대한 와우관을 조직학적으로 분석하여 나타내는 실험 결과이다. 도 3g는 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델을 포함하는 4 가지 동물 모델 (인간 SLC26A4(-), 인간 SLC26A4(+), 인간 p.H723R(-) 및 인간 p.H723R(+)) 에 대한 와우관의 내림프관 및 내림프낭의 크기를 측정하여 나타낸 실험 결과이다. Figure 3f is a graph depicting four animal models (human SLC26A4 (-), human SLC26A4 (+), human p.H723R (-) and human p.H723R (-)) containing an animal model of Pendream syndrome according to one embodiment of the present invention +)) Were obtained by histological analysis. Figure 3g shows the results of four animal models (human SLC26A4 (-), human SLC26A4 (+), human p.H723R (-) and human p.H723R (-)) containing an animal model of Pendream syndrome according to one embodiment of the present invention +)) And the size of the endolymphatic and endolymphatic sacs in the cochlear duct.
도 3f 및 도 3g를 참조하면, 마우스 본연의 SLC26A4 유전자가 결실된 인간 p.H723R(-)에서는 내림프관 및 내림프낭의 크기의 확장, 즉 와우관의 확장이 나타났다. 또한, 본 발명의 펜드리드 증후군 동물 모델인 인간 p.H723R(+) 및 인간 SLC26A4(-)에서는 도 3d 및 도 3e의 결과와 마찬가지로, 내림프관 및 내림프낭의 크기의 확장이 나타났다. 이들과 대조적으로, 인간 SLC26A4 유전자가 이식된 마우스인 인간 SLC26A4(+)에서는 내림프관 및 내림프낭의 크기의 확장이 나타나지 않았다. 이 결과는, 도 3c의 결과와 동일하다. 즉, 인간 p.H723R (+) 의 경우 인간 펜드리드 증후군의 모델로 사용될 수 있다. Referring to FIG. 3F and FIG. 3G, in the human p.H723R (-) in which the mouse-derived SLC26A4 gene was deleted, the size of the lymph node and the endolymphatic sac, that is, the expansion of the womb tube, were shown. In addition, in the human p.H723R (+) and human SLC26A4 (-) animal models of the Pendream syndrome of the present invention, enlargement of the size of the endolymphatic and endolymphatic sacs was shown, similarly to the results of Figs. 3d and 3e. In contrast, human SLC26A4 (+), a human SLC26A4 transgenic mouse, did not exhibit an enlargement of the size of the lymph nodes and endolymphatic sac. This result is the same as the result in Fig. 3C. That is, human p.H723R (+) can be used as a model of human Pendrite syndrome.
펜드리드 증후군 동물 모델에 대한 청력 측정Hearing aids for Pendream syndrome animal models
펜드리드 증후군 동물 모델에 대한 청력 측정은 ABR 검정으로 수행된다. Hearing measurements for Pendream syndrome animal models are performed with ABR assays.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델을 포함하는 4 가지 동물 모델 (인간 SLC26A4(-), 인간 SLC26A4(+), 인간 p.H723R(-) 및 인간 p.H723R(+)) 에 대한 ABR 검정의 결과를 나타내는 실험 결과이다. 4A is a graph showing the results of four animal models (human SLC26A4 (-), human SLC26A4 (+), human p.H723R (-) and human p.H723R +)), Which is the result of the ABR test.
도 4a를 참조하면, 본 발명의 펜드리드 증후군 동물 모델인 인간 p.H723R(+)에서는 100dB에서 반응하지 않는다. 도 3a 내지 3g에서 구조적 이상을 보여준 결과와 마찬가지로, 인간 p.H723R(+)는 펜드리드 증후군의 또 다른 증상인 청력이상을 갖는 것을 확인하였다. 나아가, 정상 인간 SLC26A4 유전자가 이식된, 인간 SLC26A4(+)는 약 25dB에서 반응한다. 도 3a 내지 3g에서 와우관의 구조적 이상이 나타나지 않은 결과와 마찬가지로, 인간 SLC26A4(+)는 청력 또한 정상인 것을 확인하였다.Referring to Figure 4a, the human p.H723R (+), an animal model of the Pendream syndrome of the present invention, does not respond at 100 dB. Similar to the structural abnormalities shown in FIGS. 3A to 3G, it was confirmed that human p.H723R (+) had hearing abnormality, which is another symptom of Pendrim syndrome. Furthermore, human SLC26A4 (+) transplanted with the normal human SLC26A4 gene responds at about 25dB. Similar to the results in which the cochlear abnormalities were not shown in FIGS. 3A to 3G, the human SLC26A4 (+) confirmed that the hearing was normal.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델을 포함하는 3 가지 동물 모델 (인간 p.H723R(+), 인간 SLC26A4(+) 및 마우스 p.H723R(+)) 에 대한 ABR 검정의 결과를 나타내는 실험 결과이다.Figure 4b is a graph showing the effect of ABR on human animal models (human p.H723R (+), human SLC26A4 (+) and mouse p.H723R (+)) including Peddler syndrome animal models according to one embodiment of the present invention. The results of the test are shown.
도 4b의 (a)를 참조하면, 마우스 p.H723R 돌연변이 유전자를 갖는, 마우스 p.H723R(+)의 ABR 검정결과가 도시된다. 마우스 내의 SLC26A4 돌연변이는 일어났지만, 청력은 정상으로 나타나는 것을 알 수 있다. 이에 따라, 마우스 자체의 SCL26A4 유전자에 돌연변이가 일어난 모델은 펜드리드 증후군 동물 모델로 이용되는데 어려움이 있다. 도 4b의 (b)를 참조하면, 인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 이식되고 마우스 본연의 SLC26A4 유전자는 결실된 본 발명의 펜드리드 증후군 동물 모델인, 인간 p.H723R(+)의 ABR 검정결과가 도시된다. 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델은 전술한 와우관의 조직학적 분석 결과에서 와우관의 이상이 나타난 결과와 함께, 난청 또한 나타난 것을 알 수 있다. 이에 따라, 인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 이식된 마우스는 펜드리드 증후군 동물 모델로서 바람직할 수 있다. 도 4b의 (c)를 참조하면, 인간 SLC26A4 유전자가 이식되고 마우스 본연의 SLC26A4 유전자는 결실된 마우스의 ABR 검정결과가 도시된다. 인간 SLC26A4 유전자가 이식된 마우스의 청력은 정상으로 나타나는 것을 알 수 있다.Referring to Figure 4b (a), the ABR assay results for mouse p.H723R (+) with the mouse p.H723R mutant gene are shown. The SLC26A4 mutation in the mouse occurred, but hearing is normal. Accordingly, a model in which the mouse itself mutates to the SCL26A4 gene has difficulties in being used as an animal model of Pendrim syndrome. Referring to Figure 4b (b), the results of the ABR assay of human p.H723R (+), an animal model of the Peddle syndrome of the present invention in which the human p.H723R mutant gene has been transplanted and the mouse native SLC26A4 gene has been deleted Respectively. An animal model of Pendream syndrome according to an embodiment of the present invention shows that the above-described histopathological analysis of the cochlear duct also revealed hearing loss as well as the result of the abnormality of the cochlear duct. Accordingly, a mouse transplanted with the human p.H723R mutant gene may be preferable as an animal model of Peddle syndrome. Referring to (c) of Figure 4b, the results of ABR assays of mice in which the human SLC26A4 gene has been transplanted and the mouse native SLC26A4 gene has been deleted are shown. It can be seen that the hearing ability of the mouse transplanted with the human SLC26A4 gene appears normal.
이상의 실시예 1의 결과로 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델 및 펜드리드 증후군 동물 모델 제조 방법에 의해 제작된 마우스는 인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 발현될 뿐만 아니라 감각신경성 난청 및 와우관의 이상이 관찰되어, 펜드리드 증후군에 따른 질환에 대한 동물 모델로 제공될 수 있다.As a result of the above Example 1, the mouse model produced by the animal model of Pendream syndrome and the animal model of Pendlet syndrome according to an embodiment of the present invention not only expresses the human p.H723R mutant gene, And anomalies of the cochlear duct are observed and can be provided as animal models for diseases according to Pendream syndrome.
또한, 본 발명은 본 발명에서 제공하는 펜드리드 증후군 동물 모델을 이용한 펜드리드 증후군 치료용 조성물 스크리닝 방법을 제공할 수 있다. 예를 들어, 펜드리드 증후군에 대한 치료 효과가 기대되는 물질은 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델에 복강내 투여, 비강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 경피 투여, 피하 투여, 흡입 투여, 경구 투여, 난원창내 투여, 고막내 주사 또는 자궁내 주사의 방법으로 투여될 수 있다. 이때, 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델은 생후 1주령 내지 2개월령의 마우스 또는 본 발명에서 제공하는 펜드리드 증후군 마우스 모델을 임신한 마우스가 바람직할 수 있다. 또한, 펜드리드 증후군 치료용 후보 물질에 대한 평가를 위해, 본 발명의 일 실시예에 따른 펜드리드 증후군 동물 모델에 대한 청력의 측정, 와우관의 내림프관 또는 내림프낭의 크기의 측정이 수행될 수 있다. 선택적으로, 펜드리드 증후군 치료용 후보 물질이 정상 SLC26A4 유전자 그 자체인 경우, 이에 대한 평가는 펜드리드 증후군 마우스 모델 내이에서의 SL723R 유전자의 발현 수준 또는 펜드린 단백질의 수준을 측정함으로써 수행될 수 있다. 나아가, 펜드리드 증후군 치료용 후보 물질에 대한 평가는 펜드리드 증후군 마우스 모델을 임신한 마우스의 자궁내의 SL723R 유전자의 발현 수준 또는 펜드린 단백질의 수준을 측정함으로써 수행될 수 있다. In addition, the present invention can provide a method for screening a composition for treating Pendream syndrome using the Pendream syndrome animal model provided by the present invention. For example, a substance expected to have a therapeutic effect on Pendrim syndrome may be administered intraperitoneally, intranasally, intramuscularly, or transdermally to an animal model of Pendrim syndrome according to an embodiment of the present invention , Subcutaneous administration, inhalation administration, oral administration, intravaginal administration, intramembrane injection or intrauterine injection. At this time, an animal model of Pendream syndrome according to an embodiment may be preferably a mouse at 1 to 2 months old or a mouse pregnant with the Pendlet syndrome mouse model provided in the present invention. In addition, for the evaluation of candidates for treatment of Pendream syndrome, measurement of hearing for the Pendream syndrome animal model according to one embodiment of the present invention, measurement of the size of the endolymphatic or endolymphatic sac of the cochlear duct . Alternatively, if the candidate substance for the treatment of Pendrim syndrome is the normal SLC26A4 gene itself, the evaluation can be performed by measuring the expression level of the SL723R gene or the level of the pendrin protein in the Pendrill's syndrome mouse model have. Further, an evaluation of candidate substances for treating Pendrim syndrome can be performed by measuring the expression level of the SL723R gene in the uterus of the pregnant mouse or the level of the pendrin protein in a mouse model of Pendrim syndrome.
비교예 1: 종래의 기술을 이용한 펜드리드 증후군 동물 모델에 대한 평가Comparative Example 1: Evaluation of an animal model of Pendream syndrome using conventional techniques
이하에서는, 마우스 p.H723R 돌연변이 유전자를 갖는 마우스 및 pax2 cre-마우스를 이용한 펜드리드 증후군 마우스 모델에 대하여 설명한다. 이때, 마우스 모델들은 실시예 1의 마우스 모델과 동일한 방법으로 만들어 진다. 마우스 모델은 구체적으로, 마우스 본연의 SLC26A4 유전자를 갖고 있는 pax2 마우스 (이하, 대조군), 인간 SLC26A4 유전자가 이식되고 마우스 본연의 SLC26A4 유전자는 결실된 pax2 마우스 (이하, p인간 SLC26A4(+)), 인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 이식되고 마우스 본연의 SLC26A4 유전자는 결실된 pax2 마우스 (이하, p인간 p.H723R(+)), 마우스 p.H723R 돌연변이 유전자를 갖는 pax2 마우스 (이하, p마우스 p H723R(+)) 및 마우스 SLC26A4 유전자가 결실된 pax2 마우스 (이하, p마우스 SLC26A4(-))로 구성된다. Hereinafter, a mouse model of Pendrim syndrome using mouse p.H723R mutant gene and pax2 cre-mouse will be described. At this time, the mouse models are made in the same manner as the mouse model of Example 1. Specifically, the mouse model includes a pax2 mouse (hereinafter referred to as a control) having a mouse-specific SLC26A4 gene, a pax2 mouse (hereinafter referred to as p human SLC26A4 (+)) in which a human SLC26A4 gene has been transplanted and a mouse- (hereinafter referred to as p human p.H723R (+)), a mouse p.H723R mutant gene (p mouse p H723R (+)) having a mouse p.H723R mutant gene and a mouse native SLC26A4 gene ) And pax2 mouse in which the mouse SLC26A4 gene has been deleted (hereinafter, p mouse SLC26A4 (-)).
도 5a는 마우스 p.H723R 돌연변이 유전자를 갖는 마우스를 이용한 펜드리드 증후군 동물 모델에 대한 서던 블랏 (southern blot), 와우관의 조직학적 분석 및 ABR 검정의 결과를 나타내는 실험 결과이다. 5A is an experimental result showing the results of southern blot, histological analysis of the cochlear duct, and ABR assay for an animal model of Pendrill's syndrome using a mouse having the mouse p.H723R mutant gene.
도 5a의 (a)를 참조하면, 마우스 본연의 SLC26A4 유전자를 갖는, 대조군과 대조적으로 마우스 p.H723R 돌연변이 유전자를 갖는, p마우스 p.H723R(+)에서는 A 밴드 및 B 밴드로 나타나는 DNA 단편을 갖는 것을 알 수 있다. 이때, B 밴드는 마우스 SLC26A4 유전자 내의 p.H723R 돌연변이가 일어난 DNA 단편을 의미할 수 있다. 도 5a의 (b)를 참조하면, p마우스 p.H723R(+)는 p.H723R 돌연변이가 일어났음에도 와우관, 내림프관의 확장이 일어나지 않아, 정상 마우스인 대조군과 동일한 결과를 나타낸다. 그러나, 마우스 SLC26A4 유전자가 결실된, p마우스 SLC26A4(-)에서는 와우관의 기형, 즉, 내림프관의 확장이 나타난다. 도 5a의 (c)를 참조하면, p마우스 p.H723R (+)는 대조군과 마찬가지로 정상의 청력을 갖고 있는 것을 알 수 있다.Referring to FIG. 5A, in the mouse mouse p.H723R (+) having the mouse p.H723R mutant gene, which has the SLC26A4 gene of the mouse, as compared with the control group, DNA fragments represented by the A band and the B band are shown . Herein, the B band may refer to a DNA fragment in which p.H723R mutation occurs in the mouse SLC26A4 gene. Referring to FIG. 5 (a), p.H723R (+) of the mouse p.H723R mutant does not cause expansion of the cochlear and lymphatic vessels even when the mutation of p.H723R occurs. However, in the mouse SLC26A4 (-) in which the mouse SLC26A4 gene has been deleted, malformation of the cochlear duct, that is, extension of the lymph node, appears. Referring to (c) of FIG. 5A, it can be seen that the mouse p.H723R (+) of p mouse has normal hearing power as in the control group.
도 5b의 (a) 및 (b)는 pax2 cre-마우스를 이용하여 인간 p.H723R 돌연변이 유전자가 이식된, p인간 p.H723R(+)의 와우관의 조직학적 분석 및 ABR 검정의 결과를 나타낸다. p인간 p.H723R(+)은 본 발명의 펜드리드 증후군 동물 모델 (인간 p.H723R(+)) 과 마찬가지로, 와우관의 기형 및 난청이 유도된 것을 확인할 수 있다.Figures 5 (b) and 5 (b) show the results of histological analysis and ABR assays of the cohort of p human p.H723R (+) transplanted with the human p.H723R mutant gene using pax2 cre-mouse . p human p.H723R (+) can be confirmed to have induced malformation and deafness in the cochlear duct, as in the animal model of Peddler syndrome of the present invention (human p.H723R (+)).
도 5c의 (a) 및 (b)는 마우스 본연의 SLC26A4 유전자는 결실되고, pax2 cre-마우스를 이용하여 인간 SLC26A4 유전자가 이식된, p인간 SLC26A4(+)의 와우관의 조직학적 분석 및 ABR 검정의 결과를 나타낸다. 이를 참조하면, p인간 SLC26A4(+)은 와우관 구조의 정상, 청력의 정상을 나타낸다. 그러나, 도 5c의 (c)를 참조하면, p인간 SLC26A4(+)에서의 펜드린 단백질은 p마우스 SLC26A4(-)와 비교했을 때, 내이뿐만 아니라 콩팥에서도 발현되는 것을 알 수 있다. 나아가, p인간 SLC26A4(+) 대조군 마우스의 수명은 4 주령으로 관찰되어 정상 마우스보다 짧아, 펜드리드 증후군 동물 모델에 대한 대조군의 동물 모델로 부적합할 수 있다. Figures 5 (a) and 5 (b) show histological and histological analysis of the human papillomavirus SLC26A4 (+), in which the mouse SLC26A4 gene was deleted and the human SLC26A4 gene was transplanted with pax2 cre- Lt; / RTI > Referring to this, the p-human SLC26A4 (+) represents the normal of the cochlear structure and the normal hearing. However, referring to (c) of FIG. 5c, it can be seen that the pendrin protein in p human SLC26A4 (+) is expressed not only in the inner ear but also in the kidney as compared to the p mouse SLC26A4 (-). Furthermore, the lifespan of the p human SLC26A4 (+) control mice is observed at 4 weeks of age and is shorter than that of normal mice, which may be unsuitable as an animal model of control for Pendrim syndrome animal models.
이상의 비교예 1의 결과로, 종래의 기술을 이용한 펜드리드 증후군 동물 모델은 펜드리드 증후군 동물 모델로 이용되기에 부적합한 것을 확인할 수 있었다. 이에, 본 발명의 일 실시예에 따른, 펜드리드 증후군 동물 모델 및 펜드리드 증후군 동물 모델 제조 방법에 의해 제조된 마우스 모델은 펜드리드 증후군에 대한 치료제 또는 치료법의 개발에 적합한 모델일 수 있다. 나아가, 본 발명은 본 발명의 일 실시예에 따른, 펜드리드 증후군 동물 모델을 이용한 펜드리드 증후군 치료용 조성물 스크리닝 방법을 제공함으로써 펜드리드 증후군에 따른 다양한 질환들의 치료 연구에 기여할 수 있는 효과가 있다. As a result of the above Comparative Example 1, it was confirmed that the Pendream syndrome animal model using the conventional technique is unsuitable for use as an animal model of Pendrim syndrome. Thus, the mouse model produced by the animal model of Pendream syndrome and the method of producing Pendlet syndrome animal model, according to an embodiment of the present invention, may be a suitable model for the development of a therapeutic agent or treatment for Pendrim syndrome . Further, the present invention provides a method for screening a composition for treating Pendream syndrome using an animal model of Pendrim syndrome according to an embodiment of the present invention, thereby contributing to the study of various diseases according to Pendrim syndrome .
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.Although the embodiments of the present invention have been described in detail with reference to the accompanying drawings, it is to be understood that the present invention is not limited to those embodiments and various changes and modifications may be made without departing from the scope of the present invention. . Therefore, the embodiments disclosed in the present invention are intended to illustrate rather than limit the scope of the present invention, and the scope of the technical idea of the present invention is not limited by these embodiments. Therefore, it should be understood that the above-described embodiments are illustrative in all aspects and not restrictive. The scope of protection of the present invention should be construed according to the following claims, and all technical ideas within the scope of equivalents should be construed as falling within the scope of the present invention.
Claims (21)
동물 모델은 정상 모델과 대조적으로 와우관 기형 또는 난청이 유발된 모델이고,
상기 동물 모델은 내이에서 특이적으로 cre-재조합효소 (cre-recombinase) 를 발현하는, 인간을 제외한 비인간 동물이고,
상기 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자는 상기 동물 모델의 내이 (inner ear) 에서만 발현하는, 펜드리드 증후군 (Pendred syndrome) 동물 모델.An animal model in which a human SLC26A4 mutant gene has been knocked in,
In contrast to the normal model, the animal model is a model of induced warts or hearing loss,
The animal model is a non-human animal excluding a human, expressing a cre-recombinase specifically in the inner ear,
The human SLC26A4 mutant gene is expressed only in the inner ear of the animal model, Pendred syndrome animal model.
상기 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자는 p.H723R, p.T410M, p.L676Q 또는 p.M147V 돌연변이 유전자들 중 적어도 하나의 인간 돌연변이 유전자인, 펜드리드 증후군 동물 모델.The method according to claim 1,
Wherein the human SLC26A4 mutant gene is a human mutant gene of at least one of the p.H723R, p.T410M, p.L676Q, or p.M147V mutant genes.
상기 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자는 인간 p.H723R 유전자인, 펜드리드 증후군 동물 모델. The method according to claim 1,
The human SLC26A4 mutant gene is the human p.H723R gene, an animal model of Pendre syndrome.
상기 와우관 기형은 와우관 내림프관 또는 와우관 내림프낭의 확장과 대응하는, 펜드리드 증후군 동물 모델.The method according to claim 1,
The anomaly of the cochlea corresponded to the expansion of the lymphatic vessels in the cochlear duct or the lymphocyte in the cochlear duct.
상기 난청은 감각신경성 난청인, 펜드리드 증후군 동물 모델.The method according to claim 1,
An animal model of Pendrill's syndrome, wherein the hearing loss is sensory nerve impairment.
상기 동물 모델은 마우스인, 펜드리드 증후군 동물 모델.The method according to claim 1,
The animal model is a mouse, Pendre syndrome animal model.
상기 마우스는 SLC26A4 유전자가 결손 (knock-out) 된, 펜드리드 증후군 동물 모델.8. The method of claim 7,
The mouse is an animal model of Pendrill's syndrome in which the SLC26A4 gene is knocked out.
상기 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자는 상기 펜드리드 증후군 마우스 모델의 내이에서만 발현하는, 펜드리드 증후군 동물 모델 제조 방법.Obtaining a first-generation mouse by crossing a mouse expressing a cre-recombinant enzyme specifically in the inner ear with a mouse into which a human SLC26A4 mutation gene has been transduced; And a step of crossing the first-generation mouse and the SLC26A4 gene-deficient mouse to obtain a Pendlet syndrome mouse model,
Wherein said human SLC26A4 mutant gene is expressed only in the inner ear of said Pendrim syndrome mouse model.
상기 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자는 p.H723R, p.T410M, p.L676Q 또는 p.M147V 돌연변이 유전자들 중 적어도 하나의 인간 돌연변이 유전자인, 펜드리드 증후군 동물 모델 제조 방법.10. The method of claim 9,
Wherein the human SLC26A4 mutant gene is a human mutant gene of at least one of the p.H723R, p.T410M, p.L676Q, or p.M147V mutant genes.
상기 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자는 인간 p.H723R 유전자인, 펜드리드 증후군 동물 모델 제조 방법.10. The method of claim 9,
Wherein said human SLC26A4 mutation gene is a human p.H723R gene.
상기 cre-재조합효소를 발현하는 마우스는 Foxg1-Cre 마우스인, 펜드리드 증후군 동물 모델 제조 방법.10. The method of claim 9,
Wherein the mouse expressing the cre-recombinant enzyme is a Foxg1-Cre mouse.
상기 형질 주입된 마우스는 상기 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 삽입된 cre-재조합효소 유도 전이 유전자 (cre-recombinase inducible transgene) 가 형질 주입된, 마우스와 대응하는, 펜드리드 증후군 동물 모델 제조 방법.10. The method of claim 9,
Wherein the transfected mouse corresponds to a mouse transfected with a cre-recombinase inducible transgene into which the human SLC26A4 mutation gene is inserted.
상기 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자는 상기 cre-재조합효소 유도 전이 유전자 내의 XhoI 및 NotI 핵산 내부가수분해효소 (endonuclease) 인식 자리 사이에 삽입된, 펜드리드 증후군 동물 모델 제조 방법.15. The method of claim 14,
Wherein said human SLC26A4 mutation gene is inserted between the XhoI and NotI nucleic acid internal hydrolase recognition sites in said cre-recombinant enzyme inducible transgene gene.
상기 후보 물질을 투여한 동물 모델에 대한 청력을 측정하거나 와우관의 내 림프관 또는 내림프낭의 크기를 측정하는 단계를 포함하고,
상기 펜드리드 증후군 동물 모델은 인간 SLC26A4 돌연변이 유전자가 상기 동물 모델의 내이에서만 발현하는 비인간 동물인, 펜드리드 증후군 치료용 조성물 스크리닝 방법.8. A method for treating Pendream syndrome, comprising administering to a Pendlet syndrome animal model according to any one of claims 1 to 5, 7 and 8 a candidate substance for treating Pendrim syndrome; And
Measuring the hearing of the animal model to which the candidate substance is administered, or measuring the size of the endolymphatic or endolymphatic sac of the cochlea,
Wherein the Pendream syndrome animal model is a non-human animal in which the human SLC26A4 mutant gene is expressed only in the inner ear of the animal model.
상기 투여는 복강내 투여, 비강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 경피 투여, 피하 투여, 흡입 투여, 경구 투여 또는 자궁내 주사인, 펜드리드 증후군 치료용 조성물 스크리닝 방법.17. The method of claim 16,
Wherein said administration is by intraperitoneal, intranasal, intravenous, intramuscular, transdermal, subcutaneous, inhalation, oral or intrauterine injection, for the treatment of Pendrim syndrome.
상기 펜드리드 증후군 동물 모델은 생후 1주령 내지 2개월령의 마우스인, 펜드리드 증후군 치료용 조성물 스크리닝 방법.17. The method of claim 16,
Wherein said Pendream syndrome animal model is a mouse at 1 to 2 months of age at birth.
상기 투여하는 단계는 동형접합체 (homozygote) 의 펜드리드 증후군 마우스 모델들을 교배하여 임신한 마우스를 얻는 단계; 및
상기 임신한 마우스에 상기 펜드리드 증후군 치료용 후보 물질을 투여하는 단계를 포함하는, 펜드리드 증후군 치료용 조성물 스크리닝 방법.17. The method of claim 16,
Wherein the administering step comprises crossing the Peddle syndrome mouse models of a homozygote to obtain a pregnant mouse; And
And administering to said pregnant mouse a candidate substance for treating said Pendream syndrome.
상기 측정하는 단계는 상기 임신한 마우스의 자궁 내의 펜드린 단백질의 수준 또는 SLC26A4 유전자의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 펜드리드 증후군 치료용 조성물 스크리닝 방법.20. The method of claim 19,
Wherein said measuring step comprises measuring the level of the Pendrin protein or the level of the SLC26A4 gene in the uterus of said pregnant mouse.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170027182A KR101954726B1 (en) | 2017-03-02 | 2017-03-02 | Animal model for pendred syndrome and method for producing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170027182A KR101954726B1 (en) | 2017-03-02 | 2017-03-02 | Animal model for pendred syndrome and method for producing the same |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20180100849A KR20180100849A (en) | 2018-09-12 |
| KR101954726B1 true KR101954726B1 (en) | 2019-03-06 |
Family
ID=63592848
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020170027182A KR101954726B1 (en) | 2017-03-02 | 2017-03-02 | Animal model for pendred syndrome and method for producing the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101954726B1 (en) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022025553A1 (en) * | 2020-07-29 | 2022-02-03 | 연세대학교 원주산학협력단 | Age-related hearing loss animal model and construction method therefor |
| KR102563048B1 (en) * | 2020-07-29 | 2023-08-04 | 연세대학교 원주산학협력단 | Age-related hearing loss animal model and manufacturing method of animal model |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150052623A1 (en) | 2009-07-30 | 2015-02-19 | Eric M. Ostertag | Genetically modified rat models for pharmacokinetics |
-
2017
- 2017-03-02 KR KR1020170027182A patent/KR101954726B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150052623A1 (en) | 2009-07-30 | 2015-02-19 | Eric M. Ostertag | Genetically modified rat models for pharmacokinetics |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Qi Li 등, J Transl Med. vol.10 pp.225(2012.11.14. 공개)* |
| Xiangming Li 등, PLOS Genetics vol.9 no.7 e1003641(2013.07.11. 공개)* |
| Ying-Chang Lu 등, PLOS One vol.6 no.7 e22150(2011.07.30. 공개)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20180100849A (en) | 2018-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fratta et al. | Mice with endogenous TDP‐43 mutations exhibit gain of splicing function and characteristics of amyotrophic lateral sclerosis | |
| Sugo et al. | Neonatal lethality with abnormal neurogenesis in mice deficient in DNA polymerase β | |
| KR101954726B1 (en) | Animal model for pendred syndrome and method for producing the same | |
| Avenarius et al. | Grxcr2 is required for stereocilia morphogenesis in the cochlea | |
| CN116144658B (en) | sgRNA for constructing neurodegenerative animal model and application thereof | |
| JP2001211782A (en) | Tob gene deletion knock out non-human mammal | |
| Buxbaum et al. | The pathogenesis of transthyretin tissue deposition: lessons from transgenic mice | |
| JP4550530B2 (en) | Synaptic maturation disorder animal model | |
| US8420886B2 (en) | Transgenic mouse comprising a disrupted Fibulin-4 gene as a model for cardiovascular disease | |
| JP2005502341A (en) | Transgenic rodents as animal models for regulating B1 bradykinin receptor protein | |
| EP1859676A1 (en) | Hairless transgenic animal | |
| JP2002541765A (en) | Mice deleted from MSH5 and method of using | |
| US20220217956A1 (en) | Rodent Model Of Increased Bone Mineral Density | |
| WO2002034041A1 (en) | Senescence marker protein 30-defective nonhuman animal, antibody and method of constructing the same | |
| Dumanian | Endothelial-Specific Ablation of ANTXR1, ANTXR2, and MMP14 in Retinal Angiogenesis | |
| JP2023076344A (en) | Method for producing uterine cancer model nonhuman animal, uterine cancer model nonhuman animal, and method for evaluating test substance | |
| US20080295186A1 (en) | Neurotrypsin overexpressing animal | |
| CN114304068A (en) | Preparation and application of epilepsy animal model | |
| JP3817638B2 (en) | Transgenic non-human mammal | |
| JP4696316B2 (en) | CD9 / CD81 double deficient non-human animal | |
| WO2004092371A1 (en) | Mouse with deficiency of glutamate trasnporter glast function | |
| KR20240132213A (en) | Transgenic animal model for polycystic kidney disease based on the kidney-specific PIBF1 gene deletion and manufacturing method thereof | |
| JP2004244339A (en) | Adamts4 function inhibitor | |
| JP2008022714A (en) | NEUROPSYCHIATRIC DISORDER MODEL ANIMAL USING PROTOCADHERIN alpha AND USE THEREOF | |
| JP2011518551A (en) | Heparanase-deficient non-human mammal |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |