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KR101943673B1 - 스핑고미엘린의 측정 방법 및 측정용 키트 - Google Patents

스핑고미엘린의 측정 방법 및 측정용 키트 Download PDF

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KR101943673B1
KR101943673B1 KR1020147000846A KR20147000846A KR101943673B1 KR 101943673 B1 KR101943673 B1 KR 101943673B1 KR 1020147000846 A KR1020147000846 A KR 1020147000846A KR 20147000846 A KR20147000846 A KR 20147000846A KR 101943673 B1 KR101943673 B1 KR 101943673B1
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교와 메덱스 가부시키가이샤
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Abstract

검체 중의 스핑고미엘린을 간편하고 또한 정확하게 측정하기 위한 방법, 및 키트를 제공하는 것에 있다. 검체를, 스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 및 콜린 산화 효소와 반응시켜, 생성되는 과산화수소를 소거하고, 이어서 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 콜린 산화 효소와 반응시켜, 생성되는 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 스핑고미엘린의 측정 방법.

Description

스핑고미엘린의 측정 방법 및 측정용 키트 {SPHINGOMYELIN MEASUREMENT METHOD AND MEASUREMENT KIT}
본 발명은 스핑고미엘린의 측정 방법 및 측정용 키트에 관한 것이다.
혈액 중에는 고밀도 리포 단백 (이하, HDL 이라고 약기한다), 저밀도 리포 단백 (이하, LDL 이라고 약기한다), 초저밀도 리포 단백 (이하, VLDL 이라고 약기한다), 킬로미크론 (이하, CM 이라고 약기한다) 등의 리포 단백이 함유되어 있다. 각 리포 단백은 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 인 지질, 단백질 등의 구성 성분의 비율이 상이하며, 생체 내에서 상이한 작용을 갖는다. 리포 단백에는 주로 3 종류의 인 지질, 즉, 포스파티딜콜린 (이하, PC 라고 약기한다), 리소포스파티딜콜린 (이하, LPC 라고 약기한다), 스핑고미엘린 (이하, SM 이라고 약기한다) 이 함유되어 있다.
이들 3 종류의 인 지질 중에서는, PC 및 SM 이 주요한 인 지질이고, 각각 전체 인 지질의 약 7 할 및 2 할을 차지하고 있다. SM 은 인간 및 동물 모델의 아테롬에 축적되는 것으로 알려져 있다. 인간의 동맥 경화소 (巢) 에 존재하는 LDL 에는, 혈장 중의 LDL 과 비교하여 SM 이 다량으로 함유되어 있다 (비특허문헌 1).
한편, 인간의 임상 연구에 있어서도, 혈장 중의 SM, 및 SM/PC 비율이 허혈성 심질환에 대한 독립된 위험 인자인 것이 나타나 있다 (비특허문헌 2 ∼ 4).
지금까지 SM 의 측정 방법으로는, 박층 크로마토그래피를 사용하는 방법이나 고속 액체 크로마토그래피를 사용하는 방법 (비특허문헌 5) 이 보고되어 있지만, 조작이 번잡하고 측정에 장시간을 필요로 하는 등의 결점을 가지고 있다. 또, 세균 유래의 스핑고미엘리나아제를 이용한 효소적 측정법도 보고되어 있다 (특허문헌 1, 비특허문헌 2). 본 측정법은, 스핑고미엘린을 세균의 스핑고미엘리나아제에 의해, 포스포릴콜린 및 n-아실스핑고신으로 가수분해하고, 생성된 포스포릴콜린을 알칼리성 포스파타아제에 의해 콜린으로 가수분해하며, 생성된 콜린을 콜린옥시다아제와 반응시켜, 생성된 과산화수소를 측정함으로써, 스핑고미엘린을 측정하는 방법이다. 그러나, 본 측정법은, 알칼리성 포스파타아제의 사용에서 기인하는 다른 측정 항목의 측정에 대한 영향이나, 스핑고미엘리나아제가 SM 과 함께, LPC 에도 반응한다는 특이성 등의 문제를 가지고 있다 (비특허문헌 6).
일본 공표특허공보 2009-519713호
Circulation, Vol.110(22), p.3465-3471 (2004). Arterioscler Thromb Vasc Biol., Vol.20, p.2614-2618 (2000). Nutrition & Metabolism, Vol.3, p.5 (2006). Am. J. Epidemiol., Vol.163, p.903-912 (2006). Dairy Sci., Vol.88, p.482-488 (2005). Biol. Pharm. Bull. Vol.27, p.1725-1729 (2004).
본 발명의 목적은 검체 중의 SM 을 간편하고 또한 정확하게 측정하기 위한 방법, 및 키트를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 실시하여, PC, LPC 및 SM 을 함유하는 검체 중의 SM 을 선택적으로 측정하는 방법에 있어서, LPC 를 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제와 반응시켜 생성되는 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않지만, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 를 사용함으로써, SM 을 특이적으로 측정할 수 있는 것을 알아내어 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은 이하의 [1] ∼ [17] 에 관한 것이다.
[1] 검체를, SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 및 콜린 산화 효소와 반응시켜, 생성되는 과산화수소를 소거하고, 이어서 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 콜린 산화 효소와 반응시켜, 생성되는 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 SM 의 측정 방법.
[2] 검체를, SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 산화형 보조효소, 콜린 탈수소 효소, 및 환원형 보조효소 산화 효소와 반응시켜, 생성되는 과산화수소를 소거하고, 이어서 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 산화형 보조효소, 콜린 탈수소 효소, 및 환원형 보조효소 산화 효소와 반응시켜, 생성되는 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 SM 의 측정 방법.
[3] 검체와, SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 및 콜린 산화 효소의 반응을 카탈라아제의 존재하에 실시하고, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 콜린 산화 효소의 반응을 카탈라아제 저해제의 존재하에 실시하는 [1] 에 기재된 방법.
[4] 검체와, SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 산화형 보조효소, 콜린 탈수소 효소, 및 환원형 보조효소 산화 효소의 반응을 카탈라아제의 존재하에 실시하고, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 산화형 보조효소, 콜린 탈수소 효소, 및 환원형 보조효소 산화 효소의 반응을 카탈라아제 저해제의 존재하에 실시하는 [2] 에 기재된 방법.
[5] 카탈라아제 저해제가 아지화물인 [3] 또는 [4] 에 기재된 방법.
[6] 과산화수소의 소거를 퍼옥시다아제, 및 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방의 존재하에 실시하고, 과산화수소의 측정을 퍼옥시다아제, 및 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 존재하에 실시하는 [1] 또는 [2] 에 기재된 방법.
[7] 과산화수소의 측정을 퍼옥시다아제, 및 류코형 색원체의 존재하에 실시하는 [1] ∼ [5] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[8] SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces sp . 유래의 포스포리파아제 D 인 [1] ∼ [7] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[9] 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 [1] ∼ [8] 중 어느 하나에 기재된 방법.
[10] SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 산화 효소, 및 카탈라아제를 함유하는 제 1 시약과, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 카탈라아제 저해제를 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 SM 측정용 키트.
[11] SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 산화 효소, 퍼옥시다아제, 및 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방을 함유하는 제 1 시약과, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 산화 커플링 발색형 색원체의 다른 일방을 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 SM 측정용 키트.
[12] SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 탈수소 효소, 산화형 보조효소, 환원형 보조효소 산화 효소, 및 카탈라아제를 함유하는 제 1 시약과, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 카탈라아제 저해제를 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 SM 측정용 키트.
[13] SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 탈수소 효소, 산화형 보조효소, 환원형 보조효소 산화 효소, 퍼옥시다아제, 및 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방을 함유하는 제 1 시약과, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 산화 커플링 발색형 색원체의 다른 일방을 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 SM 측정용 키트.
[14] 카탈라아제 저해제가 아지화물인 [10] 또는 [12] 에 기재된 키트.
[15] 퍼옥시다아제와 류코형 색원체가 각각 제 1 시약 및 제 2 시약의 각각의 시약에 함유되는 [10], [12] 또는 [14] 에 기재된 키트.
[16] SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces sp . 유래의 포스포리파아제 D 인 [10] ∼ [15] 중 어느 하나에 기재된 키트.
[17] 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 [10] ∼ [16] 중 어느 하나에 기재된 키트.
본 발명에 의해, 검체 중의 SM 을 간편하고 또한 정확하게 측정하기 위한 방법 및 키트가 제공된다.
도 1 은 실시예 1 의 키트 (키트 A ∼ F) 에 있어서의 SM, LPC 및 PC 의 각 인 지질의 표준액에 대한 「흡광도」 를 나타내는 도면이다. 세로축은 흡광도 (mAbs) 를, 가로축은 각 키트 (키트 A ∼ F) 를 나타낸다. □ 는 SM 을, ■ 는 PC 를, 박스 점선은 LPC 를 나타낸다.
도 2 는 실시예 2 의 키트를 사용한 측정과, 대조 키트를 사용한 측정 사이의 상관도를 나타낸다. 세로축은 실시예 2 를 사용한 측정에 의해 결정된 검체 중의 SM 농도 (㎎/㎗) 를, 가로축은 대조 키트를 사용한 측정에 의해 결정된 검체 중의 SM 농도 (㎎/㎗) 를 나타낸다.
도 3 은 실시예 2 의 키트를 사용한 측정에 있어서의 SM 농도와 흡광도 사이의 관계를 나타내는 그래프이다. 세로축은 흡광도 (mAbs) 를, 가로축은 SM 농도 (㎎/㎗) 를 나타낸다.
<SM 의 측정 방법>
본 발명의 SM 측정 방법은 SM 의 분리 조작을 필요로 하지 않는 방법이다.
본 발명의 SM 의 측정 방법은, 검체를, SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 및 콜린 산화 효소와 반응시켜, 생성되는 과산화수소를 소거하고, 이어서 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 콜린 산화 효소와 반응시켜, 생성되는 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 SM 의 측정 방법이다. 구체적으로는, 하기의 공정을 포함하는 방법을 들 수 있다.
(1) 검체를, SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 및 콜린 산화 효소와 반응시켜, 과산화수소, 글리세롤-3-포스포릴콜린, 및 유리 지방산을 생성시키는 공정 ;
(2) 공정 (1) 로 생성된 과산화수소를 소거하는 공정 ;
(3) 공정 (2) 후의 반응액 중의 SM 을, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 콜린 산화 효소와 반응시켜, 과산화수소를 생성시키는 공정 ; 및,
(4) 공정 (3) 으로 생성된 과산화수소를 측정하는 공정.
상기 공정 (1) 에 있어서의 검체로서, SM 농도가 이미 알려진 표준품을 사용하여 상기 공정에 의해 측정을 실시하고, SM 농도와 측정치 사이의 관계를 나타내는 검량선을 제조한 후, 실제의 검체를 사용하여 상기 공정에 의해 측정을 실시하고, 얻어진 측정치를 먼저 제조한 검량선에 대조함으로써 검체 중의 SM 농도를 결정할 수 있다.
또, 공정 (3) 에서 사용되는 콜린 산화 효소로는, 공정 (1) 에서 사용되는 콜린 산화 효소이어도 되고, 새로이 첨가되는 콜린 산화 효소이어도 된다.
상기 공정에 의한 본 발명의 SM 의 측정 방법의 원리도를 제 1 표에 나타낸다.
Figure 112014003129161-pct00001
상기 방법의 공정 (1) 에 있어서, PC 는, SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D 에 의해 콜린으로 변환되고, 콜린 산화 효소에 의해 과산화수소로 변환된다. 또, LPC 는 리소포스포리파아제 또는 모노글리세로리파아제에 의해 글리세롤-3-포스포릴콜린과 유리 지방산으로 변환된다. 공정 (1) 로 생성된 과산화수소는 공정 (2) 에 있어서 소거된다. 본 발명의 측정 방법에 있어서, 과산화수소의 소거란, PC 로부터 생성된 과산화수소를 SM 의 측정에 영향을 미치지 않는 물질로 변환하는 것을 의미한다. 과산화수소의 소거는, 예를 들어 PC 로부터 생성된 과산화수소를 카탈라아제와 반응시켜, 과산화수소를 물로 변환함으로써, 혹은 PC 로부터 생성된 과산화수소를 퍼옥시다아제와 후술하는 한 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방과 반응시켜 무색의 물질로 변환함으로써 실시할 수 있다.
다음으로, 공정 (3) 에 있어서, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 에 의해, SM 은 콜린으로 변환되고, 콜린은 다시 콜린 산화 효소에 의해 과산화수소로 변환된다. 여기서, 공정 (2) 로 발생한 글리세롤-3-포스포릴콜린과 유리 지방산은, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 와는 반응하지 않기 때문에, 반응액 중에 잔존하는 SM 으로부터 과산화수소가 발생하게 된다. 이 SM 으로부터 발생한 과산화수소가 공정 (4) 로 측정된다.
또, 본 발명의 SM 의 측정 방법은, 검체를, SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 산화형 보조효소, 콜린 탈수소 효소, 및 환원형 보조효소 산화 효소와 반응시켜, 생성되는 과산화수소를 소거하고, 이어서 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 산화형 보조효소, 콜린 탈수소 효소, 및 환원형 보조효소 산화 효소와 반응시켜, 생성되는 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 SM 의 측정 방법이다. 구체적으로는, 하기의 공정을 포함하는 방법을 들 수 있다.
(1) 검체를, SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 산화형 보조효소, 콜린 탈수소 효소, 및 환원형 보조효소 산화 효소와 반응시켜, 과산화수소, 환원형 보조효소, 글리세롤-3-포스포릴콜린, 및 유리 지방산을 생성시키는 공정 ;
(2) 공정 (1) 로 생성된 과산화수소를 소거하는 공정 ;
(3) 공정 (2) 후의 반응액 중의 SM 을, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 산화형 보조효소, 콜린 탈수소 효소, 및 환원형 보조효소 산화 효소와 반응시켜, 과산화수소 및 환원형 보조효소를 생성시키는 공정 ; 및,
(4) 공정 (3) 으로 생성된 과산화수소를 측정하는 공정.
상기 공정 (1) 에 있어서의 검체로서, SM 농도가 이미 알려진 표준품을 사용하여, 상기 공정에 의해 측정을 실시하고, SM 농도와 측정치 사이의 관계를 나타내는 검량선을 제조한 후, 실제의 검체를 사용하여 상기 공정에 의해 측정을 실시하고, 얻어진 측정치를 먼저 제조한 검량선에 대조함으로써, 검체 중의 SM 농도를 결정할 수 있다.
또, 공정 (3) 에서 사용되는 콜린 탈수소 효소, 산화형 보조효소, 및 환원형 보조효소 산화 효소로는, 공정 (1) 에서 사용되는 콜린 탈수소 효소, 산화형 보조효소, 환원형 보조효소 산화 효소이어도 되고, 새로이 첨가되는 것이어도 된다.
상기 공정에 의한 본 발명의 SM 의 측정 방법의 원리도를 제 2 표에 나타낸다.
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상기 방법의 공정 (1) 에 있어서, PC 는, SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D 에 의해 콜린으로 변환되고, 콜린 산화 효소, 산화형 보조효소 및 환원형 보조효소 산화 효소에 의해 과산화수소로 변환된다. 또, LPC 는 리소포스포리파아제 또는 모노글리세로리파아제에 의해 글리세롤-3-포스포릴콜린과 유리 지방산으로 변환된다. 공정 (1) 로 생성된 과산화수소는 공정 (2) 에 있어서 소거된다. 본 발명의 측정 방법에 있어서, 과산화수소의 소거란, PC 로부터 생성된 과산화수소를 SM 의 측정에 영향을 미치지 않는 물질로 변환하는 것을 의미한다. 과산화수소의 소거는, 예를 들어 PC 로부터 생성된 과산화수소를 카탈라아제와 반응시켜, 과산화수소를 물로 변환함으로써, 혹은 PC 로부터 생성된 과산화수소를 퍼옥시다아제와 후술하는 한 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방과 반응시켜 무색의 물질로 변환함으로써 실시할 수 있다.
다음으로, 공정 (3) 에 있어서, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 에 의해, SM 은 콜린으로 변환되고, 콜린은 다시 콜린 산화 효소에 의해 과산화수소로 변환된다. 여기서, 공정 (2) 로 발생한 글리세롤-3-포스포릴콜린과 유리 지방산은, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 와는 반응하지 않기 때문에, 반응액 중에 잔존하는 SM 으로부터 과산화수소가 발생하게 된다. 이 SM 으로부터 발생한 과산화수소가 공정 (4) 로 측정된다.
본 발명의 측정 방법에 있어서, 공정 (1) 과 공정 (2) 는 단계적으로 실시할 수도, 동시에 실시할 수도 있지만, 동시에 실시하는 것이 바람직하다. 공정 (1) 과 공정 (2) 의 반응 온도는 통상적으로 10 ∼ 50 ℃ 이고, 20 ∼ 40 ℃ 가 바람직하고, 반응 시간은 통상적으로 1 ∼ 60 분간이고, 2 ∼ 30 분간이 바람직하다.
공정 (2) 에 있어서, 공정 (1) 로 생성된 과산화수소를 카탈라아제를 사용하여 소거하는 경우, 공정 (3) 의 반응은 카탈라아제 저해제의 존재하에서 실시하는 것이 바람직하다. 카탈라아제 저해제로는, 예를 들어 아지화물 등을 들 수 있다. 아지화물로는, 예를 들어 아지화리튬, 아지화나트륨, 아지화칼륨 등을 들 수 있다.
공정 (4) 에 있어서, 공정 (3) 으로 생성된 과산화수소는, 예를 들어 퍼옥시다아제와 후술하는 류코형 색원체 또는 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체와 반응시켜, 생성된 색소의 흡광도를 측정함으로써 측정할 수 있다. 특히, 공정 (1) 로 생성된 과산화수소의 소거를 퍼옥시다아제와 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방을 사용하여 실시하는 경우에는, 공정 (3) 의 반응에 있어서, 다른 일방의 산화 커플링 발색형 색원체를 첨가하는 것이 바람직하다. 이 경우, 공정 (3) 으로 생성된 과산화수소는, 공정 (4) 에 있어서, 당해 과산화수소를 퍼옥시다아제 존재하, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체와 반응시켜, 생성된 색소의 흡광도를 측정함으로써 측정할 수 있다.
본 발명의 측정 방법에 있어서, 공정 (3) 과 공정 (4) 는 단계적으로 실시할 수도, 동시에 실시할 수도 있지만, 동시에 실시하는 것이 바람직하다. 공정 (3) 과 공정 (4) 의 반응 온도는 통상적으로 10 ∼ 50 ℃ 이고, 20 ∼ 40 ℃ 가 바람직하고, 반응 시간은 통상적으로 1 ∼ 60 분간이고, 2 ∼ 30 분간이 바람직하다.
본 발명의 측정 방법은 드라이 케미스트리나 포인트 오브 케어 테스팅 (POCT) 에도 적용할 수 있지만, 후술하는 수성 매체 중에서 실시되는 것이 바람직하다.
또한, PC 로부터 생성된 과산화수소를 퍼옥시다아제와 후술하는 산화 발색형 색원체와 반응시켜 색소로 변환하여 반응액의 흡광도 (A1) 을 측정한 후, SM 으로부터 생성된 과산화수소를 동일하게 색소로 변환하여 반응액의 흡광도 (A2) 를 측정하고, 흡광도 (A2) 로부터 흡광도 (A1) 을 뺌으로써 SM 을 측정할 수도 있다. 이 방법에 있어서, 산화 발색형 색원체 대신에, 형광 물질 [예를 들어, 4-하이드록시페닐아세트산, 3-(4-하이드록시페닐)프로피온산, 쿠마린 등], 발광 물질 (예를 들어, 루미놀 화합물, 루시게닌 화합물 등) 을 사용할 수도 있다. 형광 물질을 사용한 경우에는 반응액의 형광 강도를, 또한 발광 물질을 사용한 경우에는 발광 강도를 측정함으로써 SM 을 측정할 수 있다. 또, PC 로부터 생성된 과산화수소와 SM 으로부터 생성된 과산화수소를 과산화수소 전극으로 측정함으로써, SM 을 측정할 수도 있다. 이들 방법도 본 발명의 측정 방법에 포함된다.
또한, 공정 (2) 에 있어서의 과산화수소의 소거를 카탈라아제를 사용하여 실시하는 경우, 공정 (3) 으로 생성된 과산화수소는, 공정 (4) 에 있어서, 당해 과산화수소를 카탈라아제 저해제 및 퍼옥시다아제 존재하, 형광 물질 또는 발광 물질과 반응시켜, 생성된 형광 또는 발광의 강도를 측정함으로써 측정할 수도 있다. 형광 물질 및 발광 물질로는, 예를 들어 전술한 형광 물질 및 발광 물질을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 검체로는, 예를 들어 전혈, 혈장, 혈청, 수액 (髓液), 타액, 양수, 뇨, 땀, 췌액 등을 들 수 있지만, 혈장 및 혈청이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D 로는, PC 와는 반응하지만, SM 에도 LPC 에도 반응하지 않는 포스포리파아제 D 이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 포스포리파아제 D, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 포스포리파아제 D 등을 들 수 있다. 미생물 유래의 포스포리파아제 D 로는, 예를 들어 Streptomyces sp. 유래의 포스포리파아제 D 등을 들 수 있다. 또, 포스포리파아제 D 로는 시판품을 사용할 수도 있다. 시판되는 포스포리파아제 D 로는, 예를 들어 포스포리파아제 D (PLDP ; 아사히 화성사 제조) 등을 들 수 있다. 또, 본 발명에 있어서는, 2 종류 이상의 SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D 를 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명에 있어서의 리소포스포리파아제로는, LPC 에 대한 가수분해 활성을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 리소포스포리파아제, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 리소포스포리파아제 등을 들 수 있다. 또, 리소포스포리파아제로서 시판품을 사용할 수도 있다. 시판되는 리소포스포리파아제로는, 예를 들어 리소포스포리파아제 (LYPL ; 아사히 화성사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 모노글리세로리파아제로는, LPC 에 대한 가수분해 활성을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 모노글리세로리파아제, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 모노글리세로리파아제 등을 들 수 있다. 또, 모노글리세로리파아제로서 시판품을 사용할 수도 있다. 시판되는 모노글리세로리파아제로는, 예를 들어 모노글리세로리파아제 (MGLP ; 아사히 화성사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 2 종류 이상의 리소포스포리파아제 또는 모노글리세로리파아제를 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 SM 의 측정 방법에 있어서의 SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D 의 반응액 중의 농도는 본 발명의 SM 의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 통상적으로 0.001 ∼ 200,000 U/ℓ 이고, 0.005 ∼ 100,000 U/ℓ 이 바람직하다.
본 발명의 SM 의 측정 방법에 있어서의 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제의 반응액 중의 농도는 본 발명의 SM 의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 통상적으로 0.001 ∼ 200,000 U/ℓ 이고, 0.005 ∼ 100,000 U/ℓ 이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 콜린 산화 효소로는, 콜린을 산화하여 과산화수소를 생성하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜린옥시다아제 외에, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 콜린옥시다아제 등도 사용할 수 있다. 또, 콜린옥시다아제 (CLOD ; 쿄와 발효사 제조), 콜린옥시다아제 (CHO-301 ; 토요 방적사 제조) 등의 시판품을 사용할 수도 있다. 본 발명에 있어서는 2 종류 이상의 콜린 산화 효소를 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 SM 의 측정 방법에 있어서의 콜린 산화 효소의 반응액 중의 농도로는, 본 발명의 SM 의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 통상적으로 0.001 ∼ 200,000 U/ℓ 이고, 0.005 ∼ 20,000 U/ℓ 이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 로는, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 포스포리파아제 D, 포스포리파아제 D 활성을 갖는 리포프로테인리파아제 외에, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 포스포리파아제 D 등도 사용할 수 있다. 미생물 유래의 포스포리파아제 D 로는, 예를 들어 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 등을 들 수 있다. 또, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 로는 시판품을 사용할 수도 있다. 시판되는 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 로는, 포스포리파아제 D (PLD ; 아사히 화성사 제조) 등을 들 수 있다. 또, 본 발명에 있어서는, 2 종류 이상의 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 를 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 SM 의 측정 방법에 있어서의 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 의 반응액 중의 농도로는, 본 발명의 SM 의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 통상적으로 0.001 ∼ 500,000 U/ℓ 이고, 0.005 ∼ 250,000 U/ℓ 이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 콜린 탈수소 효소로는, 산화형 보조효소의 존재하에 콜린을 산화하여 환원형 보조효소를 생성하는 능력을 갖는 효소이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 콜린데하이드로게나아제 외에, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 콜린 탈수소 효소 등도 사용할 수 있다. 또, 본 발명에 있어서는 2 종류 이상의 콜린 탈수소 효소를 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 SM 의 측정 방법에 있어서의 콜린 탈수소 효소의 반응액 중의 농도로는, 본 발명의 SM 의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 통상적으로 0.001 ∼ 200,000 U/ℓ 이고, 0.005 ∼ 100,000 U/ℓ 가 바람직하다.
콜린 탈수소 효소를 사용한 측정에 있어서 사용되는 산화형 보조효소로는, 예를 들어 NAD(P)+, thio-NAD(P)+ 등을 들 수 있다. 콜린 탈수소 효소의 반응에 의해 생성되는 환원형 보조효소로는, 예를 들어 NAD(P)H, thio-NAD(P)H 등을 들 수 있다.
본 발명의 SM 의 측정 방법에 사용되는 산화형 보조효소의 반응액 중의 농도로는, 본 발명의 SM 의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 통상적으로 0.01 ∼ 400 m㏖/ℓ 이고, 0.1 ∼ 100 m㏖/ℓ 가 바람직하다.
본 발명에 있어서의 환원형 보조효소 산화 효소로는, 콜린 탈수소 효소의 반응에 의해 생성되는 환원형 보조효소로부터 과산화수소를 생성시키는 능력을 갖는 효소이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 NAD(P)H 산화 효소 등을 들 수 있다. 환원형 보조효소 산화 효소로는 시판품을 사용할 수도 있다. 시판되는 환원형 보조효소 산화 효소로는, NADH oxidase (코스모·바이오사 제조) 등을 들 수 있다.
본 발명의 SM 의 측정 방법에 사용되는 환원형 보조효소 산화 효소의 반응액 중의 농도로는, 본 발명의 SM 의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 통상적으로 0.01 ∼ 400,000 U/ℓ 이고, 0.02 ∼ 200,000 U/ℓ 가 바람직하다.
본 발명의 SM 의 측정 방법에 사용되는 카탈라아제로는, 과산화수소를 물과 산소 분자로 변환할 수 있는 효소이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 동물, 식물 또는 미생물 유래의 카탈라아제 외에, 유전자 공학적인 수법에 의해 제조되는 카탈라아제 등도 사용할 수 있다. 또, 카탈라아제로는, 시판품을 사용할 수도 있다. 시판되는 카탈라아제로는, 카탈라아제 (CAT ; 키코망사 제조), 카탈라아제 (CAT-R ; 키코망사 제조), 카탈라아제 소 간장 유래 (시그마·알드리치사 제조) 등을 들 수 있다. 또, 본 발명에 있어서는 2 종류 이상의 카탈라아제를 조합하여 사용할 수도 있다.
본 발명의 SM 의 측정 방법에 사용되는 카탈라아제의 반응액 중의 농도로는, 본 발명의 SM 의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 통상적으로 0.001 ∼ 1,000,000 U/ℓ 이고, 0.01 ∼ 500,000 U/ℓ 가 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용되는 수성 매체로는, 본 발명의 SM 의 측정 방법을 가능하게 하는 수성 매체이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 탈이온수, 증류수, 완충액 등을 들 수 있지만, 완충액이 바람직하다. 완충액에 사용하는 완충제로는, 예를 들어 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 완충제, 인산 완충제, 붕산 완충제, 굿 완충제 등을 들 수 있다.
굿 완충제로는, 예를 들어 2-모르폴리노에탄술폰산 (MES), 비스(2-하이드록시에틸)이미노트리스(하이드록시메틸)메탄 (Bis-Tris), N-(2-아세트아미드)이미노 2 아세트산 (ADA), 피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산) (PIPES), N-(2-아세트아미드)-2-아미노에탄술폰산 (ACES), 3-모르폴리노-2-하이드록시프로판술폰산 (MOPSO), N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산 (BES), 3-모르폴리노프로판술폰산 (MOPS), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-아미노에탄술폰산 (TES), 2-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]에탄술폰산 (HEPES), 3-[N,N-비스(2-하이드록시에틸)아미노]-2-하이드록시프로판술폰산 (DIPSO), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-2-하이드록시-3-아미노프로판술폰산 (TAPSO), 피페라진-N,N'-비스(2-하이드록시프로판술폰산) (POPSO), 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]-2-하이드록시프로판술폰산 (HEPPSO), 3-[4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지닐]프로판술폰산 [(H)EPPS], N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신 (Tricine), N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신 (Bicine), N-트리스(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), N-시클로헥실-2-아미노에탄술폰산 (CHES), N-시클로헥실-3-아미노-2-하이드록시프로판술폰산 (CAPSO), N-시클로헥실-3-아미노프로판술폰산 (CAPS) 등을 들 수 있다. 완충액의 농도는 측정에 적합한 농도이면 특별히 제한은 되지 않지만, 통상적으로 0.001 ∼ 2.0 ㏖/ℓ 이고, 0.005 ∼ 1.0 ㏖/ℓ 가 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용되는 퍼옥시다아제로는, 본 발명의 SM 의 측정 방법을 가능하게 하는 퍼옥시다아제이면 특별히 제한은 없고, 예를 들어 서양고추냉이 유래의 퍼옥시다아제 등을 들 수 있다.
본 발명의 SM 의 측정 방법에 사용되는 퍼옥시다아제의 반응액 중의 농도로는, 본 발명의 SM 의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 통상적으로 0.01 ∼ 500,000 U/ℓ 이고, 1 ∼ 200,000 U/ℓ 가 바람직하다.
본 발명의 SM 의 측정 방법에 사용되는 류코형 색원체로는, 본 발명의 SM 의 측정 방법을 가능하게 하는 류코형 색원체이면 특별히 제한은 없다. 류코형 색원체는, 퍼옥시다아제의 존재하, 과산화수소와 반응하여 단독으로 색소를 생성하는 기능을 갖는다.
류코형 색원체로는, 예를 들어 10-N-카르복시메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (CCAP), 10-N-메틸카르바모일-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진 (MCDP), N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민나트륨염 (DA-64), 10-N-(카르복시메틸아미노카르보닐)-3,7-비스(디메틸아미노)-10H-페노티아진나트륨염 (DA-67), 4,4'-비스(디메틸아미노)디페닐아민, 비스[3-비스(4-클로로페닐)메틸-4-디메틸아미노페닐]아민 (BCMA) 등을 들 수 있다.
본 발명의 SM 의 측정 방법에 사용되는 류코형 색원체의 반응액 중의 농도로는, 본 발명의 SM 의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 통상적으로 0.001 ∼ 5 g/ℓ 이고, 0.01 ∼ 1 g/ℓ 가 바람직하다.
본 발명의 SM 의 측정 방법에 사용되는 산화 커플링 발색형 색원체로는, 본 발명의 SM 의 측정 방법을 가능하게 하는 산화 커플링 발색형 색원체이면 특별히 제한은 없다. 산화 커플링 발색형 색원체는, 퍼옥시다아제의 존재하, 과산화수소와 반응하여 색소를 생성하는 기능을 갖는다. 이 색소를 생성하는 반응에 있어서는, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 조합이 사용된다. 한편, 산화 커플링 발색형 색원체는, 퍼옥시다아제의 존재하, 과산화수소와 반응하여 과산화수소를 무색의 물질로 변환하는 기능도 갖는다. 이 과산화수소를 무색의 물질로 변환하는 반응에 있어서는, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방만이 사용된다. 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 조합으로는, 커플러와 아닐린류의 조합, 커플러와 페놀류의 조합을 들 수 있다.
커플러로는, 예를 들어 4-아미노안티피린 (4-AA), 3-메틸-2-벤조티아졸리논하이드라진 등을 들 수 있다.
아닐린류로는, N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOOS), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린 (MAOS), N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (DAOS), N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메틸아닐린 (TOPS), N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린 (HDAOS), N,N-디메틸-3-메틸아닐린, N,N-디(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-(3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린, N-에틸-N-(3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)아닐린, N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-숙시닐에틸렌디아민 (EMSE), N-에틸-N-(3-메틸페닐)-N'-아세틸에틸렌디아민, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-4-플루오로-3,5-디메톡시아닐린 (F-DAOS) 등을 들 수 있다.
페놀류로는, 페놀, 4-클로로페놀, 3-메틸페놀, 3-하이드록시-2,4,6-트리요오드벤조산 (HTIB) 등을 들 수 있다.
본 발명의 SM 의 측정 방법에 사용되는 산화 커플링 발색형 색원체의 반응액 중의 농도로는, 본 발명의 SM 의 측정을 가능하게 하는 농도이면 특별히 제한은 없고, 통상적으로 0.001 ∼ 5 g/ℓ 이고, 0.01 ∼ 1 g/ℓ 가 바람직하다.
<SM 측정용 키트>
본 발명의 SM 측정용 키트는 본 발명의 SM 의 측정 방법에 사용된다. 본 발명의 SM 측정용 키트로는, 예를 들어 2 시약계의 키트, 3 시약계의 키트 등을 들 수 있지만, 제 1 시약과 제 2 시약으로 이루어지는 2 시약계의 키트가 바람직하다.
본 발명의 SM 측정용 키트는 동결 건조된 상태이어도 되고, 수성 매체에 용해된 상태이어도 된다. 동결 건조된 상태의 키트를 사용하여 검체 중의 SM 을 측정하는 경우에는, 측정 전에 수성 매체에 용해하여 사용된다. 수성 매체로는, 예를 들어 전술한 수성 매체 등을 들 수 있다.
본 발명의 SM 측정용 키트에 있어서는, 전술한 SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 산화 효소, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 산화형 보조효소, 콜린 탈수소 효소, 환원형 보조효소 산화 효소, 카탈라아제, 카탈라아제 저해제, 류코형 색원체, 산화 커플링 발색형 색원체를 사용할 수 있다.
제 1 시약과 제 2 시약으로 이루어지는 2 시약계의 SM 측정용 키트에 있어서는, SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D 는 제 1 시약에 함유된다. 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제는 제 1 시약에 함유된다. 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 는 제 2 시약에 함유된다. 콜린 산화 효소는 제 1 시약에 함유되지만, 추가로 제 2 시약에 함유되어도 된다. 콜린 탈수소 효소는 제 1 시약에 함유되지만, 추가로 제 2 시약에 함유되어도 된다. 산화형 보조효소는 제 1 시약에 함유되지만, 추가로 제 2 시약에 함유되어도 된다. 환원형 보조효소 산화 효소는 제 1 시약에 함유되지만, 추가로 제 2 시약에 함유되어도 된다. 카탈라아제는 제 1 시약에 함유된다. 카탈라아제 저해제는 제 2 시약에 함유된다. 퍼옥시다아제는 제 1 시약에 함유되지만, 추가로 제 2 시약에 함유되어도 된다. 류코형 색원체는 제 2 시약에 함유된다. 과산화수소의 소거를 퍼옥시다아제, 및 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방의 존재하에 실시하는 경우, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방은 제 1 시약에 함유된다. 과산화수소의 측정을 퍼옥시다아제, 및 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 존재하에 실시하는 경우, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방은 제 1 시약에 함유되고, 다른 일방은 제 2 시약에 함유되는 양태가 바람직하다.
본 발명의 SM 측정용 키트에 있어서의 SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D 의 제 1 시약 중의 농도는 통상적으로 0.002 ∼ 400,000 U/ℓ 이고, 0.01 ∼ 200,000 U/ℓ 가 바람직하다. 동결 건조된 상태의 SM 측정용 키트에 있어서는, SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D 의 제 1 시약 중의 함량은 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 통상적으로 0.002 ∼ 400,000 U/ℓ, 바람직하게는 0.01 ∼ 200,000 U/ℓ 가 되는 함량이다.
본 발명의 SM 측정용 키트에 있어서의 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제의 제 1 시약 중의 농도는 통상적으로 0.002 ∼ 400,000 U/ℓ 이고, 0.01 ∼ 200,000 U/ℓ 가 바람직하다. 동결 건조된 상태의 SM 측정용 키트에 있어서는, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제의 제 1 시약 중의 함량은 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 통상적으로 0.002 ∼ 400,000 U/ℓ, 바람직하게는 0.01 ∼ 200,000 U/ℓ 가 되는 함량이다.
본 발명의 SM 측정용 키트에 있어서의 콜린 산화 효소의 제 1 시약 중의 농도는 통상적으로 0.002 ∼ 400,000 U/ℓ 이고, 0.01 ∼ 200,000 U/ℓ 가 바람직하다. 동결 건조된 상태의 SM 측정용 키트에 있어서는, 콜린 산화 효소의 제 1 시약 중의 함량은 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 통상적으로 0.002 ∼ 400,000 U/ℓ, 바람직하게는 0.01 ∼ 200,000 U/ℓ 가 되는 함량이다.
본 발명의 SM 측정용 키트에 있어서의 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 의 제 2 시약 중의 농도는 통상적으로 0.004 ∼ 800,000 U/ℓ 이고, 0.02 ∼ 400,000 U/ℓ 가 바람직하다. 동결 건조된 상태의 SM 측정용 키트에 있어서는, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D 의 제 2 시약 중의 함량은 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 통상적으로 0.004 ∼ 800,000 U/ℓ, 바람직하게는 0.02 ∼ 400,000 U/ℓ 가 되는 함량이다.
본 발명의 SM 측정용 키트에 있어서의 콜린 탈수소 효소의 제 1 시약 중의 농도는 통상적으로 0.002 ∼ 400,000 U/ℓ 이고, 0.01 ∼ 200,000 U/ℓ 가 바람직하다. 동결 건조된 상태의 SM 측정용 키트에 있어서는, 콜린 탈수소 효소의 제 1 시약 중의 함량은 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 통상적으로 0.002 ∼ 400,000 U/ℓ, 바람직하게는 0.01 ∼ 200,000 U/ℓ 가 되는 함량이다.
본 발명의 SM 측정용 키트에 있어서의 산화형 보조효소의 제 1 시약 중의 농도는 통상적으로 0.02 ∼ 800 m㏖/ℓ 이고, 0.2 ∼ 200 m㏖/ℓ 가 바람직하다. 동결 건조된 상태의 SM 측정용 키트에 있어서는, 산화형 보조효소의 제 1 시약 중의 함량은 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 통상적으로 0.02 ∼ 800 m㏖/ℓ, 바람직하게는 0.2 ∼ 200 m㏖/ℓ 가 되는 함량이다.
본 발명의 SM 측정용 키트에 있어서의 환원형 보조효소 산화 효소의 제 1 시약 중의 농도는 통상적으로 0.02 ∼ 800,000 U/ℓ 이고, 0.04 ∼ 400,000 U/ℓ 가 바람직하다. 동결 건조된 상태의 SM 측정용 키트에 있어서는, 환원형 보조효소 산화 효소의 제 1 시약 중의 함량은 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 통상적으로 0.02 ∼ 800,000 U/ℓ, 바람직하게는 0.04 ∼ 400,000 U/ℓ 가 되는 함량이다.
본 발명의 SM 측정용 키트에 있어서의 카탈라아제의 제 1 시약 중의 농도는 통상적으로 0.002 ∼ 1,500,000 U/ℓ 이고, 0.02 ∼ 750,000 U/ℓ 가 바람직하다. 동결 건조된 상태의 SM 측정용 키트에 있어서는, 카탈라아제의 제 1 시약 중의 함량은 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 통상적으로 0.002 ∼ 1,500,000 U/ℓ, 바람직하게는 0.02 ∼ 750,000 U/ℓ 가 되는 함량이다.
본 발명의 SM 측정용 키트에 있어서의 퍼옥시다아제의 제 1 시약 중의 농도는 통상적으로 0.01 ∼ 500,000 U/ℓ 이고, 1 ∼ 200,000 U/ℓ 가 바람직하다. 동결 건조된 상태의 SM 측정용 키트에 있어서는, 퍼옥시다아제의 제 1 시약 중의 함량은 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 통상적으로 0.01 ∼ 500,000 U/ℓ 이고, 1 ∼ 200,000 U/ℓ 가 되는 함량이다.
본 발명의 SM 측정용 키트에 있어서의 류코형 색원체의 제 2 시약 중의 농도는 통상적으로 0.002 ∼ 7.5 g/ℓ 이고, 0.02 ∼ 1.5 g/ℓ 가 바람직하다. 동결 건조된 상태의 SM 측정용 키트에 있어서는, 류코형 색원체의 제 2 시약 중의 함량은 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 통상적으로 0.002 ∼ 7.5 g/ℓ, 바람직하게는 0.02 ∼ 1.5 g/ℓ 가 되는 함량이다.
본 발명의 SM 측정용 키트에 있어서의 산화 커플링 발색형 색원체의 제 1 시약 및 제 2 시약 중의 농도는 통상적으로 0.002 ∼ 7.5 g/ℓ 이고, 0.02 ∼ 1.5 g/ℓ 가 바람직하다. 동결 건조된 상태의 SM 측정용 키트에 있어서는, 산화 커플링 발색형 색원체의 제 1 시약 및 제 2 시약 중의 함량은 수성 매체로 용해된 상태에서의 농도가 통상적으로 0.002 ∼ 7.5 g/ℓ, 바람직하게는 0.02 ∼ 1.5 g/ℓ 가 되는 함량이다.
본 발명의 SM 측정용 키트에는, 필요에 따라, 수성 매체, 안정화제, 방부제, 간섭 물질의 영향 억제제, 반응 촉진제, 계면 활성제 등이 함유되어도 된다. 수성 매체로는, 예를 들어 전술한 수성 매체 등을 들 수 있다. 안정화제로는, 예를 들어 에틸렌디아민 4 아세트산 (EDTA), 수크로오스, 염화칼슘, 글리신, 글루탐산나트륨, 트립토판 등을 들 수 있다. 방부제로는, 예를 들어 아지화나트륨, 항생 물질, 바이오 에이스 등을 들 수 있다. 간섭 물질의 영향 억제제로는, 예를 들어 아스코르브산의 영향 억제를 위한 아스코르브산옥시다아제, 빌리루빈의 영향 억제를 위한 페로시안화물 등을 들 수 있다. 반응 촉진제로는, 예를 들어 코리파아제 등의 효소, 황산나트륨, 염화나트륨 등의 염류 등을 들 수 있다. 계면 활성제로는, 예를 들어 비이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양쪽성 계면 활성제 등을 들 수 있다. 비이온성 계면 활성제로는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌계 계면 활성제 등을 들 수 있다.
이하에, 본 발명의 SM 측정용 키트의 구체적 양태를 기재하지만, 본 발명의 SM 측정용 키트는 이들에 한정되지 않는다.
·키트 1
제 1 시약
SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 산화 효소, 카탈라아제, 퍼옥시다아제
제 2 시약
글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 카탈라아제 저해제, 류코형 색원체
·키트 2
제 1 시약
SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 산화 효소, 카탈라아제, 퍼옥시다아제
제 2 시약
글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 콜린 산화 효소, 카탈라아제 저해제, 류코형 색원체
·키트 3
제 1 시약
SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 탈수소 효소, 산화형 보조효소, 환원형 보조효소 산화 효소, 카탈라아제, 퍼옥시다아제
제 2 시약
글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 카탈라아제 저해제, 류코형 색원체
·키트 4
제 1 시약
SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 탈수소 효소, 산화형 보조효소, 환원형 보조효소 산화 효소, 카탈라아제, 퍼옥시다아제
제 2 시약
글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 콜린 탈수소 효소, 산화형 보조효소, 환원형 보조효소 산화 효소, 카탈라아제 저해제, 류코형 색원체
·키트 5
제 1 시약
SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 산화 효소, 퍼옥시다아제, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방
제 2 시약
글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 다른 일방
·키트 6
제 1 시약
SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 산화 효소, 퍼옥시다아제, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방
제 2 시약
글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 콜린 산화 효소, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 다른 일방
·키트 7
제 1 시약
SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 탈수소 효소, 산화형 보조효소, 환원형 보조효소 산화 효소, 퍼옥시다아제, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방
제 2 시약
글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 다른 일방
·키트 8
제 1 시약
SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 탈수소 효소, 산화형 보조효소, 환원형 보조효소 산화 효소, 퍼옥시다아제, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방
제 2 시약
글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 콜린 탈수소 효소, 산화형 보조효소, 환원형 보조효소 산화 효소, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 다른 일방
·키트 9
제 1 시약
SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 산화 효소, 퍼옥시다아제, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방
제 2 시약
글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 퍼옥시다아제, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 다른 일방
·키트 10
제 1 시약
SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 산화 효소, 퍼옥시다아제, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방
제 2 시약
글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 콜린 산화 효소, 퍼옥시다아제, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 다른 일방
·키트 11
제 1 시약
SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 탈수소 효소, 산화형 보조효소, 환원형 보조효소 산화 효소, 퍼옥시다아제, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방
제 2 시약
글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 퍼옥시다아제, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 다른 일방
·키트 12
제 1 시약
SM 및 LPC 와는 반응하지 않고, PC 와는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 탈수소 효소, 산화형 보조효소, 환원형 보조효소 산화 효소, 퍼옥시다아제, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방
제 2 시약
글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, SM 과는 반응하는 포스포리파아제 D, 콜린 탈수소 효소, 산화형 보조효소, 환원형 보조효소 산화 효소, 퍼옥시다아제, 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 다른 일방
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이들은 본 발명의 범위를 전혀 한정하는 것은 아니다. 또한, 본 실시예 및 참고예에 있어서는, 하기 메이커의 시약 및 효소를 사용하였다.
PIPES (도진 화학 연구소사 제조), EMSE (다이토 케믹스사 제조), 염화칼슘 2 수화물 (와코 쥰야쿠 공업사 제조), 4-AA (사이쿄 화성사 제조), 퍼옥시다아제 (POD ; 토요 방적사 제조), 카탈라아제 (키코망사 제조), CLOD (콜린 산화 효소 ; 쿄와 발효사 제조), 아지화나트륨 (와코 쥰야쿠 공업사 제조), MGLP (모노글리세롤리파아제 ; 아사히 화성사 제조), PLDP (아사히 화성사 제조), PLD (아사히 화성사 제조), 포스파티딜콜린 (시그마·알드리치사 제조), 리소포스파티딜콜린 (시그마·알드리치사 제조), SM (시그마·알드리치사 제조), 트리톤 X-100 (폴리옥시에틸렌계 계면 활성제 : 시그마·알드리치사 제조).
실시예 1
PC, LPC 및 SM 의 각 인 지질에 대해, (1) PLDP, (2) PLD, 및 (3) MGLP 의 각 효소에 대한 반응성을 이하의 방법에 의해 검토하였다.
<키트>
제 3 표에 나타내는 이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 키트 (키트 A ∼ F) 를 조제하였다.
제 1 시약
PIPES (pH 7.0) 15 g/ℓ
EMSE 0.3 g/ℓ
트리톤 X-100 0.05 g/ℓ
MGLP
제 2 시약
PIPES (pH 7.5) 15 g/ℓ
4-AA 0.5 g/ℓ
아지화나트륨 0.2 g/ℓ
POD 20 kU/ℓ
염화칼슘 2 수화물 0.3 g/ℓ
CLOD 30 kU/ℓ
PLDP 또는 PLD
Figure 112014003129161-pct00003
<검체>
생리 식염수, SM 표준액 (SM 농도 : 100 ㎎/㎗), PC 표준액 (PC 농도 : 100 ㎎/㎗), LPC 표준액 (LPC 농도 : 100 ㎎/㎗) 을 검체로서 사용하였다.
<키트 A 를 사용하는 측정 ∼ 표준액에 대한 흡광도>
검체로서 생리 식염수 (인 지질 : 0.0 ㎎/㎗) 와 SM 표준액을 사용하고, 키트로서 키트 A 를 사용하여, 히타치 7170S 형 자동 분석기에 의해, SM 표준액에 대한 「흡광도」 를 이하의 방법에 의해 결정하였다.
반응 셀에 생리 식염수 (2.5 ㎕) 와 제 1 시약 (240 ㎕) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 가온하고, 그 반응액의 흡광도 (E1생식) 를 주파장 600 ㎚, 부파장 700 ㎚ 에서 측정하며, 이어서 이 반응액에 제 2 시약 (80 ㎕) 을 첨가하고, 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 가온한 후에, 반응액의 흡광도 (E2생식) 를 주파장 600 ㎚, 부파장 700 ㎚ 에서 측정하였다. E2생식 으로부터 E1생식 을 뺀 값을 ΔE생식 으로 하였다.
검체로서 생리 식염수 대신에 SM 표준액을 사용한 것 이외에는 상기와 동일한 반응을 실시하고, E2SM 으로부터 E1SM 을 빼서 ΔESM 으로 하였다. 식 (I) 에 나타내는 바와 같이 ΔESM 으로부터 상기의 ΔE생식 을 빼서 얻어지는 값을 SM 표준액에 대한 「흡광도」(A) 로 하였다.
Figure 112014003129161-pct00004
SM 표준액 대신에 PC 표준액, 및 LPC 표준액을 각각 사용하고, 동일하게 하여, PC 표준액에 대한 「흡광도」(A), 및 LPC 표준액에 대한 「흡광도」(A) 를 결정하였다.
<키트 B ∼ F 를 사용하는 측정 ∼ 표준액에 대한 흡광도>
키트 A 대신에 키트 B ∼ F 를 각각 사용하여, 각 키트에 있어서의 각 표준액에 대한 「흡광도」 를 결정하였다. 각 키트에 있어서의 각 표준액에 대한 「흡광도」 를 도 1 에 나타낸다.
도 1 로부터 이하가 판명되었다. 먼저, 키트 A 를 사용한 경우, 어느 인 지질에 대해서도 「흡광도」 가 얻어지지 않았던 점에서, 어느 인 지질도 콜린 산화 효소와는 반응하지 않는 것을 알 수 있었다. 키트 B 를 사용한 반응에서 PLDP 는 PC 에 특이적으로 반응하여 콜린을 생성하는 것을 알 수 있었다. 키트 C 를 사용한 반응에서 PLD 는 어느 인 지질과도 반응하여 콜린을 생성하는 것을 알 수 있었다.
키트 D 를 사용한 반응에서 어느 인 지질에 대해서도 MGLP 와의 반응에 의해 콜린을 생성하지 않는 것을 알 수 있었다.
키트 E 를 사용한 경우, PC 만이 콜린을 생성하는 것을 알 수 있었다. 키트 B 를 사용한 반응과의 비교에서, PC 는 MGLP 와는 반응하지 않고, PLDP 와 반응하여 콜린을 생성하는 것으로 생각되었다. 또, LPC 로부터는 「흡광도」 가 얻어지지 않았기 때문에, LPC 와 MGLP 의 반응에 의해 생성되는 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산은, PLDP 와는 반응하지 않아, 콜린을 생성하지 않는 것을 알 수 있었다.
키트 F 를 사용하는 반응에서 PC 와 SM 의 경우에는 콜린을 생성하는 것을 알 수 있었다. 키트 C 를 사용한 반응과의 비교에서, PC 와 SM 은 MGLP 와는 반응하지 않고, PLD 와 반응하여 콜린을 생성하는 것으로 생각되었다. 한편, LPC 로부터는 「흡광도」 가 얻어지지 않았기 때문에, LPC 가 MGLP 와 반응하여 생성되는 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산은, PLD 와는 반응하지 않아, 콜린을 생성하지 않는 것을 알 수 있었다.
따라서, PC, LPC 및 SM 을 함유하는 검체에 PLDP 를 작용시킴으로써, PC 만이 PLDP 와 반응하여, 생성된 콜린을 과산화수소로 변환하여 소거함과 함께, 잔존하는 LPC 와 SM 에 MGLP 를 작용시킨 후에 PLD 를 작용시킴으로써, LPC 만이 MGLP 와 반응하여, 생성된 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산이 PLD 와 반응하지 않기 때문에, 검체 중의 SM 만이 PLD 와 반응하여 콜린을 생성하고, 당해 콜린으로부터 생성된 과산화수소를 측정함으로써, SM 만을 측정할 수 있는 것이 판명되었다.
실시예 2
이하의 제 1 시약 및 제 2 시약으로 이루어지는 SM 측정용 키트를 조제하였다.
제 1 시약
PIPES (pH 6.25) 15 g/ℓ
EMSE 0.3 g/ℓ
카탈라아제 300 kU/ℓ
PLDP 10 kU/ℓ
MGLP 10 kU/ℓ
CLOD 10 kU/ℓ
트리톤 X-100 0.05 g/ℓ
제 2 시약
PIPES (pH 7.5) 15 g/ℓ
4-AA 0.5 g/ℓ
아지화나트륨 0.2 g/ℓ
POD 20 kU/ℓ
PLD 4 kU/ℓ
CLOD 10 kU/ℓ
염화칼슘 2 수화물 0.3 g/ℓ
트리톤 X-100 8 g/ℓ
실시예 3
실시예 2 의 측정용 키트, 및 대조 키트로서 Sphingomyelin Assay Kit (Cayman Chemical Company 사 제조) 를 사용하여, 인간 혈청 28 검체의 각 검체 중의 SM 농도를 이하의 순서에 의해 결정하였다.
(1) 검량선의 제조
표준액으로서 생리 식염수 (SM : 0.0 ㎎/㎗) 와 SM 농도가 35.0 ㎎/㎗ 인 것이 판명되어 있는 표준 혈청을 사용하고, 키트로서 실시예 2 의 키트를 사용하여, 히타치 7170S 형 자동 분석기에 의해, SM 농도와 「흡광도」 의 관계를 나타내는 검량선을 제조하였다.
여기서 기재하는 「흡광도」 란, 이하의 반응으로 측정된 2 개의 흡광도 (E1 및 E2) 를 기초로, E2 로부터 E1 을 뺌으로써 얻어지는 값을 나타낸다.
반응 셀에 표준액 (2.5 ㎕) 과 제 1 시약 (240 ㎕) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 5 분간 가온하며, 그 반응액의 흡광도 (E1) 을 주파장 600 ㎚, 부파장 700 ㎚ 에서 측정하고, 이어서 이 반응액에 제 2 시약 (80 ㎕) 을 첨가하고, 추가로 37 ℃ 에서 5 분간 가온한 후에, 반응액의 흡광도 (E2) 를 주파장 600 ㎚, 부파장 700 ㎚ 에서 측정하였다.
(2) 인간 혈청 검체에 있어서의 「흡광도」 의 측정
(1) 의 검량선 제조에 있어서, 표준액 대신에 인간 혈청 검체 (28 검체) 를 사용한 것 이외에는, (1) 의 「흡광도」 산출 방법과 동일한 조작을 실시하여, 당해 검체의 각 검체에 있어서의 「흡광도」 를 측정하였다.
(3) 인간 혈청 검체 중의 SM 농도의 결정
(2) 로 측정한 「흡광도」 와, (1) 로 제조한 검량선으로부터 각 검체 중의 SM 농도를 측정하였다.
(4) 대조 키트에 의한 SM 농도의 결정
대조 키트의 사용 설명서에 따라, 대조 키트를 사용하여 동일한 인간 혈청 28 검체 중의 SM 농도를 결정하였다.
대조 키트를 사용한 측정에 의해 결정된 각 검체 중의 SM 농도 (x) 와, 실시예 2 의 키트를 사용한 측정에 의해 결정된 각 검체 중의 SM 농도 (y) 로부터, 대조 키트를 사용한 측정과 실시예 2 의 키트를 사용한 측정 사이의 상관을 검토한 결과, 도 2 에 나타내는 상관도가 얻어졌다. 이 상관도가 나타내는 바와 같이, x 와 y 사이에는 식 (II) 로 나타내는 관계가 성립되어, 상관 계수 (r) 는 0.8445 가 되어 양 측정간에 양호한 상관 관계가 있는 것이 판명되었다.
Figure 112014003129161-pct00005
실시예 4
SM 표준액 (SM 농도 : 100 ㎎/㎗) 을 사용하여 10 단계의 희석계열을 조제하고, 각 희석 검체에 대해 실시예 3 과 동일한 방법에 의해 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 3 에 나타낸다.
도 3 으로부터 분명한 바와 같이, 실시예 2 의 키트를 사용하는 측정에 의해, SM 농도와 흡광도 사이에 매우 양호한 직선성이 얻어지는 것을 알 수 있었다.
실시예 5
실시예 2 의 키트를 사용하여 SM 에 대한 특이성을 검토하였다. 검체로서, 생리 식염수, SM 표준액 (SM 농도 : 100 ㎎/㎗), PC 표준액 (PC 농도 : 100 ㎎/㎗), LPC 표준액 (LPC 농도 : 100 ㎎/㎗) 을 사용하여, 실시예 3 의 방법에 의해 각 검체에 대한 「흡광도」 를 측정하였다.
한편, 실시예 2 의 키트 대신에 인 지질 측정용 키트인 「디터미너L PL」 (쿄와 메덱스사 제조) 을 사용하여, 실시예 3 과 동일한 방법에 의해 각 검체에 대한 「흡광도」 를 측정하였다. 측정 결과를 제 4 표에 나타낸다.
Figure 112014003129161-pct00006
제 4 표로부터 분명한 바와 같이, 「디터미너L PL」 을 사용한 측정에 있어서는, SM, PC, LPC 의 모든 인 지질이 반응했지만, 실시예 2 의 키트를 사용한 측정에 있어서는 SM 만이 반응하였다. 따라서, 실시예 2 의 키트는 SM 을 특이적으로 측정하는 키트인 것이 확인되었다.
산업상의 이용가능성
본 발명에 의해, 동맥 경화 등의 진단에 유효한 혈액 중의 SM 의 측정 방법, 및 측정용 키트가 제공된다.

Claims (42)

  1. 검체 중의 포스파티딜콜린을, 스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 콜린 산화 효소와 반응시켜, 포스파티딜콜린으로부터 과산화수소를 생성시켜, 생성되는 과산화수소를 소거하여 포스파티딜콜린을 소거함과 함께,
    검체 중의 리소포스파티딜콜린을, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제와 반응시켜, 리소포스파티딜콜린을 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산으로 변환하여 리소포스파티딜콜린을 소거한 후,
    검체 중의 스핑고미엘린을, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 콜린 산화 효소와 반응시켜, 스핑고미엘린으로부터 과산화수소를 생성시켜, 생성되는 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 스핑고미엘린의 측정 방법.
  2. 검체 중의 포스파티딜콜린을, 스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 산화형 보조효소, 콜린 탈수소 효소, 및 환원형 보조효소 산화 효소와 반응시켜, 포스파티딜콜린으로부터 과산화수소를 생성시켜, 생성되는 과산화수소를 소거하여 포스파티딜콜린을 소거함과 함께,
    검체 중의 리소포스파티딜콜린을, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제와 반응시켜, 리소포스파티딜콜린을 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산으로 변환하여 리소포스파티딜콜린을 소거한 후,
    검체 중의 스핑고미엘린을, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 산화형 보조효소, 콜린 탈수소 효소, 및 환원형 보조효소 산화 효소와 반응시켜, 스핑고미엘린으로부터 과산화수소를 생성시켜, 생성되는 과산화수소를 측정하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 스핑고미엘린의 측정 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    검체와, 스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 및 콜린 산화 효소의 반응을 카탈라아제의 존재하에 실시하고, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 콜린 산화 효소의 반응을 카탈라아제 저해제의 존재하에 실시하는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    검체와, 스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 산화형 보조효소, 콜린 탈수소 효소, 및 환원형 보조효소 산화 효소의 반응을 카탈라아제의 존재하에 실시하고, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 산화형 보조효소, 콜린 탈수소 효소, 및 환원형 보조효소 산화 효소의 반응을 카탈라아제 저해제의 존재하에 실시하는 방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    카탈라아제 저해제가 아지화물인 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    과산화수소의 소거를 퍼옥시다아제, 및 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방의 존재하에 실시하고, 과산화수소의 측정을 퍼옥시다아제, 및 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 존재하에 실시하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    과산화수소의 측정을 퍼옥시다아제, 및 류코형 색원체의 존재하에 실시하는 방법.
  8. 제 5 항에 있어서,
    과산화수소의 측정을 퍼옥시다아제, 및 류코형 색원체의 존재하에 실시하는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces sp. 유래의 포스포리파아제 D 인 방법.
  10. 제 5 항에 있어서,
    스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces sp. 유래의 포스포리파아제 D 인 방법.
  11. 제 6 항에 있어서,
    스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces sp. 유래의 포스포리파아제 D 인 방법.
  12. 제 7 항에 있어서,
    스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces sp. 유래의 포스포리파아제 D 인 방법.
  13. 제 8 항에 있어서,
    스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces sp. 유래의 포스포리파아제 D 인 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 방법.
  15. 제 5 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 방법.
  16. 제 6 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 방법.
  17. 제 7 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 방법.
  18. 제 8 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 방법.
  19. 제 9 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 방법.
  20. 제 10 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 방법.
  21. 제 11 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 방법.
  22. 제 12 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 방법.
  23. 제 13 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 방법.
  24. 스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 산화 효소, 및 카탈라아제를 함유하는 제 1 시약과, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 카탈라아제 저해제를 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 스핑고미엘린 측정용 키트.
  25. 스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 산화 효소, 퍼옥시다아제, 및 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방을 함유하는 제 1 시약과, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 산화 커플링 발색형 색원체의 다른 일방을 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 스핑고미엘린 측정용 키트.
  26. 스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 탈수소 효소, 산화형 보조효소, 환원형 보조효소 산화 효소, 및 카탈라아제를 함유하는 제 1 시약과, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 카탈라아제 저해제를 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 스핑고미엘린 측정용 키트.
  27. 스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 리소포스포리파아제 혹은 모노글리세로리파아제, 콜린 탈수소 효소, 산화형 보조효소, 환원형 보조효소 산화 효소, 퍼옥시다아제, 및 1 쌍의 산화 커플링 발색형 색원체의 일방을 함유하는 제 1 시약과, 글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D, 및 산화 커플링 발색형 색원체의 다른 일방을 함유하는 제 2 시약을 함유하는 것을 특징으로 하는 검체 중의 스핑고미엘린 측정용 키트.
  28. 제 24 항 또는 제 26 항에 있어서,
    카탈라아제 저해제가 아지화물인 키트.
  29. 제 24 항 또는 제 26 항에 있어서,
    퍼옥시다아제와 류코형 색원체가 각각 제 1 시약 및 제 2 시약의 각각의 시약에 함유되는 키트.
  30. 제 28 항에 있어서,
    퍼옥시다아제와 류코형 색원체가 각각 제 1 시약 및 제 2 시약의 각각의 시약에 함유되는 키트.
  31. 제 24 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces sp. 유래의 포스포리파아제 D 인 키트.
  32. 제 28 항에 있어서,
    스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces sp. 유래의 포스포리파아제 D 인 키트.
  33. 제 29 항에 있어서,
    스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces sp. 유래의 포스포리파아제 D 인 키트.
  34. 제 30 항에 있어서,
    스핑고미엘린 및 리소포스파티딜콜린과는 반응하지 않고, 포스파티딜콜린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces sp. 유래의 포스포리파아제 D 인 키트.
  35. 제 24 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 키트.
  36. 제 28 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 키트.
  37. 제 29 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 키트.
  38. 제 30 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 키트.
  39. 제 31 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 키트.
  40. 제 32 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 키트.
  41. 제 33 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 키트.
  42. 제 34 항에 있어서,
    글리세롤-3-포스포릴콜린 및 유리 지방산과는 반응하지 않고, 스핑고미엘린과는 반응하는 포스포리파아제 D 가 Streptomyces chromofuscus 유래의 포스포리파아제 D 인 키트.
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