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KR101946180B1 - 비-복제 형질도입 입자 및 형질도입 입자-기반 리포터 시스템 - Google Patents

비-복제 형질도입 입자 및 형질도입 입자-기반 리포터 시스템 Download PDF

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KR101946180B1
KR101946180B1 KR1020177008083A KR20177008083A KR101946180B1 KR 101946180 B1 KR101946180 B1 KR 101946180B1 KR 1020177008083 A KR1020177008083 A KR 1020177008083A KR 20177008083 A KR20177008083 A KR 20177008083A KR 101946180 B1 KR101946180 B1 KR 101946180B1
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KR
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reporter
nucleic acid
sequence
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KR1020177008083A
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KR20170046731A (ko
Inventor
디에고 아리엘 레이
마크 레푸스
샤오원 리우
Original Assignee
지니위브 바이오사이언시스, 인코포레이티드
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Filing date
Publication date
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Abstract

리포터 분자로서 사용되기 위한 비-복제 형질도입 입자에 리포터 핵산 분자를 패키징하기 위한 방법 및 시스템이 제공된다. 비-복제 형질도입 입자는, 바이러스로부터 구축될 수 있고, 바이러스 형질도입 및 복제 시스템을 이용한다. 리포터 핵산 분자는 리포터 유전자, 예컨대 리포터 분자 또는 선택성 마커를, 표적 유전자 또는 세포를 검출하기 위해 포함한다. 리포터 분자로서 비-복제 형질도입 입자를 이용하는 세포 및 표적 핵산 분자의 검출을 위한 방법 및 시스템이 제공된다.

Description

비-복제 형질도입 입자 및 형질도입 입자-기반 리포터 시스템 {NON-REPLICATIVE TRANSDUCTION PARTICLES AND TRANSDUCTION PARTICLE-BASED REPORTER SYSTEMS}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2014 년 8 월 25 일에 제출된 미국 가출원 제 62/041,539 호 및 2015 년 8 월 7 일에 제출된 미국 가출원 제 62/202,653 호의 이익을 주장하며, 이들의 개시 사항은 본원에서 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 그 전체가 참조로 본원에 포함되고 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 포함한다. 2015 년 8 월 24 일에 제작된 상기 ASCII 사본은 29681PCT_CRF_SequenceListing.txt 로 명명되고, 크기는 37,642 바이트이다.
기술 분야
본 발명은 세포에서의 표적 유전자의 검출을 위해 세포에의 비-복제 (non-replicative) 형질도입 리포터 분자의 패키징 및 전달을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
형질도입 입자는 비-바이러스 핵산을 세포에 전달할 수 있는 바이러스를 말한다. 바이러스-기반 리포터 시스템은 세포의 존재를 검출하는데 사용되며, 세포로부터 리포터 분자의 발현을 허용하는 바이러스의 용원기에 의존한다. 이들 바이러스-기반 리포터 시스템은 리포터 분자를 발현하고 표적 세포가 검출 가능한 신호를 방출하도록 하는 복제-컴페턴트 (competent) 형질도입 입자를 사용한다.
그러나, 바이러스-기반 리포터 분석에 있어서, 바이러스의 용균 주기 (lytic circle) 가 악영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 (Carriere, C. et al., Conditionally replicating luciferase reporter phages: Improved sensitivity for rapid detection and assessment of drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology, 1997. 35(12): p. 3232-3239). Carriere et al. 은 30℃ 에서 억제되지만 37℃ 에서 활성인 용균 주기를 가지는 엠. 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis) /바실루스 칼메트-구에린 (bacillus Calmette-Guerin; BCG) 루시퍼라아제 리포터 파지를 개발했다. 이 시스템을 사용하여 Carriere et al. 은 용균 주기가 억제된 리포터 파지를 사용한 BCG의 검출을 증명했다.
그러나, 박테리오파지-기반 리포터 분석에서 박테리오파지의 복제 기능을 제거하지 않고 억제한 것과 관련되는 몇 가지 단점이 있다. 먼저, 박테리오파지의 복제 기능을 제어하는 경우 분석 조건에 제한이 생긴다. 예를 들어, Carriere et al. 에 의해 사용된 리포터 파지 phAE40 의 용균 주기는 이 파지가 30℃의 비-허용 온도에서 세포를 감염시키는데 사용되었을 때 억제되었다. 이 온도 요건은 표적 박테리아의 최적 온도가 37℃ 였다는 점에서 리포터 분석에 제한적 조건이 되었다. 이들 제한적 조건은 최적 분석 성능을 저해한다.
더욱이, 바이러스의 복제 기능은 제어하기 어렵다. 바이러스의 복제는 리포터 시스템으로서 형질도입 입자의 사용 동안 억제되어야 한다. 예를 들어, Carriere et al. 에 의해서 보고된 리포터 파지 phAE40 의 세포용해 활성은 감소되었지만 제거되지는 않았으며, 그 결과 분석에서의 루시퍼라아제 신호가 약해졌다. Carriere et al. 은 무손상 파지-발현 유전자 및 분석의 온도 제한과 같은 리포터 신호를 최종적으로 약화시킨 원인을 강조했고, 이들은 모두 파지 리포터의 용균 주기가 제거되지 않았다는 사실로부터 기인한다.
파지의 자연적 용원 주기 (lysogenic cycle) 에 의존하는 리포터 분석은 세포용해 활성을 산발적으로 나타낼 것으로 예상될 수 있다. 게다가, 파지의 용원 주기에 의존하는 분석은 유사한 파지로 이미 용원화된 표적 세포와 침입한 바이러스 핵산을 표적화하는 자연 발생 숙주 제한 시스템으로부터 중복감염 면역을 나타내는 경향이 있을 수 있고, 이것이 리포터 파지의 숙주 범위를 제한한다.
다른 예에서, 형질도입 입자 제조 시스템은 외인성 핵산 분자를 패키징하도록 설계되지만, 형질도입 입자는 주로 외래 핵산 분자와 자생 (native) 자손 바이러스 핵산 분자의 조합을 함유한다. 자생 바이러스는 분석 성능을 저해하는 세포용해 활성을 나타낼 수 있으며, 바이러스의 세포용해 활성이 제거되어야 형질도입 입자가 정제된다. 그러나, 이러한 정제는 일반적으로 불가능하다. Scholl et al.에 의해 발명의 명칭 "Reporter Plasmid Packaging System for Detection of Bacteria" 으로 개시된 U.S. 2009/0155768 A 는 이러한 형질도입 입자 시스템의 개발을 보고했다. 이 시스템의 생성물은 리포터 형질도입 입자와 자생 박테리오파지의 조합이다 (참고자료의 도 8). 상기 저자들은 형질도입 입자와 자생 박테리오파지가 초원심 분리에 의해서 분리될 수 있다고 했지만, 이 분리는 형질도입 입자와 자생 바이러스가 초원심 분리에 의한 분리를 허용하는 상이한 밀도를 나타내는 시스템에서만 가능하다. 이러한 속성은 참고자료에서 개시된 박테리오파지 T7-기반 패키징 시스템에 의해서 제시되어 있지만, 이것은 다른 바이러스 시스템에도 일반적으로 적용될 수 있는 속성이 아니다. 바이러스 패키징 기구는 흔히 초원심 분리에 의해 분리될 수 없는 구별 불가능한 밀도를 나타내는 자생 바이러스와 형질도입 입자를 야기하는 헤드풀 패키징을 나타낸다. 또한, 바이러스 패키징 시스템은 구별 불가능한 밀도를 가진 자생 바이러스와 형질도입 입자를 야기하는 적절한 바이러스 구조 조립을 위한 요건으로서 패키징의 최소량에 의존한다.
따라서, 검출 한계를 증가시키고 거짓 음성 결과를 가져옴으로써 리포터 분석의 성능을 제한할 수 있는, 바이러스의 세포용해 기능으로부터의 악영향과 중복감염 면역 및 바이러스 핵산 분자와 바이러스 기능을 표적화하는 숙주 제한 기전에 의해서 제한될 가능성에 의해서 영향을 받지 않는 비-복제 형질도입 입자가 요구된다.
형질도입 입자를 조작하는 경우에도, 세포에서 표적 핵산 분자의 존재를 검출하고 보고하기 위해 형질도입 입자를 사용하는 방법에는 몇 가지 제한이 있다. 일부 방법은 세포의 파괴와 세포 용해물 (lysate) 에서 전사체를 분리하고 검출하기 위한 복잡한 기술을 필요로 한다. 검출 방법은 항체, 앱타머 (aptamer), 또는 핵산 프로브와 같은 표지된 프로브를 사용하는 것을 포함한다. 표적 유전자에 지정된 표지 프로브는 의도치 않은 표적과의 비-특이적 결합을 가져오거나, 또는 높은 신호-대-노이즈 비율을 가진 신호를 생성할 수 있다. 따라서, 세포에서의 내인성 핵산 분자의 검출 및 보고를 위한 특이적이며 효과적이고 정확한 방법이 요구된다.
따라서, 복제-컴페턴트 자손 바이러스를 제거하면서 세포에서의 리포터 분자의 패키징 및 발현을 허용하는 비-복제 형질도입 입자를 생성하기 위한 방법 및 시스템이 요구된다. 또한, 발현된 리포터 분자를 사용하여 세포에서 분자를 검출하기 위한 효과적이며 정확한 방법도 요구된다.
하기를 포함하는, 박테리아 세포로의 도입을 위한 비-복제 형질도입 입자 (non-replicative transduction particle; NRTP) 에 리포터 핵산 분자를 패키징하기 위한 박테리아 세포 패키징 시스템이 본원에 개시되며, 상기 패키징 시스템은 숙주 세포를 포함한다: (1) 파괴를 포함하는 제 1 유전자를 포함하는 박테리오파지 게놈 (이때, 파괴 부재시에는, 상기 제 1 유전자는 패키징-관련 효소 활성의 제 1 필수 성분을 인코딩 (encode) 하며 제 1 패키징 개시 부위 서열을 포함하고, 상기 패키징 관련-효소 활성은 제 1 패키징 개시 부위를 인지하고, 상기 파괴는 필수 패키징-관련 효소 활성에 의한 제 1 패키징 개시 부위 서열의 인지를 방해하고, 상기 파괴는 패키징-관련 효소 활성의 수준을 감소시킴), 및 (2) 리포터 유전자, 필수 패키징-관련 효소 활성의 제 1 성분을 인코딩하는 제 2 유전자, 및 필수-패키징 관련 효소 활성의 제 2 성분을 인코딩하는 제 3 유전자를 포함하는 리포터 핵산 분자 (이때, 상기 제 2 유전자는 비-파괴된 제 1 패키징 개시 부위 서열을 포함하고, 상기 제 1 패키징 개시 부위 서열은 NRTP 로 리포터 핵산 분자의 레플리콘의 패키징을 촉진시키도록 배치됨).
하나의 구현예에서, 박테리오파지는 복수의 파괴된 유전자를 포함하고, 이때 파괴 부재시, 각각은 패키징-관련 효소 활성의 필수 성분을 인코딩한다. 하나의 구현예에서, 박테리오파지 상 복수의 파괴된 유전자 각각은 리포터 핵산 분자에 의해 인코딩된 작용성, 비-파괴된 유전자에 의해 보상된다 (complement). 또 다른 구현예에서, 파괴는 결실, 삽입, 돌연변이, 또는 대체를 통하는 것이다.
또 다른 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 작은 터미나아제 (terminase) 유전자 및 큰 터미나아제 유전자를 포함한다. 추가 구현예에서, 터미나아제 유전자는 엔테로박테리아세아에 (Enterobacteriaceae) 박테리오파지 P1 의 pacA 유전자 및 pacB 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 박테리오파지 유전자의 상기 제 2 세트 중 적어도 하나는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID N0:4, 또는 SEQ ID N0:6 의 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 터미나아제 유전자는 에스. 아우레우스 (S.aureus) 박테리오파지 φ11 또는 φ80α 로부터의 terS 유전자 및 terL 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 터미나아제 유전자는 이. 파에칼리스 (E. faecalis) 박테리오파지 φEf11 로부터의 terA 유전자 및 terB 유전자를 포함한다.
일부 구현예에서, 패키징-관련 효소 활성은 터미나아제 활성이다. 하나의 구현예에서, 제 2 유전자 및 제 3 유전자는 각각 터미나아제 유전자이다. 하나의 구현예에서, 제 2 유전자는 pacA 유전자이고, 제 3 유전자는 pacB 유전자이다. 하나의 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 SEQ ID NO:1 의 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 제 2 유전자는 terA 유전자이고, 제 3 유전자는 terB 유전자이다. 하나의 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 SEQ ID N0:6 의 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 제 2 유전자는 terS 유전자이고, 제 3 유전자는 terL 유전자이다. 하나의 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 SEQ IDN0:4 의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제 2 유전자 및 제 3 유전자는 조건부 프로모터 (conditional promoter) 에 작동적으로 연결된다. 하나의 구현예에서, 조건부 프로모터는 SEQ ID NO: 9 의 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 조건부 프로모터는 박테리오파지 게놈의 터미나아제 유전자의 자생 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제 2 유전자 또는 제 3 유전자의 발현은 박테리오파지의 용균 주기의 활성화의 부재 때 억제되고, 제 2 유전자 또는 제 3 유전자의 발현은 박테리오파지의 용균 주기의 활성화 때 활성화된다. 특정 구현예에서, 제 2 유전자 및 제 3 유전자는 박테리오파지 게놈에 대해 자생인 터미나아제 유전자이고, 조건부 프로모터는 터미나아제 유전자의 자생 프로모터이다.
일부 구현예에서, 박테리오파지 게놈은 리포터 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 박테리오파지 게놈은 추가로 항생물질 내성 유전자를 포함한다. 하나의 구현예에서, 리포터 유전자는 검출가능한 마커 또는 선택성 마커를 인코딩한다. 하나의 구현예에서, 리포터 유전자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: 발광 반응을 매개하는 효소 (luxA, luxB, luxAB, luc, ruc, nluc), 비색 반응을 매개하는 효소 (lacZ, HRP), 형광 단백질 (GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry, 근적외선 형광 단백질), 친화성 펩티드 (His-tag, 3X-FLAG), 및 선택성 마커 (ampC, tet(M), CAT, erm). 하나의 구현예에서, 리포터 유전자는 터미나아제 유전자를 파괴한다. 특정 구현예에서, 항생물질 내성 유전자는 카나마이신 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 리포터 유전자는 구성성 프로모터 (constitutive promoter) 에 작동적으로 연결된다. 추가 구현예에서, 구성성 프로모터는 Pblast 이다.
하나의 구현예에서, 파괴는 선택성 마커를 인코딩하는 유전자로의 제 1 패키징 개시 부위 서열로의 삽입 또는 그 대체를 포함한다. 특정 구현예에서, 선택성 마커를 인코딩하는 유전자는 구성성 프로모터에 작동적으로 연결된다. 하나의 구현예에서, 파괴는 검출가능한 마커를 인코딩하는 유전자로의 제 1 패키징 개시 부위 서열로의 삽입 또는 대체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 검출가능한 마커를 인코딩하는 유전자는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다: luxA, luxB, 및 luxAB. 일부 구현예에서, 검출가능한 마커를 인코딩하는 유전자는 구성성 프로모터, 예를들어 Pblast 에 작동적으로 연결된다. 특정 구현예에서, 제 1 유전자는 pacA 유전자좌를 포함하고, 이때 파괴는 pacA 유전자좌내 삽입된 kan 유전자 및 luxAB 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 박테리오파지 게놈은 SEQ ID NO: 12 을 포함한다.
일부 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 복제 기점을 포함한다. 하나의 구현예에서, 리포터 핵산 분자의 레플리콘은 비-복제 형질도입 입자 내로 패키징할 수 있는 콘카타 (concatamer) 머를 포함한다. 특정 구현예에서, 비-파괴된 제 1 패키징 개시 부위 서열은 콘카타머 접합부 (junction) 를 포함한다. 일부 구현예에서, 레플리콘은 엔테로박테리아세아에 박테리오파지 P1 세포용해 레플리콘이다.
하나의 구현예에서, 레플리콘은 C1 억제자-제어된 P53 프로모터, 프로모터 P53 안티센스, repL 유전자, 및 kilA 유전자의 프레임-내 (in-frame) 결실을 포함한다. 하나의 구현예에서, 레플리콘은 SEQ ID N0:2 의 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 레플리콘은 pBHR1 레플리콘 또는 pBHR1 레플리콘의 유도체이다. 하나의 구현예에서, 레플리콘은 SEQ ID N0:3 의 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 SEQ ID N0:4 의 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 리포터 핵산 분자의 레플리콘은 에스. 아우레우스 pT181 플라스미드 복제 기점으로부터 유래된다. 하나의 구현예에서, 리포터 핵산 분자의 레플리콘은 SEQ ID N0:5 의 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 SEQ ID N0:6 의 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 리포터 핵산 분자의 레플리콘은 엔테로코쿠스 (Enterococcus) repB 플라스미드 복제 기점으로부터 유래된다. 하나의 구현예에서, 리포터 핵산 분자의 레플리콘은 SEQ ID N0:7 의 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 리포터 핵산 분자의 레플리콘은 엔테로코쿠스 pDL278 플라스미드 복제 기점으로부터 유래된다. 하나의 구현예에서, 핵산 분자의 레플리콘은 SEQ ID N0:8 의 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 비-파괴된 제 1 패키징 개시 부위 서열은 pac-부위를 포함한다. 하나의 구현예에서, 비-파괴된 제 1 패키징 개시 부위 서열은 cos-부위를 포함한다.
하나의 구현예에서, 박테리오파지 게놈은 엔테로박테리아세아에 박테리오파지 P1 을 포함한다. 하나의 구현예에서, 박테리오파지 게놈은 에스. 아우레우스 박테리오파지 φ80α 또는 박테리오파지 φ11 을 포함한다. 하나의 구현예에서, 박테리오파지 게놈은 이. 파에칼리스 박테리오파지 φEF11 을 포함한다.
하나의 구현예에서, 박테리아 세포는 이. 콜라이 (E. coli) 세포를 포함한다. 하나의 구현예에서, 박테리아 세포는 에스. 아우레우스 세포를 포함한다. 하나의 구현예에서, 박테리아 세포는 이. 파에칼리스 세포를 포함한다. 하나의 구현예에서, 박테리아 세포는 그람(Gram)-음성 세포를 포함한다. 하나의 구현예에서, 박테리아 세포는 그람-양성 세포를 포함한다.
하나의 구현예에서, 리포터 유전자는 검출가능한 마커 또는 선택성 마커를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 리포터 유전자는 발광 반응을 매개하는 효소 (luxA, luxB, luxAB, luc, ruc, nluc), 비색 반응을 매개하는 효소 (lacZ, HRP), 형광 단백질 (GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry, 근적외선 형광 단백질), 친화성 펩티드 (His-tag, 3X-FLAG), 및 선택성 마커 (ampC, tet(M), CAT, erm) 로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 앱타머를 포함한다. 하나의 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 리포터 핵산 분자 내 제 2 서열과 상보성인 핵산 전사체 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 핵산 전사체 서열은 세포 전사체와 상보성이다. 추가 구현예에서, 핵산 전사체 서열은 cis-억제 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 프로모터에 작동적으로 연결된다. 추가 구현예에서, 프로모터는 박테리아 세포 내 리포터 핵산 분자로부터 발현된 리포터 분자의 반응성에 기여하도록 선택된다. 일부 구현예에서, 리포터 핵산 분자의 레플리콘은 리포터 핵산 분자의 레플리카 (replica) 에서 제 2 서열과 상보성인 핵산 전사체 서열을 포함한다.
또한 본원에서는 비-복제 형질도입 입자 내로 리포터 핵산 분자를 패키징하는 방법으로서, (1) 상기 리포터 핵산 분자와 패키징된 비-복제 형질도입 입자를 생성하기 위해 박테리오파지의 용균 기 (lytic phase) 를 유도하는 조건을 본원에 개시된 바와 같은 박테리아 세포 패키징 시스템에 제공하고; 및 (2) 리포터 핵산 분자를 포함하는 비-복제 형질도입 입자를 수집하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 비-복제 형질도입 입자는 복제된 박테리오파지 게놈을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 비-복제 형질도입 입자는 리포터 핵산 분자와의 재조합으로 인해 박테리오파지 게놈의 일부분 (portion) 을 포함하고, 이때 박테리오파지 게놈의 일부분은 리포터 유전자를 포함한다.
또한, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 리포터 핵산 분자의 레플리콘을 포함하는 비-복제 형질도입 입자를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
또한, 비-복제 형질도입 입자에 핵산 분자를 패키징하기 위한 박테리아 세포 패키징 시스템으로서, 상기 박테리아 세포는 (1) 제 1 패키징 개시 부위 서열을 포함하는 박테리오파지 게놈으로서, 상기 제 1 패키징 개시 부위 서열은 리포터를 인코딩하는 유전자에 의해 파괴된, 박테리오파지 게놈; 및 (2) 비-복제 형질도입 입자에 리포터 핵산 분자의 레플리콘의 패키징을 촉진하는 제 2 패키징 개시 부위 서열을 포함하는 리포터 핵산 분자로서, 상기 리포터 핵산 분자는 비-복제 형질도입 입자에 패키징되도록 배치된 레플리콘을 형성하는, 리포터 핵산 분자를 포함하는 박테리아 세포 패키징 시스템이 제공된다.
또한, (1) 제 1 터미나아제 유전자 쌍을 포함하는 박테리오파지 게놈 (이때, 상기 제 1 터미나아제 유전자 쌍 중 적어도 한쪽은 파괴되어, 그 파괴된 터미나아제 유전자는 비작용성이 되게 함); 및 (2) 리포터 유전자, 및 제 1 터미나아제 유전자 쌍을 보완하는 제 2 터미나아제 유전자 쌍을 포함하는 리포터 핵산 분자 (이때, 제 2 터미나아제 유전자 쌍의 각각은 작용성이고, 제 2 터미나아제 유전자 쌍은 리포터 핵산 분자의 레플리콘의 NRTP 로의 패키징을 촉진시킴) 을 포함하는, 세포 내 도입을 위한 비-복제 형질도입 입자 (NRTP) 에 리포터 핵산 분자를 패키징하기 위한 박테리아 세포 패키징 시스템으로서, 상기 패키징 시스템은 숙주 세포를 포함하는 박테리아 세포 패키징 시스템이 본원에서 제공된다.
또한, (1) 제 1 터미나아제 유전자 쌍을 포함하는 박테리오파지 게놈 (이때, 상기 제 1 터미나아제 유전자 쌍 중 오직 하나만이 파괴되어, 파괴된 터미나아제 유전자를 비작용성으로 만듦) ; 및 (2) 리포터 유전자, 및 제 1 터미나아제 유전자를 보완하는 제 2 터미나아제 유전자를 포함하는 리포터 핵산 분자 (이때, 제 2 터미나아제 유전자는 작용성이고, 제 2 터미나아제 유전자는 리포터 핵산 분자의 레플리콘의 NRTP 로의 패키징을 촉진시킴) 를 포함하는, 세포 내 도입을 위한 비-복제 형질도입 입자 (NRTP) 에 리포터 핵산 분자를 패키징하기 위한 박테리아 세포 패키징 시스템으로서, 상기 패키징 시스템은 숙주 세포를 포함하는, 박테리아 세포 패키징 시스템이 본원에 제공된다.
일부 비-복제 형질도입 입자 패키징 시스템에서, 플라스미드 DNA 와 재조합된 바이러스 DNA 가 패키징될 수 있다. 이러한 시스템에서, 패키징 시스템에 의해 생성된 세포 용해물은 2 종의 형질도입 입자를 함유할 수 있다: (1) 플라스미드 DNA 를 보유하는 형질도입 입자, 및 (2) 바이러스 DNA 를 보유하는 형질도입 입자. 이러한 시스템에서, 후자의 형질도입 입자 종은, 표적 세포의 검출을 위한 리포터 시스템으로서 세포 용해물을 이용할 때 신호 발생에 기여하지 않는다. 이로써, 리포터 유전자가 두 종의 형질도입 입자가 신호를 발생시킬 수 있도록 바이러스 게놈에 혼입되어 있는 개선된 비-복제 형질도입 입자-기반 리포터 시스템이 본원에서 개시된다.
본 발명의 이들 및 다른 특징들, 양태들 및 이점들은 이후의 설명 및 첨부한 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1 은 구현예에 따른, 대립유전자 교환을 통한 pacA 유전자 내 카나마이신 내성 유전자의 삽입에 의한 박테리오파지 P1 에서 pacA 유전자 파괴의 일례를 도시한다.
도 2 는 구현예에 따른, 자생 pacA 유전자 프로모터의 제어 하 pacA 및 pacB 유전자를 보유하는 보상성 리포터 플라스미드의 도해를 도시한다.
도 3 은 구현예에 따른, 파괴된 pacA 를 갖는 박테리오파지 P1 으로 용원화된 이. 콜라이 세포 (이 세포는 pacA 및 pacB 를 함유하는 플라스미드도 또한 보유함) 를 포함하는 패키징 시스템의 설계 및 기능의 일례를 도시한다.
도 4 는 구현예에 따른, 파괴된 pacA 를 갖는 박테리오파지 P1 으로 용원화된 이.콜라이 세포 (이때, 파괴는 카나마이신 내성 유전자 및 박테리아 루시퍼라아제 luxAB 유전자의 삽입을 통해 달성되고, 이 세포는 또한 pacA 및 pacB 를 함유하는 플라스미드를 보유함) 를 포함하는 패키징 시스템의 설계 및 기능의 일례를 도시한다.
도 5 는 본 발명의 구현예에 따른, 생육성 세포 내 표적 유전자 프로모터에 대한 유도인자 (inducer) 의 검출을 위한 NRTP 의 사용을 위한 시스템을 도시한다.
도 6 은 본 발명의 구현예에 따른, 엔테로코쿠스 파에시움 (Enterococcus faecium; 또는 이. 파아칼리스) 에서 반코마이신 내성 (vanA) 유전자의 프로모터의 유도인자인 VanR 을 검출하기 위해 구축된 리포터 핵산 분자 (예, 플라스미드) 를 포함한다. 이 리포터 플라스미드는 vanA 유전자 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 보유한다.
도 7 은 본 발명의 구현예에 따른, 씨. 디피실 (C. difficile) 의 독소 A 및 B 유전자 (tcdA 및 tcdB, 각각) 의 프로모터의 유도인자인 TcdD 를 검출하기 위해 구축된 리포터 핵산 분자를 포함하는 리포터 시스템을 도시한다. 이 리포터 핵산 분자는 tcdA 유전자 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 포함한다.
도 8 은 본 발명의 구현예에 따른, 에스. 아우레우스에서 단백질 A 유전자 (spa) 의 프로모터의 유도인자인 SarS 를 검출하기 위해 구축된 리포터 핵산 분자를 포함하는 리포터 시스템을 도시한다. 이 리포터 핵산 분자는 spa 유전자 프로모터 (Pspa) 에 작동적으로 연결된 박테리아 루시퍼라아제 유전자 luxA 및 luxB 를 포함한다.
도 9 는 리포터 전사체의 cis-억제 서열과 표적 전사체 사이의 염기쌍의 도해를 나타낸다.
도 10 은 형질도입된 세포의 콜로니로부터 빛 생성 (RLU) 를 측정하여 수득된 데이타 표를 나타낸다. 스펙티노마이신에 내성인 세포 (SpecR) 는 플라스미드 DNA 로 형질도입되어 있는 반면에, 카나마이신에 내성인 세포 (KanR) 는 P1 DNA 로 형질도입되었다. 그 게놈 내에 luxAB 이 혼입되어 있지 않고 P1 을 함유하는 세포로부터 생성된 세포 용해물 (1505) 을 이용하여 수득된 데이타는 일반적으로 빛을 생성하지 않는 KanR 형질도입체를 야기하는 반면에, 그 게놈 내 luxAB 가 혼입되어 있는 P1 을 함유하는 세포로부터 생성된 세포 용해물 (1525) 을 이용하여 수득된 데이타는 빛을 생성하는 KanR 형질도입체를 도모하였다.
I. 정의
청구항과 명세서에서 사용된 용어들은 달리 명시되지 않는다면 아래 제시된 것과 같이 정의된다.
본원에서 사용된 "리포터 핵산 분자"는 DNA 또는 RNA 분자를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 리포터 핵산 분자는 자연 발생할 수 있거나, 또는 인공 또는 합성 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 숙주 세포에 외인성이고, 플라스미드 또는 벡터와 같은 외인성 핵산 분자의 일부로서 숙주 세포에 도입될 수 있다. 특정 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 세포에서 표적 유전자에 상보성일 수 있다. 다른 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 리포터 분자 (예를 들어, 리포터 효소, 단백질) 를 인코딩하는 리포터 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 "리포터 구축물" 또는 "핵산 리포터 구축물"로서 언급된다.
"리포터 분자" 또는 "리포터"는 검출 가능한 또는 선택성 표현형을 유기체에 부여하는 분자 (예를 들어, 핵산 또는 단백질) 를 말한다. 검출 가능한 표현형은, 예를 들어 비색, 형광 또는 발광일 수 있다. 리포터 분자는 발광 반응을 매개하는 효소를 인코딩하는 리포터 유전자 (luxA, luxB, luxAB, luc, ruc, nluc), 비색 반응을 매개하는 효소를 인코딩하는 유전자 (lacZ, HRP), 형광 단백질을 인코딩하는 유전자 (GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry, 근적외선 형광 단백질), 친화성 펩티드를 인코딩하는 핵산 분자 (His-tag, 3X-FLAG) 및 선택성 마커를 인코딩하는 유전자 (ampC, tet(M), CAT, erm) 로부터 발현될 수 있다. 리포터 분자는 세포로의 핵산 분자 또는 외인성 서열 (플라스미드) 의 성공적인 흡수를 위한 마커로서 사용될 수 있다. 또한, 리포터 분자는 본원에 개시된 대로 표적 유전자, 표적 핵산 분자, 표적 세포내 분자, 또는 세포의 존재를 나타내는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 리포터 분자는 앱타머 또는 리보자임과 같은 핵산일 수 있다.
본 발명의 일부 양태에서, 리포터 핵산 분자는 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 발명의 다른 양태에서, 프로모터는 특정 세포 (예를 들어, 특정 종)에서만 프로모터의 활성에 기초하여 리포터 시스템의 반응성 및 교차-반응성에 기여하도록 선택되거나 설계될 수 있다. 특정 양태에서, 리포터 핵산 분자는 복제 기점을 포함한다. 다른 양태에서, 표적 세포 내에서의 리포터 핵산 분자의 복제가 특정 세포 (예를 들어, 특정 종) 에서의 복제 기점의 활성에 기초하여 리포터 신호 생성에 기여하는 경우, 복제 기점의 선택이 리포터 시스템의 반응성 및 교차-반응성에 유사하게 기여할 수 있다. 일부 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 바이러스 복제 동안에 자손 바이러스에 콘카타머 DNA로서 패키징될 수 있는 레플리콘을 형성한다.
본원에서 사용된 "표적 전사체"는 표적 유전자의 전사 동안에 형성된 것과 1차 전사 생성물의 RNA 프로세싱 생성물인 mRNA 를 포함하는 표적 세포에 의해 자연적으로 형성된 DNA 서열 또는 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 일부를 말한다. 또한, 표적 전사체는 세포 전사체 또는 자연 발생 전사체로서 언급될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "전사체"는 DNA 또는 RNA 주형 서열 또는 유전자로부터 전사된 뉴클레오티드 서열 (DNA 또는 RNA) 가닥을 말한다. 전사체는 RNA 주형으로부터 전사된 cDNA 서열 또는 DNA 주형으로부터 전사된 mRNA 서열일 수 있다. 전사체는 단백질 코딩 또는 비-코딩일 수 있다. 또한, 전사체는 조작된 핵산 구축물로부터 전사될 수 있다.
리포터 핵산 분자로부터 유래된 전사체는 "리포터 전사체"로서 언급될 수 있다. 리포터 전사체는 리포터 서열 및 cis-억제 서열을 포함할 수 있다. 리포터 전사체는 상보성 영역을 형성하는 서열을 가질 수 있으며, 이로써 전사체는 듀플렉스 (예를 들어, 분자간 듀플렉스 영역) 를 형성하는 두 영역을 포함한다. 하나의 영역은 "cis-억제 서열" 로서 언급될 수 있으며, 표적 전사체 및/또는 리포터 서열의 일부 또는 전부에 상보성을 가진다. 전사체의 제 2 영역은 "리포터 서열"로 칭해지며, cis-억제 서열에 상보성을 가질 수 있다. 상보성은 완전한 상보성 또는 실질적인 상보성일 수 있다. cis-억제 서열과 리포터 서열의 존재 및/또는 결합은 리포터 전사체에서 어떤 입체구조를 형성할 수 있으며, 이것은 리포터 분자의 추가적인 발현을 차단할 수 있다. 리포터 전사체는 2 차 구조, 예컨대 헤어핀 구조를 형성할 수 있으며, 이로써 서로 상보성인 리포터 전사체 내의 영역들이 서로 혼성화할 수 있다.
핵산 분자 또는 외래 서열 (예를 들어, 플라스미드, 벡터, 구축물) 을 언급할 경우, "세포에 도입하는" 은 당업자에게 이해되는 대로 세포로의 흡수를 촉진하는 것을 의미한다. 핵산 구축물 또는 전사체의 흡수는 비-보조 확산 또는 활성 세포 과정을 통해서, 또는 박테리오파지, 바이러스 및 형질도입 입자의 사용을 포함하는 보조제나 장치에 의해서 일어날 수 있다. 이 용어의 의미는 시험관내 세포에만 제한되지 않으며, 세포가 살아있는 유기체의 일부인 경우에도 핵산 분자는 "세포에 도입"될 수 있다. 이러한 예에서, 세포로의 도입은 유기체로의 전달을 포함할 것이다. 예를 들어, 생체내 전달을 위해, 본 발명의 핵산 분자, 구축물 또는 벡터는 조직 부위에 주사되거나 전신 투여될 수 있다. 세포로의 시험관내 도입은 전기천공 및 리포펙션과 같은 본 분야에 알려진 방법을 포함한다. 추가적인 접근법도 본원에 개시되거나 본 분야에 알려져 있다.
"형질도입 입자"는 세포에 비-바이러스 핵산 분자를 전달할 수 있는 바이러스를 말한다. 이 바이러스는 박테리오파지, 아데노바이러스 등일 수 있다.
"비-복제 형질도입 입자"는 세포에 비-바이러스 핵산 분자를 전달할 수 있지만 자신의 복제된 바이러스 게놈을 형질도입 입자에 패키징할 수 없는 바이러스를 말한다. 이 바이러스는 박테리오파지, 아데노바이러스 등일 수 있다.
"플라스미드"는 물리적으로 분리된 형태인 작은 DNA 분자이며, 세포 내에서 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있다. 박테리아에서 작은 원형 이중가닥 DNA 분자가 가장 흔하게 발견되며, 플라스미드는 때로는 고세균 및 진핵 유기체에 존재한다. 플라스미드는 적합한 숙주 내에서 자체적으로 복제할 수 있는 레플리콘으로 간주된다.
"벡터"는 다른 세포로 외래 유전자 물질을 인공적으로 운반할 수 있는 비히클로서 사용되는 핵산 분자이며, 이것은 복제 및/또는 발현될 수 있다.
"바이러스"는 다른 유기체의 살아있는 세포 내에서만 복제하는 작은 감염성 물질이다. 바이러스 입자 (비리온으로 알려져 있다) 는 두 부분 또는 세 부분을 포함한다: i) 유전 정보를 가진 DNA 또는 RNA 분자로부터 제조된 유전자 물질; ii) 이들 유전자를 보호하는 단백질 코팅; 및 일부 경우 단백질 코팅을 둘러싼 지질 외피.
본원에서 사용된 용어 "보상 (complement)" 이란, 파괴되어진 동일 서열의 존재 하의 비-파괴 서열, 또는 파괴된 서열에 대한 비-파괴된 서열의 관계를 말한다. 한 구현예에서, 보상체는 작용성이고 발현이 가능한 세포 내 폴리뉴클레오티드 상 인코딩된 유전자를 포함하고, 파괴 전 박테리오파지 상 파괴된 유전자와 동일 기능을 갖는 단백질을 발현한다. 일부 구현예에서, 보상체 유전자는 파괴 전 파괴된 박테리오파지 유전자, 즉 자생 박테리오파지 유전자와 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과의 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서, 보상체 유전자는 파괴전 파괴된 박테리오파지 유전자, 즉 자생 박테리오파지 유전자와 동일하다. 일부 구현예에서, 보상체 유전자는 박테리오파지로부터 결실되어 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 보상체 유전자는 플라스미드 상 박테리오파지의 패키징 기구 (machinery) 를 인코딩하는 유전자를 지칭하고, 이때 그 유전자는 박테리오파지에서 파괴되어져 있다. 따라서, 플라스미드는 형질도입 입자 내 폴리뉴클레오티드를 패키징하는데 필수적인 필수 패키징 기구를 제공하도록 돌연변이된 패키징 기구 유전자를 갖는 박테리오파지의 존재 하에 놓이는 것이 요구되어 진다.
본원에서 사용된 용어 "패키징-관련 효소 활성"이란, 형질도입 입자 내로 폴리뉴클레오티드를 패키징하기 위한 패키징 개시 부위 서열과의 상호작용에 있어서 결정적인 하나 이상의 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 터미나아제 유전자 한쌍은 이러한 상호작용에 필수적이고, 이때 각각의 터미나아제가 패키징-관련 효소 활성을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 효소 활성은 에스. 아우레우스 박테리오파지 φ11 또는 φ80α 로부터의 terS 및/또는 terL 유전자, 이. 파에칼리스 박테리오파지 φEf11 로부터의 terA 및 terB 유전자, 또는 엔테로박테리아세아에 박테리오파지 P1 의 pacA 및 pacB 유전자에 의해 인코딩된다. 이들 구현예에서, 터미나아제 유전자 쌍의 각각은 패키징-관련 효소 활성을 발현하고, 양자의 작용성 버젼이 패키징 개시 부위를 갖는 폴리뉴클레오티드의 패키징에 요망된다. 일부 구현예에서, 패키징-관련 효소 활성과 연관된 복수의 유전자들의 유전자 중 하나의 파괴는 패키징-관련 효소 활성을 제거한다. 일부 구현예에서, 터미나아제 유전자 쌍 양자 모두가 박테리오파지 상에서 파괴되어, 박테리오파지 상 패키징-관련 효소 활성 인코딩 유전자의 전체 세트가 파괴된다.
"MRSA" 는 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 를 말한다.
"MSSA" 는 메티실린-감응성 스타필로코쿠스 아우레우스를 말한다.
용어 "완화하는" 은 질환 치료에서 어떤 치료학적으로 유익한 결과, 예를 들어 예방, 중증도 또는 진행의 감소, 개선 또는 치유를 포함하는 질환 상태의 어떤 치료적으로 유익한 결과를 말한다.
용어 "인시튜 (in situ)" 는 살아있는 유기체와 분리되어 성장중인, 예를 들어 조직 배양물에서 성장중인 살아있는 세포에서 일어나는 과정을 말한다.
용어 "생체내 (in vivo)" 는 살아있는 유기체에서 일어나는 과정을 말한다.
본원에서 사용된 용어 "포유동물" 은 사람과 비-인간을 모두 포함하며, 제한은 아니지만 인간, 비-인간 영장류, 개과, 고양이과, 쥣과, 소과, 말과 및 돼지과를 포함한다.
"G", "C", "A" 및 "U" 는 각각 일반적으로 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실을 염기로서 각각 함유하는 뉴클레오티드를 표시한다. "T" 와 "dT" 는 본원에서 상호 교환하여 사용되며, 뉴클레오염기가 티민인 데옥시리보뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시리보티민을 말한다. 그러나, 용어 "리보뉴클레오티드", "뉴클레오티드" 또는 "데옥시리보뉴클레오티드"는 또한 아래 더 상세히 설명된 대로 개질된 뉴클레오티드, 또는 대용 대체 부분을 말할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 당업자는 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실이 이러한 대체 부분을 가진 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기쌍 특성의 실질적인 변경 없이 다른 부분으로 대체될 수 있다는 것을 잘 알고 있다. 예를 들어, 제한은 아니지만, 이노신을 염기로서 포함하는 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신 또는 우라실을 함유하는 뉴클레오티드와 염기쌍을 이룰 수 있다. 따라서, 우라실, 구아닌 또는 아데닌을 함유하는 뉴클레오티드는, 예를 들어 이노신을 함유하는 뉴클레오티드로 본 발명의 뉴클레오티드 서열에서 대체될 수 있다. 이러한 대체 부분을 포함하는 서열도 본 발명의 구현예이다.
본원에서 사용된 용어 "상보성" 은 제 2 뉴클레오티드 서열과 관련하여 제 1 뉴클레오티드 서열을 개시하기 위해 사용될 때 당업자에게 이해되는 대로 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 특정 조건에서 혼성화하여 듀플렉스 구조를 형성할 수 있는 제 1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 능력을 말한다. 상보성 서열들은 또한 서로 결합하는 것으로서 개시되며, 결합 친화성에 의해서 특성화된다.
예를 들어, 제 1 뉴클레오티드 서열은 긴축 혼성화 조건하에 두 서열이 혼성화 (예를 들어, 아닐링) 할 때 제 2 뉴클레오티드 서열과 상보성인 것으로 설명될 수 있다. 혼성화 조건은 온도, 이온 강도, pH, 및 아닐링 및/또는 세척 단계를 위한 유기용매 농도를 포함한다. 용어 긴축 혼성화 조건은 제 1 뉴클레오티드 서열이 그것의 표적 서열, 예를 들어 제 2 뉴클레오티드 서열과 우선적으로 혼성화하고, 다른 서열들과는 더 적은 규모로 혼성화하거나, 또는 전혀 혼성화하지 않는 조건을 말한다. 긴축 혼성화 조건은 서열 의존적이며, 상이한 환경 매개변수에서 상이하다. 일반적으로, 긴축 혼성화 조건은 규정된 이온 강도 및 pH 에서 뉴클레오티드 서열에 대한 열 용융점 (Tm) 보다 약 5℃ 더 낮도록 선택된다. Tm 은 제 1 뉴클레오티드 서열의 50% 가 완전히 매치된 표적 서열과 혼성화하는 온도 (규정된 이온 강도 및 pH 에서) 이다. 핵산의 혼성화에 관한 광범위한 지침은, 예를 들어 [Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I, chap. 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," Elsevier, N.Y.("Tijssen")] 를 참조한다. 유기체 내에서 일어날 수 있는 생리학적으로 관련된 조건과 같은 다른 조건들도 적용될 수 있다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오티드의 최종 용도에 따라서 두 서열의 상보성 시험에 가장 적합한 조건 세트를 결정할 수 있다.
상보성은 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 전체 길이에 걸쳐서 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 제 1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 염기쌍화를 포함한다. 이러한 서열들은 본원에서 서로에 관해서 "완전히 상보성" 인 것으로 언급될 수 있다. 그러나, 본원에서 제 1 서열이 제 2 서열에 관하여 "실질적으로 상보성"인 것으로 언급된 경우, 두 서열은 완전히 상보성일 수 있거나, 또는 혼성화시 최종 용도와 관련된 조건하에서 혼성화하는 능력을 보유하면서 하나 이상의, 일반적으로 4 이하, 3 또는 2 개의 미스매치 염기쌍을 형성할 수 있다. 그러나, 2 개의 올리고뉴클레오티드가 혼성화시 하나 이상의 단일 가닥 오버행을 형성하도록 설계된 경우, 이러한 오버행은 상보성 결정과 관련하여 미스매치로 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 21 개 뉴클레오티드 길이의 하나의 올리고뉴클레오티드와 23 개 뉴클레오티드 길이의 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA 는, 더 긴 올리고뉴클레오티드가 더 짧은 올리고뉴클레오티드와 완전히 상보성인 21 개 뉴클레오티드의 서열을 포함할 때도 본원에 개시된 취지로서 "완전히 상보성" 인 것으로 언급될 수 있다.
또한, 본원에서 사용된 "상보성" 서열은 비-천연 및 개질된 뉴클레오티드로부터 형성된 염기쌍 및/또는 비-왓슨-크릭 염기쌍을 포함하거나, 그로부터 전적으로 형성될 수 있으나, 단 혼성화하는 능력과 관련한 상기 요건들이 충족되어야 한다. 이러한 비-왓슨-크릭 염기쌍은, 제한은 아니지만, G:U Wobble 또는 Hoogstein 염기쌍을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "상보성", "완전히 상보성" 및 "실질적으로 상보성"은 이들의 사용과 관련하여 설명된 대로 dsRNA 의 두 가닥 사이의, 또는 dsRNA 의 안티센스 가닥과 표적 서열 사이의, 또는 단일 가닥 RNA 서열과 단일 가닥 DNA 서열의 상보성 가닥들 사이의 염기 매칭과 관련하여 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "듀플렉스 구조"는 2 개의 역-평행하며 실질적으로 상보성인 핵산 서열을 포함한다. 핵산 구축물에서 두 전사체 사이, 전사체 내의 두 영역 사이, 또는 전사체와 표적 서열 사이의 상보성 서열이 "듀플렉스 구조"를 형성할 수 있다. 일반적으로, 각 가닥의 뉴클레오티드의 대부분은 리보뉴클레오티드이지만, 본원에 상세히 개시된 대로, 각 가닥 또는 양쪽 가닥은 또한 적어도 하나의 비-리보뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시리보뉴클레오티드 및/또는 개질된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 듀플렉스 구조를 형성하는 2 개 가닥은 하나의 큰 RNA 분자의 상이한 부분일 수 있거나, 또는 별개의 RNA 분자일 수 있다. 두 가닥이 하나의 큰 분자의 일부이어서, 한 가닥의 3'-단부와 각각의 나머지 가닥의 5'-단부 사이가 뉴클레오티드의 중단되지 않은 사슬에 의해서 연결되어 듀플렉스 구조를 형성하는 경우, 연결하는 RNA 사슬은 "헤어핀 루프"라고 언급된다. 한 가닥의 3'-단부와 각각의 나머지 가닥의 5'-단부 사이에서의 뉴클레오티드의 중단되지 않은 사슬 이외의 다른 수단에 의해서 두 가닥이 공유 연결되어 듀플렉스 구조를 형성하는 경우, 연결하는 구조는 "링커"라고 언급된다. RNA 가닥은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 염기쌍의 최대 수는 듀플렉스의 최단 가닥의 뉴클레오티드의 수에서 듀플렉스에 존재하는 임의의 오버행을 뺀 것이다. 일반적으로, 듀플렉스 구조는 15 내지 30 또는 25 내지 30, 또는 18 내지 25, 또는 19 내지 24, 또는 19 내지 21, 또는 19, 20 또는 21 개 염기쌍 길이이다. 하나의 구현예에서, 듀플렉스는 19개 염기쌍 길이이다. 다른 구현예에서, 듀플렉스는 21 개 염기쌍 길이이다. 두 상이한 siRNA가 조합하여 사용되었을 때 듀플렉스 길이는 동일할 수 있거나 상이할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "상보성 영역"은 본원에서 정의된 대로 서열, 예를 들어 표적 서열에 실질적으로 상보성인 안티센스 가닥 상의 영역을 말한다. 상보성의 영역이 표적 서열에 완전히 상보성이 아닐 경우, 미스매치는 말단 영역에서 가장 용인되며, 일반적으로 말단 영역 또는 다른 영역들에, 예를 들어 5' 및/또는 3' 말단의 6, 5, 4, 3, 또는 2 뉴클레오티드 내에 존재한다.
둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 관해서 용어 "퍼센트 동일성" 은 아래 설명된 서열 비교 알고리즘 (예를 들어, BLASTP 및 BLASTN 또는 당업자가 이용가능한 다른 알고리즘) 중 하나를 사용하여 또는 육안 검사에 의해서 측정하여 최대 상응성에 맞게 비교하고 정렬했을 때 명시된 퍼센트의 뉴클레오티드 또는 핵산 잔기가 동일한 둘 이상의 서열 또는 하위서열을 말한다. 용도에 따라서 퍼센트 "동일성" 는 비교되는 서열의 어떤 영역에 걸쳐서, 예를 들어 기능 도메인에 걸쳐서 존재할 수 있거나, 또는 비교되는 두 서열의 전 길이에 걸쳐서 존재할 수 있다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 기준 서열로 작동한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때 시험 서열과 기준 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요하다면 하위서열 좌표가 지정되며, 서열 알고리즘 프로그램 변수가 지정된다. 다음에, 서열 비교 알고리즘이 지정된 프로그램 변수에 기초하여 기준 서열에 대한 시험 서열(들)의 서열 동일성 퍼센트를 계산한다.
비교를 위한 최적의 서열 정렬은, 예를 들어 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) 의 국소 상동성 알고리즘, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970) 의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988) 의 유사성 검색 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행 (GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), 또는 육안 검사 (일반적으로 Ausubel et al. 참조) 에 의해서 수행될 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트 결정에 적합한 알고리즘의 한 가지 예는 BLAST 알고리즘이며, 이것은 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)에 개시된다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information(www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 이용할 수 있다.
용어 "충분한 양" 은 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양, 예를 들어 세포로부터 검출 가능한 신호를 생성하기에 충분한 양을 의미한다.
용어 "치료적 유효량" 은 질환의 증상을 완화하는데 효과적인 양이다. 예방이 치료적 효과가 있는 경우는 치료적 유효량은 "예방적 유효량" 일 수 있다.
명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 단수형 "한" 및 "그" 는 문맥상 명백히 다른 의미가 아니라면 복수의 언급을 포함한다는 것이 주지되어야 한다.
II. 바이러스의 용원 및 용균 주기
바이러스는 숙주 세포에서 용원 주기 및 용균 주기를 겪는다. 용원 주기가 시작된 경우, 파지 염색체는 박테리아 염색체에 혼입될 수 있거나, 또는 숙주에서 자체적으로 안정한 플라스미드를 확립할 수 있으며, 이 경우 장기간 동안 휴면 상태를 유지할 수 있다. 용원이 유도된 경우, 파지 게놈은 박테리아 염색체로부터 절제되고 용균 주기를 개시하며, 이 주기는 세포의 용해 및 파지 입자의 방출시 종료된다. 용균 주기는 숙주의 세포용해에 의해서 방출되는 새로운 파지 입자의 생성을 초래한다.
특정 잠재 파지 (temperate phage) 는 세포용해 활성을 나타낼 수 있고, 이런 경향은 숙주 박테리아가 변함에 따라 변할 수 있다. 이 현상을 증명하기 위해, 10 개의 MRSA 임상 분리주에서 2 개의 잠재 에스. 아우레우스 파지의 세포용해 활성을 플라크 분석을 통해서 시험하였다 (표 1). 파지 φ11 은 10 개 임상 MRSA 분리주 중 10개에서 세포용해 활성을 나타냈고, φ80α 는 10 개 임상 MRSA 분리주 중 6 개에서 세포용해 활성을 나타냈다. 따라서, 파지의 자연적인 용원 주기에 의존하는 리포터 분석은 세포용해 활성을 산발적으로 나타낼 것으로 예상될 수 있다.
표 1.: 10 개의 임상 MRSA 분리주에서 에스. 아우레우스 잠재 파지 φ11 및 φ80α의 세포용해 활성 (문자 "x"로 표시된다)
Figure 112017029052662-pct00001
게다가, 파지-기반 리포터와 같은 바이러스-기반 리포터 분석은 숙주-기반 및 프로파지(prophage)-유래 파지 내성 기전에 의해서 야기된 파지 숙주 범위의 제한으로 인한 제한된 반응성 (즉, 분석 포괄성) 으로 인해 어려움을 겪을 수 있다. 이들 내성 기전은 자생 파지 핵산을 표적화하여 파지 DNA와 기능을 변성시키거나 억제할 수 있다. 이러한 내성 기전은 파지-유래 전사체를 억제하는 파지 DNA 및 CRISPR 시스템을 절단하는 제한 시스템을 포함한다.
세포용해 활성과 파지 내성은 모두 리포터 파지에 기초한 분석에서 억제성일 수 있다. 세포용해 활성은 검출 가능한 신호를 생성하는 세포를 파괴하거나 억제함으로써 신호를 억제할 수 있으며, 이로써 검출 가능한 신호의 양을 감소시키거나 검출 가능한 신호의 생성을 차단함으로써 검출 한계에 영향을 미친다. 파지 내성 기전은 파지의 숙주 범위를 제한할 수 있고, 파지-기반 리포터의 포괄성을 제한할 수 있으며, 이는 또한 검출 가능한 신호의 양을 감소시키거나 검출 가능한 신호의 생성을 차단함으로써 검출 한계에 영향을 미친다. 리포터 파지에서의 파지 DNA 의 혼입에 의해서 야기된 세포용해 활성과 파지 내성은 모두 파지 리포터를 혼입한 분석에서 거짓-음성 결과를 초래할 수 있다.
III. 비-복제 형질도입 입자 (NRTP) 의 제조 방법
비-복제 형질도입 입자 제조를 위한 파괴/보상-기반 방법
바이러스 생성 동안 게놈 패키징을 개시하는 요소인 바이러스 패키징 기구에 의해 인지되는 바이러스 게놈 성분의 파괴를 기반으로 하는 비-복제 형질도입 입자 패키징 시스템이 개시된다. 하나의 구현예에서, 상기 파괴는 박테리오파지로부터 패키징 개시 부위를 파괴하고, 또한 터미나아제 기능을 파괴한다. 파괴된 요소의 예에는 pac-타입 박테리오파지의 pac-부위 서열 및 cos-타입 박테리오파지의 cos-부위 서열이 포함된다. 하나의 구현예에서, 파지 내 패키징 개시 부위 서열이 파괴되는 경우, 파지는 작용성 터미나아제를 생성할 수 없다. 일례로, pac-부위는 pacA 유전자 서열 내에서 인코딩되고, 터미나아제 기능은 작용성 PacA 및 PacB 양자 모두를 요구한다. 구현예에서, 플라스미드 DNA 는 상기 파괴된 터미나아제를 보상하고 플라스미드 DNA 상 인지가능한 패키징 개시 부위를 포함함으로써 파지 캡시드에 패키징된다. 박테리오파지는 임의의 박테리오파지, 예컨대 엔테로박테리아세아에 박테리오파지 P1 또는 φEF11, 또는 에스. 아우레우스 박테리오파지 φ80α 또는 박테리오파지 φ11 일 수 있다.
패키징 개시 부위는 바이러스 생성에 필수적인 유전자의 코딩 영역 내에서 종종 발견된다. 일부 구현예에서, 박테리오파지 게놈의 영역은 패키징 개시 부위를 파괴하는 삽입, 대체, 결실 또는 돌연변이에 의해 파괴된다. 이를 완수하는 파괴의 예에는 이에 제한되는 것은 아니나, 패키징 개시 부위 서열을 함유하는 박테리오파지 게놈 상 서열을 항생물질 내성 유전자의 것과 같은 또 다른 서열로 대체하는 대립유전자 교환 이벤트, 또는 작은 및 큰 터미나아제 유전자의 완전 결실이 포함된다. 터미나아제 유전자 pacA 및 pacB 를 이용하는 예에서, pacA 는 PacA 및 PacB 에 의해 매개된 전체 터미나아제 기능 및/또는 pacB 발현을 또한 파괴하는 극성 효과를 야기시키는 방식으로 파괴될 수 있다. 또 다른 예는 에스. 아우레우스 박테리오파지 φ11 또는 φ80α 로부터의 terS 및 terL 유전자, 또는 이. 파에칼리스 박테리오파지 φEf11 로부터의 terS 및 terL 유전자를 포함할 수 있는 터미나아제 유전자를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 터미나아제 유전자는 pac-부위를 함유하는 유전자 서열의 일부가 카나마이신 내성 유전자에 의해 대체되어 있는 P1 pacA 유전자, SEQ ID NO:20 을 포함한다. 도 1 은 대립유전자 교환을 통해 pacA 유전자 내에서 카나마이신 내성 유전자의 삽입에 의한 박테리오파지 P1 내 pacA 유전자의 파괴의 예를 도시한다.
한 예에서, 세포의 게놈은 패키징 개시 부위가 파괴되어 있는 바이러스 게놈으로 용원화된다. 일부 구현예에서, 세포는 이 콜라이 세포, 에스. 아우레우스 세포 또는 이. 파에칼리스 세포일 수 있다. 세포는 그람-음성 또는 그람-양성일 수 있다. 보상성 플라스미드 (또는 리포터 핵산 분자) 가 세포에 도입되고, 플라스미드 DNA 는 적어도 박테리오파지 내 파괴되어 있는 유전자를 포함하고, 그 뿐 아니라 패키징 개시 부위 서열 및 임의로는 추가적인 박테리오파지 유전자 및 리포터 유전자 (검출가능한 마커 및/또는 선택성 마커를 인코딩할 수 있음) 를 포함한다. 플라스미드는 본원에서 그 전문이 참조로 포함되어 있는 국제 출원 제 PCT US 2014/026536 호에서 발견된 방법을 이용하여 구축될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 개시 부위 서열은 pac-부위 또는 cos-부위를 포함한다. 하나의 구현예에서, 패키징 개시 부위 서열은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 6 의 서열을 포함한다. 플라스미드의 하나 이상의 유전자는 프로모터, 예컨대 유도성 프로모터 (패키징이 박테리오파지를 유도함으로써 개시될 때 유도될 수 있음) 에 작동적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 작은 터미나아제 유전자 또는 큰 터미나아제 유전자의 자생 프로모터일 수 있다. 하나의 구현예에서, 자생 프로모터는 박테리오파지에 의해 제어될 수 있고, 그에 따라 효과적으로 패키징 동안 유도된 조건부 프로모터로서 작용한다. 하나의 구현예에서, 프로모터는 SEQ ID NO: 9 의 서열을 포함한다.
도 2 는 pacA 및 pacB 를 보유하는 플라스미드의 개략도를 도시한다. 도 3 은 파괴된 pacA 유전자를 갖는 박테리오파지 P1 으로 용원화된 이 콜라이 세포로 구성된 패키징 시스템의 설계 및 기능의 일례를 도시한다. 이 세포는 또한 pacA 및 pacB 유전자를 함유하는 플라스미드를 보유할 수도 있다. 하나의 구현예에서, 플라스미드 내 pacA 및 pacB 유전자는 엔테로박테리아세아에 박테리오파지 P1 로부터 유래된다. 돌연변이된 바이러스가 용균 주기를 겪는 경우, 박테리오파지 게놈 또는 (파괴시) 보상성 플라스미드로부터 생성된 바이러스 패키징 단백질은 플라스미드 DNA 의 레플리콘을 패키징 유닛에 그의 패키징 개시 부위로 인해 패키징하고, 복제된 플라스미드 DNA 를 보유하는 비-복제 형질도입 입자가 생성된다.
하나의 구현예에서, 레플리콘은 엔테로박테리아세아에 박테리오파지 P1 세포용해 레플리콘이다. 레플리콘은 또한 에스. 아우레우스 pT181 플라스미드 복제 기점, 엔테로코쿠스 repB 플라스미드 복제 기점, 또는 엔테로코쿠스 pDL278 플라스미드 복제 기점으로부터 유래된 pBHR1 레플리콘 또는 pBHR1 레플리콘의 유도체일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 레플리콘은 C1 억제자-제어된 P53 프로모터, 프로모터 P53 안티센스, repL 유전자 및 kilA 유전자의 프레임 내 결실을 포함한다. 레플리콘의 하나의 예는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 8 의 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 파괴/보상은 돌연변이된 바이러스 DNA 와 보상 외인성 DNA 사이의 상동성이 없도록 설계되는 것이 바람직하다. 이는, 돌연변이된 바이러스 DNA 및 보상 외인성 DNA 사이의 상동성 결여가 바이러스 게놈 내 패키징 서열의 재도입을 도모할 수 있는 두 DNA 분자들간의 상동 재조합의 가능성을 방지하기 때문이다. 상동성의 결여를 달성하기 위한 하나의 전략은 바이러스 게놈으로부터 패키징 개시 부위 서열을 함유하는 전체 유전자 (또는 유전자들) 를 결실시킨 후, 이 유전자를 바람직하게 바이러스로부터 결실된 정확히 그 DNA 서열 이하를 함유하는 외인성 DNA 분자로 보상하는 것이다. 이 전략에서, 보상성 DNA 분자는 바이러스로부터 결실된 유전자를 발현하도록 설계된다. 박테리오파지 φ80α, pac-타입 파지를 이용하는 이러한 시스템의 또 다른 예가 제공된다. 파지 게놈은 숙주 박테리아 세포에서 용원화되고, 파지 게놈에는 pac-타입 프로파지 φ80α 의 pac-부위가 결실되어 있는 작은 터미나아제 유전자가 포함된다. 자생 pac-부위를 갖는 상보성 작은 터미나아제 유전자를 포함하는 플라스미드가 세포 내로 형질전환된다. 용원화된 프로파지의 용균 주기가 유도된 경우, 박테리오파지 패키징 시스템은 자생 박테리오파지 DNA 를 패키징하는 것이 아니라 플라스미드 DNA 를 자손 박테리오파지 구조 성분에 패키징한다. 따라서, 이 패키징 시스템은 플라스미드 DNA 를 가진 비-복제 형질도입 입자를 생성한다.
또 다른 구현예에서, 박테리오파지 게놈의 영역은 패키징 개시 부위를 파괴하는 삽입에 의해 파괴된다. 한 구현예에서, 파괴는 박테리오파지 게놈 내로 혼입된 리포터 유전자를 포함한다. 한 구현예에서, 파괴는 박테리오파지 게놈 내로 혼입된 리포터 유전자 및 내성 마커를 포함한다. 한 구현예에서, 파괴는 리포터 유전자로의 박테리오파지 게놈 상 서열을 대체 또는 파괴하는 대립유전자 교환 이벤트에 의해 달성된다. 한 구현예에서, 파괴는 내성 마커 및 리포터 유전자로의 박테리오파지 게놈 상 서열을 대체 또는 파괴하는 대립유전자 교환에 의해 달성된다. 일부 구현예에서, 내성 마커 및/또는 리포터 유전자는 구성성 프로모터의 제어 하에 있다.
도 4 는 kan 및 luxAB 유전자가 pac-부위 서열 내로 삽입되어 있는 파괴된 pacA 유전자를 갖는 박테리오파지 P1 을 포함하는 이. 콜라이 세포로 구성된 패킹 시스템의 설계 및 기능의 일례를 나타낸다. 도 3 에서와 같이, 세포는 또한 pacA 및 pacB 유전자를 함유하는 플라스미드를 보유한다. 따라서, 재조합이 박테리오파지와 플라스미드 사이에서 발생하는 경우, P1 캡시드에 삽입되어 NRTP 를 형성하는 복제된 플라스미드는 리포터 유전자를 여전히 포함할 것이다.
하나의 구현예에서, 리포터 유전자는 검출가능한 마커 또는 선택성 마커를 인코딩한다. 추가 구현예에서, 상기 리포터 유전자는 발광 반응을 매개하는 효소 (luxA, luxB, luxAB, luc, ruc, nluc), 비색 반응을 매개하는 효소 (lacZ, HRP), 형광 단백질 (GFP, eGFP, YFP, RFP, CFP, BFP, mCherry, 근적외선 형광 단백질), 친화성 펩티드 (His-tag, 3-FLAG), 및 선택성 마커 (ampC, tet(M), CAT, erm) 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 리포터 유전자는 luxA 이다. 일부 구현예에서, 내성 마커는 항생물질 내성 유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 내성 마커는 카나마이신 내성 유전자 (kan) 이다. 일부 구현예에서, 구성성 프로모터는 Pblast 를 포함한다. 일부 구현예에서, 박테리오파지 게놈 파괴는 패키징 개시 부위 서열을 함유하는 박테리오파지 게놈 상 서열을 대체 또는 파괴하는 대립유전자 교환 이벤트에 의해 달성된다.
일부 구현예에서, 박테리오파지 게놈 파괴는 구성성 프로모터 (Pblast) 의 제어 하 카나마이신 내성 유전자 (kan) 및 박테리아 루시퍼라아제 유전자 (luxAB) 로 패키징 개시 부위 서열을 함유하는 박테리오파지 게놈 상 서열을 대체 또는 파괴하는 대립유전자 교환에 의해 달성된다. 하나의 구현예에서, 대립유전자 교환은 도 1 에 도시된 것과 유사한 방식으로 달성되고, 여기서 리포터 또는 리포터 및 내성 마커는 이동된다.
하나의 구현예에서, 박테리오파지 게놈 상 터미나아제 유전자 쌍, 예를 들어 pacA 와 pacB, terA 와 terB, 또는 terS 와 terL 은 터미나아제 유전자에 의해 매개되는 전반적인 터미나아제 기능 및/또는 터미나아제 유전자 중 하나의 발현을 파괴하기도 하는 극성 효과를 야기하는 방식으로 파괴된다. 하나의 구현예에서, pacA 유전자좌에 삽입된 kan 및 luxAB 를 포함하는 구축물은 SEQ ID NO: 12 에 제공된다. 한 구현예에서, 파괴된 박테리오파지는 박테리오파지 게놈의, 터미나아제 유전자, 예를 들어 pacA 및 pacB, terA 및 terB, 또는 terS 및 terL 를 포함하는 플라스미드로 보상된다. 한 구현예에서, 플라스미드는 파괴된 터미나아제 유전자를 갖는 박테리오파지로 용원화된 세포 내로 도입된다. 한 구현예에서, 세포는 이. 콜라이 세포이다. 한 구현예에서, 박테리오파지는 엔테로박테리아세아에 박테리오파지 P1 이다. 한 구현예에서, 플라스미드 내 터미나아제 유전자는 엔테로박테리아세아에 박테리오파지 P1, 즉, pacA 및 pacB 유전자로부터 유래된다. 돌연변이화된 바이러스가 용균 주기를 겪는 경우, 박테리오파지 게놈으로부터 또는 (파괴된 경우) 보상성 플라스미드로부터 생성된 바이러스 패키징 단백질은 이것이 패키징 개시 부위를 함유하기 때문에 플라스미드 DNA 의 레플리콘을 패키징 유닛으로 패키징하고, 복제된 플라스미드 DNA 를 보유하는 비-복제 형질도입 입자가 생성된다.
이들 결실/보상 시스템에서, (1) 플라스미드 DNA 를 보유하는 비-복제 형질도입 입자, 및 (2) P1 DNA 를 보유하는 비-복제 형질도입 입자 (이때, 후자는 플라스미드 DNA 와 P1 DNA 사이의 재조합으로 생성될 수 있음) 을 포함하는 2 종의 형질도입 입자가 생성될 수 있다. P1 돌연변이체가 P1 게놈 내 삽입된 luxAB 를 함유하지 않는 구현예에서, P1 DNA 를 보유하는 비-복제 형질도입 입자는 이들 형질도입 입자가 DNA 를 표적 세포 내로 전달하는 경우 신호 발생에 기여하지 않는다. 그러나, P1 돌연변이체가 P1 게놈에 삽입된 luxAB 를 함유하는 구현예에서는, P1 DNA 를 보유하는 비-복제 형질도입 입자는 이들 형질도입 입자가 DNA 를 표적 세포 내로 전달하는 경우 신호 전달에 기여한다.
이와 같이, luxAB 유전자가 P1 게놈 내로 삽입된 구현예는 개선된 비-복제 형질도입 입자 리포터 시스템을 도모한다.
IV. 리포터
일부 구현예에서, NRTP 및 본 발명의 구축물은 리포터 유전자를 포함하는 리포터 핵산 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 박테리오파지는 리포터 유전자를 포함한다. 리포터 유전자는 리포터 분자를 인코딩할 수 있고, 리포터 분자는 검출 가능한 마커 또는 선택성 마커일 수 있다. 특정 구현예에서, 리포터 유전자는 세포에서 발현되었을 때 검출 가능한 신호를 생성하는 리포터 분자를 인코딩한다.
특정 구현예에서, 리포터 분자는 형광 리포터 분자, 예컨대 제한은 아니지만, 녹색 형광 단백질 (GFP), 증진된 GFP, 황색 형광 단백질 (YFP), 시안 형광 단백질 (CFP), 청색 형광 단백질 (BFP), 적색 형광 단백질 (RFP) 또는 mCherry, 뿐만 아니라 근적외선 형광 단백질일 수 있다.
다른 구현예에서, 리포터 분자는 발광반응을 매개하는 효소일 수 있다 (luxA, luxB, luxAB, luc, ruc, nluc 등). 리포터 분자는 박테리아 루시퍼라아제, 진핵 루시퍼라아제, 비색 검출에 적합한 효소 (lacZ, HRP), 면역 검출에 적합한 단백질, 예컨대 친화성 펩티드 (His-tag, 3X-FLAG), 앱타머로서 기능하거나 효소 활성을 나타내는 핵산 (리보자임) 또는 선택성 마커, 예컨대 항생물질 내성 유전자 (ampC, tet(M), CAT, erm) 를 포함할 수 있다. 본 분야에 잘 알려진 다른 리포터 분자들도 표적 핵산 또는 세포를 검출하기 위한 신호를 생성하는데 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 리포터 분자는 핵산 분자를 포함한다. 일부 양태에서, 리포터 분자는 특이적 결합 활성을 갖거나, 또는 효소 활성을 나타내는 앱타머이다 (예를 들어, 앱타자임, DNAzyme, 리보자임).
리포터 및 리포터 분석은 본원의 섹션 V 에서 더 자세히 기재된다.
NRTP 및 리포터 분석
유도인자 리포터 분석
일부 구현예에서, 본 발명은 생육성 세포 내에서 유전자 프로모터를 표적화하는 내인성 또는 자생 유도인자와 함께 사용하기 위한 리포터 분자로서 NRTP의 사용 방법을 포함한다. 본 발명의 NRTP 는 섹션 III 및 아래 실시예 1-2 에 기재된 방법을 사용하여 조작될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 리포터로서 NRTP를 이용하는 것을 포함하며, 상기 NRTP는 표적 세포 내에서 표적 유전자의 발현을 제어하는 유도성 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 포함한다. 리포터 유전자를 포함하는 NRTP가 표적 세포에 도입되었을 때, 리포터 유전자의 발현은 리포터 핵산 분자에서 표적 유전자 프로모터의 유도를 통해서 가능하다.
도 5 는 두 유전자, 즉 유도인자를 인코딩하는 유전자 (502) 와 표적 유전자 (503) 를 가진 표적 세포의 게놈 유전자좌 (500) 를 도시한다. 또한, 표적 세포의 표적 유전자의 프로모터 (506) 에 작동적으로 연결된 리포터 유전자 (505) 를 포함하는 리포터 핵산 분자 (504) 가 도시된다. 리포터 핵산 분자 (504) 는 NRTP 를 통해서 세포에 도입될 수 있다. 자생 세포에서, 유도인자 유전자 (502) 가 발현되고 유도인자 단백질 (507)을 생성할 때, 유도인자 단백질 (507) 은 표적 유전자에 작동적으로 연결된 표적 유전자 프로모터 (506) 를 유도할 수 있으며, 따라서 표적 유전자의 발현 및 표적 유전자 생성물 (508) 을 생성한다.
리포터 핵산 분자 (504) 가 표적 유기체 내에 존재하는 경우, 유도인자 (507) 는 또한 리포터 핵산 분자 (504) 내에 존재하는 표적 유전자 프로모터 (506) 를 유도할 수 있으며, 따라서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 리포터 분자 (509) 를 생성하는 리포터 유전자 (505) 의 발현을 야기한다.
따라서, 리포터 분자 (509) 로부터의 검출 가능한 신호의 생성은 표적 세포 내에 유도인자 단백질 (507) 의 존재에 기초하여 세포의 존재를 나타낸다.
VanR 리포터 시스템
하나의 구현예에서, 리포터 시스템은 리포터 핵산 분자 (예를 들어, 플라스미드) 를 포함하는 NRTP 를 포함한다. 리포터 핵산 분자는 엔테로코쿠스 파에시움 (또는 이.파에칼리스) 에서 반코마이신 내성 (vanA) 유전자의 프로모터의 유도인자인 VanR 을 검출하도록 구축될 수 있다. 이 리포터 플라스미드는 vanA 유전자 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 가진다.
도 6 은 VanR 리포터 시스템의 설계 및 기능을 개략한다. 도 6 은 이. 파에시움에 존재할 수 있는 트랜스포손 Tn1546 (601) 의 영역을 묘사한다. Tn1546 트랜스포손은 vanR 유도인자 유전자 (602) 와 vanA 표적 유전자 (603) 를 포함할 수 있다. 또한, 이 도면에는 NRTP 에 패키징되어 세포에 도입될 수 있는 리포터 핵산 분자 (604) 가 묘사된다. 리포터 핵산 분자 (604) 는 vanA 유전자를 포함하는 vanHAX 오페론의 발현을 제어하는 프로모터 PH (606) 에 작동적으로 연결된 리포터 유전자 (605) 를 포함한다. 자생 세포에서, vanR 유전자 (602) 가 발현되어 VanR 단백질 (607) 을 생성할 때, VanR 은 Tn1546 트랜스포손에서 PH (606) 를 유도할 수 있고, 따라서 vanA 유전자의 발현을 야기하며, VanA 단백질 (608) 을 생성한다. 리포터 핵산 분자 (603) (벡터)가 표적 유기체 내에 존재할 경우, VanR 은 리포터 핵산 분자 (603) 내에서 PH (606) 을 유도할 수 있으며, 따라서 리포터 분자 (609) 의 발현을 야기한다. 따라서, 리포터 분자의 생성은 표적 세포 내에 VanR 의 존재를 가리킨다.
VRE 분석의 개발에 적합한 프로모터의 예들은 vanA 유전자 프로모터 및 vanB 유전자 프로모터를 포함한다 (Arthur, M., et al., The VanS sensor negatively controls VanR-mediated transcriptionnal activation of glycopeptide resistance
genes of Tnl546 and related elements in the absence of induction. J. Bacterial., 1997. 179(1): p. 97-106 참조).
TcdD 리포터 시스템
이 시스템의 다른 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 NRTP 를 사용하여 세포에 도입된다. 리포터 핵산 분자는 씨. 디피실의 독소 A 및 B 유전자 (각각 tcdA 및 tcdB) 의 프로모터의 유도인자인 TcdD를 검출하도록 구축될 수 있다. 리포터 핵산 분자는 tcdA 유전자 프로모터에 작동적으로 연결된 리포터 유전자를 포함한다.
도 7 은 본 발명의 구현예에 따른 TcdD 리포터 시스템의 설계 및 기능을 개략한다. 도 7 은 씨. 디피실에 존재할 수 있는 트랜스포손 PaLoc (701) 의 영역을 묘사한다. PaLoc 트랜스포손은 tcdD 유전자 (702) 와 tcdA 표적 유전자 (703) 를 포함할 수 있다. 또한, 이 도면에는 NRTP 를 사용하여 세포에 도입될 수 있는 리포터 핵산 분자 (704) (예를 들어, 벡터) 가 묘사된다. 리포터 핵산 분자 (704) 는 tcdA 유전자 프로모터 (PtcdA) (706) 에 작동적으로 연결된 리포터 유전자 (705) 를 포함한다.
자생 세포에서, tcdD 유전자가 발현되어 TcdD 단백질 (707) 을 생성할 때, TcdD 는 PaLoc 트랜스포손 (701) 에서 PtcdA (706) 를 유도할 수 있고, 따라서 tcdD 유전자 (703) 의 발현을 야기하며, 독소 A 단백질 (708) 을 생성한다.
리포터 핵산 분자 (704) 가 표적 유기체 내에 존재할 경우, TcdD 는 리포터 벡터 내에서 PtcdA (706) 를 유도할 수 있으며, 따라서 리포터 분자 (709) 의 발현을 야기한다. 따라서, 리포터 분자 (709) 의 생성은 표적 세포 내에 TcdD 의 존재를 가리킨다.
씨. 디피실 분석의 개발에 적합한 프로모터의 예들은 tcdA 유전자 프로모터 및 tcdB 유전자 프로모터를 포함한다 (Karlsson, S., et al., Expression of Clo-stridium difficile Toxins A and B and Their Sigma Factor TcdD Is Controlled by Temperature. Infect. Immun., 2003. 71(4): p. 1784-1793 참조).
표적 세포 및 유도인자: 표적 세포는 진핵 및 원핵 세포 표적과 관련된 유도인자를 포함할 수 있다.
벡터 전달 시스템: 재조합 DNA를 함유하는 벡터의 전달은 비-생물학적 또는 생물학적 시스템에 의해서 수행될 수 있다. 제한은 아니지만 리포솜, 바이러스-유사 입자, 파지 또는 바이러스로부터 유래된 형질도입 입자, 및 콘쥬게이션을 포함한다.
박테리오파지-기반 SarS 리포터 시스템
본 발명의 다른 구현예에서, 리포터 핵산 분자는 에스. 아우레우스에서 단백질 A 유전자 (spa) 의 프로모터의 유도인자인 SarS 를 검출하도록 구축된다. 리포터 핵산 분자는 NRTP 에서 세포에 도입될 수 있고, spa 유전자 프로모터 (Pspa) 에 작동적으로 연결된 박테리아 루시퍼라아제 유전자 luxA 및 luxB 를 포함한다. 리포터 핵산 분자는, 예를 들어 NRTP 를 통해서 에스. 아우레우스에 전달된다. SarS 가 세포에 존재한다면, luxAB 유전자의 발현을 유도할 것이고, 따라서 발광 신호를 생성할 수 있는 루시퍼라아제 효소를 생성한다.
도 8 는 본 발명의 구현예에 따른 SarS 리포터 시스템의 설계 및 기능을 개략한다. 도 8 는 SarS 유전자 (802) 및 spa 유전자 (803) 를 함유하는 에스. 아우레우스 게놈 (801) 의 영역을 묘사한다. 또한, 이 도면에는 세포에 NRTP 에 의해서 전달되는 리포터 핵산 분자 (예를 들어, 벡터) (804) 가 묘사되며, 이것은 spa 유전자 (803) 의 발현을 제어하는 프로모터 Pspa (806) 에 작동적으로 연결된 luxAB 리포터 유전자 (805) 를 포함한다.
자생 세포에서, sarS 유전자 (802) 가 발현되어 SarS 단백질 (807) 을 생성할 때, 이 단백질은 에스. 아우레우스 게놈 트랜스포손에서 Pspa (806) 을 유도할 수 있고, 따라서 spa 유전자 (803) 의 발현을 야기하며, 단백질 A (808) 을 생성한다.
리포터 핵산 분자 (804) 가 표적 유기체 내에 존재할 경우, SarS (807) 는 리포터 핵산 분자 (804) 내에서 Pspa (806) 를 유도할 수 있으며, 따라서 발광 신호를 생성할 수 있는 루시퍼라아제 효소 (809) 를 생성하는 luxAB 의 발현을 야기한다. 따라서, 루시퍼라아제의 생성은 표적 세포 내에 SarS 의 존재를 가리킨다.
본원에 개시된 NRTP 를 갖고 이용하기 위한 기타 리포터 시스템은 국제 PCT 출원 제 WO 2014/160418 호에 기재되어 있으며, 이 전문은 본원에 참조로서 포함된다.
리포터 서열의 cis-억제 및 표적 전사체의 결합에 의한 입체구조 변화의 기전
본 발명에서 이용된 일반적인 기전은 두 연속 기전을 야기할 수 있는 분자간 핵산 분자 상호작용이다: (1) 핵산 분자의 2 차 구조의 입체적 변화, 및 (2) 절단 이벤트. cis-억제 입체구조와 탈-억제 입체구조 간에 입체구조 변화를 일으킬 수 있는 리포터 전사체를 설계하는 방법이 본원에 개시되며, 여기서 입체구조 변화는 리포터 전사체와 표적 전사체의 결합에 의해서 유도된다.
상기 개시된 대로, 리포터 전사체는 리포터 서열을 포함할 수 있고, 리포터 유전자 서열의 번역이 리포터 유전자의 리보솜 결합 부위 (RBS) 의 cis-억제에 의해서 차단되도록 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, 아래와 같은 방식이 본 발명의 리포터 전사체를 설계하는데 사용될 수 있다.
1) RNA Institute College of Arts and Sciences, University at Albany, State University of New York (Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15 (2003))(http:// mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form) 에 의해서 유지되는 서버에서 이용 가능한 Mfold와 같은 2 차 구조 프로그램을 사용하여 RNA 2 차 구조가 계산된다.
2) Graduate School of Information Science, Nara Institute of Science and Technology (NAIST), Department of Biosciences and Informatics, Keio University Japan (http://rna.naist.jp/ractip/) 에 의해서 유지되는 서버에서 이용 가능한 Integer Programming (RactIP) 을 사용한 RNA-RNA InterACTion 예측과 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 분자간 RNA 상호작용이 계산된다.
3) RNA의 2 차 구조 드로잉 전용 Java 경량 애플릿인 RNA용 비쥬얼라이제이션 에플릿 (VARNA) (http://varna.lri.fr/)을 사용하여 RNA 2 차 구조가 시각화된다.
표적 전사체의 2 차 구조는 MFold 에 의해 계산된 최저 에너지 입체구조에 기초하여 생성되고 VARNA 로 시각화될 수 있다.
ssRNA 영역 또는 표적 영역은 리포터 전사체에 결합하기에 이상적일 수 있는 표적 전사체 내에서 확인될 수 있다. 일부 예에서, 표적 전사체의 2 차 구조는 리포터 서열의 일부에 결합할 수 있는 공통 (consensus) 서열 또는 루프 서열을 포함한다. 예를 들어, 메티실린 내성 에스. 아우레우스의 mecA 전사체에는 리포터 전사체의 cis-억제 서열에 결합하기 위해 사용될 수 있는 공통 YUNR 서열 ("UUGG") 을 포함하는 말단 루프가 있다. 표적 전사체의 2 차 구조의 분석은 cis-억제 서열에 결합하기에 적합할 수 있는 하나 이상의 ssRNA 영역을 드러낼 수 있다. 리포터 전사체의 cis-억제 서열은 하나 이상의 ssRNA 영역에 결합하도록 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, cis-억제 서열은 리포터 전사체에서 리포터 서열의 RBS 에 결합하고 리포터 전사체 내의 줄기-루프 구조를 형성하도록 설계될 수 있으며, 이로써 cis-억제 서열은 리포터 서열의 RBS 와 RNA 중합효소의 결합을 차단한다. cis-억제 서열과 표적 전사체의 ssRNA 영역의 결합시 리포터 서열의 RBS 가 노출될 수 있고, 리포터 서열의 번역이 개시될 수 있다.
일부 구현예에서, 리포터 전사체의 cis-억제 서열은 리포터 서열의 5' 말단에 위치되도록 설계되고 리포터 서열에서 줄기-루프 구조를 생성하도록 설계될 수 있으며, 이로써 리포터 서열의 RBS 서열이 차단된다. cis-억제 줄기-루프 구조는 MFold 에 의해 계산되고 VARNA 로 시각화되었을 때 리포터 전사체의 최저 에너지 입체구조에 기초하여 RBS 서열을 차단하도록 설계될 수 있다. 표적 전사체와 리포터 전사체의 cis-억제 서열 사이의 예측된 분자간 상호작용은 RactIP에 의해 계산되고 VARNA 에 의해 시각화될 수 있다. 아래 도 9 에 도시된 대로 표적 전사체와 리포터 전사체의 cis-억제 서열 사이의 염기쌍화를 시각화하기 위한 다이어그램이 그려질 수 있다.
상호작용은 표적 서열과 cis-억제 서열에서 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 또는 그 이상의 뉴클레오티드 사이의 염기쌍화를 포함할 수 있다. 두 서열 사이의 상보성 결합은 완전히 상보성, 실질적으로 상보성, 또는 부분적으로 상보성일 수 있다. 염기쌍화는, 예를 들어 도 9 에 도시된 대로 표적과 cis-억제 서열 내의 연속 뉴클레오티드 서열 또는 영역을 가로질러 이루어질 수 있다.
전사체
상기 개시된 대로, 전사체는 DNA 또는 RNA 주형 서열 또는 유전자로부터 전사된 뉴클레오티드 서열 (DNA 또는 RNA) 의 가닥이다. 전사체는 RNA 주형으로부터 전사된 cDNA 서열 또는 DNA 주형으로부터 전사된 mRNA 서열일 수 있다. 전사체는 조작된 핵산 구축물로부터 전사될 수 있다. 전사체는 자체 내에 상보성 영역을 가질 수 있으며, 이로써 전사체는 분자내 듀플렉스를 형성할 수 있는 두 영역을 포함한다. 하나의 영역은 리포터 서열에 결합하여 번역을 차단하는 "cis-억제 서열"로서 언급될 수 있다. 전사체의 제 2 서열은 검출 가능한 마커 또는 선택성 마커와 같은 리포터 분자를 인코딩하는 "리포터 서열"로서 칭해진다.
본 발명의 전사체는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 개 뉴클레오티드 길이일 수 있는 전사체 서열일 수 있다. 다른 구현예에서, 전사체는 적어도 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 4000, 5000 개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. cis-억제 서열과 리포터 서열은 동일한 길이 또는 상이한 길이일 수 있다.
일부 구현예에서, cis-억제 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 개 또는 그 이상의 스페이서 뉴클레오티드에 의해서 리포터 서열과 분리된다.
벡터
다른 양태에서, 본 발명의 전사체 (안티센스 및 센스 서열 포함) 는 DNA 또는 RNA 벡터에 삽입된 전사 유닛으로부터 발현된다 (예를 들어, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., 국제 PCT 공보 No. WO 00/22113, Conrad, 국제 PCT 공보 No. WO 00/22114, 및 Conrad, 미국 특허 No. 6,054,299 참조). 이들 서열은 선형 구축물, 원형 플라스미드, 또는 박테리오파지-기반 벡터를 포함하는 바이러스 벡터로서 도입될 수 있으며, 이들은 숙주 게놈에 혼입된 트랜스젠으로서 혼입되고 유전될 수 있다. 전사체는 또한 염색체외 플라스미드로서 유전되는 것을 허용하도록 구축될 수 있다 (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292 참조).
전사체 서열은 발현 플라스미드 상에 위치된 프로모터에 의해 전사될 수 있다. 하나의 구현예에서, cis-억제 및 리포터 서열이 전사체가 줄기 및 루프 구조를 갖도록 링커 폴리뉴클레오티드 서열에 의해서 이어진 반전된 반복부로서 발현된다.
재조합 발현 벡터가 본 발명의 전사체를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 재조합 발현 벡터는 일반적으로 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 전사체를 발현하는 바이러스 벡터는, 제한은 아니지만, 아데노-관련 바이러스 (Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129) 참조); 아데노바이러스 (Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616, Rosenfeld et al. (1991), Science 252:431-434, 및 Rosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155 참조); 또는 알파바이러스 뿐만 아니라 본 분야에 알려진 다른 것들로부터 구축될 수 있다. 레트로바이러스는 시험관내 및 생체내에서 내피세포를 포함하는 많은 상이한 세포 타입에 다양한 유전자를 도입하는데 사용되었다 (예를 들어, Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7640-19; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150: 4104-4115; 미국특허 No. 4,868,116; 미국특허 No. 4,980,286; PCT 출원 WO 89/ 07136; PCT 출원 WO 89/02468; PCT 출원 WO 89/05345; 및 PCT 출원 WO 92/07573 참조). 세포 게놈에 삽입된 유전자를 형질도입하고 발현할 수 있는 재조합 레트로바이러스 벡터가 재조합 레트로바이러스 게놈을 PA317 및 Psi-CRIP와 같은 적합한 패키징 세포주로 트랜스펙션함으로써 생성될 수 있다 (Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349 참조). 재조합 아데노바이러스 벡터는 감수성 숙주에서 광범위한 여러 세포와 조직을 감염시키기 위해 사용될 수 있고 (예를 들어, 래트, 햄스터, 개 및 침팬지) (Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769 참조), 또한 감염에 유사분열 활성 세포가 필요하지 않다는 이점을 가진다.
발현되는 전사체(들)에 대한 코딩 서열을 수용할 수 있는 임의의 바이러스 벡터가 사용될 수 있고, 예를 들어 아데노바이러스 (AV); 아데나-관련 바이러스 (AAV); 레트로바이러스 (예를 들어, 렌티바이러스 (LV), 랍도바이러스, 쥣과동물 백혈병 바이러스); 헤르페스 바이러스 등으로부터 유래된 벡터가 있다. 바이러스 벡터의 트로피즘은 벡터를 다른 바이러스로부터의 외피 단백질이나 다른 표면 항원으로 슈도타이핑 (pseudotyping) 함으로써, 또는 적절하다면 상이한 바이러스 캡시드 단백질을 치환함으로써 개질될 수 있다.
예를 들어, 본 발명에서 특정된 렌티바이러스 벡터는 소포 스토마티티스 바이러스(VSV), 라비에스, 에볼라, 모콜라 등으로부터의 표면 단백질로 슈도타이핑될 수 있다. 본 발명에서 특정된 AAV 벡터는 상이한 캡시드 단백질 혈청형을 발현하도록 벡터를 조작함으로써 상이한 세포를 표적화하도록 제조될 수 있다. 상이한 캡시드 단백질 혈청형을 발현하는 AAV 벡터를 구축하는 기술은 본 분야의 기술 범위 내이다; 예를 들어, 전체 내용이 참고자료로 본원에 포함되는 [Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801]을 참조한다.
본 발명에 사용하기 적합한 재조합 바이러스 벡터의 선택, 벡터에 전사체를 발현하기 위해 핵산 서열을 삽입하는 방법, 및 관심 세포에 바이러스 벡터를 전달하는 방법은 본 분야의 기술 범위 내이다. 예를 들어, [Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; 및 Rubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406] 을 참조하며, 이들의 전체 내용은 참고자료로 본원에 포함된다.
바이러스 벡터는 AV 및 AAV로부터 유래될 수 있다. 본 발명에서 특정된 전사체를 발현하기 위한 적합한 AV 벡터, 재조합 AV 벡터를 구축하는 방법, 및 표적 세포에 벡터를 전달하는 방법은 [Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010] 에 개시된다. 본 발명에서 특정된 전사체를 발현하기 위한 적합한 AAV 벡터, 재조합 AV 벡터를 구축하는 방법, 및 표적 세포에 벡터를 전달하는 방법은 [Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61:3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol, 70:520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63:3822-3826; 미국특허 No. 5,252,479; 미국특허 No. 5,139,941; 국제특허출원 No. WO 94/13788; 및 국제특허출원 No. WO 93/24641] 에 개시되며, 이들의 전체 내용이 참고자료로 본원에 포함된다.
본 발명에서 특정된 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터에서 전사체 발현을 추진하는 프로모터는 진핵 RNA 중합효소 I (예를 들어, 리보솜 RNA 프로모터), RNA 중합효소 II (예를 들어, CMV 조기 프로모터 또는 액틴 프로모터 또는 U1 snRNA 프로모터) 또는 일반적으로 RNA 중합효소 III 프로모터 (예를 들어, U6 snRNA 또는 7SK RNA 프로모터) 또는 원핵 프로모터, 예를 들어 T7 프로모터일 수 있으며, 다만 발현 플라스미드는 또한 T7 프로모터로부터의 전사에 필요한 T7 RNA 중합효소를 인코딩한다. 프로모터는 또한 트랜스젠 발현을 췌장에 지시할 수 있다 (예를 들어, 췌장에서의 인슐린 조절 서열 (Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515) 참조).
게다가, 전사체의 발현은, 예를 들어 유도성 조절 서열 및 특정한 생리학적 조절인자, 예를 들어 순환 글루코오스 수준, 또는 호르몬에 감응하는 조절 서열과 같은 발현 시스템에 의해서 정확히 조절될 수 있다 (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24 참조). 세포 또는 포유동물에서 트랜스젠 발현의 제어에 적합한 이러한 유도성 발현 시스템은 엑디손, 에스트로겐, 프로게스테론, 테트라사이클린, 이량화의 화학적 유도인자, 및 이소프로필-베타-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG) 에 의한 조절을 포함한다. 당업자는 dsRNA 트랜스젠의 사용 목적에 기초하여 적절한 조절/프로모터 서열을 선택할 수 있을 것이다.
일반적으로, 전사체 분자를 발현할 수 있는 재조합 벡터가 하기 개시된 대로 전달되고, 표적 세포에서 지속된다. 또는, 전사체 분자의 일시 발현을 제공하는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 필요에 따라 반복적으로 투여될 수 있다. 일단 발현되면 전사체는 표적 RNA와 결합하여 기능이나 발현을 조정한다. 전사체 발현 벡터의 전달은, 예컨대 정맥내 또는 근육내 투여, 환자로부터 외식된 표적 세포에 투여 후 환자에 재도입, 또는 원하는 표적 세포에 도입 가능하게 하는 어떤 다른 수단에 의해서 전신적으로 이루어질 수 있다.
전사체 발현 DNA 플라스미드는 전형적으로 양이온성 지질 캐리어 (예를 들어, 올리고펙타민) 또는 비-양이온성 지질-기반 캐리어 (예를 들어, Transit-TKOTM)와의 복합체로서 표적 세포에 트랜스펙션된다. 또한, 1 주 이상의 기간에 걸쳐서 단일 PROC 유전자 또는 다수 PROC 유전자의 상이한 영역들을 표적화하는 dsRNA-매개 녹다운을 위한 다중 지질 트랜스펙션이 본 발명에 의해서 제시된다. 숙주 세포로의 벡터의 성공적인 도입은 다양한 공지된 방법을 사용하여 모니터링될 수 있다. 예를 들어, 일시 트랜스펙션인 녹색 형광 단백질 (GFP) 과 같은 형광 마커와 같은 리포터로 신호화될 수 있다. 생체외 세포의 안정한 트랜스펙션은 히그로마이신 B 내성과 같은 특정 환경 요인 (예를 들어, 항생물질 및 약물) 에 내성을 가진 트랜스펙션된 세포를 제공하는 마커를 사용하여 보장될 수 있다.
재조합 DNA를 함유하는 벡터의 전달은 비-생물학적 또는 생물학적 시스템에 의해서 수행될 수 있다. 제한은 아니지만 리포솜, 바이러스-유사 입자, 파지 또는 바이러스로부터 유래된 형질도입 입자, 및 콘쥬게이션을 포함한다.
전사체 분석을 위한 리포터
일부 구현예에서, 핵산 구축물은 리포터 서열 (예를 들어, 리포터 유전자 서열) 을 포함한다. 리포터 유전자는 세포에서 발현되었을 때 신호를 생성하는 리포터 분자를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 리포터 분자는 검출 가능한 마커 또는 선택성 마커일 수 있다. 특정 구현예에서, 리포터 분자는 형광 리포터 분자, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 시안 형광 단백질 (CFP), 청색 형광 단백질 (BFP), 또는 적색 형광 단백질 (RFP) 일 수 있다. 다른 구현예에서, 리포터 분자는 화학발광 단백질일 수 있다.
리포터 분자는 박테리아 루시퍼라아제, 진핵 루시퍼라아제, 형광 단백질, 비색검출에 적합한 효소, 면역검출에 적합한 단백질, 면역검출에 적합한 펩티드 또는 앱타머로서 기능하거나 효소 활성을 나타내는 핵산일 수 있다.
선택성 마커가 또한 리포터로서 사용될 수 있다. 선택성 마커는, 예를 들어 항생물질 내성 유전자일 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 수행하기 위한 특정 구현예들의 실시예이다. 이 실시예들은 단지 예시의 목적으로 제공되며, 본 발명의 범위를 어떤 식으로도 제한하지 않는다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 온도 등) 와 관련하여 정확성을 확보하기 위한 노력이 이루어졌지만 일부 실험 오차 및 편차는 당연히 허용되어야 한다.
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는다면 본 분야의 기술 범위 내에서 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약학 분야의 종래의 방법을 이용할 것이다. 이러한 기술들은 문헌에 상세히 개시된다. 예를 들어, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed.(Plenum Press) Vols A and B (1992)를 참조한다.
실시예 1: 대립유전자 교환-기반 파괴/보상 패키징 시스템
하기는 비-복제 형질도입 입자 제조를 위한 대립유전자 교환-기반 파괴/보상-기반 패키징 시스템의 설계 및 구축의 일례이다.
패키징 시스템을 개발하는데 사용된 재료는 이하에 열거한다:
박테리아 균주:
* N1706, 이. 콜라이 K-12 P1 c1-100 Tn9 용원
벡터:
* Y14439 (pBHR1 백본)
다음의 GenBank 수탁 번호 (N.B., 수탁 번호로서 인용된 서열은 본 출원의 우선일 현재 데이터베이스에 기록된 것들이다) 또는 SEQ ID NOs.가 벡터 백본 및 카세트 서열에 사용될 수 있다:
* X06758 (박테리아 루시퍼라아제 유전자 luxAB)
* SEQ ID NO: 1 (자생 pacA 유전자 프로모터를 포함하는 자생 P1 pacA 및 pacB 유전자)
* SEQ ID N0:2 (C1 억제자-제어된 P53 프로모터, 프로모터 P53 안티센스, repL 유전자, 및 kilA 유전자의 프레임 내 결실을 함유하는 P1 세포용해 레플리콘)
* SEQ ID NO: 11 (luxAB 발현을 구동하는 Pbalst 프로모터)
N1706(pacA::Kan) : 균주 1505 로도 공지된 pacA 돌연변이된 균주의 구축: pacA 돌연변이된 서열의 예시적 서열을 SEQ ID NO: 1O 에 나타낸다. 이 돌연변이화는, 그 자신을 대체되어지는 것이 요망되는 pacA 유전자의 서열에 인접시키는 (flank) pacA 유전자 서열에 의해 인접되는 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 대립유전자 교환 기질을 구축하는 것에 의해 달성된다. 대립유전자 교환 기질은, 유전자 합성을 통해 제조되어, N1706 내 자생 서열을 대체하고, Kan 유전자를 대립유전자 교환을 통해 삽입시켜 제조할 수 있다. 파괴가 또한 돌연변이된 P1 파지의 DNA 패키징 능력을 파괴한다는 점이 판별되었다. 돌연변이된 파지의 유도로, 자생 파지 대 돌연변이된 파지의 유도에 의해 생성된 세포 용해물의 플라크 검정을 통해 P1 파지 타이터 (titer) 를 비교하여 측정한 바, 자손 파지가 제거되었다. 나아가, pacA 유전자를 발현하는 보상성 플라스미드를 P1 돌연변이체 용원에 도입하여, 돌연변이 파지를 형질전환체로부터 유도하는 경우, 형질도입 입자는 세포 용해물에서 회수되지 않았으며, 이는 파지가 pacA 유전자 및 pac-부위를 보상함에도 불구하고, 보상성 플라스미드를 패키징할 수 없음을 시사한다.
보상성 플라스미드의 구축: 보상성 플라스미드는 넓은 그람-음성 활성을 보이는 pBHR1 복제 기점, 스펙티노마이신에 대한 선택성 마커, 자생 박테리오파지 P1 pacA 및 pacB 유전자 (자생 pacA 유전자 프로모터 서열과 작동적으로 연결) 구성성 블라스티실린 (blasticillin) 프로모터 (Pblast) 에 작동적으로 연결된 알리비브리오 피스세리 (Aliivibrio fischeri) 로부터의 luxA 및 luxB 유전자, 및 C1 억제자-제어된 P53 프로모터, 프로모터 P53 안티센스, repL 유전자, 및 kilA 유전자의 프레임 내 결실을 포함하는 P1 세포용해 레플리콘을 포함한다.
상기 플라스미드는 자생 공급원으로부터 PCR 을 통해서 또는 유전자 합성을 통해서 카세트를 얻고, 전통적인 제한 효소-기반 클로닝이나 Gibson 조립과 같은 대안적 기술을 통해서 벡터를 조립하는 것을 포함하는 당업자에게 알려진 여러 방식으로 구축될 수 있다.
보상-기반 패키징 시스템: 패키징 시스템은 보상성 플라스미드로 보상된 pacA 돌연변이 균주 1505 를 포함한다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 이 시스템의 구축 방식은 보상성 플라스미드로 1505 의 형질전환을 수반할 수 있다. 보상성 플라스미드는 10 ug/mL 의 스펙티노마이신의 존재 하에서 형질전환체를 성장시킴으로써 형질전환된 1505 의 배양물에서 유지될 수 있다.
플라스미드 DNA 를 보유하는 형질전환 입자의 제조: 보상성 플라스미드를 보유하는 비-복제 형질도입 입자는 42℃ 에서 열 유도를 통해 1505 형질전환체로부터 제조할 수 있다. 42℃ 에서의 인큐베이션으로, P1 용균 주기의 유도를 도모하고, 여기서 프로파지가 파지 구조 요소를 생성하고, 자손 파지 입자 내 세포 용해 레플리콘에 의해 형성된 보상성 플라스미드 콘카타머 DNA 를 패키징한다. pacA 및 pacB 유전자 양자 모두가 박테리오파지 게놈에서 파괴될 때, 형질도입 입자의 제조를 도모하지 않는 pacA 유전자만을 발현하는 보상성 플라스미드를 이용하는 보상과는 달리, pacA 및 pacB 유전자 양자 모두를 발현하는 보상성 플라스미드는 비-복제 형질도입 입자를 함유하는 세포 용해물을 도모하는데, 그 각각은 보상성 플라스미드의 선형 콘카타머를 보유하는 박테리오파지 P1 입자로 이루어지므로, 그리하여, 상기 보상성 플라스미드가 성공적으로 패키징 파괴를 보상한다는 점이 입증된다.
실시예 2: 개선된 대립유전자 교환-기반 파괴/보상 패키징 시스템
터미나아제 유전자 pacA 및 pacB 를 포함하는 엔테로박테리아세아에 박테리오파지 P1 를 이용하는 실시예에서, PacA 및 PacB 에 의해 매개된 전반적인 터미나아제 기능 및/또는 pacB 발현을 또한 파괴하는 극성 효과를 유발하는 방식으로 pacA 를 파괴하였다. kan 및 luxAB 를 pacA 유전자좌에 삽입한 최종 구축물은 SEQ ID N0:12 에 포함된다.
이어서, pacAB 파괴된 박테리오파지 게놈을, 도 2 에 도시한 플라스미드로 보상하였다. 도 4 는 파괴된 pacA 유전자를 갖는 박테리오파지 P1 으로 용원화된 이.콜라이 세포로 구성된 패키징 시스템의 설계 및 기능을 도시한다. 세포는 또한 pacA 및 pacB 유전자를 함유하는 플라스미드를 함유했다. 이 실시예에서, 플라스미드 내 pacA 및 pacB 유전자는 엔테로박테리아세아에 박테리오파지 P1 로부터 유래되었다. 돌연변이된 바이러스가 용균 주기 하에 있는 경우, 바이러스 패키징 단백질은 보상성 플라스미드로부터 생성되고, 이의 패키징 개시 부위로 인해 패키징 유닛으로 플라스미드 DNA 의 레플리콘이 패키징되며, 복제된 플라스미드 DNA 를 보유하는 비-복제 형질도입 입자가 생성되었다.
이들 결실 보상 시스템에서, 하기를 포함하는 2 종의 형질도입 입자가 생성되었다: (1) 플라스미드 DNA 를 보유하는 비-복제 형질도입 입자 및 (2) P1 DNA 를 보유하는 비-복제 형질도입 입자 (이때, 후자는 플라스미드 DNA 와 P1 DNA 사이의 재조합으로 인해 제조될 수 있음). P1 돌연변이체가 pacA 유전자 내 삽입된 luxAB 를 함유하지 않는 경우, P1 DNA 를 보유하는 비-복제 형질도입 입자는 이들 형질도입 입자가 DNA 를 표적 세포로 전달할 때 신호 발생에 기여하지 않았다. 그러나, P1 돌연변이체가 pacA 유전자에 삽입된 luxAB 를 함유하는 경우, P1 DNA 를 보유하는 비-복제 형질도입 입자는 이들 형질도입 입자가 DNA 를 표적 세포에 전달하는 경우 신호 발생에 기여하였다 (도 10 참조).
따라서, luxAB 유전자를 P1 게놈에 삽입해 본원에 기재된 시스템을 도출하는 시스템 NRTP 로 혼입시킨 경우, 개선된 비-복제 형질전환 입자 리포터 시스템이 제공되었다.
하기는 이 실시예에 기재된 비-복제 형질도입 입자의 제조를 위한 대립유전자 교환-기반 파괴/보상-기반 패키징 시스템의 설계 및 구축에 대한 추가 상세 사항을 제공한다.
패키징 시스템 개발에 사용된 재료를 이하에 열거한다:
박테리아 균주:
* N1706, 이. 콜라이 K-12 P1 c1-100 Tn9 용원
벡터:
* Y14439 (pBHR1 백본)
다음의 GenBank 수탁 번호 (N.B., 수탁 번호로서 인용된 서열은 본 출원의 우선일 현재 데이터베이스에 기록된 것들이다) 또는 SEQ ID NOs.가 벡터 백본 및 카세트 서열에 사용될 수 있다:
* X06758 (박테리아 루시퍼라아제 유전자 luxAB)
* SEQ ID NO: 1 (자생 pacA 유전자 프로모터를 포함하는 자생 P1 pacA 및 pacB 유전자)
* SEQ ID N0:2 (C1 억제자-제어된 P53 프로모터, 프로모터 P53 안티센스, repL 유전자, 및 kilA 유전자의 프레임 내 결실을 함유하는 P1 세포용해 레플리콘)
* SEQ ID NO:11 (luxAB 발현을 구동하는 Pblast 프로모터)
N1706 (pacA::Kan luxAB): 균주 1525 로도 공지된 pacA 돌연변이된 균주의 구축을 이하와 같이 수행하였다:
돌연변이된 pacA 서열의 예시적 서열은 SEQ ID NO: 12 에 나타낸다. SEQ ID NO: 12 에서 제공된 바와 같은 pacA 돌연변이된 서열을, 그 자신을 pacA 유전자의 서열에 인접시키는 pacA 유전자 서열에 의해 인접되고 Pblast 프로모터의 제어 하 카나마이신 내성 유전자 (Kan) 및 luxAB 유전자를 포함하는 대립유전자 교환 기질을 구축함으로써 제조했다. 대립유전자 교환 기질을, 유전자 합성을 통해 제조했다. 이어서, N1706 에서 자생 pacA 서열을, 대립유전자 교환을 통해 Kan 및 luxAB 유전자의 삽입을 통해 대체하였다. 파괴는 또한 돌연변이된 P1 파지의 DNA 패키징 능력을 파괴한다는 점이 판별되었다. 돌연변이된 파지의 유도로, 자생 파지 대 돌연변이된 파지의 유도에 의해 생성된 세포 용해물의 플라크 검정을 통해 P1 파지 타이터를 비교하여 측정한 바, 자손 파지가 제거되었다.
보상성 플라스미드의 구축: 보상성 플라스미드는 넓은 그람-음성 활성을 보이는 pBHR1 복제 기점, 스펙티노마이신에 대한 선택성 마커, 자생 pacA 유전자 프로모터 서열에 작동적으로 연결된 자생 박테리오파지 P1 pacA 및 pacB 유전자, 구성성 블라스티실린 프로모터 (Pblast) 에 작동적으로 연결된 알리비브리오 피스세리 유래의 luxA 및 luxB 유전자, C1 억제자-제어된 P53 프로모터, 프로모터 P53 안티센스, repL 유전자 및 kilA 유전자의 프레임 내 결실을 함유하는 P1 세포용해 레플리콘를 함유한다.
상기 플라스미드는 자생 공급원으로부터 PCR 을 통해서 또는 유전자 합성을 통해서 카세트를 얻고, 전통적인 제한 효소-기반 클로닝이나 Gibson 조립과 같은 대안적 기술을 통해서 벡터를 조립하는 것을 포함하는 당업자에게 알려진 여러 방식으로 구축될 수 있다.
보상-기반 패키징 시스템: 패키징 시스템은 보상성 플라스미드로 보상된 pacA 돌연변이 균주 1525 를 포함한다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 이 시스템의 구축 방식은 보상성 플라스미드로 균주 1505 을 형질전환시켜 달성할 수 있다. 보상성 플라스미드는 10 ug/mL 의 스펙티노마이신의 존재 하에서 형질전환체를 성장시킴으로써 형질전환된 1505 의 배양물에서 유지될 수 있다.
플라스미드 DNA 를 보유하는 형질도입 입자의 제조: 보상성 플라스미드를 보유하는 비-복제 형질도입 입자는 42℃ 에서 열 유도를 통해 1525 형질전환체로부터 제조할 수 있다. 42℃ 에서의 인큐베이션으로, P1 용균 주기의 유도를 도모하고, 여기서 프로파지가 파지 구조 요소를 생성하고, 자손 파지 입자 내 세포 용해 레플리콘에 의해 형성된 보상성 플라스미드 콘카타머 DNA 를 패키징한다. pacA 및 pacB 유전자 양자 모두를 발현하는 보상성 플라스미드는 비-복제 형질도입 입자를 함유하는 세포 용해물을 도모하고, 이들 각각은 보상성 플라스미드의 선형 콘카타머를 보유하는 박테리오파지 P1 입자로 이루어지므로, 그리하여 상기 보상성 플라스미드가 성공적으로 패키징 파괴를 보상한다는 점이 입증된다.
플라스미드 DNA 를 보유하는 형질도입 입자에 더해, 시스템은 P1 DNA 를 보유하는 형질도입 입자를 생성한다. P1 DNA 를 보유하는 형질도입 입자는 플라스미드 DNA 와 P1 DNA 사이의 재조합을 통해 발생할 수 있다. P1 DNA 를 보유하는 형질도입 입자의 존재는, 이 시스템으로부터의 세포 용해물에 표적 세포를 노출시키고, 카나마이신을 혼입한 선택적 배지 상에서 번식하는 형질도입된 세포의 존재를 스크리닝함으로써 평가하는 한편, 스펙티노마이신 내성을 기반으로 하는 유사 방법으로 플라스미드 DNA 를 보유하는 형질도입 입자를 평가하였다. 도 10 은 형질도입된 세포의 콜로니로부터 광 생성 (RLU) 를 측정하여 수득된 데이타 표를 나타낸다. 스펙티노마이신에 내성인 세포 (SpecR) 는 플라스미드 DNA 로 형질도입되어 있는 반면에, 카나마이신에 내성인 세포 (KanR) 는 P1 DNA 로 형질도입되었다. 1505 로부터의 데이타는 P1 게놈 내에 luxAB 이 혼입되어 있지 않는 패키징 라인으로부터 수득한 반면, 1525 로부터의 데이타는 P1 게놈 내 삽입된 luxAB 를 갖는 패키징 라인으로부터 수득하였다. 데이타에서 볼 수 있듯이, 모든 SpecR 형질도입체는 빛을 생성시키지만, KanR 형질도입체 전부는 오직 1525 로부터 형질전환된 것에 있어서만 빛을 발생시켰다.
이와 같이, 1525 는 개선된 비-복제 형질도입 입자-기반 리포터 시스템을 나타내고, 여기서 플라스미드 DNA 와 바이러스 DNA 양자 모두를 보유하는 형질도입 입자는 빛을 생성시킬 수 있다.
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SEQUENCE LISTING <110> GENEWEAVE BIOSCIENCES, INC. <120> NON-REPLICATIVE TRANSDUCTION PARTICLES AND TRANSDUCTION PARTICLE-BASED REPORTER SYSTEMS <130> 28421-29681/PCT <140> <141> <150> 62/202,653 <151> 2015-08-07 <150> 62/041,539 <151> 2014-08-25 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2733 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Enterobacteriaceae bacteriophage P1 sequence <400> 1 atgtgacttt cgttaccctc gcgtcaaaaa gagtttttac gaaaggaagc ataagtgacc 60 tgggacgatc acaagaagaa ttttgctcgc ctggcgcgag atggtggtta caccatcgca 120 cagtatgccg ccgagtttaa tcttaaccct aataccgcac gtcgttatct ccgtgccttc 180 aaagaagaca ccaggactac ggacagccgc aagccaaata agccagtcag gaagccacta 240 aaaagcatga tcattgatca ctctaatgat caacatgcag gtgatcacat tgcggctgaa 300 atagcggaaa aacaaagagt taatgccgtt gtcagtgccg cagtcgagaa tgcgaagcgc 360 caaaataagc gcataaatga tcgttcagat gatcatgacg tgatcacccg cgcccaccgg 420 accttacgtg atcgcctgga acgcgacacc ctggatgatg atggtgaacg ctttgaattc 480 gaagttggcg attacctgat 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<220> <223> Description of Unknown: Enterobacteriaceae bacteriophage P1 sequence <400> 6 ctcaattcaa caagtattgt gaggtggtgt tatatgtcag atggataaaa aggaacaagc 60 aaagaaatat tatgaaaaag gttggaaata caaggatatt tccgaaaagc tttctgtacc 120 tctcaacaca ttgaagtcat ggagaaaacg tgataaatgg gaaagagggg gtgcaaccaa 180 agaggtgcaa cctacaaata ggggtgcacc taaaggtaat caaaatgcta taggcaataa 240 aggtaatagt cgagcctcgc caccaaaaag aaataagaat gctgttaaaa ctggcgaata 300 cgaaacaata tttgccgata tgttatctga cgaagaaaag gacatctatt ctactatgaa 360 tgatgatcct ttttttattt tggatgaaga aataagaatc ctgaaaattc gccaatatag 420 aatgcttaaa cgcataaaag atgcagaggc tggcttaaat gatgaagaag ttgaacgttt 480 gcagcagctt cgcaaagtta aagagccatc ggtaattgat gggaaaatgg ttactgttaa 540 gagagaagtt ttaaaagatg tacaagtcac tcgtaaaaca tttagaaagt tagatgacat 600 cctggctatt gaagatgcgt tgactcgcgt tagcaatcaa ttaataaagg cgattaagca 660 acaaaaagaa ttattgtcga cagataaaaa atctctttta atggaggctc aaattgagaa 720 gataaagctt gagacagaca aattaagtgg cggatcatct aacgatgaag ctgactcttg 780 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gggcaggtgg cgtttgtgta aagcaaatcg 60 acacaatcca aaggggataa aaggggaaag tgaaacttcc cccttttcaa gccacattgt 120 aatacaagaa cgaagtgttt tgtattacaa tgtgatagct tgcagtattt atggttttat 180 atggtctatt ttgttgtgag gattgtaacc gaatagggcg caatgcttat tacaaaatca 240 atgacaaagg gcgattgagg aatgagcgct gaggcatttt atctttgagt aagttattga 300 tggatcagaa aaatgtatca caaattgaaa caaagactca ctcatttaag agaagctact 360 atcatgaaat tttgttgttg tgataagcaa cttctaatac acgattttta gccattacat 420 cactcgtttt tagagtgatg tgtaagtgcg cattgcactc tttttttacg aaacaagccg 480 accagcgttt gaaacttttt agtttttcat cattctattt taaaacgttc taaaactcga 540 tttaagcgac tttaattcga aactgtctat ttgttcaaag ggagcattaa gaatgcttaa 600 acgagctttt aagggggttt aaattgattt tgaattgaat agcttgttgt aagttgtaaa 660 aaaaacaagt taaacaaagt atcagttttc catttaaggg ttgttagggc ttgccctgac 720 cgtctgtaag acgcttgatt gcatgatatg agtatttagc tagtcaaaca gttaaaacag 780 cttatatgag caattagagg gaatccaata aattcctaaa agcggttttg atcttttctt 840 ttagcgagtg aacgctgcaa gtaaaatgtg agcgttcact cgctcactcc 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tcgaaacaaa cgcgacaaaa attaacctga gttctttttg aggacaaaaa 960 agaaagacag tagttccagc tactgttttt tttgcgttgt gctattcgtt tcctagaact 1020 tctagcgtta aaattattat accacgtttg gatttagaaa gtcaaaattt gaggttttag 1080 gggtgaattt ttcgtgaaac gaaaaagagg gctgaaaagc ccttaaaaac ccaattgcgt 1140 agcaagggtt ttttcttatc ttgatacata tagaaataat gagttttttt attttcttgt 1200 tttaaagcac ctcaaaccct tgatattgct gggtttttag gtaacaaaaa agcccttgca 1260 atttaataaa ataaagttta taatttaagt gtccaattta aaataataaa cttaggagaa 1320 ttgcaggaac ttttttatat actcaaaaaa atttttttgc aagaaaatta taacatgaca 1380 ggtactgaaa atcaagtctt taaggactat tctaagaatg gcaaagatag aaagtggcga 1440 gaacgcaagt taaaaaatat tgagcttgct ggtcgtttag agcgtttagg atatcgttcg 1500 tttgaacggg tctatcaatg tgccgaagtg ttgaagttta tcgaacaaca agacggcacg 1560 aaaaaactct atcagtctta tttttgcaaa aataagctct gcccaatttg taactggaga 1620 cggtcaatga agtatgctta tcaagctgaa ttagtggtaa atgaagcaat gaaacgctat 1680 ccaaaaggtc gctttctctt tttgaccttg acgattaaga acattagtgg tgaaaaatta 1740 aataaatcaa 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 11 cgtcaggtgg cacttttcgg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat tttctaaata 60 cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 120 aaaggaagag t 131 <210> 12 <211> 6145 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (2860)..(2860) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 12 atgtgacttt cgttaccctc gcgtcaaaaa gagtttttac gaaaggaagc ataagtgacc 60 tgggacgatc acaagaagaa ttttgctcgc ctggcgcgag atggtggtta caccatcgca 120 cagtatgccg ccgagtttaa tcttaaccct aataccgcac gtcgttatct ccgtgccttc 180 aaagaagaca ccaggactac ggacagccgc aagccaaata agccagtcag gaagaagaga 240 aagcaggtag cttgcagtgg gcttacatgg cgatagctag actgggcggt tttatggaca 300 gcaagcgaac cggaattgcc agctggggcg ccctctggta aggttgggaa gccctgcaaa 360 gtaaactgga tggctttctt gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc aagatctgat 420 caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct 480 ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc 540 tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc 600 gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc 660 acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg 720 ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat cccaccttgc tcctgccgag 780 aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc 840 ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt 900 cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc 960 gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc 1020 tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg 1080 ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag 1140 cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg 1200 cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gaattgaaaa aggaagagta 1260 tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 1320 tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 1380 gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 1440 aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 1500 gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 1560 ttgagtactc gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 1620 ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 1680 aataatattg aaaaaggaag agtatgaagt ttggaaatat ttgtttttcg tatcaaccac 1740 caggtgaaac tcataagcaa gtaatggatc gctttgttcg gcttggtatc gcctcagaag 1800 aggtagggtt tgatacatat tggaccttag aacatcattt tacagagttt ggtcttacgg 1860 gaaatttatt tgttgctgcg gctaacctgt taggaagaac taaaacatta aatgttggca 1920 ctatgggggt tgttattccg acagcacacc cagttcgaca gttagaagac gttttattat 1980 tagatcaaat gtcgaaaggt cgttttaatt ttggaaccgt tcgagggcta taccataaag 2040 attttcgagt atttggtgtt gatatggaag agtctcgagc aattactcaa aatttctacc 2100 agatgataat ggaaagctta cagacaggaa ccattagctc tgatagtgat tacattcaat 2160 ttcctaaggt tgatgtatat cccaaagtgt actcaaaaaa tgtaccaacc tgtatgactg 2220 ctgagtccgc aagtacgaca gaatggctag caatacaagg gctaccaatg gttcttagtt 2280 ggattattgg tactaatgaa aaaaaagcac agatggaact ctataatgaa attgcgacag 2340 aatatggtca tgatatatct aaaatagatc attgtatgac ttatatttgt tctgttgatg 2400 atgatgcaca aaaggcgcaa gatgtttgtc gggagtttct gaaaaattgg tatgactcat 2460 atgtaaatgc gaccaatatc tttaatgata gcaatcaaac tcgtggttat gattatcata 2520 aaggtcaatg gcgtgatttt gttttacaag gacatacaaa caccaatcga cgtgttgatt 2580 atagcaatgg tattaaccct gtaggcactc ctgagcagtg tattgaaatc attcaacgtg 2640 atattgatgc aacgggtatt acaaacatta catgcggatt tgaagctaat ggaactgaag 2700 atgaaataat tgcttccatg cgacgcttta tgacacaagt cgctcctttc ttaaaagaac 2760 ctaaataaat tacttatttg atactagaga taataaggaa caagttatga aatttggatt 2820 attttttcta aactttcaga aagatggaat aacatctgan gaaacgttgg ataatatggt 2880 aaagactgtc acgttaattg attcaactaa atatcatttt aatactgcct ttgttaatga 2940 acatcacttt tcaaaaaatg gtattgttgg agcacctatt accgcagctg gttttttatt 3000 agggttaaca aataaattac atattggttc attaaatcaa gtaattacca cccatcaccc 3060 tgtacgtgta gcagaagaag ccagtttatt agatcaaatg tcagagggac gcttcattct 3120 tggttttagt gactgcgaaa gtgatttcga aatggaattt tttagacgtc atatctcatc 3180 aaggcaacaa caatttgaag catgctatga aataattaat gacgcattaa ctacaggtta 3240 ttgtcatccc caaaacgact tttatgattt tccaaaggtt tcaattaatc cacactgtta 3300 cagtgagaat ggacctaagc aatatgtatc cgctacatca aaagaagtcg tcatgtgggc 3360 agcgaaaaag gcactgcctt taacatttaa gtgggaggat aatttagaaa ccaaagaacg 3420 ctatgcaatt ctatataata aaacagcaca acaatatggt attgatattt cggatgttga 3480 tcatcaatta actgtaattg cgaacttaaa tgctgataga agtacggctc aagaagaagt 3540 gagagaatac ttaaaagact atatcactga aacttaccct caaatggaca gagatgaaaa 3600 aattaactgc attattgaag agaatgcagt tgggtctcat gatgactatt atgaatcgac 3660 aaaattagca gtggaaaaaa cagggtctaa aaatatttta ttatcctttg aatcaatgtc 3720 cgatattaaa gatgtaaaag atattattga tatgttgaac caaaaaatcg aaatgaattt 3780 accataaagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atgggcccac cggaccttac 3840 gtgatcgcct ggaacgcgac accctggatg atgatggtga acgctttgaa ttcgaagttg 3900 gcgattacct gatagataac gttgaagcgc ggaaggccgc gcgcgctatg ttgcgtcggt 3960 ccggggccga tgttctggaa accactcttc tggaaaagtc tctttctcat ctccttatgc 4020 tggagaacgc cagggatacg tgtattcgcc tggtgcagga aatgcgcgat cagcaaaaag 4080 acgatgatga aggtactccg cctgaatacc gtatcgcgag catgctaaac agctgttccg 4140 cgcagataag cagcctgatc aacaccattt acagcatccg gaataactat cgaaaagaaa 4200 gccgggaggc ggaaaagcac gctttatcta tggggcaagc tggcattgtt aagctggcat 4260 acgaacgaaa gcgtgaaaat aactggtcag tgctggaagc ggctgaattc atcgaggcgc 4320 atggaggaaa agtgccgccc ctgatgctgg agcaaatcaa agccgatctg cgtgctccta 4380 agaccaatac cgatgatgag gaaaaccaaa cagcatctgg cgctccatca cttgaagatc 4440 tggataaaat cgcgcgagaa cgggccgcca gccgccgcgc tgatgccgca ttgtggattg 4500 agcatcgtag agaagaaatt gccgatatcg tcgatacagg tggttatggt gatgtcgatg 4560 cggaaggcat atcaaacgaa gcatggcttg aacaggatct ggacgaagac gaggaggaag 4620 acgaagaagt tacccgcaaa ctgtacgggg atgatgatta atggccagaa gttgcgtaac 4680 ggacccacgt tggcgcgagc ttgtggcgct atatcgttat gactggattg cggccgctga 4740 tgtgttgttt gggaagacac caacctggca gcaggatgag atcattgagt ccacgcagca 4800 ggacggcagt tggacaagtg tgacctccgg ccatggtact ggtaaatcgg atatgacgag 4860 tatcattgca atactcttca tcatgttttt ccccggcgct cgcgtcattc tggtcgctaa 4920 caaaagacag caagtccttg atggtatttt caaatacata aagagcaatt gggctactgc 4980 tgttagcaga ttcccgtggt tgtcgaagta tttcattctt acagaaacgt ctttttttga 5040 ggtgactggc aagggtgttt ggacaatatt gataaagtcc tgtcgtcccg gaaatgagga 5100 ggcgttggct ggtgaacacg ccgatcatct cttgtatatc atcgacgaag cgtcgggtgt 5160 gagtgataaa gcattcagtg tgataacagg tgcgctgacc ggtaaggata accgtattct 5220 gcttctttcc cagcctacgc gaccttcagg ctatttctac gattcacacc acagactagc 5280 tattcgcccg ggaaatcctg atggattgtt tactgcgata atactgaata gtgaagaatc 5340 tccgcttgta gatgcaaaat ttatacgagc aaaacttgcg gagtatggcg gtcgtgataa 5400 ccccatgtac atgatcaaag tacgtggtga atttcccaaa tctcaagatg gctttcttct 5460 tggtcgtgat gaggttgagc gggcgacgcg gcgaaaggtc aagattgcca aaggatgggg 5520 ctgggttgca tgtgttgacg ttgctggtgg cacaggacga gataagtccg ttattaatat 5580 catgatggtg tccggccagc gaaataaacg ccgtgtaatc aactatcgta tgctggaata 5640 cacagacgtt acagaaacgc agttagccgc caagattttc gcagaatgta acccagaacg 5700 gttcccgaac ataaccatag ctattgatgg cgatggcttg gggaaatcga cggctgatct 5760 aatgtacgaa cgctatggca ttaccgtcca gcgtatccgc tggggtaaaa agatgcacag 5820 ccgtgaagat aaaagccttt atttcgatat gcgcgctttc gcgaatattc aggcggcaga 5880 agctgtaaaa tcagggcgta tgaggcttga taagggggct gcgactatag aggaagcatc 5940 aaagataccg gtagggataa attccgcagg tcaatggaag gtgatgtcaa aggaagatat 6000 gaagaaaaaa ctcaacctgc actcaccgga ccattgggat acatattgtt tcgctatgtt 6060 ggcgaactat gttccccaag atgaagtgct tagcgtcgaa gacgaagcgc aggttgatga 6120 agctctggca tggcttaatg aataa 6145

Claims (75)

  1. 파괴를 포함하는 pacA, terA 및 terS 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 제 1 터미나아제 유전자를 포함하는 박테리오파지 게놈으로서, 여기서 파괴는 결실, 삽입, 돌연변이 또는 대체를 통하는 것이고, 이때 파괴 부재시, 제 1 터미나아제 유전자는 터미나아제 활성의 제 1 성분을 인코딩하며 (encode) 제 1 패키징 개시 부위 서열을 포함하고, 터미나아제 활성은 제 1 패키징 개시 부위를 인지하고, 파괴는 터미나아제 활성에 의한 제 1 패키징 개시 부위 서열의 인지를 방해하고, 파괴는 터미나아제 활성 수준을 감소시키는, 박테리오파지 게놈; 및
    리포터 유전자, 터미나아제 활성의 제 1 성분을 인코딩하는 pacA, terA 및 terS 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 제 2 유전자, 및 터미나아제 활성의 제 2 성분을 인코딩하는 pacB, terB 및 terL 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 제 3 유전자를 포함하는 리포터 핵산 분자로서, 이때 제 2 유전자는 비-파괴된 제 1 패키징 개시 부위 서열을 포함하고, 제 1 패키징 개시 부위 서열은 NRTP 내 리포터 핵산 분자의 레플리콘의 패키징을 촉진하도록 배치되는, 리포터 핵산 분자
    를 포함하는 박테리아 세포 내 도입을 위한 비-복제 형질도입 입자 (NRTP) 내 리포터 핵산 분자를 패키징하기 위한 박테리아 세포 패키징 시스템으로서, 상기 패키징 시스템은 숙주 세포를 포함하는, 박테리아 세포 패키징 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서, 박테리오파지는 복수의 파괴된 터미나아제 유전자를 포함하고, 파괴 부재시, 각각은 터미나아제 활성의 성분을 인코딩하고, 박테리오파지 상 복수의 파괴된 터미나아제 유전자들 각각은 리포터 핵산 분자에 의해 인코딩된 비-파괴된 유전자에 의해 보상되는(complemented), 박테리아 세포 패키징 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서, 제 2 유전자 및 제 3 유전자는 조건부 프로모터 (conditional promoter) 에 작동적으로 연결된, 박테리아 세포 패키징 시스템.
  4. 제 3 항에 있어서, 조건부 프로모터는 박테리오파지 게놈의 터미나아제 유전자의 자생 (native) 프로모터인, 박테리아 세포 패키징 시스템.
  5. 제 3 항에 있어서, 제 2 유전자 또는 제 3 유전자의 발현은 박테리오파지의 용균 주기의 활성화 부재시에 억제되고, 제 2 유전자 또는 제 3 유전자의 발현은 박테리오파지의 용균 주기의 활성화 때 활성화되는, 박테리아 세포 패키징 시스템.
  6. 제 1 항에 있어서, 박테리오파지 게놈은 검출가능한 마커 또는 선택성 마커를 인코딩하는 리포터 유전자를 포함하고, 리포터 유전자는 구성성 프로모터에 작동적으로 연결된, 박테리아 세포 패키징 시스템.
  7. 제 1 항에 있어서, 파괴는 선택성 마커를 인코딩하는 유전자로의 제 1 패키징 개시 부위 서열의 대체 또는 이 내로의 삽입을 포함하고, 선택성 마커를 인코딩하는 유전자는 구성성 프로모터에 작동적으로 연결된, 박테리아 세포 패키징 시스템.
  8. 제 1 항에 있어서, 파괴는 검출가능한 마커를 인코딩하는 유전자로의 제 1 패키징 개시 부위 서열의 대체 또는 이 내로의 삽입을 포함하는, 박테리아 세포 패키징 시스템.
  9. 제 1 항에 있어서, 리포터 핵산 분자는 복제 기점을 포함하는, 박테리아 세포 패키징 시스템.
  10. 제 1 항에 있어서, 리포터 핵산 분자의 레플리콘은 비-복제 형질도입 입자로 패키징될 수 있는 콘카타머를 포함하는, 박테리아 세포 패키징 시스템.
  11. 제 1 항에 있어서, 비-파괴된 제 1 패키징 개시 부위 서열은 콘카타머 접합부를 포함하는, 박테리아 세포 패키징 시스템.
  12. 제 1 항에 있어서, 리포터 핵산 분자는 cis-억제 서열을 포함하는 핵산 전사체 서열을 포함하는, 박테리아 세포 패키징 시스템.
  13. 제 1 항에 있어서, 리포터 핵산 분자가 앱타머(aptamer)를 포함하는, 박테리아 세포 패키징 시스템.
  14. 비-복제 형질도입 입자 내로 리포터 핵산 분자를 패키징하는 방법으로서,
    상기 리포터 핵산 분자와 패키징된 비-복제 형질도입 입자를 생성하기 위해 박테리오파지 게놈의 용균기를 유도하는 조건을 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 박테리아 세포 패키징 시스템에 제공하고; 및
    리포터 핵산 분자를 포함하는 비-복제 형질도입 입자를 수집하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제 14 항의 방법으로부터 생성된 리포터 핵산 분자의 레플리콘을 포함하는 비-복제 형질도입 입자를 포함하는 조성물.
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