KR101891296B1

KR101891296B1 - 키티노파가 속 hk235 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 분획물을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물

Info

Publication number: KR101891296B1
Application number: KR1020170087707A
Authority: KR
Inventors: 김헌; 김다연; 최경자; 한재우; 장경수; 최용호; 최정섭
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2017-07-11
Filing date: 2017-07-11
Publication date: 2018-08-24

Abstract

본 발명은 키티노파가 속 HK235 균주, 이의 배양액 및 상기 배양액의 분획물을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것으로 본 발명에 의한 키티노파가 속 HK235 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 분획물은 도열병, 잎집무늬마름병, 잿빛곰팡이병, 역병, 흰가루병, 붉은 녹병 및 탄저병과 같이 작물생산에 있어 중요한 식물병에 대하여 방제 효과를 나타내므로 이를 식물병 방제용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

키티노파가 속 HK235 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 분획물을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물 {Composition for controlling plant diseases including Chitinophaga sp. HK235 strain and its culture broth, its fraction as an active ingredient}

본 발명은 키티노파가 속 HK235 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 분획물을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것이다.

작물 생산에 있어 각종 식물병원균, 해충 및 잡초가 작물의 생육을 저해하고, 수확량 감소를 일으키므로 이의 방제는 농업에 있어 중요한 부분으로 존재한다. 현대 농업에서 대부분의 방제용 약제는 화학적으로 합성된 약제를 이용하고 있으며, 합성농약의 사용은 작물의 생산성을 크게 높였으나, 이는 광범위한 다년간의 합성농약 사용으로 인해 약제 저항성 유해생물의 출현빈도가 증가하고 있고, 잔류 농약의 인간 및 동물 독성과 환경오염 및 생태계 교란에 대한 우려가 커지고 있다. 이에, 한국을 포함한 OECD 가입국을 중심으로 합성농약 사용에 대한 정책적인 규제가 강화되고 있다. 미국화학협회의 화학정보데이터베이스(CAS)에 등록된 수백만 종의 화합물을 군집분석하면 단 몇백 종의 선도물질 군으로 분류할 수 있는데, 선도물질을 기준으로 규제가 강화되면, 향후 사용할 수 있는 합성농약의 수는 급감하게 될 수밖에 없다. 상기한 바와 같이 합성농약의 환경 친화적이지 못한면과 안전성 우려 및 해충의 저항성 발현 문제등으로 인해도 있어 합성 제재를 대체할 수 있는 천연 성분의 친환경 활성 물질에 대한 수요가 존재하고 있다. 또한. 합성농약 사용을 감축하고자 하는 친환경농업정책과 더불어 새로운 친환경적인 방제 수단에 대한 수요가 증가하고 있다.

생물농약(biopesticide)은 합성농약과는 달리 인간과 동물 및 생태계에 미치는 영향이 적은 환경친화적인 작물보호제로서, 유기농산물 같이 부가가치가 높은 농산물을 생산하는데 이용할 수 있고, 합성농약으로 방제가 어려운 병해충을 효과적으로 방제하는데 이용될 수 있다. 생물농약에는 미생물의 기능을 활용하는 미생물농약과 미생물이나 식물에서 유래한 대사물질을 활용하는 생화학농약이 있다. 세계 농약의 20%를 생물농약으로 대체하자는 ‘리우환경회의 협약’ 이후 친환경 천연물 농약 개발이 주목을 받고 있다. Global Biopesticide Market(2016-2021)에 의하면 2015년 37억 달러였던 글로벌 생물농약시장은 매년 14.1% 정도 성장하여 2021년에는 77억 달러에 이를 것으로 전망 되고 있어 생물농약의 수요는 지속적으로 존재하고 있다. 2016년 3월 기준으로 총 427종이 병해충 방제용 생물농약으로 공시되어 있고, 이 가운데 식물 추출물이 204종, 미생물추출물 10종, 미생물제제 62종으로 알려져있다.

키티노파가(Chitinophaga) 속 균주는 사상형의 키틴 분해 능력을 가진 그람음성 토양세균으로 과거 플렉시박터(Flexibacter), 플라보박테리움(Flavobacterium), 사이토파카(Cytophaga)로 분류되었던 균주를 포함하며, 키티노파가 균주에서 유래하는 다양한 기능의 펩타이드가 보고된 바 있다. 대한민국 등록특허 제10-173956호에서는 항산화, 주름개선 및 미백 효능에 더불어 방부효능을 갖는 신규한 균주를 이용한 화장료를 개시하고 있으며, 국제 공개특허 제2016-045783호에서는 키티노파가 유래의 항진균활성을 갖는 펩타이드를 개시하고 있다.

이에 본 발명자들은 환경친화적인 식물병 방제 수단으로서 신규한 키티노파가 균주, 이의 배양액 및 이의 분획물을 이용한 식물방제용 조성물을 완성하였다.

대한민국 등록특허 제10-173956호 국제 공개특허 제2016-045783호

본 발명의 목적은 키티노파가 속 HK235 균주, 이의 배양액 및 상기 배양액의 분획물을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KACC 81044BP로 기탁된 키티노파가 균주 HK235(Chitinophaga sp. HK235) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 키티노파가 균주 HK235, 이의 배양액, 상기 배양액의 분획물로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 키티노파가 균주 HK235, 이의 배양액, 상기 배양액의 분획물로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물병 방제 방법을 제공한다.

본 발명에 의한 키티노파가 속 HK235 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 분획물은 도열병, 잎집무늬마름병, 잿빛곰팡이병, 역병, 흰가루병, 붉은 녹병 및 탄저병과 같이 작물생산에 있어 중요한 식물병에 대하여 방제 효과를 나타내므로 이를 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)에 대한 살균효과를 나타내는 토양세균을 시험한 결과를 나타낸다.
도 2는 한천배지 상에서 순수배양 된 키티노파가 균주 HK235(Chitinophaga sp. HK235, 수탁번호: KACC 81044BP)이다(A: 균총, B: 균주의 주사전자현미경 사진).
도 3은 키티노파가 균주 HK235의 식물병원균에 대한 길항 작용 보여주는 대치배양 결과이다.
도 4는 본 발명에 의한 키티노파가 균주 HK235의 16S rRNA 유전자의 염기서열을 근연한 종들과 대비분석한 결과를 나타낸 계통도이다.
도 5는 키티노파가 균주 HK235의 생장 조건을 비교한 결과이다.
·A: 배지별 생장 비교 (TSB: Tryptic soy broth 배지, LB: Luria broth 배지, MB: malt extract broth 배지, NB: nutrient broth 배지)
·B: 배양온도별 생장 비교
도 6은 본 발명에 의한 키티노파가 균주 HK235 배양여액의 용매 분획물별 토마토 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)에 대한 억제환을 나타낸 결과이다.
·A: 용매분획물별 억제능력 비교(NC: Negative control, Aq: 물 분획물, BuOH: n-부탄올 분획물, EA: 에틸 아세테이트 분획물, Hex: n-헥산 분획물)
·B: 배지별 분획물 비교(TSB: Tryptic soy broth 배지, LB: Luria broth 배지, MB: Malt extract broth 배지, NB: Nutrient broth 배지)
도 7은 본 발명에 의한 키티노파가 균주 HK235의 배양액, 배양여액 및 균체현탁액의 토마토 잿빛곰팡이병 방제활성을 시험한 결과이다. (Culture broth: 배양액, Culture filtrate: 배양여액, Cell: 균체현탁액)
도 8은 본 발명에 의한 부탄올 분획물 및 HP-20 컬럼 분획물의 토마토 잿빛곰팡이병 방제활성을 조사한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 수탁번호 KACC 81044BP로 기탁된 키티노파가 균주 HK235(Chitinophaga sp. HK235) 균주를 제공한다.

또한 본 발명은 수탁번호 KACC 81044BP로 기탁된 키티노파가 균주 HK235, 이의 배양액, 상기 배양액의 분획물로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물병 방제용 조성물을 제공한다.

상기 배양액은 균주를 배양한 배양액 또는 이를 물리적 방법으로 여과한 것이다.

상기 배양액의 분획물은 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 용매로 사용하여 분획된 또는 흡착제를 사용한 컬럼을 사용하여 분획된 것이다.

상기 컬럼에 이용될 수 있는 흡착제는 스티렌-디비닐벤젠, 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄(Toyopearl) 및 XAD 수지를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.

상기 식물병은 도열병균(Magnaporthe oryzae), 잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 역병균(Phytophthora infestans), 흰가루병균(Blumeria graminis) 붉은녹병균(Puccinia recondita) 및 탄저병균(Colletotrichum coccodes)으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상에 의해 발생하는 것이다.

상기 식물은 벼, 토마토, 보리, 밀, 무, 고추 및 토마토로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 식물병 방제용 조성물이다.

본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물은 키티노파가 균주 HK235, 이의 배양액, 상기 배양액의 추출물 또는 상기 추출물에서 분리한 활성 물질의 단순 혼합물일 수 있다. 대안적으로는, 식물병 방제용 조성물은 상기 배양액, 배양액의 추출물 또는 추출물에서 분리한 활성 물질과 불활성 담체를 혼합하고, 상기 혼합물이 유제, 유액, 유동화제, 습윤성 분말, 과립화 습윤성 분말, 분말제, 과립제 등으로 제형화 될 수 있도록 혼합물에 계면활성제 및 필요한 기타 보조제를 첨가함으로써 제조된다. 상기 언급된 식물병 방제용 조성물은 그 자체로서 또는 다른 불활성 성분을 첨가하여 본 발명은 종자 처리제로도 사용될 수 있다.

제형에서 사용될 수 있는 액체 담체의 예는 물; 알콜, 예로 메탄올 및 에탄올; 케톤, 예로 아세톤 및 메틸 에틸 케톤; 방향족 탄화수소, 예로 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 및 메틸나프탈렌; 지방족 탄화수소, 예로 헥산, 시클로헥산, 케로신 및 라이트 오일; 에스테르, 예로 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트; 니트릴, 예로 아세토니트릴 및 이소부티르니트릴; 에테르, 예로 디이소프로필에테르 및 디옥산; 산 아미드, 예로 N,N-디메틸 포름아미드 및 N,N-디메틸아세트아미드; 할로겐화 탄화수소, 예로 디클로로메탄, 트리클로로에탄 및 사염화탄소; 디메틸 술폭시드; 및 식물성 오일, 예로 대두유 및 면실유가 포함될 수 있다.

제형에서 사용될 수 있는 고체 담체의 예는 미세 분말 또는 과립 예컨대 광물 예컨대 카올린 점토, 애터펄자이트 점토, 벤토나이트, 몬트모릴로나이트, 애시드 화이트 점토, 피로필라이트, 탈크, 규조토 및 탈사이트; 천연 유기 물질 예컨대 옥수수 잎대 분말 및 월넛 껍질 분말; 합성 유기 물질 예컨대 우레아; 염 예컨대 탄산 칼슘 및 황산 암모늄; 합성 무기 물질 예컨대 합성 수화 산화 규소를 포함하며; 액체 담체로서, 방향족 탄화수소 예컨대 자일렌, 알킬벤젠 및 메틸나프탈렌; 알코올 예컨대 2-프로판올, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르; 케톤 예컨대 아세톤, 시클로헥사논 및 이소포론; 식물성 오일 예컨대 대두유 및 면실유; 석유 지방족 탄화수소, 에스테르, 디메틸술폭시드, 아세토니트릴 및 물을 포함한다.

계면활성제의 예는 음이온성 계면활성제 예컨대 알킬 술페이트 에스테르 염, 알킬아릴 술포네이트 염, 디알킬술포숙시네이트 염, 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르 포스페이트 에스테르 염, 리그노술포네이트 염 및 나프탈렌 술포네이트 포름알데히드 중축합물; 및 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬폴리옥시프로필렌 블럭 공중합체 및 소르비탄 지방산 에스테르 및 양이온성 계면활성제 예컨대 알킬트리메틸암모늄 염을 포함한다.

다른 제형 보조제의 예는 수용성 중합체 예컨대 폴리비닐 알코올 및 폴리비닐피롤리돈, 다당류 예컨대 아라비아 고무, 알긴산 및 이의 염, CMC (카르복시메틸-셀룰로오스), 잔탄 고무, 무기 물질 예컨대 알루미늄 마그네슘 실리케이트 및 알루미나 졸 (alumina sol), 보존제, 착색제 및 안정화제 예컨대 PAP (산 포스페이트 이소프로필)및 BHT(부틸하이드록리톨루엔)를 포함한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 식물병원균에 대한 방제 효과를 갖는 균주의 선별을 통해 확인된 신규 균주인 키티노파가 균주 HK235(도 1, 도 2 및 도 4)는 균주 자체 및 배양액, 및 이의 분획물에서 식물병원균에 대한 억제 활성을 가지는 것으로 나타났다(표 1 및 2, 도 3 및 도 6 내지 8).

따라서 본 발명에 의한 키티노파가 속 HK235 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 분획물은 식물병 방제에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 수탁번호 KACC 81044BP로 기탁된 키티노파가 균주 HK235, 이의 배양액, 상기 배양액의 분획물로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물병 방제 방법을 제공한다.

상기 처리는 조성물을 식물체에 직접 살포하거나, 식물체가 자라고 있는 토양에 살포하거나 식물체의 배양용 매개체에 살포하는 간접 살포일 수 있다.

본 발명의 방제 방법은 식물의 줄기 및 잎의 처리, 식물이 성장하는 장소 (예를 들어 토양)의 처리, 종자 멸균/종자 코팅과 같은 종자의 처리 및 뿌리의 처리를 포함한다.

본 발명의 방제 방법으로의 줄기 및 잎의 처리로서, 특히, 예를 들어 줄기 및 잎에 분무하는 것과 같은 식물 표면 상의 적용이 포함될 수 있다. 본 발명의 방제 방법으로의 토양의 처리로서, 예를 들어 토양 상 분무, 토양과의 혼합, 액체 처리제의 토양 내로의 살포 (액체 처리제의 관개, 토양 내로의 주입, 액체 처리제의 적하) 가 포함될 수 있으며, 처리되는 장소의 예는 재식혈 (planting hole), 고랑, 재식혈 주변, 심을골 (planting furrow) 주변, 성장 부위의 전체 표면, 토양과 식물 사이 부분, 뿌리 사이 부위, 식물체의 줄기 밑 부위, 주 고랑, 성장 토양, 못자리. 모 재배용 상자, 모 재배용 트레이, 모판을 포함한다. 처리는 살포 전, 살포 시, 살포 직후, 모의 재배 기간 동안, 재배 정착 전, 재배 정착시 및 재배 정착 후 성장 시기에 수행될 수 있다. 상기 언급한 토양 처리에서, 유효 성분이 식물이 동시에 적용될 수 있거나, 유효 성분을 함유하는 페이스트 비료와 같은 고체 비료가 토양에 적용될 수 있다. 유효 성분은 관개 액체 내에서 혼합될 수 있으며, 예를 들어 관개 시설 (관개 튜브, 관개 파이프, 스프링클러 등) 에 주입되고, 고랑 사이 범람하는 액체 내에 혼합되거나, 수경 배지 (water culture medium)에 혼합될 수 있다. 대안적으로는, 관개 액체 및 유효 성분은 사전에 혼합될 수 있고, 예를 들어 상기 언급된 관개 방법 및 살포 및 범람과 같은 다른 방법을 포함하는 적절한 관개 방법에 의한 처리에 사용될 수 있다.

본 발명의 방제 방법으로 휘발 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 식물을 배양하는 토양 및 식물의 배양을 위한 수경 배지, 모판 등의 매개물에 살포 처리하여 살포된 조성물의 휘발을 통해 식물체를 병충해로부터 보호되도록 하는 방법이며, 이외에도 상기 조성물을 식물체 주변에 거치시켜 휘발된 기체상태의 조성물에 식물체를 노출시킬 수 있다.

본 발명의 방제 방법으로의 종자 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 병충해로부터 보호되도록 종자를 처리하는 방법이며, 이의 특정 예는 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 현탁액을 미립화하고 종자 표면 상에 분무하는 분무 처리법; 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 습윤성 분말, 유액, 유동화제 등을 그 자체로 또는 소량의 물을 첨가하여 종자 표면 상에 적용하는 살포 처리법; 종자를 특정 기간 동안 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 용액 내에 함침시키는 함침 처리법; 필름 코팅 처리법 및 펠렛 코팅 처리법을 포함한다.

식물, 또는 식물 성장용 토양이 본 발명에 의한 화합물로 처리되는 경우, 처리량은 처리할 식물의 종류, 방제할 해충의 종류 및 발생 빈도, 제형 형태, 처리 기간, 기후 조건 등에 따라 변화할 수 있다.

유액, 습윤성 분말, 유동화제 등은 통상 물로 희석된 후 처리를 위해 살포된다. 이러한 경우, 유효 성분의 농도는 통상 0.0001 내지 3 중량%, 바람직하게는 0.0005 내지 1 중량% 의 범위이다. 분말제, 과립제 등은 통상 희석 없이 처리에 사용된다.

본 발명의 방제 방법은 논과 같은 경작지 또는 비경작지에서 사용될 수 있다.

상기 식물은 벼, 토마토, 보리, 밀, 무, 고추 및 토마토로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상이다.

따라서 본 발명에 의한 키티노파가 속 HK235 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 분획물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 방법은 식물병 방제에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해서 상세히 설명한다.

단 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 길항미생물의 선발

한국화학연구원 친환경신물질연구센터의 토양 미생물 배양여액 라이브러리로부터 식물병 방제에 유용한 미생물을 선발하였다. 96웰 플레이트에 PDB(potato dextrose broth; BD Biosciences) 배지 100 ㎕에 토양 미생물 배양여액을 각 2.5, 5, 10 및 20%(v/v) 농도로 첨가하고, 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)의 포자를 10^-5 spores/mL의 농도로 접종하여, 20℃에서 3일간 배양하였다.

그 결과 도 1과 같이 7개의 키티노파가속 균주 중 HK235 균주의 배양여액이 잿빛곰팡이병균의 생장을 5% 농도에서부터 완전히 억제하는 것을 확인했으며, 상기 균주를 순수배양 후 관찰했다.

구체적으로, 3% TSA(tryptic soy agar; BD Biosciences) 배지에 접종하여 사용하였으며, 도 2와 같이 원통형(평균지름 0.4 ㎛; 평균길이 4.1 ㎛)으로 표면은 매끄럽지 않고, 한천배지에서 노란색 슬라임 상의 균총을 형성한 것을 확인했다. 장기보관을 위해서 상기 균주는 TSB(trptic soy broth; BD Biosciences) 배지에서 2일간 순수 배양하여 40% 글라이세롤 수용액과 1:1로 혼합하고 80℃에서 보관하였다.

상기 HK235 균주가 다른 식물병원균에 대해서도 길항작용을 갖는지 확인하기 위하여 PDA(potato dextrose agar; BD Biosciences) 배지에 식물병원균인 알터나리아 브라직시콜라(Alternaria brassicicola), 알터나리아 파낙스 Alternaria panax, 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea ), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae), 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans) 및 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)의 균총에서 떼어낸 균사 절편(mycelial disk, 직경 5 mm)을 중앙에 놓고, 30 mm 떨어진 거리에 HK235 균주를 접종하고 7일간 배양한 뒤 억제되는 거리를 측정하였다.

그 결과, 도 3과 같이 HK235 균주는, 시험에 사용한 식물병원균 8종 모두의 균사 생장을 강하게 저해하는 길항작용을 나타내는 것으로 나타났다.

실시예 2. HK235 균주의 동정 및 동일 속 균주와의 살균활성 비교

CTAB 버퍼를 사용한 DNA 추출법을 사용하여 HK235 균주의 DNA(100 ng/㎕)를 얻었다. 상기 DNA를 주형으로 한쌍의 프라이머(primer) 27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)와 1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)을 사용하여 PCR 반응으로 16S rRNA 유전자 단편을 얻었다.

상기 HK235 균주의 16S rRNA 서열을 이용, 계통분석하였고, 그 결과, 도 4와 같이 키티노파가 지앙니제네시스(Chitinophaga jiangningensis ) JN53(= DSM27406)와 97.06%의 유사성을 나타냈다. 계통분석에서 키티노파가 에이세니애(Chitinophaga eiseniae) YC6729(= DSM22224)와 가까운 것으로 나타났지만, 계통도 가지에서 정확도와 관련된 부트스트래핑 값(bootstrap value, %)은 50% 미만으로 나타났다. 따라서 HK235 균주는 키티노파가 속에 속하며, 기존에 알려진 다른 키티노파가 균주와는 계통학적으로 다른 특징을 가지는 것으로 확인되었다.

키티노파가 균주와 HK235 균주의 살균활성 비교를 위해 KACC로부터 12종의 키티노파가 균주를 분양받아 배양여액의 살균활성을 페이퍼디스크 한천배지확산법(paper disk agar diffusion method)으로 조사했다.

구체적으로는, TSB 배지에 각 균주를 접종 후 30℃에서 2일간 진탕배양 후 원심분리(10,000×g, 15 min)하여 배양여액을 제조하였다. 배양여액 2 mL 씩을 감압농축기로 농축하여 얻은 농축액을 포함한 페이퍼디스크를 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)의 포자가 10^-5 spores/mL의 농도가 되도록 하여 굳힌 감자한천배지 위에 놓고 20℃에서 3일간 배양한 수 생성되는 억제환(inhibitory zone)을 관찰하였다. 억제환 형성을 통해 확인된 키티노파가속 균주들의 항진균 활성은 하기 표 1과 같이 나타났다.

균주명	KACC 기탁번호	항진균 활성
Chitinophaga sp . HK235	81044BP	+++
Chitinophaga rupis	14521	-
Chitinophaga niastensis	12954	-
Chitinophaga polysaccharea	17184	-
Chitinophaga cymbidii	17363	-
Chitinophaga japonensis	12057	-
Chitinophaga arvensicola	17191	-
Chitinophaga sancti	13046	-
Chitinophaga eiseniae	13774	+
Chitinophaga barathri	18797	-
Chitinophaga pinensis	12763	-
Chitinophaga terrae	12755	-
Chitinophaga costaii	18713	-

(+++: 억제환 > 25 mm, ++: 억제환 = 18~25 mm, +: 억제환 = 10~17 mm

±: 억제환 < 10 mm, -: 살균활성없음)

그 결과, 표 1과 같이 근연관계인 키티노파가 에니제니애(Chitinophaga eiseniae) KACC 13774(= YC6729; DSM 22224)만이 HK235 균주처럼 살균활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 종래에 살균활성 펩타이드를 생산한다고 알려진 KACC 12763 균주에 비해 토마토 잿빛곰팡이병균에 대한 살균활성이 확실하게 나타나 본 발명의 키티노파가 균주 HK235는 식물병원균에 대한 길항세균으로서의 가치가 다른 키티노파가 균주보다 뛰어난 균주로 확인되었다. 이에 본원발명의 균주 HK235를 기탁하였고, KACC81044BP로 수탁번호를 받았다.

실시예 3. 최적 배양 조건 결정

상기 HK235 균주의 최적배양조건을 확인하기 위해 배지와 온도를 다르게하여 생장을 비교하였다.

구체적으로는 미생물 배양에 일반적으로 이용되는 4가지 배지로 nutrient broth(NB; 3g beef extract, 5g peptone, pH 6.8) 배지, Luria broth(LB; 110g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride, pH 7.0) 배지, MEB(6g malt extract, 1.8g maltose, 6g dextrose, 1.2g yeast extract, pH 4.7) 배지, TSB(17g tryptone, 3g soytone, 2.5g dextrose, 5g sodium chloride, 2.5g dipotassium phosphate, pH 7.3) 배지에 상기 HK235 균주를 접종하고 25℃, 150 rpm에서 3일 동안 진탕 배양하였다.

또한 최적배양조건에 있어 적정 배양온도를 확인하기 위하여 20℃, 25℃, 30℃, 37℃로 배양온도를 달리하여 생장을 비교하였다. TSB 배지에 접종한 후 진탕 플라스크 배양으로 각 1일, 2일, 3일째마다 배양액의 흡광도(OD₆₀₀)를 측정하였다.

그 결과, 도 5 같이 배지에 따른 조건으로는 TSB 배지에 배양했을 때, HK235 균주의 생장이 가장 왕성한 것으로 나타으며, 온도에 따른 조건으로는 25℃, 30℃에서 생육속도가 가장 빠르고, 2일째부터는 온도별 차이가 크지 않음을 확인하였다. 따라서 25~30℃의 온도에서 1~2일 배양하는 것이 균주 배양에 있어 유리한 조건임을 확인하였다.

실시예 4. HK235 배양여액의 분획물별 살균활성 비교

살균활성물질을 탐색하기 위하여, 각 분획물에 대해 페이퍼디스크 한천배지확산법(paper disk agar diffusion method)으로 토마토 잿빛곰팡이병의 병원균에 대한 살균활성을 평가하였다.

구체적으로는 HK235 균주를 TSB 배지에 접종 후 30℃에서 2일간 진탕 배양 후 원심분리(10,000×g, 15 min)하여 얻은 배양여액을 동량의 유기용매와 혼합한 다음 분액깔때기(separatory funnel)를 사용하여 유기용매층과 물층으로 분리하였으며, 유기용매로는 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올을 순차적으로 사용하였다. 각각의 분획물 2 mL씩을 감압농축기로 농축하여 얻어진 농축액을 페이퍼디스크(직경 8㎜)에 점적하고, 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)의 포자를 10⁵ spores/mL의 농도로 배양한 감자한천배지 위에 상기 페이퍼디스크를 놓았으며, 20℃에서 3일간 배양하여 결과를 관찰하였다.

또한, 실시예 3의 다양한 배지별로 원심분리(10,000×g, 15 min)한 배양여액을 액깔때기와 유기용매로 추출하여 배지별 잿빛곰팡이병균에 대한 살균활성을 비교하였다.

그 결과, 도 6과 같이 부탄올 분획물(BuOH)에서만 억제환이 형성되었으며, 배양액의 조성과 관계 없이 부탄올 분획물에서 잿빛곰팡이병균을 생장을 억제하는 살균활성이 나타나 키티노파가 HK235 균주에서 생성된 살균활성물질은 부탄올에 용해되는 물질임을 확인했다.

실시예 5. 배양액, 배양여액 , 균체현탁액의 방제활성 비교

식물병 방제효과를 평가하기 위해 배양액, 배양여액 및 균체 현탁액을 비교하였다.

구체적으로, HK235 균주를 진탕 플라스크 배양으로 TSB 배지에 접종한 후 25℃, 150 rpm으로 2일간 진탕배양한 균주배양액과 이를 원심분리(10,000×g, 15 min)하여 배양여액을 준비하였다. 원심분리 된 균체(baeterial cell)는 2 × 10⁹ cells/mL 농도로 증류수에 현탁하였다. 식물병 방제효과를 평가하기 위해 유화성을 높이는 보조제(전착제)로 계면활성제인 트윈 20(tween 20)을 250㎍/mL 농도가 되도록 첨가하였다. 이때 대조구는 250㎍/mL의 트윈 20을 함유하는 TSB 배지를 사용하였다. 토마토 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)에 대한 in vivo 살균활성을 조사하였다. 토마토 잿빛곰팡이병은 토마토 3~4엽기 유묘에 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 포자 현탁액(5 × 10⁵ spores/mL)을 처리한 후, 20℃의 습실상에서 3일간 배양하여 발병을 유도하였다. 상기로부터 얻은 병반 면적율(%)을 이용하여 다음의 식에 따라 방제가(control value, %)를 계산하였다.

[계산식 1]

방제가(%) = {1-(처리구의 병반면적율/무처리구의 병반면적율)} x 100

도 7에 나타난 바와 같이, HK235 균주의 배양액 및 배양여액에서는 각각 91% 및 69%의 방제가를 나타냈으나, 균체 현탁액 처리에서는 토마토 잿빛곰팡이병 방제효과가 거의 나타나지 않았다.

실시예 6. 배양액 및 배양여액의 7가지 식물병에 대한 방제활성

식물병 방제효과를 평가하기 위해 상기 실시예 5의 방법으로 HK235의 균주배양액과 이를 원심분리한 배양여액을 준비하였다.

구체적으로는, HK235 균주 배양액과 배양여액의 벼 도열병균(Magnaporthe oryzae), 벼 잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 토마토 역병균(Phytophthora infestans), 보리 흰가루병균(Blumeria graminis f. sp. hordei), 밀 붉은녹병균(Puccinia recondita) 및 고추 탄저병균(Colletotrichum coccodes) 등 7가지 식물병의 병원균에 대한 in vivo 살균활성을 조사하였다. 배양액과 배양여액을 각각 1배, 3배 및 10배로 증류수로 희석하고, 전착제로 트윈 20을 250㎍/mL 농도가 되도록 첨가하였으며, 대조군으로는 250 ㎍/mL의 트윈 20을 함유하는 TSB 배지를 사용하였다. 각 식물병 당 2개의 해당 작물을 포트에 배양하였고, 추출물 용액을 엽면에 분무 살포한 후 24시간 동안 자연건조한 다음 각각의 식물 병원균을 접종하였다. 실험에 사용한 벼, 토마토, 보리 및 밀은 지름 4.5㎝의 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 다음, 종자를 파종하여 25 ± 5℃의 온실에서 1주 내지 4주간 재배하였다. 벼 도열병은 3~4엽기의 유묘에 도열병의 원인균인 마그나포르테 오라이제(Magnaporthe oryzae)의 포자 현탁액(5 × 10⁵ spores/mL)을 분무 접종하고, 25℃의 습실(moist chamber)상에서 하루 동안 처리한 후, 25℃의 항온실에서 4일간 배양하여 발병을 유도하였다. 벼 잎집무늬마름병은 잎집무늬마름병의 원인균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)를 배지(밀기울 90g, 왕겨 15g 및 증류수 100mL)에서 7일간 배양하여 얻은 배양물을 5엽기 유묘에 접종하고 25℃의 습실상에서 4일간 처리한 후, 25℃의 항온실에서 4일간 배양하여 발병을 유도하였다. 토마토 역병은 3~4엽기 토마토 유묘에 역병의 원인균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)의 유주자낭(10⁵ sporangia/mL)에서 나출된 유주자 현탁액을 분무 접종한 후 25℃의 습실상에서 2일간 처리하고 25℃의 항온항습실에서 1일간 배양하여 발병을 유도하였다. 토마토 잿빛곰팡이병은 토마토 3~4엽기 유묘에 잿빛곰팡이병의 원인균인 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 포자 현탁액(5 × 10⁵ spores/mL)을 처리한 후, 20℃의 습실상에서 3일간 배양하여 발병을 유도하였다. 밀 붉은녹병은 1엽기 유묘에 녹병의 원인균으로 활물기생균(活物寄生菌, parasite)인 퍽시니아 리콘디타(Puccinia recondita)의 포자를 250㎍/mL의 트윈 20 용액에 0.67g spores/ℓ의 양으로 현탁하여 분무 처리하고 20℃의 습실상에서 하루 동안 처리한 후 20℃의 항온실로 옮겨 6일간 배양하여 발병을 유도하였다. 보리 흰가루병은 보리의 1엽기 유묘에 숙주 식물에서 계대배양된 흰가루병의 원인균인 블루메리아 그래미니스 포메 스페살리스 홀데이(Blumeria graminis f. sp. hordei)의 포자를 접종하고 20℃의 항온실에서 7일간 배양하여 발병을 유도하였다. 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병은 접종 3일 후, 벼 도열병은 접종 5일 후, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병은 접종 7일 후, 벼 잎집무늬마름병은 접종 8일후에 병반면적율(%)을 조사하였다.

한편, 고추 탄저병에 대한 방제활성 실험을 위해서는, 지름 7.0㎝의 플라스틱 포트에 원예용 상토를 70% 정도 채운 다음 최아된 고추 종자를 파종하고, 이를 온실에서 3~4엽기까지 키운 다음 상기에서 준비된 용액을 엽면 살포하였다. 시료 살포 후 24시간 동안 상온에서 건조시킨 다음 고추 탄저병의 원인균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes)의 포자 현탁액(4 × 10⁵ spores/mL)을 분무 접종하였다. 25℃의 습실상에서 2일간 습실처리 후에 항온항습실(25℃, 상대습도 80%)에서 1일간 재배하였고, 접종 3일 후에 병반면적율(%)을 조사하여 방제가(control value, %)를 계산하였다. 본 발명에 의한 키티노파가 균주 HK235의 배양액 및 배양여액의 7가지 식물병에 대한 방제활성은 하기 표2와 같이 나타났다.

Sample	Dilution factor	Control value(%)
Sample	Dilution factor	RCB	RSB	TGM	TLB	WLR	BPM	PAN
Culture broth (배양액)	1	0	57±15	94±2	29±14	91±4	96±2	77±6
	3	0	13±15	91±2	5±8	51±17	79±4	67±12
	10	0	0	33±8	0	2±4	44±10	50±15
Culture filtrate (배양여액)	1	4±7	0	69±4	48±8	91±4	70±6	50±10
	3	8±7	0	41±11	19±8	4±4	50±0	23±15
	10	4±7	0	14±0	5±8	0	22±10	3±6

(RCB: 벼 도열병, RSB: 벼 잎집무늬마름병, TGM: 토마토 잿빛곰팡이병, TLB: 토마토 역병 ,WLR: 밀 붉은녹병 ,BPM: 보리 흰가루병, PAN: 고추 탄저병)

표 2에 나타난 바와 같이, HK235 균주의 배양액과 배양여액은 토마토 잿빛곰팡이병(TGM), 밀 붉은녹병(WLR), 보리 흰가루병(BPM), 및 고추 탄저병(PAN) 방제에 활성을 나타냈다. 배양여액은 희석액에서의 방제활성이 크게 감소하는 반면에 배양액은 3배 희석액에서도 토마토 잿빛곰팡이병과 보리 흰가루병(BPM) 방제에 91% 및 79%의 높은 방제활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 배양추출물 및 분획물의 토마토 잿빛곰팡이병 방제 시험

상기 실시예에서 얻어진 부탄올 분획물 및 HP-20 column 분획물의 식물병 방제활성을 비교하였다.

구체적으로, HK235 균주를 진탕 플라스크 배양으로 TSB 배지에 접종한 후 25℃, 150 rpm으로 1일간 진탕배양하여 전배양액(pre-culture)을 만들었으며, TSB 배지 500 mL에 전배양액 5 mL씩 접종하고 25℃, 150 rpm으로 3일 배양하였으며, 이를 모아 총 5L의 균주배양액을 원심분리(10,000×g, 15 min)하여 배양여액을 얻었다. 또한 컬럼을 이용한 분획물은 Diaion HP-20 column(5 × 30 cm; Mitsubishi chemical)에 배양여액을 흡착시킨 다음, 페이퍼디스크 한천배지확산법을 통해 토마토 잿빛곰팡이병균에 살균활성이 확인된 k80% 아세톤수용액 분획을 C18 column(10 × 70 cm)에 흡착시키고, 메탄올로 분당 5 mL의 유속으로 용출시켜 분획하였다. 식물병 방제효과를 평가하기 위해 부탄올 분획물 250, 500, 1000 및 3,000 ㎍/mL의 농도로 준비하고, HP-20 column 분획물은 500, 1000, 2000 및 3,000 ㎍/mL의 농도로 준비하였다. 전착제로는 트윈 20을 250 ㎍/mL 농도로 첨가하였으며, 용해를 위해서 사용한 메탄올의 농도는 5%를 넘지않았다. 이때 대조구는 250 ㎍/mL의 트윈 20을 함유하는 5% 메탄올수용액을 사용하였다. 토마토 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)에 대한 in vivo 살균활성을 조사하였다. 토마토 잿빛곰팡이병은 토마토 3~4엽기 유묘에 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea)의 포자 현탁액(5 × 10⁵ spores/mL)을 처리한 후, 20℃의 습실상에서 3일간 배양하여 발병을 유도하였다. 상기로부터 얻은 병반면적율(%)을 이용하여 방제가(%)를 계산하였다.

도 8에 나타난 바와 같이, 부탄올 추출물 및 HP-20 column 분획물에서는 3,000 ㎍/mL 농도로 처리했을 때, 72 내지 85%의 토마토 잿빛곰팡이병 방제활성이 나타났다. 또한, 시험에 사용한 농도에서 식물에 대한 독성은 나타나지 않았다.

기탁기관명 : 국립농업과학원 미생물은행

수탁번호 : KACC81044BP

수탁일자 : 20170117

Claims

수탁번호 KACC 81044BP로 기탁된 키티노파가 속 HK235(Chitinophaga sp. HK235) 균주.
수탁번호 KACC 81044BP로 기탁된 키티노파가 속 HK235 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 분획물로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 도열병균(Magnaporthe oryzae), 잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 역병균(Phytophthora infestans), 흰가루병균(Blumeria graminis), 붉은녹병균(Puccinia recondita), 탄저병균(Colletotrichum coccodes), 검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 점무늬병균(A. panax) 및 시들음병균(Fusarium oxysporum)으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 균으로부터 유도되는 식물병 방제용 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 배양액은 균주를 배양한 배양액 또는 이를 물리적 방법으로 여과한 것인, 식물병 방제용 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 분획물은 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 용매로 사용하여 분획된 또는 흡착제를 사용한 컬럼으로 분획된 것인, 식물병 방제용 조성물.
삭제
제 2항에 있어서, 상기 식물은 벼, 보리, 밀, 무, 고추 및 토마토로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 식물병 방제용 조성물.
제 2항의 조성물을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는, 도열병균(Magnaporthe oryzae), 잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 역병균(Phytophthora infestans), 흰가루병균(Blumeria graminis), 붉은녹병균(Puccinia recondita), 탄저병균(Colletotrichum coccodes), 검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 점무늬병균(A. panax) 및 시들음병균(Fusarium oxysporum)으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상의 균으로부터 유도되는 식물병 방제 방법.
삭제
제 7항에 있어서, 상기 식물은 벼, 보리, 밀, 무, 고추 및 토마토로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 식물병 방제 방법.